Comments
Description
Transcript
Title 癌化肥満細胞のプロスタグランジンI[2]
Title
Author(s)
Citation
Issue Date
URL
癌化肥満細胞のプロスタグランジンI[2]とE受容体に関す
る研究( Dissertation_全文 )
橋本, 均
Kyoto University (京都大学)
1993-05-24
https://doi.org/10.11501/3092161
Right
Type
Textversion
Thesis or Dissertation
author
Kyoto University
ω
山
化
J
)
巴j
的細月包のフロスタクゃランジン 1
2
とE受谷体に関する研究
1993
橋 本 均
目 次
緒
言
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・....................
1
略
語
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
4
第 1章
癌化肥満細胞の PGI
2受容体の同定とその情報伝達系の解析
実験結果
••.•••••••••••••••.••.•.•.••.•••.•••••••.••••.••.•.••..•.•
6
PGI2の受作体結合反応、と促進性G蛋白 (
G
s
)を介する
第1
節
アデニル般シクラーゼ活性化の解析
第 2節
・・・・・・・・・・・・・・・・・・
光親不n
1
"
L
L'~ (
&j~ による PGI 2 受存体の同定
第3
日
!
I PGI2受容体反応の多掠グ:
1
・・・・・・・・・・
・・・・・・...
.
.
.
.
一
一
一
.
.
.
.
.
.
.
.
7
15
25
考察...........
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. 31
結 論
第 2章
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
..
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. 38
癌化肥満細胞の PGE
受容体刺激に対する脱感作の解析
実験結果
. ・ ・・・・.............................................
39
.•.••• ・
考察............
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. 46
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
49
実験の部
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
50
謝
・・・・・・・・・・・・・.....................................................
57
・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・
58
結
論
辞
引用文献
緒
E
プロスタグランジン (PG)は、炭素数2
0
1
開のアラキドン椴などの不飽和脂肪
般から生成する、微{止で強い楽理・生理活性をイiする 一群の脂肪酸の総称、
で、特徴のあるシクロペンテン構造あるいはトロンパン構造を分子内に布す
る 保体内ではアラキドン般に由来する PGが以-も多く産生されている
その
応性彼棋が最近 Iy~ らかにされている。すなわち、細胞が種々の細胞外刺激を
受作体で受けると、うえ・符休と共役する機構でホスホリバーゼ A2、あるいはホ
スホリバーゼ Cとアシルグリセロールリバーゼが的性化し、細胞膜リン脂質
のアラキドン酸を切り 1"し、アラキドン酸はまずシクロオキシゲナーゼによ
り阪本分 fの添加反応を受け、次いで各種イソメラーゼ作用により、 PGI
2、
PGE
，PGF
λ A2なと、構造の任かに y
(なる PGが多種頬 '
t
J
&され
2
α 、T
2、PGD2
る 15
) 生成した PG は ~~III 1.泡外に政
wされ、!'lじもしくは川辺の細胞に作川し
てその機能を調節する 68
)
。その￨際、大部分の PGの質的 ・世的情報は、車1
1
1胞
J~~ にある受容体に認識され、受容体 /G 蛋 (1/ エフェクター分子、 三 -t;.から
なる↑/
j報伝達系を刺激し、その結果細胞内にセカンドメッセンジャーを生成
mにより細胞代謝が制節される 9)。この PG受
する。セカンドメッセンジャー作
千五体/間報伝述系の研究は、 PGが化学的に不宏之なため 10)、 PGアンタゴニ
ストがはとんど￨泊先されていないため、 PG受待外の (
l
;
・が少なく不安定で州製
がl
村銚なため 11.12)、などの.E
H
山で多くの未解決の 1
1
1
J泌が残されている。
ところで、最近、 TxA213)受谷体がヒト H
I
l
小依よりあ1
2
4され 14)、ヒト胎盤、
i
ミ核牙球細胞の受容体 i
t
i
イム{-の cDNAがクローニングされ、遺伝子cDNAから
の受符体一次構造が決之された 15)。次いで、 TXA2受容体の cDNA塩基配列を
必にしたホモロジースクリーニングにより、マウス J
l
r
I
i
の TXA2
受料体の cDN八
作体の 4
i
t
j
i
iと機能、.t，'jt
f
H
去i
主系、持続的な PG)t蕗に対する細胞の受容体反応、
カf クローニングされた 16)。さらにその自己列を)~(こ、マウス州イtJJ巴渦調lIJ抱から
を介する辿応羽象である脱感作機構を研究することが1[(裂である
PGE2
受容体のサプタイプの・つ、 E
P3受容体の cDNA
がクローニングされ、
ギ'
i
者 は 、 マ ウ ス 掛 化 肥 満 細 胞P
8
1
5
細胞が、 PGI
受符体を多 J
止に合
2とPGE
その受符体の・次構造がI
Y
jらかにされた 1
7
)
。 し か し 、 こ れ ら 以 外 の PG受 存
することに J
i
・
1
.
1
し
て2
5
2
9
)、PGI2
イf
受容体の情報伝達系、 PGI受存体の向定と
むについては依然不明j
である。
体 の 椛j
PGE2受谷体の J
5
l
U
岳f
Fについて研究を行ない、その研究内容をつぎの 2t
1
;に分
血管内皮細胞でアラキドン般
PGI
2はプロスタサイクリンとも呼ばれ、主に i
2
けて:己 '~oc した 。
から生成する強い 'I~ J11日 lwh を示す PG で 18)、血l 小板凝 ~~Iltl'. 作川 19) や tfllW 干
作J
治的j
d
也級作川 20)をイfし、その効-*が TXA
M
A
:することかられ:1
1され
I
j
に}
2
t
C
lt
J
Eでは、まず4
¥
¥
/
;化肥満細胞における PGI
受容体の↑J
j械伝述系を解析し、
2
ている。 しか 1 、 PCì (2 の叉・作休 fi)f究は、人然の PGI 2 が t(IL 法'1 1 1':.~，~JUj が約的j
促 進f
'
I
(
G
s
)('カップルし、アデニル椴シクラーゼを mt
'
I
:
G1
:
I
il
l:化する PGI
と不安定なこと、 ')t r~休の飢餓発現;誌が少ないこと、アンタゴニストが1)11 発
7
2
9
) 次にこの PGI2
・
イEを1
9
Jらかにした 2
持民的な受料体のイ{
受存体にあjす る 光
されていないこと、などのJl
H
1
1
1から他の PGに比しても溢れていた。hl:近、
i
'it化介物知)を 1
l
J
M
l
l1
"
1
:t;'~ p
先し、 P
I
I
J定し、分子 ;
1
.
3
2
)
Jを封(A::した 3
m
GI2受谷体を [
P
G
I
.
:の安定 J将休がいくつか令成され、その放射能際政体も使川が l
i
I能とな
さらに、 PGI2
)
叉・容体がJ
巴;
t
I
J
t
l
l
l胞の俊能をどのように別節するのかをゆ]らかに
り
、 PGI2
受存体の研究が .
I
J能となった。
するため、
、
とこんで、 p(ì受存体の研究は、'1::命科学の攻要以題である II~物の.t，'J秘ü~i主
系 の 解I
Y
Jに
'
{
.
f1jするどけではなく、 PGを医祭 t
f
l
』として開発する応川研究にお
2に
3
)およびAT
P
3
4)
+勤 Hに する、
2
トロンピン 3
による剥!IJ
泡内 Ca
M
PGI2
5
)
I
受容体主J
散による W
J
I
Jについておべた 3
7
;
をで{よ、 PGE1
知2
の受符体刺激、こ対する細胞の脱感作機仇に!到して解析し
効な法伐知凡となるものである。すなわち、収イ:
1い く つ か の PG21
.
2
2
)
いてイf
た。的化 }J l'.l ìt~1*1II胞は PGF ，刺散による細胞内 cAMP応Jt に|対して、顕治:な脱 1i長
お よ び そ の 誘 叫 体2
3
.
2
.
l
)が l
去来品として使川されており、今後、益々 PG:
M
i
を
6
)。脱感作 胞では、 PGE
作を起こすことを仰伐しその機構を解析した3
1と
*
1
1
1
l
l
u
l
l売が行なわれることは明らかである。この PG知の￨伝説:
I
U
1
際的として以来 d
叉:W~ がみコとな校合体を形成した状態でイ子在することを
J
I
fJ発の 1
1
1
J題点は、 PGが'1:休のどの組織でも政'1:され、 I
l
Ij
じタイプの PGでも
併;を
組織により、あるいは純X~ ・ゲUL
，
介
イ
'
:
I
f'
m なGT
P*
i
l1
1
¥されたことから、複合体の形状として PGE1
1
'
iが検 1
受容体
年齢差などの述いにより似J 民が y~ なり、
時に.-f
l
l
l
比する幼栄を I
J
ミすことがef，るという複雑な作川をぷわすという .
.
'
J
i
↑
J
jに
よる 。 そのため、合成されるアゴニスト、アンタゴニストの作JIjは、組織等
ì~IS 分料製した。その結果、部分村製した佐合体'1'に、分
6
0kDaの 新
r ，::
G
'
I
P
結介i
fd
'
I
1
'
I
(
6
0kDa)を封'
l
察し、これが細胞の脱感作に機能することを
6
)
示唆した 3
において ~IIイIIJ に府民:tt を if6 くできるかということであり、そのためにはPG受
-2-
>L いだし、この校合
-3
由
5m
略
PG
p
r
o
s
t
a
g
l
a
n
d
i
n
PT
p
c
r
t
u
s
s
i
st
o
x
i
n(百日咳毒素)
PGI
2
p
r
o
s
l
a
g
l
a
n
c
l
i
n12 • p
r
o
s
t
a
c
y
c
l
i
n
I
P3
i
n
o
s
i
t
o
l
l.
