3,4-DHBA (µg/ml)

梅の不妊治療成績改善効果と
その作用メカニズム
―梅成分3,4-DHBAは酸化ストレスを抑制し卵質を改善する―
発表者： 和歌山県立医科大学 機能性医薬食品探索講座
和歌山高等工業専門学校
うつのみやレディースクリニック
准教授 宇都宮 洋才
助教 河野 良平
准教授 奥野 祥治
院長 宇都宮 智子
平成２6年8月28日 和歌山県立医科大学
和歌山県に伝わる梅の言い伝え
我々はこれまで和歌山に伝わる梅の言い
伝えを、科学的に検証してきた。
これらの研究活動により、言い伝えは人々
の間で長い間の経験的に実証されてきたも
のであると確信した。
更に近年、新たな言い伝えも生じてきてお
り、これら新たな言い伝えも検証を進めてい
る。
これまでの梅の言い伝え
1.
制菌作用
2.
胃潰瘍
3.
動脈硬化
4.
糖尿病
5.
免疫系に対する影響と効果
6.
ガンに対する影響と効果
7.
骨粗鬆症予防効果
梅の言い伝えの変化
1.
制菌作用
2.
胃潰瘍
3.
動脈硬化
4.
糖尿病
5.
免疫系に対する影響と効果
6.
ガンに対する影響と効果
7.
骨粗鬆症予防効果
8.
鶏卵が美味しい
梅は難治性不妊患者の治療成績を改善する
～卵子老化の観点からの考察～
うつのみやレディースクリニック
宇都宮 智子
平成２６年８月２８日 記者発表
和歌山県立医科大学
卵子数は加齢とともに着実に減少する
閉経の５年前にはほぼ卵子は喪失している
64％
卵子数の変化
思春期30万個
３５歳：安全生殖限界
不
妊
率
（
％
）
30％
20代
15万個
15％
40歳
３万個
女性の生殖能力は２０代後半から低下し始め、
３０代後半になると加速度的に低下する
卵子のほとんどは
排卵されず
閉鎖卵胞になり
失われる
卵巣の構造
卵子を包み込み栄養する
エストラジオールを分泌する
卵胞顆粒膜細胞
成熟卵胞
卵子
30代前半正常卵巣
成熟卵胞
排卵後の出血黄体
40代後半卵巣
卵胞は失われている
一般不妊治療
人工授精
・タイミング療法
・人工授精
精子を子宮内に注入する方法
原理は自然妊娠とほぼ同じ
精子の洗浄濃縮
スイムアップ
生殖補助医療 ＡＲＴ（assisted reproductive technologies)
難治性不妊症に対する不妊治療
・体外受精―胚移植
・顕微授精
・凍結融解胚移植
体外受精ー胚移植（IVF-ET)
出生児の37人に１人は
IVF-ET, ICSIでの妊娠
重症男性不妊、重症受精障害に対する最終手段
生殖補助医療
242,017周期
生殖補助医療
約29000人/年
37人に1人が
ＡＲＴ児
総ＥＴあたりの妊娠率
流産率
総治療あたりの妊娠率
生産率
研究の背景
・晩婚化にともなう不妊率の上昇
１０組に１組から６組に１組の時代
・不妊治療患者の高齢化
・加齢にともなう卵巣の老化、卵子数の減少が無視できない
不妊治療の大きな障害になっている
卵子の老化は卵子の質の低下、染色体数の異常につながり
妊娠率の低下、流産率の上昇を引きおこす
卵子の老化は酸化ストレスによるところが大きいとされている
（卵子も錆びつく）
→抗酸化作用のある梅がヒト卵子にも有益ではないか？
対象・方法
以前から当院や他院でARTを施行し、良好胚の得られない
反復不成功例18例（３３歳～４３歳、平均年齢39.2歳）に対して、
ＤＨＥＡ（dehydroepiandrosterone）を50mg/dayでＡＲＴ周期の２
か月前から連日投与し、ＩＶＦまたはＩＣＳＩを施行した。
上記１8例のうちＤＨＥＡを服用後も妊娠に至らなかった症例
のうち同意の得られた9例に対し、ＤＨＥＡ 50mg/dayと脱塩濃
縮梅酢（梅：UMU®）12ml/dayをＡＲＴ周期前の２か月間服用さ
せ、ＩＶＦまたはＩＣＳＩを施行した。
何も服用しなかった周期とＤＨＥＡ服用周期、ＤＨＥＡと梅服用
周期、それぞれの採卵前ＨＣＧ投与日の血清estradiol (E2)値、
採卵数、受精率、妊娠率について検討した。
治療成績
①無添加周期
