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スタートアップマニュアル (Ver 3, 2016年2月更新)
® レジェノバ Regenova® スタートアップマニュアル Ver.3 2016.2月作成 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 1 ●2016年2月版 目次 事前準備 1. 準備する器具・・・・・・・・・・・・・・・・・・３ 2. 細胞塊（スフェロイド）作製・・・・・・・・・・・６ 3. ３Ｄデザインの作成・・・・・・・・・・・・・・・７ 4. 器具の滅菌・・・・・・・・・・・・・・・・・・・８ 積層 1. 立ち上げ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１１ 2. ソフトウェア立ち上げ・・・・・・・・・・・・・１３ 3. セットアップ・・・・・・・・・・・・・・・・・１４ 4. 設定・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・１６ 5. 積層・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２０ 6. 片づけ・洗浄・・・・・・・・・・・・・・・・・２５ 積層後 1. 培養・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２７ 2. 剣山抜去・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２８ ＦＡＱ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２９ アドバンス操作・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・３１ 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 2 ●2016年2月版 事前準備１：準備する器具 レジェノバ®を用いて３Dプリントを行う前に、以下のもの を準備します。 製品名 製品番号 定価（税抜） 付属数 剣山 9X9汎用 NA1001 ¥99,800- 2 剣山 9X9管腔構造用 NA1002 ¥99,800- 2 剣山 26X26 NA1003 ¥198,000- 2 剣山設置プレート 9X9剣山用 NB0104 ¥149,800- 1 剣山設置プレート 26X26剣山用 NB0105 ¥149,800- 1 剣山容器 NC0103 ¥49,800- 1 ノズル 25ゲージ、60本入り NZ0107 ¥24,800- ノズル 26ゲージ、60本入り NZ0102 ¥24,800- 5本 ノズル 27ゲージ、60本入り NZ0108 ¥24,800- 5本 吸気系一式 VS0101 ¥149,800- 1 捨て容器 WB0106 ¥14,800- 1 灌流培養器 タイプ１ PC1004 ¥39,800- 4連灌流培養器 PC1008 ¥149,800- 標準ゲルビーズ GB1009 ¥9,800- 1 96ウェルプレート 推奨：PrimeSurface®MS-9096U（住ベ） ローラーポンプ 流速4mL/min程度で流せるポンプ p25参照 PBS 滅菌、非滅菌両方 マイクロピペット 100μL、1mLがあると望ましい ピンセット P5参照 細胞、培地 P6、25参照 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 3 ●2016年2月版 事前準備１：準備する器具 作製する組織の形状に合った剣山をお選びください。 *グリッドプレートの2枚目を剣山から抜かないように！ 剣山 9X9 汎用 剣山 9X9管腔構造用 プリント可能サイズ: 3.5 x 3.5 x10mm NA1001 針数 81 本 ベース Na1002 針数 60 本 グリッドプレート（2枚） 外寸法 W 10 x D 20 x H 18 mm 針径 170 μm 針ピッチ 400 μm 材質 ステンレス、耐熱性樹脂 剣山 9X9管腔構造用は、 管腔内への培地の循 環のため、中心部通 して穴があります ２６Ｘ２６ プリント可能サイズ: 10.5 x 10.5 x 10 mm NA1003 針数 676 本 外寸法 W 20 x D 30 x H 18 mm 針径 170 μm 針ピッチ 400 μm 材質 ステンレス、耐熱性樹脂 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 4 ●2016年2月版 事前準備１：準備する器具 アクセサリは１セット、装置に付属しています。 プリント間の滅菌などによる時間のロスを減らすためにも、 もう１セットそろえて置くことをおすすめいたします。 吸気系一式 ノズル 通常のスフェロイドであれば、26ゲージ （内径0.23mm、NZ0102）をおすすめ めします。 内腔が詰まる可能性があるので、単回使 用をおすすめします。 