4
.
5・l
r
i
p
h
o
s
p
h
a
l
c
T
x
.
A2
thromboxanA2
PI
p
h
o
s
p
h
a
t
i
d
y
l
i
n
o
s
i
l
o
l
Gs
促進性Giffl~l
Fura-2/AM
Fura-2
・a
celoxymc
山y
l
c
s
l
c
r
Gi
抑制性G蛍 (
1
2+
I
C
a
]
i
2+c
1
o
s
o
l
i
cf
r Ca
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n
cy
BSA
bovinescrumalbumin
∞
∞
Kd
d
i
s
s i
a
t
i
o
nc
o
n
S
l
a
n
t(解離定数)
WGA
wheatgcrma
g
g
l
u
t
i
n
i
n(小麦目玉凝集ぷ)
Bmax
bindingmaximum(故大結合日)
GlcNAc
N-accty
トO-glucosaminc
IC
50
50%i
n
h
i
b
i
L
oryc
o
n
c
c
n
t
r
a
t
i
o
n
-p-FS02BχGuo 5・
p
-f
1uorosulfonylbcnzoilguanosinc
5・
cAMP
c
y
c
l
i
cAMP
ObcAMP
d
i
b
u
t
y
r
y
lc
y
c
l
i
cAMP
・cA
ル伊
8Br
8七romocyclicAMP
GT
P
y
S
3・l
h
i
o
l
r
i
p
h
o
s
p
h
a
t
c
)
g
u
a
n
o
s
i
n
c
5
'・0・(
GOPsS
SOS
sodiumdodccyls
u
l
f
a
l
c
PAGE
仰l
y
a
c
r
y
l
a
m
t
d
cg
c
lc
l
c
c
t
r
o
p
h
o
r
c
s
i
s
UV
t
r
a
v
i
o
l
c
l
u1
00
Jd
c
n
s
i
l
)
'
o
p
t
i
ca
2
-山i
o
d
i
p
h
o
s
p
h
a
t
c
)
guanosinc-5'-0・(
PsS
phosphalc-buffcrcds
a
]
i
n
c
dGTP
2'-dcoxyguanosinc・5
'・1
吋p
hosphatc
I
BMX
n
c
3
i
s
o
b
u
l
y
l
l・mClhylxan出i
dGOP
-deoxyguanosinc・5・
-diphosphatc
2・
EDTA
c
t
h
y
l
c
n
c
d
i
a
m
i
n
c
l
c
l
r
a
a
c
c
t
i
ca
c
i
d
dGMP
2'-deoxyguanosinc-5'-monophosphatc
EGTA
l
c
n
cg
l
y 1b
i
s
(
s引 ninocthylclhcr)-N.N，
N'，
N
'
t
e
l
r
a
a
c
e
l
i
ca
c
i
d
c山y
cGMP
c
y
c
l
i
cGMP
PMSF
1uoridc
phenylmcthylsulfonylf
GppNHp
guanylyl・imidαJiphosphatc
CHAPS
3-[(3-cholamidopropyl)-dimcthylammonio]
l
p
r
o
p
a
n
c
s
u
l
f
o
n
i
ca
c
i
d
y
S
ATP
3・t
h
i
o
t
r
iphosphatc)
adcnosinc5'-0・(
f
lEPES
y
d
r
o
x
y
c
t
h
y
l
]
p
i
p
c
r
a
z
i
n
c
N
'
[
2・c
l
h
a
n
c
s
u
l
f
o
n
i
ca
c
i
d
]
N-[2・h
AppNHp
d
o
d
iphosphatc
a
d
c
n
y
l
y
l・imi
APNIC
19
・0
・a
z
i
d
o
p
h
c
n
y
l
)
-20・n
o
r
i
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
l
i
n
[3H]APNIC
[
l5-3Hd19・(3-azidophcnyl)・20・nonsocarbacyclin
∞
3・位idophcnyl)・1
5・cpi-20
・n
onsocarbacyclin
1
5・epi-APNIC 19・(
-4-
-5-
第 1章
癌化肥満細胞の PGI2受容体の同定とそ情報伝達系の解析
ぷ イ ロ プ 口 ス ト 46)が 使 川 で き る よ う に な っ た
そこで、 cAM P
/
1
:
_成 を 起 こ す
PGI2~立・作体のイ{{E iJ{予怨されるマウス極化j肥満細胞を川い、 PGI 2 交符休の岡
おもに柴Jl
n
1
1
:的 研 究 か ら PGI2
受符体が、 l
f
i
L
小牧、血校、 I
l
r
i
'
t
筋、神経融合荊1
1
，
山とその↑ I
H
t(伝i2じ系の解艇を行なった。
受 容 体i
j
抱374
0
)にイ{イ:
1することが知られていた。しかし、 PGI
J
f"
1
1
1の'主体、
2
s
Z
f
i
i
T
iをはじめリガンド結介にi'I'って起こる細胞内的秘伝述系守についての
，
t化 学 的 側 先 は ほ と ん ど 行 な わ れ て い な い 。 こ れ は PGI2肉 体 が 化 学 的 に 不 安
1がィ、三:A.:で火活しやすいなどのJlt
l1
1
1
定性であることや 10)、 PGI2受苦手休蛍 I'~ 1
による 1
1
)。
第 1節
PGI2の受容体結合反応と促進性G蛋白 (
G
s
)を介する
アデニル酸シクラーゼ活性化の解析
)J巴il~:J Â:IIIJj包は、 IgE-1iGIJ;[ キIJ~止に j必じて tlllJ.抱タトにう〉十必したヒスタミンやその 1~
の炎払のメ
，.
1 ，(
..r.ーターの作JIlにより、炎拍;やアレルギーの時々のキI
l
t
l
1
ばL
与
をJUlする *
1
1
1胞であゐ川 )0 )J~tl~~ì利l 胞は分泌J;xJi:.、1I.'j'に、 lむな どのアラ今ドン
受容体結合部位の同定〕
〔癌化肥満細胞膜における P
GI2
父I
J
t
・P
Gl
2お よ び イ ロ ブ ロ ス ト の 構 造 式 を 不 す
l
PGI2は環状エノ ールエー
限 代 謝 産 物 を 令j
ぷし剤1
1
1.泡外に J
t
lI
1
'
1
す る 。 と こ ろ で 、 肥 満*
1
1
1胞 の i
nv
i
t
r
o
実験系
I
l
t.ì!iを JJ: っており、イ~m 性な 6-kclO-PGF 1α になるため、非常に不安定で
テ ル十
で 細 胞 に PGE1
GI2をれ:
)
I
Jさせると細胞内の c
AMPレベ ル が 1
:叫 し 、 そ れ に
、P
ある。イロザロストは、 5
震構造の般 2
i
i
l
1
2を民主に C
f換 し て 安 定 化 し l-PGI2
より肥向調H胞からの炎症メデイエーターの分泌が抑~IIJ されることが報公芯れ
i ，，~~rj 作である
た4
2
.
.
4
4
)
、 乙の PGE 1 の cA~1P 1
"
0j
l
.
f
:
tJlJは、 PGE1や PGI2が I
f
l
LI
J寸瓦に f
'
f
-J1Jしてそ
の説先を抜く問符する作JIlと似ている。 I
f
l
l
小似におし‘て、 PG[
:
二
河
I
lyl
p
〈
〉
G
;
i
h
2がと
もにcAM
P上J:ク州外~.イイ刊作
1下:リ)パ川!リJ ~を:11
ぷ:す i即
'1中lド'1山
11 が杉般:し，~~t
l
して C八MP
引
叶
31
.
1
川
外i
ト
.
効
月
瓜3
を発現していることが i
明
ゆ
p
列
jらかにされた 4
柑5
)
λ。 ζ の i
知
1
リ
;
凡
L
カ
か
、
ら
、
J
l
胤
f
I
侃
l
V
小
J
l
ト
、
叶
4
依
え
J
比 と1
川
い
1
υ叶
IJ
I
級 に肌
j
J
配
e
巴
U
J
;
渦
h
向
'
1
*
1
1
1
胞 に お い て も PGE1とP
GI2に よ る 、 そ れ ぞ れ の 受 作 体
j_泌による幼-*が子先立された。しかし、 J
)
出向 *
1
1
1胞 に お け る
レ ベ ル で の 交 えJ
PGI2受待作のイ{{tに￨対する過去の報行は非常に少なく、マウ.Aj
¥
I
/
・
1
化J
)
巴i
陥*
1
1
1
胞
を川い、 1L~波 l皮の PG l 2 か PGE よりも強く CAMP/[:.成を尚めることがI~H 一知ら
PGI
2
F
i
g
.1
.
イロプロスト
Chemic
als
t
ru
c
t
u
r
e
so
fPGI2andi
lopro
s
t
.
れ て い た 25)0 1
泣近、 PGI
2
の安定方l
縁体の・つイロプロストおよびその [
31
1J
{
ポ
-6-
ー 7-
5
細胞株)より粕細胞!民間分を，胡裂し、 その
まず、 マウス絹化肥満細胞伊・81
o
i1.
0
朕凶分への [3HJ イロプロストの制民的結合について IJ~ ベた。幽 2 は特異的鮎合
反応の時間と 7
/
1
M
立に対する依イ{
t
'J:を示したものである。 インキュペーション
E
。
“
、
A
B
E
a
.
)
出度が高くなると結合述度は増加するが、 370Cでは 30
分以降、鮎合主が漸減
ol
z
て3
.
5
c 0
した。 2
5 C、 60
分において最大結令が符られたので、 以降の実験はこの 7
1
r
i
l
立
0
.0
.
回
a
ω
。
。
‘
a
.
