Title 有毒渦鞭毛藻類における麻痺性貝毒原因毒素に特異的な 硫酸基

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有毒渦鞭毛藻類における麻痺性貝毒原因毒素に特異的な
硫酸基転移酵素に関する研究( Dissertation_全文 )
吉田, 天士
Kyoto University (京都大学)
1999-01-25
https://doi.org/10.11501/3147485
Right
Type
Textversion
Thesis or Dissertation
author
Kyoto University
U
有毒渦鞭毛藻類における麻痩性貝毒原因毒素に
特異的な硫酸基転移酵素に関する研究
S
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吉田天士
1998
一次
第 1章
緒言
第 2章
各海域から分離された
および
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A
P毒成分組成 比の地域
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A
性
J
第
3章
1に
2
P毒 の N
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mからの P
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硫 酸基 を付加する 酵素 (
)の精製とそ の性質
T
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第 4章
aからの麻癖 性貝毒硫酸
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x
lθ'
A
P
S
Tの精製とそ の性質なら びに P
S
N
Tの分布
S
原因渦鞭毛 藻類におけ る N
基 転移酵素
第 5章
X
T
m からの ll-hydroxyS
u
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tθn
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G
を基 質 とする硫酸基 転移酵素の 精製 とその性質
Tの分
S
P原因渦鞭毛 藻類におけ る Q
S
ならびに P
布
第
6章
P母
S
mの日周期に おける P
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G
T比活性の変 動
S
ー とN
第 7章
謝辞
参考文献
著者関連文 献
総括
第 1章
緒言
近年の活発な 産業活動に伴 う多 量の工業廃水 や 生活排水は、 海洋や湖沼の
富栄養化を引 き起こしてい る。水系の 寓栄養化は微 細藻類の異常 増殖による 着
)。
7
9
9
色現象、すな わち赤潮を招 き、水産業に 甚大な被害 を及ぼしている(岡市 1
赤潮による被 害形態として 、増殖魚介類 の大量弊死や 、有毒微細藻 類による魚
介類の毒化が知られている。後者は日本のみならず世界中で頻発しており
)、また、着色 現象を伴わな い非常に低密 度で発生した 場合
5
9
9
f1
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g
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H
(
でも魚介類を 毒化させ、こ れを摂食する ことで人間に 直接被害が及ぶことから
)。
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より深刻な問 題となってい る (
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P
毒化した魚介 類の摂食によ る食中毒とし て、麻痔性貝 毒 (
)、
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)、下痢性貝毒 (
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)、 記 憶 喪 失 性 貝 毒
P
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(
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) およびシガテ ラ (
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A
(
m属のいくつかの
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)。その中でも A
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9
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H
報告されてい る (
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0
3
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mなどの渦鞭毛藻類は、 1 リットル当たり 2
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種や G
神経性貝毒
細胞という低 濃度でホタテ 貝やカキなど の 二枚貝の毒化 引き起こし、 近年では
0年
7
7
Pの発生は北米で 1
S
0P
)
2
8
9
Pが発生している。(大島 1
S
毎年のように P
)、現在北米の みならず、チ リ南
7
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9
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S
代に初めて記 録され (
) さらにオース トラリアでそ の発生が報告 され
4
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部、南アフリ カ (
5 年以来北海道 や東北
7
9
)。わが国においては、 1
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ている (
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O
の三 陸 海 岸 な ど の 北 日 本 で 二枚貝の毒化 現象が顕在 化しており (
3年からは広島湾のカキにおいて
9
9
)、 1
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2，H
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もその発生がみられるようになり、その発生も西日本にまで及んでいる
) 。現在のとこ ろ貝類の毒化 は全国的に
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2，N
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(
厳重に監視さ れており、毒 化した貝の摂 食による中毒 の発生件数は 過去に比べ
て著しく減少 した。しかし 、許容レベル を超えて毒化 した貝類は出 荷・流通が
禁止されるた め、カキやホ タテなどの貝 類の養殖をは じめとする水 産業に与え
)。また、最近 では貨物
5
8
9
る被害は甚大 なものとなっ ている(小金 沢と小谷 1
船が船体の安 定化のために 積み込むパラ スト水中に有 毒微細藻類の シスト(休
眠接合子)が 混入し、有毒 種の伝搬が行 われているの ではとの問題 も新たに提
P
S
)、その P
5
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3，1
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8，H
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H
起されており (
の分布域の拡大の原因の解明は急務となっている。
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m属の種や G
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x
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P毒)は、 A
S
Pの原因となる毒素(以下 P
S
P
などの渦鞭毛 藻類以外にも 、珊瑚礁に生 息するカニ、 巻き貝、石灰 藻やラン藻
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STX
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G1χ3
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H
CONH
2
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CONHS0
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文3
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OS03-
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o泊IlS.
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Fig.l・1 Structureofparalytics
もamoy
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dc:decar
neoSTX:neosaxitoxin，
泊t
gonyauto羽n，
GTX:
o泊n，
STX:sa
P毒産
S
) が報告され、 P
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9
9
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と貝類の毒化が必ずしも相関しないことはo
生が有毒渦鞭毛藻類の遺伝的形質であることについて疑問が投じられた。さら
C蛍光分析に供
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P
eの培養液中から分離された細菌抽出液を H
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a
m
、 A
a
に
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P毒産
S
4 に一致するピークが認められたことから細菌による P
したところ、 C
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0，F
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8，K
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K
生説が提唱され (
7年に
9
9
)、P
5
9
P原因生物についての議論は一次混乱した。しかし、 1
9
S
.1
al
4を示すピ
スペインで開催された第八回国際有害プランクトン会議において、 C
oa
t
a
S
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n
P毒成分でないとの発表 (
S
ークをマススペクトル解析を行った結果 P
P毒生産説は疑問視されている
S
) が行われ、細菌による P
7
9
9
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S
aの完
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eおよび A
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)は、従来困難であった A
8
8
9
1
左子ら (
全な無菌・クローン株を多数分離し、その生活環を明らかにしてきた。その結
果、各クローン株は二分裂により無性的に栄養増殖を繰り返すこと、また接合
.
eと A
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a
m
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.t
実験 により各クローンの交配型が決定できたことから、 A
tθ'
a
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aの生活環にはヘテロタリックな有性生殖と無性生殖が共に存在する
l
l
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ことが確認された。
m属の培養
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l
P毒に関して、これまでにも A
S
一方、本藻の産生する P
の増殖段階における毒量及び毒組成の変動について数多くの報告がなされてき
0P
)
2
9
P毒は、強力な 一群の神経
9
S
からもその存在が報告されている(大島 1
毒で、 すべて特異な 三環性の骨格を有する低 分子化合物であり側鎖構 造の差異
r
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7，B
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7，B
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(
)。それらの
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8， And
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P毒量は一般に対数増殖段階で急上昇
S
いずれによっても、細胞当たりの総 P
X)
T
G
:
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)やゴニオトキシン (
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X
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T
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G
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x
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a
S
によりサキシトキシン (
0種余りの成分があり、渦 鞭毛藻類の藻体内にはい くつかの成分が同時
など 2
し、以後、時間の経過に伴い減少する傾向が認められている。この変動は、細
) と異化作用や培養液中へ
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s
0
n1
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胞分裂による娘細胞への 毒の分配 (
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)(
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7，
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S
に含まれていることが明 らかとなっている (
)。またそれぞれ比毒性は 異な
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9，
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3，O
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m
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P毒生合成量との差を反映して
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s )といった損失の総量と P
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s
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の漏出 (
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おり、対数増殖期には後者が前者を上回るためだと考えられている(And
P
S
eを用い、 P
s
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)。また、つい最近になり高度に向調化した A
a
0
9
9
1
.
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a
た
)と同様に生体膜
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i
x
o
t
o
d
o
r
t
e
T
るものの、いずれもフグ毒テ トロドトキシン (
のナトリウムチャンネルを特異的に阻害する作用を有することから、薬理学な
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7，
n
5
a
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c
S
(
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)。しか
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c
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S
Pの
S
しながら、原因、藻の無菌地養の困難さ、増殖の緩慢さ等の原因により、 P
らびに生理学的研究においても注目されている
貞の原因を解明する立場 にある生物学、生化学的 側面からの研究は立ち後 れて
おり、とりわけ毒の生合 成経路についての知見は ほとんど得られていない のが
現状である。
1期のみに行われる
毒の生合成が構成的に行われるのではなく、細胞周期の G
)。
7
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ke
1
u
b
n
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d
1
0
n
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h
c
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o
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T
ことが報告された (
7，
8
9
6，1
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B
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一方 、毒組成に関しては 一定であるという報告 (
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9
9
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1
ta
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s
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)と、変化するという報告がある(And
7
8
9
.1
l
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1
1
e
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C
) 。これは培養株や培養条 件あるいは分析法が不
8
8
9
.1
l
ta
re
a
z
c
o
a，b， B
統ーであることに加え、特にそれらの実験に用いられた培養株のほとんどが無
)は
a
3
9
9
1
.
、 A
m ら(
i
菌株ではないことが原因 であると考えられた。そ こで K
ae
t
a
)や現場海域中での A
g
7
O
8
9
eのブルームの消長
s
n
e
r
.1
a
1
m
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ること (
ta
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aの無菌・クローン株を確立し、各増殖段階におけ
l
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eと A
s
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e
r
a
m
a
t
P毒量は変化す
S
る毒量と毒組成の変動を詳細に調べた結果、 一細胞あたりの P
)
2
9
9
1
るもののその組成はほぼ一定であることを明らかにした。さらに、左子ら (
2
3
eの培養株の同 一有 菌クロ
s
n
e
r
a
m
a
.t
さらに近年になって、有毒種である A
ーン培養に由来する複数 のサブクローン聞におい て大きな毒量の差異がみ られ
P毒組
S
はこれらの藻類がヘテロタリックな有性生殖を行うことを利用して、 P
成の異なる親株同士の交配によって得られた子 株の毒組成を分析した。その結
⑪¥中立¥2
也き人件色/久' C
P毒組成比を有する子株がそれぞれ 1:1の割合で出現し、
S
果、親株と同じ P
)遺伝によって子株ヘ伝達されることを確認した。
l
a
t
n
e
r
a
p
i
b
毒組成は両親性 (
P毒組成比を決定する遺伝因子は、藻体自身の染色体に組み込
S
このことより P
まれていることが示唆された。またその後、藻体 が有する毒組成比を比較する
と、分離された地域によって毒組成比が異なり、個体群の識別マーカーになり
4，
9
9
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l
ta
ne
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b，A
0
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9
1
.
l
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K
うるのではとの報告がなされた (
A遺伝子の塩基配列やモノクロー
N
R
r
S
6
、 1
)。その 一方 で
3
9
9
.1
l
ta
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m
i
h
s
O
ナル抗体を用いた有毒種の分子生物学的あるい は生化学的手法を用いた分類法
)、これらの手法を総合
4
9
9
a，b， 1
3
9
9
.1
l
ta
ie
h
c
a
d
A
も確立されつつあり (
P 毒組成比が前述の有毒種の人為的伝播を追跡す るため
S
的に用いることで P
のマーカーになるのではと期待されている。
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a
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a
h
p
P毒の生合成について、有毒ラン藻 A
S
これまで、 P
P毒基本骨格がアルギニ
S
I標識した物質の取り込み実験が行われ、 P
について R
e
t
a
r
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Rl
R2
R3
文
1
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2Schemeo
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dGTX2+3組 dp
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mPAPSt
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GTX5組 dC1+2，r
3，
9
9
u1
z
i
m
i
h
S
ン、メチオニンおよび酢酸に由来することが明らかになっている (
STX
)。前述した有毒種の伝播を追跡する上でも、ま た、今なお元来プランク
6
9
9
1
トンフィーダーではないカニや巻き貝などを毒化させる生物種が不明であり、
P毒の生合成系酵素をコードする遺伝子をプーロブ
S
これらを特定する上でも P
P毒
S
として用いることは非常に有効な手段であると思われる。しかし、その P
P毒の生合成系酵素
S
生合成の中間体については全く知見が得られておらず、 P
P 毒の側鎖構造に
S
群を解明することは現在のところ不可能である 。ここで P
3位のカルパモイ
1
、 C
H化
1位の O
ついて注目してみると、基本骨格に対する N
H
1位への硫酸基の付加反応等が存在
2
4のカルパモイル基の N
1位及び R
1
ル化、 0
OH
P 毒組成比は、これらの反応の量的な差異あるい は有無
S
o P
)
1
1
.
g
i
F
する (
P毒組成比を決定する因子が藻
S
で決定されると考えられるが、上述のように P
体自身の遺伝情報によるものとするならば、こ れらの反応は酵素反応にもとづ
/
PAPS
同NOC
PAP
ySTX
x
o
r
d
y
h
s
，
d
11
TT
，
"
"
.
u
m
くものと推測される。また、分離される地域によって藻体の持つ毒組成に差異
がみられるのは、各酵素の有無や、あるいはその 比活性・発現量等に差異があ
人
7
NH
GTX2+3
るとすれば理解できる。
6などの
X
T
5 および G
X
T
4や G
l
1位に硫酸基が付加した C
2
特に、藻体には N
4 など
1
X
T
1位に硫酸基を付加した G
1
-スルフオカルパモイル毒群あるいは 0
N
.
l
ta
ae
m
i
h
s
5，O
9
9
.1
l
ta
oe
k
a
a，b，S
3
9
9
1
.
l
ta
me
i
K
の成分が多く含まれる (
)。硫酸基付加反応は、晴乳類においては、ステロ イドホルモ
3 a，b
9
9
0，1
9
9
1
fO-ST
no
o
i
t
c
ea
h
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3 Schemeo
.1
g
i
F
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x
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t
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c
c
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1
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1s
1
0
.
3
X2+
sGT
e
c
u
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yS1χandp
x
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r
d
y
H
1
f1
1o
1
o0
t
ンやフェノールなどの生理活性物質の解毒および代謝に関わっていることが明
4
5
m
u
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b
l
i
h
s
n
i
e
6，W
9
9
y1
o
dR
n
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k
k
i
4，R
9
9
a1
m
m
o
dH
n
ia
u
s
t
a
M
らかになっている (
)。すな わちこ の反応 は、硫 酸抱合 と呼ば れ、こ れらの 物質の アミ
7
9
9
.1
l
ta
e
める
ノ基や 水酸基 に硫酸 基を付 加する ことに よって 、不活 化させ 、水溶 性を高
酵素
ことに よって 体外へ の放出 を容易 にする 。この 反応を 触媒す る硫酸 基転移
)を
S
P
A
P
e(
t
a
f
l
u
s
o
h
p
s
o
h
p
'
e5
n
i
s
o
n
e
d
a
o
h
p
s
o
h
p
'
は、細胞質画分に存在し、 3
硫酸基の供与体として利用する。
加
このよ うに高 等動物 におけ る薬物 代謝で の重要 性を考 慮する と、硫 酸基付
P毒の生 合成あ るいは 代謝に おいて 重要な 反応過 程であ ると期 待され
S
反応が P
体ク
る。ま た、硫 酸基付 加反応 の基質 と産物 ともに 、すで に確立 された 高速液
P毒の分 離・定 量法に よって 比較的 容易に 測定で
S
ロマトグラフィーを用いた P
P毒に硫 酸基を
S
)、本研 究では この P
9
8
9
4，1
8
9
1
.
l
ta
ae
m
i
h
s
O
きることから (
.
産 G
付加す る反応 を触媒 する硫 酸基転 移酵素 に注目 した。 その結 果、ス ペイン
1 位 に 特 異 的 な 硫 酸 基 転 移 酵 素 (N
2
3の N
+
2
X
T
Xと G
T
1 より S
s
U
t
a
n
e
t
a
c
1 位に特
1
Xの 0
T
yS
x
o
r
d
y
h
β
α，
1
)と 1
2
1
.
g
i
F
)(
T
S
:N
e
s
a
r
e
f
s
n
a
r
t
o
f
l
u
s
)を見出した。
3
1
.
g
i
F
)(
T
S
e :O
s
a
r
e
f
s
n
a
r
t
o
f
l
u
s
O
異的な 硫酸基 転移酵 素 (
P毒合成 系に関 与する 酵素と しては 世界で 初めて 見出さ れ
S
これらの酵素は、 P
P毒の生 合成を
S
たものであり、これらの酵素の特性を明らかにすることは、 P
れら
解明し ていく 上で極 めて重 要であ ると思 われる 。そこ で、本 研究で は、こ
比較
の酵素 を精製 し、性 質を詳 細に調 べ、さ らに異 なる属 の種間 でのそ れらを
することを主な目的とした。
第 2章
各海域から分離された
eおよび
s
n
e
r
a
m
a
.t
A
P毒成分組成比の地域性
S
aの P
l
l
e
n
e
t
a
.c
A
P )は、有毒渦鞭毛藻をプ
S
g :P
n
i
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s
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hp
s
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f
l
l
e
h
cs
i
t
y
l
a
l
a
p
麻痩性 員毒 (
た貝を 人が
ランク トンフ ィーダ ーであ る 二枚貝 が摂食 し毒化 する現 象で、 毒化し
生上 問
食する とふぐ 中毒に 似た高 死亡率 の食中 毒を引 き起こ すこと から、 食品衛
Pの原因藻とし
S
0P
)
3
9
9
a1
l
l
e
b
m
e
dC
n
ya
a
w
m
u
h
0，S
9
9
y1
a
w
m
u
h
S
題となっている (
mは、世 界各
u
t
a
n
e
t
a
mc
u
i
n
i
d
o
n
m
y
m属の種 や G
u
i
r
d
n
a
x
le
て知ら れる渦 鞭毛藻 A
P による被害地域も年々広
S
地の沿 岸域で 毎年の ように 繰り返 し発生 し、さ らに P
P
S
)。この P
6
9
9
f1
f
e
a
r
g
e
l
I
a
dH
n
ya
b
g
i
5，R
9
9
1
3，
9
9
f1
f
e
a
r
g
e
l
l
a
H
域化している (
接合子 )
の広域 化につ いては 、大型 船のパ ラスト 水中有 毒渦鞭 毛藻の シスト (休眠
ており、
が混入することによって、世界中に伝播しているのではとの指摘もなされ
y
b
g
i
R
られ (
オース トラリ アでは 湾内で のパラ スト水 の放出 を禁止 する手 段がと
)、わが国にとっても深刻な問題となっている。そのため、
6
9
9
f1
f
e
a
r
g
e
l
l
a
dH
n
a
P原因生 物の伝 播を追 跡する ための 、簡便 かつ迅 速なモ ニタリ ング法 の確立 が
S
P
Aの塩基 配列を 用いて 有毒渦 鞭毛
N
D
r
S
8
望まれている。モノクローナル抗体や、 1
識別に
藻の同 定、検 出しよ うとす る試み がなさ れてき たが、 これら の手法 は種間
析にこ
おいて 極めて 有効で あるが 人為的 な伝播 を追跡 する上 で、種 内・個 体群解
.
l
ta
ie
h
c
a
d
A
れらの 手法を 用いる ことは 困難で あるの が現状 である (
3a，b，
9
9
1
eの培養
s
n
e
r
a
m
a
.t
aと A
l
l
e
n
e
t
a
.c
第 2章では 、各海 域より 分離し た A
かに
株につ いて毒 成分の 分析を 行い、 渦鞭毛 藻類が 有する 毒成分 の特性 を明ら
地域
した。 また、 各株の 毒成分 比を各 海域ご とにま とめて 平均し 、毒組 成比に
P毒成分について、 1細胞当 たりの
S
一方、 これま でに藻 体が生 産する 多様な P
成比は
総毒量 は培養 周期や 培養条 件によ って大 きく変 動する ものの 、毒成 分の組
.
イン産 G
性が認 められ るのか 否かに ついて 検討を 行った 。第 3章では 、スペ
Tの精製を行い、その性質について検討を行った。本株は、
S
mより N
u
t
a
n
e
t
a
c
5
X
T
4や G
1
m属の種にくらべて高く、また、 C
u
ri
d
n
a
x
le
一細胞 当たり の毒量 が A
-スルフオカルパモイル毒群をきわめて多く含むことから
6 などの N
X
T
および G
1株の毒 組成比 は、親 株のい ずれか
を有す る親株 間での 交配に よって 得られ た F
に安定
の組成 比を示 し、ま た毒組 成比が 両親性 遺伝に よって 子株に 伝達す る非常
。第 4
硫酸基転移酵素の活性が高いものと考え、本実験の供試藻として選択した
Tの精製 とその 性質の 検討を
S
aより同じく N
l
l
e
n
e
t
a
.c
章では 、高知 県産 A
P原因
S
T との比較を行った。さらに、代表的な P
S
mの N
u
t
a
n
e
t
a
.c
行い、 G
1よ
s
U
at
n
e
at
.c
Tの分布を調べた。また第 5章では G
S
渦鞭毛 藻類に おける N
Tの分布を調
S
P原因渦鞭毛藻類における O
S
Tの精製を行うとともに、 P
S
りO
P毒の生 合成に 直接関 与する 酵素で あるの か
S
、 P
Tが
S
べた。 第 6章では、 N
否かについて検討を行った。
)。
6
9
9
4，1
9
9
1
t
ae
l
l
e
b
m
e
C
7，
8
9
1
6，
8
9
.1
l
ta
re
e
y
o
B
ほぼ一 定であ ること が明ら かとな ってい る (
)は、異 なる毒 組成比
2
9
9
1
)。さら に、左 子らは (
3a
9
9
.1
l
ta
me
i
7，K
8
9
.1
l
a
A
N
R
、 r
な遺伝 形質で あるこ とを報 告した 。そこ で本章 では、 日本各 地で分 離され
が行われた
やモノクローナル抗体を用いた分子分類法によって種の同定
m属の培 養株に ついて 、毒成 分を分 析し、 分離地 ごとに まとめ て比較
u
ri
d
n
a
x
le
A
P毒成分 組成比 が、種 内・個 体群解 析の識 別マー カーと なりう るかを
S
を行い、 P
本食言すした。
1 材料及 び方法
2
7
2-1-1-1 A
a
m
a
r
e
n
.t
s
θ
O
F 系株一京都大学農学部水産微生物学研究室で、 岩手県 大船渡 湾にお いて
1
9
84年と 1
9
87年に採取した底泥中のシストを発芽させ、 分離後、無菌 ・クロ
2
1
1 実験に用いた A
le
x
a
n
d
ri
U
D
1属藻類培 養株とそ の培養
A
l
e
x
a
n
d
l
由
本実験に用いた
∞
∞
払
}
[
ロー ン株として 分離され、分譲していただいた 1
1株。
3
. 香川 県赤潮 研究所 吉松定 昭氏に より、 香川県 ・播磨灘 よりク ローン 株とし て
分離 され分譲 して いただ いた
、 A
t
6
3-1
、3、 -4
、 -5
、A
t4、 9および 9
1
何回何回
FaJ
28凶匂凶長岡w
m mwh
ぷ何回出回押
三ω。凶ぷ圃同国王ωロ。ロ
g
h
M
-1の 7株。
4
. 愛知 県水産 試験場の 石田 氏によ り愛知 県三河湾 より分離され、 譲渡し ていた
だいた A
t
3
0
4
A
Aと 5
0
3
A株。
同
d
h
S偲診正問255
PFdM四何一
凶6古
川Z占E
τ 何回
何回何回
s
m
w
k
F同点何回。S何
回2
。
﹄
。
o
l
)
』
}[amm-[
︻
}[句払}{
a
[
ト∞a
-
∞
回。右側向。2
gh
﹄。﹄
E
ー ン化した 7株
。
I 系株 一南西海区水産研究所の山口峰生氏らによって、 広島県広島湾よりク
2
. H
a
t
e
n
e
2
l
l
1
a
1
.c
2 A
O
F 系株一 京都大 学農学 部水 産
︿
内
A
Y
k
m
ω︿
市
∞
守
a
-
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わ司
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J
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::ミミミミミミミミミ∞:::: :
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:
: :::∞
C
J
¥
︻
。
z
m
w
-2
﹄ 。 話ω ﹂
F
、
:
:
F骨
:
::
::
:::
:
:
:
σ
宇叫
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t
JlQ
刊
刊
h
ω︿
c
d
，
ロk
kmω
，
∞トw，akω︿
，
。
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m
門
，
。
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Na
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で
。
ぷ ω︿
N，岡弘ωd刊
で 岡 弘ω
︿
N関同∞
ト同∞
渇一嗣∞
MZ'岡、
NN
凶Z
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市
N
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一
同ー
同P
同L
ZH
O同
一
関Z H
関
L
FZH
L
FZH
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内回。
問。吋嗣同。
、
NトC
凶民。
ch
同ト
Hhhwhehv.w
I
n
g
r
e
d
i
e
n
t
72 mg
KH2
P0
4
~
微生物 学研 究 室で
、 岩手県 大 船 渡
湾において 1
9
8
7年に採取した底 泥
中のシ ストを 発 芽 させ 、分 離後、
KN03
。
図
、
。
σ、
σ
、
σ
、
。
f司~わ司
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:
:
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τ 何回
』診、
"
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h
間
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r
:
n
〈
刊
刊
︿
， d刊向。mud刊
︿寸{}包 d 刊
で
同Sd
寸材︿
s
d
寸内沼恒︿
刊
刊
m
g内沼恒︿
制
旬刊阿国
，
m
S d
で
川
市 Zd
で白岡田
で︿岡田
トN
同
剛
山
町刊阿岡山
潟岡田
内刊岡田
NN
岡
田
宮甲山
的問阿岡山
トロ図
A)
Nmo凶同。
N
a
-戸同。
寸mwT
戸同。
g ヨハル﹃
同四四回一関同。
同門的同九戸'向。
Z3n'E)
e
s
s
.甲、
詰刷会と
Z
無菌 ・クローン化した 4株
。
N 系株ー 京都大 学農学 部水 産
2
.T
微生物 学研究 室 で、和 歌山県 田辺
4.
