コラーゲンゲルサンドイッチ法が初代培養肝細胞の機能・分化機構に

慶 晦 医 学 ・81(i):49∼60。2004
著
原
コ ラ ー ゲ ンゲ ル サ ン ドイ ッ チ法 が 初 代 培 養 肝 細 胞 の 機 能 ・
分化機構 に及 ぼす影響
慶匪 養殖 大学 医学 部 内科学 教 室
(指導:石 井裕 正教授)
いの く
ち さ い か
井 口 清 香
('F成L5算12月
・1日受 付)
ABSTRACT
Effects of collagen gel sandwich mechanisms in primary Department Bioartificial construct were liver is one sandwiched maintained filaments, proteins layer of collagen reduced actin cells could differentiate gel sandwich enough[o induce supplying bone showed stress hepatic on single into fibers and that collagen of liver layer when of bone gel sandwich had they been co・cultured configuration, specific with primary This cultured to extend hepatocyte, Bone the cell
marrow
functionally clearly the lifespan biohybrid the
Overlaying
hepatocytes was evidence of actin
secretion, gel reversed expressions. gel sandwich hepatocytes. cultured cell spreading. on a single protein hepatocytes
the distribution the albumin and cultured liver will be able primary and fibers in collagen cell into artificial proteins to re。
rat hepatocytes
sandwiched gel decreased stress In an effort in the liver, adult Functionally, specific liver cultured marrow cells into biohybrid that o臼iver`ai且UfE. found of collagen of actin Keio University
recovery matrix. recovered[he hepatocytes of Medicine, normally formation hepatocytes differentiation Key Word:collagen polarity the expression abnormal hepatocytes
to expedite gels on the hepa[ocytes indicating marrow School of hydrated of albumin, and cellular layers cultured and differentiation
Sayaka lnokuah7
Medicine, apProaches and the cells cultured spreading, lagen two the secretion liver specific asecond function between whereas of Internal of the prolnising the hepatocyte on functions in coト
good
suggests that
of thisdevice.
artificial liver,
di[terentiation.
現 在 わ が 国 に お い て肝 硬 変 患 者 は 約30万
人 い る と推
定 さ れ る.ま た慢 性C型 肝 炎 患 者 が約200万
人 存 在 し,
ドナ ー不 足 は,今 後解 消 され る見 込 み が 極 め て 低 い と言
わ ざ るを え な い.し た が って,多
くのC型 肝 硬 変 患 者 は
将 来 的 な肝 不 全予 備 軍 とみ な され る,肝 硬 変 は ひ とた び
有 効 な 根 本 的 治 療 を 受 け る こ と な く,生 活 の 質(qual・
肝 不 全 に陥 る と機 能 の 回 復 は非 常 に難 し く,根 本 的 な治
ity of life)の 低 下 に苦 しん で い る.
療法 が な い の が現 状 で あ る.現 在,末 期 肝 硬 変 患 者 の唯
一 の救 命手 段 は肝 移 殖 で あ るが ,C型 肝 硬 変患 者 は,現
肝 臓 は,肝 硬 変 に 陥 る と,肝 再 生 が お こ らず 非 可 逆 的
在 の わ が 国 の 深 刻 な ドナ ー不 足 の状 況 か ら見 て,そ の ほ
打 開 す る革 新 的 治 療 法 の可 能 性 を 持 っ もの と して注 目 さ
とん ど が 移 植 を受 け られ な い と考 え られ る.そ
れ て い る.我 々 は.肝 臓 を 標 的 と した肝 再 生 医 療 の実 現
して この
一49一
に徐 々 に肝 不 全 に 向 か う.再 生 医学 の 開 発 は この現 状 を
慶 雌 医 学81巻1号
と 人 工 肝 臓 の 開 発 を リ ン ク し,肝
不 全治 療 へ の 応用 を 目
指 す 新 た な 試 み を 行 っ た.
化 な 状 態 の ま ま 半 永 久 的 に 増 殖 しIR:,移 植 に よ り 二 胚 葉
性 の 分 化 能 が 維 持 さ れ て い る こ と を 確 認 で き る.現
一 般 に 人 工 肝 臓 と 言 え ば,バ
肝 臓(biohybrid い1三
成16年3月)
イ オ ハ イ ブljッ
artificial liver:BAL)を
ド型 人 工
指 し,肝
で に.様
々 な 臓 器 ・組 織 に 特 異 的 に 分 化 誘 導 す る 試 み が
報 告 さ れ て き た1'L20'.す
細 胞 の 機 能 を 持 つ 何 ら か の 細 胞 を 利 用 す る もの を 言 う.
embryonic こ の 開 発 に お い て 璽腰 な 点ｫ.①
り, DMSO ど の よ う な 組 織 ・細 胞
を 肝 細 胞 の 機 能 を 代 用 す る も の と して 用 い る か?(細
ソ ー ス)②
胞
治 療 に 用 い うる だ け いか に持 続 的 に長 期 間 機
能 を 維 持 さ せ ら れ る か?(機
ス と し て は,す
能 維#5)で
あ るP,細
胞 ソー
で に 肝 細 胞 と して の 機 能 を 有 し て い る 細
在ま
で に ヒ トES細
stem ce11)が
胞 株(human
樹 立 さ れxii応 用 が 始 ま っ て お
(dimethylsul(oxide)xaやHGF tocyle growth factor}"', (hepa・
beta一[JGF {beta-nerve
growth factor)xr.を 培 養 液 に 添 加 す る こ と に よ り,肝
細
胞 へ 分 化 誘 導 さ せ る こ と が で き る こ と も 釈 告 さ れ た.
ES細
胞 をmい
た 場 合 の 利 点 と し て は ①ES細
胞の操作
胞 を 用 い る 方 法 が 実 用 化 に 向 け て 先 行 し て い る2'.
方 法 が 確 、1され て お り 多 くの 研 究 室 で 比 較 的 簡 単 に 扱 え
Demeiriou る こ と ② 遺 伝 子 操 作 を 行 う 技 術 が マ ウ ス で 確:;r.され て
111名
A.Aら
は,ブ
タ肝 細 胞 を 用 い たBALを
の 患 者 に 対 し 用 い,良
の 他 に,ヒ
を 使 用 し た も の`,,不
死 化 肝 細 胞 を 用 い た も の51,ヒ
る 遺 伝 子 の 検 索 がuJ能
ト胎 児 肝 細 胞 を 利 用 し た
も の61な ど が 検 討 さ れ て い る.ブ
は.す
い る こ と ③ 遺 伝 子 操 作 に よ り肝 細 胞 へ の 分 化 を 誘 導 す
好 な 結 果 を 得 て い る'1.そ
ト肝 芽 腫 由 来C3A株
タ肝 細 胞 を 用 い る 方 法
で に 成 熟 し た 機 能 を 持 っ 肝 細 胞 を 用 い る 点,多
く
しか し こ の よ う に,ES細
の,倫
と な っ て い る 。 さ ら に,①
細 胞 に は マ ウ スES細
い る.し
性
畜 共 通 感 染 に 関 して は 大 き な 問 題 で あ
る こ と が 一 般 に 認 知 さ れa,今
後 この問 題 を 解 決 す る こ
が あ り.安
め,骨
肝 臓 の 組 織 特 異 的 幹 細 胞 は,肝
ま で,組
の 高 い 細 胞 で あ る.肝
小 葉 門 脈 周 囲 の 肝 細 胞 索 と小 葉 闇
胆 管 と の 組 織 学 的 な 境 界 で あ るHerring 領 域 に,卵
2dや そ の 周 辺
円 形 の 核 を 持 っ と い う形 態 学 的 な特 微 か ら
テ ラ ト ー マ の 発 生 ② ヒ トES
胞 と異 な る技 術 が必 要 とな る可能
定 した培 養 法 の 開 発 が 今 後 の 課 題 とみ な
さ れ て い る.一
と が 重 要 に な っ て く る と 思 わ れ る.
細 胞 に 分 化 す る増 殖 能
胞 に は 高 い可 能 性 が あ る もの
理 的 問 題 点 は本 邦 の み な らず 世 界 的 に大 き な問 題
の 細 胞 を一 度 に大 翫 に供 給 す る こ とが 可 能 な 点 で 優 れ て
か し,人
で あ る こ と な ど が 挙 げ ら れ る.