で行なわれた 。
{
工
M
‘
・
ー4
5
6 7
(pH)
8
9
。
5 ・
4 ・
3 ・
2 ・
1
。
C
a
t
i
o
n(
I
o
gM)
官l
Cmcmbrancf
r
a
c
u
o
nwasi
n
c
u
b
a
t
c
dw
i
t
h20nM[
3
H
]
i
l
o
p
r
o
s
tf
o
r60mina
t
亡
:
n
c
今言
4
F
ig
. 3. p
l
l andc
a
t
ion de
pe
nde
nc
i
e
sof[
3H)
il
opro
st bindi
ng
.
1.
5
て3
C ぞき
0
2
5oCi
n50m Mp
O
l
a
s
s
i
u
mp
h
o
s
p
h
a
l
cw
i
t
hi
n
d
i
c
a
l
c
dpH. c
o
n
t
a
i
n
i
n
g 1m M
1
.
0
EDTAa
n
d1
0m MMg02(
A
)，ori
n1
0m Mp
o
l
a
s
s
i
um p
h
o
s
p
h
a
l
e
， pH6
.
2
.
。
ω二
c
o
n
t
a
i凶ng1m MEDT
Aa
n
dt
h
ci
n
d
i
c
a
l
c
dc
o
n
c
c
n
t
r
a
t
i
o
n
so
fMgα2(
・)
， C
aC1
2
包E
oa
.0
.
5
(
0)o
rNaCI(ム)(
B
)
. 明l
CanlOunL~ o
fbound[
3
H
]
i
l
o
p
r
o
s
tw
c
r
cd
c
t
c
r
m
i
n
e
da
s
、
。
。
d
c
s
c
r
i
b
c
di
n出ct
c
xl
.
司
・
F
Z
M
・
ー
‘
4
30
60
90 120
I
n
c
u
b
a
t
iontime(
min)
3H)
イロプロストの駒沢.的結合}x.応は、 インキュベー
[
;
;
.
:
1
3に不すように、 [
ションの際の治法の pHにより異なり、 最 大 の 結 合 主 は pH6
.
2で 1
!
}られた 。 ま
F
i
g
.2
. Timecours
e andt
e
mperatur
ede
pe
nde
nc
eof[
31
1]
i
1opros
t
2+またはMg
た、府県的結合反応には Ca
2+のて価カチオンが必須であり、 とも
b
i
n
d
i
ng t
ot
hemembranef
r
a
ct
i
on.
明l
Cmc
mb
r
a
n
cf
r
a
c
t
i
o
nwasi
n
c
u
b
a
l
c
dw
i
t
h20nM[
3H)
i
1o
p
r
o
s
ta
t(
)o
C(
0
)
.
2
5oC(
・)o
r3
7oC(
A)f
o
rω
凶 b
i
n
d
i
n
g
.N
o
n
s
p
c
c
i
f
i
cb
i
n
d
i
n
ga
s
s
a
ywasc
a
r
r
i
c
d
にIOmMの設)JtでllX:大活 t
l
.が符られた。 しかし、 Na+イオンは不安であった 。
[
31
11
イロプロストの府民的結合の濃度依存性は、 幽4A
の挿入[2{
1
に示すよう
o
u
ta
t0，25o
r 370C， o
fw
h
i
c
h25oCi
sshown(
口
)
. Th
ca
m
o
u
n
t
so
fbound
[
3
H]
i
l
o
p
r
o
s
twc
r
ed
e
l
c
r
m
i
n
e
da
tv
a
r
i
o
u
sumci
n
t
c
r
va
Js
.
c
a
l
c
h
a
r
d
解析した結果から(図4A)、 結 合 部 位 は
に飽;f
l性であり、 このがi来を S
0
.
4n
M
、 故 大 結 合 主 Bmaxは 1
.
12
一 種 知 で あ り 、 そ の 結 令 解 離 定 数 Kdは 1
l
lプロットの結果、 Hi
l
l
係数は 1
.0となり、
蛋 白 質 と な っ た 。 さらにHi
pmol
/mg
結合には協向性が認められなかった(図 4B)。
ー8
-
-9-
0.
15
ピ
A
E
c
る 0.
10
io
。 50 100
[
3
H
]o
p
r
o
s
t(
nM)
•
E
。
、
、
、
l
I
E
E
:0
.
0
5
1
1
.
PG I2誘導体の~1l:";:l'F JI1について凋べた(図 5B)
。その結果 PGE1:?- PG~>> イロ
1
.5
プロスト〉カルパサイクリン >PGF
2
α >PGD2の順となり、イロプロストは、
(
(
国
[3H jPG E 2 の払介 ì~ßf，i: への.m;fll性は非常に低いことが分かった 。 以上より掛化
)(
c
'
o
e0
国
，
、
j
肥満細胞には、 PGE受容体の他に、 PGI
3
H
jイロプロスト
受容体が存在し、 [
2
国
は
、 PGI
作体に i
ま択的に結合していることが明らかとなった 。
2叉・
‘
、
、
。
}
ol
、
‘
回
。
。
0.5
1
.
0
B(
pmol/
mg)
-1.5
A
log(
[
3H1110pr
o
s
t(nM))
Fig. 4. P
l
o
ts(
)
fs
p
c
c
i
f
i
c[
31
1]
ilopros
t binding.
cwith incrcasing
Thc mcmbranc r
r
a
c
t
i
o
nwas i
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r60mina
t 25o
3Hj
i
l
o
p
r
o
S
I(
1 10 1
0
0nM). Spcc
i
f
i
c
a
l
l
ybound!
"
'l
Ijiloprost
c
o
n
c
c
n
l
r
a
l
i
o
n
s0
1・[
wasd
c
t
c
n
n
t
n
c
d(
i
n叩 t
)
. For山cS
c
a
t
c
h
a
r
d(
A
)and山cHi
l
lp
lOl (8) wc陀
t
r
a
n
s
f
o
n
n
c
dfroml
.
h
cv
a
l
u
cofs
p
c
c
i
f
i
c[
3H1
i
l
o
p
r
o
s
tb
i
n
d
i
n
g
.
_ 100ι
ポ
ol
c
τ
コ
c
s
ω 50
ω
a
ω
-匂
圃ー
・
ω
また磁化 J
J出向制I
J
泡l
院での結合の特央.性は、 [
3Hj
イロプロストの特 j
略的結合
こ
!Hするやk
々の J
1
:
t
f
;
7
tのPGによる旺I
:
J
;
:1111 岩浪より ([.~15A) 、イロプロスト >> PGE 1
>カルパサイクリン
PGI
m
c
t
h
y
lc
s
t
c
r
>PGE2>>PGF2
n
i
に1
見
不I
It:
l
・
α >PGD
2
2の J!
が1
1
1く
、 PGI
2の知総体に選択的に親和性が出いことか分かった。目見述したよ
B
。
o
L/
，
9 8 7 6 5 40 9 8 7 6 5 4
PGs(
-IogM)
PGsトlogM)
F
ig
. S. Ef
f
c
c
t ofu
n
labcl
ed PG on [
3Hj
i
l
o
p
r
os
tand [
3I
1j
PGE2
binding.
Th
cmcmbrancI
r
a
cl
Io
nwast
n
c
u
b
a
t
c
dw
i
t
hc
it
h
c
r20nM [
3Hj
i
l
o
p
r
o
s
t(
A
)o
r5
IflL小松において PGE 1 は PG I 2 受容体にも親不 11ft があることが~1Iられて
nM!
"
'
11
1I
PGE2(
0
)i
nU
1
Cp
r
c
s
c
n
c
co
fv
a
r
i
o
u
sc
o
n
c
c
n
t
r
a
t
ionso
funl
a
b
c
l
c
di
1
op
r
o
st
いる 。 こ の こ と か ら 4
5
・えると、総化肥満細胞において PGE1
がPGI
2"t将休に
(
・)
， PGE1(
・)
， PGE2(円)，ω巾a
c
y
c
l
i
n(6)，PGl2
mct
h
ylc
s
t
cr(X)，PGF
2
α
(
企 )orPGD
0)
. Al
Iv
a
l
u
c
swc
r
cc
o
r
r
c
c
t
c
df
ornons
p
c
ci
f
icb
i
ndi
nga
nda
r
c
2(
~ç 敵する 111j いネlj 作税利'~I:を /Jミすのは、 PG I 2 受符体への交又れ11 イ干の IIJ 従 1 1:が F
cxp
r
c
s
s
c
da
sp
c
r
c
c
n
tc
o
n
t
r
o
l
s
.S
p
c
c
i
f
i
cb
i
n
d
ingi
ncon
l
r
ol
swas1pmol
/
mg f
or
3
H]PGE
l
/
mgf
o
rr
[
3H)
i
l
Op
r
O
S
Ia
nd0
.
5pmo
2・
うに、
f
t
L
1される
ところで、総化肥満細胞には PGI
2受容体に J
J
I
Iえて、また PGE(El/~ を結
合する)受作体もイ{{tすることが知られているお) そこで、 PGI
2リガンドの
PGE
受容体への交又粘介を調べる
H的で、[3H)PGE2*
h令に対する各純非線拡
-10-
ー1
1-
1
可分に結合した [
また、膜 1
3
H
]
i
l
o
p
r
o
s
tの解離を促進する GT
町Sの 効 果 の 用 量
〔癌化肥満細胞の PGI
2受容体と Gsとの機能的会合〕
ところで、いくつかの PG受符体は、 G蛋
I'Jと会合していることが報告され
ており、 G蛍 1
:Iと会合する受容体は GTPによりその結合親和性が低下するこ
とが知られている
6に /
J
'す。 100μM
以上の GT
町Sで、結合した [
3
H]
i
l
O
p
r
o
s
tを ほ ぼ 完
依存性を医1
全に解離した 。
そこで、税々の GTP
の誘導体による、結合したイロプロ
ストの解離に対する作用を訓べたところ、み:I
にぷすように、 GTPや そ の 非
~
しなかった
Table1 E
f
f
c
c
t ofv
a
r
i
o
l
l
sn
u
c
leot
i
de
son t
hed
is
s
oc
i
a
t
ion ofbound
3H]i
r
1oprosl from lhe mernbrane f
r
a
C
l
i
on.
fv
a
r
i
o
u
sn
u
c
l
c
o
l
i
d
c
sf
o
r30
Mcmbrancf
r
a
c
t
i
o
n
swerci
n
c
u
b
a
t
c
dwiUl 100μMo
mina
t25o
Candrcmainingamountsofbound(
3}1l
i
l
o
p
r
o
s
twcrcd
c
t
c
r
m
i
n
e
d
.