5mg
湾において 1
9
8
7年に採取した底泥
1
0.
5mg
中のシス トを発芽 させ、分 離後、
Fe-EDTA
0.
5mg
VitaminB12
0
.
6 ドg
無菌・クローン化した 7株
。
3
. 吉松定昭氏により 、香川 県播磨
B
i
o
t
i
n
1
.0μg
たS
E6、7および 8
2株。同じく 吉
Thiamine
0.
1mg
T
r
i
saminomethane
l
.0 g
松氏に分 譲してい ただいた 、 高 知
県浦の内湾産 A
c系株と A
c
k
o系株
Na2g
1
y
c
e
r
o
p
h
o
s
p
h
a
t
e
灘より 分離さ れ譲渡 してい ただい
』
ミ
ミ
ミ
6
=
FFS-w一
凶
ミ
ミ
ミ
ミ
ミ
ミ
ミ
ミ
﹃
h
何
雪
同
嗣
ロ
同
内偲ぷ附E
﹄
沼
剛
て
箇阿吋同
帆k
E
z
叩王﹄ m。
ミ
、
ミ
ミ
ミ
ミ
ミ
ω 制w
F同メ何回。525
剤h
。
﹄
。
59h
一
mgz﹄
w
∞
-
.
f。偉丘告白石ωmE聞とω邑mSSささむ 甲、泊。開55話回， N・
ω25
mgzw
3m
・
。
旬
同
定
、
T
a
b
l
e2・2.CompositionofSWIm medium
S
o
i
le
x
t
r
a
c
t
Seaw
a
t
e
r
30
mQ
970
mQ
の計 6株、お よび鹿 児島県 山川湾
産の A
c
y系 5株。
培養は全て S
W
I
I
m培地
pHwasa
d
j
u
s
t
e
dt
o7
.
9byHCl
(
T
a
b
l
e2
a
m
a
r
e
n
s
eにつ
.t
-2) を用い、 A
a
t
e
n
e
l
l
aについ
.c
いては 1
5C、 A
0
ては 2
0C において、明暗サイクル
0
0
0
0l
u
xの標準 培養条
1
4
L
:
1
0
D、5
8
9
件下で静置培養を行った。
2
1
2
A
l
e
x
a
n
d
r
i
u
m属藻体からの PSP毒の抽出
1
0
0
m
l の三角フラスコを用いて、各株を標準培養条
件下で培養を行い、対数増
殖中期に 1
，
2
0
0g
、 5分間の遠心分離により集藻を行った。 S
W
I
I
m培地で洗浄後、
0
.
0
5M酢酸水溶液を 200μl 加えて、 2
0ロC で凍結保存した。全てのサンプル
がそろい次第、氷冷下で計 3分間の超音波破砕
を行った。次に 1
9，
5
0
0g
、 2
0分
間の遠心分離により得た上清を孔径 0
.2μm の D
I
S
M
I
C
1
3
c
p フィルター
(
M
i
l
l
i
p
o
r
e社)で鴻過し、さらにウルトラフリー C
3
L
G
C (M
i
l
l
i
p
o
r
e社) を用
いて 8，
1
0
0ふ 2
0 分間の遠心分離による分子量 1
0，
0
0
0 での限外鴻過を行い、
漉液を H
P
L
C 蛍光分析に供した。
2
1
3 H
P
L
C 蛍光分析
2
1
3
1 H
P
L
C蛍光アナライザーの構成
P
S
P 毒の検出には、 O
s
h
i
m
a ら(
1
9
8
9
)によって考案された H
P
L
C を利用したシ
ステムを用いた。 H
P
L
C送液ユニット、蛍光検出器及び記録計にはそ
れぞれ L
C
-
6
A、R
F5
3
5および C
R6
A(島津製作所)または W
a
t
e
r
s6
0
0
E、 7
4
1および 4
7
0
(M
i
l
l
i
p
o
r
e社 ) を 用 い た o 蛍光検出器における検出は
、 3
4
0n
m の励起光に
対する 3
9
0n
mの蛍光を測定することにより行った。酸化剤
及び中和液の送液に
はS
P
U
3
.
2 (島 津製 作所 )ま たは S
S
CF
L
O
WS
Y
S
T
E
M3
1
0
0 S(
S
e
n
s
h
uS
c
i
e
n
t
i
f
i
c
C
o・)を用いが o また、酸化剤の反応コイルとし
て内計 0
.
5皿 、 長 さ 1
0m の
テフロンチユ ブを恒温槽中で 6
0
5C に加湿して用いた。また、カラムは W
a
k
o
s
i
l
5
C
1
8 (φ46x250mm) (和光純薬)を用いた (
T
a
b
l
e
2
ω
J
2
1
3
2 移動相及び反応液
毒成分を極性の異なる 3つのグループにわけ
、それぞれに対して 3種類、の移動
相を調製した (
T
a
b
e
l2
3
)
0 A液 は C
1
C
4を
、 B液は G
T
X1
-5 を、また C液
は STX~ neoSTXおよび dcSTX をそれぞれ分析する際に用いた
。カラム通過後の
毒成分をアルカリ性下で酸化するために 7
mM過ヨウ素酸溶液を p
H9
.
0
1 に調整
して用いた。また、反応後、 p
H を低下させ蛍光物質の蛍光強度を増強させる
た
めの酸性溶液は、 0
.
5N酢酸溶液を用いた o それぞれの移動相及ひ
反応液の流速
は、移動相が 0
.
8 m
l
/
m旬、酸化液は 0
.
4m
l
/
m旬、 酢酸 溶液 は 0
.
4m
l
/
m
i
nとし
た
。
T
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b
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C
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C
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mp
h
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t0.
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0
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c
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i
s
s
i
o
nw
a
v
e
l
e
n
g
t
h390nm
1
0
2
1
4 P
S
P毒の標準試料
H
P
L
C蛍光分析用の標準試料 (
S
T
X
、n
e
o
S
T
X
、d
c
S
T
X
、G
T
X
l
5 および C
l
4
)は
、
東北大学の大島泰克先生より譲渡していただ
いた。本標準試料を毎回の H
P
L
C分
析時に供し、試料に含まれる P
S
P毒成分を各標準試料の保持時聞から同定した
。
また、試料と標準試料のピーク面積の比より
試料中の P
S
P毒量を定量した。
2
2 結果
各株の P
S
P毒量および毒組成比を測定した結果を T
a
b
l
e2
4に示す。まず、細
胞あたりの全毒量は、各株間で異なっており
、最大で約二倍の開きが認められた o
特に、この違いは分離地の異なる株間で大き
く、分離地が北であるほど細胞あた
りの毒量が高く、逆に南ヘ行くほど小さい傾
向が認められた。一方、分離地が同
じ株間では、毒量の差は小さかった。これは、
A
.t
a
m
a
r
e
附と A
.c
a
t
e
n山 と
もに共通してみとめられる現象であった。た
だし、広島湾産の A
.t
a
m
a
r
e
n
s
e
た
けは、例外的に高い毒量を示した。
各株 の悶 毒成 分組 成比 に注 目す ると 、 A
.t
a
m
a
r
e
附 と A - e n山 と も に
C
l
+
2 を主成分としており、種閣での差は認められ
なかった。たとえば、大船渡産
のA
.t
a
m
a
r
e
n
s
eと A・c
a
t
e
n
e
l
l
aは、主成分として Cl+2以外にも neoSTXを多く
1
1
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l
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一α
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一4
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一
一3
-G
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一
-G
-G
m
一
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b
一m
. Continued
4
Table2
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i
x
o
T
Glχ1 GTX2 Glχ3 Glχ4 Glχ5
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s
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e
r
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) (0.4) (4.1) (21
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.
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.
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) (23.
1
.
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(3.
8) (3.1)
) (8.
7
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0 6
.
1
.
6
9)
(0.
.0)
) (11
3
(0.
.4) (54.2)
(1
.5) (27.6) (3.2)
(1
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6
.
0
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.
0
2
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0
8
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5
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0
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.3) (0.
(1
(1.5) (62.1)
.6)
) (21
8
.
(0
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.
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7)
(59.
.3) (3.4)
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0
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r
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)
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司
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圃
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・・
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圃
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岡
・
・
ー
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・
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・
・
圃
圃
・
・
・
・
・
・
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・
・
・
・
・
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・
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・
・
・
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圃
・
・
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・
・
・
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圃
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圃
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3
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.
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(7.2) (0.2)
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5
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0.
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(7.
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) (22.
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3
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.
0
1
.
7
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.
0
)
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1
) (42.3) (
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.
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.
0
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.
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.
0
2)
) (2.
3
.1) (16.
1
) (52.2) (
6
.
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.
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.
0
) (2.7)
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.
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.
0
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.
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.
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r
t
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)(
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)
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6
.
5
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.
0
)
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.
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) (65.1)
1
.
2
) (23.8) (
3
) (4.
4
.
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5.
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1
.
5
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.
1
1
.
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1
.
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1
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) (
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.
0
1
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1
.
0
8
.
0
5
0.
r
t
) (14.2)
7
.
(5
.0) (67.0)
1
) (7.5) (
7
.
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1
1)
.
7
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1
.
0
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r
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6
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.
6
1
2
.
9
5
.
7
.4
21
X工S
) を多く含み 、分離地が 南ヘ行くほ どトス
4
l
X
T
Xゃ G
T
S
o
e
n
カルパメイト 毒群 (
) の組成比が 高い傾向が 認められた n
6
5，
X
T
、G
4，
l
C
ルフオカル パモイル毒 群 (
偉
~
SX~Ð
何
ε+ZX~Ð
g
回押
6
工0
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l
R
l
l
O
X
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U
4
・
J-
X~S
伺
白
.
)
'
f
』
eは形態が酷 似しており 、北米では 多くの混乱 が生じてい る。そこで 本
s
n
e
y
d
n
u
f
A
4
0
3
t
、および A
4
t
8、A
2
1、 A
I
F系株の全株、 H
eO
s
n
e
r
a
m
a
.t
実験で用い られた A
3については
o
k
c
2および A
y
c
N系株、 A
F系株、 T
aO
1
l
e
n
e
t
a
.c
A也、 また A
3
0
5
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刊
凶国
織難題総
O耳N
ε3
/
J
7
1
ZJ/IJ
SX~Ð
m
H
m
m
k
国
。
Egad
伺
E
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f+ZX~Ð
"+1X~Ð
し一一」
X~S
03N
.
s
s
e
匂句史句、
主
ε3
"J/
。
.
。
伺
ロ
E
、
甲
〈。
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ZJ/IJ
￨
SX~Ð
I
￨
l
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4V+IXiO
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き。
，
、
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。モ0F 。
。色、
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6
10
l町 0.
l
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X
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U
a
l
l
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b
m
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)と C
5
8
9
1
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n
a
r
a
が認められた。このような分離地による毒量の差異は M
aらは、北米の大西洋沿岸の各地
d
n
a
r
a
)によって報告されている。特に M
7
8
9
1
ら(
4
1
1X~Ð
+
7
1
。
。 o 0 門
。
o き
同∞、。守
N
、
除
)
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I
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)
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UJX011町 0.
03N
，，;)/ε3
5
1
s
s
m
h何回
g
s
'
z
d
可
C
何
P毒量および 毒成分組成 比を測定し た。今回用 いたすべ
S
のすべての 株について P
.
ての株は形 態学的分類 に従い種が 決定されて いる。しか しながら上 記 2種と A
P
S
.分子分類によって種が明確になった日本産の株を用いて、 一細胞あた りの P
aともに分離地ごとに差異
1
1
e
n
tθ'
a
.c
eと A
s
n
e
r
a
m
a
.t
毒量 を測定したところ、 A
凶
0
.
ε
。
7株(大船渡 産
e2
s
n
e
r
a
m
a
.t
本実験では 、日本全国 の各海域よ り分離され た A
5株(大
a2
1
1
e
n
e
t
a
.c
1株、播磨灘 産 7株、渥美湾 産 2株)と A
7株、広島湾 産 1
船渡湾産 4株、田辺湾 産 7株、播磨灘 産 5株、浦の内 湾産 4株、山川湾 産 5株)
態分類と 一致した結果が得られている。
何
き。 o 0
同句、。マ
o
言
宣
考察
)の塩基配列 を用いた系 統解析
，2
Aおよび隣接 する内部ス ペーサー( 山 1
5伽 N
)と、両種に 特異的なモ ノクローナ ル抗体を用 いた免疫学 的
6
9
9
.1
l
ta
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h
c
a
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A
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.1
l
ta
帥 ie
肌 A
.1
tal
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k
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S
手法によっ ても種の確 認が行われ (
、
険
︼
回
何
km何 回3 何回
H
g
l
。
守門
、。。
。旬o
Rl
1%
O.
lI
O
X
f
U
Xが認められることから、両者を区別することができた。
T
S
o
e
n
3
2
つ
1X工
+
7
1
X~S
.M阿
Xが含まれる ことから播 磨灘産の株 と識別する ことができ た。ま
T
Xと S
T
S
o
e
は n
P毒成分比を 比較すると 、山川湾産 の株には
S
た、山川湾 産と浦の内 湾産の株の P
ε+ZX~Ð
回占
H
s
.伺
、
也誌とむ同同3.V
Xの割合が非 常に高く他 の地域の株 と異なる毒 組成比を
T
S
o
e
産の株は約 60%と n
5 が認められ たが、田辺 湾産の株に
X
T
有した。田 辺湾産の株 と播磨灘産 の株は G
SX~Ð
ロ
何
回
同
・
W(
』
何
Xを主成分と し非常に似 た毒成分組 成比を示し た。播磨
T
S
o
e
2と n
+
1
株はともに C
X をほとんど 含まないこ とからこれ らと区別す ることが可 能で
T
S
o
e
灘産の株は n
aで も 、 す べ て の 株 で 山 を主成分と しているが ¥大船渡
1
蜘 問 時 時H
ω
2の割合が約 95%にも達し、
+
1
として認認、められたがが、、特に愛知県産の株では、 C
他の 三 つの地域の 株とは明ら かに異なっ ていた。ま た、大船渡 湾産と広島 湾産ら
ω制
a
:
a
ω
ロ
。
凶
ω
3
ε
/
)
;
7
1
ZJ/IJ
凶
、
降
何
そこで、各 株の悶毒組 成比を分離 地ごとにま とめて平均 し、種内で の毒組成止
θn
e
守
訂r
仰
U
a
m
a
.t
)0 A
υ
-1
2
. 判刊
g
i
F
の比較を行 った (
あった o A
03N
、
降
何
同
ロEhME。占的ω芯
。2mdMhぷ=aus。
。2 市て岡山何回}匂Z，何回国℃何回目。占的32。2mυJvmhぷ
M困
w
占
m
m
k
陰 窪田向h E。
吋
層
︾ dZE
四
百
何回国立同国自。占お古-。2
。g。占的￡縄問。♂守ぱ広何伺 E53d刊自。占的32。2 N d一
。2 ト凶広忠岡 3251明
三
ω﹄SMFHE。占的ω恒
・
BE苫どωヒ宅自。﹄泊四︾ω恒三。2(て 田 川 ︾ 両 両 )
g。
m
w d尚一広ぷ問。混同固と。g。と m
匹
gs。2 市
。2 0何
四
トパ︾広岡w
m何回国温的。・ Z国富。占的ω百
田5 8 2同εωω22mwωgh。因。的右側内凶富。ハ︾岡山・凶日
角
。
問
遣
。
ミ SAShhHUM-可 -。
)
w (白羽。こ53XZ)図
層 白 U d d・
困
同
︾
同
、
甲
同国民主認さ hv・
P毒組成比の 差 は、種間で はなくむし ろ
S
、 非常 に似た成分を有していた。 P
含み
分離地のこ となる株閣 のあいだで 認められ、 分離地が北 であるほど 比毒性の高 い
A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eの P
S
P毒を測定したところ、分離地が北に行くにつ
に関してヘテロな個体群が混在している可能性もあり、 一つの海域に対しである
れー細胞あたりの毒量が高くなり、また毒成分についても北ヘ行くほど比毒性の
一定数以上の株を分離し、 P
S
P毒組成比を測定する必要があると思われる。さら
高いカルパメート毒群の比率が高くなることを指摘しており、今回の実験におい
に今後の課題として、同一海域で経年的に調査を行い、毎年発生する
ても同様の結果を得た。日本における P
S
P による被害は、当初、北海道から東北
属の種や
にかけて顕在化しており (
O
s
h
i
m
a e
ta
l
.1
9
8
2，H
a
s
h
i
m
o
t
oa
n
dN
o
g
u
c
h
i1
9
7
6
)、
毎に変化するのかを明らかにする必要があると思われる。
で分離された
A
le
x
a
n
d
r
i
u
m
G
y
m
n
o
d
i
n
i
u
mc
a
t
e
n
a
t
u
mの P
S
P毒組成比が一定であるのか、あるいは年
A
le
x
a
n
d
rju
m属の毒量が高くかっ比毒性が高い成分を多
く含むことに起因した可能性がある。広島湾産の A
.t
a
m
a
r
e
n
s
e株が例外的に毒
した C
l
4や G
T
X
5、および G
T
X
6などの N
-スルフォカルパモイル毒群、あるい
量が高く、また毒組成が北日本地域で、分離された株の毒組成と似ているのは、カ
は 0
1
1位に硫酸基を付加した G
T
X
l
4などの成分が多く含まれることが明らか
キの養殖に用いる稚貝を東北地方から仕入れており、この輸送とともに本種が運
となった。これは、以前に
ばれ定着した可能性を示唆するものであるが、今後、個体群の識別に可能な分子
識別法の確立を待たねばならない。
られた P
S
P毒組成についてもいえる (
K
i
me
ta
l
.
1
9
9
3
a，b，S
a
k
oe
ta
l
.1
9
9
5，
O
s
h
i
m
ae
ta
l
.1
9
9
0，1
9
9
3a，b
)。また、硫酸基付加反応は、晴乳類において、
次に、各株の P
S
P毒成分比を各地域ごとにまとめて平均し、比較したところ、
ステロイドホルモンやフェノールなどの生理活性物質の解毒および代謝に関わ
これは北日本で発生する
また今回の実験から、藻体の有する P
S
P毒成分には、 N
2
1位に硫酸基が付加
A
le
x
a
n
d
r
i
u
m属の種や G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mについて調べ
各海域ごとに特徴的な毒組成比を示すことが示された O ただし、大船渡湾産の A
.
