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遺伝子組換え実験計画書
（別紙様式１） 遺伝子組換え実験計画書 提出年月日：平成２４年１０月２２日 ■機関承認 □大臣確認（ 年 申請の種類 (注１) ■新規 □継続 ( 年 月 □変更 ( 年 月 月 号） 実験の区分 (注２) 1)微生物使用実験 ■ 2)動物使用実験 作成（使用） ■ 接種 3)その他（上記以外） ・大量培養実験 □ ・植物等使用実験 作成（使用） □ 接種 ・細胞融合実験 □ 号) 号) 拡散防止措置の区分 (注２) 1)■Ｐ１ ■Ｐ２ □Ｐ３ 2)■Ｐ１Ａ □Ｐ２Ａ □Ｐ３Ａ 3)□その他 （ □ □ きのこ作成 □ ） 倫理委員会の承認 1)倫理委員会承認済 □ （ヒトの遺伝子を用い 2)倫理委員会申請中又は申請準備中 □ る実験計画の場合） 3)倫理委員会の承認を要しない ■ (注３) （理由： 実験実施機関 所 在 名 地 (〒520-2192) 大津市瀬田月輪町 称 国立大学法人滋賀医科大学 代表者の職名・氏名 課 題 名 ） 学長・馬場 忠雄 免疫細胞の生体内移動の分子機構 安全委員会の承認日から 所属部局の所在地 (〒520-2192) 大津市瀬田月輪町 実験責任者 実験実施期間（注４） 平成２９年１０月まで 所属機関・部局・職名 滋賀医科大学・医学部・教授 氏 名 平田 多佳子 印 TEL:077-548-2122 FAX:077-548-2122 E-mail:[email protected] 所 在 地 (〒520-2192) 大津市瀬田月輪町 実験場所 滋賀医科大学動物生命科学研究センター２階 小型げっ歯類飼育室(204 号室) 名 称 一般教養棟２階 生命科学講座（生物学）生物学実験室(205 号室) 実験実習支援センター２階 遺伝子工学実験室(214 号室) 実 験 従 事 経験年数 氏 名 所属機関・職名 微生物実験 （注５） 動（植）物実 験（注５） 遺伝子組 換え実験 者 平田 多佳子 実験の目的 滋賀医科大学・教授 大腸菌 22 年 マウス 16 年 22 年 年 年 年 年 年 年 年 年 年 免疫細胞の移動・局在を制御する接着分子・ケモカイン・脂質メディエーターの生体内で の役割を、遺伝子改変マウスを用いて明らかにする。また、これらの分子の機能の制御機構 を分子レベルで明らかにする。 1. 免疫細胞の移動・局在を制御する分子の遺伝子改変マウスを用いた解析(実験 1) 【実験 1】L-selectin ノックアウト(KO)マウス、PSGL-1 KO マウス、CD43 KO マウス、フコー ス転移酵素 Fut4 KO マウス、Fut7 KO マウス、moesin KO マウスは京都大学医学研究科より凍 結胚を導入する。凍結胚を仮親マウスに戻し個体を得る。これらのマウスの表現型の解析を 行う。(P1A) 2. 免疫細胞における S1P 受容体 S1PR1 の機能制御機構(実験 2〜4) 【実験 2】レトロウイルスベクターpRetroQ-cGFP1-N1 または pRetroQ-mCherry-N1 に S1PR1、 -arrestin、clathrin heavy chain、dynamin を挿入したプラスミドで大腸菌をトランスフォ ームする。当該組換え大腸菌を増幅後、プラスミドを精製する。(P1) 実験の概要 (注６) 【実験 3】実験 2 で精製したプラスミドを PLAT-E 細胞にトランスフェクトし、各タグ付きタ ンパク質を発現する組換えレトロウイルス(自立増殖能を欠損)を作成する。(P2) 【実験 4】実験 3 で作成した組換えレトロウイルスを、マウス免疫細胞に感染させ、各タグ付 きタンパク質を発現する細胞を作成し、解析する。(P2) 3. フコース転移酵素 Fut4 および Fut7 の転写制御機構(実験 5〜6) 【実験 5】ルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.17[luc2/Neo]に Fut4 および Fut7 のプロ モーター領域を挿入したプラスミドで大腸菌をトランスフォームする。