質量分析法によるラット脳内アミノ酸とカテコールアミンの同時分析

質量分析法によるラット脳内ペプチドならびにカテコールアミンの定量と
Diethylstilbestrol投与による下垂体への影響
○前⽥尚之1,2、⽥中絵美1、桝 加奈恵1、池⽥有希2、奥村加奈⼦２、宮庄 拓２、⽣野聡⼦2、横⽥ 博2
1 ⼀般社団法⼈⾷⾁科学技術研究所 ・ 2 酪農学園⼤学獣医学部獣医⽣化学
⽬的
・脳内ペプチドは神経活動を反映する。そこで、カテコールアミンとアミノ酸⼀⻫分析法を開発した。
・Diethylstilbestrol（DES）投与した成雄ラット脳内ペプチドである⾎管作動性腸管ペプチド
Vasoactive Intestinal Peptide（VIP）とカテコールアミンの変動を測定した。
VIP測定
カテコールアミンとアミノ酸の同時分析
標準試薬Vasoactive intestinal peptide（VIP）をTrypsin消化後、
EASY-nLC-captive spray–micrOTOF-QII Bruker Daltonics)
で測定。得られたスペクトラムをたんぱく質データベースMascotで検索
The separation was achieved using an Intrada Amino Acid
(100 x 3 mm 3-μm particle size, Imtakt)
(A)CH3CN / THF / 25mM HCOONH4 / HCOOH=10 / 80 /10 / 0.4
(B)CH3CN/100mM HCOONH4 = 20/80
0 %B (0-1 min)
0-17 %B (1-6.5 min)
100 %B (6.5-10 min)
100 %B hold (10-18 min)
400 μL/min flow rate at 35 C.
5 μL injection
Arginine(Arg)
Lysine(Lys)
Histidine (His)
γ-aminobutyric acid d4 (GABA d4)
Aminobutyric acid (GABA)
Dopamine d4 (DP d4)
Dopamine (DP)
Cystine (Cys)2
Epinephrine (EPN)
Serotonin (5-HT)
Serotonin d4 (5-HT d4)
L-column micro (C18 0.07 5x 150 mm, 3-μm particle size,CERI),
and the trapping column was 0.3 × 5 mm, 5-μm particle size. Flow
rate of 300 nL/min. All results were stored and further analyzed
using Data analysis 4.0 and biotools 3.2 software.
Asparagine (Asn)
Serine (Ser)
Glycine (Gly)
Glutamine (Gln)
Norepinephrine (NEPN)
Alanine(Ala)
MS/MSで得られたフラグメント情報から四重極型MSを設定する。（MRM法)
Threonine (Thr)
Aspartic acid (Asp)
Proline (Pro)
Glutamic acid (Glul)
標準添加法による定量
Valine(Val)
Methionine(Met)
Isoleucine (Ile)
Leucine (Leu)
添加サンプルと同量の最終溶媒
同量のVIP 5uMSTD
同量のVIP 10uM STD
Dioxyphenylalanine (L-DOPA)
Tyrosine (Tyr)
Phenylalanine (Phe)
Quantify Compound Summary Report
5-Hydroxytryptophan (5-HTP)
Printed Thu Apr 02 11:30:09 2009
90
抽出したサンプル
0
1
2
3
4
Tryptophan (Trp)
5-hydroxyindoleacetic acid （5-HIAA)
Compound 1: MRT
%
Sample Text
Std. Con RT
MRT std 50ppb
50
MRT 10279
0
MRT 10279 50ppb
50
MRT 10279 100ppb
100
5uM
面積値
9.13
8.84
9.13
9.13
Trace
221.1 > 111
221.1 > 111
221.1 > 111
221.1 > 111
Area
15202.66
3869.563
11436.42
18917.36
S/N
1º Trace
1º Area
3956.048 221.1>123.15 16729.84
309.746 221.1>123.15 4355.058
1453.256 221.1>123.15 12092.86
2727.595 221.1>123.15 20723.88
10uM
1º S/N
376
400
1847
3350
25000
Amino acid 100nmol/ml
Catecholamine 1μmol/ml
Melatonin
-10
-0.00
Tim e
2.00
4.00
6.00
Dopamine
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
Serotonin
20000
１２時間後に少し増加したが、
２４時間後には正常に戻っていた。
15000
10000
y = 150.48x + 3883.9
2
R =1
5000
0
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
-5000
MRM測定に⽤いたAcquity UPLC H-class
-Xevo TQD (Waters)
Column; cadenza-CD-C18 50 x2 mm 3um
VIP 100 nmoles/g typsin消化物
MRM測定
713>1288
HSDAVFTDNYTR
713>1015
HSDAVFTDNYTR
713>916
HSDAVFTDNYTR
713>553
HSDAVFTDNYTR
Ｘ値の絶対値を定量値とする。
VIP
DES投与による下垂体のドーパミン量に変化は⾒られなかった。
同様に調査したエピネフリンやノルエプネフリン、アミノ酸
（20種類、GABAなど）に変化は⾒られなかった。
⼤脳のセロトニン量はDES投与後24時間で有意に増加した。
下垂体のVIP量はDES投与後１２時間で
減少した後、24時間で有意に増加していた。
Prolactin
雄ラット下垂体のプロラクチンが
DES投与24時間後に誘導されていた。
Testosterone
精巣のテストステロンは投与後24時間
で変化が⾒られなかった。
まとめ
脳内VIP、カテコールアミンを簡便に測定できた。脳内神経伝達物質やペプチドを正確に測定すること
により、DES投与24時間後のプロラクチン誘導は、セロトニン誘導によるVIP上昇に起因する事が判
明した。 DESによるセロトニン増加メカニズム解明が今後の興味ある課題である。