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ゾリンザカプセル100mgに関する資料 第2部（モジュール2） CTDの概要（サマリー） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 ―薬理― MSD株式会社 ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.1 緒言 目次 頁 図一覧............................................................................................................................................................. 2 略号及び用語の定義..................................................................................................................................... 3 2.6.1 緒言............................................................................................................................................. 4 2.6.1.1 参考文献............................................................................................................................. 5 2.6.1 緒言 - 1 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.1 緒言 図一覧 頁 図 2.6.1: 1 ボリノスタット及びその主要代謝物の構造式................................................................. 5 2.6.1 緒言 - 2 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.1 緒言 略号及び用語の定義 略号 SAHA L-001302381 L-000341257 CTCL HDAC IC50 定義 ボリノスタット（Vorinostat、開発番号：WIN64652、 AP390、MSK390、MK-0683又は L-001079038）の別称 ボリノスタットの O-グルクロン酸抱合体 4-アニリノ-4-オキソブタン酸（ボリノスタットの β-酸 化体） 皮膚 T 細胞性リンパ腫 ヒストン脱アセチル化酵素 50%阻害濃度 Suberoylanilide hydroxamic acid O-glucuronide of vorinostat 4-anilino-4-oxobutanoic acid （β-oxidation product of vorinostat） Cutaneous T-cell lymphoma Histone deacetylase 50% inhibition concentration 2.6.1 緒言 - 3 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.1 緒言 2.6.1 緒言 ボリノスタット（MK-0683、L-001079038、WIN64652、AP390、MSK390、SAHA）は新規の強 力なヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤であり、本承認申請では、再発又は難治性の皮 膚T細胞性リンパ腫（CTCL）への適用を予定している。ボリノスタット及びその主要代謝物の構 造式を[図2.6.1: 1]に示す。HDACは蛋白質のリジン残基、特にヌクレオソームコアヒストンのリ ジン残基に対する脱アセチル化反応を触媒する酵素群である。HDAC酵素群は3つのクラスが確認 されている[資料4.3: 4]。ボリノスタットは、クラスⅠ（HDAC1及び3）及びクラスⅡ（HDAC6） のHDACを阻害するが、クラスⅢのHDACは阻害しない[資料4.3: 2]、[資料4.3: 25]、[資料4.3: 4]。 アフィニティクロマトグラフィ精製したHDAC1に対するボリノスタットのin vitroにおける50% 阻害濃度（IC50）は30 nMである。ボリノスタットは、HDACを阻害しアセチル化ヒストンを蓄積 させることにより、細胞の分化やアポトーシスを誘導し腫瘍増殖を阻害すると考えられる遺伝子 の発現を活性化させ抗腫瘍効果を発揮すると考えられる。 一連の非臨床試験により、ボリノスタットの薬理、薬物動態及び毒性を評価した。ボリノスタ ットは、他の抗がん療法（放射線、キナーゼ阻害剤、細胞毒性薬剤及び分化誘導剤）と併用する ことにより、種々の培養がん細胞に対して相加的又は相乗的な効果を発揮した。また、ボリノス タットは、マウス腫瘍モデル及びヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、生物学的活性及び抗腫瘍活 性を示した。経口投与したボリノスタットは、試験動物において速やかに吸収され、薬理学的に 非活性の代謝物として消失した。主要代謝物は、ボリノスタットのグルクロン酸抱合体及び加水 分解後の β 酸化による生成物であった。経口投与毒性試験として、マウス、ラット、ウサギ又は イヌを用いた単回及び反復投与毒性試験、並びに生殖発生毒性試験を行った。遺伝毒性試験では、 ボリノスタットは弱陽性を示した。ラット及びイヌの反復投与毒性試験で認められた毒性は、ヒ トの副作用（食欲不振、体重減少、疲労、血液毒性、消化管障害）を予見させるものであり、通 常の診療でモニター可能なものであった。これら非臨床試験より得られた成績を本概要に記載し た。 2.6.1 緒言 - 4 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.1 緒言 ボリノスタット（分子量 264.3） L-001302381（O-グルクロン酸抱合体；分子量 440.5） L-000341257（β 酸化体、4-アニリノ-4-オキソブタン酸；分子量 193.2） 図 2.6.1: 1 2.6.1.1 ボリノスタット及びその主要代謝物の構造式 参考文献 [資料4.3: 2] [資料4.3: 4] [資料4.3: 25] Richon VM, Emiliani S, Verdin E, Webb Y, Breslow R, Rifkind RA, et al. A class of hybrid polar inducers of transformed cell differentiation inhibits histone deacetylases. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:3003-7. Marks PA, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nature Rev Cancer. 2001;1:194-202. Secrist JP, Zhou X, Richon VM. HDAC inhibitors for the treatment of cancer. Current Opinion in Investigational Drugs. 2003;4(12):1422-7. 2.6.1 緒言 - 5 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 目次 頁 表一覧............................................................................................................................................................. 3 図一覧............................................................................................................................................................. 4 略号及び用語の定義..................................................................................................................................... 5 2.6.2.1 まとめ................................................................................................................................. 6 2.6.2.2 効力を裏付ける試験......................................................................................................... 7 2.6.2.2.1 in vitro試験 ................................................................................................................. 7 2.6.2.2.1.1 ボリノスタットによるヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性阻 害 ......................................................................................................................... 7 2.6.2.2.1.2 ボリノスタットによるヒト由来培養がん細胞の増殖阻害 ......................... 8 2.6.2.2.1.3 細胞内ヒストンアセチル化に対するボリノスタットの効果 ..................... 9 2.6.2.2.1.4 ボリノスタットの作用機序 ........................................................................... 10 2.6.2.2.1.5 がん化学療法剤併用におけるボリノスタットの活性 ............................... 12 2.6.2.2.2 in vivo試験................................................................................................................ 15 2.6.2.2.2.1 ヒト前立腺癌細胞CWR22異種移植モデルに対するボリノスタット の効果 ............................................................................................................... 20 2.6.2.2.2.2 治療抵抗性APLトランスジェニックモデルにおけるボリノスタット の効果 ............................................................................................................... 21 2.6.2.2.2.3 ラットにおけるN-メチルニトロソウレア誘発性乳腺腫瘍に対するボ リノスタットの効果 ....................................................................................... 21 2.6.2.2.2.4 マウスにおける4-（メチルニトロソアミノ）-1-（3-ピリジル）-1-ブ タノン誘発性肺腫瘍に対するボリノスタットの効果 ............................... 22 2.6.2.2.2.5 ヒト乳癌細胞MDA-MB-231の異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対 するボリノスタットの効果 ........................................................................... 22 2.6.2.2.2.6 ヒト大腸癌細胞HCT-116の異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対す るボリノスタットの効果 ............................................................................... 23 2.6.2.2.2.7 ヒト大腸癌細胞HCT-15の異種移植モデルにおけるボリノスタット の効果 ............................................................................................................... 26 2.6.2.2.2.8 ヒト非小細胞肺癌細胞A549の異種移植モデルにおけるボリノスタ ットの効果 ....................................................................................................... 26 2.6.2.2.2.9 ヒト大腸癌細胞HCT-15及びHCT-116の異種移植モデルにおける5-フ ルオロウラシルの併用に伴うボリノスタットの効果 ............................... 27 2.6.2.3 副次的薬理試験............................................................................................................... 27 2.6.2.3.1 In vitro試験 ............................................................................................................... 27 2.6.2.3.1.1 ボリノスタットの特異性 ............................................................................... 27 2.6.2.3.1.2 ボリノスタット及びその代謝物の活性評価 ............................................... 27 2.6.2 薬理試験の概要文 - 1 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.3.2 2.6.2.4 In vivo試験 ............................................................................................................... 28 安全性薬理試験............................................................................................................... 28 2.6.2.4.1 経口投与によるラット呼吸機能試験 ................................................................... 28 2.6.2.4.2 経口投与によるラット機能観察総合評価（FOB）試験 ................................... 28 2.6.2.4.3 hERG発現細胞における電気生理学的評価 ......................................................... 29 2.6.2.4.4 経口投与によるイヌ心血管系テレメトリ試験 ................................................... 29 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用試験 ........................................................................................... 29 2.6.2.6 考察及び結論................................................................................................................... 30 2.6.2.7 参考文献........................................................................................................................... 31 2.6.2 薬理試験の概要文 - 2 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表一覧 頁 表 2.6.2: 1 ボリノスタットによるHDAC活性の阻害.......................................................................... 8 表 2.6.2: 2 他の抗がん剤との併用におけるボリノスタットのin vitro効果 ................................... 14 表 2.6.2: 3 ボリノスタットのin vivo抗腫瘍効果................................................................................ 16 表 2.6.2: 4 ボリノスタット及び主要代謝物の活性........................................................................... 28 2.6.2 薬理試験の概要文 - 3 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 図一覧 頁 図 2.6.2: 1 ボリノスタットによるヒト由来培養がん細胞の増殖阻害............................................. 9 図 2.6.2: 2 ボリノスタット処理したヒト大腸癌細胞HCT-116 の増殖阻害（A：48 時間培養） 及びヒストンH3 の高アセチル化（B：6 時間培養） .................................................. 10 図 2.6.2: 3 ヒト大腸癌HCT-116 異種移植マウスにおけるボリノスタットの用量依存的及び時 間依存的な腫瘍中アセチル化ヒストンH3 の蓄積........................................................ 24 図 2.6.2: 4 腫瘍中ヒストンH3 のアセチル化（A、B）に対するボリノスタットの影響及び血 漿中／腫瘍中ボリノスタット濃度（C、D） ................................................................ 25 2.6.2 薬理試験の概要文 - 4 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 略号及び用語の定義 略号 定義 SAHA Suberoylanilide hydroxamic acid L-001302381 O-glucronide of vorinostat L-000341257 5-FU 17-AAG 4-anilino-4-oxobutanoic acid（β-oxidative form of vorinostat） 5 fluorouracil 17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin APL CHO-K1 CML Cmax CMC CTCL CYP DLBCL ELISA FOB GI50 HAT HDAC hERG NCI NNK Acute promyelocytic leukemia Chinese hamster ovary-K1 Chronic myeloid leukemia Maximum serum concentration Carboxymethylcellulose Cutaneous T-cell lymphoma Cytochrome P450 Diffuse large B-cell lymphoma Enzyme-linked immunosorbent assay Functional Observational Battery 50% growth inhibition concentration Histone acetyltransferase Histone deacetylase Human ether-a-go-go related gene National Cancer Institute 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone NMU MEL MTV NAD N-methylnitrosourea Mouse erythroleukemia Median tumor volume Nicotinamide adenine dinucleotide PSA RAR mRNA siRNA SIRT SRB STAT T/C TRAIL Prostate specific antigen Retinoic acid receptor Messenger ribonucleic acid Small interfering RNA Sirtuin Sulforhodamine-B Signal transducer and transcription activator Treated tumor volume/control tumor volume Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand VEGF XIAP Vascular endothelial growth factor X-linked inhibitor of apoptosis protein 2.6.2 薬理試験の概要文 - 5 - ボリノスタット（Vorinostat、開発番 号：WIN64652、AP390、MSK390、 MK-0683又は L-001079038）の別称 ボリノスタットの O-グルクロン酸抱 合体 4-アニリノ-4-オキソブタン酸（ボリ ノスタットの β-酸化体） 5-フルオロウラシル 17-アリルアミノ-17-デメトキシゲル ダナマイシン 急性前骨髄球性白血病 チャイニーズハムスター卵巣-K1 慢性骨髄性白血病 最高血清中濃度 カルボキシメチルセルロース 皮膚 T 細胞性リンパ腫 チトクローム P450 びまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫 酵素免疫測定法 機能観察総合評価試験 50%増殖阻害濃度 ヒストンアセチル基転移酵素 ヒストン脱アセチル化酵素 ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子 米国国立がん研究所 4-（メチルニトロソアミノ）-1-（3ピリジル）-1-ブタノン N-メチルニトロソウレア マウス赤白血病 腫瘍体積の中央値 ニコチンアミドアデニンジヌクレオ チド 前立腺特異抗原 レチノイン酸受容体 メッセンジャーリボ核酸 低分子干渉 RNA サーチュイン スルホローダミン B シグナル伝達性転写因子 治療群／対照群の腫瘍体積比 腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発 リガンド 血管内皮増殖因子 X 染色体連鎖アポトーシス阻害蛋白 ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.1 まとめ ボリノスタット（MK-0683、L-001079038、WIN64652、AP390、MSK390、SAHA）は、ヒスト ン脱アセチル化酵素（HDAC）活性を強力に阻害する化合物であり[資料4.3: 2]、皮膚 T 細胞性リ ンパ腫（CTCL）の治療薬としての適用を予定している。