当該組換え大腸菌を 増幅後、プラスミドを精製する。(P1) 【実験 6】実験 5 で精製したプラスミドを培養細胞にトランスフェクトし、Fut4 または Fut7 プロモーター下でルシフェラーゼを発現する細胞を作成し、解析する。(遺伝子組換え実験に あたらない) 組換え生物等の詳細：供与体・供与核酸・プラスミドベクター・宿主の組合わせ (注７) 宿主に導入される核酸 宿主から除去 される核酸 プラスミド ベクター の名称 (注 11) 宿主 （実験分類） (注 12) 認定宿主 物理的封 ベクター系 じ込めレ (B1、B2) ベル （注 13） (注 14) 備考 (注 15) 供与核酸の名称 (注９) 核酸の名称 （生物種） （注 10） 1) マウス (クラス 1) 大腸菌 (クラス 1) PGK プロモータ ー neomycin 耐性遺 伝子 L-selectin 遺 伝子 (NM_011346) (マウス) マウス (C57BL/6) (クラス 1) P1A 【実験 1】 L-selectin KO マウス 2) マウス (クラス 1) 大腸菌 (クラス 1) PGK プロモータ ー neomycin 耐性遺 伝子 PSGL-1 遺伝子 (NM_009151) (マウス) マウス (C57BL/6) (クラス 1) P1A 【実験 1】 PSGL-1 KO マウス 3) マウス (クラス 1) 大腸菌 (クラス 1) PGK プロモータ ー neomycin 耐性遺 伝子 CD43 遺伝子 (NM_009259) (マウス) マウス (C57BL/6) (クラス 1) P1A 【実験 1】 CD43 KO マ ウス 核酸供与体 （実験分類） (注８) 4) マウス (クラス 1) 大腸菌 (クラス 1) PGK プロモータ ー neomycin 耐性遺 伝子 Fut4 遺伝子 (NM_010242) (マウス) マウス (C57BL/6) (クラス 1) P1A 【実験 1】 Fut4 KO マ ウス 5) マウス (クラス 1) 大腸菌 (クラス 1) PGK プロモータ ー neomycin 耐性遺 伝子 Fut7 遺伝子 (NM_013524) (マウス) マウス (C57BL/6) (クラス 1) P1A 【実験 1】 Fut7 KO マ ウス 6) マウス (クラス 1) 大腸菌 (クラス 1) PGK プロモータ ー neomycin 耐性遺 伝子 moesin 遺伝子 (NM_010833) (マウス) マウス (C57BL/6) (クラス 1) P1A 【実験 1】 moesin KO マウス 7) マウス (クラス 1) S1PR1 遺伝子 (NM_007901) pRetroQ-AcG FP1-N1 大腸菌 (DH5) (クラス 1) B1 P1 【実験 2】 -arrestin 1 遺 伝子 (NM_177231) pRetroQ-mCh erry-N1 大腸菌 (DH5) (クラス 1) B1 P1 【実験 2】 clathrin heavy chain 遺伝子 (NM_001003908) pRetroQ-mCh erry-N1 大腸菌 (DH5) (クラス 1) B1 P1 【実験 2】 dynamin 1 遺伝 子 (NM_010065) pRetroQ-mCh erry-N1 大腸菌 (DH5) (クラス 1) B1 P1 【実験 2】 S1PR1 遺伝子 (NM_007901) pRetroQ-AcG FP1-N1 自律増殖能を もたないレト ロウイルス (クラス 2) P2 【実験 3】 【実験 4】 -arrestin 1 遺 伝子 (NM_177231) pRetroQ-mCh erry-N1 自律増殖能を もたないレト ロウイルス (クラス 2) P2 【実験 3】 【実験 4】 clathrin heavy chain 遺伝子 (NM_001003908) pRetroQ-mCh erry-N1 自律増殖能を もたないレト