About80%ofs
p
c
c
i
l
i
c
a
l
l
ybound(
3
H
]
i
l
o
p
r
o
s
tr
c
m
a
i
n
α
ia
f
t
c
ri
n
c
u
b
a
t
i
o
nf
o
r30
minwast
a
k
c
na
s100%. A
11v
a
l
u
c
sa
r
cmcans:
tS.E.of凶 p
l
i
c
a
t
cc
x
p
c
r
i
m
c
n
t
s
.
N
u
c
l
c
O
l
i
d
ea
d
d
c
d
Bound[
31
1]
i
l
o
p
r
o
s
l(%)
∞
Nonc
F
i
g
.6
.
E
f
f
c
c
tofGTPγs
on t
h
ed
i
s
s
o
c
i
a
t
i
o
n of
100
m一
ch
v
一
ca
水解性誘導体である GT
町Sが解離を促進したが、 ATPなどではほとんど解離
。
、
bound [
3H]
i
l
o
p
r
o
s
t from
t
h
e mcmbranc f
r
a
c
t
i
o
n
.
‘
同
.
~ 50
[
3H]
n
o
p
r
o
s
t
l
a
b
c
l
c
dmcmbrane
。
f
r
a
c
l
i
o
n
swcrei
n
c
u
b
a
t
c
di
n山e
Z
p
r
c
s
c
n
c
cofi
n
c
r
c
a
s
i
n
g
‘
a
.
.
.
.
.
M
]
。
。
c
o
n
c
c
n
t
r
a
l
i
o
n
so
fGT
P
y
Sf
o
r30
1
10
100
y
Sμ
(M)
GTP
C
.andrcma
.
i
n
i
n
g
1000 mina
t25o
amountso
fbound[
3H]
i
1o
p
r
o
s
t
wcrcd
e
t
e
r
m
i
n
c
d
. AI
lva
1u
c
s
wcrcc
o
r
r
c
c
t
c
df
o
rn
o
n
s
p
c
c
i
f
i
cb
i
n
d
i
n
ganda
r
ec
x
p
r
c
s
s
c
da
sperccmo
fc
o
n
t
r
o
l
.
S
p
c
c
i
f
i
cb
i
n
d
i
n
gof[
3
H
]
i
l
o
p
r
o
s
twas1pmol/mg.
GTP
l
6
5
.
9:
t 1
.2
GDP
t1
.
0
7
6
.
6:
P
Gルt
9
5
.
5 :
t 0.69
dGTP
61
.1 土 0
.
6
6
ルPの1.好を起こすことは知られてい
肥満細胞においては、 PGI2が細胞内 cA
dGDP
7
7
.
0:
t 0.76
cGMP
9
6
.
8:
t 0.83
Y
Jらかではなかった。そこで、 PGI受符体刺激に
る25)が、その詳細!な機構は J
G
u
a
n
o
s
i
n
e
97.0 :
t1
.5
よる細胞膜アデニル般シクラーゼの前性化について検討した 。 その結果、イ
GppNHp
4
9
.
7:
t 0.92
ロプロストの存イ1
:ー
ドにおいて、 GTPの波度依存的にアデニル酸シクラーゼ活
町S
GT
1
6
.
1 :
t 0.16
GDPsS
t 0.12
1
8
.
6:
、また GTPの存在ドで、イロプロストの設皮依存的にアデ
性が上昇し(肉 7A)
ATP
8
7
.
7:
t 0.22
1
刈78)。
ニル般シクラーゼ的性が上糾した (
ADP
91
.1 :
t 0.52
AppNHp
8
8
.
3:
t 0.75
PyS
AT
8
7
.
7:
t1
.1
-12-
J
(
L
小板において PGI
PGI
2の細胞作川に関しては、 J
2受容体紡介は Gsを介し
Y
Jらかにされている。癌化
てアデニル般シクラーゼの活性化を起こすことが I
2
ー
1
3
-
第 2節
B
A
一
(C
E
mE二OEa)
F
C
ω
k
F
Z﹀一戸ω ω
ωω
ω
ω
w
m
wk
一 ﹀
一
。
句
400
300
光親和性標識法に よるPGI受容体の同定
2
PGI
;
:
:の決定や、 一次構造の解析などを目的とした受容体蛍
2受容体の分子 f
(
1質の料製には、効率的な I
I
I液化や精製β 法の様、i
:が必要であるが、 PGI
2受
平手体1Jf自質は、
200
Ji待化やその後のカラムクロマトグラフィーなどの操作によ
日I
1
)
り、容易に失活してしまう不交定な蛋白質である 1
。そこで、光照射により
100
刀︽
メ
9 8 7 6 5o9 8 7 6 5
o
gM)
GTP(ー l
叉・符体蛍白質と共イf
*
"
;イ干する、政射性標識安定 PGI
2議導体を合成し、 それを
)
I
JいPGI
2受容体の同定と分 (
-:I~: の 推定を行なった 31.32) 。
o
gM)
I
10prost(
ーl
f
e
ctofi
tadcnyl
a
t
ecyc
l
a
s
e
F
ig
.7. Ef
l
o
p
r
os
ton GTP・dependen
act
ivi
t
y
.
t
h(
i
t
h
o
u
l(
A，s
m
a
p
l
c
scomaincdi
n
d
i
c
a
t
c
dconccmra
i
Lo
n
sofGTPwi
rw
0)
・)o
(PGI
2受容体 に対する光親和性標識化合物の合成〕
;
:
i
¥
発b
〔科として、 i
χ
1
8にぶした化学的に安定な PGI
2
知縁体であるイソカル
i山
lμMi
a
m
p
l
c
sc
o
n
t
a
i
n
ω
i
n
d
i
c
a
t
c
dc
o
n
c
c
n
t
r
a
t
i
o
n
so
fi
l
o
p
r
o
s
lw
l
. B
l
o
p
r
o
s
.s
パサイクリンを J
I
Iい、 それに紫外線によって活性化され、蛋白質のアミノ般
i
t
h
o
u
l(つ)1μMGTP
.Thcs
a
m
p
l
c
swcrca
s
s
a
y
c
df
o
ra
d
c
n
y
l
a
l
cc
y
c
l
a
s
c
(
・)orw
a
c
i
Lv
i
t
ya
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
n山Ct
c
xt
.
タえ J主と j~ イi結合を形成し f!; るアジドフェニル J去を導入した。
OOH
これらの実験対米・から、的化j
肥満細胞には、 PGI
;
Y的:な受存体がイf
イi
:
2に特 !
OOH
し、受容体は Gsと機能的に会令して 、 アデニル般シクラーゼを活性化するこ
σ
いム
とが I
Y
Jらかとなった
I
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
li
n
P
h
c
n
y
lora
z
i
d
o
p
h
c
n
y
l
f
u
n
c
t
i
ona
l
i
z
c
d
i
s
o
c
a
r
ba
c
y
c
l
i
na
n
a
l
o
g
c
us
F
i
g
. 8
.
Che
micals
t
r
u
c
t
u
r
esofi
s
ocabac
yc
l
i
n and phenyl
-
or azidophenyl-functionalized i
s
ocarbacy
c
l
i
n anal
ogues.
-14-
ー1
5-
去2に
、 イソカ J
レパサイクリンおよびその ω鎖 に フ ェ ニ ル 基 ま た は ア ジ ド
ドフエニルまたはヨードフ z ニル誘導体を各科イト成し、それらの [
3
H
]イロプ
レJ
与を料合した各誘導体による、 [
3
H
Jイロプロスト結令に対する阻害
フェニ J
ロスト結令に対する問答!日l
線から求めた I
C
S
0
1
I
i
(を比較した結来、 ω
}
j
'
lの長さ
I
曲線から求めた I
C
S
O
値を示す
(n=3
)とアジド法を導入する伎町.
(
m位)が符られ、 n=3，m-N3の(
1
5
S
)
e
p
i
m
c
r
・0・a
z
i
d
o
p
h
e
n
y
l
)
2
0
n
o
r
i
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
l
i
n(APNI
Cと略称、)がもっとも優れて
である 1
9
TableI
I I
CsOofi
s
ocarbacy
c
l
i
n der
i
v
er
t
iv
e
sf
orbindi
ng
i
n
h
i
b
i
t
i
o
no
f[
3H]
i
l
opros
ti
n membrane f
r
act
ions
.
いることが分かった。 APNIC の{IIi.i!i式を ~19 に IJ' す。 APNIC は主2 の *ii 来より
イロプロストを j
.
.
[
l
l
jる向い親和1''1:をイiしていた 。ところで、このAPINCの放
PGs
1
C
5
0(M)
I
l
o
p
r
O
S
I
0・8
0
.
9
3x 1
I
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
l
i
n
3
.
2
Ca巾 a
c
y
c
l
i
n
5
.