ボリノスタットの非臨床薬理試験一覧 を[2.6.3.1 項]に示す。 オンコロジーの分野は大きな進展がみられるにも関わらず、進行がんの多くは治療が困難であ る。従来の細胞毒性型抗腫瘍薬は、細胞増殖の基となる DNA 複製を阻害することなどにより、 腫瘍細胞を傷害する。このような薬物はがん組織と正常な増殖組織を識別しないため、腫瘍を縮 小させる一方で正常な組織に対しても毒性を示す。その毒性には、重篤で生命の危険を伴うもの もある。これに対し、がん化の過程で変化した分子を標的とする新規抗腫瘍薬は、進行がんの治 療において低い毒性と優れた効果を発揮することが期待される。HDAC 阻害剤は新規作用機序を 有する抗腫瘍薬であり、遺伝子発現調節及びシグナル伝達系の異常を標的とすることにより、形 質転換した細胞の分化、細胞周期の停止及びアポトーシスを誘導する[資料4.3: 4]。 腫瘍形成には、染色体の増幅、転座、変異、欠失がもたらす遺伝子発現の異常が、重要な意味 をもつことが知られている。近年、クロマチン構造も、遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす ことが明らかにされた[資料4.3: 4]。ヒトゲノムの繰り返し構造単位であるヌクレオソームは、 DNA とそれが巻きつくヒストンオクタマー（1つの H3-H4テトラマー＋2つの H2A-H2B ダイマー） から構成される。これらのコアヒストンには、アミノ末端に直鎖状のテール（ヒストンテール） が存在する。このアミノ末端テールはリジン残基に富み、正に荷電する。2種の酵素蛋白複合体、 ヒストンアセチル基転移酵素（HAT）及び HDAC は、コアヒストンにアセチル基を、それぞれ付 加及び除去する酵素である。ヒストンのリジン残基にアセチル基が付加されると、クロマチンが 開放的な構造をとり、転写活性が増大する。 がんにおいて、HDAC 活性の変動と腫瘍形成の関連性が確認されている。多くのがん種におい て、HDAC は過剰発現しているか、若しくは発がんに関わる転写因子に関与している[資料4.3: 10]。 急性前骨髄球性白血病（APL）においては、t（15;17）転座によりレチノイン酸受容体 α（RARα） と他の蛋白質との融合が生じる。これらの融合蛋白質はレチノイン酸レスポンスエレメントに結 合し、HDAC をリクルートして、骨髄細胞の分化に必須のレチノイン酸標的遺伝子の転写を阻害 する。HDAC 阻害剤の存在により APL 細胞の対レチノイド感受性が回復するが、これは、ヒスト ンアセチル化の異常が、白血病誘発及びレチノイド抵抗性の重要なステップであることを示すも のである[資料4.3: 25]、[資料4.3: 4]。 HDAC はシグナル伝達系にも関係する。最近のデータによれば、STAT 蛋白質（signal transducer and transcription activator）が関与する転写活性に、HDAC 活性が必要であることが示された[資料 4.3: 26]。これらの知見を総合すると、HDAC は、異常な転写活性とシグナル伝達に介在すること により、腫瘍形成に重要とされる複数の分子に関与することが示唆される[資料4.3: 25]、[資料4.3: 4]。したがって、HDAC 活性の阻害により、遺伝子の転写パターンを正常に回復させ、腫瘍細胞 を分化及びアポトーシスに導くことが期待される。ボリノスタットのがん治療における有用性を 2.6.2 薬理試験の概要文 - 6 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 評価するため、その作用機序及び抗腫瘍活性が検討されている[資料4.3: 10]、[資料4.3: 4]。それら の試験結果より、ボリノスタットは HDAC 分子の触媒ポケットに直接結合し、酵素活性を強く阻 害することが示された。ボリノスタットの抗腫瘍活性は、HDAC 活性の阻害とそれに伴うアセチ ル化蛋白、特にアセチル化ヒストンの蓄積に基づくものである。アセチル化ヒストンの蓄積によ り、細胞の分化やアポトーシスを誘導し腫瘍増殖を阻害すると考えられる遺伝子の発現が活性化 される。ボリノスタットは、培養がん細胞において細胞周期を停止させ、アポトーシス又は分化 を誘導した。また、ボリノスタットは種々の培養がん細胞において、他の抗がん療法との併用に より相乗的又は相加的な効果を示した。ボリノスタットは、マウス腫瘍モデル及びヒト腫瘍異種 移植モデルにおいて、生物学的活性及び抗腫瘍活性を示した。ボリノスタットをラット及びイヌ に経口投与したときに血清中に認められた主要代謝物は、in vitro で HDAC1活性を阻害せず、ま たマウス赤白血病細胞（MEL）の増殖を阻害しなかった。安全性薬理試験では、経口投与による ラットの呼吸機能試験及び機能観察総合評価試験（FOB）を行ったが、高用量群（150 mg/kg/day） においても影響は認められなかった。また、イヌにおけるテレメトリを用いた心血管系の試験で は、QT 間隔の延長は認められなかった。 2.6.2.2 効力を裏付ける試験 2.6.2.2.1 in vitro試験 2.6.2.2.1.1 ボリノスタットによるヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）活性阻害 ボリノスタットは強力な HDAC 阻害剤である[資料4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.2.1 項]、[2.6.3.2.2 項]、 [2.6.3.2.3 項]、[2.6.3.2.6 項]、[資料4.3: 2]。HDAC は、蛋白質、特にヌクレオソームコアヒストン のリジン残基に対するアセチル基除去反応を触媒する酵素である。HDAC 酵素群は3つのクラス が確認されている。クラスⅠのヒト HDAC は酵母 HDAC の Rpd3と相同性を有し、このクラスに は HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8及び HDAC11がある。クラスⅡの HDAC は、Ⅱa（HDAC4、 HDAC5、HDAC7、HDAC9）及びⅡb（HDAC6、HDAC10）のサブクラスに分かれる。クラスⅡ の HDAC は酵母 HDAC の Hda1と相同性をもつ。クラスⅠとクラスⅡでは、触媒部位の重要な残 基が保存されている。クラスⅢのヒト HDAC は酵母 Sir2とホモログを構成する。クラスⅢの HDAC の触媒部位は、クラスⅠ、クラスⅡ酵素のそれと類似性を示さない。クラスⅢの HDAC は、活性 にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を要する[資料4.3: 3]、[資料4.3: 4]。 HDAC活性に対するボリノスタットの阻害能を、アフィニティクロマトグラフィ精製した遺伝 子組換えHDACを用いて、in vitroで評価した[資料4.2.1.1.1: PD001]、[表2.6.2: 1]。ボリノスタット はクラスⅠのHDAC（HDAC1、HDAC2、HDAC3）、クラスⅡのHDAC6の酵素活性を、低濃度で 阻害した。クラスⅠのHDAC8に対する阻害能はそれより約10倍低く、クラスⅡaのHDAC4、5、7 に対しては約100倍低い阻害能を示した。クラスⅢのHDACであるSIRT1活性に対しては、100 μM の高濃度でも阻害しなかった。また、ボリノスタットは最高50 μMの濃度まで細胞内HATを活性 化せず、わずかに（約10%）阻害した[資料4.2.1.1.2: PD002]、[2.6.3.2.21 項]。これらの結果よりボ リノスタットはクラスⅠ及びⅡの特定のHDACに対し、強力かつ選択的な阻害活性を有すること が示された。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 7 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 1 ボリノスタットによる HDAC 活性の阻害 IC50（nM） 30（5） 49（1） 86（4） >10000（3） 5000 nM で58%阻害（1） 37（4） ≤5000 nM で阻害せず（1） 779（5） ≤100000 nM で阻害せず（1） 酵素 HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC4 HDAC5 HDAC6 HDAC7 HDAC8 SIRT1 数値は、平均値（n）を示す。 [2.6.3.2.1 項]、[2.6.3.2.2 項]、[2.6.3.2.3 項]、[2.6.3.2.4 項]、[2.6.3.2.5 項]、[2.6.3.2.6 項]、[2.6.3.2.7 項]、[2.6.3.2.8 項]、[2.6.3.2.9 項] HDAC ホモログである超好熱菌 Aquifex aeolicus 由来のヒストン脱アセチル化酵素様蛋白と、ボ リノスタットを用いて X 線結晶解析が行われ、HDAC の活性部位は管状ポケット、Zn2+結合部位 及び2つの Asp-His charge relay system から成ることが示された[資料4.3: 27]。ボリノスタットは、 そのヒドロキサム酸基、アルキル側鎖のほとんどとフェニルアミノ基の一部を、HDAC の活性部 位に挿入することにより、酵素分子と結合する。 ヒドロキサム酸基はポケットの極性奥部に達し、 Zn2+と二座の配位結合を形成し、さらに活性部位のアミノ酸残基と相互作用する。ボリノスタッ トの鎖長6のアルキル鎖は、ポケットの管状疎水性部に収納される。ボリノスタット分子が活性部 位に入り込むことにより、本来の基質の結合が妨害され、酵素的な脱アセチル化が阻害されると 考えられる。 2.6.2.2.1.2 ボリノスタットによるヒト由来培養がん細胞の増殖阻害 ボリノスタットは、広範囲の培養がん細胞に対して分化、増殖阻害、アポトーシスを誘導する[資 料4.3: 4]。ボリノスタットは、当初マウスの赤白血病（MEL）細胞の分化誘導剤として同定され[資 料4.3: 5]、またラットの前立腺癌細胞の増殖を阻害することも示された[資料4.3: 28]。ボリノスタ ットは、ヒト CTCL 細胞株（MJ、Hut78及び HH）及び CTCL 患者由来の循環性の異型 T 細胞に おいて、濃度依存的にアポトーシスを誘導した[資料4.3: 6]。また、ボリノスタットは、CTCL 以 外にもバーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型 B 細胞リンパ腫（DLBCL） 等、ヒトリンパ腫細胞株のアポトーシスを誘導することが示された[資料4.3: 7]。 でin vitro培養細胞株を用いて ボリノスタットの増殖阻害能は、 評価された[資料4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.2.10 項]。白血病、非小細胞肺癌、大腸癌、中枢神経系 の腫瘍、メラノーマ、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、乳癌などに由来する培養がん細胞において も、増殖阻害が示された[図2.6.2: 1]。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 8 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 GI50 (nM) 10000 1000 100 図 2.6.2: 1 N Le uk em i SC a LC C ol on C M N el an S o O ma va r ia R n e Pr na os l ta Br te ea st 10 ボリノスタットによるヒト由来培養がん細胞の増殖阻害 細胞の増殖はボリノスタット処理2日目にスルホローダミン B（SRB）を用いて測定した。各点は、 各細胞株の GI50値（50%増殖阻害濃度）を示す。 [2.6.3.2.10 項] これらの細胞株に対するボリノスタットの50%増殖阻害濃度（GI50）は、38.6 nM から6.2 μM の 範囲となり、細胞株パネル全体の中で、顕著に高い感受性を示すがん種は認められなかった。 ボリノスタットの増殖阻害作用を調べた他の試験では、ミエローマ細胞（MM1.5）[資料4.3: 29]、 ヒト骨髄単球性白血病細胞（U937）[資料4.3: 30]、横紋筋肉腫細胞[資料4.3: 31]、急性 T 細胞白血 病細胞（CEM-CCRF）[資料4.3: 32]、卵巣癌細胞[資料4.3: 33]、子宮内膜癌細胞[資料4.3: 34]、慢性 骨髄性白血病細胞[資料4.3: 35]、[資料4.3: 36]、[資料4.3: 37]、膠芽腫細胞[資料4.3: 38]及び甲状腺 癌細胞[資料4.3: 39]等のヒト由来がん細胞株で、アポトーシスの誘導が認められた。さらに、ボリ ノスタットは前立腺癌細胞[資料4.3: 18]、乳癌細胞[資料4.3: 40]、[資料4.3: 41]、[資料4.3: 42]、非 小細胞肺癌細胞[資料4.3: 43]等のヒト由来がん細胞株の増殖を阻害した。 ボリノスタットは P-糖蛋白質発現、非発現のいずれのがん細胞（CEM、LoVo 及び K562）に対 しても、同じような細胞死をもたらす。これは、ボリノスタットが P-糖蛋白質の基質にならない こと、さらに P-糖蛋白質を発現する多剤耐性腫瘍の治療に有効である可能性を示すものである[資 料4.3: 8]、[資料4.3: 9]。薬剤耐性 L1210細胞をボリノスタット処理した場合、薬剤感受性の親細胞 株と比較して、細胞生存率低下やアポトーシス促進の程度が大きくなることが報告されている[資 料4.3: 44] 2.6.2.2.1.3 細胞内ヒストンアセチル化に対するボリノスタットの効果 がん細胞において、ボリノスタット処理によるヒストンアセチル化への影響を評価し、アセチ ル化ヒストンの蓄積と細胞増殖との関係を検討した[資料4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.2.11 項]、 [2.6.3.2.13 項]。ボリノスタットはHCT-116細胞の増殖を阻害し、48時間曝露時のIC50は約800 nM であった[図2.6.2: 2]。また、600 nMのボリノスタットを6時間HCT-116細胞に曝露することにより、 総ヒストンH3に対するアセチル化ヒストンH3の割合は溶媒と比較して約3倍増大した。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 9 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 10.0 100 AcH3/tot H3/DMSO % inhibition A 75 50 25 0 -10 B 7.5 5.0 2.5 0.0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -8 図 2.6.2: 2 -7 -6 -5 -4 log [Vorinostat], M log[Vorinostat], M ボリノスタット処理したヒト大腸癌細胞 HCT-116 の増殖阻害（A：48 時間培養） 及びヒストン H3 の高アセチル化（B：6 時間培養） [2.6.3.2.11 項]、[2.6.3.2.13 項] ボリノスタットによるヒストンの高アセチル化は、正常細胞及びがん細胞の双方に誘導される [資料4.3: 10]が、がん細胞の方がアポトーシス促進作用に対して高い感受性を示す可能性があるこ とが報告されている[資料4.3: 40]。 2.6.2.2.1.4 ボリノスタットの作用機序 ボリノスタットによる細胞の増殖阻害、分化及びアポトーシスの詳細な分子メカニズムについ て完全には解明されていないが、様々な研究報告がなされてきた[資料4.3: 10]。ヌクレオゾームヒ ストンのアセチル化は、多くの遺伝子の転写制御に重要な役割を果たす[資料4.3: 4]。ヒストンの 脱アセチル化はクロマチン構造の凝縮に関係し遺伝子転写を阻害するのに対し、アセチル化ヒス トンは開放的なクロマチン構造に関係し転写機構を活性化する。ヒストンアセチル化の調節に関 わる酵素の異常が、各種のがんに見出されている[資料4.3: 4]。この種の異常はヒストンアセチル 化に不均衡をもたらし、それによりクロマチン構造が変化し細胞周期の進行、細胞分化及びアポ トーシスの調節に関わる遺伝子の転写パターンに異常が生じると考えられる。ボリノスタットの 抗腫瘍活性のメカニズムは、HDAC 活性の阻害とそれに伴うアセチル化ヒストンの蓄積により、 細胞増殖阻害に関連すると考えられる遺伝子の発現が活性化されることによるものと考えられる。 この考えは、限られた数の遺伝子の発現が、ボリノスタット処理により調節を受けるという知見 に基づくものである[資料4.3: 45]、[資料4.3: 46]、[資料4.3: 47]、[資料4.3: 48]、[資料4.3: 49]、[資 料4.3: 50]。 ボリノスタット処理により最もよく誘導される遺伝子の一つが、細胞周期に関わるキナーゼの 阻害因子 p21WAF1/CIP である[資料4.3: 11]、[資料4.3: 12]、[資料4.3: 13]。クロマチンの免疫沈降実験 により、ボリノスタット誘発性の p21WAF1/CIP の発現が、そのプロモータ領域に位置するヒストン の高アセチル化と関係することが示された[資料4.3: 11]、[資料4.3: 13]。p21WAF1/CIP の発現は、HDAC 阻害剤誘発性の細胞増殖阻害や細胞周期停止に重要な役割を果たす可能性がある一方で、アポト ーシスの誘導には必要ではない。実際、ヒト骨髄単球性白血病細胞株 U937において、p21WAF1/CIP 2.6.2 薬理試験の概要文 - 10 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 発現のブロックにより、ボリノスタット処理で導かれるアポトーシスの増強が示された[資料4.3: 30]。 ボリノスタットによるアポトーシスは、チトクローム c のようなミトコンドリア膜蛋白質の遊 離とその後のカスパーゼ活性化に特徴づけられる内因性のメカニズムを通じて誘導されると考え られる。ボリノスタット誘発性のアポトーシスは Bcl-2の過剰発現により阻害される[資料4.3: 32]、 [資料4.3: 29]。細胞の種類によってボリノスタット誘発性の細胞死に、カスパーゼの活性化が必要 な場合[資料4.3: 51]、[資料4.3: 52]、[資料4.3: 40]と、不要の場合[資料4.3: 32]、[資料4.3: 29]がある。 また、ある試験では、ボリノスタットで誘導されるアポトーシスが p53依存性であることが示さ れた[資料4.3: 52]が、一般にボリノスタットは野生型 p53の非存在下で作用すると考えられている [資料4.3: 10]。大腸癌細胞株では、ボリノスタットにより15-リポキシゲナーゼ-1の発現が誘導さ れ、このリポキシゲナーゼ-1が阻害されると、ボリノスタットのアポトーシス促進作用が減弱す る[資料4.3: 53]。 ボリノスタットに誘導される細胞死の選択性を裏付けるメカニズムについて、がん細胞と正常 細胞を比較する試験が行われた[資料4.3: 54]。この試験では、ボリノスタットによりがん細胞に活 性酸素種の蓄積が起きるのに対し正常細胞では蓄積がみられず、一方、正常細胞にチオレドキシ ン蛋白レベルが上昇するのに対しがん細胞ではそれがみられなかった。このことは、ボリノスタ ット誘発性の細胞死に対する抵抗性に、チオレドキシンが重要な役割を果たすことを示唆するも のである。また、ボリノスタットは自食性の細胞死も誘導することが報告された[資料4.3: 14]。こ の細胞死の様態は、膜／小胞の再構成及びリソソーム活性による細胞内容物の大規模な分解を特 徴とする。 多くの試験において、ヒストンの高アセチル化が遺伝子の転写活性を促進することが示唆され ているが、遺伝子発現を検討した試験には、ボリノスタット処理による遺伝子発現阻害を示した ものもある[資料4.3: 45]、[資料4.3: 47]、[資料4.3: 48]、[資料4.3: 49]。ボリノスタットによる転写 阻害を説明するメカニズムとして、ヒストンアセチル化がもたらす直接的、間接的な影響、ある いはヒストン以外の蛋白の高アセチル化が関係する可能性がある[資料4.3: 25]。例えば最近の研究 において、サイトカイン誘発性の STAT5標的遺伝子のトランス活性化に対し、ボリノスタットに よる阻害が示された[資料4.3: 26]。別の研究では、ボリノスタット処理により c-jun プロモータに 対する転写開始前複合体の形成が阻害され、c-jun の転写を阻害し、その結果 COS-2、サイクリン D1及びコラゲナーゼ-1の転写レベルが低下した[資料4.3: 55]。 ボリノスタットは、腫瘍細胞の増殖・生存に対する直接作用以外に、腫瘍組織の血管形成及び 炎症性過程に関わる遺伝子の発現に影響を及ぼすことにより、がんの増殖に影響を及ぼす可能性 がある。ボリノスタットが血管内皮増殖因子（VEGF）のシグナル伝達を撹乱する強力な血管新 生阻害剤であることを示す報告がなされている[資料4.3: 56]。ボリノスタットの血管新生阻害作用 は、VEGF 受容体1、2及びニューロピリンの発現を阻害することにより発揮される可能性がある [資料4.3: 10]。さらに、ボリノスタットは VEGF の競合蛋白質であるセマフォリンⅢの発現を誘 導し、VEGF による血管新生刺激に対する内皮細胞の応答を阻害することで、血管新生を阻害す る可能性がある[資料4.3: 56]。別の研究では、ボリノスタットが in vivo 及び in vitro で抗炎症作用 2.6.2 薬理試験の概要文 - 11 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 を示すこと、またサイトカインや一酸化窒素（NO）の産生を制御する遺伝子の発現を促進し、さ らに他の標的蛋白質を高アセチル化する可能性もあることが報告された[資料4.3: 57]。 ボリノスタットのような HDAC 阻害剤は、腫瘍細胞の有糸分裂過程への進行や同過程からの離 脱能を変動させることにより、細胞周期に影響する可能性も考えられる[資料4.3: 10]、[資料4.3: 15]。 ヒストンのアセチル化は細胞周期の過程で厳密に制御されており、DNA 合成や有糸分裂の際の染 色体分離の過程で、ヒストン分子のクロマチンへの適切な組み込みに重要な意味を持つ可能性が ある。例えば、S 期及び G2期の間でアセチル化ヒストンが増加すると、G2チェックポイントが活 性化し、細胞周期が G2期で停止する。がん細胞でしばしばみられる G2チェックポイントの欠失 があると、細胞周期が G2期で停止せず、異常な有糸分裂を引き起こし、アポトーシスが誘導され る可能性が考えられる。