剣山設置プレート VS0101 9X9剣山用 NB0104 26X26剣山用 NB0105 剣山容器 捨て容器 NC0103 WB0106 96ウェル 低接着プレート 剣山 26X26使用 PrimeSurface MS-9096UZ 時には、幅広のピン (住友ベークライト）をおす セットがあると便利 すめします。 です ピンセット類 先端の細いピン セットがあると 、剣山抜去の際 に便利です 4mm P26参照 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 5 ●2016年2月版 事前準備２：細胞塊（スフェロイド）作製 Step 1 : 細胞の準備 必要数の細胞を準備します。 培養細胞を用いる場合は、対数増殖期付近 の状態の良い細胞を用いることが推奨され ます。 Step 2 : ウェルプレートへ細胞播種 低吸着のU底96ウェルプレートに、数千～数万個/ウ ェル程度で細胞（一種類、もしくは複数種でも可能 ）を播種します。 Step 3 : スフェロイド形成 ウェルプレートをCO2インキュベーターに入れ、細胞を培 養します。48時間程度で細胞凝集し、スフェロイドが形成 されます。 細胞腫にもよりますが、積層可能なスフェロイドサイズは 直径450～600mm程度です※。 *細胞ごとに播種のコンディションが異なりますので、以下のようにお使いになる 細胞でサイズテストをしてください。 濃度(cells/mL) 細胞数／ウェル (cells/uL) 400,000 200,000 100,000 50,000 40,000 20,000 10,000 5,000 600um 500um 360um 280um 48時間後 直径 ※: 小さすぎるとスフェロイド同士が融合しにくい、大きすぎると積層時に細胞間で干渉の 可能性あり 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 6 ●2016年2月版 事前準備３：3Dデザインの作成 Step1: Bio 3D Designer(CADソフト）のインストール 本体に付属するソフトウェアを、お持ちのパソコンにインストー ルが可能です。事前トライアルをご要望の場合はお問合せくださ い。弊社から発行するパスワードを入力して立ち上げます。 Step2：立体構造をデザイン *使用方法は、B3Dソフトのマニュアルをご参照ください。 ① ② Step3:保存 *レジェノバ®へデータを読み込む際にはcsvファイルでの保 存が必要となります。 最初に試しやすいデザイン チューブ 9X9管腔構造用剣山を 用います。 プリント後は灌流培養 器（PC1004、または PC1008）を用いて内腔 にも培地を循環させる ことをおすすめします （p27参照）。 シート 9X9汎用の剣山を 用います。 培地への接触と、 プリントしやすさ から中間層を用い ることをおすすめ します。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 7 ●2016年2月版 事前準備４：器具の滅菌 使用する器具を、オートクレーブ滅菌します。滅菌条件は高 圧蒸気滅菌法の一般的な条件を使用（121度15分以上等） *吸気系一式 廃液容器* 剣山容器・フタ 剣山 シリコンチューブ* (長さ約33cm） ノズルアダプタ* 捨て容器 剣山設置プレート ノズル 滅菌前に、実体顕微鏡を用い て剣山にゴミや、先端に損傷 がないかなどを確認します。 もし針が曲がっている場合な どは新しい剣山を使用してく ださい。 剣山先端の損傷 ピンセットも一緒に滅菌しま す。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 8 ●2016年2月版 事前準備４：器具の滅菌 滅菌する際には、滅菌バッグ、もしくはアルミフォイ ルを用います. 剣山を剣山設置プレートにセット して剣山容器に入れます。 剣山容器にPBSを注ぎます。 （次ページ参照） 滅菌バッグ使用例 ノズルは滅菌前にノズルアダプタに 接続することもできます。 この際、チューブが折れ曲がらな いように注意してください！ ノズルと剣山は、予備を滅菌しておくことをおすすめします。 この際、剣山は、剣山内の抜気のためMilliQ中で滅菌してくだ さい。 アルミフォイルでフタを します。 9X9: 予備剣山は横に倒して 滅菌します。上向きにすると 滅菌中にグリッドプレートが 抜ける恐れがあります。 26X26: グリッドプレートと 針の抵抗が大きいので、上向 きに置いて滅菌して問題あり ません。 剣山を十分に覆う量のMilliQ を注いでください。 予備ノズルは、ビー カーなどにいれてア ルミフォイルでフタ をしてください。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 9 ●2016年2月版 事前準備４：器具の滅菌 剣山の滅菌 剣山内の抜気をするため、剣山はPBS中（予備剣山は MilliQ中）で滅菌することをおすすめします。空気が剣 山内に残っていると針先を認識するカメラの障害にな り、誤作動の要因になりえます。 1. 剣山を剣山設置プレートにしっかりと固定 し、剣山容器内に置きます。 2. 剣山設置プレートのジグが剣山のグリッドプ レートをしっかり押さえていることを確認しま す。 3. およそ50mLのPBSを注ぎます。右図にお いてA=Bになる程度です。 