方,ES細
胞 の 倫 理 的 問 題 点 を避 け る た
髄 細 胞 が 細 胞 ソ ー ス と して 注 目 さ れ て い る.最
織 特 異 的 幹 細 胞 が 唯 一 その 組 織 に 分 化 す る こ と
が 出 来 る と 考 え ら れ て い た が,骨
由 来 の 多 能 性 成 体 前 駆 細 胞(MAPC:mu且ti-potent
adult progenitor cells)は80回
は,重
が 可 能 で あ り,採
塑 性 を も っ こ と か ら注 目 さ れ,す
細 胞11レ,小 腸 細 胞in,騨
臓 細 胞uw,神
す る こ と が 報 告 さ れ て い る.ま
養 肝 細 胞 の 培 養 中 に,通
管
経 細 胞151に 分 化
たMitakaら
は,初
代培
常 の 成 熟 肝 細胞 とは 増 殖能 力 の
異 な る細 胞 群 の 存 在 を 見 出 し,こ
け た161.こ
で に 肝 細pC9,101,胆
れ を 小 型 肝 細 胞 と名 づ
の 細 胞 は 増 殖 能 が 高 く,超
微 構造 的 に も機 能
的 に も 成 熟 肝 細 胞 に 非 欝 に よ く 似 て い る.し
か し,こ
れ
髄 細 胞 が 他 の臓 器 の 細
胞 に 分 化 す る 可 能 性 が 発 表 さ れ たxs-rep.骨 髄 間 葉 系 細 胞
oval cellと 名 づ け ら れ た 細 胞 が 存 在 す るfll. Oval cell
篤 な 肝 障 害 を 加 え た と き に 門 脈 周 囲 に 出 現 し,可
近
取 した後 増 殖 させ る こ とに よ り十 分量
を 得 る こ と が 可 能 で,生
臓,肺,腸
体 内 に 移 績 す る と 血 液 細 胞,肝
管 上 皮 細 胞 に 分 化 す る こ と が 報 告 され て い
る"). FGF・4 (hepatocyte に よ り,肝
程度 分 裂 増 殖 す る こ と
(fibroblast growth growth(actor)の
factor) とHGF
存在 下 で 培 養す る こ と
細 胞 へ 分 化 させ る こ とが 可能 で あ る ζ と も示
さ れ た'。1.た だ し,ES細
vitroで は,未
胞,骨
髄 細 胞 と も.特
に 」"
分 化 細 胞 か ら肝 細 胞 へ の 分 化 誘 導 は可 能
らoval cellと 小 型 肝 細 胞 を 効 率 よ く 大 癒 に 採 取 し,
で は あ る が100%で
BALや
か っ た 細 胞 を ど の よ うに 処 理 す る か 検 討 す る 必 要 が あ る.
細 胞 移 植 に 応 用 す る た め に は,な
カ ー が 必 要 と な る が,今
ん らか の マ ー
の と こ ろ効 率 よ く分 離 す る方 法
は な い.
さ せ て 利 用 す る 方 法 が あ る.こ
れを肝細胞に分化
れ は ヒ ト由 米 の 細 胞 を 利
用 で き る 可 能 性 が 広 が る 点 で 優 れ て い る.も
細 胞 は,受
こ の よ う な 観 点 か ら,我
in vitroで
未 分 化 な 細 胞 を 大 量 に 増 殖 さ せ,こ
と も とES
の 分 化 全 能 性 を 保 った ま ま
樹 立 さ れ た 細 胞 株 で あ るlfl.こ
LIF(leukemia の 細 胞 は,マ
inhibitory factor)の
ウスでは
存 在 下 で,未
と,未
作 り,肝
た が って肝 細 胞 に な らな
々は 肝 臓組 織 内 に近 い環 境 を
細 胞 の 機能 を長 期 的 に維 持 させ る こ
分 化 細 胞 を 肝 細 胞 へ 分 化 誘 導 す る こ と を 考 え た.
こ の こ と は,BAL開
発 に お い て 璽 要 な 点 で あ る.肝
細
胞 の 機能 維 持 には細 胞 外 マ トリ ッ クス を利 用 す る こ とが
精 卵 が 分裂 して胚 盤 胞 と な った 際 に 形 成 され
る 内 部 緬 胞 集 塊 に 由 来 し,こ
は な い.し
分
一50一
重 要 で あ る3P.現
在,ス
フ ェ ロ イ ド形 成amや,マ
イクロ
マ ニ ピ ュ レ ー シ ョ ン 法 に よ る 混 合 培 養 法123])な ど が 開 発
さ れ て い る が い ず れ も 高 度 の 技 術 が 必 要 で あ り,一
研 究 室 で の 応 用 は 困 難 で あ る.し
か も,こ
般 の
れ らの方 法 を
井 口 ニコ ラー ゲ ンゲ ル 内 初 代培 養肝 細 胞 の 機 能 訓1価
用 い て も,初 代 培 養肝 細 胞 を 維 持 す る こ とが 可能 な の は
L5ケ
月 ほ ど で あ る.そ こ で我 々は,コ
よ るサ ン ドイ ッチ法 を 応 用 した.こ
らに よ り1989年
材料 と方法
ラー ゲ ンゲ ル に
の 方 法 はYarmush
に 報 告 され た3の.コ ラ ー ゲ ンは 低温 状
1.初
代 培 養 肝 細 胞 の 作 成 と培 養
況 下,ア ル カ1,性 に保 っ と液 体 と して保 存 可能 で あ るが,
体 輩100∼120gのWistar系
これ を 初 代 塙 養 肝 細 胞 培 養 環 境 で あ る,37℃
step perfusion の中性 に
雄 性 ラ ッ ト か ら. two-
method(一.=段
階 コ ラ ゲ ナ ー ゼ 灌 流71'")
す る と ゲ ル化 す る.こ の性 質 を 応 用 す る こ とに よ り。 簡
を 改 変 し た 方 法 で 分 離 し た 後,Perco1】
便 に 初 代 壇 養 肝 細 胞 を1ケ 月 間機 能 保 持 した ま ま培 養 を
心 法XO1で 精 製 し た 、 す な わ ち 麻 酔 下 に ラ ッ ト 門 脈 に18
継 続 で き る.こ の 方 法 は非 常 に 簡 単 で あ り,か つ 細 胞 を
Gサ
通 常 型 顕 微 鏡 で 経 時 的 に観 察 で き る利 点 が あ る.ま た,
ylene glycol 骨 髄 細 胞 を,傷 害 した肝 職 に 移 植 した 場 合,ほ ぼ2週 間
ascetic で肝 細 胞 にtransdifferentiateし
balanced て い る こ とか ら.1r
ー フ ロ ー 針 を挿 入
bis(β
要 な利 点 で あ る,初 代 培 養 肝 細 胞 が 通 常 の 培 獲環 境 で は
酸 素 化 し た0.05%コ
機能 を継 続的 に喪 失 して い くこ と は報 告 さ れ て い る が,
Louis, そ の メ カニ ズム に っ い て の検 討 は未 だ な い.肝 細 胞 の 機
灌 流 し た.肝
シ ンな どの 蛋 白 質 が 正常 に 分布 し,毛 細 胆 管 や そ の 周 囲
を取 り巻 く収 縮 蛋 白(ア
クチ ン線 維)な
どの 構 造 が 保 た
で15分
必 要 が あ る.し か し一 般 の 細胞 培 養 で は細 胞 と塘 質 の 接
符が 下 面 のみ に限 局 され て しま う ため,イ
ンテ グ り ンが
ド面 の み に 樂中 して しま い.そ の 精 果 と して細 胞 全体 が
ラ ゲ ナ ー ゼ(Type し,肝
分
濃 度 のHBSS (DMEM)(Sigma, 蛋 白(ア
Nordisk, G に コ ラー ゲ ンゲ ルを 璽 層 す る とイ ンテ グ リ ンの 分 布 が 細
Carlsbad, 胞 の 上 面 に も分 布 す るた め,細 胞 の 立 体 構造 が 回 復 して
(Banyu い く可 能 性 が 考 え られ る.
HEPES(Sigma, レ ッ
Percoll原
液
USA)21.6 ml,
た ベ レ ッ ト をHBSSで1回
Novo modified g
洗 浄
Tokyo, St. Louis, Type FA (Nitta 出 来 る の か.こ
dium bicarbonate USA), io倍
(Nova
factor)(lnvitrogen,
Ns./mi hydrocortisone
Japan)十10 USA) streptomycin(lnvitrogen, Bagsvard,
R100 ng/m!Natura且
growth Pharmaceutical, bo・
Nordisk. Novolin +7.5 medium
USA)+7ng/m!