っていることが明らかになっており (
M
a
t
s
u
ia
n
dH
o
m
m
a1
9
9
4，R
i
k
k
ea
n
dR
o
y1
9
9
6，
t
a
m
a
r
e
n
s
eと A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aの毒成分比のように、異なる種間でも非常に似た毒
W
e
i
n
s
h
i
l
b
o
u
me
ta
l
.1
9
9
7
)、硫酸基付加反応が P
S
P毒の生合成あるいは代謝
組成比を示すものもあり (
F
i
g
.2
1
)、種聞の識別は不可能で、あった。これまでに
において重要な反応過程であると推測される。
無菌・クローンの
A
l間 耐j
u
m属の株を用い毒成分比の測定を行われ、各増殖段
階で ー細胞あたりの P
S
P毒量は変化するもののその組成はほぼ一定であることが
A1
e
x
a
n
d
r
ju
m属がヘテロタ
2
4
摘要
リツクな有性生舶を行うこと利用して P
S
P毒組成の異なる親株同士を交配するこ
A
.t
a
m
a
r
e
s
e2
7株(大船渡湾産 7株、広島湾産 1
1株、搭磨灘産 7株、渥美
湾産 2株
)
、 A
. c
a
t
e
n
e
l
l
a2
5株(大船渡湾産 4株、田辺湾産 7株、播磨灘
とよって得られた子株の毒組成を分析し、親株と同じ P
S
P毒組成比を有する子株
産 5株、浦ノ内湾産 4株、山川湾産 5株)の全ての株について毒成分を測定
がそれぞれ 1:1の割合で出現し、毒組成は両親性の遺伝様式に従うことも報告
したところ、分離地が北であるほど細胞あたりの毒量が高く、逆に南ヘ行く
されている (
S
a
k
oe
ta
l
.1
9
9
2
)。このように P
S
P毒組成比は非常に安定な遺伝形
ほど低い傾向が認められた。 P
S
P毒組成比の差は、種間では認められなかっ
質であり、毒成分比に地域性が認められることから、 P
S
P毒組成比が個体群の識
たが、種内において分離地の異なる株間で認められ、広島湾産の
明らかとなっている (
K
i
m e
ta
l
.1
9
9
3
a
)。さらに、
別マーカーになりうる可能性が示唆された。また、このような例は、
ιcatenatum
A
.t
a
m
a
r
e
s
e
を除き分離地が北であるほど比毒性の高いカルパメイト毒群 (
n
e
o
S
T
Xや
においても報告されており、カルパモイル基が脱水された 1
3
d
e
o
x
y
d
e
c
a
r
b
a
m
o
y
l
S
T
Xが¥オーストラリアの株に特徴的であり、他の地域で分離
G
T
X
l
4
) を多く含み、分離地が南ヘ行くほど N
-スルフォカルパモイル毒群
(
C
l
4
、
， G
T
X
5，
6
) の組成比が高い傾向が認められた。両種について、 P
S
P
された株と異なることが示されている (
O
s
h
i
m
a1
9
9
3
a
)。その 一方で、 r
R
N
A遺伝
毒組成比をそれぞれ分離地ごとにまとめ、比較を行ったところ、各地域ごと
子の塩基配列やモノクローナル抗体を用いた有毒種の分子生物学的あるいは生化
に固有の毒組成比が存在することが示された。これらの株について r
R
N
Aや
学的手法を用いた分類法も確立されつつあるが (
A
d
a
c
h
ie
ta
l
.1
9
9
3
a，b， 1
9
9
4，
モノクローナル抗体を用いた分子分類が行われ、同種であること認められて
1ω6)、これらの手法は種間識別には非常に有効であるが¥種内解析は困難で、あ
るのが現状である。そこで、 P
S
P毒成分比解析とこれらの手法を総合的に用いる
いることから、藻体の持つ毒組成比を種内における個体群解析に用いること
ことでより正確に有毒趨の人為的伝播を追跡することが可能になるのではないか
跡するためのマーカーとして利用されることが期待される。また、いずれの
A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株におい
株においても基本骨格の C
1
1位や N
2
1位に硫酸基を有する毒成分を多く含
てみられるように、同じ地域で分離された中にも他の株とは P
S
P毒組成比が全く
むことから、硫酸基転移反応が P
S
P毒の生合成において重要な反応の一つ
異なる株が認められた (
T
a
b
l
e2
4
)。このように、同じ海域内にも P
S
P毒組成比
であると考えられた。
と期待される。しかしながら、高知県浦の内湾産
1
6
が可能であることが示唆され、今後、毒組成比が有毒種の人為的な伝播を追
1
7
第 3章
G
y
m
n
o
d
i
n
i
u
mc
a
t
e
n
a
t
u
mからの P
S
P毒の N
2
1に
硫酸基を付加する酵素 (
N
-s
u
l
f
o
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
e
:N
S
T
) の精製とその性質
これまで、 P
S
P 毒の 生合 成に つい て、 本毒 を生 産す る藍 藻 A
p
h
a
n
i
z
o
m
e
n
o
n
f
l
o
s
a
q
u
a
eについて R
l標識した物質の取り込み実験が行われ、 P
S
P毒基本骨
格がアルギニン、メチオニンおよび酢酸に由来するこ
とが明らかになっている
(
S
h
i
m
i
z
u1
9
9
3，
1
9
9
6
)。し かし 、そ の中 間体 につ いて は全 く知 見が 得ら れて
お
らず、 P
S
P毒の生合成系酵素群を解明することは現在のところ極
めて困難であ
る。ところで、有毒渦鞭毛藻類の有する P
S
P毒には、 N
Z
1位に硫酸基が付加し
たC
1
4や G
T
X
5および G
T
X
6などの N
-スルフォカルパモイル毒群、あるいは 0
1
1
位に硫酸基を付加した G
T
X
1
4などの成分が多く含まれる (
O
s
h
i
m
a1
9
9
0，
1
9
9
3a，
b，
K
i
me
ta
l
.1
9
9
3a，
b，S
a
k
oe
ta
l
.1
9
9
5
)。高等動物における薬物代謝での硫
酸化の重要性を考慮すると、硫酸基付加反応が P
S
P毒の生合成あるいは代謝に
おいて重要なステップであると推測される。さらに、
硫酸基付加反応の基質と
産物ともに、すでに確立された高速液体クロマトグラ
フィーを用いた P
S
P毒の
分離 ・定 量法 によ って 比較 的容 易に 測定 でき るこ とか
ら
(
O
s
h
i
m
ae
ta
l
.
1
9
8
4，
1
9
8
9
)、硫酸基転移酵素に注目し、その分離と精製を試みた。まず
、 A
.c
a
t
e
n
e
l
1
a
および A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eの培養株について、 P
S
P毒に対して特異的な硫酸基転移
酵素 (
S
u
l
f
o
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
e
:S
T )の検索を行ったが、これらの種からは微弱な活
札 か 認 め ら れ な か っ た o そこで、 A
lθx
a
附 M 属にくらべ、 一細 胞 当 た り ?
毒量 が高 く
、 C
1
1位あるいは N
2
1 位に硫酸基を有する G
T
X
5
+
6や C
1
4 の毒
ム比が高いスペイン産 G
y
m
n
o
d
i
n
i
u
mω
θnatumGC21V株 (Fig 刊 を 用 い て
検索を行ったところ、 S
T
Xと G
T
X
2
+
3の N
2
1イ
立に硫酸基を転移し、それぞれ G
T
X
5
とC
1
+
2を生 じる 活性 の存在を見いだした (
F
i
g
.
1
2
)。
G
.c
a
tθn
a
t
u
mは無 殻で 連鎖 群体 をつ くる 独 立栄養性の渦鞭毛藻で、あり、
本、メキシコ、スペイン、ポルトガル及びオーストラ
リアでその分布が確認さ
れている。 国内 では、山 口県仙崎湾、京都府久美浜
湾及び瀬戸内海播磨灘南部
で観察されている o スペイン、メキシコで P
S
P が発 生した際に、本種がみら
れたことから 有毒種であると 考えられていたが¥後
に本種が毒を産生するこ子
が確認され ，A
l
e
x
a
n
d
r
i
u
m属 とともに P
S
P の原因藻 として 注目されるようにな
った (
O
s
h
i
m
ae
ta
1
.1
9
9
3
a，
b
)。
本章では、スペイン産 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mより本酵素の精製を 行い、性質を検討
した。なお、本論では以下本酵素を N
S
Tとする。
3
1 材料及び方法
3
1
1 G
y
m
n
o
d
i
n
i
u
mc
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V株の培養及び、集藻
以下 の実 験に 用い た株 は、 スペ イン のビ ゴ湾 で附
年に 採取 され (抑m
a
n
dO
s
h
i
m
a1
9
9
0
)、久保により無菌・クローン化した後、継代培養
されている
ものである。培養は全て、 S
W
l
l
m培地 (
T
a
b
1
e2
2
)を用い、 2
0C、明暗サイク
ル 1
4
L
:1
0
D、 5
0
0
0L
u
xの標準培養条件下で行った。また、大量培養 には試験 管
で培養されている保存株より S
W
l
l
m培地 21をいれた駒型フラスコに接種し
標準培養条件下で、培養を行った o 対数 増殖 中期 の藻
体を 孔径 20μmのナイロ
ンネットで鴻過した後、遠心管に移して、 5分間、
1
，
Z
O
O
g の遠心分離により
集藻した o さらに、集めた藻体を滅菌海水で 二回洗浄
した後、、液体窒素中で
保存した。
0
80
60
ロ
3
4
0
M
0
H
3
1
2 酵素活性の測定法
~
20
0
寸
同
。υ+υ
MFHh
Z
円
N
U
+
[
υ
mXHO
の
ナ
刊一×
↑
。
寸+
-vハ
'
H
O
。
F
I
g
.
3
1.T
o
x
i
nC
o
m
p
o
s
i
t
i
o
no
fGymnodiniumc
a
t
e
n
a
t
u
mGC21V
1
8
酵素反応はエツペンドルフチューブを用いて、 1μMG
T
X
2
+
3(5μ1)、印刷 P
A
P
S
(10μ1、
) 1
0
0
世1
M
gC
1
2(4μ1)、2
0
0釧リ ン酸 緩衝 液 K
H
2
P
0
4
N
a
2
P
0
4(
p
H6
.
0
)(
3
1
μ1)と酵素液 50μl を加えて全量 を 100μl とし、 3
0C 、 1時間の反応を
行った。反応は、 100μl の 0
.
5M酢酸 を添 加し て停 止し た。 反応 後の 試料
ウ ル ト ラ フ リ ー 山 川1
1
i
p
o
r
e社)を用いて分子量 瓜 0
0
0 の限外鴻過を
行い、澱液を H
P
L
C蛍光分析 (
O
s
h
i
m
ae
tal
.1
9
8
9
)に供し、反応 産物である C
1
+
2
定量 した 。ま た、 酵素 液の 代わ りに 緩衝 液 A (印刷
Tris-HωH8
.
0
)を加
z
z
1
9
，
r
g、
m
T活性は、タンパク質 1
S
えて反応を行ったものを対照とした。なお、 N
)である比活性で表わした o
g
2量 (μM/h・m
+
1
たりで 1時間に生成された C
Tの諸性質の検討
S
3 N
1
3
1 基質特異性
3
1
3
2 の反応系に、他生物の硫酸基転移酵素の基質と して報告されている化
1
3
r，
e
t
s
le
y
h
t
e
em
n
i
s
o
r
y
T
e、 L
n
i
s
o
r
y
T
e、 L
n
l
l
l創 l
y
t
h
p
a
l、 N
o
n
e
h
p
o
r
t
i
N
物 p
o
r
t
s
E
肌
n
i
l
h
叩p
e
児
l
帥
n
l
凶
凶
p
、 E
払
臥e
n
附 l
p
o
D
肌
n
l
山
l
l
副
m
狙
創湖
鈎a
s
o
ω
t
c
山叫仙前似
州 l
十 A
DP
1
叩
u
瓜
n
山
副
m
n
.
加
凶
I
制
加
狙
細
百
創
a
、
勺 r
L
ム
T活 枇 与
S
凶)添加し、 N
2
0
.
0倍 量 ( 0
は3の 2
+
2
宇それぞれ基質である凹町ロめ
)の代
0
.
H6
p
4(
0
P
2
a
N
4
0
P
2
H
mMリン酸緩衝液 K
0
0
2 の反応系において、 2
1
3
H を調整し、活性を測
0 の範囲で以下に示す緩衝液を用いて p
1
H4
わりに p
凶リ
0
0
8は 2
H5
mM酢酸緩衝液、 p
0
0
、 2
6は
H4
定した。用いた緩衝液は、 p
s緩衝液を用いた。
i
r
mMT
0
0
0は 2
1
H8
ン酸緩衝液、 p
+およびその他の 2価金属陽イオンの要求性
6 Mg2
3
1
3
0酬 の 範 囲 で 変 化 さ せ 、 そ の
1
+の濃度のみ 0
2 の反応系においてMg2
1
3
2
+、
2
+、防}
a
酬になるように C
+の代わりに終濃度 5
2
活性を測定した。また、Mg
2
+ を加えた場合についても検討を行った。
2
n
j2+または Z
、N
+
u
、C
+
e2
、F
+
o2
C
、
X
T
S
o
e
4、n
+
1
X
T
Tの基質の代表的な類似体である G
S
える影響を調べた。また N
3 の 2倍量添加した場合に
+
2
X
T
Xをそれぞれ基質である G
T
S
c
3および d
+
2
X
T
G
c
d
ついても+食討した。
P の影響
A
7 P
3
1
3
酬の
0
1
Pを終濃度 0
A
P
e
t
a
h
p
s
o
h
p
i
d
'
5
'，
e3
n
i
s
o
n
e
d
2の反応系において、 a
1
3
T活性に及ぼす効果を測定した。
S
範囲で変化させて添加し、 N
2 基質親和性
3
1
3
、
円
7
.
4
M、 1
5
7
.
6
、 3
目
5
.
3
4明、 7
3の終濃度のみを 1
+
2
X
T
2の反応系で G
1
3
4別に変化させて活性を測定し、両逆数プロジ
.
M、 1
5
7
6
.
M、 3
5
3
.
1 問問、 7
1
S の終濃度のみを
P
A
m値を求めた。 同様にして P
3 に対する K
+
2
X
T
トにより G
凶
0
3
0
.
、 0
凶
5
7
0
.
、 0
凶
0
5
1
.
、 0
5凶
2
2
.
、 0
凶
3
.
、 0
凶
5
7
.
、 0
5凶
.
凶、 1
それぞれ 3
m値を求めた。
S に対する K
P
A
3 を基質にしたときの P
+
2
X
T
に変化させ、 G
5Mに変化さ
.
、1
M
0
.
問 3
、
5
.
、 7
M
5
側、 1
Xの終濃度のみを 3
T
また同様に S
S
P
A
、 P
)
凶
3
0
.
0
Xを基質として用い (
T
m値を求めた。また S
Xに対する K
T
せて S
X を基質にした
T
凶に変化させて S
3
.
、 0
凶
5
7
.
5凶、 0
.
凶、 1
の終濃度のみを 3
m値を求めた。
S に対する K
P
A
ときの P
3 硫酸基供与体特異性
3
1
3
1酬
.
Sの代わりに終濃度 0
P
A
2の反応系において、硫酸基供与体として P
1
3
l
y
n
e
h
p
o
r
t
i
N
)、 p
S
P
A
e(
t
a
f
l
u
s
'
e5
t
a
h
p
s
o
h
p
'
e3
n
i
s
o
n
e
d
になるように A
州
t
似
e
“
伶
i
M
一恥
十
) または 4
幻
S
附
附
N
P
e(
t
a
f
l
u
s
ついて+検食討を行つた O
ように添加しその活性を測定した。
Tの精製
S
4 N
1
3
1 組酵素液の調整
4
1
3
0 1の培養から集藻し、液体窒素中で凍結保存して おいた
0
精製には、 約 2
H
p
l，
C
H
s
i
r
mMT
0
3gの藻体を用いた。藻体を湿重量と同量の緩衝液 A(5
約 2
0 )に懸濁し、氷冷下で計 5分間の超音波破砕を行った。細胞質画分を得
.
8
0分間の超遠心分離を行い、得られた上清に硫酸 アンモニ
、 3
0旬
0
0，
0
るため 1
%飽和になるように加え、氷冷下で撹狩しながら 塩析を行った。次
0
ウムを 8
0分間の遠心分離によって得た沈殿を緩衝液 A に溶解し、同緩
、 3
0旬
0
5，
に 2
衝液に対して一晩透析を行い粗酵素液を調整した。
e カラムクロマトグラフィー
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
2 D
4
1
3
0カ
4
/
6
2
K
n社 ) を X
a
m
t
ha
2 (W
5
E
eD
s
o
l
u
l
l
e
C
E
A
E
緩 衝 液 A に懸濁した D
、 2倍量の緩衝液 A で平
)し
m
0m
5
6x1
a社 ) に 充 填 ( 2
i
c
a
m
r
a
h
ラム( P
nで添加し、緩衝液 Aで洗
i
m
/
l
衡化した。このカラムに粗酵素液を流速 1m
l を含む緩衝液 A の
C
a
0MN
.
3 および 1
.
2、 0
.
1、 0
.
、0
浄した。その後、 0
mM
0
5
ステップワイズにより試料を溶出した。活性画分を集めて緩衝液 B(
)に対して透析し、次のカラムの試料とした。
0
.
H7
4，p
0
P
H
2
a
N
4
0
P
2
H
K
o
4 至適反応温度
3
1
3
0C の間で 5Cずつ変化させ
4
5
2 の反応系において、反応温度のみ 1
1
3
Tの活性を測定した。
S
N
0
5
3
1
3
8 塩の影響
3
1
3
0Mとなる
.
5、 1
.
3、 0
.
l を終濃度 0
C
l および K
C
a
2 の反応系において N
1
3
H
至適反応 p
20
0
21
一
日
仰 削 ア フ イ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト ク ラフィー
eT
u
1
B
0 カラ
I
/
0
I
氾(東ソ一社)を C
0
5
l6
r
a
e
p
o
y
o
eT
u
l
B
F
緩衝液 Bに懸濁した A
m)に均 し、 2倍量の緩衝液 Bで平衡化した o このカラムに
m
0
0x1
ム ( 1
ムを洗浄した o 試料
試料を流速 0・1?IAIn- で添加した後、緩衝液 B でカラ
lを を 含 む C
MK
3 および 2
.
2、 0
.
1、 0
.
、 0
湾出は、町山の流速で 0
1
3
ψ
o
1
1
L
L
J2ニ
Z
の
ど っ た 。 活 性 画 分 間 て 緩 衝 液 A に対
、
J
oQ カラムクロマトグラフィー
n
o
4M
4
1
3
5 カラムを装着し、 5倍量の緩衝液 A で平衡化
/
5
R
oQH
n
o
附アこ M
CS
L
P
F
山 で 添 加 し 、 緩 衝 液 Aで
/
l
5m
.
し千スーハループを用いて試料を流速 0
1 の濃度勾配により試料の溶出を
3Mの ぬC
.
0
ヲフムを洗浄した o その後、 0
附 e社)で 2倍に濃縮した o
1i
i1
M
C(
L
1川 3
o
行った。活性画?を集めて M
;
f
3聞 に よ っ て 最 終 如 こ 10倍 に 濃 縮 吋 の カ ラ
み:江。フフリー C
R カラムクロマトグラフィー
H
0
0
x2
e
d
r
e
p
u
5 S
4
1
3
Rゲル鴻過カラムを装着し、 2倍量の緩衝液
H
0
0
x2
e
d
r
e
p
u
CSyd--に S
L
P
F
n で添加
i
m
/
1
5m
.
SHC13pH80) で平衡 化した 。試料 を流速 0
I
r
凶 T
0
0
2
C(
スタンダードタン
し、緩衝液 Cで試料の溶出を行った o また、分子量測定用
a社)を用いて検量線を作成し、分子量を測定した。
i
c
a
m
r
a
h
P
パク質 (
E ポリアクリルアミドゲル電気泳動
G
A
P
e
v
i
t
a
5 N
1
3
R カラムクロマトグラフ ー
H
0
0
x2
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d
r
e
p
u
S
0馴
1
印
川
口
[
川
川
削
液
衝
繍
緩
Aの定電流
m
0
1
泳動は 5C下で.
m幅でゲルを切り出し九 切り出した
m
で行った。一方のレーンについて、 5
二を用いて振還
2 に示す反応液に浸し、細かく砕いた後、シエ
1
ゲルを 3
5Cで 4時間反応させ活性を測定した。また、もう一方のレー
させながら、 2
バン ドを 検出
いて は、 クマ シー ブリ リア ント ブル ーで 染色 しタ 川質
0x1凹 ) の 2本のレ一ンに供した
4
0x1
4
1
(
O
0
J
-
7
;
;
0
l (pH6.8)J 300μl を加え、ウルトラフ
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r
e
c
y
l
0見 g
l，2
o
n
a
h
t
e
o
t
p
a
c
r
e
n
r
2
5C の熱処理を行
C を用いて 10μl に濃縮した。その後、 3分間、 9
G
L
3
リー C
0mAの定電流で行い、泳動後クマシー
E に供した。泳動は、 3
G
A
P
S
D
S
%
0
、 1
い
0
同時に、分子量マ
ブリリアントブルーで染色しタンパク質バンドを検出した。
a社)を泳動し、泳動距離からサブユニットの分子量を推
i
c
a
m
r
a
h
P
ーカー (
定した。
7 タンパク質の定量
1
3
d社)を用いた。
a
R
o
i
B
タンパク質の定量は、プロテインアッセイキット (
これをもとに試料
牛血清アルブミンを標準タンパク質として検量線を作成し、
中のタンパク質を定量した。
2 結果
3
Tの精製
S
Vからの N
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
mc
u
i
n
i
d
o
n
m
y
1 G
2
3
Tの精製には、硫安分画、
S
1 に示した。 N
e3
l
b
a
本酵素の精製のまとめを T
x
e
d
r
e
p
u
5および S
/
5
R
oQH
n
o
、 M
也
0
5
l6
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B
F
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s
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u
l
l
e
c
E
A
E
D
T活性
S
N
Rの各種カラムを用いた。各カラム操作におけるタンパク質と
H
0
0
2
5 に示す 。本酵 素の活 性は広 い範囲 の硫安 濃度
2
3
.
s
g
i
の溶出パターンを F
% の硫安飽和
0
8
0
Tの精製では、 2
S
の飽和によって沈殿してくることから、 N
e カラムクロ
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
T活性を含む沈殿を得た。 D
S
による分画を行い、 N
l のステップワイズによって試料の溶出を行った。
C
a
マトグラフィーでは、 N
)。活性画分
2
3
.
g
i
F
l によって溶出した (
C
a
1MN
.
Tの活性は 0
S
その結果、 N
C21V.
mG
u
t
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n
e
t
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.c
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g
m
μMCl+2/h・
) (μMCl+2/h)(%) (
g
m
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5
5
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x
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C
3
8
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0
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2
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FPLCS
Eゲル電気泳動
G
A
P
S
D
6 S
1
3
各精製段階の活性画分 10μl に試料用緩衝液
2
%
S，1
D
%S
1
1，
C
H
s
i
r
凶 T
0
[1
6
7
.
0
5
3
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.
0
0
6
1
0
3
2
7
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2
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3
2
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0
1
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.
4
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1
.2
1
5
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。
Z
ーを行ったところ、非吸着画分には本酵素活性は認められず、 0
.
1MK
C
l で溶
出する画分に活性を回収した (
F
i
g
.
3
3
)。続く M
o
n
oQでは、 0
.
1
0
.
2
M
N
a
C
lで
本酵素 が溶出 した (
F
i
g
.
3
4
)。また、 S
u
p
e
r
d
e
x2
0
0
H
Rによるゲル鴻過では、 1
5
から 1
7m
l に溶出する画分に本酵素活性を回収した (
F
i
g
.2
5
)。今回の精製
操
作により 、収率は 1
.
5
%と低いものの、約 5
4倍にまで、精製が進んだ、 (
T
a
b
l
e
3
1
)。
そこで、 精製度 を確認 するた めに S
u
p
e
r
d
e
x2
0
0
H
Rカラムクロマトグラフィー
2
4
J
2
.
5
0.
1
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.
1
Z
について、 A
F
B
l
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5
0
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•
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0
1
0
0
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E を行った (
G
A
P
e
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)。その結果、一本 のタ
t
6
a
3
g
i
F
ンパ ク質のバ ンドが得 られ、また 同時に 同 じ R
f値のゲル断片より N
T活性が
S
回収 されたことから、以 上の操作によって 本酵素の精製が 完了したものと 判断
した。
.SDS-PAGEofN-STpreparations.
Fig.3・8
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e
t
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3
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Tの諸性質
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u
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Rと S
H
0
0
E においてそれぞ れ標準タンパク 質より検量線
G
A
P
S
D
Tの分子量 を求めた (
S
を作成 し N
7，3
3
.
s
g
i
F
0S
)
9
x2
e
d
r
e
p
u
R によるゲ
H
0
0
ル溶過で約 6
5k
a
D
、また S
Eにおいて約 5
G
A
P
S
D
aの位置に 一本のバンドが
D
k
9
26
で見つかっている硫酸基転移酵
0
.
9
0.
8
T
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b
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2
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E
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f
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c
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x
i
n
s and
T
X
2
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3および
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c
t
i
v
i
t
yfrom 素 の 基 質 お よ び G
G
.c
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t
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S
T
X以外の P
S
P毒を反応液に添
G
a
lactosidase
G
.catenatum
0.
7
N-ST
g0.6
Compoundsa
5
ヲkDa
〆
T
r
a
n
s
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e
〉
Glutamate Dehydroge~ase
切 smog阻
止¥0
0
.
3
Chymo
0
.
2
1
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1
(
)
4
None
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GTX1+4
neoSTX
dcSTX
dcGT
X2+3
1
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1
1
1
1
0
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0
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2
1
p
N
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t
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n
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l
Naphtylamine
L
T
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emethyle
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UDP-N-Acetylgalactosamine
Dopamine
E
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1
っても活性の変化は認められな
かった (
T
a
b
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2
)。
硫酸基供与体として P
A
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Sの代
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y
ls
u
l
f
a
t
e
)あ
るいは A
P
S (
A
d
e
n
o
s
i
n
e 3
'
p
h
o
s
p
h
a
t
e5
'
s
u
l
f
a
t
e
) を加えた
場合について N
S
Tの 活 性 を 測
わりに
M.
W
.
F
i
g
.