同様に、M 期紡錘体チェックポイントが欠失している場合も、腫瘍細胞 の HDAC 阻害剤によるアポトーシスが起こりやすくなると推測される。 ボリノスタットによるヒストン高アセチル化及び遺伝子発現に対する作用が、その生物学的活 性を裏付けるものと想定されるが、ヒストン以外の多くの蛋白質が HAT 及び HDAC により調節 を受けるため、ボリノスタットの標的となる可能性もある[資料4.3: 10]。いくつかの非ヒストン蛋 白質（チュブリン、Hsp90及び p53など）は、リジン残基が可逆的にアセチル化されることが知ら れており、ボリノスタット処理により高アセチル化を受ける[資料4.3: 16]、[資料4.3: 17]、[資料4.3: 15]。ヒト乳癌細胞のボリノスタット処理により Hsp90のアセチル化が誘発され、生存促進に働く X 染色体連鎖アポトーシス阻害蛋白（XIAP）、Survivin、Bcl-2、Bcl-XL 及び Her-2のレベルが低下 した[資料4.3: 16]。HDAC6に対する siRNA を用いて同酵素のレベルを低下させた場合にも、Hsp90 のアセチル化が誘発されたことから、ボリノスタット誘発性の Hsp90アセチル化に、HDAC6がメ カニズムベースで関係することが示唆された。これらの結果により、ボリノスタットのアポトー シス促進作用はアセチル化 Hsp90の蓄積に由来する可能性が示された。 2.6.2.2.1.5 がん化学療法剤併用におけるボリノスタットの活性 単剤としての使用に加え、他の抗がん療法と併用したin vitro試験においてボリノスタットの活 性を評価した[表2.6.2: 2]。 CTCL 細胞に対して、5-アザ-2'-デオキシシチジン又はベキサロテンをボリノスタットと併用し たときの活性を検討した。5-アザ-2'-デオキシシチジンにより、濃度依存的にアポトーシスが誘導 されたが、この効果はボリノスタット併用により相乗的に増強した[資料4.3: 6]。ボリノスタット をベキサロテンと併用した場合は、CTCL 細胞に対する増殖阻害効果は相加的であった[資料 4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.2.12 項] 。 ボリノスタットを標準的な化学療法剤と併用したときの効果を検討した。ボリノスタットの前 処理により、シスプラチン及びエトポシドの殺腫瘍活性が増大した[資料4.3: 58]。ボリノスタット は、肝癌細胞に対する5-フルオロウラシル（5-FU）及びイリノテカンのアポトーシス促進作用を 増強した[資料4.3: 59]。また、ボリノスタットは、ヒト前立腺癌細胞及びグリオーマ細胞の放射線 2.6.2 薬理試験の概要文 - 12 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 照射によるアポトーシスを増強し[資料4.3: 60]、ヒト扁平上皮癌細胞の放射線照射に対する感受性 を増加した[資料4.3: 61]。Bcr-Abl を発現する慢性骨髄性白血病（CML）細胞に対するイマチニブ の細胞毒性作用は、ボリノスタット併用により増強され[資料4.3: 35]、またイマチニブ抵抗性の CML 細胞に対して細胞死を誘導した[資料4.3: 62]。ボリノスタットとプロテアソーム阻害剤のボ ルテゾミブとの併用では、イマチニブ抵抗性の CML 細胞[資料4.3: 63]、多発性骨髄腫細胞[資料4.3: 64]及び非小細胞肺癌[資料4.3: 65]に対し、相乗的なアポトーシス誘導作用が認められた。乳癌細 胞ではボリノスタット前処理により、トポイソメラーゼⅡ阻害剤エピルビシンに誘導されるアポ トーシスが増強した[資料4.3: 66]。急性前骨髄球性白血病（APL）細胞に対するボリノスタットと レチノイン酸の併用により、相加的な増殖阻害効果が認められた[資料4.3: 19]。乳癌細胞に対する ドセタキセル又はトラスツズマブとボリノスタットの併用により、相乗的なアポトーシス効果が 得られた[資料4.3: 16]。 さらに、ボリノスタットを現在開発中の薬剤と併用したときの効果を評価した。TRAIL（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand）とボリノスタットとの併用により、ヒト白血病細 胞[資料4.3: 67]、[資料4.3: 68]、並びにヒト肺癌細胞及び前立腺癌細胞[資料4.3: 69]のアポトーシス 誘導に相乗効果が認められた。また、乳癌細胞において、ボリノスタット処理に引き続き TRAIL 処理した場合、相乗的なアポトーシス誘導効果が認められた[資料4.3: 70]。 ボリノスタットは、Hsp90阻害剤17-AAG（17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin）[資料4.3: 71]、 [資料4.3: 72]、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤フラボピリドール[資料4.3: 73]、[資料4.3: 74]、PI-3 キナーゼ阻害剤 LY294002[資料4.3: 75]、MEK1/2キナーゼ阻害剤 PD184352[資料4.3: 76]、アルキル リゾリン脂質ペリフォシン[資料4.3: 77]、IκBα リン酸化阻害剤 Bay11-7082[資料4.3: 78]との併用で、 相乗効果を示した。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 13 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 2 他の抗がん剤との併用におけるボリノスタットの in vitro 効果 併用薬 5-アザ-2'-デオキシシチジン ベキサロテン 17-AAG ATRA ボルテゾミブ シスプラチン ドセタキセル トラスツズマブ エピルビシン エトポシド フラボピリドール 5-FU+イリノテカン イマチニブ がん種 CTCL（HH） CTCL（HH） 白血病（U937、 K562、LAMA84） APL（NB4） Bcr-Abl+白血病 （K562、 LAMA84）、骨髄 腫、非小細胞肺癌 乳癌（MCF-7） 乳癌（BT-474、 SKBR-3） 乳癌（BT-474、 SKBR-3） 乳癌（MCF-7） 乳癌（MCF-7） 白血病（U937） 肝細胞癌 （HepG2、 Hep1B） CML（K562、 LAMA84） 併用効果 相乗的 相加的 相乗的 相加的 相乗的 細胞死促進 相乗的 [資料4.3: 58] [資料4.3: 16] 相乗的 [資料4.3: 16] 相乗的 細胞死促進 相乗的 細胞死促進 [資料4.3: 66] [資料4.3: 58] [資料4.3: 73]、[資料4.3: 74] [資料4.3: 59] 相加的、相乗 的 [資料4.3: 62]、[資料4.3: 35] 2.6.2 薬理試験の概要文 - 14 - 文献・資料 [資料4.3: 6] [資料4.2.1.1.1: PD001]、 [2.6.3.2.12 項] [資料4.3: 71]、[資料4.3: 72] [資料4.3: 19] [資料4.3: 65]、[資料4.3: 64]、[資料4.3: 63] ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 2 他の抗がん剤との併用におけるボリノスタットのin vitro効果（続き） 併用薬 放射線照射（外照射） TRAIL LY294002 PD184352 ペリフォシン Bay 11-7082 がん種 前立腺癌 （LNCaP）、扁平 上皮癌 白血病、肺癌、 前立腺癌、乳癌 白血病（U937、 HL-60、K562、 Jurkat） 白血病（K562、 LAMA84） 白血病（U937、 HL-60、Jurkat） 白血病（U937、 HL-60、Raji、 Jurkat） 併用効果 相乗的； 感受性増大 文献・資料 [資料4.3: 60]、[資料4.3: 61] 相乗的 相乗的 [資料4.3: 67]、[資料4.3: 68]、[資料4.3: 70]、[資料 4.3: 69] [資料4.3: 75] 相乗的 [資料4.3: 76] 相乗的 [資料4.3: 77] 相乗的 [資料4.3: 78] がん種の（）内は細胞株を示す。 CTCL：皮膚 T 細胞性リンパ腫 17-AAG：17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin ATRA：オールトランスレチノイン酸 5-FU：5-フルオロウラシル TRAIL：Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand 2.6.2.2.2 in vivo試験 ボリノスタットはヒト前立腺癌、乳癌、大腸癌細胞の異種移植モデルに対し、顕著な抗腫瘍活 性を示した[2.6.3.2.14 項]、[2.6.3.2.15 項]、[2.6.3.2.16 項]、[2.6.3.2.17 項]、[2.6.3.2.18 項]。これ らのモデルでは、移植腫瘍の生着が確認された後に、ボリノスタットの腹腔内又は持続静脈内投 与を開始した。前立腺癌移植モデルでは、腫瘍の増殖阻害のみならず退縮も認められた。ボリノ スタットの抗腫瘍活性は、ヒトAPLのトランスジェニックマウスモデルでも確認された。さらに、 発がん物質誘発性の乳腺腫瘍モデルにおいて、ボリノスタットを混餌投与することにより、腫瘍 の発生率、多発性及び体積の減少、並びに腫瘍発生に要する時間の延長が認められた。発がん物 質誘発性のマウス肺腫瘍モデルでも、ボリノスタットの混餌投与により腫瘍の多発性が減少した。 ラット乳腺腫瘍モデルでは、大型の腫瘍に対しボリノスタットは投与5週間以内に増殖を阻害し、 退縮させた。これらのデータより、ボリノスタットは種々の非臨床モデルにおいて、良好な忍容 性を示す用量で顕著な抗腫瘍活性を発揮することが示された。これら試験の要約を[表2.6.2: 3]に 示す。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 15 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 3 ボリノスタットの in vivo 抗腫瘍効果 試験／モデル系 アンドロゲン依存 性ヒト前立腺癌 CWR22皮下異種移 植モデル 動物種／系統 雄 BALB/c 無胸腺 マウス（テストス テロン投与） 投与経路 腹腔内 評価項目 腫瘍増殖阻害 用量及び投与スケジュール 25、50、100 mg/kg/day 腫瘍が触診可能になった段 階で投与開始 ヒト t（11;17）APL のトランスジェニ ックマウスモデル PLZF-RARα/ RARα-PLZF ダブ ルトランスジェ ニックマウス 腹腔内 生存日数 50 mg/kg/day 雌 Sprague-Dawley ラット 混餌 NMU†誘発乳腺腫瘍 モデル † 50 mg/kg/day＋レチノイン酸 1.5 mg/kg/day 450、900 ppm NMU 処理1週間前から投与 開始し18週間投与 総腫瘍発生率、 多発性、腫瘍体 積、腫瘍発生ま での時間 NMU：N-メチルニトロソウレア 2.6.2 薬理試験の概要文 - 16 - 結果 •Day 18に対照群の腫瘍体積 が1.8 cm3に達した段階で、25、 50、100 mg/kg/day 群の腫瘍増 殖阻害率は、それぞれ78、97、 97%。 •25、50、100 mg/kg/day 群で、 それぞれ1/8匹、5/9匹、3/5匹 の腫瘍が退縮。 •治療群の生存日数中央値43 日に対し、無治療群の生存日 数は21日 •レチノイン酸+ボリノスタッ ト群の生存日数中央値62日に 対し、レチノイン酸のみでは 36日 •6/11匹で寛解し、1～7週間持 続 •腫瘍発生までの時間29日延 長、腫瘍発生率39%低下、群 あたりの総腫瘍数66%減少、 個体あたりの多発性の平均値 43%減少、群あたりの平均腫 瘍体積78%減少 文献・資料 [資料4.3: 18] [資料4.3: 19] [資料4.3: 20] ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 3 試験／モデル系 NMU 誘発乳腺腫瘍 モデル 動物種／系統 雌 Sprague-Dawley ラット 投与経路 混餌 ボリノスタットのin vivo抗腫瘍効果（続き） 評価項目 総腫瘍発生率、腺 癌発生率、腺癌多 発性、腫瘍体積、 腫瘍発生までの時 間 樹立腫瘍の増殖阻 害 NNK†誘発性肺腫瘍 モデル 雌 A/J マウス 混餌 肺腫瘍発生率、多 発性 ヒト乳癌 MDA-MB-231皮下 異種移植モデル 雌ヌードマウス 腹腔内 腫瘍増殖阻害 † 用量及び投与スケジュール 900 ppm Day -14から Day 130（試験終了） まで投与（NMU 投与日を Day 0 とする） 900 ppm Day 14又は28から試験終了まで 投与 900 ppm Day -14から Day 14まで投与 900 ppm Day -14から Day 50まで投与 900 ppm 腫瘍径が0.5～2 cm に達したと きから投与 450 ppm NNK 処理1週間前から投与開 始、17週間投与 25、100 mg/kg/day 腫瘍が触診可能になった段階で 投与開始 NNK：4-（メチルニトロソアミノ）-1-（3-ピリジル）-1-ブタノン 2.6.2 薬理試験の概要文 - 17 - 結果 •総腫瘍発生率低下、腺癌発生率 低下、腺癌多発性低下、腫瘍体 積減少 資料 [資料4.3: 21] •総腫瘍発生率低下、腺癌発生率 低下、腺癌多発性低下、腫瘍体 積減少 •効果なし •効果なし •腫瘍増殖は対照群と比較して、 5週間で80％阻害 •対照群の腫瘍の76％が増殖し 続けたが、ボリノスタット群で は38%のみが増殖継続 •ボリノスタット群の11%の腫瘍 が完全消失（対照群は0％） •総腫瘍数は80％減少 •25、100 mg/kg/day 群で、Day 23 にそれぞれ34%、41%の増殖阻害 [資料4.3: 22] [資料4.2.1.1.6: PD008]、 [2.6.3.2.14 項] ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 3 ボリノスタットのin vivo抗腫瘍効果（続き） 試験／モデル系 ヒト乳癌 MDA-MB-231皮下 異種移植モデル 動物種／系統 雌 Swiss ヌードマ ウス 投与経路 経口 評価項目 腫瘍増殖遅延 用量及び投与スケジュール 結果 •重度の毒性を示さない最高 86、144、240、400 mg/kg 用量240 mg/kg で、Day 28に最 腫瘍が触診可能になった段 階で投与開始（Day 17～35） 大10.1%の体重減少 •240 mg/kg の19日間投与での log cell kill†は0.2 •25、100 mg/kg/day で、Day 25 25、100 mg/kg/day にそれぞれ0%、49%の増殖阻 腫瘍が触診可能になった段 害 階で投与開始 ヒト大腸癌 HCT-116 皮下異種移植モデ ル 雌ヌードマウス 腹腔内 腫瘍増殖阻害 ヒト肺癌 A549皮下 異種移植モデル 雌 Swiss ヌードマ ウス 経口 腫瘍増殖遅延 86、144、240、400 mg/kg 腫瘍が触診可能になった段 階で投与開始（Day 19～33 及び Day 36～41） ヒト肺癌 A549皮下 異種移植モデル 雌 NMRI nu/nu マ ウス 経口 腫瘍増殖阻害 ヒト大腸癌 HCT15 皮下異種移植モデ ル 雌 NMRI nu/nu マ ウス 経口 腫瘍増殖阻害 120 mg/kg/day 腫瘍が触診可能になった段 階で投与開始 60 mg/kg/day 腫瘍が触診可能になった段 階で投与開始 † •重度の毒性を示さない最高 用量240 mg/kg で、Day 26に最 大7.2%の体重減少 •240 mg/kg の26日間投与での log cell kill†は0.6 •T/C‡は最高0.23（Day 11） •T/C‡は最高0.55（Day 11） log cell kill = (T-C)/(3.32×腫瘍細胞倍加時間)。T-C は治療群と対照群間での規定腫瘍体積になるまでの時間（中央値）の差 T/C：治療群／対照群の腫瘍体積比 ‡ 2.6.2 薬理試験の概要文 - 18 - 資料 [資料4.3: 79] [資料 4.2.1.1.6: PD008]、 [2.6.3.2.15 項] [資料4.3: 79] [資料4.3: 80] [資料4.3: 80] ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 3 ボリノスタットのin vivo抗腫瘍効果（続き） 試験／モデル系 ヒト大腸癌 HCT-116 皮下異種移植モデ ル 動物種／系統 雌無胸腺ヌード マウス 投与経路 腹腔内 評価項目 腫瘍増殖阻害 用量及び投与スケジュール 100、150 mg/kg を1日1回、又 は5、15、50、100、150 mg/kg を1日3回 腫瘍が触診可能になった段 階で投与開始 ヒト大腸癌 HCT-15 皮下異種移植モデ ル 雌 NMRI nu/nu マ ウス 経口（5-FU† は腹腔内） 腫瘍増殖阻害 ヒト大腸癌 HCT-116 皮下異種移植モデ ル 雄 NMRI nu/nu マ ウス 経口（5-FU は静脈内） 腫瘍増殖阻害 ヒト大腸癌 HCT-116 皮下異種移植モデ ル 雌ヌードラット 持続静脈 内、腹腔内 腫瘍増殖阻害 ボリノスタット60、120 mg/kg/day ボリノスタット60 mg/kg/day + 5-FU 25 mg/kg ボリノスタット120 mg/kg/day + 5-FU 25 mg/kg ボリノスタット60、120 mg/kg/day ボリノスタット60 mg/kg/day + 5-FU 50 mg/kg ボリノスタット120 mg/kg/day + 5-FU 50 mg/kg 25、50 mg/kg/day の持続静脈 内投与又は150 mg/kg/day の 1日1回腹腔内投与 ヒト大腸癌 HCT-116 皮下異種移植モデ ル 雌ヌードラット 持続静脈内 腫瘍増殖阻害 † 50 mg/kg/day の24時間又は8 時間持続静脈内投与、100 mg/kg/day の8時間持続静脈 内投与 5-FU：5-フルオロウラシル 2.6.2 薬理試験の概要文 - 19 - 結果 •150 mg/kg の1日1回21日間投 与で、腫瘍増殖阻害率は57%、 平均体重減少率は4%未満 •100 mg/kg の1日3回21日間投 与で腫瘍増殖阻害率は53%、 平均体重減少率は3%未満 •効果は顕著ではなかった •併用と5-FU 単独は効果同じ •ボリノスタット120 mg/kg は 60 mg/kg を上回る効果を示さ ず 資料 [資料 4.2.1.1.4: PD005]、 [2.6.3.2.16 項] [資料4.3: 81] •効果は顕著ではなかった •ボリノスタット120 mg/kg と 5-FU 単独は効果同じ •50 mg/kg/day の14日間持続 静脈内投与で、忍容性良好、 腫瘍増殖阻害率77% •50 mg/kg/day の1日8時間、14 日間にわたる持続静脈内投与 により、明らかな毒性は認め られず、64%の腫瘍増殖阻害 [資料 4.2.1.1.3: PD003]、 [2.6.3.2.17 項] [資料 4.2.1.1.5: PD006]、 [2.6.3.2.18 項] ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.2.2.1 ヒト前立腺癌細胞CWR22異種移植モデルに対するボリノスタットの効果 In vivo におけるボリノスタットの腫瘍増殖阻害能を、ヒト前立腺癌細胞 CWR22を異種移植し たマウスモデルで検討した[資料4.3: 18]。テストステロン補給処置を施したヌードマウスの右脇腹 部に、CWR22細胞懸濁液を皮下移植した。腫瘍が触診可能になった段階で、各群8～9匹のマウス に溶媒（ジメチルスルホキシド）又はボリノスタット25、50、100 mg/kg/day を1日1回3週間腹腔 内投与した。溶媒対照群では、実験期間を通して指数関数的に腫瘍体積が増大したが、ボリノス タット投与群では明らかな腫瘍増殖の阻害が認められた。25、50、100 mg/kg/day 群の腫瘍体積は、 溶媒対照群と比較して、最終的にそれぞれ平均78、97、97%減少した。腫瘍の退縮は、25 mg/kg/day 群で8匹中1匹、50 mg/kg/day 群で9匹中5匹に認められた。100 mg/kg/day 群では、投与期間中20日 間以上生存した動物5匹中3匹に、腫瘍退縮が認められた。 ボリノスタットの毒性を評価するため、投与期間中に体重測定及び死亡の有無の観察を行った。 また、試験終了時に各群1匹を剖検した。溶媒対照群及び25 mg/kg/day 群に死亡は認められなかっ た。これら2群では、試験期間中に体重が平均1.5～1.7 g 増加した。50 mg/kg/day 群の1匹は、体重 減少はみられなかったが投与最終日に死亡した。この群では、試験期間中に体重が平均1.0 g 増加 した。100 mg/kg/day 群では、9匹中5匹が試験期間中に死亡した。各死亡例には、死亡の1～2日前 に急速な体重減少がみられた。この群では生存動物でも、投与開始時と比較して平均で0.8 g の体 重減少を示した。 CWR22腫瘍におけるヒストンアセチル化に対するボリノスタットの効果を、in vivo で評価した。 CWR22腫瘍が生着したマウス（各群4匹）に溶媒又は25、50 mg/kg のボリノスタットを投与した。 投与6、12時間後に各群2匹を屠殺し腫瘍を摘出した。腫瘍からヒストンを単離し、ウェスタンブ ロットによりヒストンアセチル化の解析を行った。溶媒対照群では、ヒストン H3及び H4のアセ チル化は低レベルであったが、25 mg/kg 群の1匹及び50 mg/kg 群の2匹で、投与6時間後の腫瘍中 ヒストン H3及び H4のアセチル化レベルが上昇した。投与12時間後の腫瘍中アセチル化ヒストン 量は、ボリノスタット投与群と溶媒対照群で同程度であった。 移植した CWR22腫瘍の増殖に伴い、前立腺特異抗原（PSA）の血清中濃度も上昇するので、PSA に対するボリノスタットの影響も検討した。ボリノスタット投与群では、CWR22腫瘍の増殖がほ ぼ完全に阻害されたにもかかわらず、血清中 PSA レベルは12倍に上昇した。ノーザンブロット解 析により、ボリノスタット投与群における血清中 PSA レベルの上昇は、PSA の mRNA の誘導と 相関することが示された。これらの結果より、血清中 PSA レベルがボリノスタット投与後の腫瘍 量や病態の進展を評価する上で、良好な代替指標にはならないことが示唆された。 以上より、50 mg/kg/day のボリノスタットを21日間投与した場合、マウスにおける CWR22腫瘍 の増殖は顕著に阻害された。この用量では、ボリノスタットの毒性はほとんど認められなかった。 25 mg/kg/day 群では明らかな毒性は認められなかったが、腫瘍増殖阻害率は50 mg/kg/day 群より も低下した。100 mg/kg/day 群では顕著な腫瘍増殖阻害が確認されたが、急速な体重減少と死亡が 認められた。さらにボリノスタット投与により、CWR22腫瘍においてコアヒストン分子のアセチ ル化レベルの上昇、並びに PSA の mRNA の発現誘導が認められた。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 20 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.2.2.2 治療抵抗性APLトランスジェニックモデルにおけるボリノスタットの効果 ヒト t（11;17）APL に対応する PLZF-RARα/RARα-PLZF ダブルトランスジェニックマウスモデ ルにおいて、レチノイン酸との併用によるボリノスタットの in vivo 抗腫瘍活性を検討した[資料 4.3: 19]。RARα の融合遺伝子をもつトランスジェニックマウスは、相当する染色体転座を有する 患者にみられる臨床病態及びレチノイン酸投与に対する応答を正確に反映するようなタイプの白 血病を発症する。