7 X
x
1
08
)
0・6
P
h
c
n
y
l
i
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
l
i
nd
c
r
i
v
c
n
i
v
c
s
8
0x 1
08
3
.
2x 1
n=)
1
6
.
0
n=3
Aスi
d
o
p
h
c
n
y
l
i
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
l
i
nd
e
r
i
v
e
r
u
v
c
s
25.0 X
n= 1， p-N3
n= 1
，m-N
1
5
S
)
c
p
i
m
c
r
3(
n=3，mI (1
5
S
)
e
p
i
m
e
r
n=3. m
I
(
1
5
R
)
c
p
i
m
c
r
x
5
.
0x
6
.
3 x
7
.
9
1
08
射能標識体の合成を検討した結決、 ω鎖フェニルへのヨード(1251
校総を想定)
げ
1
:
の{
1
1:ドを起こしたので、
の狩人は組不i
トリチウム掠識体のイ子 J
J
)
之を検 J
、
fし
、
15f，j. のぷ点の水 Jf をトリチウムに ii'i:換した Já~・tt'I:.t:'~晶体を合成した 。 また、
1
5
付.のよ;υ?の
ι休 配i
1
i
:がRイヘである、
たことから、
トリチウム標設反応によって作られる、 1
5
S
-およひ 1
5R-lsomcr
1
5・cpi-AP
l
¥ICの 1
足
取l
性は大きく f
1
l下し
をi
且相 1
(
d
i
d
:
i
也休クロマトグラフィーにより分離した。
3
a
z
i
d
o
p
h
c
n
)1
)・20・no巾 o
c
a
r
b
a
c
y
c
1i
n([3H]APNIC)<L~19) の
f
!
?られた [151Hd19・(
，
比j
f
j官
主は 1
5CJ
/
mmolであった 。
)
08
1
07
1
06
O OH
OO
H
08
0.30x 1
APNIC
3
2
.
0
1
5・
cpi-APNIC
x
1
08
3
[
3H]イロプロスト結合に対する阻害 l
曲線から求めた I
CSO
怖で比蚊すると、
3
APNI
C
[
3H]APN
I
C
痴化肥満細胞肢のPGI2
受容体は、カ Jレパサイクリンよりもイソカルパサイク
Fig
. 9. Chemicals
t
r
uct
u
re
sofAPNIC and[
3H]
APNIC.
リンの方が向い ~JU日性を有していた。そこで、イソカ Jレパサイクリンのアジ
-16-
-17-
i
j
3
H
]
APNICの癌化肥満細胞膜の PGI2受容体に対する結合の親和性と選択性〕
3
特異的結
合は 10分以内に伝大となり、総結合泣の約 7()%が府県的結合であった 。
0
.
1
5
A
2
c
、
、
.
0
(mEこoEa) 刀C au
一
za︽[ヱ円]
(mEミoE33CコO国
3HIAPNI
Cの抱化 J
巴渦細胞膜への結合の経1与変化を /
J
く
す
詞10に[
l
3
B
E
2
二 0.
10
0
E
Q.
O
ω
ι0.05
3
コ
。
C
国
1
.
0
。
コ
50
100
[
3
H]APNIC(nM)
0
.
2 0
.
4 0
.
6
Bound(
pmol/mg
)
0.5
F
i
g
. 11
. Scntchardplotf
o
r[
3I
I)APNJC binding t
o the plasma
。
。
membrane
.
Plasmamcmbrancs(200μg)wcrci
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r60mina
t30oCw
i
l
hi
n
c
r
c
a
s
i
n
g
30
60
90
Incubationtime(min)
c
o
n
c
c
n
t
r
a
l
l
o
n
sof[
'H]APNI
C(
02t
o100nM)i
nU
1
Cp
r
c
s
c
n
c
c(
C)ora
b
s
c
n
c
e
(
・)of 100μM u
n
l
a
b
c
l
c
di
l
o
p
r
o
sl
. B
ound 1
31
11APNICwas d
c
t
c
n
n
i
n
c
da
s
.
d
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
h
cl
C
Xl
1
l
1
Cs
p
c
cl
Ii
cb
i
n
d
i
n
g(
企)waso
b
t
a
i
n
c
dbys
u
b
t
r
a
c
t
i
o
nof
3I
1)
APNIC binding t
o the p
l
ai
Cma
F
i
g
.1
0
. Timccourseof[
山cn
o
n
s
p
c
c
l
f
i
cb
i
n
d
i
n
gf
r
o
m 山cI
O
l
a
lb
i
n
d
i
n
ga
ti
n
d
i
c
a
t
c
dc
o
n
c
c
n
t
r
a
llOn
sof
membrane.
r
a
n
s
f
o
n
n
c
df
r
o
mUlCv
a
l
u
c0
1ち戸c
i
f
i
c
1
3HjAPNIC ThcS
c
a
t
c
h
a
r
dp
l
o
t(8)wasl
.
.
:
i
t
h1
3nM[
1J
i)APN
I
C
Plasmamcmhrancs(200μg)wcrci
n
c
u
b
a
t
c
da
t30 C v
b
i
n
d
i
n
g(
A
)
.
f
o
rv
a
r
i
o
u
sI
c
n
b
r
t
h
s oft
i
m
c and t
h
c
na
s
s
c
s
s
c
df
o
rl
o
t
a
lb
i
n
d
i
n
g(
・) and
n
o
n
s
p
c
c
i
l
i
cb
i
n
d
i
n
g(
(
"
")
.1
l
1
Camountsofbound[
3
1
1jAPNICwcrcd
c
t
c
n
n
i
n
ω
l
l
l
Cちp
c
c
i日cbmding(
企)wa'
i
a
t山ci
n
dにJ
l
c
dt
i
m
c
sa
sd
c
s
c
r
i恥 di
n山ct
c
xl
. '
c
a
l
c
u
l
a
l
c
dbys
u
b
t
r
a
c
t
i
n
g山Cn
o
n
s
p
c
c
i
f
i
cb
i
n
d
i
n
gf
r
o
m山c1
0
凶 b
i
n
d
i
n
g
.
第1
I
!
i
Iでも述べたように、泌化!肥満細胞には PG受符体として、 PGI
2受 容 体
走行{ドがイバ1
:している 。 そこで、 APNI
受存体のみを特異
CがPGI
以外‘こ PGE'
2
的に 11忍J
注しているかどうかを検 λするために、 [311]APNICの料作特異性につ
いて調べた 》
また [
:
i
(
[1
1にぷすように、 [
3HIAPNIC
粘介の併)'(的結合は飽和性であり、
S
c
a
t
c
h
a
r
d解析の結来から、 車J
令部位は
.
;
H
U
;
(
iで
、
t
0
.
5
8
.
7nM、 Bmaxカ{
Kdが 4
f
3
1
1
1イロプロストの場令とほぼ 致
f
tは
、 [
pmol/mg
蛍(
1
1
となった。 これらのイ1
1'~112A に/)ミすように (3HIAPNIC恥令に対して、 )
1
，
標識 APNICはイロプロス
トと Itij桔皮に強く鮎介を ~nw したが、 PGE 2 はほとんど結合を阻害しなかった。
この結果から、 APNICはPGI2
受料体に選択的に鮎令していると与・えられた。
また、 15R-cpimcr体である 1
5cpi-APNICは [3HjAPINCの結合問主作川は弱い
した(第 1!立与然)。
・
ものであった 。
-18-
-19-
主について調べるため 、APNICが編化 J
j
巴渦
さらに 、APNICのアゴニスト泊f
剤師抱腹のアデニル般シクラーゼを活性化するかどうかについて調べた(凶 128)
9M以上で浪泣依 作的に この醇ぷCは 10をm
f
t
化
lμMGTP
イ{イfドで 、 APNI
，
これらの結果から、 APNICはPGI
2受容体に対 して
、 向い親和性と選択性を
するアゴニストであり、 その PGI
受容体との結合はアデニ Jレ酸シクラーゼ
イI
2
を治性化することが分かった 。
06 M
以上で最大i
lf
I
:となったが、 APNI
Cはイロ プロスト のが)80%の机
し、 1
恥
5・cpi-APNI
Cのそれ ぞ
判;
イ
tであ った。 この点を除 きAPNI
C、 イロプロスト 、 1
3
れによ るアデニル般 シクラーゼの 活性化の花皮と、 r
和 合 に対す る
Hj
APNIC
~li持活性の 花皮 はよく対応した 。
〔
光親和性標識化合物 [
3H]
APNICを用いた PGI
2受容体の同定〕
[
3H]APNICがPGI2
、 光照射により共布結合を形成すること
受容体蛋 (111と
を侃:必するため、次の実験を行なった。 まず婚化肥満細胞膜に [
3
H)APN
I
Cを
500
車
i
i
イ干させた後、 GTPySを添加すると [3H)APNICの解離が起こった。 しかし細
B
m崎
n
u
n
u
!抱J~ に[3 H ]APNIC を結合させ、 254nm の紫外線を 3 分間!照射した後、 GT
門 Sを
添加 lしでも [
3H]APNICがま ったく解離しなかった(み3
)。
300
200
f
f
e
c
t
sofGTPySand UVi
r
r
a
d
i
a
t
i
o
non t
h
ed
i
s
s
o
c
i
a
ti
on
TableI
I
I E
100
ofbound [3H)APNIC from s
o
l
u
b
i
l
i1
.ed membrane f
r
a
ct
i
o
n
s
.
3H1APNICand t
Mc
mbranc
sp
r
c
l
a
b
c
l
c
dw
i
t
hr
陀 a
t
c
do
rn
o
tbyUVi
r
r
a
d
i
a
t
i
o
n
一
直
987 6
PGs(ーl
o
gM)
円 MG
1
一。M
件
﹂ ，
、
司
・
47 0
- (
48 s
G
P
LQV
一
一
。
。 L
.