Denmark)十20 USA) 養 に は,コ
Eagle●s USA)+且0%fetal (Novo EGF(epidermal 骨 髄 細 胞 を肝 細 胞 へ 分 化 誘 導 す る環 境 を 形 成 す る こ とが
臓 に い か に 機能 上 近 づ く こ とが 出 来 るか を
し, Carlsbad, Bagsvard, murine BALが,肝
し た,ベ
加 え て よ く 混 和 し,50 十 〇.5 U/m! 細 胞 機 能 が 失 わ れ て い くと 考 え られ る.こ の 時細 胞 の 上
の こ と は肝 臓 と して の 機 能 を 代 用 す る
m/と
St. Louis, す る こ とが で きず,毛 細 胆 菅 や そ の周 囲 を取 り巻 く収 縮
し た.培
菌 した ガ ー ゼ
Piscataway, 細 胞 培 養 液 (Dulbecco's Denmark) た
間
リ パ ン ブ ル ー 排 斥 試 験 に て 生 存 率 を 確 認 後,肝
Glucagon こ とに よ り再 び機 能 を 回 復 す る こ とが 出 来 るの か.ま
し て29 間 遠 心 し た,得
E・カ ドヘ リンや ラデ ィギ シ ンな ど の蛋 白質 が 正常 に 分布
は た して機 能 を 失 った 肝 細 胞 は コ ラ ーゲ ンを 重 層 す る
Sし
で ・・サ ミ と ピ ン セ ッ
2.4 m'を
vine serum(lnvitrogen. ど の構 造 が形 成 され な くな り,
に,
U(Sigma, 間 遠 心
Biosciences, し た,ト
た.次
細 胞 を 分 散 し た.滅
散
ニ
ド坦 化 して しま うOBE
.そ の た め肝 細 胞 間 接 着 分 子 で あ る
クチ ン線維)な
含 むHank's
St. Louis,
に 重 ね 漣 過 後,50gで3分
(Amersham 接 着 を担 う イ ンテ グ リ ンが 細 胞 の 上 下 に 正 し く分 布 す る
St. Louis, USA)を
臓 を 摘 出 し,HBSS巾
ト をHBSSに
10倍
9・N,N.N',N'・tetr
含 む 後 漉 流 液 を5ml/minで20分
トを 用 い て 細 切
れ る こ とが 亟 要 で あ る3"。 その ため に は,細 胞 と基 質 の
・aminoeしhylether 間 液 流 し 脱lhlし
USA)を
を4重
EGTA(eth-
salt solution(HBSS)(Sigma. USA)で5m'/minで4分
あ る&」
‡6'.肝細 胞 間 の 接 着 に はE・カ ドヘ リ ンや ラデ ィ キ
・ 留 置 し,0.2mM acid)(Sigma, 月間 肝 細 胞 と しての 機 能 を維 持 して 培 養 出 来 る こ と は亟
能維 持 に お い て は,細 胞 の3次 元 的 構 造 の 理解 が 重 要 で
を 用 い た低 速 遠
mM
+且%peniciUin・
Carlsbad, USA))に
懸 濁
ラ ー ゲ ン ゲ ル 混 合 液(Cellmatrix
gelatin. Osaka, solution Japan), (lnvitrogen, Carlsbad,
濃 度 のDMEMを8:1:1の
割 合 で 混 合)
測 る指 標 と して 重 要 で あ ると考 え られ る.本 研 究 で は こ
を60mm培
れ らの こ とを 念 頭 に,コ
イ ン キ ュ ベ ー ト し て 作 成 し た コ ラ ー ゲ ン ゲ ル デ ィ ッ シ}
ラー ゲ ンゲ ル サ ン ドイ ッチ法 を
用 い,肝 細 胞 の 分 化機 構 に お け る細 胞 外 マ ト リッ ク ス と
を 用 い た.分
肝 細 胞 分 化 機 構 との関 係 を解 明 し,さ らに は骨 髄 細 胞 か
37℃
ら肝 細 胞 へのin vitroで のtransdifferentiationカi可 能
か否 か を明 らか にす る.
養 皿 に500ｵ1ず
7.5%so・
離
・ 精 製 し た 細 胞 を3×
の5%CO'気
5,7,9日
つ 分 注 し.37℃
後 に,培
且05個
桐 下 に て 培 養 し た.培
一SI一
間
ず つ 撒 い て,
養 開 始1,3,
養 細 胞 の 上 に 上 記 と同 様 に して作 成
し た コ ラ ー ゲ ン ゲ ル を 重 層 し た(第1・A図).培
培 養 皿 あ た り2m1と
で20分
し,毎
日 交 換 し た,
養 液 は
慶 思 医 学 81巻1.号(∼li成]6fi 3月)
A
一
初代焔養驕 醐
囲
コラ幽ゲンゲル
[==コ
職 液
B
70
oo
1
1
}
.、
1
「1
非サ ンドイッチ 群
己曜1サ ンドイッチ群
噂-凸
= ゆ
工
50 ⑩ 30 ⑳
(
あヨ}E、 竜︾
袋3208 雇E3 く
罰
t
尋
甚
10
w3サ
ンドイツ子詳
由y5サ
ンドイツ予群
由Y7サ
ンドイツ予農
daγ9サ ンドイツチ群
a
3
7
n
19
15
P7
av
第1図A;コ
ラ ー ゲ ンゲ ル サ ン ドイ ・!チ法.60mmコ
ラ ー ゲ ン ゲ ル デ ィ ッ シュ に.ラ
ッr肝 臓
か ら分 離 ・掴 製 した肝 細 胞 を 撤 い た.し か るべ き期間 培 養 後 。 コ ラーr'ン ゲル を 璽 層 した.培
液 は 培 養 皿 あ た り2m'用
い, ra e交 換 した. B:コ
培 養 肝 細胞 の ア ル ブ ミン産 生能,培
養
ラー ゲ ンゲ ル サ ン ドイ ・,チ法 でto した 初 代
養液 中 の 了 ル ブ ミン濃度 をELISA法
で 測 定 しr.培
養開 始5
日 目 まで に コラ ー ゲ ンゲ ル を 重層 した場 合.重 暦 す るま で は 減 少 して い た アル ブ ミン濃 度 が,重
層 後1週 間 で培 養 開 始 且日 目に 重層 した 場 合 と同 程 度 に達 し,そ の 後 も維 持 さ れ た.量 層 しなか っ
た場 含 は,減 少 し続 け,検 出感 度 以'ドとな っ た.
2,ア
を 得
ル ブ ミ ン測 走
隔 日 に 培 養 上 清 を 採 取 し,上
ELISA (enzyme・1inked 加 え.続
レ ー トに,細
い てHRP(horse ラ ッ ト ア ル ブ ミ ン抗 体100μ
で30分
問 反 応 さ せ た.洗
で プ レ ー ト を6回
TagMan 温
応 停 止 液(1M硫
酸)100N1を
吸 光 度 を 測 定 し た.
USA)で
定
培 養 液 を 吸 引 後,0,5%コ
を デ ィ ッ シ}に
後,細
RNA袖
加 え,10分
胞 を50gで5分
にIsogen(Nippon ラ ゲ ナ ー ゼ(Type 間37℃
で加 温 しゲ ル を溶 解
週 心 して..ヒ 清 を 捨 て 細 胞 沈 渣
gene, Tokyo. Japan)1m1を
出 液 を 得 た. Isogen RNA垂
gene, Tokyo, Japan)の
プ ロ トa一
PCR 加え
USA)を
CT 一52一
System(Applied (Applied method)ABI (Applied ル に 従 い,全RNA
(Applied
に6・
ら び に3'端
に6標 識
らに プ ライ マ ー ペ
PRISM 7700 Sequence
Biosystems, Foster City.