ロウイルス (クラス 2) P2 【実験 3】 【実験 4】 dynamin 1 遺伝 子 (NM_010065) pRetroQ-mCh erry-N1 自律増殖能を もたないレト ロウイルス (クラス 2) P2 【実験 3】 【実験 4】 pGL4.17[luc 大腸菌 (DH5) (クラス 1) P1 【実験 5】 8) マウス (クラス 1) 9) マウス (クラス 1) 10) マウス (クラス 1) 11) マウス (クラス 1) 12) マウス (クラス 1) 13) マウス (クラス 1) 14) マウス (クラス 1) 15) マウス (クラス 1) Fut4 プロモータ ー (NC_000075.6) 2/Neo] B1 16) マウス (クラス 1) Fut7 プロモータ ー (NC_000068.7) 核酸供与体の特性 (注 16) pGL4.17[luc 2/Neo] 大腸菌 (DH5) (クラス 1) B1 P1 【実験 5】 マウスはクラス 1 であり、哺乳動物に対する病原性、有害物質産生性は知られていな い。 大腸菌はクラス 1 であり、それ自体は無害と考えられるが、人体の血液中や尿路系に 侵入した場合には、敗血症や尿路感染症の原因となり、内毒素を産生するため、エン ドトキシンショックを引き起こすことがある。 1. マウス PGK プロモーター(M18735) phosphoglycerate kinase 1 遺伝子のプロモーターで、動物細胞で neomycin 耐性 遺伝子をドライブし、組換え細胞の選別に用いる。病原性は知られていない。 2. 大腸菌 neomycin 耐性遺伝子 (M19465) 大腸菌・細胞に薬剤耐性機能を付加する。病原性はない。 3. マウス S1PR1 遺伝子(NM_007901) sphingosine 1-phosphate (S1P)の受容体の一つをコードする。病原性はない。 供与核酸（その産物 4. マウス-arrestin 1 遺伝子(NM_177231) -arrestin 1 をコードする。病原性はない。 を含む）の特性 (注 17) 5. マウス clathrin heavy chain 遺伝子(NM_001003908) clathrin の heavy chain をコードする。病原性はない。 6. マウス dynamin 1 遺伝(NM_010065) dynamin 1 をコードする。病原性はない。 7. マウス Fut4 プロモーター Fut4 遺伝子の発現制御を行うプロモーター/エンハンサー領域で、病原性はない。 8. マウス Fut7 プロモーター Fut7 遺伝子の発現制御を行うプロモーター/エンハンサー領域で、病原性はない。 以下の市販のプラスミドベクターを用いる。いずれも安全性は確立されている。それ ぞれのプラスミドベクター内の供与核酸については、遺伝子構成マップを添付する。 プラスミドベクター 1. pRetroQ-AcGFP1-N1(Clontech)(別紙 1) の特性(注 18) 2. pRetroQ-mCherry-N1(Clontech)(別紙 2) 3. pGL4.17[luc2/Neo](Promega)(別紙 3) マウスはクラス 1 であり、病原性はない。 宿主の特性(注 19) 大腸菌 DH5は E.coli K12 株由来である。E.coli 自体は無害と考えられるが、人体の 血液中や尿路系に侵入した場合には、敗血症や尿路感染症の原因となり、内毒素を産 生するため、エンドトキシンショックを引き起こすことがある。 自律増殖能をもたないレトロウイルスは、ヒト細胞に接着した場合に感染が成立する 可能性はあるが、自己複製能をもたないため増殖はせず、人体の安全性に関わる病原 性は生じないと考えられる。 1. 組換え生物 1)〜6) 遺伝子改変マウスであり、免疫応答への影響が考えられるが、病原性や伝達性は ないと考えられる。 組換え生物等の特性 2. 