本トランスジェニックマウスはよく知られた t（11;17）APL の特徴を示し、疾 患の発症から3週間以内に死亡し、オールトランスレチノイン酸、亜ヒ酸又はそれらの併用投与に 対して極めて強い抵抗性を示す。本試験では、レチノイン酸単独、レチノイン酸＋ボリノスタッ ト及びボリノスタット単独の3群でボリノスタットの効果を検討した。 末梢血白血球分画の自動計 測により白血病の診断が得られた時点で、本トランスジェニックマウスに1.5 mg/kg/day のレチノ イン酸を2週間投与した。その後、レチノイン酸投与マウスを無作為に3群に分け、レチノイン酸 1.5 mg/kg/day 単独群、ボリノスタット50 mg/kg/day 単独群及びレチノイン酸1.5 mg/kg/day+ボリノ スタット50 mg/kg/day 併用群とした。投与は4週間実施した。投与期間中及び投与終了後も、採血 を毎週行い白血球分画の自動計測及び形態観察を行った。 白血病発症マウスの生存日数中央値は、 レチノイン酸単独群で36日、ボリノスタット単独群で43日であったのに対し、レチノイン酸+ボ リノスタット併用群では62日と有意に延長した（P<0.05：Kaplan Meier 法）。 本試験では寛解を次のように定義した：少なくとも連続2回の計測で白血球数 < 25×103 /mL； 骨髄細胞 < 30%；未成熟細胞の消失；血小板 > 800×103 /mL；ヘモグロビン > 10 g/dL。レチノ イン酸+ボリノスタット併用群の11匹中6匹（55%）が寛解し、この寛解は1～7週間持続した。レ チノイン酸単独及びボリノスタット単独群では、寛解は認められなかった。 以上、マウス白血病モデルに毒性を伴わない用量のレチノイン酸及びボリノスタットを併用投 与したところ、寛解及び生存期間の延長が認められた。 2.6.2.2.2.3 ラットにおけるN-メチルニトロソウレア誘発性乳腺腫瘍に対するボリノスタット の効果 化学物質誘発性の乳腺腫瘍に対し、混餌投与したボリノスタットは、比較的低用量（ラット1 匹あたり1日13 mg 程度）で、毒性を発現することなく腫瘍の増殖を阻害した[資料4.3: 20]。雌 Sprague-Dawley ラットに対し、N-メチルニトロソウレア（NMU）処理の1週間前からボリノスタ ット（濃度450、900 ppm）を混餌投与し、18週間投与を継続した。試験期間を通して乳腺腫瘍の 発生を触診により観察した。試験終了時に、腫瘍の発生率、腫瘍数、多発性、腫瘍発生までの時 間、腫瘍体積を評価した。体重は試験期間中、隔週に測定した。900 ppm 群では NMU 誘発性乳 腺腫瘍の発生率を39%、総腫瘍数を66%、多発性の平均値を43%、平均腫瘍体積を78%減少させた 一方で、体重増加量、摂餌行動、被毛の変化、神経系に対する影響などで評価する限り、明らか な毒性を示さなかった。剖検において、心臓、肺、肝臓、腎臓、消化管等の主要臓器に変化は認 められなかった。450 ppm 群では、腫瘍の発生や成長に影響は認められなかった。 同モデルを用いた別の試験において、ボリノスタットは樹立乳腺腫瘍の増殖を阻害した[資料 2.6.2 薬理試験の概要文 - 21 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 4.3: 21]。腫瘍径が0.5～2 cm に達した段階で、ラットに対してボリノスタット（濃度900 ppm）の 混餌投与を開始したところ、ボリノスタットは樹立腫瘍の増殖を顕著に阻害した。ボリノスタッ ト投与群では、腫瘍の完全退縮が11%、部分退縮が32%、安定が24%であった。一方、対照群では、 腫瘍の完全退縮が0%、部分退縮が12%、安定が12%であった。全体としてボリノスタット群の腫 瘍は、対照群と比較して、試験期間中の増殖が7分の1に低下した。本試験より、樹立乳腺腫瘍に 対して、混餌投与したボリノスタットは、明らかな毒性を発現せずに腫瘍増殖を阻害することが 示された。 2.6.2.2.2.4 マウスにおける4-（メチルニトロソアミノ）-1-（3-ピリジル）-1-ブタノン誘発性肺 腫瘍に対するボリノスタットの効果 タバコに特異的な発がん物質である 4-（メチルニトロソアミノ）-1-（3-ピリジル）-1-ブタノン （NNK）誘発性の肺腫瘍マウスモデルを用いてボリノスタットの効果を評価した[資料4.3: 22]。 このモデルでは、NNK の単回投与により16週以内に肺に多数の腫瘍が発生する。6週齢の雌 A/J マウス（各群20匹）に、450 ppm のボリノスタットを混餌投与し、混餌投与開始1週間後に NNK （10 μmol／マウス）を腹腔内に単回投与した。その後試験終了時まで、混餌投与を継続した。試 験終了時に動物を屠殺し、肺腫瘍を計数した。その結果、ボリノスタットにより NNK 誘発性肺 腫瘍の形成が阻害された。両ボリノスタット投与群の腫瘍数は、対照群（通常飼料、NNK 投与） の腫瘍数を統計学的に有意に下回った。 2.6.2.2.2.5 ヒト乳癌細胞MDA-MB-231の異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対するボリノス タットの効果 ヒト乳癌細胞 MDA-MB-231の異種移植モデルにおいて、ボリノスタットを腹腔内又は経口投与 し、その効果を検討した。 腹腔内投与試験では、ホストのヌードマウスの皮下で成長した MDA-MB-231腫瘍の一部を、雌 ヌードマウスの皮下に移植した[資料4.2.1.1.6: PD008]、[2.6.3.2.14 項]。腫瘍重量が80 mg 程度にな った段階（移植12日後）で、動物を治療群及び対照群（各群8～9匹）に分け、25又は100 mg/kg/day のボリノスタットを毎日腹腔内投与した。本試験は、対照群の腫瘍重量が約2 g に達した Day 23 に終了した。25及び100 mg/kg/day 群の腫瘍増殖阻害率は、それぞれ34%及び41％であった。本試 験では明らかな毒性は認められなかった。 経口投与試験[資料4.3: 79]では、雌 Swiss ヌードマウス（各群5～7匹）の皮下に MDA-MB-231 細胞を移植し、86、144、240、400 mg/kg/day のボリノスタットを腫瘍移植後 Day 17から Day 35 まで1日1回経口投与した。重度の毒性を示さない最高用量の240 mg/kg/day では、Day28に最大 10.1%の体重減少が認められたが、腫瘍増殖遅延活性を示さず、19日の投与期間で log cell kill は 0.2であった［log cell kill = (T-C)/(3.32×腫瘍細胞倍加時間)、T-C は治療群と対照群間での規定腫 瘍体積になるまでの時間（中央値）の差］。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 22 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.2.2.6 ヒト大腸癌細胞HCT-116の異種移植モデルにおける腫瘍増殖に対するボリノスタッ トの効果 ヌードマウス及びヌードラットを用いたヒト大腸癌細胞 HCT-116の異種移植モデルにおいて、 異なる投与スケジュールによるボリノスタットの有効性、薬物動態、薬力学を評価する複数の試 験を実施した[2.6.3.2.15 項]、[2.6.3.2.16 項]、[2.6.3.2.17 項]、[2.6.3.2.18 項]、[2.6.3.2.19 項]、 [2.6.3.2.20 項]。 最初の試験では、HCT-116大腸癌移植マウスモデルに対するボリノスタットの有効性を評価し た[資料4.2.1.1.6: PD008]、[2.6.3.2.15 項]。ホストヌードマウスの皮下で成長した HCT-116腫瘍の 一部を、雌ヌードマウスの皮下に移植した。腫瘍重量が約70 mg になった段階（移植10日後）で、 動物を治療群及び対照群（各群8～9匹）に分け、25又は100 mg/kg/day のボリノスタットを毎日腹 腔内投与した。本試験は、対照群の腫瘍重量が約1 g に達した Day 25に終了した。25及び100 mg/kg/day 群の腫瘍増殖阻害率は、それぞれ0%及び49％であった。この試験では明らかな毒性は 認められなかった。 第2の試験では、HCT-116大腸癌移植マウスモデルを用いて、ボリノスタットの忍容性及び抗腫 瘍活性に対する投与頻度の影響を検討した[資料4.2.1.1.4: PD005]、[2.6.3.2.16 項]。雌の無胸腺ヌ ードマウス（各群10匹）に、100又は150 mg/kg/day のボリノスタットを1日1回21日間、あるいは5、 15、50、100、150 mg/kg のボリノスタットを1日3回、腹腔内投与した。対照群には、2通りの投 与スケジュールのそれぞれにおいて溶媒を投与した。腫瘍が触診可能になった段階（体積約89 mm3）を Day 1として、マウスへの投与を開始した。150 mg/kg の1日3回投与群は、毒性発現のた め Day 10にボリノスタット投与を中止したが、それ以外の群は Day 21まで投与を継続した。1日1 回投与及び1日3回投与ともに、溶媒対照群の Day22における腫瘍体積の中央値は約1,200 mm3であ った。150 mg/kg/day の1日1回21日間投与群では、57%の腫瘍増殖阻害を示し、統計学的に有意差 が認められた（P<0.001）。この群では、ボリノスタット投与による死亡は認められず、また平均 体重減少率は4%未満であった。100 mg/kg/day の1日1回21日間投与群では、16%の腫瘍増殖阻害を 示したが統計学的有意性は認められなかった（P>0.05）。100、150 mg/kg の1日3回投与群では、そ れぞれ1匹及び9匹の死亡が認められた。したがって、1日3回21日間投与では、100 mg/kg が最大 耐量であった。100 mg/kg の1日3回21日間投与群では、53％の腫瘍増殖阻害を示し、統計学的に 有意差が認められ（P<0.01）、平均体重減少率は3%未満であった。より低用量の1日3回21日間投 与群では、有意な腫瘍増殖阻害効果は認められなかった。 HCT-116異種移植ヌードマウスを用いて、ヒストン H3のアセチル化に対するボリノスタットの in vivo 薬力学試験を実施した[資料4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.2.19 項]、[2.6.3.2.20 項]。 HCT-116異種移植ヌードマウス（雌）に5、15、50、100、150 mg/kgのボリノスタットを単回腹 腔内投与し、投与後0.5、1、2、4、8、12時間に腫瘍を採取した[2.6.3.2.19 項]。溶媒対照群からも 同様に腫瘍を採取した。腫瘍組織からヒストン蛋白質を調製し、アセチル化ヒストンH3の蓄積を 酵素免疫測定法（ELISA）により測定した。結果を[図2.6.2: 3]に示す。投与後1、2、4時間では、 2.6.2 薬理試験の概要文 - 23 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 ボリノスタットの用量依存的なアセチル化ヒストンH3の蓄積が認められ、投与後8、12時間には アセチル化ヒストンH3の蓄積は消失した。150 mg/kg群では、投与後4時間まで有意なアセチル化 ヒストンの蓄積が持続した（ピークは投与後2時間）が、より低用量群では1～2時間の持続（ピー クは投与後1時間）に止まった。 8 Ac-Histone H3 (K18) 7 0 mpk 6 5 5 mpk 4 15 mpk 3 50 mpk 2 100 mpk 1 150 mpk 0 0.5 hr 図 2.6.2: 3 1 hr 2 hr 4 hr 8 hr 12 hr ヒト大腸癌 HCT-116 異種移植マウスにおけるボリノスタットの用量依存的及 び時間依存的な腫瘍中アセチル化ヒストン H3 の蓄積 平均±標準偏差。mpk は mg/kg を示す。 [2.6.3.2.19 項] 次の試験では、HCT-116異種移植雌ヌードマウスに30、100、300、600 mg/kgのボリノスタット を腹腔内投与し、投与後2時間のヒストンH3のアセチル化レベル、並びにボリノスタットの血漿 中及び腫瘍中濃度を測定した[2.6.3.2.20 項]。その結果、ボリノスタットの用量に応じて、ヒスト ンH3のアセチル化レベル、並びに血漿中及び腫瘍中ボリノスタット濃度が上昇した[図2.6.2: 4]（そ れぞれパネルA及びC）。 さらに、HCT-116異種移植雌ヌードマウスに150 mg/kgのボリノスタットを投与し、経時的にヒ ストンH3のアセチル化レベル、並びにボリノスタットの血漿中及び腫瘍中濃度を測定した [2.6.3.2.20 項]。その結果、ボリノスタットの血漿中及び腫瘍中濃度は、投与後1～2時間でピーク （約10 μM）に達し、その後も同様な濃度推移を示した[図2.6.2: 4]（それぞれパネルB及びD）。投 与後7時間までに、ボリノスタットの濃度は血漿中及び腫瘍中とも1 μM未満になった。ボリノス タット投与によるヒストンH3のアセチル化レベルの上昇は、投与後1時間より確認され、4時間後 に最高レベルに達し、7時間後には低下した。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 24 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 A B 150 mg/kg Vorinostat 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 100 200 300 400 500 600 700 0 2 C D 100 200 300 400 500 600 700 Concentration (uM) Concentration (uM) 6 8 10 12 14 16 18 20 10.0 1.0 0.1 0.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 100.0 100.0 10.0 1.0 0.1 0.0 plasma 図 2.6.2: 4 4 Time of Pretreatment (hr) Dose (mg/kg) 0 Vehicle 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Ac-H3/T o tal H3 (Relative to Veh icle) Ac-H3/Total H3 (Relative to Vehicle) Vorinostat (2 hr post-dose) tumor plasma tumor 腫瘍中ヒストン H3 のアセチル化（A、B）に対するボリノスタットの影響及び 血漿中／腫瘍中ボリノスタット濃度（C、D） 平均±標準偏差（n = 4）。 [2.6.3.2.20 項] ヒト大腸癌細胞 HCT-116異種移植雌ヌードラットを用いて、ボリノスタットを3種類の投与スケ ジュールで持続静脈内投与したときの有効性を評価する二つの試験を実施した[2.6.3.2.17 項]、 [2.6.3.2.18 項]。 初めの試験では、25又は50 mg/kg/day の14日間持続静脈内投与、あるいは150 mg/kg/day の1日1 回14日間急速腹腔内投与を行った[資料4.2.1.1.3: PD003]、[2.6.3.2.17 項]。溶媒対照群には、溶媒 を14日間持続静脈内投与した。陽性対照群には、200 mg/kg のイリノテカンを週1回3週間腹腔内 投与した。ラット（各群6又は8匹）の移植腫瘍が樹立した段階（腫瘍体積約254 mm3）で投与を 開始した（Day 1）。ボリノスタットの150 mg/kg/day 腹腔内投与群では、毒性により1匹が Day 12 に死亡し、同群の他の動物はすべて多飲及び嗜眠を呈したため、投与を中止した。ボリノスタッ トの持続静脈内投与群における有効性を Day 15に評価した。有効性は、各群の腫瘍体積の中央値 （MTV）で評価した。溶媒投与群5匹の MTV は2475 mm3であった。イリノテカン投与群では、 MTV は1813 mm3、腫瘍増殖阻害率は27%で、統計的有意差は認められなかった（P>0.05）。ボリ ノスタット25 mg/kg/day の14日間持続静脈内投与群では、MTV は2363 mm3、腫瘍増殖阻害率は5% であり、統計学的有意差は認められなかった。ボリノスタット50 mg/kg/day の14日間持続静脈内 投与群では、MTV は575 mm3 、腫瘍増殖阻害率は77%となり、統計学的有意差が認められた （P<0.01）。平均体重減少率は、25及び50 mg/kg/day 群で、それぞれ最大5.6%及び16.7%であった。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 25 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 次の試験では、ヒト大腸癌細胞 HCT-116異種移植ラットを用いて、2とおりのスケジュールでボ リノスタットを持続静脈内投与し、抗腫瘍効果を評価した[資料4.2.1.1.5: PD006]、[2.6.3.2.18 項]。 雌ヌードラット（各群5匹）に、ボリノスタット50 mg/kg/day の24時間持続静脈内投与を7日間、 あるいは50又は100 mg/kg/day の8時間持続静脈内投与を14日間行った。対照群には溶媒を投与し た。ラットの移植腫瘍が樹立した段階（腫瘍体積約344 mm3）で投与を開始した（Day 1）。100 mg/kg/day 群では毒性が認められたため Day 7に投与を中止したが、Day 8に同群の2匹が死亡し、 残りの3匹を安楽死させた。ボリノスタットの有効性は、全動物で腫瘍体積を測定できた最終日の Day 7に、腫瘍増殖阻害率に基づいて評価した。溶媒対照群の MTV は1568 mm3 であった。50 mg/kg/day の24時間持続静脈内投与群では、MTV は650 mm3、腫瘍増殖阻害率は59%であった。50 及び100 mg/kg/day の8時間持続静脈内投与群では、MTV はそれぞれ567及び221 mm3、腫瘍増殖阻 害率はそれぞれ64%及び86%であった。50 mg/kg/day 群ではいずれの投与スケジュールでも、有意 な抗腫瘍効果が認められた（P<0.01）。100 mg/kg/day 群の抗腫瘍効果は、毒性のため評価不能で あった。50 mg/kg/day の両持続静脈内投与群では、Day 2又は Day 3にわずかな平均体重の減少（最 大約4%）が認められた。100 mg/kg/day の持続静脈内投与群では、Day 7までに15.5%平均体重が 減少した。 2.6.2.2.2.7 ヒト大腸癌細胞HCT-15の異種移植モデルにおけるボリノスタットの効果 ヒト大腸癌細胞 HCT-15異種移植モデルを用いてボリノスタットの効果を検討した[資料4.3: 80]。 雌 NMRI nu/nu マウスの皮下に HCT-15細胞を移植し、腫瘍体積が50～160 mm3に達した段階（移 植後18日）で、溶媒（1群10匹）又は60 mg/kg/day のボリノスタット（1群20匹）を1日1回経口投 与した。陽性対照として25 mg/kg/day の5-フルオロウラシル（5-FU）を、Day 1、2、8、9、15、 16に腹腔内投与した。本試験は Day 20に終了した。ボリノスタット群及び5-FU 群の T/C（治療群 ／対照群の平均腫瘍体積比）はそれぞれ0.55及び0.43であり、同程度の抗腫瘍活性を示した。 2.6.2.2.2.8 ヒト非小細胞肺癌細胞A549の異種移植モデルにおけるボリノスタットの効果 ヒト非小細胞肺癌細胞 A549の異種移植モデルを用いて、ボリノスタットの効果を検討した[資 料4.3: 79]、[資料4.3: 80]。 第1の試験[資料4.3: 79]では、雌 Swiss ヌードマウス（各群5～7匹）に A549細胞を皮下移植し、 86、144、240、400 mg/kg/day のボリノスタットを、Day 19から Day 33、Day 36から Day 41にかけ て1日1回経口投与した。重度の毒性を示さない最高用量240 mg/kg/day では、Day 26に最大7.2%の 体重減少が認められた。この用量での log cell kill は0.6であった［log cell kill=(T-C)/(3.32×腫瘍細 胞倍加時間)、T-C は治療群と対照群間での規定腫瘍体積になるまでの時間（中央値）の差］。 第2の試験[資料4.3: 80]では、雌 NMRI nu/nu マウスに A549細胞を皮下移植し、腫瘍体積が約70 mm3に達した段階（移植16日後）で、溶媒又は120 mg/kg/day のボリノスタット（各群10匹）を1 日1回経口投与した。陽性対照として15 mg/kg/day のパクリタキセルを Day 1から Day 4、Day 15 から Day 18にかけて1日1回急速静注した。本試験の投与は Day 21に終了した。ボリノスタット群 2.6.2 薬理試験の概要文 - 26 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 の T/C は Day 11に最良値0.23を示し、パクリタキセル群（T/C=0.16）と比較し若干低い有効性を 示した。 2.6.2.2.2.9 ヒト大腸癌細胞HCT-15及びHCT-116の異種移植モデルにおける5-フルオロウラシ ルの併用に伴うボリノスタットの効果 ヒト大腸癌細胞 HCT-15及び HCT-116の異種移植モデルを用いて、ボリノスタットを5-FU と併 用した場合の効果を検討した[資料4.3: 81]。最初の試験では、雌 NMRI nu/nu マウス（各群10匹） に HCT-15細胞を皮下移植し、60又は120 mg/kg/day のボリノスタット単独、あるいは25 mg/kg/day の5-FU との併用で1日1回経口投与した（5-FU は週2回腹腔内投与）。移植腫瘍体積が25～90 mm3 に達した段階（移植後14日）で投与を開始した。第2の試験では、雄 NMRI nu/nu マウス（各群10 匹）に HCT-116腫瘍片を皮下移植し、60又は120 mg/kg/day のボリノスタット単独、あるいは50 mg/kg/day の5-FU との併用で1日1回経口投与した（5-FU は週1回静脈内投与）。移植腫瘍体積が60 ～100 mm3に達した段階（移植後10日）で投与を開始した。ボリノスタットの効果は、HCT-15及 び HCT-116双方の大腸癌モデルに対し、単独療法、5-FU との併用療法のいずれも低いレベルに止 まった。ボリノスタット、5-FU ともその単独療法は良好な忍容性を示したが、ボリノスタットと 5-FU との併用では毒性が増強した。 2.6.2.3 副次的薬理試験 2.6.2.3.1 2.6.2.3.1.1 In vitro試験 ボリノスタットの特異性 において、標的となる HDAC 以外の酵素・蛋白分子に対するボリノスタットの阻 害能を、25種の酵素アッセイパネルを用いて評価した[資料4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.3.1 項]。この パネルでは、複数の金属酵素を含むほとんどの酵素（25種類のうち23種）に対して、10 μM のボ リノスタットは明らかな阻害作用を示さなかったが、遺伝子組換えの2種のチトクローム P450 （CYP）分子種（2C19、2D6）に対して、明らかな阻害が認められた。CYP に対するボリノスタ ットの影響については、Merck Research Laboratories でさらに検討し、その結果を代謝[2.6.4.5 項] 及び薬物動態学的相互作用[2.6.4.7 項]の項に記載した。 2.6.2.3.1.2 ボリノスタット及びその代謝物の活性評価 ボリノスタット代謝物の HDAC1（アフィニティクロマトグラフィ精製標品）に対する阻害能、 及び MEL 細胞の増殖に対する阻害能を検討した[資料4.2.1.1.1: PD001]、[2.6.3.3.2 項]。