ラ イ マ ー シ ー ク エ ンス は
定 値 の 定 量 化 に はraU8S
Biosystems, Foster City,
内 部 コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い(comparative
Systemの
宙出 キ ッ ト (Nippon
mix は
用 い て,5'端
nM:),さ
と も に, ABI RNA PCR法
rhadamine(TAMRA)を
に ま と め て 示 し た.測
ribosomal reverse
TagMan master City,USA)を
増 幅 し 測 定 し た.プ
第1表
ll l mt
し た. Probe(250 ア(900nM)と
プ ラ イ
逆 転 写 反 応 を さ せ,
fluorescein(FAM)な
Detection 3.mRNA測
不 活 性 化
し たTaqMan 加 え.た
transcriptase(Perkin・
る こ と に よ りmultiscribe carboxy・tetramethyl 間室温 で
はrandom
用 い て25℃10分
に48℃30分
Foster carhoxy 合 成 に
reverse USA)を
universal Biosystems, あ るい は水 道 水
加 え て5分
処 理 す
transcriptaseを
識抗
を 加 え よ く 混 和 し,窒
液 を100μ
だ ち に450nmの
95℃5分
を
洗 浄 後 。02mg/m!tetramethy】
benzidine(TMH)溶
反 応 さ せ,反
胞 培 養 」=滴100μ
浄 バ ッ7r一
mulしiscribe マ ー と 親 和 さ せ,次
用いて
radish peroxidase)標
cDNAの
Elmer., Wellesley,. assay)法
(Nephrat ll(Exoce11, Philadelphia, USA))を
測 定 し た.ELISAプ
hexamers, 清 巾 の ア ル ブ ミ ン濃 度 を
immunosorbent た.First・strand 添 付
PRISM 文 書
Biosystems, に 蟻
7700 Sequence づ
きTagMan Foster City, USA)を
Detection
software
用 いて 各 々
井 口:コ
第L凝
ラー ゲ ンゲ ル 内 初代 培 養肝 細 胞 の機 能 評 価
リ ア ル タ イ ムPCRに
用 い たTagplanプ
ロ ー ブ と プ ラ イマ ー ベ ア ー
Forward TagMan primer
Reverse Albumin
PCR
product
(bp)
Probe
primer
AAGGCACCCCGATTACTCCC
TTCCAAAACGCCGTTCTGGTTCGATA
6A8
TGCGAAGTCACCCATCACCG
TGCTTATGGGAGGCGTAT
asep
TGGCCCAGCCAGGCATACTTATTATT
ssa
GGGCTGACAGCAAGAATC
TAT
TACTCAGTTCTGCTGGAGCC
TGCCTCTCCCACCCATTTCCTCG
511
GCAAAGTCTCTAGAGAGGCC
CYP2E1
AAGCGCTTCGGGCCA
TGTTCACACTGCACCTTGGCTCAAGG
60
CATGCAGGACCACGATGC
AGGTCCATGGTGTTCAAGGATG
CAATGACTACATCGTCCCTCGGCACTG
HnF・4
Los
TCGAGGATGCGAATGGACA
CCCGATGTCACCCAGCC
CCCAAGGCGGCGCTTCTCAAC
Activin A
67
TTACCCACATGAAGCTTTCTGATC
TGGCCCCTGAGGAGCA
CTGTGCTGCTCACCGAGGCCC
P・actin
69
ATCTTTTCACGGTTGGCCTTAG
CAGAGTGCCGCTGTGGGT
Integrin n l ATCCTCCTGAGCGCCTTCGCG
73
GAGCCAATATAAGGAGCATTAGCAG
の 反 応 に お け るCt値
を 得,且8S い た 内 部
コ ン ト ロ ー ル のCt値
target・Ct l8S ribosomal ribosomal を サ ブ
RNAを
ト ラ ク
RNA冨Ct.)す
用
Bioscineces. ト (Ct
Paque る こ と に よ り
Plus USA)に
結 果 を 解 析 し た.
San Jose, USA)で
重 層
間 層 を 採 取
飽 過 し,等
(Amersham Biosciences, し,且8℃360 gで20分
し,HBSSで2回
4.ス
ト レ ス フ ァ イ バ ー(Stress 培 養 液 を 吸 引 し た 後,氷
ered sa且ine(PBS)で1回
ル デ ヒ ド(Sigma, 定
冷
し たphosphate St. Louis, USA)を
洗 浄 後, phalloidin(Sigma, (ECLIPSE buff・
ラtル
加 え,5分
Sし. Louis, USA)溶
重 晒
シ ュ に,lx且05圖
た.培
human 間 問
Systems, 識
液 を 加 え,窒
Systems, 洗 浄 し,90%グ7セ
ィ ッ
ラー ゲ ンゲ ル を 重 層 し
(fibroblast growth USA)と50 HGF(hepatocyte Minneapolis. factor-4)(RRD
ng/ml growth USA)を
recombi-
factor)(R&D
加 え た も の を 用 い,
毎 日 交 換 し た.
し た も の を 倒 立 型 蛍 光 顕 微 鏡
TE 300)(Nikon, Tokyo。
Japan)で
観 察
6.免
疫 染 色
初 代 培 養 肝 細 胞 を デ ィ ッ シ ー で 培 養 後,冷PBSで3
髄 細 胞 の.共 培 養
雌 悔EGFP(enhanced rラ
ラ ー ゲ ンゲ
細 胞 培 養 液 に20ng/m!recombinant
Minneapolis, Want human し た.
5.骨
FGF-4 し た,コ
し た.中
培 養 し た60mmデ
ず つ 撒 き,コ
養 液 は,肝
ム ア
I NS/mlのFITC標
間 反 応 後,PBSで3回
ロ ー ル/PBSを
観 察
洗 浄 し,4%パ
し た.PBSで3回
温 で1時
fiber:SF)の
Piscataway,
間 述 心
洗 浄
ル 上 に 初 代 培 養 肝 細 胞 をlLI間
量 のFicoll-
ン
ス
Hamamatsu. ジ
ェ
green ニ
・7ク
Japan)の
大 腿 骨
18Gの
針 を 差 し 込 みHBSSで
Nmの
セ
ル
ス
ト レ イ
ラ
fluorescent ・
ソ
ト (Nippon ー(40 Nylon.) Louis, USA)で20分
間 固 定 し た.0,2%Triton St, Louis, USA)/PBSにio分
ウ シ ア ル ブ ミ ン(Sigma, 30分
し 出 し た 細 胞 液 を40
Nm ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド(Sigma, (Sigma, SLC,
・脛 骨 の 両 端 を 切 断 し,
押
ナ
protein)
回 洗 浄 し,冷4%パ
(ウ
(BD
サ ギ 抗
Iwine, 一53一
間 浸 漬 後,3%
希 釈
ラ ッ ト ア ル ブ ミ ン 抗 体(ICN USA)、
X・100
St, Louis。 USA)ノPBSで
間 ブ ロ ッ キ ン グ し た.100倍
ニ ワ ト7抗GFP(green St,
室 温
し た 一 次 抗 体
biomedicals,
fluorescent
慶 日匹医 学 81巻.1号c,a.成16fF protein)抗
USA))で
体(Chemicon 室 温1時
浄 し た.100倍
体(Sigma, 体(Sigma, リ セ ロ ー ル/PBSを
微 鏡(ECLIPSE↑E FITC標
間3回
結
1.コ
洗 浄 し,
よ る 初 代 培 養 肝 細 胞 の 報 告 と 同 じ条 件 を 用 い た.肝
に 特 異 的 な 機 能 解 折 は,分
Tokyo, Japan)お
泌 蛋 白 と して.ア
培 養f:5'iへ の 分 泌 量 を 培 養 開 始 後25日
細胞
ル ブ ミ ンの
間 ま で 測 定 し,
0︽浸 E O≧茸 2
8 1 1 6 4 2 0
;2脚脚餐
了A▼
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○ ・
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myl
己自y g
6醐5 現 且 を'1ア
SQmal RNAを
ル タ イ ムRT-PCRで
用 い て 補 正 し,培
ドイ ・
アチ 群 と し て 培 鐙 開 始3日
ア ル ブ ミ ン,Bile P45011EIJ. 養 開 始1日
d巴》
非 サ ン ドイ ・
アチ 群 で 減 少 し,明
目 のnマ
pump(Bsep), ー カ ー のmRNA歴
TAT(tyrosine nuclear factor・4)のmRNAは.コ
ら か な オ…を 認 あ た.Activin る い は 不 変 で あ っ た の に 対 し,サ
傾 向 で あ っ た が,9kyン
測 定 し た.$mRNA量
は.内
・ ●●
ン ドイ7チ
群 でf3ど
陶9
6fの 比 較.培
餐細
ラー ゲ ン ゲ ルサ ン
コ ラ ー ゲ ン サ ン ドイ ッ チ 群 と 比 較 した,
aminotransfecase7. CYP2E](cytochrome
ラ ー ゲ ン ゲ ル サ ン ドイ ッ チ 群 で 発 現 蹟 が 増 加.