②DHEA周期
③DHEA/梅周期
症例数（例）
18
18
9
IVF周期（周期）
24
21
14
ICSI周期（周期）
5
6
3
妊娠周期/治療周期
治療周期あたり妊娠率
1/29
３．４％
7/27
２５．９％
5/17
２９．４％
（妊娠数/症例数）
症例あたり妊娠率
（１例/１8例）
５．６％
（７例/１8例）
３８．９％
（5例/9例）
５５．６％
個
pg/ml
10
4000
8
3000
6
2000
4
2
1000
0
0
無添加
DHEA
図1 採卵数の比較
100
80
無添加
DHEA梅
DHEA
DHEA梅
図2 血清estradiol 値の比較
％
p＜0.05
30
p＜0.05
60
20
40
10
20
0
0
DHEA
無添加
図3 受精率の比較
40 ％
DHEA梅
無添加
DHEA
DHEA梅
図4 治療周期あたりの妊娠率比較
無添加周期
ＤＨＥＡ梅周期
顆粒膜細胞の変性
採卵後1日目
受精卵の形成
受精せず
採卵後３日目
８細胞期胚の形成
無添加
顆粒膜細胞と
受精卵細胞質変性
ＤＨＥＡ
梅
採卵後
１日目
変性胚
採卵後
3日目
変性胚
採卵後
5日目
正常受精卵
８細胞期胚の形成
胚盤胞の形成
梅単独周期の臨床研究も進行中
１０症例：２９歳～４１歳（平均年齢 ３５．６歳）に対し
治療周期の２か月前から梅（梅：UMU®）12ml/dayを
投与の後、体外受精を施行
１０症例中６例が妊娠成立、４例が無事出産成功
結果・考察
・難治性不妊患者にDHEAと梅を投与することにより平均受精率、
妊娠率が有意に向上した。
・梅投与によりＤＨＥＡ単独投与で妊娠しなかった9症例中5症例に
妊娠が成立した。
・別の不妊患者集団でも梅単独で１０症例中６例に妊娠成立した。
難治性不妊患者に対して梅を投与することにより卵の質が改善
し不妊治療成績を改善させる可能性がある。
梅に含まれる不妊症に有効な活性成分を探索する
発表者： 和歌山県立医科大学 機能性医薬食品探索講座
和歌山高等工業専門学校
うつのみやレディースクリニック
准教授 宇都宮 洋才
助教 河野 良平
准教授 奥野 祥治
院長 宇都宮 智子
平成２6年8月28日 和歌山県立医科大学
目的：卵巣顆粒膜細胞（培養細胞）を使用し、
梅に含まれる不妊症に有効な活性成分を探索する
顆粒膜細胞（ヒト卵巣顆粒膜細胞：COV434)
卵の形成に重要な役割を果たす
酸化ストレス
加齢に伴い増加
顆粒膜細胞にダメージを与える
（アポトーシスを起こす）
酸化ストレスから顆粒膜細
胞を保護する効果を指標と
して梅から活性成分を探索
ウメ
卵
ウメ
抽出物
ウメの種から抽出
同定された梅活性成分の顆粒膜細胞
自身に及ぼす機能性評価
（エストラジオール分泌能の評価）
酸化ストレスによる細胞死に対する梅抽出物の保護効果を
指標として有効成分の探索を行った
梅種抽出物
[48.8 g]
Hexane
Dichloromethane
Ethyl acetate
[6.3 g]
[1.5 g]
[1.7 g]
Fr. 1
梅抽出物
Fr. 2
Fr. 3
Water
SiO2 column chromatography
Fr. 4
Fr. 5
酸化ストレス（過酸化水素）
細胞生存率測定
5 min
ヒト顆粒膜細胞（COV434)
培養細胞
18 hr
酸化ストレスを細胞に与え
ると細胞死が起きる
梅抽出物があるとどうか？
細胞死を抑制する物質をウメ種から単離・同定した
梅種抽出物
[48.8 g]
Hexane
Dichloromethane
[6.3 g]
[1.5 g]
Ethyl acetate*
[1.7 g]
Water
SiO2 column chromatography
Fr. 1
Fr. 2
Fr. 3*
Fr. 4
Fr. 5
[6.8 mg]
[12.5 mg]
[185 mg]
[143 mg]
[370 mg]
*活性画分
C18 column chromatography
Fr. 6
Fr. 7
[44 mg]
[17 mg]