組換え生物 7)〜10),15),16) （宿主等との相違を 組換えプラスミドでトランスフォームした大腸菌であり、導入するプラスミドが 含む） アンピシリン耐性遺伝子をもつため、アンピシリンに対して耐性になる。供与核 (注 20) 酸の項に記載した遺伝子によって病原性、伝達性は変化しないと予想される。 3. 組換え生物 11)〜14) 組換えレトロウイルスは、PLAT-E 細胞に発現する gag, pol, env タンパク質で感 染粒子を構成するが、ウイルスゲノム RNA はこれらの遺伝子を欠く。培養細胞に 感染後は増殖できず、伝達性も消失している。 (組換え)微生物 (組換え)微生物の(組換え)動植物への接種実験（注 21） 物理的 （組換え）動植物 封じ込めレベル (注 22) 備考 （組換え）微生物を 保有している（組換 え）動物、植物等の 特性 (注 23) 1. 組換え生物 1)〜6) 核酸防止措置の区分：P1A 理由：動物作成(使用)実験であり、宿主のマウスはクラス 1 である。供与核酸が 宿主の病原性を高めることはないと推測されるので、作成されたマウスには P1A レベルの核酸防止措置をとる。 拡散防止措置 2. 組換え生物 7)〜10),15),16) 核酸防止措置の区分：P1 理由：核酸供与体であるマウスはクラス 1 である。宿主の大腸菌はクラス 1 であ り、B1 認定系である。プラスミドベクターに含まれる供与核酸の核酸供与体中の 区分及び選択理 サイトメガロウイルス、マウス肉腫ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、 由(注 24) SV40 ウイルスはクラス 2 であるが、すべての供与核酸は同定済核酸で哺乳動物等 に対する病原性及び伝達性に関係しないと科学的に推定される(第五条第一号ハ に該当)。以上から、P1 レベルの核酸防止措置をとる。 3. 組換え生物 11)〜14) 核酸防止措置の区分：P2 理由：レトロウイルスの実験分類はクラス 2 である。作成される組換えウイルス の病原性・伝達性は、供与核酸により付加される性質によって変化しないと推測 されるので、P2 レベルの核酸防止措置をとる。 遺伝子改変マウスは実験終了後安楽死せしめ、動物生命科学センターに依頼して処分 する。 組換え生物等を 不活化するため 組換え大腸菌およびそれらに触れた器具類はオートクレーブ処理(121℃、20 分間)で の処置 不活化する。 (注 25) レトロウイルスおよびそれらに触れた器具類はオートクレーブ処理(121℃、20 分間) で不活化する。 遺伝子改変マウスの飼育 滋賀医科大学 動物生命科学実験センター2 階 小型げっ歯類飼育室(204 号室) 平成 16 年 11 月 9 日 P1A 承認 物理的封じ込めに係 る施設・設備(注 26) 遺伝子改変マウスを用いた実験および組換え大腸菌を扱う実験 滋賀医科大学 一般教養棟 2 階 生命科学講座(生物学) 生物学実験室(205 号室) 平成 16 年 7 月 30 日 P1 承認 P1A 承認申請準備中。本実験室における P1A 実験は承認取得後に開始する。 組換えウイルスを扱う実験 滋賀医科大学 実験実習支援センター2 階 昭和 62 年 12 月 25 日 P2 承認 その他 遺伝子工学実験室(214 号室) 上記実験計画は、□大臣確認実験 □機関承認実験 であり、実験計画書に不備のないことを認めます。 平成 年 月 日 安全主任者確認欄 安全主任者の部局・職 氏 付記 名 後 藤 病理学講座（微生物感染症学部門）教授 敏 印 計画書記入要領 １）機関承認実験— 項目にチェックを入れる。 本様式の各項目に記入する。余白が不足して記入できない場合は、適宜、枠を縦に拡大するか、あるいは 別紙を添付し該当項目に別紙番号を記入する。 ２）大臣確認実験— 項目にチェックを入れ、大臣確認を受けた年月及び確認番号を記入する。 大臣確認実験は、第二種使用等拡散防止措置確認申請書を文部科学大臣に提出し大臣確認を受ける。その 後、大臣確認申請書の写しと本申請書を提出する。ただし、本申請書は、１ページ目を記入するだけでよい。 