.
.
/
，
メ
﹄一
20
ω
m
w
n
u
h
Q
O
w
m
w
h
c
o
u
d
H
40
εpεこoEa)
60
hAM
一
﹀
80
Zυ
。
(
。
旬
A
100
{
ち
﹄MC8-oJC
ω
ω
a
ω
﹄
一
a
u
z
a
d
H
{
Z
n
}
ω 一
一
万C一
。c
120
5
r
e
s
e
n
c
eo
r
wcrcso
l
u
b
i
l
i
z
c
dandf
u
r
t
h
c
ri
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r10mina
t30oCi
n出ep
∞μMGT門3
a
b
s
c
n
c
eof5
刊
er
e
m
a
i
n
i
n
gr
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
y wasd
c
t
e
r
m
i
n
eda
s
h
ct
c
x
t
.A
1
lv
a
l
u
c
swcrcc
o
r
r
e
c
t
c
df
o
r山cn
o
n
s
p
c
c
i日cb
i
n
d
i
n
g
.
d
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
2
. E
F
i
g
. 1
f
f
e
c
t
sofunlabeled PGson t
he d
i'
is
o
c
i
a
t
i
o
n ofbound
R
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
y陀 m創n
i
n
g
)
'
c
1ase i
nt
he
[3H]APNIC fromandthe s
t
i
m
u
l
a
t
ion ofadenyl
a
t
cC
%民 c
r
e
a
s
c
T
r
c
a
u
n
c
n
t
pla
s
ma membrane
.
+GT
門S
yS
-GTP
3H]APNICi
nt
h
c
A
. Plasmamcmbrancs(200μg)wercincubatcdwilh13nM[
p
r
c
s
c
n
c
cofv
a
r
i
o
u
sc
o
n
c
c
n
t
r
ヨt
i
o
n
sofu
n
l
a
b
c
l
c
di
l
o
p
r
o
s
t(
i
.
.
.
.
)
. APNIC(
・)
.
dpm
1
5・cpi-APNIC(
ゐ)
. o
rPGE2(
・)
.A
l
Jv
a
l
u
c
swc陀 c
o
r
r
c
c
t
c
df
o
rn
o
n
s
p
c
c
i
f
i
c
l n
b
i
n
d
i
n
ganda陀 c
x
p
r
c
s
s
c
da
sap
c
r
toft
h
cc
o
n
t
r
o
la
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
h
et
c
x
(
.
∞
8.Plasmamcmbrancs(1.9μg)wcrei
n
c
u
b
a
t
c
dw
l
t
h1μMGTPi
nt
h
cp
r
c
s
c
n
c
c
ofv
a
r
i
o
u
sc
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n
sofu
n
l
a
b
c
l
c
di
l
o
p
r
o
s
t(
0)
. APNI
C(
・)
.
None
.
1
t2
450:
2
1
1:
t 8.9
5
3
.
1
UVi
r
r
a
d
i
a
t
i
o
n
388 :
t1
1
386:
t 6.6
0
.
5
15-cpi-APNIC(
ム
)
.C
y
c
l
i
cAル伊 formcdwasmcasurcda
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
h
ct
c
x
t
.
一20-
-21-
受容体に結合させた後、紫外
そこで、 [3H)APNI
CをN6化肥満細胞膜の PGI
2
線を照射し、 SOSポリアクリ J
レアミドゲル活気泳動 (SDSPAGE)により蛋 (
11
'
1
を分離した後、 X線フィルムに対 してフルオログラフィーを約 5日間行なった 。
k
4
3kOaと推定される佐世にプロ
その結果、図 138に見られるように、分f-h
3H]APNIC
標識受容体が碕2
dされた 。 このバンドは、
ー ドなバンドとして、 [
[
3
H]APNICを細胞膜に結合させる際に、 GT
PySを添加すると減弱すること、
つぎに [3H]APNIC
結合部位の特異性を調べるために、 [3H]APNICを泌化肥
満細胞肢に結合させる|捺に、過剰量の種々の JI~-t:R 識PG を添加後、光親府l 性標
識を行なった(図 1
4
)。 そ の 結 果 PGI2の 安 定 誘 導 体 で あ る イ ロ プ ロ ス ト 、
APNI
C、イソカ l
レパサイクリンによりのkD
aのバンドは消失した 。 また、
PGE1
、 PG02
、 PGF
ぬではコントロー J
レとほとんど変
でもかえ弱したが、 PGE2
標識のkD
a
蛋白質は、結合リガンド
化がなかった 。 このことから [3H)APNIC
また非椋識のイロプロストを加えるとほぼ完全に消失することから、 Gi
長1
'
1
と共役した PGI
受容体であることが確認された 。尚、電気泳動後のゲ Jレを ー
2
・
定サイズでスライスにし、その放 9
I
定した乱1
i呆(図 1
3
A
)からも GT
P
y
S
、
H市性を出J
2
誘導体)を特異的に認識する、受容体蛋白質である
として PGI2(もしくは PGI
ことが分か った。
イロプロストの阻害効果が定量的に確認された 。
MMM
.圃圃咽圃.
67
-106 一
一 80 一
。
30
(1μM)
2
2
[
3H]APNICbound
3)
(dpmx10-
.
43
一 50 一
一 33 一
一 28一
一 191
W 泊例
MW
(kDa)
3
123456789
F
i
g
. 14. Ef
f
ec
t
sofun1abe1ed PGs on p
h
o
t
o
a
f
f
i
n
i
t
y1
a
b
e
l
i
n
gw
i
t
h
[
3H)APNIC.
Plasmamcmbrancs(200μg)wcrci
n
c
u
b
a
l
e
df
o
r60mina
l30oCw
i出 1
3nM
問 AP
NlCi
nt
h
ea
b
s
c
n
c
e(
la
n
c1a
n
d9
)o
rp
r
c
s
c
n
c
eo
f1μMi
1
0
p
r
o
s
t(
la
n
c2
)
，
[
3
Fi
g.1
3
. P
h
o
t
o
a
f
f
i
n
i
t
yl
a
b
e
l
i
n
goft
h
ep
1asma mcmbr
ane w
i
t
h
[
3H]APNIC.
APNI
C(
la
n
c3
)，i
s
o
c
a
r
b
a
c
y
c
1
i
n(
la
n
c4
)，PGE1(
la
n
c5
)，PGE
l
a
n
c6
)，PGD
2
2(
P
l
a
s
m
amcmbrancs(200μg)wcrcJ
O
c
u
b
a
t
c
df
o
r60mina
t30o
Cw
i
t
h1
3nM
n山ct
c
xt
.
SOS-PAGE(4-20%)f
o
l
l
o
w
c
dbyD
u
o
r
o
g
r
a
p
h
ya
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
(
la
n
c7
)，o
rPGF
l
a
n
e8
)
. Thes
a
m
p
l
c
swcrcp
h
o
l
o
l
a
b
c
l
c
da
n
ds
u
b
j
e
c
!
c
dt
o
2
α(
[
3H)APN
ICi
nt
h
ca
b
s
e
n
c
c(
la
n
e1
)o
rp
r
e
s
c
n
c
co[100μMGTP)
'
S(
l
a
n
c2
)o
r
es
a
m
p
l
e
sw
c
r
cph
O
l
o
l
a
b
c
l
e
da
n
ds
u
b
j
c
c
t
c
dt
o
10μMi
l
O
p
r
o
S
l(
l
a
n
e3
)
. 百1
. A，r
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
yi
nt
h
cg
c
ls
u
∞;
SOS-PAGE(
4
-20%)a
sd
c
s
c
r
i
h
c
di
nt
h
ct
c
xt
・，加1c1
; 0，l
a
n
c2
. B，O
u
o
r
o
g
r
a
p
h
y
.
-22-
-23-
さらに li~t~ の )i法により、 PGI 2 受容体の存在が明らかにされているプタ血
第 3節
PGI2受容体反応の多様性
Daの プ
i
i
を求めた(図 1
5
)
。 そ の 結 来 、 分 子 世 51k
小板朕を川いて、その分子i
ロードなバンドが認められ、このバンドは癌化肥満細胞における場什と同様
に
、 GT
町Sの添加lによって弱く、イロプロストの添加によって強く阻得され
肥満細胞は、刺激に応、 じてヒスタミンなどのメデイエータ ー を
J
t
.
n
Hし、炎
i
.
応 に￨刻与する細胞である
1
;
E1
PGI
2は血管内皮細胞で産生され、血小級や血
管平治鍛j
細 胞の機能を制節することはよく知られているが、￨司しく I
竹の近
f
l
L
る性質のものであ った。
・
する j
:
傍に多くイf
イi
肥満刺J
抱に対する作用は、ほとんど明らかではなか った。
I
ー
ー
MW
2+濃 度 (
2+
ニ ス ト 刺 激 す る と 、 細 胞 内 の 遊 離 Ca
]
i
)が増加し、その車J
[
C
a
ミヒス
i
3
1
(
k
D
a
)
2+
タミン肱 /
)
i変化を指紋にし
1
'
，が促進されることを凡いだした 。 そこで、 [
C
a
-94ー
-67-
て、 PG I 2 の受存体刺激で ~j._ J~記する cAMP の効果について調べた 。
-43-
。
2+
2+
J
iの変化を、 Ca
蛍 光 プ ロ ー プF
u
r
a2を用いて測定した紡来をj;;{1
fCa
1
6に
-30-
示 す ，まず、
」一一ー幽
1
若布' は、 f~l\ 化 j肥満細胞に ATP とトロンピンの受容体があり、両受作休をアゴ
2+
トロンピンで抱化肥満細胞を刺激すると '
過性の [Ca
J
i.