*
Fr. 8
[2.4 mg]
Fr. 9
Fr. 10
Fr. 11
Fr. 12
Fr. 13
Fr. 14
[6.9 mg]
[9.0 mg]
[2.9 mg]
[2.4 mg]
[8.7 mg]
[90 mg]
Compound 1
酸化ストレス下における
細胞生存率
100
3,4-dihydroxybenzaldehyde
(3,4-DHBA)
酸化ストレス
80
60
40
20
0
0
5
25
3,4-DHBA (µg/ml)
50
梅から同定された梅成分3,4-DHBAを用いて、
酸化ストレスによる細胞死に対する効果を検討
酸化ストレス（過酸化水素）
酸化ストレスによって・・・
カスパーゼ活性上昇
顆粒膜細胞
DNA酸化損傷
アポトーシス（細胞死）
梅成分3,4-DHBA
酸化ストレス（過酸化水素）
5 min
ヒト顆粒膜細胞（COV434)
培養細胞
18 hr
カスパーゼ活性測定
DNA酸化損傷マーカー測定
アポトーシス細胞検出
梅成分3,4-DHBAはカスパーゼ3/7の活性化を抑制する
60000
生細胞数
カスパーゼ活性
50000
3000
40000
2000
30000
20000
1000
10000
0
0
0
酸化ストレス
（過酸化水素）
25
50
3,4-DHBA (µg/ml)
未処理
Control
カスパーゼ -3/-7
（相対発光強度）
生細胞
（相対蛍光強度）
4000
3,4-DHBAはDNA酸化損傷を抑制する
8-OHdG (% of control)
DNA損傷マーカー
400
未処理
0.5 mM 過酸化水素
300
酸化ストレス
*
200
*
*
100
0
未処理
Control
0
5
25
3,4-DHBA (µg/ml)
50
P<0.05
0.5 mM 過酸化水素
3,4-DHBAはアポトーシスを抑制する
3,4-DHBA 0
Green： Annexin V
: アポトーシス細胞
Red: PI
：死細胞
Blue: Hoechst33342
：核
50 µm
5
25
酸化ストレスなし
酸化ストレスあり
50 (µg/ml)
アポトーシスに典型的な細胞の萎縮、核の凝集を、
梅成分3,4-DHBAは抑制する
0.5 mM過酸化水素
0.5 mM 過酸化水素
+ 3,4-DHBA
bar = 20 m
bar = 20 m
3,4-DHBAのみ
未処理
10 μm
10 μm
梅成分3,4-DHBAは酸化ストレスから
顆粒膜細胞を保護する
顆粒膜細胞
卵の形成に重要
な役割を果たす
酸化ストレス
加齢に伴い増加
顆粒膜細胞にダメージを与える
（アポトーシスを起こす）
卵
梅成分3,4-DHBAは
酸化ストレスから顆粒膜細胞
を保護する
3,4DHBA
ウメ
ウメの種から抽出
他に機能性はないか？
梅成分3,4-DHBAのもう一つの機能性として
エストラジオール分泌と遺伝子発現に対する効果を検討
梅成分3,4-DHBA
細胞からエストラジオール
が分泌される
細胞から分泌されるエストラジ
オール量の測定
(化学発光免疫測定法）
18 hr
ヒト顆粒膜細胞（COV434)
培養細胞
ヒト顆粒膜細胞（COV434)
培養細胞
遺伝子発現解析
（リアルタイムPCR法）
培養液に3,4-DHBAを添加すると
エストラジオール分泌が促進される
エストラジオール分泌量
(相対値)
200
*
*
150
100
50
0
0
5
25
3,4-DHBA (µg/ml)
50
P<0.05
エストラジオール産生に関わるsteroidogenic factor 1（SF-1）
遺伝子のmRNA発現量は3,4-DHBA添加によって増加する
2.5
*
SF-1/GAPDH
2
1.5
*
1
0.5
0
0
25
3,4-DHBA (µg/ml)
50
P<0.05
考察：梅成分3,4-DHBAは酸化ストレスから顆粒膜細胞を保
護し、顆粒膜細胞をより活性化することで質の良い卵形成
に寄与する可能性がある
顆粒膜細胞
卵の形成に重要
な役割を果たす