その結果、 ラット及びイヌの経口投与時に認められる血清中主要代謝物はいずれも、in vitro において HDAC1 活性を阻害せず（IC50 > 10 μM）、また、MEL 細胞の増殖を阻害しなかった（IC50 > 20 μM）[表2.6.2: 4]。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 27 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 表 2.6.2: 4 ボリノスタット及び主要代謝物の活性 化合物 ボリノスタット ボリノスタットの O-グルクロン酸抱 合体（L-001302381） ボリノスタットコハク酸 （L-000341257：4-アニリノ-4-オキソブ タン酸） ボリノスタットアジピン酸 （L-001302471：6-アニリノ-6-オキソヘ キサン酸） ボリノスタット一級アミド （L-001302100：N-フェニルオクタンジ アミド） ボリノスタット酸（L-001301732：8-ア ニリノ-8-オキソオクタン酸） アセトアニリド 2.6.2.3.2 HDAC1活性に対する IC50（μM） 0.07 >10 MEL 増殖に対する IC50（μM） 0.66 >20 >10 >20 >10 >20 >10 >20 >10 >20 >10 >20 In vivo試験 In vivo の副次的薬理試験は行わなかった。 2.6.2.4 安全性薬理試験 安全性薬理試験として、ラットを用いた経口投与による呼吸機能試験[2.6.3.4.2 項]及び機能観 察総合評価試験（FOB）[2.6.3.4.3 項]、並びにイヌを用いた経口投与による心血管系テレメトリ 試験[2.6.3.4.4 項]を実施した。また、ヒト ether-a-go-go 関連遺伝子（hERG）発現細胞を用いて、 in vitro における電気生理学的評価を行った[2.6.3.4.1 項] 2.6.2.4.1 経口投与によるラット呼吸機能試験 雄 Sprague-Dawley ラットに20、50、150 mg/kg のボリノスタットを単回経口投与し、全身プレ チスモグラフィにより呼吸機能に対する影響を検討した[資料4.2.1.3.2: TT 5654]、[2.6.3.4.2 項]。 溶媒として1.0%（w/v）カルボキシメチルセルロース（CMC）ナトリウム／0.5%（v/v）Tween80 を用いた。呼吸機能パラメータとして、呼吸数、1回換気量、分時換気量、PenH（気道抵抗性の 指標）を評価した。いずれのボリノスタット投与群においても、呼吸機能パラメータに投与に関 連した変化は認められなかった。したがって、雄ラットの呼吸機能に対するボリノスタットの無 作用量は≥150 mg/kg であった。 2.6.2.4.2 経口投与によるラット機能観察総合評価（FOB）試験 雄 Sprague-Dawley ラットに20、50、150 mg/kg のボリノスタットを単回経口投与し、中枢神経 2.6.2 薬理試験の概要文 - 28 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 系機能に対する影響を検討した[資料4.2.1.3.3: TT 5655]、[2.6.3.4.3 項]。溶媒として1.0%（w/v） CMC ナトリウム／0.5%（v/v）Tween80を用いた。投与後約30分より、FOB 観察（ケージ内観察、 ハンドリング観察、オープンフィールド観察、刺激反応性、握力、着地時後肢開脚度及び体温測 定）を行った。投与に関連した神経行動学的変化は観察されなかった。したがって、雄ラットの 中枢神経系機能及び一般状態に対する無作用量は≥150 mg/kg であった。 2.6.2.4.3 hERG発現細胞における電気生理学的評価 チャイニーズハムスター卵巣（CHO）-K1細胞に異種発現させた hERG チャネルに対するボリ ノスタットの影響を、標準的な whole-cell voltage clamp 法を用いて検討した[資料4.2.1.3.1: TT 4720]、[2.6.3.4.1 項]。ボリノスタットは最高300 µM の濃度で、hERG 電流に影響を及ぼさな かった。別の in vitro 試験において、IKr チャネル蛋白質に対するボリノスタット結合をリガンド 結合置換法により解析したところ、ボリノスタットは1及び10 µM の濃度で結合活性を示さなかっ た。 2.6.2.4.4 経口投与によるイヌ心血管系テレメトリ試験 覚醒雌ビーグル犬にボリノスタットのカプセル剤を用量漸増経口投与し、心血管系への影響を 検討した[資料4.2.1.3.4: TT 5656]、[2.6.3.4.4 項]。ボリノスタットは賦形剤を含む混合物製剤と して供給され、4匹のイヌに、プラセボ、30、90、240 mg/kg（ボリノスタットとして0、20、60、 160 mg/kg）のカプセル剤を用量漸増経口投与した。プラセボ群には空のカプセルを投与した。そ の結果、90及び240 mg/kg（ボリノスタットとして60及び160 mg/kg）群で心拍数がそれぞれ24% 及び25%増加した。また、両群で PR 間隔の短縮（いずれも-9%）及び QT 間隔の短縮（それぞれ -5%及び-12%）が認められた。その他の投与に関連した心血管系への影響及び一般状態変化は認 められず、また QT/QTc 間隔の延長を示す変化も認められなかった。イヌ心血管系に対する無作 用量は30 mg/kg（ボリノスタットとして20 mg/kg）であった。 2.6.2.5 薬力学的薬物相互作用試験 ボリノスタットの主代謝経路はグルクロン酸抱合と加水分解後の β-酸化である。ボリノスタッ トの消失にチトクローム P450（CYP）は関与していないため、CYP 阻害能や誘導能のある薬物と 併用した場合でも、ボリノスタットは CYP を介した薬物間相互作用を受けないことが予想される。 また、ボリノスタットは、CYP の強力な可逆的阻害剤ではなかった。遺伝子発現変化の試験結果 から、ボリノスタットは10 μM 以上の濃度で CYP2C9及び CYP3A4の活性を抑制することが示唆 されたが、この変化は、ヒトでボリノスタットの薬理作用がみられた血清中濃度2 µM（Cmax）よ りも高い濃度で認められた。ボリノスタットは CYP の強力な阻害剤でも誘導剤でもないため、 CYP を介して他剤の薬物動態に影響を及ぼさないと推察され、相互作用試験を実施しなかった [2.6.4.7 項]。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 29 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.6 考察及び結論 ボリノスタットはクラスⅠ及びⅡの特定の HDAC に対し強力な阻害活性を示す。その作用は、 ボリノスタットが HDAC の触媒ポケットに直接結合することにより発揮されると考えられる。培 養がん細胞において、ボリノスタットは細胞周期の G1期又は G2期停止、アポトーシス又は細胞 分化を誘導する。種々動物モデルにおいて、ボリノスタットの生物学的活性及び抗腫瘍効果が示 されている。ヒト前立腺癌細胞のマウス異種移植モデルでは、ボリノスタットの腹腔内投与によ り顕著な腫瘍増殖阻害作用が認められた。特に、50 mg/kg/day の用量では、重度の毒性を伴わず に腫瘍の退縮が認められた。治療抵抗性 APL のトランスジェニックマウスモデルでは、レチノイ ン酸との併用でボリノスタットを腹腔内投与したときに、白血病の寛解と生存期間の延長が認め られた。発がん物質処理ラットに、ボリノスタットを130日間にわたり混餌投与した試験では、乳 腺腫瘍発生までの時間の延長、腫瘍発生率、多発性、腫瘍体積の減少が認められた。同様に、発 がん物質処理したラット乳腺腫瘍モデルにおいて、腫瘍樹立後にボリノスタットを5週間混餌投与 したとき、ボリノスタットは腫瘍の増殖を顕著に阻害した。発がん物質処理したマウス肺腫瘍モ デルでは、ボリノスタットの17週間混餌投与により発生腫瘍数の減少が認められた。ヒト乳癌細 胞及びヒト大腸癌細胞のマウス異種移植モデルでは、ボリノスタットの腹腔内投与により腫瘍増 殖が阻害された。ボリノスタットによる腫瘍増殖の阻害は、重度の毒性を伴わない用量で認めら れた。マウスのヒト大腸癌細胞 HCT-116異種移植モデルでは、ボリノスタットの腹腔内投与によ り、アセチル化ヒストン H3の蓄積が用量依存的かつ時間依存的に生じ、この蓄積はボリノスタッ トの腫瘍中レベル及び血漿中レベルと関連した。以上より、ボリノスタットは、in vitro 及び in vivo で生物学的活性及び抗腫瘍活性を有することが示された。 ボリノスタットの安全性薬理試験では、経口投与によるラットの呼吸機能試験及び機能観察総 合評価試験において、ボリノスタットは最高用量150 mg/kg/day においても呼吸器系及び神経系に 影響を及ぼさないことが示された。イヌを用いた経口投与による心血管系テレメトリ試験では、 QT/QTc 間隔延長を示す所見は認められなかった。また、CHO-K1細胞に異種発現させた hERG チ ャネルに対するボリノスタットの作用を、標準的な whole-cell voltage clamp 法を用いて検討した 試験では、ボリノスタットは300 μM の濃度で hERG 電流に対して影響を及ぼさなかった。さらに、 IKr チャネル蛋白質に対するボリノスタットの結合をリガンド結合置換法により in vitro で解析し たところ、ボリノスタットは1及び10 μM の濃度で結合活性を示さなかった。 2.6.2 薬理試験の概要文 - 30 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.2 薬理試験の概要文 2.6.2.7 参考文献 [資料4.3: 2] [資料4.3: 3] [資料4.3: 4] [資料4.3: 5] [資料4.3: 6] [資料4.3: 7] [資料4.3: 8] [資料4.3: 9] [資料4.3: 10] [資料4.3: 11] [資料4.3: 12] [資料4.3: 13] [資料4.3: 14] [資料4.3: 15] [資料4.3: 16] [資料4.3: 17] Richon VM, Emiliani S, Verdin E, Webb Y, Breslow R, Rifkind RA, et al. 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Coadministration of histone deacetylase inhibitors and perifosine synergistically induces apoptosis in human leukemia cells through Akt and ERK1/2 inactivation and the generation of ceramide and reactive oxygen species. Cancer Res. 2005;65(6):2422-32. Dai Y, Rahmani M, Dent P, Grant S. Blockade of histone deacetylase inhibitor-induced RelA/p65 acetylation and NF-κB activation potentiates apoptosis in leukemia cells through a process mediated by oxidative damage, XIAP downregulation, and c-Jun N-terminal kinase 1 activation. Mol Cell Biol. 2005;25(13):5429-44. : Chemotherapy evaluation for SAHA (Aton), -20 . : Profiling of HDAC inhibitors in vivo, - -20 . : Profiling of SAHA provided by ATON Pharma in HCT-15 and HCT-116 Xenografts, -20 . 2.6.2 薬理試験の概要文 - 36 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 目次 頁 2.6.3.1 薬理試験：一覧表............................................................................................................. 2 2.6.3.2 効力を裏付ける試験......................................................................................................... 5 2.6.3.2.1 HDAC1酵素活性の阻害............................................................................................ 5 2.6.3.2.2 HDAC2酵素活性の阻害............................................................................................ 6 2.6.3.2.3 HDAC3酵素活性の阻害............................................................................................ 7 2.6.3.2.4 HDAC4酵素活性の阻害............................................................................................ 8 2.6.3.2.5 HDAC5酵素活性の阻害............................................................................................ 9 2.6.3.2.6 HDAC6酵素活性の阻害.......................................................................................... 10 2.6.3.2.7 HDAC7酵素活性の阻害.......................................................................................... 11 2.6.3.2.8 HDAC8酵素活性の阻害.......................................................................................... 12 2.6.3.2.9 hSirT1酵素活性の阻害............................................................................................ 13 2.6.3.2.10 ヒトがん細胞株の増殖阻害 ................................................................................... 14 2.6.3.2.11 大腸癌細胞HCT-116の増殖阻害 ............................................................................ 15 2.6.3.2.12 ベキサロテン併用によるヒトCTCL細胞株HHの増殖阻害 ............................... 16 2.6.3.2.13 ヒト大腸癌細胞株HCT-116におけるヒストン高アセチル化 ............................ 17 2.6.3.2.14 ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231異種移植マウスにおける腫瘍増殖阻害........... 18 2.6.3.2.15 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 ................ 19 2.6.3.2.16 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 ................ 20 2.6.3.2.17 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植ラットにおける腫瘍増殖阻害 ................ 21 2.6.3.2.18 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植ラットにおける腫瘍増殖阻害 ................ 22 2.6.3.2.19 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスに対するボリノスタット単回 投与によるヒストン高アセチル化 ....................................................................... 23 2.6.3.2.20 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスに対するボリノスタット単回 投与によるヒストン高アセチル化 ....................................................................... 24 2.6.3.2.21 細胞内HAT活性に対するボリノスタットの効果 ............................................... 25 2.6.3.3 副次的薬理試験............................................................................................................... 26 2.6.3.3.1 ボリノスタットの特異性 ....................................................................................... 26 2.6.3.3.2 ボリノスタット及びその代謝物の活性評価 ....................................................... 27 2.6.3.4 安全性薬理試験............................................................................................................... 28 2.6.3.4.1 hERG発現細胞における電気生理学的評価 ......................................................... 28 2.6.3.4.2 経口投与によるラット呼吸機能試験 ................................................................... 29 2.6.3.4.3 経口投与によるラット機能観察総合評価（FOB）試験 ................................... 30 2.6.3.4.4 経口投与によるイヌ心血管系テレメトリ試験 ................................................... 31 2.6.3 薬理試験概要表 - 1 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.1 薬理試験：一覧表 試験の種類 効力を裏付ける試験 試験系 投与方法 実施施設 試験番号 記載箇所 HDAC1酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRLa PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC2酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC3酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC4酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC5酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC6酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC7酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 HDAC8酵素活性の阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 hSirT1酵素活性の阻害 ヒト in vitro Atonb PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 ヒトがん細胞株の増殖阻害 ヒト in vitro Aton PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 大腸癌細胞 HCT-116の増殖阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 ベキサロテン併用によるヒト CTCL 細胞株 HH の増殖阻害 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 ヒト大腸癌細胞株 HCT-116におけるヒストン高アセチル化 ヒト in vitro MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 ヒト乳癌細胞株 MDA-MB-231移植マウスにおける腫瘍増殖 阻害 ヒト、 マウス 腹腔内 c PD008 [資料4.2.1.1.6: PD008] 参考資料 2.6.3 薬理試験概要表 - 2 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） 試験の種類 試験系 投与方法 ヒト大腸癌細胞株 HCT-116移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 ヒト、 マウス 腹腔内 ヒト大腸癌細胞株 HCT-116移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 ヒト、 マウス 腹腔内 ヒト大腸癌細胞株 HCT-116移植ラットにおける腫瘍増殖阻害 ヒト、 ラット ヒト、 ラット 静脈内、 腹腔内 静脈内 ヒト大腸癌細胞株 HCT-116移植マウスに対するボリノスタッ ト単回投与によるヒストン高アセチル化 ヒト、 マウス 腹腔内 ヒト大腸癌細胞株 HCT-116移植マウスに対するボリノスタッ ト単回投与によるヒストン高アセチル化 ヒト、 マウス 細胞内 HAT 活性に対するボリノスタットの効果 ヒト ヒト大腸癌細胞株 HCT-116移植ラットにおける腫瘍増殖阻害 2.6.3 試験番号 記載箇所 PD008 [資料4.2.1.1.6: PD008] 参考資料 PD005 [資料4.2.1.1.4: PD005] 参考資料 PD003 [資料4.2.1.1.3: PD003] 参考資料 PD006 [資料4.2.1.1.5: PD006] 評価資料 MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 腹腔内 MRL PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 in vitro MRL PD002 [資料4.2.1.1.2: PD002] 評価資料 薬理試験概要表 - 3 - 実施施設 d ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.1 薬理試験：一覧表（続き） 試験の種類 副次的薬理試験 ボリノスタットの特異性 ボリノスタット及びその代謝物の活性評価 試験系 投与方法 実施施設 試験番号 記載箇所 ヒト、ラット、ウ サギ、イヌ、ウシ ヒト、マウス in vitro Aton PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 in vitro Aton PD001 [資料4.2.1.1.1: PD001] 評価資料 CHO-K1細胞 in vitro MRL TT # -4720 [資料4.2.1.3.1: TT 4720] 評価資料 安全性薬理試験 hERG 発現細胞における電気生理学的評価 e ラット 経口 MRL TT # -5654 [資料4.2.1.3.2: TT 5654] 評価資料 経口投与によるラット機能観察総合評価試験 e ラット 経口 MRL TT # -5655 [資料4.2.1.3.3: TT 5655] 評価資料 経口投与によるイヌ心血管系テレメトリ試験 e イヌ 経口 MRL TT # -5656 [資料4.2.1.3.4: TT 5656] 評価資料 経口投与によるラット呼吸機能試験 薬力学的薬物相互作用試験 該当試験なし a b c d e MRL：Merck Research Laboratories Aton：Aton Pharma, Inc.