3
9 Molecularweightd
e
t
e
r
m
i
n
a
t
i
o
noftheN-STfromG
.
c
a
t
e
n
a
t
u
mGC21V bySDS-PAGE
，
向
、
若
1
.0 A
~0.5
ω
G
号0.4
弓0.
8
c
H
a
8
0
.
3
』
噌
~ 0.
6
a
・
特異性について調べた。
ち0
.
2
ロ
0
c
ず、本酵素は硫酸基供与体とし
ロ
u
o
u
詰
o 0
O
aT
h
e
s
ecompoundswerea
d
d
e
dt
os
t
a
n
d
a
r
dr
e
a
c
t
i
o
nm
i
x
t
u
r
e
t
oaf
i
n
a
lc
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
no
f200μM.
g
O.
1
E0
.
2
1
2
I
n
c
u
b
a
t
i
o
n也n
e(
h
)
3
e0
u o
しかし
いずれの場合も活性は検出され
司
U
ち 0.
4
U
定し、本酵素の硫酸基供与体の
G
:
.
.
l
ω
加し、活性に与える影響を調べ
たところ、いずれの化合物によ
湿 0.
5
0.
4
R
e
l
a
t
i
v
ea
c
t
i
v
i
t
y
(
%
)
て P
A
P
Sのみを利用した (
T
a
b
l
e
3
-
3
)。
本酵素の基質親和性について調べたところ、 S
T
Xと G
T
X
2
+
3 に対する K
m値
1
2
I
n
c
u
b
a
t
i
o
nt
i
皿e
(
h
)
F
i
g
.3
1
0
.Time-courseo
f
r
e
a
c
t
i
o
np
r
o
d
u
c
t
sbyt
h
eN-ST
.
TheN-STw
ぉ i
n
c
u
b
a
t
e
dwi
也 PAPSa
sas
u
l
f
a
t
edonorandwithSTX(
A
)組 dGTX2+3
(
B
).
G1
文 5(
・ )wereproduced企omSTX.C1(・ )andC2(A )wereproducedfrom
GTX2+
3
.Noa
c
t
i
v
i
t
ywぉ o
b
s
e
r
v
e
dw
i
t
hh
e
a
t
e
denzyme(く
)，マ)
得られたことから (
F
i
g
.
3
8
)、本酵素は約 6
0k
D
aのモノマーであると判断した
は、それぞれ 1
6.1μ 日と 29.8μ 円であった (
F
i
g
.
3
1
1A，
C
)。また、 P
A
P
Sに
対する K
m値は、 S
T
Xを基質としたとき 8.3μMで
、G
T
X
Z
+
3を基質にしたとき 7
8
.
7
μMであった (
F
i
g
.
3
1
1B，
D
)。また、本酵素の至適 p
Hは 6
.
0で (
F
i
g
.
3
1
2A
)、
T
a
b
l
e
3
3. S
u
l
f
a
t
edonors
p
e
c
i
f
i
c
i
t
yo
f
t
h
eN-STfromG
.c
a
t
e
n
a
t
u
m
GC21V.
A
c
t
i
v
i
t
y
S
u
l
f
a
t
edonor
(
F
i
g
.3
9
)。
また、精製画分を用いて本酵素の性質の検討を行った。まず、 S
Tx
" n
e
o
S
T、
d
c
S
T
X
、1
1
α，
β-hydS
T
X
、G
T
X
2
+
3および G
T
X
1
+
4のそれぞれを基質として、活
性を測定したところ、 N
S
Tは
、 G
T
X
2
+
3と S
T
Xのみに活性を示した。また、そ
れぞれの反応産物である C
1
+
2と G
T
X
5 は反応の経時変化に伴い、直線的に増
加することが確認され、 1
0
0Cで 1
0分間の熱処理した酵素液を用いた系では両
気質とも反応産物は得られなかった (
F
i
g
.3
1
0
)。さらに、これまでに哨乳類
PAPS(
3
'
p
h
o
s
p
h
o
a
d
e
n
o
s
i
n
e5
'
p
h
o
s
p
h
o
s
u
l
f
a
t
e
)
APS(adenosine3
'
p
h
o
s
p
h
a
t
e5
'ーs
u
l
f
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t
e
)
PNS(p
n
i
t
r
o
p
h
e
n
y
ls
u
l
f
a
t
e)
4MUS(4
m
e
t
h
y
l
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m
b
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l
l
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f
e
r
y
ls
u
l
f
a
t
e)
0
29
十
0
1
0
0
1
C
，
.
、
、
、
〆
;
町
、
~
、
_
、
.
，
A
~、
マ 8← GTX2+3
3
~6
0
5
、
コ
吋
呂
ー
〉 50
、
〉
〉
よ
〉
ご
ろ
守4
ニ
ミ
)mvハ
トO
2
¥
(﹄
765432T
A
Km=16.1μM
Vm年 =2i6μWh
。
。
.2
8 1 1
.
6 0
4 0.
2 0.
0.
立(州)/S
l
d
5
0.
1
.5
1
l
l/GTX2+3(μM)
2
O~
o
8
40
λ35
三30 PAPS
ミ 25
ζ20
5
三1
3μM
K皿 =8.
210
h
J
1
Vmax=0.25μ恥
5
0
2
.
8 1 1
6 0.
.
4 0
2 0.
0 0.
l
)
M
μ
厚 APS(
l
【
7
26
~5
34
n(M )
o
i
t
a
r
t
n
e
c
n
o
C
~3
υ2
sontheN-ST
n
o
i
t
a
tc
n
e
l
a
v
i
. Effectofd
4
Table3
至適温度は
.
y
t
l
v
I
t
ac
。
。
5
2
.
2 0
.
5 0
1
.
1 0
5 0.
0
.
0
ーl
の
凶
APS(
/P
I
C02+
乙+
乱企1
(京)
A
200
2
+
Ca
2
+
Ni
+
Cu2
2
+
Zn
B
、、
モ
、
，
、
ト
rJ
，
h
える影響を調べたところ、
一司
g2+
M
o2+ で活性が著しく促進さ
と C
275
324
86
23
38
42
16
36
れ、何も加えない系にくらべ
3倍 の 増 加 が 認 め ら れ た
)。 ま た 本 酵 素 の 活
4
e3
l
b
a
T
(
lお
C
a
P、 1MN
A
性は、 5酬 の P
l の添加によ
C
5Mの K
.
よび 0
約
d
e
d
d
ea
r
e
)w
n
o
i
t
a
r
t
n
e
c
n
o
lc
a
n
i
2mM，f
s(
n
o
i
t
a
tc
n
e
l
a
v
i
aD
.
s
t
l
a
es
d
i
r
o
l
h
sc
a
d
e
i
f
i
r
u
fp
5μgo
.7
h1
t
i
dw
e
r
u
s
a
e
ywぉ m
t
i
v
i
t
c
ea
m
y
z
n
ee
h
bT
50
b1
J
3
a
〉
c
Zh
t
0
0
1
0
ンを反応液に添加し活性に与
None
Mg2+
5 Cで あ っ た
2
。 二価 金 属 イ オ
)、
2B
1
3
.
g
i
F
(
Cationa
Fe2+
って完全に阻害された
)。
4
1
3
3，
1
3
.
s
g
i
F
(
.
N-ST
a50
d
〉
a
ω
ミ
E
。
。
勺I
p
H
J
fhu
F
、
AU寸
u
n
。
9
1
0
1
5
n(m M)
o
i
回 t
Concen
tofNaCl(・)祖dKCl(.)
c
e
f
f
.E
4
1
3
g.
i
y. F
t
i
v
i
t
c
tofPAPonN-STa
c
e
f
f
.E
3
1
3
.
g
i
F
y
t
i
v
i
t
c
f onN-STa
.75μgo
h1
t
i
dw
e
r
u
s
a
出 血e
ityw
せv
c
Thea
f
Igo
5l
.7
h1
t
i
dw
e
r
u
s
a
e
ywasm
t
i
v
i
t
c
Thea
.
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e
i
f
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u
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.
dN-ST
e
i
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i
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u
p
PAPS
n.
o
i
t
c
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eN・STr
h
t
f
so
c
i
t
e
n
i
yk
t
i
c
o
l
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lv
a
i
t
i
n
11
.l
3
.
g
i
F
d
仕e
o
l
vp
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Al
.，
s
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o
h
t
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i
s
pAPS]u
/[
t1
s
n
i
a
g
da
抗e
o
l
vp
I
;B，l
]
3
X2+
T
S
[
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t1
s
n
i
a
g
a
+3a
叉2
gGl
n
i
s
tl/[pAPS]u
s
n
i
a
g
da
e
t
t
o
l
vp
/
D，l
];
3
X2+
T
G
[
/
t1
s
n
i
a
g
da
仕e
o
l
vp
/
l
.
e
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l
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a
b
:
g
a
〉
t
z
a
民
A
d
，
o
〉
出
2
2
5
5
1
3 考察
3
5
20 25 30 3
C)
eC
r
u
t
a
r
e
p
m
e
T
40
旬.
i
v
i
t
c
.catenatumN-ST a
)onG
B
e(
旬r
a
r
e
p
m
e
) andt
A
fpH(
臼 o
c
e
f
f
.E
2
1
g.3
i
F
y
t
i
v
i
t
c
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h
T
.
s
d
o
h
t
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y
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t
i
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i
t
c
A N-STa
.，
dN-ST
e
i
f
i
r
u
fp
h1.75μgo
t
i
wωmeasuredw
， 125m M
・)
-6(
epH4
組 g
n也er
di
e
s
rwasu
e
f
f
u
eb
t
a
t
e
c
5m Ma
2
:1
s
r
e
f
f
u
gb
n
i
w
l
l
o
f
9
epH8
姐 g
n也er
・)組d125m MTris-HCli
組gepH5・8(
n也er
ri
e
f
f
u
eb
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a
h
p
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p
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t也ei
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t
i
v
i
t
c
).B，N・STa
.
A
(
s
n
o
i
t
i
d
n
o
c
P毒の生合成に関する知見を得るため、生理活性 物質の代謝
S
本研究では、 P
P毒の成分の多くが硫酸化さ
S
における重要性と、有毒渦鞭毛藻類に含まれる P
P毒に対する硫酸基転移酵素に注目した。その結果、
S
れていることを考慮、して P
スペイン産
1位に硫酸基を
2
3の N
+
2
X
T
Xと G
T
V株より、 S
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
G
2を生じる活性を見いだしたので、精製を行い、
+
l
5と C
X
T
転移し、それぞれ G
性質を検討した。本株を供試藻として選択したの は、
m属 に く ら べ
u
ri
d
n
a
x
le
A
-スルフォカルパモイ
X5の N
T
2と G
+
l
て毒量が高く、さらに含まれる成分も C
0%を占め硫酸基転移活性が高いことが期待された からである。
ル毒群が約 8
31
0gの超遠心分離し たところ上
0
0
0，
0
本酵素の活性は、超音波破砕した後、 1
Tと
清画分に のみ回収されたことから、本酵素は報告されているほとんどの S
4側鎖にカルパモ イル基をもたず
酵素活性は全く検出されなかった。また、 R
H化
1側 鎖 が O
3、 R
+
2
X
T
G
c
Xおよび d
T
S
c
硫酸基を付加す るサイトがない d
)。
4
9
9
a1
m
m
o
dH
n
ia
u
s
t
a
M
同様に、細胞質 画分に存在する ことが示唆され た (
T としては、ラットにおいてペプチド、脂質や多
細胞質画分以外に存在する S
Tの活性を阻害しな
S
4のいずれの成分も N
+
1
X
T
Xおよび G
T
S
o
e
されている n
4側鎖の構造を認識していることが予想
1 および R
Tは R
S
かったことから、 N
aの
n
e
l
g
u
)、また、 E
4
9
9
a1
m
m
o
dH
n
ia
u
s
t
a
M
Tがゴルジ体膜に (
糖質に特異的な S
f
f
i
h
c
dS
n
aa
h
d
i
a
S
Tが葉緑体内に存在することが報告されている (
S
e
n
i
s
o
r
y
T
Tの多くが、水酸基に対して特異的で、アミ
された。これまでに見出された S
d
n
a
y
w剖 n
s
m
a
0，R
6
9
1
y
o
R
T(
S
e
n
i
m
a
yl
r
ノ基への硫酸化を触媒する酵素としては、 A
)。
4
9
9
1
l のステップワイ ズによ
C
a
e カラムクロマト グラフィーは N
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
D
氾を用いたアフ ィニティークロ マトグラ
0
5
l 6
r
a
e
p
o
y
o
T
e
u
l
って、また、 B
l のステップワイズによってそれぞれ試料の溶出を行った
C
フィーでは K
C法を用いるため 、濃度勾配によ ってタン
L
P
)。活性の測定に H
3
3
2，
3
.
s
g
i
F
(
.
l
ta
ae
n
a
l
l
e
r
2，O
9
9
.1
tal
oe
t
o
m
i
h
s
a
H
T(
S
e
t
a
f
l
u
ns
a
r
a
p
e
h
)と N
7
8
9
y1
b
o
k
a
J
-スルフォカルパモ
)のみに限られる。また、本酵素によって生成される N
4
9
9
1
Tで
)、本酵素は新奇な S
6
9
9
u1
z
i
m
i
h
S
イル基は天然化 合物からの報告 はなく (
P毒
S
Tの基質や基質以外の P
あると思われる。またさらに、反応液に種々の S
)ことから本酵素
2
e3
l
b
a
T
成分を加えても 、活性の変化が 認められなかっ た (
3 に対して特異的
+
2
X
T
Xと G
T
P毒成分の S
S
活性の基質特異性は極めて高く、 P
パク質を溶出した 場合、全ての活性 画分を測定すると 約半日を要するが 、ステ
ップワイズでは、得ら れた 一つのピークに ついて活性を測定 するだけでよいの
な酵素であることが強く示唆された。
で時間の短縮がで き失活を抑えるこ とが期待できる。 また、両手法によ るタン
パク質の除去効 率も同等である ことを確認して いる。精製過程 において、
m
3 に対する K
+
2
X
T
m値を比較した場合、 G
3 に対する K
+
2
X
T
Xと G
T
また、 S
X に対する親和性がより 高いと考えら
T
)、本酵素は S
1
1
.3
g
i
F
値の方が高く (
氾を用いたアフ イティークロマ トグラフィーは 最も有効
0
5
l 6
r
a
e
p
o
y
o
T
e
u
l
B
)。本カラ
1
e3
l
b
a
T
7倍にまで精製度が高まった (
な操作で、本カラム操作後 3
X5
T
2と G
+
1
P毒組成比は、 C
S
V株の P
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
れた。しかしながら G
2
+
3の硫酸化によって 生成する C1
+
2
X
T
)、G
1
3
g
i
F
0見であり (
と 2
0見
がそれぞれ 6
ムは、アデニンヌ クレオチドを基質 もしくは補酵素と する酵素に対して 親和性
T を精製する際に使用された例が報告されて
S
e
n
i
s
o
r
y
8から T
n
lθ'
g
u
を有し、 E
e を用
s
o
r
a
g
a
P
A
Tの精製には P
)。一般的に、 S
4
9
9
f1
f
i
h
c
dS
n
aa
h
d
i
a
S
いる (
3
+
2
X
T
Xから G
T
の組成比が高く、予想に反する結果となった。これについては、 S
Tが基質と
S
3を N
+
2
X
T
への硫酸化の反応速度が大きく、結果として生成した G
いたアフィニティークロマトグラフイーが有効で最も汎用されているが
eカラムに
s
o
r
a
g
a
P
A
)、本酵素は P
9
8
9
.1
l
ta
ye
n
a
l
a
3，F
9
9
.1
l
ta
he
o
d
n
o
H
(
Q カラム操作を行うことによって、酵素活性の収
o
n
o
吸着しなかった。また、 M
率は著しく減少 したが、このカラ ムに勝る分離条件 のよいカラムが他 に得られ
T は、不安定な酵 素であ
なかったため、本酵素の精製に用いることとした。 S
)、今後更なる実験を行う上で、
5
8
9
.1
l
ta
ge
n
e
s
T
るとの報告もなされており (
安定化剤等の検討が必要であろう。本実験においてもグリセロールや βーメル
カプトエタノールを添加したが¥有為な活性の安定化は認められなかった。
)の
4
9
9
a1
m
m
o
dH
n
ia
u
s
t
a
M
aのオリゴマーである (
D
6k
3
0
、 3
Tが
多くの S
)。例外として、 ゴ
9
g3
i
F
aのモノマーであった (
D
9k
に対し、本酵素は、 5
n
a
r
a
p
e
eh
s
u
o
Tおよび m
S
e
t
i
f
l
u
s
n
a
r
a
p
e
rh
e
v
i
tl
a
ルジ膜タンパク質である r
o
t
o
m
i
h
s
a
H
Daのモノマーである (
0k
1
aと 1
D
7k
Tは、それぞれ、 9
S
e
s
a
l
y
t
e
c
a
e
d
N
)。
4
9
9
1
.
l
ta
ae
n
a
l
l
e
r
2，O
9
9
.1
l
ta
e
1位のみに特異的であり、それぞれに対
2
3の N
+
2
X
T
Xと G
T
本酵素活性は、 S
4に対する本
+
1
X
T
Xと G
T
oS
e
H基に変化しただけの n
1位が O
して構造的には R
2
3
5
X
T
Xが硫酸化された後の G
T
Tによって S
S
して利用しているか、あるいは、 N
2への反応速度が 大きいことが考 えられるが¥現 在のところ明確 な結
+
1
から C
論を見出すまでにはいたっていない。
)。このよ
4
e3
l
b
a
T
o2+によって、著しく活性が促進された (
+と C
本酵素はMg2
.
l
ta
ee
e
2，L
9
9
.1
l
ta
me
i
K
Tが知られている (
うな例は、後述の腸内細菌の S
T
Tは、本酵素と同様、アミノ基に対して特異的な S
eS
n
i
m
a
l
y
r
) 。また、 A
5
9
9
1
)。しかし、
0
6
9
y1
o
R
+によって活性が促進されることが報告されている (
で、Mg2
o2+によって、著しく
Tは、活性に金属イオンを要求せず、ト192+と C
ほとんどの S
Tの特徴的な性質といえるかもしれない。
S
活性が促進されることは、 N
Sなどフェノール
U
M
Sあるいは 4
N
最近になり、ヒトやラット腸内細菌より P
.
l
ta
me
i
K
Tが報告された (
硫酸のみを硫酸 基供与体として 利用する新奇の S
) 。しかしながら 、今回精製した 酵素は、これら を硫
5
9
9
.1
l
ta
ee
e
2，L
9
9
1
Sのみを利用した
P
A
T と同様に P
酸基の供与体として利用できず、 一般的な S
Tに普遍的な性質とされ、最近になり明
Sに対する特異性は S
P
A
oP
)
3
3
e
l
b
a
T
(
Tが遺伝子 ファ
T遺伝子の塩基配列の比較から、 S
らかになった、いくつかの S
y
b
o
dR
n
ea
m
m
o
c
a
6，L
9
9
y1
o
dR
n
ea
k
k
i
R
ミリーを形成していると考えられている (
1
9
9
6
)。今後、 N
S
Tの遺伝子の塩基配列が明らかになることで、 P
S
P毒に特異
的な S
Tが、どのような基質に対する S
Tから分岐してきたのかが推測きるもの
と思われ、 P
S
P毒の生理的な機能を考える上でも非常に興味深い。今回は、精
製した N
S
Tが微量であっため、アミノ酸配列を決定することはできなかった
が、今後、 N
S
Tのアミノ酸配列を決定し、さらにそれをコードする遺伝子の塩
4章 A
l
e
x
a
n
d
r
i
u
mc
a
t
e
n
e
l
l
aからの
麻痩性貝毒硫酸基転移酵素 N
S
Tの精製とその性質
ならびに P
S
P原因渦鞭毛藻類における N
S
Tの分布
第
S
P原因藻が
筆者は、日本における主たる P
A
l
e
x
a
n
d
r
i
u
m属藻類であること
に留意して、当初からこれらの培養株を用いて P
S
P毒に対して特異的な S
Tの
基配列が明らかになることが期待される。
検索を行ってきた。しかしながら、非常に微弱な活性しか検出されず、その精
A
le
x
a
n
d
r
i
u
m属藻類にくらべ、一細胞当たりの
1
1位あるいは N
2
1位に硫酸基を有する G
T
X
5
+
6や C
l
4が多
毒量が高く、 C
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V株を用いて S
Tの
いことが明らかにされているスペイン産 G
製は困難であった。前章では、
3
4 摘要
スペイン産
G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V株を用いて S
Tの精製を行った。本株は、
A
le
x
a
n
d
r
i
u
m属 2種にくらべ 1細胞当たりの毒量が高く、主成分として分子内
に硫酸基が 2個付加した C
1
+
2を多く含むことから硫酸基転移酵素の検索には最
検索を行った。その結果、 S
T
Xと G
T
X
2
+
3の N
2
1位に硫酸基を転移し、それぞ
適な株であると判断した。検索の結果、 3
'
p
h
o
s
p
h
o
a
d
e
n
o
s
i
n
e
5
'
p
h
o
s
p
h
o
s
u
l
f
a
t
e
S
Tの性質に基づき、大量培養により集めた
らかとなった N
(
P
A
P
S
) を硫酸基の供与体とし、 S
T
Xと G
T
X2
+
3の N
2
1位に硫酸基を付加し
てそれぞれ G
T
X5と C
l
+
2へと変換する酵素 (
N
S
T
) を見いだした (
F
i
g
.
1
2
)。
0
01の培養から藻体を集め、硫安分画、 D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e、 B
l
u
e
そこで、約 2
T
o
y
o
p
e
a
r
l、M
o
n
oQ
、S
u
p
e
r
d
e
x2
0
0
H
Rの各種カラム操作を行い、 N
S
T を電気泳
らの N
S
Tの精製を再度試みた。また、 N
S
Tを検索していく上で、 G
T
X
5ある
用い本酵素の検索を行った。しかしながら、得られた酵素活性は非常に微弱だ
動的に単一バンドにまで精製を行った。精製した本酵素の諸性質を検討したと
ったため、酵素活性測定条件を再検討し、酵素反応液中に含まれる P
A
P
S量を G
.
ころ、約 6
0k
D
aのモノマーで、基質特異性は極めて高く S
T
Xと G
T
X2
+
3のみ
c
a
t
e
n
a
t
u
mの N
S
Tの活性測定条件の 1
0倍量加え、また反応液の緩衝液を酢酸
緩衝液に変更することで、 A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株の細胞破砕液から回収され
に活性を有した。硫酸基供与体として P
A
P
Sに対してのみ特異性を有し、Mg2+ と
れ G
T
X
5と C
1
+
2を生じる N
S
Tを見いだし、精製を行った。そこで、前章で明
C
1
+
2の成分組成比が高い株は N
S
Tの活性が高いことが期待されるので、
C
1
+
2成 分 の 比 率 が 9
5
%以上を占める A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株 (
F
i
g
.4
1
)を
いは
C
o2+によって活性が促進された。また、反応の至適温度は 2
5C、至適 p
Hは 6
であり、 S
T
Xと G
T
X2
+
3に対する K
m値は、それぞれ 1
6
.
1
μ 弘 29.8μMであ
0
1
0
0
った。
75
EMO
︼古川︼。ト求
50
25
F
i
g
.
4
-1
.T
o
x
i
nC
o
m
p
o
s
i
t
i
o
no
fA
/
e
x
a
n
d
r
i
u
mc
a
t
e
n
el
/
aA
c
k
o
5
2月
︾
ハ
ド
∞
。凶 Z
寸+
υ
m
u
NU+υ
円
mMHO
+NMハト。
円
寸+同一一内ト。
。
:
:
l4
A
le
x
a
n
d
r
i
u
m属か
るN
S
T活性の向上が認められた。本章では、 A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株より N
S
T
(
A
c
N
S
T
)の精製を試み、性質を明らかにし、 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mの N
S
T
(
G
c
N
S
T
)と
S
P 毒原因渦鞭毛藻類のうち G
.