ピンセットをもちいて剣山設置プレートに剣 山がしっかり固定されていることを確認しま す。 4. PBS: about 50mL A: 8-10mm B: 8-10mm 剣山容器にフタをして、アルミフォイルで包 みます。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 10 ●2016年2月版 積層１：立ち上げ 操作電源 START 主電源 1: 2: 3: 4: 5: 起動 停止 警報停止 異常リセット 非常停止 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 11 ●2016年2月版 積層１：立ち上げ １ コンプレッサのタンクコックを閉鎖 します *タンク下部（赤矢印部）にあります ２ 主電源用ハンドルを回して主電源を 入れます 主電源用ハンドル ３ ＦＡＮ、ＦＬ（蛍光灯）のスイッチ を入れます *クリーンベンチ内右側にあります ４ 操作電源を入れます *この際警報が鳴ることがあります が、この場合はパソコン上で警報停 止してください。 操作電源 ５ パソコンの電源を入れます 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 12 ●2016年2月版 積層２：ソフトウェア立ち上げ Step１:Cell Accumuの起動 パソコンモニターのデスクトップのCell Accumuアイコンをダブルクリックして起動し ます *起動後異常状態になった場合には、異常解除 ボタン（赤矢印）を押します。 Step２:メンテナンスモード ① ② 運転補助ボタン（①）をクリックし、メンテ ナンスボタン（②）をピンクになるまで長押 しします。 すると、プリントロボットが動き、セットア ップしやすいようにスペースが得られます。 レジェノバ操作の基本ルール ・クリーンベンチのドアを下までおろさないと作動しません。 ・警報が鳴った場合は、警報停止ボタンを押し、異常解除をしてください。異常 解除すると、次の操作が可能になります。 ・Cell Accumu上の右横のタブボタンは、表示中のページのボタンが水色になり ます。 ・ Cell Accumu上、運転補助画面のボ タンは、アクティブになるとピンクにな ります。 ・ Cell Accumu上の一部重要なボタン 、起動、定位置復帰、モード変更、など 、は長押しが必要です。 ・モードを変える、クリーンベンチのド アを開ける等した後には、定位置復帰ボ タンを長押ししプリントロボットを定位 置に戻さないと次の動作ができません。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 13 ●2016年2月版 積層３：セットアップ プリントロボット ノズルアダプタ ホルダ 廃液容器設置位置 捨て容器 設置位置 吸気 チューブ 剣山容器 設置位置 Step ３：アルコールワイプで拭く ノズルアダプタホルダ、プリントロボット、剣 山容器設置台座などの周辺をアルコールワイプ で拭きます Step ４ : 捨て容器を設置 Step ５ : 吸気系一式のセットアップ 1 2 3 1. 廃液容器のフタとキャップ2種が閉まっているか確認します 2. 廃液容器を設置位置に置きます 3. 廃液容器に吸気チューブを取りつけ、軽く引っ張って抜けないこと を確認します 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 14 ●2016年2月版 積層３：セットアップ Step ５ : ノズル取り付け １ ２ 3 1. シリコンチューブをCCDカメラの配線の下を通します。 2. ノズルの先端を清潔に維持するよう注意しながら、ノズルを ノズルアダプタに取り付け、ホルダに設置します 3. 固定ネジを軽く締めます Step ６ : 剣山が入った剣山容器を設置 Step ７：ウェルプレートをマガジンに挿入 *温度に敏感な細胞の場合は、スフェロイド検査の直前にウェルプレート挿入、また検査 後積層まで時間がある場合は一旦マガジンから取り出すことをお薦めします。 ウェルプレートを挿入前に、プレート底からス フェロイドがウェル内で動くかどうかを確認し てください。P23参照 A B C A：排出マガジン B：供給１マガジン C：供給２マガジン Step ８：クリーンベンチのドアを最下部まで閉めます 定位置復帰ボタンを長押しし、プリントロボットを元の位置に戻します 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 15 ●2016年2月版 積層４：設定 ① Step１: 剣山の選択 「剣山選択」ボタン（①）を押 し、剣山選択の画面にします。 使用する剣山を選択し（②）、 適用ボタン（③）を押します。 ② ③ Step2: 剣山検査 「定位置復帰」ボタン（⑤）がピンク：アクティブであることを確認します。 「剣山検査」ボタン（⑥）を長押しします。「位置記憶」ボタン（④）でエリ アを選択し、針先を正しく認識できていることを確認します（右上写真）。緑 色の＋が針先の位置と一致していれば正しく認識されています。 正しく認識されない場合は、「剣山検査」ボタン上部にある高さ（-500～500 ㎛）、もしくはPBSの量を調整します。液量は事前準備4-3を参照。