A.β ・actin,のmRNA発
現IIIt3,.非
ち ら も 減 少 し た. Intcarin nlは
ド イ ッ チ 群 で は 増 加 した.'く0.05."く0.DI 一54一
部 コ ン ト ロ ー ル に ラ ッ ト18S ribo・
に 対 す る 比 で 波 し た.コ
目 に コ ラ ー ゲ ンゲ ル を 亜 層 し た 検 体 を 用 い,非
salt export HNF4(hepa[ocyte d巴》
コ ラ ー ゲ ン ゲ ル サ ン ド イ ッ チ 法 で 培 養 し た 切 代 培 養 肝 細 胞 の 肝 特 異 的 マ ー カ ー 等 のmRNA 胞 のmRNA発
ea
6■ソ1
d.y 8
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.. .. ..
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5 属●92登 O︽2偲E の5 ﹄ε
H"F騨4
CYPtEI
己厘サ,
加,あ
ラー ゲ ン ゲル サ ン ドイ ッチ法
培 養 条 件 は こ れ ま で コ ラ ー ゲ ン ゲ ル サ ン ドイ ッ チ 法 に
よ び 共 焦 点 レ ー ザ ー顕 微 鏡(LSM510Ver.2.02)(Car1
第2図
果
識
重 層 した もの を 倒,'1型 蛍.光顕
300)(Nikon, 観 察 した
洗
St. Louis, USA))
間 反 応 さ せ,PBSで10分
Germany)で
激 ヒ ッ ジ抗
St.。
Louis., USA), ラ ビ ッ ト抗 ニ ワ ト リIgG抗
で 室 温1時
90%グ
間3回
希 釈 し た 二 次 抗 体(Cy3標
ウ サ ギ!gG抗
Zeiss, Oberkochen, International, Temecula,
間 反 応 さ せ, PBSで10分
3月)
YS.非
サ ン ドイ ・
・チ 群 で 増
サ ンF'イ
サ ン ド イ ッ チ 群(Wilcoxon ・
アチ 群 で 減 少
N[LY4[1検 定)
な肝 特 異 的 タ ンパ ク質 の 発 現 に つ い て は
mRNA_ilをRT・PCR法
を 用 い て 測 定 し た.
ア ル ブ ミ ンの 分 泌 量 は,初
代培 養肝 細 胞 を 単層 の コ ラー
ラ ー ゲ ン ゲ ル を 培 養 開 始 後3,
目 に 重 層 し た 群,重
層 し な い 群 に 分 け て,24
撃 鑑 ∵働
扇
の コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 上 に 培 養 し続 け た 群 で は 持 続 的 に ア ル
ブ ミ ン 分 泌 は 低 下 し た.培
養 開 始5日
ゲ ン ゲ ル を 重 層 した 群 で は,重
フ
} あ 、
少 し て い た ア ル ブ ミ ン分 泌 が コ ラ ー ゲ ン ゲ ル を 璽 届 し た
., :饗嚇
直 後 か ら急 速 に 上 昇 した.コ
斜 考.
差 を も っ て,単
・
、
目 まで に コ ラ ー
層 す る ま で は持 続 性 に減
ラー ゲ ンゲ ルを 菰 層 した肝
紐 胞 か ら の ア ル ブ ミ ン分 泌 は,電
門.
.
.一
髄
`
.
時 間 で 培 養 液 中 に 分 泌 さ れ る ア ル ブ ミ ン 量 を,ELISA
で 測 定 し た 培 養 液 中 の ア ル ブ ミ ン濃 度 で 比 較 し た.単
講 饗1
レ 三 、執
ゲ ン ゲ ル 上 で 培 養 し,コ
5,7,9日
ラー ゲ ンゲ ル内 初 代 培 養 肝 紐 胞 の 機 能 詳 優
;鳴.
`.融 、亀
そ の 他 のi要
難
井 口:コ
旛 後4日
し
へ
恥 贈 目か ら有 意
讃
,・ 煙 。
レ
駕 牌 三
'
c
0
▼` ,
層 の コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 上 に 培 獲 し続 け た 群
よ り 高 く な っ た.コ
ラ ー ゲ ン ゲ ル を 培 養 開 始5日
に 重 層 し た 場 合,重
層 後7日
の 後 も維 持 さ れ,最
大 鍛 は 培 養 開 始1日
目 に 最 大 分 泌aに
まで
第3図
達 しそ
目に重 層 した
コ ラー ゲ ンゲ ルサ ン ドイ ッ チ法 で 培 養 した 初 代 培
養 肝 細 胞 の ア ク チ ン線 維 分 布 の 比 較.培
光 顕 微 鏡 像(C,D).培
群 と 同 程 度 と な り維 持 さ れ た.培
層 し た 群 で は,重
養 開 始 後7日
目 に重
し て い た ア ル ブ ミ ン濃 度 が 上 異 し て く る も の の,そ
高 分 泌L}13,1日
目 に 重 価 し た 場 合 の1/4程
り 再 び 減 少 し は じ め た.9日
養 開 始3臼
サ ン ドイ ・7チし た場 合(B,D)13.ア
層 後 数 日 し て 検 出 レ ベ ル 以.下 ま で 低 下
養 開 始6日
位 櫓 差 顕 徴 鏡 像(A.B)とFITC・Phalloidin染
ち され た 毛 細 胆 菅(BC)が
目の
色 後 のx
目に コ ラーゲ ンゲル
ク チ ン線 維 で 襲 打
観 察 さ れ た が,サ
ン ドイ7チ
しなか っ た場 合(A,C)は,細
胞 は線 維 芽 細 胞 搬 にな り,
細 胞 内 に 充 満 し た ア クチ ン線 維(ス トレ ス フ ァ イ パ ー:
の最
度 に留 ま
SF)が
観 察 され た.対 物 レ ンXgO(o.
目 以 降 に 重 層 し た 場 合,ア
ル ブ ミ ン産 生 は 回 復 し な か っ た(第1・B図).
ア ル ブ ミ ン は 肝 特 異 的 タ ン パ ク 質 と して 電 要 な 指 標 で
肝 線 維 化 を 促 進 す るf乍用 が 確 認 さ れ て い るactivin Aは
あ る が,人
逆 に コ ラ ーrン
ゲ ル 重 層 後 そ の 発 現 が 減 少 し 重 層 後4
日 目 に は0.5倍
に 減 少 し た.同
工肝 臓 を 目指 す 上 で そ の 他 の 肝 臓 機 能 が 保 た
れ て い る か の 検 討 も重 要 で あ る.そ
RT・PCRの
手 法 を 用 い,コ
日 目 に 亟 晒 し た 場 合 と,重
こで リアル タイム
ラ ー ゲ ン ゲ ル を 培 養 開 始3
較 し た.内
部 コ ン ト0一
を 測 定 して,こ
し た.ア
ル ブ ミ ン は,重
ミ ンのmRNA量
と な っ た.activity Aお
よ び β・actinは い ず れ も 培 養 開
現 量 を比
始 後 い ず れ も コ ラ ーrン
ゲ ル重 層 す る ま で の 間 そ の 発現
は 持 続 的 に 減 少 し た.一
方,3日
層 し た 直 後 か らmRNA発
著 し い 増 加 が 認 め ら れ,コ
い て 重 要 な 役 割 を 持 っintegrin a]で
を比較検討
層 し な か っ た 検 体 で は,ア
重 層 し た 検 体 で は,重
が 増 加 し た.β ・actin線 維 が 接 着 す る 細 胞 接 着 装 置 に お
ル と し て ラ ッ ト18SmRNA量
れ と の 比 と して 各mRNA皿
を 壷 層 す る こ と に よ り,発
目に
era し な い 肝 細 胞 で は 発 現 が 持 続 的 に 増 加 す る(第2
現量の
上 の 発 現 量 と な っ た.肝
は コラーゲ ンゲル
ル ブ
ラー ゲ ンゲ ル を 重 暦 しなか っ
た 肝 細 胞 に 比 し14.5{q以
目 に はo .a倍
特異
層 しな か っ た 場 合 で,肝
的 マ ー カ ー を 始 め と し た い く つ か のmRNA発
掻 に 肝 細 胞 内 のP・actin
の 発 現 量 も 璽 届 後 速 や か に 減 少 に 転 じ4日
細胞
図).形
現 が や や 減 少 す る の に 対 し,
態 学 的 に も 初 代 培 養 肝 細 胞 は,コ
を 蟹 層 せ ず に 長 期 培 養 す る と,線
ラー ゲ ンゲ ル
維 芽 細 胞 様 に な り,い
わ ゆ る ス ト レ ス フ ァ イ パ ー(stress fiber:SF)と
よば
分 化 に お け る 後 期 マ ー カ ー と 言 わ れ るtyrosine
れ る ア ク チ ン線 維 が 細 胞 内 に 充 満 す る よ う に な っ た が ,
aminotransferase(TAT)は,コ
コ ラ ー ゲ ン ゲ ル で 重 層 す る こ と に よ り,こ
ラーゲ ンゲルを重層
し た 肝 細 胞 で は コ ラ ー ゲ ン ゲ ル 重 簡 後4日
開 始 時 の9.3倍
た.同
の 発 現 量 と な り,そ
目には培養
CYP2E且(cytochrome が 抑 制 さ れ た(第3図).