の比較検討を行った。さらに、代表的な P
c
a
t
e
n
a
t
u
n
i
i
C
2
1
V株と A
.c
at
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株を除く G
.c
at
e
n
at
u
m
、A
.t
a
m
a
r
e
n
s
e、
A
.c
a
t
e
n
e
l
l
a
、 A
.l
u
s
i
t
a
n
i
c
U
O
Jおよび A
.o
s
t
e
n
f
e
l
d
i
iの計 5種 7株につい
て N
S
Tの分布を調べ、 N
S
Tがこれら有毒渦鞭毛藻類に普遍的な酵素であるの
か否かについて検討を行った。
4
1 材料及び方法
4
1
1 A
.
c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株の培養及び集藻方法
本実験に用いた株は高知県浦ノ内湾産 A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株、岩手県大船
.c
a
t
e
n
e
l
l
aO
F0
7
2株、広島県広島湾産 A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eH
I3
8株、
渡湾産 A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eA
t5
0
3A株、愛知県渥美湾産 A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eAt3
0
4
愛知県渥美湾産 A
A株、スペイン産 A
.l
u
s
i
t
a
n
i
c
u
m
A
L1V株、デンマーク産 A
.o
s
t
e
n
f
e
l
d
ii0
2
8
7
株および京都府宮津湾産 G
.c
a
t
e
n
a
t岨 f
Z
1
3株の計 5種 8株である。これら
1
1 に示した標準培養条件下で培養した。ただし、 A
.
の渦鞭毛藻類を 3
c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o5株の 2株のみ 2
0o
c、他の種及び株は 1
5O
Cで培養を行っ
W
1
1
m培地を入れたものを
た。大量培養をする際には駒型フラスコに 2Lの S
用いた。対数増殖期中期の培養藻体を孔径 20μm のナイロンネットあるいは
孔径 15μm のプランクトンネットを用いて集め、遠心管に移して 1
2
0
0gX
5
m
i
nの遠心分離 (
B
e
c
k
m
a
n社 C
PC
e
n
t
r
i
f
u
g
e
) を行い集藻した。集藻後、洗
浄用緩衝液 (
1
0
凶f T
r
i
s
H
C
l、 1
0
副 E
D
T
A、 5
0
凶 N
a
C
l，p
H7
.
0
) に藻体を懸
9
0C のディー
濁し再度遠心分離して藻体を集め、液体窒素中で急速凍結し、 0
プフリーザーで保存した。
4
1
2N
S
Tの活性測定法および H
P
L
C蛍光分析
エツペンドルフチューブに G
TX2+3 を 3μ1 (
0
.
0
3凶
1
)
、 1
0
凶1P
A
P
Sを 3
7
6凶)、酵素液を
μ1(
0
.
6凶)、 200mM酢酸緩衝液 (pH6.0)を 19μ1(
25μl加え、全量を 50μl とし、 1
5Cで 1
h反応させた。 0
.
5Nの酢酸水溶
液を添加して反応を止めた後、ウルトラフリー C
3
L
G
Cを用いて分子量 1
0，
0
0
0の
P
L
C に供し、反応産物である C
1
+
2 を定
限外漉過を行った。得られた漉液は H
P
L
C蛍光分析は 2
1
3に従った。なお、 A
c
NS
T活性はタンパク質 1
m
g
量した。 H
当たり 1時間に生成された C
1
+
2量 (
μ 日/m
g.h
)である比活性で表した。
0
4
1
3 酵素液の調製
36
3
1
4
1，こ従って細胞を破砕し、遠心分離により上清を得た後、 2
0.
.8
0おの
硫安分画を行い、 2
5，
0
0
0g X 3
0m
i
nの遠心分離によって得られた沈殿を緩
衝液 A に懸濁し、同緩衝液に対して一晩透析を行った後、以下のカラム操作
に順次供した。以後すべての操作は 5C で行った。
0
4
1
4D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e 陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e(
W
ha
t
m
a
n社 ) を C
1
0
/
2
0 カラム
緩 衝 液 Aに懸濁した D
(
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)に充填(釧 o
X2
0
0
m
m
)し
、 2倍量の緩衝液 Aで平衡化した。
このカラムに 4
1
3で調製した酵素液を流速 0
.
8m
l
/
m
i
nで添加した後、緩衝
.
1、 0
.
2、0
.
3及び 2
.
0MN
a
C
lを含む緩衝液 A の
液 Aで洗浄した。その後、 0
ステップワイズにより試料を溶出した。活性画分を集めて緩衝液 Bで透析を
行った。
4
1
5 B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l アフィニティーカラムクロマトグラフイー
緩衝液 Bに懸濁した A
F
B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l6
5
0
氾 (東ソ一社)を X
K
1
6
/
4
0カ
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)に充填 (φ16 X 2
0m
m
)し
、 2倍量の緩衝液 Bで平衡
ラム (
1
4で調製した酵素液を流速 0
.
4ml/minで添加し
化した。このカラムに 4
.
8ml/minで 0
.
1、 0
.
2、 0
.
3及
た後、緩衝液 Bで洗浄した。その後、流速 0
び 2
.
0MK
C
l を含む緩衝液 Bのステップワイズにより試料を溶出した。
4
1
6 H
i
T
r
a
pC
h
e
l
a
t
i
n
gアフイニティーカラムクロマトグラフィー
H
i
T
r
a
pC
h
e
l
a
t
i
n
g(
P
h
a
r
m
a
c
i
a社 ) に 予 め リ ガ ン ド と し て 0
.
1
MC
u
C
1
2を
1
5 で得ら
吸着させた後、 5倍量の緩衝液 Bで平衡化した。このカラムに 4
れた活性画分を流速 0
.
4
m
l
/
m
i
nで添加し、緩衝液 Bで洗浄した。その後緩衝
液 C(
5
0凶 リ ン 酸 緩 衝 液 p
H5
.
0
)および 0
.
0
5
ME
D
T
Aを含む緩衝液 Cのステ
ップワイズにより試料を溶出した。活性画分を集めて緩衝液 D(
2
0mM酢酸緩
H6
.
0
) で透析を行った。
衝液 p
4
1
7R
e
dT
o
y
o
p
e
a
r
l アフィニティーカラムクロマトグラフイー
F-R
e
dT
o
y
o
p
e
a
r
l6
5
0
氾(東ソ一社)を X
K
1
6
/
4
0カ
緩衝液 Dに懸濁した A
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)に充填 (
o16 X 1
0m
m
)し
、 2倍量の b
u
f
f
e
rDで平衡
ラム (
1
6で調製した酵素液を流速 0
.
4
m
l
/
m
i
nで添加し、
化した。このカラムに 4
2
0mM酢酸緩衝液 (
p
H6
.
0
)で洗浄した。その後、流速 0
.
8ml/minで 0
.
.
1
.
0M
K
C
lを含む 2
0
mM酢酸緩衝液 (
p
H6
.
0
)のグラジェントにより試料を溶出した。
0mMリン酸緩衝液 (
p
H7
.
0
) で透析を行った。
活性画分を集めて 2
37
4
1
8M
o
n
oQ陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
F
P
L
CS
y
s
t
e
mに M
o
n
oQH
R5
/
5(
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)を装着し、 2倍量の 2
0mM
P
h
o
s
p
h
a
t
eb
u
f
f
e
r(
p
H7
.
0
)で平衡化した。 4
1
7で調製した酵素液を M
o
l
c
u
t
(
M
i
l
l
i
p
o
r
e社)で濃縮した後、このカラムに流速 0
.
8ml/minで添加し、 2
0
mM
リン酸緩衝液 (
p
H7
.
0
) で洗浄した。その後、 o
，
_1
.0MN
a
C1を含む同ーの緩
i
l
J
B
u
f
f
e
r
口
ー
-
〆
:
!
コ‘
、
h
，
B
u
f
f
e
rC
、
r
∞
刊
、，.
J
、
〆
-14
衝液の濃度勾配により試料を溶出した。
五
E
3
O
4
1
9 S
u
p
e
r
d
e
x2
0
0
H
Rカラムクロマトグラフィー
F
P
L
CS
y
s
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0
0
H
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P
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c
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a社)を装着し、 2倍量の 2
0
0mM
酢酸緩衝液 (
p
H6
.
0
)で平衡化した。 4
1
8で調製した酵素液を M
o
l
c
u
t1
1L
G
C
3
L
G
Cで 濃 縮 し た 後 、 こ の カ ラ ム に 流
(
M
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l
l
i
p
o
r
e社 ) お よ び ウ ル ト ラ フ リ ー C
速 0
.
5
m
l
/
m
i
nで添加し、 2
0
0mM酢酸緩衝液 (
p
H6
.
0
) で試料を溶出した。ま
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)を用いて検量線を作成し、
た、分子量測定用標準タンパク質 (
分子量を測定した。
4
1
1
0 A
.
c
a
t
e
n
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l
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c
k
o
5株からの N
S
Tの諸性質の検討
第 3章 3
1
3に従って行った。
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についても本食討した。
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1
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4
2 結果
ええ
(﹄・∞日¥豆ミ NU+G)
〆
、
、
.
.
司、“巧ん
4
1
2 に従い作成した。その反応液に 4
1
1
1
1 で調製した粗酵素
0o
c、4時間反応を行った。以下の操作は 3-1-2 に従っ
液を 50μ1加え、 2
た。また、終濃度が 5mMとなるようにMgC
1
2又は C
o
C
1
2を反応液に加えた系
6
0
5
0
0
.
2
0
~
反応液を
・
￨
F
i
g.
4
2.
H
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)c
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g
5
0m Mp
0
.
0
5恥1EDTA.
ロ
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4
1
1
1
2 N
S
T活性の測定法
〈
Z
に
ヨ
ふ
Z
ト
∞
:J
社)に供し、得られた画分を粗酵素液とした。
言
2
nunv
4
1
1
1 P
S
P原因渦鞭毛藻類、における N
S
Tの分布
4
1
1
1
1 粗酵素液の調製
4
1
1で集藻、保存しておいた藻体に同湿重量の 2
0
0凶 g
l
y
c
y
l
g
l
y
c
i
n
e
N
a
O
H
p
H8
.
0 を加え、氷冷下で超音波破砕を行った後、 1
0
0，
0
0
0g、 3
0分 間 の 超 遠
心分離に供し上清を得た。その上清を、 0
.
1 MN
a
C
l を含む 5
0凶
g
l
y
c
y
l
g
l
y
c
i
n
e
N
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O
Hp
H8
.
0で平衡化した H
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gカラム {
P
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2
2
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1
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T
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辺
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田F
F
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・皿g
c
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4
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3
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2
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9
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5.
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A
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Rの 各 カ ラ ム 操
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l
C
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l
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c
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A
E
作によって行った。まず、陰イオン交換カラム D
e
u
l
で溶出した画分に活性があり、この画分をアフィニティーカラム B
Tは本カラムには吸着せず非吸着画分に活性が回収
S
N
c
l に供した。 A
r
a
e
p
o
y
o
T
g カラムでは、
n
i
t
a
l
e
h
pC
a
r
T
i
された。次に用いたアフイニティーカラム H
2
+と
u
Aを含むリン酸緩衝液でリガンドにキレートされ た C
T
D
5ME
0
.
本酵素は 0
l に供
r
a
e
p
o
y
o
dT
e
)。次にアフィニティーカラム R
2
4
.
g
i
F
ともに溶出させた (
n
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A
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l
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.M
5
4
g.
i
F
.
E
ySDS-PAG
b
したところ、本酵素は非吸着部分に回収される大 部分のタンパク質とは異なり
l の広い範囲の塩濃度で溶出する吸着画分に、活 性が回収され
C
a
8MN
.
0
1
.
0
oQではタンパク質はよく展開
n
o
)。次に、陰イオン交換カラム M
3
4
.
g
i
F
た(
C1で溶出された。さらに画分をゲル濯、過カラム
a
4MN
-0.
3
.
し、本酵素は o
)。
1
e4
l
b
a
T
7倍まで精製された (
Rに供し、最終的に本酵素は 5
H
0
0
x2
e
d
r
e
p
u
S
1 の位置にバン
3
.
f値 0
E に供したところ、 R
G
A
P
e
v
i
t
a
この時の活性画分を N
Rに 供 し た 結 果 、 本 酵 素 は 分 子
H
0
0
x2
e
d
r
e
p
u
活性画分をゲル滞、過カラム S
)。また、ゲル漉過カラム後の同じ活性
4
.4
g
i
F
Da付近に回収された (
6k
量 6
a を示すバンドが 1本得られ、
D
k
5
Eに供したところ、分子量 5
G
A
P
S
D
画分を S
)。
5
4
.
g
i
F
Da前後のモノマーであると推定された (
0k
本酵素は約 6
Tが十分量得られなかったため、前章のカラム操 作手順に従
S
N
c
精製した A
ドが得られたが¥ゲルから活性を回収することは 出来なかった。そこで硫安分
l に供して部分精製した酵素液を用い
r
a
e
p
o
y
o
eT
u
l
いアフィニティーカラム B
gに供した酵素液を同時に泳動
n
i
t
a
l
e
h
pC
a
r
T
i
画後、アフイニティーカラム H
て性質を検討した。まずこれまでに哨乳類で見 つかっている硫酸基転移酵素の
f値
T活性を測定した。その結果、 R
S
N
c
mm幅でゲルを切り出し、 A
しておき、 5
基質を過剰量加えることにより、本酵素の活性に 与える影響を調べたところ、
1 のバンドは
3
.
f値 0
T活性のピークがあることから、 R
S
6に N
3
.
-0
72
.
0
)。
2
e4
l
b
a
T
いずれの化合物によっても活性はほとんど阻害さ れなかった (
本酵素であり、精製が完了したと判断した。
Sを加えた場合、
N
Sまたは P
U
M
Sの代わりに 4
P
A
次に、硫酸基供与体として P
Tの活性を測定し、本酵素の硫酸基
S
N
c
S を加えた場合についても A
P
さらに A
Tの諸性質
S
5株からの N
o
k
c
aA
l
l
e
n
e
t
a
c
.
2 A
2
4
40
供与体の特異性について調べた。しかしいずれの 場合も活性は検出されず、本
41
A.
、，
5
1
3
Km=4μM
lM
7I
Vmax=O.
2
.
0
6
0.
4
0.
ーl
)
1
1/S1χ(凶
8
0.
.
B
8
3
X2+
GT
•
I
Km=14.9μM
6μM
Vm奴 =2.
1
0.
2
.
0
3
.
0
・l
)
μM
(
3
+
l/GTX2
5
叩
ミ)N+5=
豆
(
'
(
2
642
ミ)m
豆
二
口
↑
×
Km=2.8m M
M
1
Vmax=O.61
•
。
・
。
5
1
PAPS
c.
nuzJ
•
。
。
o
ミ)N+
豆
(
¥
己
︿トロミ
)mhV
J-TI
勺
(三ミ
添ン
加で
をオ
針ノ寸
附属
、金
果の
そそ
結他
のの
川町の
ょ匂
十の
e
/‘、戸つ
M た
h れ
べ却帥
ため
調がた
。町一時郡
μ
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S 調 S れり X た 63
た至至で反を促か
引か
を替のな
ら印刷て、技あ幻ま包てベが九の
C
M い眼 l てま、合、調液九素。ン品性れ
し明
113
95
96
95
116
113
96
116
104
mmdzrz
phenol
むo
p-Ni
Naphtylamine
Tyrosine
L-Tyrosinemethylester
L
Tyramine
L
UDP-N-Acetylgalactosamine
Dopamine
Epinephline
Estron
尚三九日一日時引一関白川一齢一畑一一一一
113
111
93
89
U
4
2
.
GTX1+4
neoSTX
dcSTX
+3
dcGTX2
MU
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ιmμ
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町一村
)
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古仏
山
一
a
Compounds
， JJ基 。 至 jnJ つ の ベ
酸 が め の 1 4 r v Mぃ
一一し加の
5 あ C 調日、訓合へ
功日を辻、輸
硫性げ素基
は 異 た 酵 る ・ hwunJrv と ゆ あ た 例 凶 で 。 を ( に 沼 易 生
(G4m 質犯でま、件州制度た次にが制
探特つ本す
自にな対たとれ
類果条 温つ液しは
p 基町 M
氾nsand
o
sofPSPt
t
c
e
f
f
. E
2
Table4
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t
i
v
i
t
c
scompoundsonN-STa
u
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aAck05.
l
l
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n
e
αt
c
D.
PAPS
Km=226μM
Vm鉱 =2.9μM
n
・3 ~ 0
0
l
x
0
5 4.
.
03
.
53
.
02
.52.
.0 1
51
.
0
1
)
1
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凶
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P
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0
1
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.
0
5
0
0
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十
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4
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血
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2
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b
. B，NA)
9(
epH7
組g
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C
H
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5m MT
2
・)組d1
・8(
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g
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S
1
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y
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s
s
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t
i
v
i
t
c
STa
P原 因 渦 鞭 毛 藻 類 に
S
3 P
2
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so
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t
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l
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4.E
e4
l
b
a
T
Tの分布
S
おける N
y.
t
vi
i
t
c
STa
T は全ての 株におい て
ほぽ除去 すること ができた 。検索を 行ったと ころ、十 S
zを
l
C
o
2と C
1
mMZ13株では、 防C
u
t
a
n
e
t
a
.c
oG
)
5
4
e
l
b
a
T
活性が認 められた (
本実験には供試藻として岩
反応液に添加した場合に高い活性が得られ、他の株で、は添加しない場合にのみ
mMZ13株以外の 活性は低 く、デー タ
u
t
a
n
e
t
a
.c
活性が認められた。しかし、 G
0以下でし
mMZ13株の N-STの比活性を 100として 1
u
t
a
n
e
t
a
.c
は示さな いが G
na
o
i
t
a
C
手県大船 渡湾産
2+
9
孔1
5
8
2+
0
C
3
0
1
2+
也1
乱
7
9
3
2
2+
Fe
2
+
i
N
.
2株、広島 県広島湾 産 A
7
F0
O
8株 、 愛 知 県
eH13
s
n
e
r
a
m
a
t
eAt503
s
n
e
r
a
m
a
.t
渥美湾産 A
A株、愛知県渥美湾産
eAt 304A株、ス
s
n
e
r
a
m
a
.t
A
mAL 1
u
c
i
n
a
t
i
s
u
.l
ペイン産 A
1
2
1
2
+
Cu
V株、デンマーク産
8
0
1
8
8
2+
n
Z
a
l
l
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n
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t
a
.c
A
.
A
7株 お よ び 京
8
2
ii0
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l
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t
s
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a印 刷Z13
n
e
t
a
.c
都府宮津 湾産 G
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e
sm
a
守w
i
v
i
t
c
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m
y
z
n
ee
h
bT
出
株を用いた。藻体をを破砕し
g カラ
n
i
t
l
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s
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pD
a
r
T
i
た後、 H
.
5
o
k
c
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l
l
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n
e
t
a
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TfromA
S
N
a社)に供して
i
c
a
m
r
a
h
P
ム (
P毒成分は
S
画分を粗酵素液とし、実験に用いた。この操作により細胞由来の P
.
s
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t
a
l
l
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g
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l
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i
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i
x
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p
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g
i
V
+
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n
a
p
a
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却
Miya
+
8
3
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H
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，J
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i
H
+
At503A
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A
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1
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c
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K
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V
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V
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A
i
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d
l
e
f
n
e
t
s
.o
A
N-ST
y
t
l
v
1
t
c
a
7
8
2
0
44
かなかった。
3 考察
4
これまでに
e株
s
n
e
r
a
m
a
.t
a Acko5株とは分離地の異なる株や A
l
l
e
n
e
t
a
.c
A
でも叩の検索が行われたのにも関わらず、非常に活性が低いかあるいほ三
Tと
S
N
c
Tにおいても、 G
S
N
c
)。本酵素 A
6
9
9
く見いだせない株も見られた(藤井 1
T の 6分
S
N
c
e カラム後 の比活性 が G
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
同じ反応液条件では、 D
m属の種からの N-STの
u
i
r
d
n
a
x
e
l
の 1程度であった。予備実験の結果から、 A
S に対する 親和性が 低いこと によるの で
P
A
Tの P
S
検出が困難であるのは、 N
e
s
o
r
a
g
a
P
A
Tの精製に汎用されている P
TがI"S
S
c
実際、 A
はないかと考えられた o
P
A
Pや P
T
に吸着しなかったことからもこのことが支持される。またこれまでに A
S類似体と して硫酸 基転移酵 素の活性 を阻害す るという 報告がな されて
P
A
は P
m属の N-ST
u
i
r
d
n
a
x
e
l
0A
)
4
9
9
f1
f
i
h
c
dS
n
aa
h
d
i
a
5，S
9
9
.1
tal
ee
c
i
d
i
u
G
o
L
いる (
に J~' ても粗酵素液中では、
S に対し
P
A
T活性を阻 害するよ うな物質 や P
S
N
て競合す るタンパ ク質によ って活性 が抑制さ れている ことも考 えられた 。本実
0倍高く添 加し、そ の結果
S濃度を 1
P
A
T活性測定 用反応液 の P
S
N
c
験では G
T活性を回収することができた。
S
N
c
より安定した A
l カラムには吸着せず、に溶出さ
r
a
e
p
o
y
o
eT
u
l
精製過程 において 、本酵素 は B
+ などのアデニンヌクレオチド要求性のタ
P
D
A
+や N
D
A
れた。このカラムは N
ンパク質 を精製す るための アフィニ ティーカ ラムであ るが¥こ こでは特 異性の
強いタン パク質を 吸着させ 、目的の タンパク 質を溶出 するとい うネガテ イブア
フイニテ ィーカラ ムとして 利用した 。この操 作によっ て非活性 が 7 倍に上昇
S に親和性 の高いタ ンパク質 が除去さ れ
P
A
)、これは P
1
e4
l
b
a
T
しているが (
たため
p
a
r
T
i
はないか と考えら れる。次 に用いた アフィニ ティーカ ラム H
7
g カラムは 、タンパ ク質の外 側に位置 するアミ ノ酸残基 と金属イ オン
n
i
t
a
l
e
h
C
が錯体を 形成する 性質を利 用したも のである 。リガン ドとして よく用い られる
2
+は 2
u2
+は 1個のヒスチジン残基と、 C
2
n
+であり、 Z
u
+や C
2
n
金属イオンは Z
+の両方に ついてそ れぞれ
u2
+と C
2
n
個のヒスチジン残基と錯体を形成する。 Z
では強力 に吸着
+
u2
+で、は本酵素は全く吸着せず、 C
2
n
予備的に検討した結果、 Z
2
)。またこ の画分
2
4
.
g
i
F
+とともに溶出させた (
u
Aで C
T
D
するため 本酵素は E
45
については透析を行っても活性に変化はなく、回収率も非常に良いことから、
一方
、 G
c
N
S
Tと A
c
N
S
Tの P
A
P
S に対する親和性を比較すると、 A
c
N
S
Tでは、
B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l での非吸着画分の有効な濃縮が可能であった。 また、 R
e
d
T
o
y
o
p
e
a
r
l カラムについて、本酵素は B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l との組み合わせによっ
てのみこのカラムに吸着した。このカラムは B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l 同様アデニンヌ
クレオチドに親和性を持つタンパク質を吸着するが、 B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l とは溶
非常に低いことが明らかとなった。 G
c
N
S
T はアフイニティーカラム B
l
u
e
T
o
y
o
p
e
a
r
l に吸着するのに対し、同じ条件でカラム操作を行 っても本酵素は吸
着せずに溶出するか¥これは基質親和性に差異があることによると考えられた。
また今回の実験で、 S
T
Xを基質にした時の本酵素の P
A
P
SのKm値が G
T
X
2+
3を
出パターンが異なり、本実験ではこの溶出パター ンの違いを利用したカラム操
基質にした時に比べて非常に高いのは、 S
T
Xあるいは G
T
X5を持たない A
.