調整する 場合は無菌的に実施します。 Step3: 検査モード 「運転補助」ボタン（⑦）を押し、検 査実施の際には「検査モード」ボタン （⑧）を長押しし、検査モードにしま す。モードを変更した際には、必ず「 定位置復帰」ボタン（⑤）を長押しし ます。 ④ ⑤ 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 ⑦ ⑧ ⑥ 16 ●2016年2月版 積層４：設定 Step ４ : スフェロイド検査 ③ ② ④ ① Step 5 : Z方向ピッチの設定 初期設定ボタン（⑧）を押し、Step4で 検査したスフェロイドデータ等を用いて 、Z方向のピッチを設定します（⑤）。 総数計算（⑥）を押すと層数が計算され ます。その後適用（⑦）をおしてくださ い。 「検査モード」 （①）であることを確認 し（アクティブ時にはピンク色）、「 起動」ボタン（②）を長押しします。 ウェルプレートが動き、スフェロイド が検査されます。すべてのプレート検 査後に警報で完了がお知らせされます ので、警報停止し、異常解除してくだ さい（③） 検査結果が④に表示されますので、お よその直径（μｍ）と結果を確認してく ださい。検査が完了すると結果が消え てしまうので、結果を詳しく見たい場 合は途中で停止するか、D:CAD3¥Cell detectのファイルで確認ください。 ⑥ ⑤ ⑧ 種類にもよりますが、スフェロイド同士 が融合するのに十分な接触のため、平均 直径の0.7～0.8倍程度を目安に設定し ます。細胞種によって異なるため、積層 後にも確認して精度をあげていきます。 ⑦ ④ スフェロイド検査で得られた 直径と、顕微鏡で測定した直 径が異なる場合は、顕微鏡で 測定した値を優先してくださ い。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 17 ●2016年2月版 積層４：設定 Step 1 : 剣山マップ作成 ④ ③ ② Step 2 : 検査パラメータの設定 ④ ③ ② ① 「剣山マップ」ボタン（①）を押 し、剣山マップを作成、または３D データ（csv形式）を読み込み、適 用ボタン （②）を押します。 データの読み込みは、ファイル>読 ① み込み>剣山マップデータ（③ ） で可能です。 2種類のスフェロイドを用いる場合 は、④において、「標準」：層ご とに品種に関わらず、剣山の左上 から順番にプリント、「品種１先 行」「品種２先行」：同じ層であ れば品種１／品種２を先にプリン トが選択できます。 最上層を用いてプリントする場合 は、p32を参照ください。 レジェノバは、設定されたパラメー タに合うものをスフェロイドとして 認識し、ピックアップしています。 ピックアップ後、パラメータに合う ものが残ってないことを確認しピッ クアップの成否を認識しています。 「検査パラメータ」ボタン（①）を 押します。タブ（②）で「品種１」 「品種２」を選び、それぞれの画面 で検査パラメータを設定します。以 前のパラメータを読み込むことも可 能です（③）。「自動設定」（④） にチェックが入っていると、しきい 値（p19参照）は自動的に設定され ます。 有無確認タブ（②）で有無確認のパ ラメータも設定します。ピックアッ プの成否のためのパラメータとなの で、品種１と品種２の設定を包括す るような数値の設定をします。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 18 ●2016年2月版 積層４：設定 検査パラメータ しきい値：スフェロイドの境界線の捉え方を指し、範囲0~255（暗～明）で 設定します。しきい値よりも暗いエリアが対象範囲となります。通常 60~150で設定します。しっかり凝集していないスフェロイドは、高めの値 に設定することが必要です（下写真参照）。 中心からの距離（μm）：ウェルの中心とスフェロイドの重心との距離を指し 、入力値が認識の対象範囲となります。通常2,500-3,000で設定します。 直径（μm）：スフェロイドとして認識する直径の最小値と最大値です。スフ ェロイド検査で得られたデータを目安に設定ください。 真円度（％）：70程度が目安ですが、スフェロイド検査で得られたデータを 目安に設定ください。真円度を上げると、より正円に近いもののみをスフェ ロイドとして認識します。 円滑度（％）：70程度が目安ですが、スフェロイド検査で得られたデータを 目安に設定ください。 しきい値: 120 しきい値: 65 しきい値: 170 装置は緑の線に 囲まれた領域をス フェロイドとして認 識 Step ３ : 照明設定 「照明設定」ボタン（①）を押し、 下カメラ、上カメラの照明を調整し ます。 ① 上カメラ・リング照明の目安は以下 の通り 9X汎用剣山使用時：150-200程度 9X9管腔構造用剣山使用時：80程度 26X26剣山使用時： ・エリア５（中心）：150-200程度 ・他エリア：100-150程度 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 19 ●2016年2月版 積層５：積層 Step 1 : 積層モード 「運転補助」ボタン（①） を押し、「積層モード」（ ②）になっていることを確 認します。