の レベ ル が 維 持 され
z.初
様 に 肝 特 異 的 転 写 調 節 因 子HNF・4(hepatocyte
nuclear factor・9)はL7倍,代
の形 態 的 変 化
謝 機 能 マ ー カ ー と して
P4501IE1)は3.3倍.胆
汁分
代 培 養 肝 細 胞 と骨 髄 細 胞 の1t培 養
未 分 化 な 細 胞 は生 体 肝 臓 内 に 移 植 す る こ と で肝 細 胞 へ
分 化誘 導 さ れ るの で,コ
ラー ゲ ンゲ ル サ ン ドイ ッチ 法 で
泌 機 構 胆 汁 酸 輸 送 分 子 で あ るbile salt export pump
培 養 した 初 代 培 獲 肝 細 胞 が,未
(Bsep)は2.1倍
化誘 導 で きる か 否 か を 検 討 した.骨 髄 細 胞 に 含 ま れ る多
で あ っ た.一
方肝細 胞の増殖 を抑制 し
一55一
分化な細胞を肝細胞 へ分
1"z(li:医.7一 出
A. Hepatocyte y 巻1」
」 ,F:成1.ti年;う
月!
(+)
l孝=亨
「
、緊
rギ ・
.
﹂
﹁-
1
■
﹁
π
.、 墨
、4象
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…?
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∫㌧ . ../..・.'l
r・'.層'F藁..・" ・
...・
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是.
■ 秘
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.湘..
、、O
...、.
粘'、
B. Hepatocvte (一)
巳
L
PGFP
,:・11'<] 1{GPPラ
Afbumin
コ ラ ー ケ'ン¥'/レ
→Lン
ト イ.'チ4三
をF;い
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≠二十nlに 量占;zili:1〔1瞬邑 とf'].止奪}…1Il}とL∫
〕,'i;t;養, ッ 1・.1'1'tEG#i119包
を コ ラ ー'∫「ン.ズ ル サ ン ド イ ・.'・
卜1ノ`をE目 い 一
百2;JI!kU'1E〔', 1'{:辛i]」F の コ 匡】二 一 力i多 散 槻 察 さat'こ, 養 珊 書 …1詩
辺 と,
フ.ミ ン'養 色 をffっ
た. GPI'i,
'1圃1.田
肛害UlaidトII躍
ξ〔'〕
1二
〔}FPI逃}聖 皇辛11]目
包書
二"臼'レ ブ ミ ンGs十 唖i等
目[li包
力i「F曳
禦 き オ.己
た 〔:,,. .i.i・
髄 紬 胞 塑 独 て コ ラ ー ゲ ン ゲ ル サ ン ドf.,・
'〆 ミ ン 嚢…現[土1:謬y,ら
7"レ
・,.ド トirelt}西
チ.法 をJiiい
て 培i1}:㍉1'る と,骨
宙鱈iヨ1杷け は と ん ど ÷ヒ滅L,残(sし
れ ∫∫カ・一・'こ {B〕. 財 字
勺 レ ン フ∴1[bl`、. Yi:GFP.,'1三lili柔{1, 赤:7ル:プ
た 矧 胞 に.プ,..
ミ ンilL駐'`三:=i13と
黄:E{≡FP・
'ヒ
冨ル ブ ミ ン 陽 性illi砲.
能 性 幹 柵 胞 か 捌.1舶
法 とLて.1・1Grを
胞 へ,in 方 法 か 用 い ら れ てEる
認 はRT・pCR法
vitroて
が,い
を11い
用 い て 培jl垂Lた
∫覧寸'る 二 と に よ`,, て お り,モ
Jラ
EGFPを
Lた
の 陽i'1:#'は
性 と な 一1た. 上.L較r内 妖
い き. ほ 【.c 2週1閏
をyI]5:る
辛置殖蝕力・目1=雫¥∼
醍 葺ま白 買 て 」㍉
の 中 に.1;;殖Lコ
2∫ 固1閉舞i過Lた
ロ ニ ー を 斤滅
1CI GFP陽
の い ず れ も ア ル ブ ミ ン ・;<色で
田 】, 眺 土.'1L寸一る こ と.ご,肝
網 漸包ヰ寺f白:」:Fi'i7Yア
rレブ ミ ン を 産 生.・ト る よ う に 分 化L .た.ま
かj3T114
デ 脹 サ ンrで
性 の 辛ill胞
す る 集 団 か 現 れ た ,ま
して
て い く つ かG}{,丘 ・
ヒLたGFP陽f『1皐[Elaz
の ゐ と な 一
・た.こ
と2週
ー ゲ ン ゲ ル で サ ン ド イ.ソ チ し た 初 代 培.縮 肝 細 距邑 と
骨 髄 羅 胞 を 共 培1肇 ■
・1.ると 、2 代 培 型i「;r.胞 を 入 れ ぢ か ・ユた コ ラ ー
陰 性 て あ ・.・
た. 、.た か つ 一
こ,.i.i'髄 珊 胞 ほ?]J代ii, ii'%肝寧lii鞄
にな るの か を 子
≡{.F寸Lた.
発 現 す る ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク ラ.,1・
・方,切
ゲ.ン ゲ ル で ・
サ.ン ド イ ワ チLた.1」1'髄 郭 「胞 は1欠 第 に 死 滅
コ ラ ー ゲ.ン ノ
ブルサ ン ドイ ・
ノ
三.のII[`fの
と こ ろ, コ ラ ー 犀
∫'.ンケ「ル サ ン ドf'.F.内.〔
辛
」】f/}島 養 」
∫ト=….…
…1腎
包 と .…
ヒLas養 L. '二・i.]』
崔「
」jm寺包 て.:生 ・1δ.:i`,IIゐi…
ミ
し5
初 代 培.養 呵1:w:胞 と ・1'1・
髄 佃 胞 をｱi;i
る ア ル ブ ミ ン を 発 現 す る.kう
法 を 与越子rLた
と.共 培 養=1.∈ム
ず れ も 肝 柵 鞄 へ の 分1ヒ のrl罰:
い こ と が 捌i測 さ れ る.我rrは
tliを
分 化 を 誘 導 す る ノ∫
添 η」i.i'る方C:,1陛i]胞
・.'チ法 に よ る 切 代 培 益 肝u胞
た,二Pラ
ー ケ「ン
け 「1昌
肺 僻 田胞 を
…
】1二Q.C唖
包 ト五2二5i fヒさ 土ナ る 機 祐旨を{yij♪tてL・ る こ と カr,而'1」
邑{さi.1
た,
た(第.1図
あ と で 一
バ ル ブ ミ ン に 支.1.ll.る免 庚 料1穀五fヒ.圏}1:
3f,
〕.