（Merck Sharp & Dohme Corp., a subsidiary of Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J., U.S.A.の完全子会社） ： U.S.A.） ： U.S.A.） GLP 適用試験 2.6.3 薬理試験概要表 - 4 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2 2.6.3.2.1 効力を裏付ける試験 HDAC1酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC1酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：HDAC1酵素を C 末端 FLAG タグ（8アミノ酸から成るシークエンス：Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）の融合蛋白として HEK293F 細胞に安定発現させ、抗 FLAG 抗体レジンを用いるアフィニティクロマトグラフィにより精製した。精製 HDAC1酵素活性を、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer シス テムを用いたものであり、試薬には蛍光基質の50 mM ストック溶液及び Developer 濃縮液が含まれる。Fluor-de-Lys 基質における Lys 残基の脱 アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360 nm、蛍光波長460 nm）を測定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2及び0.1 mg/mL BSA を含有する20 mM Hepes（pH 8）を用いた。HDAC1はアッセイバッファーで2.5 nM に調製した（反応液 中の最終濃度は1 nM）。50 mM Fluor-de-Lys 基質液はアッセイバッファーで60 μM に調製した（反応液中の最終濃度は30 μM）。20倍 Developer 濃縮液はアッセイバッファーで1：167に希釈した。ボリノスタット（Lot # ）は、10倍濃度の5%ジメチルスルフォキシド （DMSO）／アッセイバッファー溶液として2.5 nM～50 μM に調製した。DMSO＋基質を Developer 液添加の後に加えて陰性対照とし、DMSO ＋基質を Developer 液添加前に加えたものを陽性対照とした。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を 固定濃度の HDAC1酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化リジン含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍 光アッセイを行った。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC 50 を算出した。 結果：ボリノスタットは HDAC1を阻害し、IC 50は30 ± 9 nM（平均 ± 標準誤差、n = 5）であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 5 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.2 HDAC2酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC2酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：HDAC2酵素を C 末端 FLAG タグの融合蛋白として HEK293EBNA1tet-on 細胞に発現させ、抗 FLAG 抗体レジンを用いるアフィニティ クロマトグラフィにより精製した。精製 HDAC2酵素活性を、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システムを用いたものであり、試薬には、蛍光基質の50 mM ストック溶 液及び Developer 濃縮液が含まれる。Fluor-de-Lys 基質における Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波 長360 nm、蛍光波長460 nm）を測定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2及び0.1 mg/mL BSA を含有する25 mM Tris/HCl（pH 8）を用いた。HDAC2濃度は最終5 nM とした。50 mM Fluor-de-Lys 基質 液は蒸留水で150 μM に調製した（反応液中の最終濃度は20 μM）。20倍 Developer 濃縮液は蒸留水で1:167に希釈した。ボリノスタット（Lot # ）薬液（1：3の連続希釈系列で最終10000～4.5 nM）は、10倍濃度の5% DMSO／蒸留水溶液として調製した。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃度の HDAC2酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化 リジン含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセイを行った。HDAC2酵素非存在下、基質のみを添加したものを 陰性対照とした。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC50を算出 した。 結果：1回の実験の結果、ボリノスタットは HDAC2を阻害し、IC50は49 nM であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 6 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.3 HDAC3酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC3酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：HDAC3酵素を C 末端 FLAG タグの融合蛋白として HEK293F 細胞に安定発現させた。これに併せて、SMRT 蛋白の DAD ドメイン（His タグ付き）を HDAC3と共発現させた。HDAC3酵素複合体は、抗 FLAG 抗体レジンを用いるアフィニティクロマトグラフィにより精製した。 精製 HDAC3酵素活性を、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセ イは Fluor-de-Lys™基質／Developer システムを用いたものであり、試薬には、蛍光基質の50 mM ストック溶液及び Developer 濃縮液が含まれ る。Fluor-de-Lys 基質における Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360 nm、蛍光波長460 nm）を測 定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2及び0.5 mg/mL BSA を含有する20 mM Hepes（pH 8）を用いた。HDAC3はアッセイバッファーで18.75 nM に調製した（反応 液中の最終濃度は7.5 nM）。50 mM Fluor-de-Lys 基質液はアッセイバッファーで60 μM に調製した（反応液中の最終濃度は30 μM）。20倍 Developer 濃縮液はアッセイバッファーで1:167に希釈した。ボリノスタット（Lot # ）は、10倍濃度の5% DMSO／アッセイバッフ ァー溶液として調製した（最終濃度2.5 nM～50 μM）。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃 度の HDAC3酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化リジン含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッ セイを行った。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC50を算出した。 結果：ボリノスタットは HDAC3を阻害し、IC 50は86 ± 7 nM（平均 ± 標準誤差、n = 4）であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 7 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.4 HDAC4酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC4酵素活性の阻害に関する IC 50 の測定 試験系：次の3種類の HDAC4蛋白を用いた：1）“HDAC4-CD”－野生型 HDAC4の触媒ドメイン（残基653～1084）に、6残基の His タグを付けた蛋白を大腸菌に発 現させ、金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルろ過クロマトグラフィにより精製；2）“HDAC4-FL”－野生型完全長 HDAC4の C 末端側に FLAG タグを付けた蛋白を、哺乳動物由来細胞株 HEK293EBNA1 tet-on において、ドキシサイクリン誘導的に安定発現させ、抗 FLAG 抗体レ ジンを用いるアフィニティクロマトグラフィにより精製；3）“HDAC4-GOF”－機能獲得型変異 H976Y を有する HDAC4触媒ドメイン（残基653～1084）に、6残基 の His タグを付けた蛋白を大腸菌に発現させ、金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルろ過クロマトグラフィにより精 製。 HDAC4-CD 及び HDAC4-FL は、アセチル化リジンを有する基質に対しては不活性若しくは極めて低い活性のみを示すが、BOC-ε-trifluoroacetyl-lysine-AMC に対して は nM 以下の濃度で活性を示す。また、HDAC4活性は、H976Y 変異によりアセチル化リジン基質に対する活性が3桁以上上昇する。 精製蛋白は、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システムを用いた。本システムの蛍光基質50 mM ストック溶液を HDAC4-GOF 活性の測定に用いたが、HDAC4-CD 及び HDAC4-FL 活性の測定には BOC-ε-trifluoroacetyl-lysine-AMC を基質として用いた。いずれの場合も、Developer 液を用いて反応を終了させた。Fluor-de-Lys 基質中の Lys 残基における脱アセチ ル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360 nm、蛍光波長460 nm）を測定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。バッファーは、1）HDAC4-CD アッセイ用に137 mM NaCl、2.7 mM KCl、 1 mM MgCl 2 及び0.1 mg/mL BSA を含有する25 mM Tris/HCl（pH 8）；2）HDAC4-FL アッセイ用に137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl 2 、0.1 mg/mL BSA 及び0.2% N-オクチルグルコシドを含有する25 mM Tris/HCl（ pH 8） ；3）HDAC4-GOF アッセイ用に137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl 2 及び0.1 mg/mL BSA を含有する20 mM Hepes（pH 7.5）を用い、それぞれの酵素標品を濃度0.2～2 nM で加えた。基質液は蒸留水で150 μM に調製した（反応液中の最終濃度は20～25 μM）。20倍 Developer 濃縮液は蒸留水で1:167に希釈した。ボリノスタット（Lot # 又は）は、10倍濃度の5% DMSO／蒸留水溶液として調製した（HDAC4-FL： 1000～0.45 nM 及び10000～78 nM、HDAC4-CD：1000～0.45 nM 及び10000～78 nM、HDAC4-GOF：20000～456 nM）。HDAC4酵素非存在下、基質のみを添加したも のを陰性対照とした。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃度の HDAC4酵素複合体とプレインキュベートした後、 基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセイを行った。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロジス ティック方程式に当てはめ、IC50 を算出した。 結果：HDAC4-CD、HDAC4-FL 及び HDAC4-GOF に対するボリノスタットの IC 50 は、それぞれ> 10000 nM（n=3）、> 10000 nM（n=3）及び408 nM（n=4）であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 8 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.5 HDAC5酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC5酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：野生型 HDAC5の触媒ドメイン（残基678～1122）に、6残基の His タグを付けた蛋白を大腸菌に発現させ、金属キレートアフィニティ クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルろ過クロマトグラフィにより精製した。精製 HDAC5酵素活性を、市販の HDAC 活 性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システ ムを用いるものであるが、HDAC5活性については、このキットに含まれる蛍光基質を用いず、BOC-ε-trifluoroacetyl-lysine-AMC を基質として 用いた。Developer 液を用いて反応を終了させた。Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360 nm、蛍 光波長460 nm）を測定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mg/mL BSA 及び0.2% N-オクチルグルコシドを含有する25 mM Tris/HCl（pH 8）を用いた。HDAC5濃度は最終0.3 nM と した。基質液は蒸留水で150 μM に調製した（反応液中の最終濃度は20～25 μM）。20倍 Developer 濃縮液は蒸留水で1:167に希釈した。ボリノ スタット（Lot # ）は、10倍濃度の5% DMSO／蒸留水溶液として調製した（最終濃度5000～39 nM）。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃度の HDAC5酵素複合体とプレインキュベートした後、基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセイを行った。HDAC5酵素非存在下、基質のみを添加したものを陰性対照とした。IC50 を算 出するため、異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロジスティック方程式に当てはめた。 結果：1回の実験の結果、ボリノスタットは濃度5 μM で HDAC5活性を58%阻害した。 2.6.3 薬理試験概要表 - 9 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.6 HDAC6酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC6酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：HDAC6酵素を、C 末端 FLAG タグの融合蛋白として HEK293F 細胞に安定発現させ、抗 FLAG 抗体レジンを用いるアフィニティクロ マトグラフィにより精製した。精製 HDAC6酵素活性を、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA） を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システムを用いた。試薬には、蛍光基質の50 mM ストック溶液及び Developer 濃縮液が含まれる。Fluor-de-Lys 基質における Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360 nm、蛍光波 長460 nm）を測定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2及び0.1 mg/mL BSA を含有する20 mM Hepes（pH 7.4）を用いた。HDAC6はアッセイバッファーで75 nM に調製した（反応液 中の最終濃度は30 nM）。50 mM Fluor-de-Lys 基質液はアッセイバッファーで60 μM に調製した（反応液中の最終濃度は30 μM）。20倍 Developer 濃縮液はアッセイバッファーで1:167に希釈した。ボリノスタット（Lot # ）は、10倍濃度の5% DMSO／アッセイバッフ ァー溶液として調製した（最終濃度2.5 nM～50 μM）。DMSO＋基質を Developer 液添加前に加えたものを陽性対照とし、DMSO＋基質を Developer 液添加後に加えたものを陰性対照とした。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃度 の HDAC6酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化リジン含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセ イを行った。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC 50を算出した。 結果：ボリノスタットは HDAC6を阻害し、IC 50は37 ± 5 nM（平均 ± 標準誤差、n = 4）であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 10 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.7 HDAC7酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC7酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：野生型 HDAC7の触媒ドメイン（残基515～952）に、6残基の His タグを付けた蛋白を大腸菌に発現させ、金属キレートアフィニティ クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルろ過クロマトグラフィにより精製した。精製 HDAC7酵素活性を、市販の HDAC 活 性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システ ムを用いるものであるが、HDAC7活性については、このキットに含まれる蛍光基質を用いず、BOC-ε-trifluoroacetyl-lysine-AMC を基質として 用いた。基質における Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360 nm、蛍光波長460 nm）を測定する ことにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、0.1 mg/mL BSA 及び0.2% N-オクチルグルコシドを含有する25 mM Tris/HCl（pH 8）を用いた。HDAC7濃度は最終0.3 nM と した。基質液は蒸留水で150 μM に調製した（反応液中の最終濃度は20～25 μM）。20倍 Developer 濃縮液は蒸留水で1:167に希釈した。ボリノ スタット（Lot # ）は、10倍濃度の5% DMSO／蒸留水溶液として調製した（最終濃度5000～78 nM）。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃度の HDAC7酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化リジン 含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセイを行った。HDAC7酵素非存在下、基質のみを添加したものを陰性対 照とした。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC 50を算出した。 結果：1回の実験の結果、ボリノスタットは最高5 μM の濃度で HDAC7を阻害しなかった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 11 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.8 HDAC8酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HDAC8酵素活性の阻害に関する IC 50の測定 試験系：HDAC8酵素を、C 末端側に His タグを付けた融合蛋白として大腸菌に安定発現させ、ニッケルベース樹脂を用いる金属キレートアフ ィニティクロマトグラフィ（蛋白はイミダゾールで溶出）、次いで陰イオン交換クロマトグラフィ（蛋白を KCl の濃度勾配で溶出）、最後にゲ ルろ過クロマトグラフィにより精製した（純度 > 95%）。