なっていない場 合は「積層モード」ボタン を長押しします。 ④ ⑤ モードを変更した場合は、 ③ ② 「定位置復帰」（③）をし ます。 ① Step 2 : スフェロイド刺し込み確認 スフェロイドがピックアップされて、針に刺しこまれているかを確認するため 、3Dプリントを始める前に、最上層を用いて、2-3個テストプリントを行い ます。 １．「剣山マップ」画面で、最上層にスフェロイドを2-3個プリントするよう 、間をあけてデザインします。この際、剣山の下側（右上写真）が、手前にな りますので、下側を使うと目視での確認が行いやすくなります。 ２．（他のデザインを残している場合には、最上層を選んで）「起動」を長押 しし、これらのスフェロイドをプリントします。 ３．「停止」を長押しし、「剣山検査（p16参照）」を長押しして差し込みを 確認します。 スフェロイドが刺しこまれていれば、右上写真のようにきれいにスフェロイド が見えます。 この際、刺し込み時にノズル先端から気泡がでないことを確認します。気泡が 確認された場合は吸気系の廃液容器の3か所のキャップが緩んでいないか確認 をしてください。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 20 ●2016年2月版 積層５：積層 Step ３ : 積層開始 「起動」ボタンを長押しすると、ノズル検査ののち、積層を開始します。 トラブルシューティング 1: ノズル検査をパスしない プリント前に、ノズル検査が自動的に行われ ます。ノズル検査でエラーが起きた場合、以 下の手順でパラメータを調整してください。 ② ⑥ 1. ノズルのパラメータを調整 「検査パラメータ（①）」を押し、「ノズル （②）」タブを選択し、以下の手順で調整し ます。 - - 直径の調整 -「画像取り込み（③）」のチェックを外 し、「実行④」を押します -「サイズ (⑤)」を表示されるノズルの 直径の数字をカバーするように調整する しきい値の調整 -「自動調整（⑥）」のチェックを外すと 、「しきい値」の数値がでてくるため、 値を10ずつ増やす -「実行（④）」を押し、“err=0”になる まで調整する ⑤ ① ③ ④ ２．ノズル検査をスキップ プリント中に培地がノズル先端に付着するなどしてノズル検査をパスできなくなるこ とがあります。この場合、「運転補助」画面にあるノズル検査の欄を「無し」に変更 することでノズル検査をスキップすることができます。ただし、ノズル先端に異常が ないことを確認する必要があるため、各プリント時、最初のノズル検査はスキップで きません。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 21 ●2016年2月版 積層５：積層 3. 新しいノズルに変える プリント中にノズルが詰まる、損傷した場合には、以下の手順で新しいノズルに取 り換えてください。 1. 2. 3. 4. 5. 6. プリントを停止し、「運転補助」画面の「収 納動作」ボタンを長押しし、ウェルプレート をマガジンに戻します。 フロントパネルを開け、警報を停止します。 コンタミを防ぐため、剣山容器にフタをしま す。 古いノズルを取り外し、新しいノズルを装着 します。 剣山容器のフタを外し、フロントパネルを閉 じます。 「定位置復帰」を長押しし、「起動」を長押 ししてプリントを再開します。 スフェロイドピックアップの確認方法 レジェノバは、スフェロイドをピックアップする前後の画像より、ピックアップできた かどうかを確認しています。すべてのパラメータが適合しているスフェロイドがピック アップできていない場合は、トラブルシューティング２をご参照ください。 ピックアップ前、適合しているパラメータは緑 で表示されます。 適合していない場合は赤、赤がある場合は ピックアップしません。 ピックアップ後、有無確認をし、スフェロイドが 残っていると、ピックアップに失敗したとレジェノ バは認識し、赤字で表示されます。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 22 ●2016年2月版 積層５：積層 トラブルシューティング２：スフェロイドをピックアップできない 同じウェルで2回ピックアップに失敗すると、捨て容器で詰 まりを解消するための動作を行い、警報がなります。警報を とめて再度起動すると、そのウェルはあきらめて次のウェル に進みます。しかし、ピックアップできないことが続く場合 は、以下の手順を試してください。 45◦ 1. ウェルプレートを叩いてスフェロイドをウェルの底から 剥がします。45度にプレートを傾けて、蛍光灯の下で、下 からウェル内のスフェロイドの動きを確認しながら叩きます 。この際、培地をこぼさないよう注意してください。 2. マイクロピペットを用いてウェル内を数回ピペッティン グします。 3. 吸引圧を変えます: p31参照 4. スフェロイド作製のプロトコールの見直しをお願いしま す。 トラブルシューティング３：スフェロイドが剣山に刺さっていない ピックアップには成功したが、剣山上にスフェロイドが刺さっている様子が見られ ない場合、以下のような可能性があります。 