作となっている。
c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5の毒組成と関係があるかもしれない。また、 G
c
N
S
Tは S
T
Xと
G
T
X
2
+
3の両方に対して同じくらいの親和性を持つが、 G
T
X
5が 2
0おに達する G
.
c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V株の毒組成と関係があるかもしれない。しかし 現段階では
P
S
P毒修飾・変換酵素の遺伝子レベルでの解析もなさ れておらず¥結論を述べ
部分精製した本酵素の諸性質の検討を行い、 G
c
N
S
Tの性質との比較を行っ
た(
T
a
b
l
e4
6
)。本酵素は、 G
c
N
S
T と同様に、 S
T
Xと G
T
X
2
+
3の
、 N
2
1位のみ
に特異的であり、
硫酸基供与体として P
A
P
Sのみを利用した。
るにはあまりにも情報が少なすぎるといえるだろう。
T
a
b
l
e4
6
.C
o
m
p
a
r
i
s
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no
fG
.c
a
t
e
n
a
t
u
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n
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e
l
l
α
N
S
T
.
G
.α
ct
e
n
α
'
t
u
m
GC21V
また至適 p
Hについて 3種類の緩衝液を用いて調べた結果、 p
H5
.
0 (酢酸
緩衝液)が至適条件であった (
F
i
g
.4
7
)
0G
c
N
S
Tは p
H6
.
0 (リン酸緩衝液)
A
.α
c'
t
e
n
e
n
α
を至適条件としている。しかし本酵素は、 p
H6
.
0 (リン酸緩衝液あるいは酢酸
A
c
k
o
5
緩衝液いずれにおいても)の反応条件では p
H5
.
0 (酢酸緩衝液)に比べて比活
性が 4
0おしかなかった。
S
u
b
s
t
r
a
t
e
GTX2+3
STX
GTX2+3
STX
S
u
l
f
a
t
ed
o
n
o
r
PAPS
PAPS
Optimumt
e
m
p
e
r
旬r
a
e
2
5C
2
5C
6
.
0
(p
h
o
s
p
h
a
t
eb
u
f
f
e
r)
5
.
0
(a
c
e
t
a
t
eb
u
f
f
e
r)
OptimumpH
C
a
t
i
o
nr
e
q
u
i
r
e
m
e
n
t
0
Mg
2
+
，C
0
2
+
0
None
Km
PAPS
(G
TX2
+
3a
ss
u
b
s
t
r
a
t
e
)
GT
X2
+
3
PAPS
(STXa
ss
u
b
s
t
r
a
t
e
)
STX
M.W.d
e
t
e
r
m
i
n
e
db
y
SDS-PAGE
78.7μM
226μM
29.8μM
2
.
9
μ恥f
8
.
3
μ孔f
2.8mM
16.1μM
4.0μM
6
0kDa
5
5kDa
A
c
N
S
Tは金属イオンによる活性への影響はほとんど認められないのに対し、
G
c
N
S
TはMg2+ や C
o2+で活性が著しく促進される。京都府宮津産 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
m
2
M
Z株からの N
S
Tにおいても、 Mg2+ や C
o+ で活性が著しく促進されるという
結果が得られていることから、 G
c
N
S
T活性は一般に上記二価金属イオンによっ
て促進されると考えられる(藤井 1
9
9
6
)。金属イオン要求性については、前章
でも述べたとおり、腸内細菌の p
h
e
n
o
l
S
T とラットの A
r
y
l
a
m
i
n
eS
Tで報告さ
れているのみであり (
K
i
me
ta
l
.1
9
9
2，L
e
ee
tal
.1
9
9
5，R
o
y1
9
6
0
)、Mg2+ や C
o2+
で活性が著しく促進されることは、 G
c
N
S
Tの特徴的な性質といえる。
また、代表的な P
S
P 毒原因渦鞭毛藻類のうち G
.c
a
t
e
n
a
tu
m
G
C
2
1
V株と A
.
c
a
t
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株を除く G
.c
a
t
e
n
a
t
U
J
I
J
、 A
.t
a
m
a
r
e
n
s
e、 A
.c
a
t
e
n
e
l
1
a
、 A
.
l
u
s
i
t
a
n
i
c
u
mおよび A
.o
s
t
e
n
f
e
l
d
i
iの計 5種 7株について N
S
Tの分布を調
べた。 A
c
N
S
Tでは、 G
c
N
S
Tの至適反応条件の 1
0倍量の P
A
P
Sを要することが
明らかとなったため、この実験では、 A
c
N
S
Tの至適反応条件に準じた反応液を
用いた。その結果、いずれの株においても N
S
T活性が認められ、本酵素が P
S
P原
因渦鞭毛藻類に広く分布する酵素であることが示唆された。 G
c
N
S
T に比べ、
A
le
x
a
n
d
ri
u
m属の各株のいずれにおいても酵素の比活性が低か ったことについ
ては、各株における N
S
T の反応至適条件が異なっているためであると思わ れ
る
。 P
A
P
S に対する親和性のみならず、反応の至適 p
H についても、 G
c
N
S
Tで
は最適なリン酸緩衝液では、 A
c
N
S
Tの活性は非常に低い (
F
i
g
.
4
8
)。そのため、
4
7
今後は各株の N
S
Tそれぞれについての反応条件の検討を行う必要がある。
今回の結果より N-ST が~" P
S
Pの原因藻類である G
.c
at
e
n
at
U
s
1や A
le
x
a
n
d
ri
U
s
1
属の種に普遍的に存在することが示唆された。一方、 P
S
P毒を生産しない G
.
c
a
t
e
n
a
tUs1 (オーストラリア産及び香川県播磨灘産)株において N
S
T活性が
検出されており、 N
S
Tは
、 P
S
P毒の生合成にはリンクしていない酵素である
という報告がなされている(大島 1
9
9
7
)。しかし、これは P
S
P毒の骨格形成に
S
P毒が検出されないもの
関与する酵素遺伝子のいずれか欠失しているために P
S
P毒の骨格形成後に働く硫酸
と考えられる。従って、上記のような無毒株に P
第5
章
G
y
m
n
o
d
i
n
i
u
mc
a
t
e
n
a
t
u
m からの 1
1
h
y
d
r
o
x
yS
T
Xを基質 とする硫酸
基転移酵素 の精製 とその性質
S
P原 因渦鞭毛藻類、
における O
S
Tの分布
ならびに P
S
Tは
、 P
S
P毒への 2つの硫酸基付加部位、
前章 までで明らかにしてきた N
すなわち N
2
1位 と C
1
1位のうち N
2
1に特異的に硫酸基 を付加する酵素である。
これまでに報告 されている S
Tは、硫酸基付加部位はアミノ 基 と水酸基 に限ら
れ、その多くが水酸基への硫酸基 転移酵素である (
M
a
t
s
u
ia
n
dH
o
m
m
a1
9
9
4
)。
r
y
l
a
m
i
n
e
S
T
(
R
o
y1
9
6
0，R
a
m
s
w創 n
ya
n
dJ
a
k
o
b
y
アミノ基への硫酸基転移酵素は A
A
.a
f
f
i
nθ な
p
h
a
n
i
z
o
m
e
n
o
nf
l
o
s
a
q
u
aや A
n
a
b
a
e
n
ac
i
r
c
i
n
a
l
i
sあ
どの無毒種、あるいは A
y
n
g
b
y
aなどの P
S
P毒生産能を有するラン藻についても N
S
Tの分布を
るいは L
1
9
8
7
)と N
h
e
p
a
r
a
ns
u
l
f
a
t
e
S
T(
H
a
s
h
i
m
o
t
oe
ta
l
.1
9
9
2，O
r
e
l
l
a
n
ae
ta
l
.1
9
9
4
)
のみに限られる。ここで、 P
S
P毒 の C
1
1位の硫酸基 について 注目 すると、この
明らかにする必要がある。
部位の硫酸基はエステル硫酸として付加していることから、第 一反応としてま
基転移酵素活性が存在しても何ら矛盾はないと思われる。今後、
ず酸化が起こり、 生成した水酸基に硫酸基が付加するのではないかと考えられ
F
i
g
.
1
3
)。また 一般に、硫酸基転移反応は 生体内において、第 一相反応で
る(
4
4 摘要
A
.c
at
e
n
e
l
l
aA
c
k
o
5株の毒成分を調べたところ、約 9
5犯が
C
1
+
2であることから、 N
.
S
Tの活性が高いものと考え、本株より N
S
T(
A
c
N
S
T
)
の精製を試みた。硫安分画、 D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e、 B
l
u
eT
o
y
o
p
e
a
r
l、 H
i
g
h
T
r
a
p
、 R
e
dT
o
y
o
p
e
a
r
l、 S
u
p
e
r
d
e
x
2
0
0
H
Rの各種カラム操作によって、本酵
C
h
e
l
a
t
i
n
g
素は 5
7倍にまで精製された。精製した A
c
N
S
Tの性質を検討したところ、 6
0k
Da
前後のモノマーであり、基質特異性は極めて高く S
T
Xと G
T
X2
+
3のみに活性を
有し、 P
A
P
Sのみを硫酸基供与体として利用した。反応の至適温度は 2
5o
c、至
適 p
Hは 5.0であり、反応に金属イオンを要求しなかった。 S
T
Xと G
T
X
2
+
3に
m値は、それぞれ 4
.
0
μ 日と 2.9μMであった。また、 G
.c
a
t
e
n
a
tUs1G
C
2
1
V
対する K
株より精製した N
S
T(
G
c
N
S
T
)と A
c
N
S
Tの P
A
P
Sに対する親和性を比較すると、
A
c
N
S
Tでは、非常に低いことが明らかとなった。このように二つの N
S
Tの性
A
P
S を硫酸
質と比較するといくつかの点で差異が認められるものの、ともに P
T
Xと G
T
X2
+
3の N2
1位のみに硫酸基を付加する酵素で
基の供与体とし、 S
高知県浦ノ内湾産
ある酸化反応につづく第 二相反応である抱合反応の ーっとして知られている
1
9
8
8
)。そこで、 G
T
X
2
+
3 を加水分解することによって C
1
1 位が
水酸化された 1
1
α 、β
h
y
d
r
o
x
yS
T
X (
1
1
h
y
dS
T
X
)を人 工的に調整 し、これ
を基質として G
.c
a
tθn
a
t
u
mの粗酵素液中の S
T の活性の検索を行った。その
1
h
y
dS
T
Xを C
1
+
2へと変換する活性が見い出された。しかしながら
結果、 1
N
S
Tには 1
1
h
y
dS
T
Xを GTX2+3へと変換する活性は認められなかったこと
から、 1
1
-h
y
dS
T
Xを GTX2+3へと変換する N
S
T とは異なる S
Tが存在する
1
h
y
dS
T
X を基質とする S
Tについて各種カラムを用
と考えられた。そこで 1
いて分離を試みたところ、 l
1
h
y
dS
T
Xの C
l
1位に硫酸基を転移し GTXZ+3へ
s
u
l
f
o
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
e (
O
S
T
) 活性を見い出した。そこで本章 では
と変換する O
G
.c
a
t
e
n
a
t
u
A
G
C
2
1
V株の藻体を用い、 O
S
Tの精製を試み、諸性質の検討を行っ
た。また、前章で用いた G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mM
Z
1
3株と A
le
x
a
n
d
ri
u
m属 4種 7株 に
ついて O
S
Tの分布を調べた。
(佐藤・大村
あった。
また、
A
.t
a
m
a
r
e
n
s
eH
I
2
8株、 A
t
3
0
4株、 A
t
5
0
3株
、 A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aO
F
0
7
2株、
A
.l
u
s
i
t
a
n
i
c
u
mA
L
1
V株、 A
.o
s
t
e
n
f
e
l
d
i
i
0
2
8
7株および G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mM
Z
1
3の
計 5種 7株ついて N
S
Tの活性を測定した。その結果、 N
S
Tは全ての株におい
S
Tが P
S
P原因渦鞭毛藻類に遍在する酵素であることが示
て活性が検出され、 N
唆された。
5
1 材料及び方法
5
1
1 G
.c
a
tθn
a
t
u
mG
C
2
1Vの培養及び集藻
3
1
1 に従った。
5
寸2 1
1
h
y
d
r
o
x
yS
T
Xを基質とする硫酸基転移酵素 (
O
S
T
) の精製
5
1
2
1 粗酵素液の調製
1
5
ミ
ど
49
5
1
1 で集 藻 し
、 8
0Cにて保 存 してお いた藻 体(約 3g
) を湿重 量 と同 量
の 2
0
0凶 T
r
i
s-H
C
l(
p
H8
.
0
)に懸濁 し、氷 冷下で 超音波破砕を行った。 1
0
0，
0
0
0
g、 3
0分間の 超遠心 分離に よって 得た上 清に硫 酸アン モニウ ムを 8
0見飽和 に
0
なるよ うに加 え、氷 冷下で 撹持し ながら 塩析を 行った 。次に 、 2
5，
0
0旬、 3
0分
間の超 遠心分 離によ って得 た沈澱 を緩衝 液 A に溶解 し、同 緩衝液 に対し
て 一晩
透析し た。こ れを粗 酵素液 とし、 以下順 次カラ ムに供 した。
5
1
2
2 D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e カラム クロマ トグラ フィー
緩衝液 Aに懸濁 した D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
eD
E5
2 (
W
h
a
t
m
a
n社)を C1
0/4
0カ
ラム (
O1
0x 1
0
0mm) (
P
h
a
r
m
a
c
i
a社 ) に 充 填 し 、 緩 衝 液 Aで平衡 化した
このカ ラムに 5
1
2
1で調製した粗酵素液を流速 1
.
0m
l /m
i
n で添加し、
緩衝液 Aで洗浄した。その後、 0
.
1、 0
.
3及 び 2
.
0MN
a
C
l を含む 緩衝液 Aの
ステッ プワイ ズによ り試料 を溶出 した。 各画分 の活性 を測定 し、活
性の認 めら
れた画 分を緩 衝液 Bに対し て透析 し、次 のカラ ムの試 料とし た。
M酢酸を 添加し て停止 した。 反応後 の試料 をウル トラフ リー C
3
L
G
C(
M
i
l
l
i
p
o
r
e
社)を 用いて 分子量 1
0，
0
0
0の限外濯、過を行い、溶液を H
P
L
C蛍光分析に供し、
反応産 物を定 量した 。なお 、 1
1
h
y
d
r
o
x
yS
T
X は、鹿 児島大 学水産 学部の 荒川
修博士が G
TX2+3 を加水 分解す ること により 調製さ れたも のを分 譲して いた
だいた もので 、その 濃度は 、標準 試料が 存在し ないた め不明 である が
I
"
光分析 に供し たとこ ろ、ク ロマト グラム 上での 検出に は、十 分量で
H
P
L
C蛍
あるこ とを
確認している。
5
1
4 O
S
Tの諸性 質の検 討
3
1
3 に従って調べた。
5
1
5 P
S
P原因渦鞭毛藻類、における O
S
Tの分布
4
1
1
1
1 に従って調製した粗酵素液について、 5
1
3に記し た反応 条件下 で
反応を行い、 O
S
Tの活性を測定した。
5
1
2
3 a
d
e
n
o
s
i
n
e3
'，
5
'
d
i
p
h
o
s
p
h
a
t
e(
P
A
P
)
a
g
a
r
o
s
eアフィニティークロ
マトグ ラフイ ー
o
緩衝液 Bに懸濁 した P
A
P
a
g
a
r
o
s
e (
S
i
g
m
a社)を 氾( 1
6
/
4
0 カラム ( 1
6
x5
0mm) (
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)に充填し、 B
u
f
f
e
rBにより平衡化した。その後、 5
1
2
2
で調製した試料を、がし速 0
.
5m
l/m
i
nで添加 した。 緩衝液 Bで洗浄した後、
1
.0、 2
.
0MK
C
l を含む 緩衝液 Bを用い たステ ップワ イズに より溶 出した 。
得られ た各画 分を緩 衝液 Dに対し て透析 した後 、活性 を測定 した。
活性の 認め
られた 画分を 緩衝液 A に対し て透析 し、次 のカラ ムの試 料とし た。
5
2 結果
5
2
1 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C2
1V株から の O
S
Tの精製
藻体を 破砕後 、硫安 分画、 透析を 行った が、藻 体由来 の P
S
P毒を完 全に取
:12.
0 l2.0園
t'
.
-，
:
.
・
ー:
t;
X'
;
:
..
.. ・;・・ .
.
;
.
.
.
.
.1
、司
2
2
r
こ〉
=
ぇ
ぜ
<
.
、
:
、
ー
，
〆
E、
守
む
吋
J
5
1
2
4M
o
n
oQ陰イオ ン交換 カラム クロマ トグラ フイー
F
P
L
CS
y
s
t
e
m(
P
h
a
r
m
a
c
i
a社)に M
o
n
o
QH
R5/5カラム を装着 し、緩 衝液 A
で平衡 化した 。スー パール ープを 用いて 試料を 流速 1
.
0m
l
/
m
i
nで添加した後、
緩衝液 Aでカラ ムを洗 浄した 。その 後、 o-0
.
3MN
a
C
l を含む 緩衝液 Aの
濃度勾配により試料を溶出した。
・
局
ー
二
三
α
。
ト
コl0
.
5
1
.0凶
0
、
，
、
，κ
-‘
4J
1
.0 e
司
聞
.
，
，
令
，
〉、
•
a
o
d
z
u
ω
←
。
t
J
)
』
0
d
L4
〈
0
5
1
3 酵素活 性の測 定法
・
酵素反 応は、 エツペ ンドル フチュ ーブを 用いて 、 P
A
P
S(5μ1)、酢酸緩衝液
(
p
H6
.
0
) (40μ1)をそれぞれ終濃度 0
.
5副、 1
6
0酬とな るよう に調製 し、
l
1
h
y
d
r
o
x
yS
T
X を 5μl加え、 50μl とした 反応溶 液に酵 素液を 50μl加
え全量 を 100μi とし、 3
5o
C、 1時間反応を行った。反応は、 100μlの 0
.
5
50
，
‘
0 ・-1 0
1
0
1
5
20
F
r
a
c
t
i
o
nnumber
F
i
g.
5
-1
. PAP略 a
r
o
s
e也 omatogr
ゆ yofO・STfromGωemmmGC21V
O-ST a
c
t
i
v
e丘a
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o
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t
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i
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gO
M
，1
.
0M 臼 d2.
0M KC
.
l
o
5
月
T
a
b
I
e5
-1
. Sum
血 出yo
fp
u
r
i
f
i
c
a
t
i
o
no
f0・ST合omG
.c
a
t
e
n
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t
u
mGC2
1V
u
r
i
f
i
c
a
t
i
T
o
t
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lP
r
o
t
e
i
n T
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cA
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i
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i
t
y P
、
a
c
t
o
r
(mg)
(μMGTχ2+3/
h
) (%) (μMG1χ2+3/h.mg) F
/ (
おl
d
)
C
r
u
d
eぽせa
c
t
2
3.
7
8
0%似H(
)
2S04
21
.3
D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e
1
1
.1
6
6
0
1
0
0
PAP-a2:a
r
o
s
e
1
.0
3
1
8
3
2
8
MonoQ
0
.
0
5
6
2
7.
8
4.
2
Aにより溶出される画分に溶出された。本酵素の精製のまとめを T
a
b
l
e5
1に
示す。最終的に O
S
T は約 8倍にまで精製された。また、 M
o
n
oQ カラム後の
活性画分を N
a
t
i
v
e
P
A
G
Eに供したところ、単一のバンドを示した (
F
i
g
.5
2
)。
さらに、 N
a
t
i
v
e
-P
A
G
E からゲル スライス により回 収された O
S
T活性は、 上
5
9.
5
1
7
7
3
5
0
1
8
一一_:
n
o
ta
n
a
l
y
z
e
d
情
。STa
c
t
i
v
i
t
yド
(M
J
h
)
o
5
溶出され る画分に 溶出され た。その 際、活性 画分には P
S
P 毒の混入は認めら
れなかった。次に活性画分を P
A
P
a
g
a
r
o
s
eに供した。その結果 O
S
Tは 1.0MKCl
を含む B
u
f
f
e
rBにより溶出される画分に溶出した (
F
i
g
.5
1
)。その後、本活
性画分を M
o
n
oQに供した。その結果、 O
S
Tは 1
.
5-1
.7MN
a
C
lを含む B
u
f
f
e
r
10
記の単一バンドの R
f値と同ーの R
f値で最大であったことから、このバンド
が O
S
T を示していることが証明された (
F
i
g
.5
2
)。これらの結果より、 O
S
T
の精製は完了したと考えた。
5
2
-2 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C2
1V株からの O
S
Tの諸性質
精製された O
S
T を用いて性質を検討した。ゲル滞、過による分子量は約 6
7
k
D
aであった (
F
i
g
.
5
3
)。また、精製した本酵素を S
D
S
P
A
G
E に供したところ分
子量約 6
5k
D
aの位置に一本のバンドが得られたことから、 O
S
Tは分子量約 6
5
k
D
aのモノマーであることが示された (
F
i
g
.
5
4，5
5
)。
O
S
Tの基質の特異性について調べた。これまでに晴乳類や植物の S
T におい
て硫酸基受容体として報告されている物質や、 d
c
S
T
X、 n
e
o
S
T
Xは O
S
T活性
には影響をほとんど与えなかったが、 S
T
Xを加えた場合活性が約 4
2%にまで
1
06
O
Th戸組o
b
u
l
i
n
O-ST
67kD
a
/
ω
E
F
i
g
.
5之 N
a
t
i
v
e
P
A
G
Eo
fO-STf
r
o
mG
.catenatum(
le
f
t
)
組 d
5mmO-STa
c
t
i
v
i
t
yo
ft
h
es
l
i
c
e
dg
e
l
s(
r
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g
h
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)
.P
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i
f
i
e
d
O-STw
a
ss
u
b
j
e
c
t
e
dt
o1
2
.
5
%PAGEa
n
ds
t
a
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5
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Al
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C
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1Q
4
0.
1
り除くことができなかったため、 O
S
T活性を測 定するこ とはでき なかった O
D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e に供した結果、 O
S
Tは 0
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1MN
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C
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u
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2
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2
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3
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足立川和吋
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1
8
149
町
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O-ST
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N
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L-T
L-Tyramine
Dopamine
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4
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F
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5
.
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1
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STX
neoSTX
dcSTX
moT
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さ与さ﹀影液が液合適こ
o響 は オ 、 い 、 に 金
、供出いいの衝性衝場至る心影度九イ果おずンたを
合間性検功 H 緩 活 緩 の の あ
6 る温川属結にれオま
でふえ応ふ金たンらイ
場開問は川口 ps ぃ
40 ・与反てベオ見トた
た硫性必る悶高印仏
H も P H 0 ・g に 適 ・ 思 し 調 イ は し
えの滑れえ
性至
5.
4
1
5.
6
μuwu
一
一
s組 d
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x
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G
5.