井 ロ コ ラー ゲ ンゲ ル 内 切代 培 養 肝 細 胞 の 機 能 評 価
き培 養 皿 上 で の 培 養 と同 じに機 能 が 失 わ れ るが,柔
考 案
い ゲ ル に 細 胞 を 撒 く と細 胞 は ゲ ル内 に埋 没 し肝 細 胞 の 機
能 を 維 持 す る と報 告 され たm.こ
肝 臓 は,薬 物 な どの 代 謝,ビ
の 輸 送 。排 泄,タ
らか
りル ビ ンな ど の胆 汁 中 へ
ンパ ク質 の 合成 とい っ た生 命活 動 に と
の 過 程 に お い て,細 胞
内 の ア クチ ン線 維 の 束 で あ る ス ト レス フ ァ イパ ー が 硬 い
ゲ ル 」二で は 発達 し細 胞 が 扁 平 化 す るが,柔
らか い ゲ ル内
り,き わ め て 重 要 な機 能 を 担 って い る.そ の た め肝 不 全
で は細 胞 は 凝 集 し伸 展 しな い.さ
とな る と,生 命活 動 が 維 持 で きず 致 死 的 と な る こ とが 多
着 す る 足場 の 構 造 で あ る接 着斑 が 硬 い基 質 で13多 く見 ら
い.こ の状 態 か ら救 う ため に,血 漿 交 換 や生 体 肝 移 植 が
れ る よ うに な る.こ の こ と は細 胞 内 の シ グナ ル伝 違 系 に
行 わ れ て い るが,高 コ ス ト,感 染.ド
らに は細 胞 が 基 質 と接
ナ ー不 足 を は じめ
も,大 き な 影 響 が あ る と考 え られ る.一 方 コ ラ ー ゲ ンゲ
とす る多 くの 問題 が あ り,今 後 これ らの 方 法 に 頼 る こ と
ル内 に埋 没 した場 合 この接 着 斑 は 大 き く変 化 しな い.我 々
が 難 しい状 況 に あ る,肝 臓 は 旺 盛 な 蒋 生 能 力 を 有 す る と
の検 討 で もイ ンテ グ リ ンは コ ラ ー ゲ ンゲ ルLに 肝 細 胞 を
い う優 れ た特 徴 が あ るが,一 度 生 体 外 に 取 り出 す と肝 細
培 養 した場 合 に は 増 加 す るが,コ
胞 と しての 機 能 ・特 徴 を急 速 に失 い再 生 能 力 も喪 失 す る.
る こ と に よ り逆 に 減 少 す る こ とが 確 認 され た.
この点 が成 熟肝 細 胞 を再生 医療 に用 い る場 合 に陳害 とな っ
ラ ー ゲ ンゲ ル を 敵層 す
我 々は肝 臓 を生 体 外 に取 り出 す こ とに よ り肝細 胞 が 失 っ
て い る.そ こで肝 前 駆 細 胞 を 再 生 医 療 に 用 い る 可能 性 が
た機 能 が,適
検 討 され た.現 在 まで,肝 臓 内 に お け る再 生 能 力 の 検 討
か ら肝 臓 内 に は 小 型 肝 細 胞,oval cellな ど の 増 殖 性 の
戻 す こ とが 出 来 る のか 否か と い う問 題 に つ い て検 討 した.
バ イ オ人r _肝臓:BALの
開 発 に お い て, Demetriou"や
高 い肝 前駆 細 胞 が報 告 され た.し か しこれ らの 単離 方法
Sussmanie'の
は未 権 立 で あ る.胎 児肝 か ら肝 前 駆 細 胞 を単 離 す る方 法
代 謝 能 が 低 く,胆 汁 酸 の 排 泄 機 能 が な く,長 期 間 の培 養
が 検 討 され,single cellか ら肝 細 胞 と胆 管 上 皮細 胞 の2
に よ り機 能 が 低 下 して い く ことが 問 題 で あ った.ま
方 向 へ 分 化 で き る こ とが 確認 さ れ て い る4n.し か し胎 児
肝 細 胞 は培 養 の 過 程 で 形 態 が 線 維 芽 細 胞 化 して い く.線
肝 の 利 用 は 倫 理 的問 題 が あ り実 用 化 は難 しい と 考 え られ
維 芽 細 胞 は一 般 に 閻 葉 系 細 胞 で や や未 分 化 な細 胞 と考 え
る,
られ て い る.従
臨 床応 用 可 能 な肝 臓 を生 体 外 で 再構 成 させ る ため には,
る可 能 性 が あ る.も し分 化 す る こ とが 出 来 るな らば,そ れ
肝 細 胞 の 増 殖 と機能 維 持 を いか に長 期 間 可 能 とす るか が
は肝 細胞 の分 化 機 構 の 検 討 に も有 用 とな る と考 え られ る.
最 も重 要 な課 題 で あ る.ri.こ の課 題 の 解 決 に向 け た 第 一
本 研 究 で は,単 層 の コ ラ ー ゲ ンゲ ル上 で 肝 細 胞 を培 養 し
歩 は,肝 細 胞 や そ の 前駆 細 胞 の培 養 条 件 の 検 討 で あ るui.
て 肝 細 胞 の 機 能 を失 わ せ て か ら コ ラー ゲ ンゲ ル で壷 層 し
肝 細 胞 は生 体 外 に取 り出す と比 較 的 早 期 か ら線 維 芽 細 胞
機 能 の 変 化 を観 察 した.そ の 結 果,培 養 開 始 か ら5日 目
様 に形 態 が 変 化 し機能 上 も肝 細 胞 と して の特 質 を 失 う.
まで は肝 細 胞 と して機 能 を 回 復 す るが その 時 期 を過 ぎた
当 な 環 境 下 で 培 養 す る こ と によ り再 び取 り
装 置 が 開 発 さ れ て い る が,い
ず れ も藁 物
た,
って適 当 な 条 件 に お け ば肝 細 胞 に分 化 す
この 変 化 を防 ぐた め様 々 な検 討 が な され て きた,液 性 因
もの は コ ラ ーゲ ンゲ ル の 重 層 の み で は肝 細 胞 の 機 能 を回
子 の 検 討 か ら,dexamethazone"', 復 す る こ とが で き なか った.ま た,代 謝,蛋
EGF(epidermal
白質 合成,
growth factor)X51, insulin'"'など が肝 細 胞 の 機 能 維 持 に
胆 汁 酸 排 泄 とい った肝 細 胞 の非 常 に 重 要 な 機 能 は い ず れ
重 要 で あ る ことが わ か った.ま た,コ
ラー ゲ ンな どの 細
も コ ラー ゲ ンゲ ル のm 培 養 で は速 や か に 失 わ れ,重 層
胞 外 マ トリ ック ス も細 胞 の接 着 性 の向 上 の み な らず 機 能
す る こと で これ も速 や か に回 復 した.そ の 逆 に,細 胞 骨
維 持 の 点 か ら も重 要 で あ る こ とが 確 認 され た細.さ
らに
格 特 に ア クチ ン線 維 と これ に結 合 す る 接 着 装 置 は いず れ
細 胞 の 足 場 と して の 構造 を よ り生 体 に近 い環 境 に す る横
も コ ラー ゲ ンゲ ル単 層 上 で の 培 養 で は増 加 し.重 層 す る
討 が な され た.多
つ細 胞 外
こ とに よ り減 少 した.こ の 事 実 は細 胞 外 マ ト リ ック ス と
マ トリ ック スと して の機 能 の 点 か らコ ラ ー ゲ ンゲ ル が比
そ れ を 足 場 に す る イ ン テ グ リ ンか ら の 情 報 伝 達 機 構 が
較 的 早 くか ら検討 され て き た.コ ラ ー ゲ ンゲ ル を培 養 基
細 胞 の 形態 と機 能 を リ ン ク させ て コ ン トロ ー ル して い る
質 と して 再生 医 療 に応 用 した 例 もあ る.線 維 芽 細 胞 を コ
こ とを 示唆 した.肝 細 胞 骨 格 と肝 細 胞 機 能 の関 係 は 肝 細
ラー ゲ ンゲ ル 内 で培 養 す る とゲ ル 自体 が 収 縮 す る.こ の
胞 の特 徴 的 な形 態 で あ る,毛 細 胆 管 の 収 縮 機 構 の 検 討 に
過手
呈は真 皮 の モ デ ル と して バ イオ 人 工 皮 膚 に 応 用 され て
お い て 報 告 され て い る.M.」. Philipsら は 毛 細 胆 管 周
い るMI.肝
細 胞 培 養 に お い て は コ ラ ー ゲ ン ゲ ル の 硬
囲 の ア クチ ン線 維 の 束 を 見 い だ した19',.これ が 肝 細 胞 の
度 を調 節 す る こ とに よ り機能 の維 持 が 変化 す る こ とが 示
胆 汁 分 泌 機 撒 こお い て 重 要 な役 割 を 果 た す こ と,こ の ア
され た.す な わ ち,ゲ ル が硬 い と細 胞 は ゲ ル 上 に 張 り付
ク チ ン線 維 の 傷 害 が胆 汁 分 泌 機 構 の み な らず細 胞 全 体 の
くの 水 を含 み 柔 軟 な材 質,か
一57一
慶 源 医 学 8且巻1号(}成16sY 3月)
傷 害 を引 き起 こす こ と,細 胞が 障 害 さ れ る こと 自体 が 毛
細 胆 管 周 囲 の ア クチ ン線 維 の傷 害 を引 き起 こす こと を示
総 括
した.こ の こ とは細胞 の 機能 と細胞 骨 格 が密 接 に っな が っ
て い る こ と を 示 す.以
上 の こ と か ら以'ドの3点
が 示唆
コ ラー ゲ ンゲ ルサ ン ドイ ッチ法 を 用 い た 初 代 培 養肝 細
され た.① 肝 細 胞 機 能 は細 胞外 マ トリ ック スに よ る情 報
胞 の 機 能,分 化 湧 導 能 に つ いて の 検 討 を 行 い以 下 の結 果
が 非 常 に重 要 な役 割 を 果 た して い る.② 肝 細 胞 の形 態 に
お い て 細 胞 内 ア ク チ ン線 維 の分 布 と それ に っ なが る細 胞
i.単 層 の コ ラ ー ゲ ンゲ ル上 で肝 細 胞 を 培 養 す る と,
接 着斑 の 分 布 が 重 要 で これ が細 胞 外 マ トリ ック ス に よ り
調 節 さ れ て い る.③ 肝細 胞 は細 胞 外 マ トリ ッ クスが 適 当
で な い と脱 分 化 し,し か も非 可逆 的 な変 化 を来 す可 能 性
が あ る.以 上 の 点 か ら,培 養開 始5日
を 掲 た.