1. スフェロイドがノズルに吸引されてしまった：スフェロイドが小さい、柔らかい 、壊れやすい場合などに起こりやすい - 吸引圧を変えます: p31参照 - ノズルを内径が小さいもの、27Gなどに変更します 2. スフェロイド作製のプロトコールの見直しをお願いします よりきれいなスフェロイドの作製が、スムーズなプリントにつ ながりますので、よりプリントしやすいスフェロイド作製の検 討をお願いします。 スフェロイド作製で疑問がありましたら、サイフューズまでご 相談ください。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 23 ●2016年2月版 積層５：積層 トラブルシューティング４：プリントデータがリセットされた プリント途中にモード（積層モード⇔検査モード）を変更すると、プリントの記録がリ セットされ、最初に戻ります。プリント途中で、次のウェルプレートへ移行のタイミン グに、新しいプレートのスフェロイド検査のため検査モードに変えることがあります。 スフェロイドの種類が同じであれば、プレートごとにスフェロイド検査をする必要はあ りません。スフェロイド検査を行いたい場合は、プリントをした最後の層とポジション を①から記録しておき、検査後のプリント再開時には次の場所を指定してから「起動」 を押してください。 針番号、エリア番号は、以下のとおりです。 1 9 10 ① 72 81 エリア 2 9X9 エリア 3 9X8 エリア 1 9X9 エリア 4 9X9 エリア 7 8X9 エリア 9 8X8 Step 5 : プリントの完了 プリント完了時には、アラームがなり、画面にその旨メッセージがでます。 途中でプリントを停止した場合には、「運転補助」ページの「収納動作」ボタ ンでウェルプレートをマガジンに戻してください。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 24 ●2016年2月版 積層６：片づけ・洗浄 Step 1 : 積層した構造体の取り出し 剣山容器にシャーレなどでカバーをし、剣山容器 ごと積層した構造体をレジェノバ®から取り出し ます。実体顕微鏡で積層状態を確認し、適切な培 養環境に設置します（培養のページ参照）。観察 は、剣山容器に入ったまま上部から行い、また必 要に応じてPBSをいれたシャーレに移して横向き の観察を行います。この際、スフェロイドの隣接 状況を確認し、Z方向のピッチが適切であったか を確認します（右写真程度が適切）。 Step 2 : データ保存 Fileからデータを保存します。一括で保存したい場合は、File > 保存 > 実験 パラメータ >一括、を選択します。 スフェロイドの検査データは、検査データの下の「保存（①）」を押してく ださい。 剣山マップのデータは、File > 保 存 > 剣山マップデータ プリント中に撮影された写真は D:CAD3¥Image¥Autoに自動的に 保存されています。 ① Step ３ :初期設定に戻す 変更したすべてのパラメータや設定を初期設定に戻します。 Step ４ : パソコンの電源OFF Cell AccumuをFileから終了、GT softGOT1000をFileから終了、パソコ ンをシャットダウンします。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 25 ●2016年2月版 積層６：片づけ・洗浄 Step 5 : アクセサリ類の取り外し 吸気系システム、ノズル、捨て容器、ウェルプレートなどをレジェノバから 取り出します。 吸気系システムの白いチューブを抜く際には、銀色のリング部を左側に 押しながらチューブを引き抜きます。 Step ６ : 本体と周辺装置の電源オフ ＦＡＮ、ＦＬ（蛍光灯）のスイッチを切ります。こ のときＵＶはONにしないでください。 操作電源（①）を切ります。 *主電源は通常ONのままにします。 ① コンプレッサのタンクコックを適度に開け、水を抜 きます。 Step ６ : 洗浄 回収した器具類は、試験研究用中性洗剤を用いて洗浄し、次の積層に備えます 。ノズルは微細な構造をしているため、単回使用をおすすめいたします。 細胞を取り外した剣山は、実験用に複数回使用する場合、針先の状態を実体顕 微鏡で確認の上、超音波洗浄機で試験研究用中性洗剤を用いて10～15分程度 洗浄します。 *9X9剣山の場合は、グリッドプレート抜け防止のため、針を上に向けた状態 で置いて洗浄してください *26X26の場合は、ゴムなどでグリッドプレートの固定が必要となります *剣山設置プレートは超音波洗浄機にかけないでください。 X 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 26 ●2016年2月版 積層後１：培養 プリント後、スフェロイドが融合するまで剣山上で培養しま す。培養条件は、細胞や組織によって異なりますので、ご自 身の細胞、組織に合った培養条件を見つけてください。 培地：通常は、スフェロイド作製に用いた培地、もしくは組織を構成する細 胞の培地を混ぜて使います。 容器：細胞を数万個含むスフェロイドを複数使っていますので、培地への接 触が重要となります。従いまして、剣山が平置きできる平らな底面を持つ循 環培養用容器をおすすめします。 期間：通常、スフェロイドは4日程度で融合します。その間培地交換を行いま す。融合した後に、p28の方法で剣山を抜去します。 