1:
升が
2+を除去しても同程度に起こった 。し か し
起こるが、この上好は紺￨胞外の Ca
2
[
3H]APNICbound
(dpmX10-3)
1
2
3
百日咳汚染 (
P
T
)を前処位 した細胞では、
れなくな った。 この*，t
尽から、
i
fporcine
h
ep
lasma membrane o
h
o
t
o
a
f
f
i
n
i
t
yl
a
b
e
l
i
n
goft
F
i
g
.1
5
. P
3H]APNIC.
p
l
a
te
l
e
t
s with 1
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r60mina
t30oC
l
a
s
m
amcmbrancs(200μg)wc閃 i
P
o
r
c
i
n
cp
l
a
t
c
l
c
tp
3111APNICi
)o
rp
r
c
s
c
n
c
co
f100μMGTP
n山ca
n
e1
b
s
c
n
c
c(
"
(
S
w
i
t
h1
3nM1
Ia
h
o
t
o
l
a
b
c
l
c
dand
a
m
p
l
c
s wc陀 p
()μM i
I
a
n
c3
)
. 官 lC s
l
o
p
r
o
s
t(
)o
rI
a
n
c2
(
l
a
d
i
o
a
c
u
v
i
t
yi
n
c
xt
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
h
ct
. A. r
PAGE(4-20%)a
sd
s
u
b
j
c
c
t
c
dt
oSDS
出cg
c
ls
l
i
c
c
;
・
.
.
..l
a
n
c3
a
n
c2
;a
n
d.
.B
; O.l
l
a
n
c1
.Ouorography.
2+
トロンピンによる [
)
i1:升が見ら
C
a
蛍l
討を介して、
トロンピン受容体はf
Y
f
感受:t'
tGi
2+を細胞内に移動させる作川があることが分か っ
カ jレシウム j
じ
て
間
百
￨
げまか らCa
た。 次に、イロプロストを!日j処 慨 し て か ら ト ロ ン ピ ン 刺 激 を 加 え る と 、
2+
2
・
Ji1
+
]
iI
:
[
C
a
刺激による [
Jx 泌が ~lt "与された 。 一 方 ATP
C
a
1
:
1
'
M・は、細胞外
Ca2 + を除去すると m~ したが、 PT の前処置では変化しないことから、 ATP 受
2+流入によるものであることが分かった。この
容体を介した細胞外からの Ca
2+
受容体刺激による [Ca
]
i上昇をさらに i
ときイロプロストは、 ATP
骨太させた。
田
24-
-25-
1
000
500
200
1
0
0
2
3
人
J
¥
_
4
Thr
k
h
u
刊
1.
5
ω
0
併
0ト t
人
﹄
1
0
0
0卜B
lWOS
1
4
-
Tlr
8
A
300
内
~
ι)
一
1
0
0
4
nu
ミ
l
_l
PT
3
(
ち
﹄ C00 0 8
200
。
2
Ca
+
3100
コ
〈
0
o
1mln
2
4
6
8 1
0
0 8 7
Timc(
m
i
n
)
I
l
o
p
r
o
s
t(
I
o
gM)
F
i
g
.1
6
. E
f
f
e
c
t
sofi
l
o
p
r
o
s
t on t
h
ethrombin-and ATP-induced
2
i
n
c
r
e
a
s
e
si
n rCa +
J
i
.
F
i
g
. 17. Time coursesand dose dependenciesoft
h
ee
f
f
e
c
t
sof
n
cr
e
a
s
ei
n [Ca2
+
Ji
.
i
1
0prost on t
h
e thrombin・ andATP-induced i
6c
・l
o
a
d
c
dc
c
l
l
s(
2x1
0
c
l
l
s
)wcrcs
t
i
m
u
l
a
t
c
dw
i
t
h0
.
5U/mlt
h
r
o
m
b
i
n(
A
)
F
u
r
a
2
2
o
r 100μMATP(
B
)i
nb
u
f
f
c
r(
1
)o
ri
nCa+f
r
c
eb
u
f
f
c
r∞n
t出国 ng0
.
3m M
6c
A，F
u
r
a
2・l
o
a
d
c
dc
c
l
l
s(
2x1
0
c
l￥
)w
crei
n
cu
b
a
t
c
df
o
rl
h
ci
n
d
i
c
a
t
c
dt
i
m
e
sa
t
370C w
i
t
h1μMi
l
o
p
r
o
s
ta
n
d0
.
5 m MIBMX. B， F
u
r
a
2・l
o
a
d
e
dc
c
l
l
swere
EGTA(
2
)
.F
u
r
a
2
1
0
a
d
c
dc
c
l
l
sc
x
p
o
s
c
dt
o100ng
/
mlPTf
o
r3hwcrcs
t
i
m
u
l
a
t
c
d
i
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r5mina
r37o
Cw
i山U1Ci
n
d
i
c
a
l
c
dc
o
n
c
e
n
t
r
a
i
Lo
n
so
fi
l
o
p
r
o
s
la
n
d
w
i
l
hl
h
r
o
m
b
i
no
rATP(
3
)
. Af
t
c
rf
u
r
a
2l
o
a
d
c
dc
c
l
l
shadb
c
c
np
r
c
i
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r5
mina
t37o
Cw
i
l
h1μMi
l
o
p
r
o
s
tand0
.
5m MIBMX， 出cc
c
U
swcrcS
l
出川 l
a
t
c
d
0
.
5m MIBM X.百 1
Cc
c
l
lss
t
.
im
u
J
a
l
c
dby0
.
5U/
mlt
h
r
o
m
b
i
n(
・)加d1 μM
2
ATP(
企)
. a
n
d 山cp
c
a
k[
C
a
+
)
il
c
v
c
l
si
n
d
u
c
c
d by t
h
c
s
cs
t
i
m
u
l
a
n
t
s wcrc
w
i
t
ht
h
r
o
m
b
i
no
rATP(
4
)
. Thrombino
rATPwasa
d
d
c
da
lt
h
ct
i
m
ci
n
d
i
c
a
l
c
dby
d
C
l
c
r
m
i
n
c
da
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
nl
h
ct
C
Xl
. Th
cv
a
l
u
c
sshownr
c
p
r
c
s
c
n
tp
e
r
c
c
n
t
a
g回 o
f
山 ca
r
r
o
w
. Thcr
c
c
o
r
d
i
n
g
s showna
r
car
c
p
r
c
s
c
n
t
a
i
Lvcoft
h
r
c
ci
n
d
c
p
c
n
d
c
n
l
山cr
c
s
p
c
c
t
.
ivcc
o
n
t
r
o
l
sa
n
da
r
cmcan
s:
tS
.E.f
o
rt
r
i
p
l
i
c
a
t
cc
x
p
e
r
i
m
c
n
t
s
. Th
c
c
x
p
c
r
i
m
c
n
t
s出a
ty
i
c
l
d
c
ds
i
m
i
l
a
rr
c
s
u
l
t
s
.
2
v
a
l
u
c
so
ft
h
ci
n
c
r
c
a
s
ci
n!
Ca
+
]ii
nc
o
n
t
r
o
l
swcrc6
3
1士 29nMf
o
rt
h
r
o
m
b
i
nand
・
∞
41
.6土 4
.
1nMf
o
rATPr
c
s
p
c
c
L
i
v
c
l
y
.
次に、イロ プ ロスト作川の経II ，~変化と川民依存性について J司ベた(凶 17)。
2
イロ プロストの ATPによる [
C
a
+1
i 仁芥に対す る促進作用と、
するその阻符作用の /Hm
は
、
トロンピンに対
J
tに 1分間の治時期lの後:i'，現し、が)3分で i
止大に
達するという j七通なものであ っ た 。
また 5分間前処 lr~ したイロプロストの効
2+
次に、このイロプロストによる [
C
a
]
i調節作川の PG特典性を調べた(表的。
その結果、イロ プ ロストをはじめ、 PGE1
、 PGE2のような細胞内 cA
ルF産生を
AMPを産生しない PGF
2
α 、PGD
2にはほとんど
引き起こす PGの効果は強く、 c
果は、両刺激に対して同 一の効民を示した 。 これらの結果から、イロプロス
_する共通のセカンドメッセンジャーの働き
トによる PGI
受容体刺激は、産 It
2
を介して、
2
P受容体を介した、 [
C
a
+
)
i作川を調節する
トロンピン交符体と AT
ルFや 8Br-cA
ル伊を添加すると、イロプ
作用が見られなか った。 さらに、 DbcA
ロストと同級な効果が認められた 。 これらのことから、イロプロストの作用
は、産生される cA
ルFの作川を介 して発現するものであることが分かった 。
ことが示唆された 。
-26-
ー 27-
Tabl
eIV E
f
f
e
c
t
sofvar
i
ousPGs
，cAMPanal
ogue
son t
he
2
t
hr
ombin-andATP-i
n
duced i
n
c
r
e
a
s
ei
n [Ca+]
iandt
hece
lul
ar
2+動 J
ところで、細胞内カルシウムJti=留部位からの Ca
1による [Ca2+
]
i上 弁 の
I
)
代謝により、ホスファチジ jレイノ
機桃は、ホスファチジルイノシトール(P
cA恥1P l
evel
.
6c
Af
t
c
rf
u
r
a
2
1
o
a
d
e
dc
c
l
l
s(
2x1
0
c
l
l
s
)hadbccnp
r
c
i
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r5mina
t37oC
wi
t
ho
rw
i
t
h
o
u
tt
h
ci
n
d
i
c
a
t
c
da
g
c
n
t
si
nt
h
cp
r
c
s
c
n
c
cof0
.