肝 細 胞 は肝 特 異 的 機能 を 失 った.
2.培 養 開 始 後 一 定 期 間 単 層 コ ラ ー ゲ ンゲ ル で 培 養 し
た 後,コ ラー ゲ ンゲ ルで 重肋 し機能 の変 化 を観 察 す る と,
目以 降 に お こ る非
培 養 開 始 か ら5日 目 まで は肝 細 胞 と して 再 び機 能 を回 復
可 逆 的 変 化 にお い て量 要 な因 子 の 同 定 が で き れ ば肝 細 胞
した が,そ の時 期 を過 ぎた もの は コ ラー ゲ ンゲ ル の 重層
の 機 能 維 持 に璽 要 な因 子 が解 明 さ れ る可 能 性 が あ る と考
の み で は肝 細 胞 の 機能 は 回 復 しなか った.
え られ る.
3.代 謝,蛋
再 生 医 療 に応 用 す る場 合,分 化 した肝細 胞 を利 用 す る
こ と と併 行 して 未 分 化細 胞 を利 用 す る方 法 が あ る.未 分
非mに
白質 合 成,胆 汁 酸 排 泄 と い っ た肝 細 胞 の
重要 な 機 能 は い ず れ もコ ラ ー ゲ ンゲ ルの 単 層 培 養
で は速 や か に 失 な わ れ,重 面 す る こ とで これ も速 やか に
化 細 胞 を移 値 細 胞 と して 応 用 す る検 討 はす で に心 筋 の 再
回i3!した.逆 に,細 胞 骨 格特 に ア ク チ ン線 維 と これ に 結
生 に お いて は積 極 的 に行 わ れ て い る501.し か し未 分 化 な
び つ く接 着装 逝 は い ず れ もコ ラー ゲ ンゲ ル単 層 上 で の 培
細 胞 を一 定 の 方 向 に分化 さ せ る人 工 的 に統 合 され た方 法
養 で は増 加 し。 重層 す る こ と に よ り減 少 した.
は な いの が 現 状 で あ る.い わ ゆ る局所 的 レベ ルで の 分 化
4.コ ラ ー ゲ ンゲ ル サ ンKイ
ッチ 法 を 応 用 した肝 細 胞
誘 導 は成 功 例 の 報 告 が 見 られ るが,未 分 化 細 胞 を分 化 誘
初代 培 養系 が,少
導 す る手 法 の 主 流 は幹細 胞,あ
し,骨 髄 内未 分化 細 胞 を,肝 細 胞 様 機 能 を 有 した 細 胞 に
る い は前駆 細 胞 を直接 標
的 臓 器 に注 入 して 周 囲 の環 境 に さ らす こ と に よ り目然 に
分 化 誘 導 す る方 法 で あ る.肝 臓 の 再生 に お い て も ES
な くと も生 体 内 の 肝 臓 に近 い機 能 を 有
分化 誘 導 す る能 力 を持 うて い た.
5.バ イ オ 人 工 肝 臓:BALに
細 胞,骨 髄 細 胞 な どが応 用 され て 肝細 胞 へ の 分 化 が確 認
未 分 化 細 胞 を応 用 す る可
能Mk:が示 唆 さ れ た,
され て い る.し か し臓 器 へ の移 櫃 す る こ と に よ る分 化 誘
導 は未 知 の 力 に ゆ だ ね る手 法 で,そ の 機序 の 解 明 は難 し
以 上 の 結 果 は肝 不 全 治 療 法 の 開 発 に お いて 重 要 な 発 見
い.そ
こでin"f鱒
で あ り,今 後 も臨床 応 用 にお い て 有 用 で あ る.
る.我
々 は 未 知 の 力 をin躍mで
で 分化 させ る方 法 の確 立 が 求 め られ
利 用 す る こ とで 未 分
化 細 胞 を 分 化 誘 導 す る方 策 と して,長 期 の 初 代 培 養 系 を
本稿 を終 え るに あた り,ご 指 導 とご校閲 を賜 った優陰 義
利 用 した.初 代 培 養 系 の 問題 点 は長 期 永続 的 に培 養 を 続
塾 大学 医学 部 内 科学 教 室石 井 裕正教 授 に深 く感 謝 いた しま
け る こ とが 困 難 で あ る点 で あ る.本 研究 で は コ ラー ゲ ン
す.ま た.本 研 究 に際 し,直 接 ご指導 いただ い た慶 晒義 塾
ゲ ル で 長 期 に 初 代培 養 肝 細 胞 を 維 持 す る こ とに よ り,こ
大学 医 学 部内 科 学教 室 棄俊 文謝 師,ご 協 力 い ただ い た研 究
れ と 共 培 養 した 未 分化 細 胞 が肝 細 胞 へ 分 化 す る こ とを 示
室 員各位 に心 か ら感 謝 いた します.
した.こ の 事実 は,こ の初 代 培 養 系 が 少 な く と も生 体 内
の 肝臓 に近 い 機能 を 有 し,未 分 化 細 胞 を 分 化 誘 導 す る未
文 献
知 の 力 を 持 って い る こと を示 して い る.ま た,こ の 系 が
1)Strain 有 効 に利 用 され れ ば,未 分 化細 胞 を 一 定 の 間 隔 で 補 充 す
A1, Neuber8er of the art. Science る こ と に よ り,永 久 的 に利 用 で き るバ イ オ人 工 肝 臓 が 可
2)川en」W, 能 に な る と考 え られ る.以Lの
bioarli`icia日iΨer 2001
点 は人 工 肝 臓 構 築 を 目指
す.1二
で画 期 的 で あ る,今 後,初 代 培 養 肝 細 胞 を共 培 養 し
た未 分 化 細 胞 が どの 程 度 の 肝機 能 を有 しど の程 度 のreuse
Hassanein 3)Hui T. Roaga support. 培 養 が 可能 で どの(i度 増殖 す る能 力 を有 す るか につ いて
2001
の検 討 が必 要 と思 わ れ る.
A)Krasteva 一58一
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Iiver
井 口=コ
support systems一
lachment, 一investigations morphology on ラー ゲ ンゲ ル 内 初代 培 養肝 細 胞 の 機能 評 価
and growth. hepatocyte Morcau aP
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J
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RP, Nagy P. Marsden E, Thorgcirsson relationship cells and hepatocytes exists in rat liver. Carcinogenesis stem oval cell marker cells express Thy-1 antigens nges upon M, Kaku nal metaplasia T. Medline as a common 23)Hamazaki T, liboshi Lab Invest Zon infarcted 27
H. Ahrens stem cells into MS, TR. Rossi [he pancreas. 15)Deng IK:Hepatic Semin J. Steindler BE, Bowers JG,
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transditfcrentiation Laywell in
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from Y
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M, M, Akaike 一59一
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Biochem
慶 態 医 学 8L巻
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一60一
LA:Hope for a broken heart?Cell 114