精製 HDAC8酵素活性を、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、 Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システムを用いたものであり、試薬には、蛍光基質の 5 mM ストック溶液及び Developer 濃縮液が含まれる。Fluor-de-Lys 基質中の Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強 度（励起波長360 nm、蛍光波長460 nm）を測定することにより行った。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、100 mM NaCl、20 mM KCl、1 mM MgCl2及び0.1 mg/mL BSA を含有する20 mM Hepes（pH 8）を用いた。HDAC8はアッセイバッファーで37.5 nM に調製した（反応液 中の最終濃度は15 nM）。5 mM Fluor-de-Lys 基質液はアッセイバッファーで200 μM に調製した（反応液中の最終濃度は100 μM）。5倍 Developer 濃縮液はアッセイバッファーで1:100に希釈した。ボリノスタット（Lot # ）は、10倍濃度の5% DMSO／アッセイバッフ ァー溶液として調製した（最終濃度2.5 nM～50 μM）。反応液中、DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定濃度 の HDAC8酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化リジン含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセ イを行った。DMSO＋基質を Developer 液添加前に加えたものを陽性対照、DMSO＋基質を Developer 液添加後に加えたものを陰性対照とした。 異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC 50を算出した。 結果：ボリノスタットは HDAC8を阻害し、IC 50は779 ± 183 nM（平均 ± 標準誤差、n = 5）であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 12 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.9 hSirT1酵素活性の阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：hSirT1酵素活性の阻害に関する IC50の測定 試験系：組換えヒト SirT1酵素及び SirT1活性蛍光アッセイキットは、 より購入した。こ のキットには、Fluor-de-Lys-SirT1™基質／Developer システムが含まれており、基質としてヒト p53の379～382番目の残基に相当するペプチド Arg-His-Lys-Lys（Ac）を用いる。p53の Lys-382残基は SirT1の in vivo 基質として知られており、それに相当するリジンの脱アセチル化レベル に比例して生じる蛍光シグナルを測定した。 試験方法：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーとして、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2及び1 mM NAD+を含有する25 mM Tris/HCl（ pH 8）を用いた。Fluor-de-Lys-SirT1基質の反応液中最終濃度を50 μM とし、37°C、 1時間酵素反応させた後、Developer 液を用いて反応を停止した。ボリノスタット薬液は、10倍濃度の5% DMSO／アッセイバッファー溶液とし て調製した。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。異なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを、4パラメータのロ ジスティック方程式に当てはめ、IC50を算出した。 結果：ボリノスタットは最高100 µM の濃度で hSirT1を阻害しなかった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 13 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.10 ヒトがん細胞株の増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：ヒトがん細胞株の増殖に対するボリノスタットの効果を in vitro の細胞株スクリーニングプロジェクトで評価した。 試験系：ヒトの白血病、メラノーマ、肺癌、大腸癌、脳腫瘍、卵巣癌、乳癌、前立腺癌及び腎癌由来の腫瘍細胞株47種を用いてスクリーニン グを行った。 試験方法： において、in vitro 細胞株スクリーニングプロジェクトの一環とし て開発された標準プロトコールに基づき、ボリノスタットの細胞増殖に対する効果を評価した。 結果：In vitro 細胞株スクリーニングにおいて、50%増殖阻害濃度（GI50）= 38.6 nM～6.2 µM の範囲でボリノスタットの細胞増殖阻害能が示さ れた。細胞株パネル全体にわたりボリノスタットは同様な阻害作用を示し、特定の組織由来のがん細胞種が他の組織由来のがん細胞種より高 い感受性を示すことはなかった。 付記：試験実施者 2.6.3 薬理試験概要表 - 14 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.11 大腸癌細胞HCT-116の増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：HCT-116大腸癌細胞の増殖阻害 試験系：ヒト由来 HCT-116大腸癌細胞の増殖に対するボリノスタットの効果を、種々濃度のボリノスタット存在下で細胞を培養することによ り検討した。細胞の生存率及び増殖能は、HCT-116細胞内の ATP レベルを測定することにより評価した。ATP レベルの測定には、Cambrex 社 製品 ViaLight PLUS のバイオルミネッセンス法を用いた［ATP 存在下、ルシフェリンがルシフェラーゼによりオキシルシフェリンに変換され る際に光が放出され、その光量（発光波長565 nm）は生細胞数に比例する］。 試験方法：ViaLight アッセイは、手順書に従い実施した。96ウェルプレートで4000 cells/well の細胞を、5%CO2存在下、37°C で24時間培養後、 ボリノスタット（Lot # ；0.01～20 μM）又は溶媒（0.2%DMSO）を添加し、さらに48～72時間培養した。Ada プログラム を用い、ボリノスタット濃度に対する相対発光量（RLU）曲線を非線形回帰により4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC50 を算 出した。 結果：ボリノスタットは HCT-116大腸癌細胞の増殖を阻害し、48時間培養後の IC 50は約800 nM であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 15 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.12 ベキサロテン併用によるヒトCTCL細胞株HHの増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：ベキサロテンとの併用時のヒト皮膚 T 細胞性リンパ腫（CTCL）HH 細胞に対する増殖阻害 試験系：HH 細胞の増殖に対するベキサロテンとボリノスタットの併用効果を、72時間の培養により検討した。細胞の生存率及び増殖能は、 HH 細胞内の ATP レベルを測定することにより評価した。ATP レベルの測定には、Cambrex 社製品 ViaLight PLUS のバイオルミネッセンス法 を用いた［ATP 存在下、ルシフェリンがルシフェラーゼによりオキシルシフェリンに変換される際に光が放出され、その光量（発光波長565 nm） は生細胞数に比例する］。 試験方法：ベキサロテン（0、0.01、0.06、0.1、0.6、3、6 μM）及びボリノスタット（0～30 μM）共存下における HH 細胞増殖阻害効果を評価 した。この実験で用いたベキサロテンの最高濃度は、HH 細胞に対する IC50にほぼ匹敵する値である。ViaLight アッセイは、手順書に従い実 施した。96ウェルプレートで細胞を、5%CO2存在下、37°C で48時間培養後、薬物（単剤又は併用）又は溶媒を添加し（DMSO の最終濃度は 0.001%）、さらに72時間培養した。 結果： ボリノスタット／ベキサロテンの併用は、HH 細胞に対し相加的な増殖阻害効果を示した。 2.6.3 薬理試験概要表 - 16 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.13 ヒト大腸癌細胞株HCT-116におけるヒストン高アセチル化 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：ヒト由来 HCT-116大腸癌細胞におけるヒストン高アセチル化を指標とした、ボリノスタットの HDAC 活性阻害効果の検討。 試験系：HCT-116細胞抽出物の酵素免疫測定法（ELISA）。 試験方法：HCT-116細胞より調製した全細胞抽出試料中のアセチル化ヒストン H3及び総ヒストン H3レベルを測定するため、抗原を直接コー トする ELISA 法を行った。6ウェルプレートで、1×10 6 cells/well の HCT-116細胞を、ボリノスタット（0.2～50 μM）又は溶媒（0.5%DMSO）の 存在下で6時間培養した。培地を除去しリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄後、プロテアーゼ阻害剤存在下、2%デオキシコール酸を含有す る50 mM Tris／150 mM NaCl／5 mM EDTA（pH 8.0）300 µL に細胞を懸濁した。1 mL シリンジと25G 針を用いて細胞懸濁液の吸引・排出操作 を10回行い、可溶化抽出液を得た。総蛋白濃度は界面活性剤適合性の蛋白定量キットで定量した。PBS を用いて、可溶化抽出液中の蛋白濃度 を200 ng/100 µL に調製し、全量を500 µL とした。マイクロタイタープレートを可溶化抽出液（200 ng 蛋白）でコートし、プレートをシール 後、一晩4°C で冷蔵保管した。次いで、Bio-Tek 社製マイクロプレートウォッシャーで、プレートを PBS で洗浄し、ブロック液（10%BSA／PBS） を添加後、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、一次抗体（2000倍希釈のウサギ抗アセチル化ヒストン H3抗体又は5000倍希 釈のウサギ抗ヒストン H3抗体）を添加後、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、二次抗体［3000倍希釈の HRP 標識ヤギ抗ウ サギ IgG（H+L）抗体］を添加後、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質 TMB（3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンジジン）を 加え、青色発色が明確になるまでインキュベートした。2N 硫酸を添加し発色を停止した後、450 nm における吸光度を測定した。データは、 バックグラウンドの値を差し引き、溶媒におけるアセチル化ヒストン H3／総ヒストン H3比を基準として、ボリノスタット添加時のその比の 変化率として示した。 結果：HCT-116細胞において、ヒストン H3のアセチル化はボリノスタットの濃度及び処理時間に依存して亢進した。細胞を600 nM のボリノ スタット存在下で6時間培養した場合、アセチル化ヒストン H3の蓄積は約3倍増加した。 2.6.3 薬理試験概要表 - 17 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.14 ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231異種移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.6: PD008] 試験番号：PD008（参考資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：ヒト乳癌 MDA-MB-231細胞の異種移植モデルにおける、ボリノスタット1日1回腹腔内投与の腫瘍増殖阻害効果を検討。 試験系：雌ヌードマウス（nu/nu； より購入）に MDA-MB-231腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍サイズがおよそ80 mg に達したとき（移植12日後）、動物（各群 9匹）にボリノスタット又は溶媒を投与した。 用量及び投与スケジュール：二つの実験を行った。第1の実験では、100% DMSO を溶媒として100 mg/kg のボリノスタットを1日1回腹腔内投与した。第2の実験では、 100% DMSO を溶媒として100又は25 mg/kg のボリノスタットを1日1回腹腔内投与した。対照群には、1 mL/kg の容量で溶媒（100% DMSO）を1日1回投与した。 陽性対照薬：パクリタキセルを陽性対照として用い、16 mg/kg を1日1回5日間腹腔内投与した。 試験方法：マウスの体重は、Day 1から週2回測定した。溶媒対照群及びボリノスタット群とも、Day 1から週2回ノギスで腫瘍サイズを計測し、対照群の平均腫瘍重 量が2 g に達した段階で試験を終了した。計測値は標準式（短径 2 ×長径）／2により腫瘍重量（mg）に変換した。ボリノスタット投与の忍容性は、体重と死亡率に基 づいて評価した。腫瘍増殖阻害率（TGI）= 100－（ボリノスタット投与群の平均腫瘍重量変化）／（対照群の平均腫瘍重量変化）×100と定義し、各投与群につい て TGI（%）を求めた。 結果：第1の実験では、100 mg/kg のボリノスタットを、スケジュール終了まで1日1回腹腔内投与した結果、最終の平均腫瘍重量は1020.9 ± 232 mg であった。陰性対 照群にはスケジュール終了まで毎日、溶媒を腹腔内投与した結果、最終の平均腫瘍重量は1878 ± 198 mg であった。よって、ボリノスタット群の TGI は41%であっ た。また1匹のマウスでは腫瘍が16.7%退縮した。体重は Day 6に-4.4%、Day 16に+2.1%の変化がみられた。ボリノスタット投与群に、薬物の毒性による死亡は認め られなかった。第2の実験では、25又は100 mg/kg のボリノスタットを1日1回、スケジュール終了まで腹腔内投与した。最終平均腫瘍重量は、25 mg/kg 群で2109.4 ± 355 mg、100 mg/kg 群で1880.5 ± 290 mg であった。陰性対照群には、試験終了まで毎日溶媒を腹腔内投与した結果、最終平均腫瘍重量は3163.5 ± 299 mg であった。よっ て、25及び100 mg/kg 群の TGI は、それぞれ34%及び41%であった。いずれの投与群でも、明らかな体重減少や薬物の毒性による死亡は認められなかった。 USA） 付記：試験実施者 2.6.3 薬理試験概要表 - 18 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.15 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.6: PD008] 試験番号：PD008（参考資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：ヒト大腸癌 HCT-116細胞の異種移植モデルにおける、ボリノスタット1日1回腹腔内投与の腫瘍増殖阻害効果を検討 試験系：雌ヌードマウス（nu/nu； より購入）に HCT-116細胞を皮下移植した。腫瘍サイズがおよそ70 mg に達したとき（移植10日後）、 ボリノスタットを各群8～9匹の動物に、また溶媒を1群9匹に腹腔内投与した。 用量及び投与スケジュール：100%DMSO を溶媒として、100又は25 mg/kg のボリノスタットを1日1回腹腔内投与した。対照群には、1 mL/kg の容量で溶媒（100%DMSO）を1日1回腹腔内投与した。 陽性対照薬：CPT-11を陽性対照として用い、100 mg/kg を週1回3週間（Days 1、8、15）腹腔内投与した。 試験方法：マウスの体重は、Day 1から週2回測定した。溶媒対照群及びボリノスタット投与群とも、Day 1から週2回ノギスで腫瘍サイズを計 測し、対照群の平均腫瘍重量が1 g に達した段階で試験を終了した。計測値は標準式（短径 2×長径）／2により腫瘍重量（mg）に変換した。ボ リノスタット投与の忍容性は、体重と死亡率に基づいて評価した。腫瘍増殖阻害率（TGI）= 100－（ボリノスタット投与群の平均腫瘍重量変 化）／（対照群の平均腫瘍重量変化）×100と定義し、各投与群について TGI（%）を求めた。 結果：ボリノスタットを25又は100 mg/kg の用量で1日1回、スケジュール終了まで腹腔内投与した。最終平均腫瘍重量は25 mg/kg 群で862.4 ± 113 mg、100 mg/kg 群で414.3 ± 89 mg であった。陰性対照群には試験終了まで毎日溶媒を腹腔内投与した結果、最終平均腫瘍重量は843.8 ± 105 mg であった。100 mg/kg 群の TGI は48.8%であり、同群のマウス1匹では腫瘍が23.2%退縮した。体重については、25 mg/kg 群では Day 8に-0.6%、 Day 25に-10.9%の変化を示し、100 mg/kg 群では Day 8に-6.3%及び Day 25に-16.7%の変化を示した。いずれの投与群でも、薬物の毒性による 死亡は認められなかった。 USA） 付記：試験実施者 2.6.3 薬理試験概要表 - 19 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.16 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスにおける腫瘍増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.4: PD005] 試験番号：PD005（参考資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：ヒト大腸癌 HCT-116細胞の異種移植モデルにおける、ボリノスタット腹腔内投与の腫瘍増殖阻害効果を検討 試験系：雌無胸腺ヌードマウス（ より購入）に HCT-116腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍サイズが62.5～144.0 mm3 のときに、動物（各群 10匹）にボリノスタット又は溶媒を投与した。 用量及び投与スケジュール：10%DMSO／45%PEG400／45%水を溶媒として、150又は100 mg/kg のボリノスタットを1日1回、あるいは5、15、 50、100、150 mg/kg のボリノスタットを1日3回、腹腔内投与した。対照群には、それぞれの投与スケジュールで溶媒を投与した。150 mg/kg の1日3回投与群は、毒性発現のため Day10にボリノスタット投与を中止したが、それ以外の群は Day21まで投与を継続した。 試験方法：溶媒対照群及びボリノスタット群とも、Day 22に試験を終了するまで週3回ノギスを用いて腫瘍サイズを計測した。ボリノスタット 投与の忍容性は、体重と死亡率に基づいて評価した。Day 22において、溶媒対照群に対するボリノスタット投与群の腫瘍体積中央値の減少率 を算出し、%腫瘍増殖阻害率（%TGI）とした。ボリノスタット群及び溶媒対照群における腫瘍体積中央値の差に関し Mann-Whitney の U 検定 を行い、有意性（p<0.05）又は高い有意性（p<0.01）を判定した。 結果：溶媒対照群は、いずれも Day 22の腫瘍体積中央値が約1,200 mm3 であった。1日1回21日間の投与スケジュールの場合、100 mg/kg 群の TGI は16%で有意差が認められなかったが、150 mg/kg 群の TGI は57%で高い有意性が認められた。150 mg/kg 群では死亡は認められず、平均 体重減少率は4%未満であった。1日3回の投与スケジュールでは、100及び150 mg/kg 群のそれぞれ1匹及び9匹が投与に関連して死亡した。した がって、1日3回21日間投与の場合100 mg/kg が最大耐量であった。100 mg/kg 群の TGI は53％で高い有意性が認められ、平均体重減少率は3% 未満であった。より低用量の1日3回投与群では、TGI に有意差は認められなかった。 USA） 付記：試験実施者 2.6.3 薬理試験概要表 - 20 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.17 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植ラットにおける腫瘍増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.3: PD003] 試験番号：PD003（参考資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：ヒト大腸癌 HCT-116細胞の異種移植ラットにおける、ボリノスタット持続静脈内投与又は腹腔内投与の腫瘍増殖阻害効果を検討 試験系：雌ヌードラット（ より購入）に HCT-116細胞を皮下移植した。腫瘍サイズが200～400 mm3に達した時点で、ボリノスタットを各群6 ～8匹に、また溶媒を1群6匹に投与した。 用量及び投与スケジュール：ボリノスタットの持続静脈内投与又は1日1回腹腔内急速投与を14日間行った。持続静脈内投与は、ボリノスタット用量 を25及び50 mg/kg/day、溶媒を2.8%ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（HPβCD）／水とし、2.5 mL/h の投与速度で行った。腹腔内投与は、 ボリノスタット用量を150 mg/kg、溶媒を10% DMSO／45% PEG400／45%水として行った。陰性対照群には、静脈内投与用溶媒を14日間持続静脈内 投与した。陽性対照群には、200 mg/kg のイリノテカンを週1回3週間腹腔内投与した。 陽性対照薬： 5%デキストロース／水に溶解したイリノテカン（200 mg/kg）を陽性対照として用いた。 試験方法：腫瘍サイズは週2回、ノギスによる長径及び短径の計測により算出した。ボリノスタット投与の忍容性は、体重と死亡率に基づいて評価 した。Day 15において、溶媒対照群に対するボリノスタット投与群の腫瘍体積中央値の減少率を算出し、%腫瘍増殖阻害率（%TGI）として効果を評 価した。ボリノスタット群及び溶媒対照群における腫瘍体積中央値の差に関し Mann-Whitney の U 検定により統計学的有意性を判定した。 