1
2
わ語的約三7TZ
ω
打
寸ヨムプ﹂司
な
枇同県た応るのの直一
S 本場山町
聞いのる同た
POK 性はさ日子ゎ版す種問、ムは一
4
オ性レ
めは定れる
た
活 H 唆
た
j て求
ベ
S
H
認た測ィがか調いれ
P が P 示がべっ訂要た引イ活キ
ポまをん性。を用らは方応が度調吋かをえひ鉛り刀
E よ駒
生し異た響を号での反と温をお(ン加て
US
山川町淵ふ特ノイ
E4
のL に
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L 口 i)
P
m円
なり一一一一活
N5U
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A
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須代も
十平
、
'+i
のてめいい
B'LM・ 円
31
w
ノ
向
，
内
，
45
で
QU し /1
償問わ法制
例て治調副
外しガて酸
ユと犬い玄川
か体拾っは十
そ与淵に素
が供右性酵
た基凶異本
A 特、
し酸
下。硫にのず
低幻ら体れ
O-ST
ESSgω-oE
(白ぷ)諸
200
116 4.
7
9
66 一
(Table 5
A
B
1
0
1
0
(︻民﹄)
(京)
1
0
0
，
.
、
、
p
E
ト
意
〉
~ 100
こ
A
N
5
6
7
pH
8
25
30 35 40
TemperatureCC)
45
F
i
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f
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e
c
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eb
u
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r(
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f臼 g
epH4
6，
p
h
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s
p
h
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t
eb
u
f
f
e
ri
n也 er
a
n
g
epH6・8(
圃
)
， PIPESb
u
f
f
e
r白 血er姐 gepH
67
(0)
，1
宜主ESb
u
f
f
e
r血 也 er
a
n
g
epH7
8(
マ
)
，T
r
i
sb
u
f
f
e
ri
nt
h
er
a
n
g
epH8
9(A)
釦 dg
l
y
c
y
l
g
l
y
c
i
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eb
u
f
f
e
ri
n也 er
a
n
g
epH8
9
(
く
)
)
. B，O-STa
c
t
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i
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s
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y
e
da
t也e
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eunders
t
a
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i
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2
Ca
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3
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Z
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2+
1
7
9
4
2
5m MEDTA
100
T
、‘
度
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hA 虐厩
塩
J
ハHV
:古同
戸つつ
九た
のついか
見い
がと﹀
下 M た
低 0 つ
性、な
活らは
T がむ
もなこ
0 しる
にかれ
もしさ
と。害
とた阻
るしに
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nαtumGC21V
.
にか求必つ与
oに ら て び 影 の 明 低 完
性と要前一にの加見い及るそ創がが
活こをげの性ふ増がお
ぇ。卵性性
l
mU 与 幻 む 活 活
T たンヒ﹂物活ふの下に
もつオ初産汀明度低度。にふ劇で
。かイリ応一一農つ濃た性
-J
None
な湖町民日航仲間制町内削川い
R
e
l
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t
i
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c
t
i
v
i
t
y
(
%
)
b
合ら t と幻印出を、
の
宝
口 ふ た し ーη
T
F
場見幻こ一
悶，
pd 果S
J る影結か刷にが和川和か
たがかい
え化、なりあるのい、全口を果引に
加変らしふでえそ伴れ完ぬ響結
T
a
b
l
e5
4
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c
t
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t
y.
C
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t
i
o
na
5
2
3 PSP原因渦鞭毛藻 類における Q-STの分布
G
.c
at
e
n
at
u
mGC21V株を除く G
.c
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e
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u
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、 A
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e、 A
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、
A
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I
c
u
mおよび A
.o
s
t
e
n
f
e
l
d
I
Iの 5種 8株について O-STの分布を
56
ωと百 出
ω
-
ω﹀
Z
S
ω出
ωと百一ω出
3
。
o
0.
050.
1
0.
51
.0
0
0
5
.
0
1
.0
2.
0
C
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C
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F
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g.
5
・7
.E
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tofPAPo
n0・STa
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T
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F
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5
8.E
f
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N
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C
l
(国)姐dKCl(.)
o
nO-STa
c
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i
t
hp
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i
a
lp
u
r
i
f
i
e
d0 ST
・
調べた結果を T
a
b
l
e5
-5に示
Table5
5
.D
i
s
t
r
i
b
u
t
i
o
nofO-ST釦 l Ongt
o
X1C
d
i
n
o
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l
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l
l
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t
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l
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O-ST
a
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l
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S
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r
a
i
n
s
+
N
S
T と同様に G
.c
a
t
e
n
a
t
u
m
M
Z
1
3株以外の株で は、その比
MZ13
+
活性は低かった。
ID38
+
At
503A
+
At
304A
+
G
.c
a
t
e
n
a
t
u
m GC21V
A
.t
a
m
a
r
e
n
s
e
A
.c
αt
e
n
e
l
l
α
5
3 考察
G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mか ら の O-ST
Ack05
は
、P
A
P
Sのアナログである P
A
P
をリガンドとして結合したア
OF072
フィニティークロマトグラフ
A
.l
u
s
i
t
a
n
i
c
u
m ALIV
+
0287
+
A
.o
s
t
e
n
f
e
l
d
i
i
の活性が認められた。しかし、
ィーである P
A
P
a
g
a
r
o
s
eに吸
着したため、 N
S
T にくらベ非
常に少ないカラム操作で精製
を行うことが可能であった。
本カラムは、 S
T の精製の際に 汎用され、非 常に効果的な 操作であるこ とが報
告されている (
H
o
n
d
o
he
ta
l1
9
9
3， F
a
l
a
n
ye
ta
l
.1
9
8
9
)。
-G.catθn
a
t
u
mからの O-ST と N-ST の性質のまとめを T
a
b
l
e5
-6に示す o 0
S
Tは
、 6
5k
D
aのモノマーであり、 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mおよび A
.c
a
t
e
n
e
l
l
aから
精製した N
S
Tとほぼ同ーの 分子量を示し た。これまで に報告されて いる S
Tは
分子量約 3
0
3
5k
D
aのサブユニッ トから成るオ リゴマーであ り (
M
a
t
s
u
ia
n
d
H
o
m
m
m
a1
9
9
4
)、N
S
Tと O
S
T とも似約 6
0k
Daのモノマーと して活性を示 すこ
とは、これらの P
S
P毒に対する S
T に特徴的な側 面であるとい えるかもしれ な
57
T
a
b
l
e5
6.
C
o
m
p
a
r
i
s
o
no
f0・ STa
n
dN-STfromG
.c
a
t
e
n
a
t
u
mGC2
1V
0-ST
S
u
b
s
t
r
a
t
e
(
s
)
P
r
o
d
u
c
t
(
s
)
S
u
l
f
a
t
eDonor
Optmu
血 pH
1
1
θ，
s
h
y
d
r
o
x
ySTX
GTX2+3
PAPS
N -ST
S
1
χ
GTX2+3
S1
文 → G1χ5
GTX2+3→C1+C2
PAPS
7.
0
6
.
0
O
p
t
i
皿u
血 t
e
m
p
e
r
a
旬r
e
3
5o
C
2
5o
C
C
a
t
i
o
nRe午l
I
T
e
m
e
n
t
none
M
o
l
e
c
u
l
a
rWeight
Mg2+，
C02+
6
5kD
a(Monomer)
5
9kDa(Monomer)
し1。
本酵素の基質特異性を検討したところ、 l
1
h
y
dS
T
X を含む反応液に S
T
Xを
加えた場合のみ活性が約 4
0見にまで低下したが (
T
a
b
l
e5
2
)、 S
T
Xを基質と
して添加しでも他の P
S
P毒成分の生成が見られなかったことから、 O
S
Tは
、
1
1
h
y
dS
T
Xを特異的に硫酸基受容体として利用することが示唆された。また、
S
T
Xを加えた場合に O
S
T活性が低下し、 d
c
S
T
Xおよび n
e
o
S
T
X を加えた場合
には Q
S
T活性に顕著な変化が見られなかったことから、 O
S
Tの基質 の認識
にはカルバモイル基や N1位の O
H基の有無が重要であることが示唆された
(
F
i
g
.
1
1
)。今後は、 l
l
h
y
dn
e
o
S
T
X を調製し、 O
S
Tの硫酸基転移活性の有無
を検討する必要があると考えられる。また、本実験では
1
1
h
y
dS
T
Xの標準試
料が得られず、 O
S
Tの基質に対する親和性を検討することができなかった。
O
S
T活性に与える反応温度の影響を調べた結果、至適反応温度は
3
5o
cで
あり、同じ株から精製された N
S
Tより 1
0 C高かった。 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
m
G
C
2
1
V株
においては培養温度を変化させても毒組成は変化しないこと
が確認されている。
これらの二種類の S
Tの発現量が調節されることにより毒組成比が一定に保た
れている可能性があり、今後、温度変化に伴う 2つの S
Tの発現量の変化を調
0
58
ベる必要がある。 p
Hが O
S
T活性に与える影響を調べた結果、 O
S
Tの至適反
応 p
Hは H
E
P
E
S緩衝液を用いた場合 7・0であることが示されたが¥同ーの p
Hに
おいても緩衝液の種類により活性に大きな差が出ることが明
らかとなった o た
とえば至適反応 p
Hである 6
.
0
7・0においては、リン酸緩衝液を用いた場合
には活性が認められなかった o このことは、 F
l
a
v
e
li
ac
h
l
o
r
a
e
f
o
li
aから精製
された f
l
a
v
o
n
o
1
4
'
S
T が¥リン酸緩衝液を用いた場合に全く活性を示さない
という報告とよく似ており (
V
a
r
i
na
n
dl
b
r
a
h
i
m1
9
9
2
)、今後 は広域 緩衝液 等
を用いて、同一緩衝液における至適反応 p
Hを調べる必要があるだろう。
また、 O
S
Tは金属イオンを要求しないことが示された o G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1V
株の N
S
Tは C
o2+ とMg2+ によって活性が促進されることから、 O
S
Tは、金属
要求性において異なることが確認された。
また、代表的な P
.
S
P原因渦鞭毛藻類について O
S
Tの分布を調べたところ、 ι
A
c
a
t
e
印n
θ
e
l
l
a2株を除く 4種 6株にお いては O
かS
幻
Tの活性を確認できた。 ι
A
.
3
1
t
“
伽
印
θn
削
」品止にこ精製されている同と異なるためである t~ 5t Gh~ 。第 4 章で明らか
に な っ た よ う に 、 叶S
Tの至 適反 応条 件は 、山 に対 する
親和 性や 反応 の至
適 pHあるいは金属要求性などの点において G
c
N
S
Tのものとはかなり異なって
いる o そのため、今後は反応条件のさらなる検討を行つ必要
があり、またこれ
により A
.c
at
e
n
e
l
l
a2株においても O
S
Tの活性も見いだせることができる
かもしれない。このように検討の余地は残されているが、
O
S
Tも広く P
S
P原因
渦鞭毛藻類分布していることが示唆された o
以上をまとめると、 P
S
P毒の N
Z
1位と C
l
1位への硫酸化はそれぞれ異なる
2つの酵素によって行われることが明らかとなった o いずれの S
Tも非常に基質
特異性が高く、これらの酵素について遺伝子レベルでの研究
を進めることによ
って、 P
S
P毒の生合成経路の解明だけではなく、 P
S
P毒の生理学的意義にも迫
ム
ることが可能となるかもしれない。
市Z C 1 1
位の硫酸基はエステルと川
n
oe"h-C~\~こ川、硫酸基
転移反応ド先ムちまず C
l
l 位が O
H化されることが必要であると考えた。そ
こで、…ょを加水分解して、 C
l
1位が O
H化された 1
川 ，
β
s占h
y
刊
凶
d
針問
r 幻
を基質として酵素活性を検索したところ、 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
Vの粗酵素液中に
GTX24へと変換する活性 (
Q
S
T
)を見いだした。そこで、 G
.c
a
tθn
a
t
u
mG
C
2
1
V
株より D
E
A
E
c
e
l
l
u
l
o
s
e、P
A
P
a
g
a
r
o
s
e、M
o
n
oQの各カ ラムを 用いて か S
Tの精
59
a
D
k
5
製を試み、電気泳動的に単一に まで精製を行った。精製した本酵素は、 6
X にのみ 活悦有 し、硫 酸基供 与体と
T
S
問
yd
h
α ，s1
のモノマーで、 1
、
0で
.
Hは 7
5C、至適 p
Sに特異性を示した。また、反応の至適温度が 3
P
A
て P
反応に金属イオン を要求しなかった O 以 上 か ら 、 問 毒 の 山 位 と 川 立 ヘ ム
i
第 6章
P毒量と
S
mの日周期における P
u
t
a
θn
t
a
.c
G
T比活 性の変動
S
N
J
0
硫酸化は それぞれ異なる酵素によって行われることが明らかとなった
2
7
0
F
、 O
5卒
o
k
c
A
凶 a
L
e
t
a
.c
開株、 A
3州 、 A
t
、 A
8株
2
I
eH
s
n
e
r
a
m
a
.t
また、 A
n
mMZ13
u
t
a
n
e
t
a
.c
7株および G
8
2
0
ii
ld
e
f
n
e
t
s
、 A・o
mALlV株
u
c
I
n
a
t
i
s
u
.l
A
a
l
l
e
n
e
t
a
.c
Tは A
S
Tの活性を測定した。その結果、 O
S
の計 5種 8株ついて O
、
株
P原因藻類に広く存在す
S
Tは P
S
の 2株を除く 7株において活性が確認され、 O
る酵素であると考えられた。
1位の 2カ所に硫酸基付加部位が有り、それぞれに
1
1位と C
2
P毒には N
S
P
nより見出し、精製した。
w
t
a
n
e
t
a
.c
Tを G
Tお よ び か S
S
対して特異的な N
P毒成分に対してのみ活性を有
S
Tは、いづれも基質特異性が高く P
これらの S
a
l
l
e
tθn
a
.c
mとは属レベルで異なる A
u
t
a
n
e
t
a
.c
Tについては G
S
した。特に、 N
P毒原因微細藻類に広〈存
S
、 P
Tが
からも見出されたことにより、これらの S
、
m
u
t
a
n
e
t
a
.c
P毒原因渦鞭毛藻類、 G
S
在する可能性がある。そこで、代表的な P
iの 5
i
d
l
e
f
n
e
t
s
.o
nおよび A
w
c
i
n
a
t
i
s
u
.l
、 A
a
l
l
e
n
e
t
a
.c
e、A
s
n
e
r
a
m
a
.t
A
Tの分布を調べたところ、 N-STは全ての株にお
S
Tと O
S
種 9株について N
aの 2株を除く 7株において活性が確認さ
l
l
e
n
e
at
.c
いて、また、 0・STは A
れた。
P毒原因藻類に広く存在する可能性が示さ
S
このように、これらの ST が~" P
P毒原因微細藻類を検出し、
S
T を海域における P
S
Tと O
S
れたことから、 N
動態を追跡するためのマーカーとして用いることが期待される。しかし一方で、
T活性が検出されたことから、
S
mにおいて N
u
t
a
n
e
t
a
.c
P毒を生産しない G
S
P
)
7
9
9
P毒の生合成にはリンクしていない酵素であるとの報告(大島 1
S
、 P
Tは
S
N
Tの関係を明らかにする必要がある。
P毒の生合成とこれらの S
S
もあり、 P
eを
s
n
e
y
d
n
u
.f
)は同調化された A
7
9
9
1
g ら(
l
u
b
n
e
d
l
O
n
e
h
c
n
o
r
a
最近になり、 T
P毒量を測定した。その結果、 l細胞当たりの毒量
S
用いて、 各細胞周期の P
P毒生合成と細胞周期の関連
S
l期にのみ増加することが明らかとなり、 P
は G
mを用いて、同調化を試みた
u
t
a
n
e
t
a
.c
を主張している。そこで本章では、 G
T
P毒量の変化を調べることにより、 S
S
Tの比活性と藻体内の P
上で日周期での S
P毒の生合成に直接関与した酵素であるのかについて検討を行った。な
S
、 P
が
Tの活性
S
お本実験では、日周期の各時間ごとに採取できる藻体量が微量で、 O
Tのみの
S
の検出は困難であったため、比活性が低い場合でも測定が可能な N
活性を測定した。
1 材料及び方法
6
V株の同調化の試み
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
1 G
1
6
Dの
0
:1
L
4
)の方法に従った。 1
7
9
9
1
gら(
l
u
b
n
e
d
l
O
n
e
h
c
n
o
r
a
培養株の同調化は T
2 時間の暗
V株の培養藻体を 8
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
明暗周期下で培養していた G
Dの明暗周期
0
L:1
4
l期にそろえた後、再び 1
条件下に置くことにより細胞を G
8 時関与える処理
8時間と 3
を与えて細胞の同調化を試みた。また、暗条件を 5
60
61
についても本食言すした。
リン酸緩衝液 (
p
H7
.
0
)で洗浄した。なお核染色は、
6
1
2 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V株の各日周期のサンプルの採取
対数増殖期の細胞を 5
0
0c
e
l
l
s
/
m
l になるように 2
Lの駒形フラスコ 8本に
接種し、 7本を N
S
T活性測定用、 1本を毒量測定用および細胞周期解析用と
した。接種後 5日目の 9時から翌日 9時まで 2時間毎に 2
Lずつの集藻を計 7
回行った 。同時に 毒量測定 用の 1本から毒 量測定用 および細 胞周期解 析用サ
ンプルとして 3
0m
l ずつ培養液を採取した。
6
1
3 毒量 ・毒組成の測定
毒量測定用サンプルを氷冷 下で計 3分間の超音波破砕を行い、ウルトラフリ
ーC
3
L
G
C
(
M
i
l
l
i
p
o
r
e 社 ) を 用 い て 8，
1
0
0
gx2
0の遠心分離(トミー精 工社
M
R
X
1
5
0
)による分子量 1
0，
0
0
0での限外漉過を行った。得られた鴻液を H
P
L
C蛍
光分析に供 し
、 2-1-4に従って毒量・毒組成を測定した。
6
1
4 粗酵素液の調製
藻体湿重 量 の 2倍量の 5
0m
MT
r
i
s
H
C
lb
u
f
f
e
r(
p
H
8
.
0
) に懸濁し 、氷冷下
で計 5分間の超音波破砕を行った。 4
0，
O
O
O
gX 3
0
m
i
nの超遠心分離 (
K
o
n
t
r
o
n社
C
e
n
t
r
i
k
o
nT
2
0
8
0
) によって得た上清に硫酸アンモニウムを 8
0%飽和になる
ように加え、撹持しながら 5Cで塩析を行った。次に 2
5，
O
O
O
gX 3
0
m
i
nの遠心
分離によって得た沈澱を 5
0凶 リ ン 酸 緩 衝 液 (
p
H
7
.
0
) に溶解し、同緩衝液に
0
対して一晩透析を行ったものを粗酵素液とした。得られた組酵素液を用いて、
3
1
2に従い N
S
Tの活性を測定した。また同時に、 3
1
7に従いタンパク質の
定量を行った。
P
I が退色しないようにフ
ローサイトメーターによる分析の 直前に行った。
6
1
5
2 フローサイトメーターによる解析
フローサ イトメー ターには E
P
I
C
SE
l
i
t
eF
l
o
wC
y
t
o
m
e
t
a
r(
C
o
u
l
t
e
r社)を
使用した 。サンプ ルの励起 レーザー として、 波長が P
I の励起波 長域にあ る
4
8
8
n
mのアルゴンレーザーを用いた。 P
Iの蛍光波長を 6
1
0
6
2
0
n
m(P
M
T
4)と
し、これ に加えて 前方散乱 光 (
F
o
w
a
r
dS
c
a
t
t
e
r :F
S )と側方 散乱光( S
i
d
e
S
c
a
t
t
e
r :S
S (P
M
T
1 ))を検出パラメータとした。なお前方散乱光と側方散
乱光はそれぞれ細胞の大きさと細胞表面の複雑さに相関のあるパラメーターで
ある。
6
1
5
1 のサンプルを 80μmのナイロンフィルターで鴻過し、フローサイ
トメーターに供した。まず、前方散乱光と側方散乱光の 2つのパラメーターよ
り、本藻と考えられる細胞集団をゲーティングし、ゲート内の細胞について P
I
赤色蛍光量を測定した。
6
2 結果
6
2
1 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V株の同調化の試み
T
a
r
o
n
c
h
e
n
O
l
d
e
n
b
u
l
g ら(
1
9
9
7
)の方法に従い、 G
.c
a
tθn
a
t
u
mG
C
2
1
V株 の 同
調化を試みた。しかし、 8
2時間の暗期条件下に細胞を置くことにより、ほぼ全
細胞が死滅した。
そこで、暗期に置く時間を 5
8時間と 3
8時間と短くした条
件についても検討を行った。しかし、 5
8時間でもほぼ全細胞が死滅した。また、
3
8時間でも生細胞はいるものの、通常の明暗周期を与えても増殖は認められな
かった。また、 3
8時間暗条件下に置いた細胞についてフローサイトメーターに
6
1
5 細胞周期の解析
6
1
5
1 細胞周期解析用サンプルの調製
6
1
2の細胞周期解析用の藻体を 1
，
2
0
0
gX5
m
i
nの遠心分離により集めた後、
0
.
1
M リン酸緩衝液 (
p
H7
.
0
) に懸濁した。懸濁した細胞に 4m
l の 99.5% エ
タノールを加え、 2
0o
C 下で最低 2
4時間放置 し、固定 および自 家蛍光色 素
の脱色を行った。色素を完全に脱色した後、このサンプルを 2
，
7
0
0
gX 5
m
i
nの
遠心分離を行い、上清を除去し、 0
.
1M リン酸緩衝液 (
p
H7
.
0
) で洗浄した。
次にこのサンプルに R
N
a
s
eを 1
皿g
/
m
l になるように添加し、 3
7ロC で 1時間反
応させた。その後、 0
.
1M リン酸緩衝液 (
p
H7
.
0
)で洗浄し、 P
r
o
p
i
d
i
u
mI
o
d
i
d
e
(
P
I
)を 1
0g
/
m
lになるように加え、氷冷下で核染色を 3
0分間行った後、 0
.
1M
62
よって 2
4時間細胞周期を解析したところ、約 9割の細胞は G
1期にとどまっ
たままで、 T
a
r
o
n
c
h
e
n
O
l
d
e
n
b
u
l
g らの方法をそのまま本藻ヘ適用することは不
可能であった。
6
2
1 G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mG
C
2
1
V培養株の日周期における N
S
T活 性 と P
S
P 毒量
の変動
本藻の同調化をあきらめ、対数増殖期の 1回の明暗サイクルを通じて 二時間
おきに藻 体を集め 、毒量の 変化およ び N
S
T活性の変化について調べた。また
同時に細 胞周期に ついても フローサ イトメト リーによ り検討し た。その 結果を
F
i
g
.6
1 に示す。
まず毒量 は、明期 にはタン パク質 1
m
g当たり 0
.
3
0
.
5p
m
o
l
eで推移し、暗
63
1
.
5
に大きな変化が見られることはよく
L
i t
1
.
5
日
..
4
・
、
戸
A
・
L
u
a
〉
J
B
0
.
5
r
o
a
.
、
乙
ト
一
一
が
A
ミ
21AU
言1.0
H
r
.
/
)
2
0
g
b
o
g
n円)ロロ♀仏∞仏
∞
( ハU
。
。
1
11
31
51
71
92
12
3
3 5 7
Time
Fig.6・1
. Changesi
nt
h
ePSPt
o
x
i
nc
o
n
t
e
n
tandN-STa
c
t
i
v
i
t
ya
saf
u
n
c
t
i
o
nofal
d
i
g
a
h
r
t
kc
y
c
l
ei
nb
a
t
c
hc
u
l
t
u
r
eofG.catel
1
αt
U
1
7
1GC21V.