9X9剣山 管腔構造用を用いた場合は、灌流培養器（PC1004、PC1008）を 用いることで、以下の手順で構造体の内腔に培地の循環が可能です。 １．剣山を剣山ベースに置き、固定します（汎用タイプの剣山を使用する場 合は、容器内に平置きしてください。） ２．必要量の培地を注ぎます（PC1004は150mL程度、PC1008は50mL程度 ）。灌流培養器に付属しているチューブの外径に合うローラーポンプを準備 します。チューブと灌流培養器はつないだ状態でオートクレーブで滅菌して おきます。 3. 灌流培養器を37℃のインキュベータ内などに置いて、4mL/min程度 で循 環させます。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 27 ●2016年2月版 積層後２：剣山抜去 剣山上での培養が完了したら、剣山から構造体を抜去します。 Step 1 : 準備 ペトリディッシュに ＰＢＳを30mL程度入れ、剣 山を横に倒して置きます。 Step 2 : 剣山の抜去 剣山基部をピンセットでしっかりと押さえながら、2枚 あるグリッドプレートの1枚のみをピンセットでスライ ドさせ、構造体を取り外します。 注意：グリッドプレートが2枚外れると、再挿入はでき ませんので ご注意ください。 剣山を再使用する場合は、抜去時に抜いたグリッドプレート を以下の方法で再挿入します。繰り返しの使用により針が破 損している場合もありますので、再使用時には実体顕微鏡で 針に損傷がないことをよく確認してください。 下部プレートを 針上部に移動 上下プレート を合わせる 上下プレートを合わ せて最下部に挿入 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 28 ●2016年2月版 FAQ 準備 P1 P2 P3 P4 P5 まず、500μm程度の大きさのスフェロイドを作る適切な細胞数、期間などを決めるために サイズ検討を行うことをお薦めします。詳細は、スフェロイドの作製方法のTech Noteをご スフェロイドが大きすぎる、小さす 参照ください。 ぎる場合はどうしたらいいか。 1: スフェロイドが小さすぎる場合: 複数のスフェロイドをひとつのウェルにいれておくと、一つの 大きなスフェロイドになることもあります。 2: スフェロイドが大きすぎる場合：数日置いておくと、小さくなることもあります。 廃液容器のキャップは複数回使用後、締めても止まらなくなることがあります。しかしながら 吸気系システムの廃液容器の 容器の気密は保てる場合は使用できますので、機密が保てる適度なところで止めていただ キャップが閉まらない。 き、お使いください。 Cell Accumu起動後に、異常リセットを解除してください。解除後にもエラーが出る場合 には、Cell Accumuのみを再起動いただくか、装置もあわせて再起動いただくことでエラー 起動時にカメラにエラーがでる。 が解除されることがあります。それでも解除できなければ、サイフューズにご連絡ください。 Cell Accumu起動後に、異常リセットを解除してください。解除後にもエラーが出る場合 には、Cell Accumuのみを再起動いただくか、装置もあわせて再起動いただくことでエラー 起動時に圧エラーがでる。 が解除されることがあります。解除されない場合は、コンプレッサーのバルブが空いている可 能性があります。 選択している剣山の種類が実際使用している剣山と異なる場合に起きます。選択している 剣山検査時のアラーム後、異常 剣山を、使用している剣山にあわせてください。 リセットが使えない。 プリント S1 スフェロイド刺し込み時に気泡が みられる。 S2 起動のボタンを押したときのアラー ム後、異常リセットが使えない。 S3 定位置復帰ができない。 S4 停止できない S5 S6 S7 吸気系システムの接続、廃液容器のキャップの閉まりを確認してください。 剣山マップなしでは、異常リセットはできないので、剣山マップを作成してください。 定位置復帰ボタンは長押ししないと動きませんので、長押ししてください。 運転補助ページの運転準備ボタンがピンクにならないと定位置復帰ができませんので、運 転準備ボタンがピンクになるまで待ってください（5秒程度）。 ウェルプレートがプリントステージにある場合に定位置復帰ができないので、収納動作ボタン か手でウェルプレートをマガジンに戻してください。 「停止」はすぐに止まらず、装置にとって区切りのいいところで止まります。緊急に停めたい場 合は、「非常停止」を押してください。 1. 初期設定ページでデモモードにチェックが入っていないか確認し、チェックが入っている場 スフェロイドをピックアップしている 合はチェックを外してください。 のに、プリントができていない 2. p23のトラブルシューティング３を参照ください。 ノズルが針にあたり、針が損傷した可能性がありますので、プリントを停止して、実体顕微 差し込み後、針の先端の光り方 鏡で針の状態をかくにんしてください。 が変わった マニュアルモードになっていますので、運転補助画面の積層方法で、「オート」に変更をしてく 剣山先端をクリックして指定してく ださい。マニュアルモードの詳細はp32を参照ください。 