注 1. 注 2. 注 3. 注 4. 注 5. 注 6. 注 7. 該当項目にチェックを入れる。 本計画において該当する項目すべてにチェックを入れる。 該当項目にチェックを入れる。 予定している実験実施期間（５年を限度とする）を記入する。 宿主名（大腸菌、マウスなど）とその取扱い経験年数を記入する。 実験が複数のステップからなる場合、実験番号をつける。 作成（使用）する組換え生物等毎に、核酸供与体、供与核酸、プラスミドベクター、宿主の組合わせ を記入する。 注 8. 核酸供与体となる生物の種名又は系統名を実験分類とともに記入する。 注 9. 同定済み核酸のときは、その名称と GenBank accession number を記入する。そうでないときは、未 同定核酸と記入する。ベクターの中に存在する供与核酸は、物理的封じ込めレベルに影響を与えない 限り、この欄には記入しない。 注 10. 宿主から核酸が除去される場合（ノックアウト動物やノックアウトウイルスなど）は、その核酸の 名称と GenBank accession number、そしてその核酸の由来する生物種名を記入する。 注 11. 宿主に遺伝子を導入するときプラスミドベクターを利用する場合はその名称を記入する。ウイルス ベクターは組換えウイルスなので、ベクター欄には記入しないこと。 注 12. 宿主の種名、系統名を実験分類とともに記入する。ここでいう宿主は感染実験の宿主ではなく、遺 伝子が導入される生物（多くの場合、大腸菌、ウイルス、マウス等が該当）のことです。 注 13. 封じ込めのレベルダウンを要求する場合は、認定宿主ベクター系の各々の組合わせについてその区 分（B1 か B2）を記入する。 注 14. 作成（使用）される組換え生物等が複数の場合、順に番号をふる。各々の組換え生物等毎に物理的 封じ込めレベルを記入する。 注 15. 組換え生物等を作成する過程が複雑な場合、備考欄にその説明を簡潔に記入する。 注 16. 核酸供与体の実験分類と病原性（毒素産生性及び発がん性など）及び伝達性について記入する。 注 17. 哺乳類動物等に対する供与核酸又はその産物の病原性（毒素産生性及び発がん性など）及び伝達性 について記入する。同定済み核酸の場合は GenBank accession number とその機能に関する文献資料を 引用する。毒素遺伝子の場合は、ＬＤ50 及びのその構造についても記入する。 注 18. プラスミドベクター（複製起点）について各々の由来を記入する。プラスミド中の各種プロモータ・ ターミネータ等は、宿主由来の核酸でない場合は供与核酸となるので、それらの由来についても記入 する。これらを記入する代わりに、プラスミドベクターの遺伝子構成マップを添付してもよい。 注 19. 宿主について実験分類を記入する。特に微生物や寄生虫等を宿主とする場合は、病原性（毒素産生 性及び発がん性など）および伝達性についても記入する。 注 20. 導入された供与核酸の特性によって、宿主にどのような形質が新たに付与されるかについて考察し 記入する。 注 21. 前欄で記述した組換え微生物を組換え動（植）物に接種する実験（感染実験）を行う場合に記入す る。組換え微生物と組換え動（植）物、組換え微生物と通常の動（植）物、通常の微生物と組換え動 （植）物のいずれかの組合わせで接種（感染）実験を行う場合が該当する。 注 22. 接種（感染）実験の組合わせ毎に物理的封じ込めレベルを記入する。 注 23. （組換え）微生物の接種により新たに獲得することが予想される宿主の特性について記入する。ま た、（組換え）微生物の病原性（毒素産生性及び発がん性など）や感染性などが変化すると予想される 場合は、その旨明記する。 注 24. 作成（使用）する組換え生物等各々について、拡散防止措置の区分とその選択理由を記入する。接 種実験を行う場合は、その拡散防止措置の区分と選択理由も記入する。 注 25. 具体的な不活化の方法を記入する。 注 26. 物理的封じ込めに係る施設・実験室の名称と安全委員会による認可年月日を記入する。