C
e
l
l
si
ne
a
r
l
ye
x
p
o
n
e
n
t
i
a
lphasewereu
s
e
dand1
1
1
0
n
i
t
o
r
e
da
t2hi
n
t
e
r
v
a
l
s[
o
r24h
.(
A
)，PSP
r
o
x
i
nc
o
n
t
e
n
tp
e
rmgp
r
o
t
e
i
n
;(8)，
N-STa
c
t
i
v
i
t
yt
oGTX2+3 measured
1
問時 d
i
a
l
y
s
e
d(NH
4
)
2
S04p
r
e
c
i
p
i
t
a
t
e
期にはいると毒量が急激に増大して
達し、その後再び減少した。タ
、暗期の中期にはピークとなり約
ンパク質当たりの毒量は、明期
1
.
4p
m
o
l
e
から暗期
にかけ
5倍に増えた。細胞周期を解析したところ
、日周期を通じ 8
0
8
5
%の
細胞が G
1期であり、細胞の分裂はわずかしか認め
られなかった。しかし、細
胞分裂期を示す G
2
+
M期の細胞は暗期の後期にわずかながら(
約 5%)増加した。
一方 、N
S
T活性は、明期には低く 0
.
3
0
.
5
μ 日I
h
.m
gであったのが、暗期には
いると最大で1.3
μM
Ih・m
gにまで上昇し、毒量の変動と非常に 一致
て最大で
した挙動
を示した。
6
3 考察
これまでの報告で G
.c
at
e
n
at
u
m(吉田 1
9
9
5
)、A
.c
a
t
e
n
e
l
l
a(
B
o
y
e
re
ta
l
.
1
9
8
7
)、A
.t
a
m
a
r
e
n
s
e(
K
i
me
ta
l
.1
9
9
3a、
) A
.e
x
c
a
v
a
t
u
m(
O
s
h
i
m
ae
ta
l
.1
9
7
8
)、
A
.f
u
n
d
y
e
n
s
e(And
e
r
s
o
ne
ta
l
.1
9
9
0
b
)、p
y
r
o
d
i
n
i
u
mb
a
h
a
m
e
n
s
e(
U
s
u
pe
ta
l
.
1
9
9
4
)などの有毒渦鞭毛藻において、増殖
段階によって 1細胞 あた りの 毒量
64
知られている。増殖時に劇的に毒量
が増加
するという現象は、細胞分裂による
娘細胞への毒の分配 (
d
i
v
i
s
i
o
n1
o
s
s
)、異
化作用や培養液中 への漏 出 (
t
r
u
e1
o
s
s
) といった損失の総量と P
S
P毒生合成
量 との 差を反映しており、 対数増殖
期には後者の量が前者を上回るため
である
とAnd
e
r
s
o
n らは指摘している(And
e
r
s
o
ne
ta
l・ 1
9
9
0
b
)0さら に定 常期 の毒
量の低下は C
O
zと N
03- の欠之が P
S
P毒生合成に何らか の影響を与えていると
述べている また 毒組成につい
ては、ほぼ一定に保た れることがし
られて い
るo 最近、 T
;
r
o
山 n
O
l帥 u
l
g ら(問問、 同調化した A
. fU岬
L
I
いて、 G
1期にのみ P
S
P毒が生合成 され、 G
2、 M
S期 に は P
S
P毒が生合成
されないことを 示 し
、 P
S
P毒生合成 と細胞周期 の関連を主張して
いる o そこで
本研究でも、 T
a
r
o
n
c
h
e
n
O
l
d
e
n
b
u
l
g らの方法に従って同調化を試みた o
しかし
G
.c
a
t
e
n
a
t
u
mにおいては 長期 の暗期によるストレス
から細胞の死滅や G
1期
の長期化が著 しく、本藻への適用は
困難を極め、残念ながら 同調化し
た細胞は
得られなかった o 以前に金ら (
1
9
9
3a)
が A
・t
a
m
a
r
e
n
s
eにおいて暗期後半に細
品分裂が行われており、同時期に毒
量が増加することを報告している
o そこで
本研究でピーと N
S
T活性の日周変動について検討することと
した
また、
毒量 を 1
たりで表わした場合、分裂前の細胞
サイズの 増 に 伴 っ て 駐
が増加する可能性があるので、タン
パク 質 1mg 当たりでの毒豆を
求 め、その
変動を調べた o これにより、 N
S
Tの活性をタンパク質 1m
g当たり の比活性で
表わしているので、毒量と比活性の
変動を同じ次元で比較することが可
能であ
L
ぷL
f
;
T
L
L
る
O
期の解析を行ったところ、 G
.c
a
t側 四 は 明 確 な 細 胞周期を
示さないものの、毒量ド亦動が認め
られた o 海洋の独立栄養の渦鞭
毛藻は、概
日時計(伽
C
y
c
l
e
)を持つと考えられている (
ω
D
o
叫1
a
油he
t叫
a
1
.1
9
9
5
)
0T
a
r
o
n
c
h
e
n
O
l
d
e
n
b
u
l
kら
の実 験でも 1
4
hL
i
g
h
t:1
0
hD
a
r
kの明暗周期を用いており、これによ
って細
胞に 概日 リズ ムが 与えられてい
るものと思われる o 従って、 町
毒生合成が
いわゆる D
N
A合成などの細胞周期と関連するのか、光
合成なとの他の 日周性
の代謝系 (
P
r
e
z
e
l
ne
ta
l・ 1
9
7
7
)と関連するのか判別できない o しかし
、 N
S
T
の活性の変動は毒量の変化と非常に
よく相関したことから、 N
S
Tは
、 P
S
P毒
合成と直接関連した酵素であること
が示唆された o
今回、 O
S
Tについては、日周期の各時間で採取でき
る藻体が微量であること
と、活性の検山成昨が低いことから
検討できなかった o これについて
は、モノ
クロ ーナ ル抗 ム作 製す る必 要が
ある と思 われ る また、抗体を
用いることに
よって、比活性ではなく発現量の変
化を追跡することができ、 P
S
P毒生合成と
“
O
65
Tと
S
これらの酵素の関係がより明確になるものと思われる o このように、 N
P毒原因生物を検出し、動態を追跡するためのマーカーとしてだけ
S
Tは P
S
O
ではなく、
P毒生合成機構を解明するための一助として大いに期待される o
S
P
)は、有毒渦鞭毛藻をプ
P
S
g :P
n
i
n
o
s
i
o
hp
s
i
f
l
l
e
h
cs
i
t
y
l
a
l
a
p
麻痩性 貝毒 (
ランクトンフィーダーである 二枚貝が摂食し毒化する現象で、毒化した貝を 人
4 摘要
6
が食するとふぐ中毒に 似た 高死亡率 の食中 毒を引 き起こすことから、食品衛生
P毒の生合成についての知見はほぼ皆無に等しい のが現状であるがつ 1
S
P
取近になり高度に同調化した
章総指
第7
n仰
u
.f
A
eを 用 い 、 問 毒の生合成が泊胞月
s
凶
e
l期に行われることが報告された。そこでまず、 G ω t
期の G
mについて
u
P の原因藻として知られる渦鞭毛藻
S
問題となっている。 P
種と
m属の
u
ri
d
n
a
x
le
A
mは、世界各地の沿岸域で毎年 のように繰 り返し 発
u
t
a
n
e
t
a
mc
u
i
n
i
d
o
n
m
y
G
生し、水産業に大きな被害をもたらしている。さらに、大型船のパラスト水中
同調化を試みたが、高度に向調化した細胞を得ることはできなかった o 次に、
P原肉種が
S
P原因渦鞭毛藻のシスト(休眠接合子)によって、 P
S
に混入する P
1回の明暗サイクルを通じて 二時間おきに藻体を集め、毒量の変化、細胞周期
T活性の変化について調べた。その結果、毒量は、暗期にはいると
S
および N
T活性は毒量の変動と非借
S
増大し、明期に比べ約 5倍に上昇した o さらに、 N
P分布域の拡大化の解明は
S
世界中に伝幡しているのではとの指摘もなされ、 P
急務となっている。
M期の細胞は暗期の後期にわずかながら増加した。
+
2
l期であり、 G
の細胞が G
P の原因毒は、すべて 三環性 の基本構造 を持ち、側鎖構造の違いによりサ
S
P
)な
X
T
n :G
i
x
o
t
u
a
y
n
o
g
) やゴニオトキシン (
X
T
n :S
i
x
o
t
i
x
a
s
キシトキシン (
P毒成分について、
S
0成分から成る。これまでに 藻体が生産 する多様な P
ど約 2
1細胞 当たりの総毒量 は培養周期や培養条件に よって大きく変動するものの、
これは、 一般的に渦鞭毛藻類が明け方に細胞分裂を行うことに 一致した。しか
各毒成分の組成比は 一定であることが明らかとなっている。さらに 、異なる母
P毒の生合成が細胞周期
S
、 高度 に同調化した細胞が得られなかったため、 P
し
組成比を有する親株間での交配によって得られた
と関連したものなのか、あるいは、サーカデイアンリズムのような他の要因に
) の遺伝様式 に従う 遺
l
a
t
n
e
r
a
p
i
b
、 毒組成比が両親性 (
ずれかの組成比を 示 し
よるのかは明確な結論を見出すまでにはいたらなかった。以上の結果を踏まテ
P毒の基本品
S
P毒の組成比は、 P
S
伝形質であることが明らかとなっている。 P
Tが 凶P原因生物の現場海域における臓をモニタリング すよ
この二つの S
格形成後の修飾・変換に関 与する種々の酵素反応の結果を反映していると考え
P毒
S
られるが、これらの酵素についての報告は皆無であった。藻体の有する P
;一致した挙動を示したことから、間毒の合成系 とリンクした酵素であるこ
こ
とが強く 示唆された。細胞周期について調べたところ、日周期を通じ 80-85%
2
P毒の生合成機構を解明するた
S
で重要 なマーカーとして利用でき、さらに、 P
めの 一助となることが期待される。
1株の毒組成比は、親株のい
F
1位に硫酸基 が付加した成分が多
1
1位あるいは C
2
成分に注目すると、骨格の N
く含まれている。 一方、硫酸化反応は、抱合反応の ーっとして、ホルモンや薬
剤等の 生理活性物質の消長に関わる 重要 な反応であることが、近年明らかにさ
P毒に対して特異的 な
S
れつつある。そこで本研究では、 上記渦鞭毛藻類より P
)を精製して、その性質を明らかにすると
T
S
:
e
s
a
r
e
f
s
n
a
r
t
o
f
l
u
s
硫酸基転移酵素 (
P原因藻類に
S
Tの P
ともに、 毒の生合成との関係についても考察した。また、 S
おける分布についても調べた。得られた成果は以下のように総指できる。
aの毒成分
l
l
e
n
e
t
a
.c
eおよび A
s
e
r
a
m
a
mt
u
i
r
d
n
a
x
e
l
. 各海域から分離した A
1
組成比の地域性
1株、播磨灘産 7株、渥美
7株(大船渡湾産 7株、広島湾産 1
e2
s
e
r
a
m
a
.t
A
5株(大船渡湾産 4株、田辺湾産 7株、播磨灘産 5
a2
l
l
e
n
e
t
a
.c
、 A
)
湾産 2株
株、浦ノ内湾産 4株、山川湾産 5株)の全ての株について 毒成分 を測定し、両
種についてそれぞれ分離地ごとにまとめ、比較 を行った。その結果、各地域ご
66
67
Aやモ
N
R
とに岡有の毒組成比が存在することが示された。これらの株について r
.
θおよび A
s
e
r
a
m
a
.t
V株は、 A
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
本研究に用いたスペイン産 G
aにくらべ 1細胞当たりの毒量が高く、主成分として分子内 に硫酸基
l
l
e
n
e
t
a
c
Rの各種カラム操作によ
H
0
0
2
x
e
d
r
e
p
u
l、 S
r
a
e
p
o
y
o
dT
e
g、R
n
i
t
a
l
e
h
pC
a
r
T
h
g
i
H
5
o
k
c
A
a
l
l
e
n
e
t
a
.c
Tの性質を検討したところ、 A
-S
って精製を行った。精製した N
S
P
A
3のみに 活性 を有し、 P
+
X2
T
Xと G
T
Tも基質特異性 は極めて 高 く S
S
株の N
Hは 5.0
C、至適 p
5o
のみを硫酸基供与体 として利用した。反応の 至適温度は 2
m値
3 に対する K
+
2
X
T
Xと G
T
であり、反応に金属イオンは要求しなかった。 S
V株より精
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
9 μMであった。 G
.
0 μM と 2
.
は、それぞれ 4
Tの性質と比較するといくつかの点で差異が認められるものの、とも
S
製した N
1位のみに硫酸基を付
2
3の N
+
X2
T
Xと G
T
S を硫酸基の供与体とし、 S
P
A
に P
、
sθHI28株
n
e
r
a
m
a
P原因渦鞭毛藻 A.t
S
加する酵素であった。また、代表的な P
.
V株、 A
I
L
mA
u
c
i
n
a
t
i
s
u
.l
2株、 A
7
0
F
aO
l
l
e
n
e
t
a
.c
3株、 A
0
5
t
4株、 A
0
3
t
A
Tの活性
S
3の計 5種 7株ついて N
1
Z
mM
u
t
a
n
e
t
a
.c
7株および G
8
2
0
ii
ld
e
f
n
e
t
s
o
P
S
Tが P
S
Tは全ての株において活性が検出され、 N
S
を測定した。その結果、 N
2を多く 含むことから硫酸基転移酵素の検索には最適な株で
+
l
が 2個付加した C
原因渦鞭毛藻類に遍在する酵素であることが示唆された。
ノクローナル抗体を用いた分子分類が行われ、同種 であること認められている
ことから、藻体の持つ毒組成比を種内解析に用い ることが可能であることが邪
唆され、今後、毒組成比を有毒種の人為的な伝播 を追跡するためのマーカーと
l位
l
して利用することが期待される。また、いずれの株においても基本骨格の C
P房
S
1位に硫酸基を有する毒成分を多く含むことから、硫酸基転移反応が P
2
や N
の生合成にお いて 重要 な反応の 一つであると考えた。
1 位に硫酸基 を付加する酵素
2
P毒 の N
S
mからの P
u
t
a
n
e
t
a
mc
u
i
n
i
d
o
n
m
y
. G
2
)の精製とその性質
T
S
e :N
s
a
r
e
f
s
n
a
r
t
o
f
l
u
s
N
(
)
S
P
A
P
e(
t
a
f
l
u
s
o
h
p
s
o
h
p
'
e5
n
i
s
o
n
e
d
a
o
h
p
s
o
h
p
'
あると判断した。検索の結果、 3
1位に硫酸基 を付加してそれぞ
2
3の N
+
X2
T
Xと G
T
S
01の
0
)を見いだした o そこで、約 2
T
S
N
2へと変換する酵素 (
+
l
X5と C
T
れG
oQ、
n
、 日o
r1
a
e
p
o
y
o
eT
u
e、 B1
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
培養から藻体を集め、硫安分画、 D
Tを電気泳動的に単一にまで精製
S
Rの各種カラム操作を行い、 N
H
0
0
x2
e
d
r
e
p
u
S
aのモノマーで、
D
9k
を行った。精製した本酵素の諸性質を検討したところ、 5
3のみに活性を有した。硫酸基供与体と
+
X2
T
Xと G
T
質特異性は煙めて高く S
+によって活性が促進された。ま
2
0
+と C
S に対して特異性を有し、Mg2
P
A
して P
3に対する
+
X2
T
Xと G
T
0であり、 S
.
Hは 6
5C、至適 p
た、反応の 至適温度は 2
問 29.8μHであった。
μ、
1
.
6
m値は、それぞれ 1
K
を硫酸基 の供与体とし、
0
P原因
S
Tの精製とその性質ならびに P
S
aからの N
l
l
e
n
e
t
a
mc
u
i
r
d
n
a
x
e
l
. A
3
Tの分布
S
渦鞭毛藻類における N
θであ
s
n
e
r
a
m
a
.t
aおよび A
l
l
e
n
e
t
a
.c
P原因藻が A
S
本における 主たる P
Tの検索を行ってきたが、非常に
P毒に対して特異的な S
S
ることに留意して、 P
0
1 位 の 硫 酸 基 を 付 加 す る 酵素 (
1
mか ら の C
u
t
a
n
e
t
a
mc
u
i
n
i
d
o
n
m
y
. G
4
P原因渦鞭毛藻類にお
S
) の精製とその性質ならびに P
T
S
O
e:
s
a
r
e
f
s
n
a
r
t
o
f
l
u
s
Tの分布
S
ける O
1位の硫酸基 はエステルとして付加されていることから、硫酸 基
l
P毒の C
S
P
H化されることが必要ではないかと考えた。
l 位が O
l
転移反応に先立ちまず C
X
T
yS
x
o
r
d
y
h
β
1-α，
H化された 1
l位が O
l
3を加水分解して、 C
+
X2
T
そこで、 G
Vの粗酵素液中
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
を基質 として酵素活性を検索したところ、 G
V
1
2
C
mG
u
t
a
n
e
t
a
.c
)を見いだした。そこで、 G
T
S
O
3へと変換する活性 (
+
2
X
T
にG
Tの
S
oQ の各カラムを用いて O
n
o
e、 M
s
o
r
a
g
a
P
A
e、 P
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
株より D
a
D
k
5
精製を試み、電気泳動的に単一にまで精製を行った。精製した本酵素は、 6
Xにのみ活性を 有 し、硫酸基供与体 として
T
1-α3β-hydroxyS
のモノマーで、 1
0で、反
.
Hは 6
5C、至適 p
Sに特異性 を示 した。また、反応の 至適温度が 3
P
A
P
1位への硫
l
1位と C
2
P毒の N
S
応に 金属 イオンを要求しなかった。以上から、 P
0
酸化はそれぞれ異なる酵素によって行われることが明らかとなった。
微弱な活性しか検出されず、その精製は困難で あった。そこで、前章で、精製し
、
5株
o
k
c
aA
l
l
e
n
e
t
a
.c
、 A
3株
0
5
t
、 A
4株
0
3
t
、 A
8株
2
I
eH
s
n
e
r
a
m
a
.t
また、 A
m属
u
ri
d
n
a
x
le
Tの性質に基づき、大量培養 により集めた A
S
明らかとなった N
m
u
t
a
n
e
t
a
.c
7株および G
8
2
0
i
i
d
l
e
f
n
e
t
s
.o
、 A
1V株
L
iCUJJlA
n
a
t
i
s
u
.l
、 A
2株
7
0
F
O
aの
l
l
e
n
e
t
a
.c
Tは A
S
Tの活性を測定した結果、 O
S
3の計 5種 8株ついて O
1
Z
M
P原因穣類に広く 存在 する
S
Tが P
S
2株を除く 7株において活性が確認され、 O
T
S
Tの精製を再検討した o N
S
aの種からの N
l
l
e
n
e
t
a
.c
eおよび A
s
e
r
a
m
a
.t
A
Tの活性
S
を除していく上で、町あるいは山の成分組成比が高い株は N
5株の毒成分
o
k
c
aA
l
l
e
n
e
t
a
.c
が高いことが期待される o 高知県浦ノ内湾産 A
Tの活性が高いものと考
S
2であることから、 N
+
l
5%が C
を調べたところ、約 9
、
r1
a
e
p
o
y
o
eT
u
e、 B1
s
o
l
u
l
l
e
c
E
A
E
Tを精製を試みた o 硫安分画、 D
S
え、本株より N
68
酵素であると考えられた。
T比活性
S
P毒量 と N
S
V株の 日周期に おける P
1
2
C
tUJJl G
a
n
e
t
a
mc
u
i
n
i
d
o
n
m
y
. G
5
69
の変動
謝辞
N
S
Tが P
S
P毒の生合成に 直接関与した酵素 であるのかについ て検討を行うた
めに、対数増殖期 の 1回の明暗サイクル を通じて 二時間おきに藻体 を集め、毒
量の変化、細胞周 期および N
S
T活性の変化について調べた。その結果、毒量は、
暗期に入ると増大 し、明期に比べ約 5倍に上昇した。細 胞周期について調 べた
ところ、日周期を通じ
8
0
8
5
%の細胞が G
l期であり、 G
2
+
M期の細胞は暗期の 後
期にわずかながら増加した。これは、 一般的に渦鞭毛藻類、が明け方に細胞分裂
本論文を 書 き終えるにあたり 、終始ご懇篤なる ご指導ならびにご 鞭縫を賜り
ました京都大学大 学院農学研究科助 教授の 左子 芳彦先生 に心から感謝申し 上 げ
ます。
また、様々なご指 導、助 言 を頂いた同教授内 田有恒先生、同助 手吉永郁夫先
を行うことに 一致した。しかし、高度に向調化した細胞が得られなかったため、
生そして福山大学 工学部教授石田祐 三郎先生にも深く お礼申し 上げます。
また、酵素反応 の基質として用 いる P
S
P毒成分を精製し て頂いた鹿児 島大
P
S
P毒の生合成が細胞 周期と関連した ものなのか、あ るいは、サーカ ディアン
学水産学部の荒 川修先生と長崎 大学水産 学部の野口 玉雄 先 生、 H
P
L
C蛍光分析
リズムのような他 の要因によるのか は明確な結論を見 出すまでにはいた らなか
用 P
S
P標準試料を分譲 してして頂いた 東北大学農学部 教 授 大 島泰 克先生 に深
った。 一方
、 N
S
T活性は毒量の変動 と非常に 一致した挙動を示したことから、
く感謝の意を表します。
N
S
T毒の合成系とリンクした酵素であることが強く示唆された。
類培養株分譲して 頂いた香川県赤潮 研究所の 吉松定昭博 士、南西海区水産 試験
G
y
m
n
o
d
i
n
I
u
mc
a
t
e
n
a
t
u
mならびに A1
e
x
a
n
d
ri
u
m属 藻
場の山口峰生博士 、愛知県水産試験 場の石田基雄様 およびビゴー海洋 研究所の
以仁の結果より、 P
S
P毒への硫酸基付 加反応は極めて 基質特異性の高 い 二 つ
のS
T、すなわち N
S
Tと O
S
Tによってなされる ことが明らかとな った。第 1章
で示した通り有毒 渦鞭毛藻類の示す P
S
P毒成分組成に地域 性が認められるこ と
から、 P
S
P毒の成分比を決定 する因子の 一つである S
Tの遺伝子の塩基配 列を比
較することによっ て、現在問題とな っている P
S
P原因生物の人為的 伝播を追跡
B
.R
e
g
u
e
r
a 博士に深く感謝いたします。
最後に、本研究 を行うに際しご 助力して頂いた 納谷憲幸様、角谷 友則様、藤
井亜湖様をはじめ とする研究室の 皆様や諸先輩 方に深く感謝し、 心からお礼申
し上げます。
できるかもしれな い。また、これら の S
TがI，P
S
P毒を生産する渦鞭 毛藻類に広
く認められたことから、 P
S
P生産する生物に対 するマーカーとし て N
S
Tと O
S
T
を利用できるの ではないだろう か。また、最近 になり明らかに なったいくつか
の S
T遺伝子の塩基配列の比較から、 S
Tが遺伝子ファミリ ーを形成している と
考えられている。今後、 N
S
T および O
S
Tの遺伝子の塩基配 列が明らかになる
ことで、 P
S
P毒に特異的な S
Tが¥どのような基 質に対する S
Tから分岐してき
たのかが推測きるものと思われ、 P
S
P毒の生理的な機 能を考える上で も非常に
興味深い。
70
71
参考文献
l
a
n
o
l
c
o
n
o
fm
no
o
i
t
a
c
i
l
p
p
.A
3a
9
9
.1
a，Y
d
i
h
s
. &I
o，Y
k
a
.， S
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