ださい、とメッセージがでた 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 29 ●2016年2月版 FAQ すべての問題を解決した後、ウェルプレートをプリントステージからマガジンに戻し、非 非常停止で止めた後に、 常停止ボタンを右に回転させてロック解除します。 S10 再開できない。 そして定位置復帰をすると、次の操作ができるようになります。 警報停止します。 プリント中にフロントパネ S11 収納動作ボタンが使えないため、ウェルプレートを手でマガジンに戻してください。 ルを開けてしまった。 そして定位置復帰をすると、次の操作ができるようになります。 刺し込み後、ノズル先端取り除きたい場合は、ピペットやピンセットで取り除きます。 S12 に気泡がついてしまった。 プリントが継続できている場合は、そのまま継続しても問題ありません。 ただちに非常停止ボタンを押してください。 可能性としては、以下が考えられます。 間違った針に刺し込ん - 剣山に気泡があり、カメラが誤認識した：ピペットで気泡を丁寧に取り除いてくださ S13 い。 だ！ - 剣山にスフェロイドの破片が付着した; スフェロイドは3Dプリントに適した状態では ないようなので、再度スフェロイド作製の検討をお願いします。 可能性としては、以下が考えられます。 1. PBSが蒸発しフォーカスがずれた可能性があるので、1-2 mLのPBSを注いでくだ さい。 3Dプリント中にカメラ画 2. カメラが針の影を認識している可能性がありますので、照明設定で調整してくださ S14 像の剣山のピントが悪く い。ライトの設定値を上げると、認識が良くなることが多いです。 なった 3. 最左上の針の使用を避けます。この針は基準針として使われているため、この針 の認識がずれると大きくずれることになります。使用せずにプリントできるデザインであれ ば、避けることをおすすめします。 他 使用フィルター：HEPA Filter, 99.97% to capture 0.3μm particles O1 清浄度レベルは？ 清浄度: ISO Class 5 (ISO 14644-1) (Federal Standard 209E Class100) 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 30 ●2016年2月版 アドバンス操作 アドバンス操作1: 吸引圧の調整 吸引圧を調整するためのコントローラーが、マ ガジンの後方にありますので、コントローラー のディスプレイを見るために鏡を用います。 ロック解除: 装置を立ち上げた最初の調整でのみ必要となり ます。 • • ▽ キーを、ディスプレイの「Loc」が点滅 するまで長押しします SETキーを押すとロック解除され、ディス プレイが「unL」となります 吸引圧の変更: 4つの圧 “P_1”から“P_4”が設定できるように なっています。 • • SETキーを再度押し、ディスプレイをP_1 にします。 ▽キーと△キーを押し、圧を変えます。こ れで圧は変更されました。 確認: • SETキーをディスプレイ表示が “NoP”にな るまで押すと、設定されている圧が確認で きます。 レジェノバの標準的な吸引圧は-4 mmHgです 。弱めたい際には、-1 mmHgまで、強めたい 際には-6 mmHgまで変えることが可能です。 スフェロイドがピックアップされないとき、ス フェロイドがノズルに吸い込まれてしまうとき に、有用です。 プリントが終わったら-4 mmHgに戻してください。 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 31 ●2016年2月版 アドバンス操作 アドバンス操作2:マニュアルモード 通常レジェノバは、自動でデザインさ れた針に刺し込んでいきますが、毎回 刺し込み先の針を指定することも可能 です。 1. 2. 3. 運転補助ページの積層方法を「マ ニュアル（①）」に変更します。 スフェロイドがピックアップされ た後、画面に位置指定のメッセー ジがでます。「設定（②）」をお して、剣山の写真上で刺しこみた い剣山の先端を指定してください （クリックする）。再度「設定」 をおし、「適用（③）」を押すと 刺しこまれます。 全てのスフェロイドで本動作を繰 り返します。 ① ② ③ 本操作は、以下のような場合に有用です。 ・プリント中に刺しこみに失敗し、その部分を埋めたい ・スフェロイドの破片が針の先端にあり、カメラが針の先端の認識ができない ・気泡や異物が剣山内にあり、針の先端の認識に影響を及ぼしている ・最上層にプリント時、スフェロイドの陰影が強くなり、針先を正しく認識でき ていない ・プリント中に針の位置が変わっている：例、スフェロイドが大きくて針の先端 が少しずつ外にずれていく、など 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 32 ●2016年2月版 株式会社サイフューズ 本社：東京都文京区本郷 2-27-17 ICNビル5A TEL：03-4455-7872 E-mail：[email protected] URL：http://www.cyfusebio.com ●このマニュアルは予告なく変更されることがあります。 33 ●2016年2月版