結果：50 mg/kg/day のボリノスタットをヌードラットに14日間持続静脈内投与したところ、忍容性は良好で、移植したヒト大腸癌細胞 HCT-116に対 する TGI は77％を示し、高い有意性が認められた。25 mg/kg/day 群では、持続静脈内投与の効果は顕著に低下し、TGI は5%であった。150 mg/kg の ボリノスタットを1日1回腹腔内投与したところ、Day 12までに重度毒性が出現し、1匹の動物が死亡、他の動物では口渇及び嗜眠がみられた。死亡 動物の剖検では、腹腔内の腹水貯留及び肝臓の蒼白がみられた。 USA） 付記：試験実施者 2.6.3 薬理試験概要表 - 21 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.18 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植ラットにおける腫瘍増殖阻害 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.5: PD006] 試験番号：PD006（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：ヒト大腸癌 HCT-116細胞の異種移植ラットにおける、ボリノスタット持続静脈内投与の腫瘍増殖阻害効果を検討 試験系：雌ヌードラットに HCT-116細胞を皮下移植した。腫瘍サイズが200～400 mm3 に達した時点で、ボリノスタットを各群5匹に、また溶 媒を1群5匹に投与した。 用量及び投与スケジュール：ボリノスタットの投与は、50 mg/kg/day の24時間持続静脈内投与を7日間、50又は100 mg/kg/day の8時間持続静脈 内投与を14日間行った。対照群の投与は、溶媒2.8%HPβCD／水の24時間持続静脈内投与（投与速度2.5 mL/h）を7日間行った。各個体の体重に 合わせてボリノスタットの濃度を調整したが、1日の静脈内投与容量は個体あたり12 mL に統一した。皮下移植した HCT-116腫瘍が成長した段 階（腫瘍体積約344 mm3 ）を Day 1とし、各群5匹に投与を行った。 試験方法：腫瘍サイズは週2回、ノギスによる長径及び短径の計測により算出した。ボリノスタット投与の忍容性は、体重と死亡率に基づい て評価した。Day 7において、溶媒対照群に対するボリノスタット投与群の腫瘍体積中央値の減少率を算出し、%腫瘍増殖阻害率（%TGI）と して効果を評価した。ボリノスタット群及び溶媒対照群における腫瘍体積中央値の差に関し Mann-Whitney の U 検定により統計学的有意性を 判定した。 結果：50 mg/kg/day 群では、24時間持続静脈内投与の7日間投与、8時間持続静脈内投与の14日間投与のいずれでも、明らかな毒性は認められ なかった。Day 7における移植ヒト大腸癌細胞 HCT-116に対する TGI は、それぞれの投与スケジュールで59％及び64%であり、高度の有意性が 認められた。したがって、1日8時間及び24時間の静脈内投与は、同等の忍容性とほぼ同等の有効性を示した。100 mg/kg/day 群では、8時間の 持続静脈内投与により、Day 8までに40%の動物が死亡した。 USA） 付記：試験実施者 2.6.3 薬理試験概要表 - 22 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.19 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスに対するボリノスタット単回投与によるヒストン高アセチル化 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：HCT-116細胞異種移植マウスに対しボリノスタットを単回投与したときの、移植腫瘍におけるアセチル化ヒストンの蓄積を検討。 試験系：HCT-116細胞異種移植マウスモデルで樹立した移植腫瘍。 試験方法：5、15、50、100、150 mg/kg のボリノスタットを、HCT-116移植ヌードマウスに単回腹腔内投与した。ボリノスタット投与後0.5、1、 2、4、8、12時間に移植腫瘍を採取した。溶媒（10%DMSO／45%PEG400／45%水）対照群のマウスからも、同様に腫瘍を採取した。腫瘍組織 からコアヒストンを精製し、得られた標品について酵素免疫測定法（ELISA）により、総ヒストン H3及びアセチル化ヒストン H3レベルを解 析した。ボリノスタット投与及び腫瘍検体採取は で行い、ヒストン蛋白の単離及びヒストンアセ チル化の解析は Merck Research Laboratories で行った。 結果：ELISA の結果、移植腫瘍におけるアセチル化ヒストン H3の蓄積はボリノスタット用量に応じて増加した。ボリノスタット投与の8、12 時間後にはアセチル化ヒストン H3の蓄積はみられなかった。また、150 mg/kg 群では、アセチル化ヒストンの蓄積が投与後4時間まで有意に 持続した（ピークは投与後2時間）が、より低い用量群では、アセチル化ヒストンの蓄積は投与後1～2時間の持続（ピークレベルは投与後1時 間）に留まった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 23 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.20 ヒト大腸癌細胞株HCT-116異種移植マウスに対するボリノスタット単回投与によるヒストン高アセチル化 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vivo） 試験の種類：HCT-116細胞異種移植マウスに対し、ボリノスタットを単回投与したときのアセチル化ヒストン H3の蓄積に対する高用量のボリ ノスタットの影響及び血漿中／腫瘍組織内ボリノスタット濃度との関連性を検討。 試験系：HCT-116細胞異種移植マウスモデルで樹立した移植腫瘍。 用量及び投与スケジュール：二つの実験を行った。第1の実験では、10%DMSO／45%PEG400／45%水を溶媒として、30、100、300、600 mg/kg のボリノスタットを、HCT-116移植マウスモデルに単回腹腔内投与した。第2の実験では、10%DMSO／45%PEG400／45%水を溶媒として150 mg/kg のボリノスタットを、HCT-116移植マウスモデルに単回腹腔内投与した。 対照群：両実験とも、溶媒対照群を設定した。 試験方法：第1の実験では、移植腫瘍が平均450～550 mm3 に達した時点で、各群4匹のマウスに30、100、300、600 mg/kg のボリノスタットを 投与した。投与2時間後に採取した移植腫瘍からコアヒストンを精製し、総ヒストン H3に対するアセチル化ヒストン H3の相対レベルを ELISA により解析した。血漿中及び移植腫瘍中ボリノスタット濃度も測定した。第2の実験では、移植腫瘍が平均450～550 mm3 に達した時点で、各 群4匹のマウスに150 mg/kg のボリノスタットを投与し、1、2、4、7、18時間後に腫瘍を採取した。腫瘍からコアヒストンを精製し、総ヒスト ン H3に対するアセチル化ヒストン H3の相対レベルを ELISA により解析した。血漿中及び移植腫瘍中ボリノスタット濃度も測定した。 結果：ボリノスタット投与マウスより採取した HCT-116腫瘍では、アセチル化ヒストン H3の蓄積が認められた。これらの腫瘍では、ヒストン アセチル化のレベルは、血漿中及び移植腫瘍中ボリノスタットレベルと関連した。 2.6.3 薬理試験概要表 - 24 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.2.21 細胞内HAT活性に対するボリノスタットの効果 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.2: PD002] 試験番号：PD002（評価資料） 効力を裏付ける試験（in vitro） 試験の種類：細胞内ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）活性に対するボリノスタットの効果を検討。 試験系：HAT は、ヒト大腸癌細胞 HCT-116の核抽出画分から得た。酵素活性は、連続する3段階の共役系アッセイにより測定した。すなわち、 アセチル CoA からアセチル基がはずれ、遊離 CoA が生じる。遊離 CoA は NADH 産生に用いられる。そして、NADH とテトラゾリウム色素 の複合体形成により発色が生じ、その440 nm における吸光度を分光光度計で測定した。 試験方法：アッセイは96ウェルプレートを用い、ウェルあたり105 μL の反応液量で行った。ボリノスタット薬液（最終10 μM 及び50 μM）は、 10倍濃度の5% DMSO／アッセイバッファー溶液として調製した。陰性対照には DMSO を添加し、HCT-116の核抽出画分は添加しなかった（代 わりにアッセイバッファー添加）。陽性対照には、ボリノスタットの代わりに DMSO を添加した。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であっ た。各ウェル中、核抽出画分40 μL（陰性対照用ウェルにはアッセイバッファー添加）及びボリノスタット又は DMSO 5 μL を添加し、次いで アッセイバッファー中に HAT 基質 I 及び II、並びに Enzyme Mix を各5 μL を含む master mix 液60 μL を加えて、アッセイを行った。プレート を37°C で1時間インキュベートし、440 nm の吸光度を測定した。すべての計測値から陰性対照サンプルによるバックグラウンド平均値を引い た値を、バックグラウンドを差し引いた陽性対照平均値（100%活性）で除し、相対活性を得た。 結果：ボリノスタットは細胞内 HAT を活性化せず、わずかに活性を阻害（約10%）した。 2.6.3 薬理試験概要表 - 25 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.3 2.6.3.3.1 副次的薬理試験 ボリノスタットの特異性 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 副次的薬理試験（in vitro） 試験の種類：標準的な酵素活性測定法を用い、種々酵素の阻害に関するボリノスタットの特異性を評価。 試験系：種々の天然又は組換え酵素。 試験方法：ヒト及び他の動物種由来の酵素パネルを用いて、ボリノスタット（10 µM）の阻害活性を測定。 結果：ボリノスタットは、2種の組換え CYP 分子種（2C19、2D6）にのみ阻害活性を示した。他の酵素に対してはいずれも IC50 > 10 μM であ った。 付記：試験実施施設 Taiwan 2.6.3 薬理試験概要表 - 26 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.3.2 ボリノスタット及びその代謝物の活性評価 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.1.1: PD001] 試験番号：PD001（評価資料） 副次的薬理試験（in vitro） 試験の種類：マウス赤白血病（MEL）細胞の増殖及び HDAC1酵素活性に対するボリノスタット及びその主要代謝物の作用を in vitro で評価。 試験系： 細胞増殖アッセイ：ボリノスタット又はその代謝物の存在下で MEL 細胞を48時間培養し、Promega の Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay キッ トを用いて、これら化合物の細胞増殖に対する影響を検討した。 HDAC1アッセイ：HDAC1酵素を C 末端 FLAG タグの融合蛋白として HEK293F 細胞に安定発現させ、抗 FLAG 抗体レジンを用いるアフィニティクロマトグラフィ により精製した。精製 HDAC1酵素活性を、市販の HDAC 活性測定キット（BioMol Research Laboratories、Plymouth Meeting, PA）を用いて測定した。本アッセイは Fluor-de-Lys™基質／Developer システムを用いたものであり、試薬には蛍光基質の50 mM ストック溶液及び Developer 濃縮液が含まれる。Fluor-de-Lys 基質におけ る Lys 残基の脱アセチル化の定量は、Developer 液の添加後、蛍光強度（励起波長360nm、蛍光波長460nm）を測定することにより行った。 試験方法： 細胞増殖アッセイ：アッセイは Promega の手順書に従って行った。ボリノスタット又はその代謝物の存在下又は非存在下、96ウェルプレートで細胞を48時間培養 した後、MTS 試薬を培養ウェルに直接加えて2～3時間インキュベートし、490 nm の吸光度を測定した。 HDAC1アッセイ：アッセイは、96ウェルプレートを用い、ウェルあたり50 μL の反応液量で行った。アッセイバッファーは、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl 2 及び0.1 mg/mL BSA を含有する20 mM Hepes（pH 8）とした。HDAC1はアッセイバッファーで2.5 nM に調製した（反応液中の最終濃度は1 nM）。50 mM Fluor-de-Lys 基質液はアッセイバッファーで60 μM に調製した（反応液中の最終濃度は30 μM）。20倍 Developer 濃縮液はアッセイバッファーで1:167に希釈した。ボリノスタッ ト（Lot # ）は、10倍濃度の5% DMSO／アッセイバッファー溶液として2.5 nM～50 μM に調製した。DMSO＋基質を Developer 液添加の前に加えて陽性対 照とし、DMSO＋基質を Developer 液添加後に加えたものを陰性対照とした。反応液中の DMSO の最終濃度は0.5%であった。ボリノスタットの連続希釈液を固定 濃度の HDAC1酵素複合体とプレインキュベートした後、アセチル化リジン含有基質、次いで Developer を添加し、脱アセチル化による蛍光アッセイを行った。異 なる濃度のボリノスタットに対して得られた活性データを4パラメータのロジスティック方程式に当てはめ、IC 50 を算出した。 結果：ボリノスタットは HDAC1活性（IC 50 = 70 nM）及び MEL 細胞の増殖（IC 50 = 660 nM）を阻害した。ボリノスタットの主要代謝物は、MEL 細胞の増殖を阻害 せず（IC 50 > 20 μM）、また HDAC1活性を阻害しなかった（IC 50 > 10μM）。 2.6.3 薬理試験概要表 - 27 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.4 2.6.3.4.1 安全性薬理試験 hERG発現細胞における電気生理学的評価 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.3.1: TT 4720] 試験番号：TT # -4720（評価資料） 安全性薬理試験（in vitro） 試験の種類： hERG チャネルに対するボリノスタットの作用を検討。 試験系：CHO-K1細胞に異種発現させた hERG チャネル。 試験方法：標準的な whole-cell patch-clamp 法を用いて、CHO-K1細胞に安定発現させた hERG を介する電流を測定した。2種類の電圧クランプ法によ り hERG 電流を誘起させ、評価した。1）電圧ステップ法：保持電位（V h）-80 mV からテスト電位（V t）+20 mV まで1秒間の脱分極ステップで活性 化電流を誘導し、-50 mV までの2秒間の再分極ステップ間での不活性化過程のテール電流を測定した。hERG 電流は、膜電位の-50 mV への復帰に際 し観測される不活性化過程のピークテール電流として計測した。2）電圧ランプ法：心筋の活動電位を模したランプ電位［膜電位を V h = -80 mV から V t = +40 mV まで短時間（20 msec）電圧ステップをかけ、0.25 mV/msec の速さのランプ電位でマイナス方向に V h まで戻す］を、約0.5秒間適用した。 この電圧ランプ法により、生理学的に類似した膜電位及び時間における複合的なカリウム電流の特性を評価した。hERG 電流は、一連の3回のランプ 電位で生じた電流の平均値のピーク値として測定した。電圧ステップ法及び電圧ランプ法は、15秒間隔で適用した。hERG 電流の振幅は対照におい て安定した電流が確認できるまで、またボリノスタット添加後は定常的な影響が確認されるまでモニターした。hERG 電流に対するボリノスタット の効果は、個々の細胞ごとに溶媒対照の電流レベルを基準として、それに対する割合を算出し評価した。 結果：ボリノスタットは2種類の電圧クランプ法（電圧ステップ法及び電圧ランプ法）により生じる hERG 電流に対し、最高濃度300 µM に至るまで 影響を及ぼさなかった。本条件ではボリノスタットの溶解性に限界があり、300 μM を超える濃度では検討できなかった。別の in vitro 試験として、 I Kr チャネル蛋白質に対する結合をリガンド結合置換法で解析したが、ボリノスタットは1及び10 µM の濃度で結合活性を示さなかった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 28 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.4.2 経口投与によるラット呼吸機能試験 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.3.2: TT 5654] 試験番号：TT # -5654（評価資料） 安全性薬理試験（in vivo） 試験の種類：覚醒ラットにボリノスタットを単回投与したときの呼吸系に対する作用を検討。 試験系：雄 Sprague-Dawley 系ラット（66～69日齢、体重265～313 g、総計24匹）を使用。 用量：1.0%（w/v）CMC ナトリウム／0.5%（v/v）Tween80／脱イオン水を溶媒とし、20、50、150 mg/kg のボリノスタットをラット（各群6匹） に単回経口投与した。 対照：溶媒投与群（n=6）を対照とした。 試験方法：Buxco BioSystem XA Data Acquisition System を用いて、呼吸数、1回換気量、分時換気量、PenH（気道抵抗性の指標）を測定した。 個々のラットを、投与の約2時間前に全身プレチスモグラフ装置に収容し、投与前約2時間、投与後約6時間データを収集した。データは10分 間の平均値として収集した。比較のため、投与前の最終1時間に収集したデータは平均してベースライン値とし、投与後のデータは10分単位 の記録の平均値として出力した。各群内でデータをパラメータごとに要約し、すべての値を平均 ± 標準誤差で示した。 結果：いずれの群においても、各パラメータに投与に関連した影響は認められなかった。覚醒ラットの呼吸機能に対するボリノスタットの無 作用量は ≥ 150 mg/kg であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 29 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.4.3 経口投与によるラット機能観察総合評価（FOB）試験 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.3.3: TT 5655] 試験番号：TT # -5655（評価資料） 安全性薬理試験（in vivo） 試験の種類：覚醒ラットにボリノスタットを単回投与したときの中枢神経系（CNS）機能に対する作用を検討。 試験系：雄 Sprague-Dawley 系ラット（体重228～259 g、総計24匹）を使用。 用量：1.0%（w/v）CMC ナトリウム／0.5%（v/v）Tween80／脱イオン水を溶媒とし、20、50、150 mg/kg のボリノスタットをラット（各群6匹） に単回経口投与した。 対照：溶媒投与群（n=6）を対照とした。 試験方法：投与約30分後に、盲検下で、ラットに対する経口投与機能観察総合評価法（FOB）を実施した。試験中、約70 dB のホワイトノイ ズを発生させた。観察／検査項目は以下のとおり：ケージ内の活動性レベル及び一般状態観察；動物をケージから取り出す際の容易さ／困難 さ；ハンドリングによる流涙、流涎、立毛、眼瞼閉鎖、その他の一般状態観察；プラスティック壁に囲まれた平面に2分間置いたときの自発 運動、姿勢、歩行、痙攣の有無、常同行動の有無、立ち上がり回数、排便及び尿の回数、その他の一般状態観察。以下の刺激反応性について も検査した：ノイズ（クリック音）反応、接近反応、接触反応、ピンセットで尾をつねった際の痛覚反射、瞳孔反射、眼瞼反射、耳介反射、 平面及び空中での正向反射。さらに、以下の測定を実施した：前肢握力、後肢握力、体温、後肢開脚度、体重。 結果：いずれの群においても、投与に関連した神経行動学的な影響は認められなかった。覚醒ラットの中枢神経系機能及び一般状態に関する 無作用量は ≥ 150 mg/kg であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 30 - ボリノスタット カプセル剤 （皮膚 T 細胞性リンパ腫） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 2.6.3 薬理試験概要表 2.6.3.4.4 経口投与によるイヌ心血管系テレメトリ試験 被験物質：ボリノスタット CTD 記載箇所：[資料4.2.1.3.4: TT 5656] 試験番号：TT # -5656（評価資料） 安全性薬理試験（in vivo） 試験の種類：覚醒ビーグル犬にボリノスタットを単回投与したときの心血管系に対する作用を検討。 試験系：雌ビーグル犬（2年6ヵ月～2年8ヵ月齢、体重8.6～10.8 kg、総計4匹）を使用。投与3～4時間後に給餌。 用量：各用量単回投与の用量漸増デザイン。ボリノスタットは賦形剤との混合物製剤として供給された。この混合物は、ボリノスタットと臨 床製剤用の賦形剤（結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム）を2：1の割合で含有し、イヌを用いた毒 性試験でも用いられた。4匹のイヌそれぞれが、30、90及び240 mg/kg の混合物製剤（ボリノスタットとして20、60及び160 mg/kg）、並びにプ ラセボの単回経口投与を受けた。プラセボは、空のブタ由来硬ゼラチンカプセルを用いた。 対照：各動物におけるプラセボ投与時のデータを対照とした。 試験方法：生体電位測定用リード線を接続した Konigsberg のソリッドステート圧力トランスデューサーをあらかじめイヌに埋め込み、動脈圧 及び心電図を測定した。データはテレメトリ伝送により CA Recorder Systems で記録し、動脈圧、心拍数、PR 間隔、QRS 間隔及び QT 間隔を 測定した。QT 間隔はまた、Fridericia の補正式により心拍数で補正した値も算出した（QTc 間隔）。データは15分単位の平均値として、プラセ ボ投与動物については投与前24時間以上、投与後24時間以上収集し、30、90、240 mg/kg の各投与動物については投与前に2時間以上、投与後 は24時間以上収集した。最終的に、データは15分単位の平均 ± 標準誤差で表示した。 結果：90及び240 mg/kg（ボリノスタットとして60及び160 mg/kg）群で心拍数がそれぞれ24%及び25%増加した。また、両群で PR 間隔の短縮 （いずれも-9%）及び QT 間隔の短縮（それぞれ-5%及び-12%）が認められた。その他の投与に関連した心血管系への影響及び一般状態変化は 認められず、また QT/QTc 間隔の延長を示す変化も認められなかった。イヌの心血管系に対する無作用量は30 mg/kg（ボリノスタットとして 20 mg/kg）であった。 2.6.3 薬理試験概要表 - 31 -