酸化ストレス
加齢に伴い増加
顆粒膜細胞にダメージを与える
（アポトーシスを起こす）
梅成分3,4-DHBAは酸化スト
レスから顆粒膜細胞を保護
する
卵
3,4DHBA
ウメ
ウメの種から抽出
梅成分3,4-DHBAは顆粒膜細胞
を活性化する
梅に含まれる不妊症に有効な活性成分を探索する
発表者： 和歌山県立医科大学 機能性医薬食品探索講座
和歌山高等工業専門学校
うつのみやレディースクリニック
准教授 宇都宮 洋才
助教 河野 良平
准教授 奥野 祥治
院長 宇都宮 智子
平成２6年8月28日 和歌山県立医科大学
実験
• 有効成分の構造を質量分析装置付き高速液体クロ
マトグラフィー（LC/MS）および核磁気共鳴スペクトル
（NMR）により解析した。
39
活性成分の構造解析１
質量分析装置付き液体クロマトうラフィーによる分析
UV
BPC
分子量：１３７．０２５７
組成式：CH7HO
5O3
組成式：C
7 5 3
40
活性成分の構造解析２
核磁気共鳴スペクトル（NMR)による分析
3,4-dihydroxybenzaldehyde（3,4-DHBA)とは
3,4-dihydroxybenzaldehydeはプロトカテクアルデヒ
ドとも呼ばれ、抗酸化作用が強い、フェノール性ア
ルデヒドの一種
梅には香りの主成分としてベンズアルデヒドが含
まれるなど、多種類のフェノール性アルデヒドが含
まれている。
3,4-dihydroxybenzaldehyde
(3,4-DHBA)
3,4-DHBAには活性酸素種（ROS）が関与する疾患
に対して、その高い抗酸化力のため、医学的有効
性があると報告されている。
例えば、3,4-DHBAは、血小板由来増殖因子が発
生させるROSによる血管平滑筋細胞の増殖と遊走
を抑制する[1]。また、3,4-DHBAは抗炎症作用[2]、
酸性ストレスからの神経保護効果[3]、抗がん活性
[4]を持つと報告されている。
[1] Moon, et. al. (2012) Biochem. Biophys. Res. Commun. 423; 116–121.
[2] Chang, et. al. (2011) J. Nutr. Sci. Vitaminol. 57; 118–122.
[3] Gao, et. al. (2011) J. Pharmacol. Sci. 115; 36–44.
[4] Jeong, et. al.(2009) Phytomedicine, 16; 85–94.
実験
• 梅酢に含まれる3,4-DHBA量を高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC)で定量した。
サンプル調整
梅酢、脱塩梅酢：0.45μmのフィルターでろ過し、そのままHPLCへ
HPLC条件
カラム ：Shim-pack VP-ODS 4.6×150mm
移動相 ：0.1%ギ酸含有H2O(A):0.1％ギ酸含有MeOH(B)
A:B＝ 0- 3分 90：10、
3- 15分 90：10→60：40
15-20分 20：80
20-30分 90：10
検出(UV)：320nm
結果
定量結果は梅酢、脱塩梅酢の1ｍL中に含まれる3,4-DHBA量を求めた。
43
梅酢に含まれる3,4-DHBA量の分析
44
実験
3,4-DHBAをマウスに経口投与
投与5, 10, 20, 30, 60 分後に採血
血清中の3,4-DHBA量をHPLCにより定量
梅成分3,4-DHBAは経口摂取による血中への移行を確認
採血
経口摂取
分析
3,4-DHBA (mg/mL)
3,4-DHBA 血清中濃度
0.05
0.04
3,4-DHBA
0.03
0.02
5 min
0.01
0
0
20
40
60
摂取後経過時間（min）
10 min
20 min
梅の言い伝え
1.
制菌作用
2.
胃潰瘍
3.
動脈硬化
4.
糖尿病
5.
免疫系に対する影響と効果
6.
ガンに対する影響と効果
7.
骨粗鬆症予防効果
8.
受精率向上