5m MIBMX
，t
h
cc
c
l
l
s
2
h
r
o
m
b
i
no
r100μMATP.羽 1C pcak [Ca+
]
i
wcrcs
t
i
m
u
l
a
t
e
dw
i
t
h0
.
5 U/mlt
I
c
v
c
l
si
n
d
u
c
c
dbyt
h
c
s
cs
t
i
m
u
l
a
n
t
swcrcd
c
t
c
n
n
i
n
c
dぉ d
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
h
ct
c
xt.百c
レ4
.
5・コリン酸(P1P
2
)から特典的ホスホリバーゼ C作用で産生される、
シト ー j・
イノシトール・ 1人 5・
)により起こることが知られている。そこで
三 リン般 (
I
P3
次に、純々の刺激による P
I
代謝@松の瓦進に対するイロプロストの作用につ
v
a
l
u
c
sshownr
c
p
r
c
s
c
n
t戸 r
c
c
n
t
a
g
c
so
ft
h
c陀 s
p
c
c
t
i
v
cc
o
n
t
r
o
l
sanda
r
cmcans土
み5に示すように、 トロ
S
.E
.f
o
ru
i
p
l
i
c
a
t
ccxpcrimcnL
'
i
.F
ormeasurcmcntofcAMP.c
c
l
l
s(
1x1
Q
6c
c
l
l
s
)
いて、 [
3
問イノシト-)レ原激細胞を用いて検討した
wcrci
n
c
u
b
a
t
c
df
o
r5mina
t37o
Cw
i
t
hv
a
r
i
o
u
sPGsi
nt
h
cp
r
c
s
c
n
c
eof0
.
5m M
ンピンあるいは ATPで細胞を刺激すると、ともに [
3H)
I
P3の産生を促進した 。
IBMX，and山cncAMPI
c
v
c
l
swcrcd
c
t
e
r
m
i
n
c
da
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
nt
h
et
c
xt.官1C
2
v
a
l
u
c
so
ft
h
ei
n
c
r
c
a
s
ci
n[
C
a勺 ii
nc
o
n
t
r
o
l
swcrc623土 6
1nMf
o
rt
h
r
o
m
b
i
na
n
d
4
2
.
5土 3
.
5nMf
o
rATPr
c
s
p
c
c
t
i
v
e
l
y
.
剥1胞を子め、イロプロストで 5
分間前処置しておくと、トロンピン刺激によ
る [3HIIP 3 の産'1:.は強く ~rl'l与されるが、
ゾJ
、ATP
刺激による [
3
H
]
I
P
、
3の産ノtは
逆に強く促進された 。 NaF+AICI3は、受容体刺激の代わりにホスホリパーゼ
にカップルする G蛋白を [{(接抗f
L
化 し 47)、ホスホリバーゼ Cの活性化を介し
6[Ca2
t
]
cAMP
A
d
d
i
t
i
o
n
2+の上好を引き起こす 4
て細胞内 Ca
8
)ことが知られている
廿l
l
'
(
)
m
b
i
n
Aτ?
%o
f
c
o
n
t
r
o
l
描化肥満細胞にお
いても、 Na
F
+A103処J.1I!は、 Ca2+イ オ ノ フ ォ ア の イ オ ノ マ イ シ ン と 向 紘 に
6c
pmoVI0
c
l
l
s
1
31
1l
1P3の陀生を点進した
しかし、これらの受符体を介さない刺激による
[
3H]
I
P
)の産生に対しては、イロプロストの前処 L
:
i
'
I
は無効であった 。
t4
.
5
1
2
.
9:
292:
t1
6
61
.5士2
.
8
l
μルlPGE
30.
3:
t6
.
7
220:
t1
6
3
4
.
5:
t3
.
1
この鮎呆から、イロプロストの作用点は、ホスホリパーゼ Cの活性化、あ
I11MPGE
2
60.0:
t6
.
3
1
8
7:
t2
1
2
3
.
5:
t5.6
るいは G蛍白によるホスホリパーゼ Cの活性化ではないことが示唆された 。
1μMPGF2α
8
3
.
1土 8
.
2
1
2
5土 1
3
4
.
5:
t2
.
1
以上、肥満細胞において、 PGl
1
:
す
る cA
恥伊は、他の
2受容体刺激により沌 '
GD
l
μM P
2
95.0:
t3
.
7
112:
t1
0
3
.
8:
t1
.8
2-t励Jlを指標にすると、刺激の違いにより全く
受作休刺激により発現する Ca
1m MDbcAMP
3
2
.
9:
t8.2
1
9
4:
t1
9
逆に関節することがあることを/示唆するもので、このメカニズムは不明であ
1m M8Br
c
A
ル1p
38.0:
t1
0
205 士 1
7
るが、 PGI
肥満細胞の機能が多様に調節されることを示す一例
2受容体により j
lμMI
1o
p
r
o
s
t
，
となる。
-28-
-29-
TableV
考 察
E
f
f
e
c
tofi
l
o
p
r
o
s
tont
h
ethrombin，ATP，NaF+ A1CI
3
and ionom
y
c
i
n
-induced accumulation ofIP
・
3
6c
A
f
t
c
r[
3
H
]
i
n
o
s
i
t
o
l
l
a
b
c
l
ωc
c
l
l
s(
2x1
0
e
l
l
s
)hadb
c
c
np
r
c
i
n
c
u
b
a
t
e
df
o
r5mina
t
37oCw
i
t
ho
rw
i
t
h
o
u
t1~品川 loprost a
n
d0
.
5m MIBM X，t
h
cc
c
l
l
sweref
u
r
t
h
c
r
i
n
c
u
b
a
t
c
dw
i
t
h0
.
5U/
m
lL
h
r
ombino
r100μMATPf
o
r30s
c
c
，o
rw
i
l
h20m M
NaFp
l
u
s 10μMAI03o
r 1μMi
o
n
o
m
y
c
i
nf
o
r5m
i
n
.[
3H]IP
3formcdwas
d
c
t
c
r
m
i
n
cda
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
nL
h
ct
c
x
t
. Th
cv
a
l
u
c
sshownr
c
p
r
c
s
c
n
tp
c
r
c
c
n
t
a
g
c
sof
t
h
cc
o
n
t
r
o
landa
r
cmcans:
tS
.E
.f
o
rt
r
i
p
l
i
c
a
t
cc
x
p
c
r
i
m
c
n
L
S
. 計 lCr
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
t
yof
t
h
cc
o
n
t
r
o
lwas7
3
.
3:
t2.9dpm/106c
e
l
l
sf
o
rI
P
3
・
第 l 節において若~-は、マウス婚化肥満細胞に、 PGI2 に特異的な受容体が
イバ1
:す る こ と を 明 ら か に し 、 そ の 悩 報 伝 達 系 を 解 析 し た 2
7
)
。描化肥満細胞膜
への[
31
1]
イ ロ プ ロ ス ト の 結 合 に 対 す る 、 極 々 の 非 絞 識 の PGによる結合阻害の
j
順 序 は 、 血 小 叡 に 報i
与されている結果 1
1
)とよく・致しており、 PGE に 比 較
1
的t
f
dい親和牲が認められたが、 PGE2の 親 和 性 は イ ロ プ ロ ス ト の l∞ 分 の 1以
)
5
、
であった。 -
[
3H]
I
P
fc
o
n
t
r
o
l
)
3(%o
A
d
d
i
t
i
o
n
司副
Nonc
司 - 司 副 圃 圃 眉 』一一一
+I
l
o
p
r
o
s
landIBMX
0
.
5U/mlThrombin
237 + 8
.
5
1
3
1 :
t25
100μMATP
t30
205 :
289 士 25
F+10μM八l
C
l3
20m MNa
220 + 4
.
1
221 + 5
.
9
1μMI
onomycin
235 + 7
.
8
t14
233 :
F
J
4
4化 j
肥満細胞膜への[
3
H]
PGE
2
紡介に対する図書作用は
PGE1
2
および、PGE2に 選 択 的 で あ っ た 。 これらのが;*は焔化肥満ー細胞に、
PGI
お よ び PGEのそれぞれに持民的な、 2
{
重類の異なる PG受 符 体 が 存 在 す る こ と
を/
J
'す も の で あ る
婚 化j
肥満細胞膜における [
3H]
イロプロスト結合の
S
c
a
l
c
h
a
r
d解 析 よ り 求 め た Bmax(
1
.
1
2pmol/mg蛍 (111) は、
l3HJPG~結合の Bmax
(
0
.
5pmol/mg
蛍f
i
1
'
{
)の約 2
f
行であり、受容体数において PGI
2
受容体が子GE
受容
体より多い 。 また
PG r2~立・待外のイ{イ1: が報告されているヒト血小紋膜
(Bmax =
1
.
0p
r
n
o
1質)11) 、マウス ~III 粁J.F 細胞腔とチヤイニーズハムスター胎児
l
/
mg
蛍(
}
J
i
込1
1
1
'
*
=
細 胞 の 融 合 細 胞NCB-20の 細 胞 膜 (Bmax= 1
3
8
)、プタ
.
2
8pmo
g蛋白質 )
Vm
大動脈、!と滑筋朕 (Bmax=0
4
0
)な ど と 比 較 し て も 、 癌 化 肥 満
.
3
6pmo
l
/
mg
蛋白質 )
!
U
f
包
に PGI
立・容体が f
2
7
7
;にイf
2:
来I
'
lしていることが分かる。
=
1
F術的な実験で、ラツ
ト}ru.}P~ )J~ ?1~:Jf(:l1I胞を、イロプロストあるいは PGE2 で刺激することにより、産生
される細胞内 cAMP!
2より
i
:
'
を 比 較 し た と こ ろ 、 イ ロ プ ロ ス ト 刺 激 の 万 カヤ GE
も多い結 ~・となった 。 ラット j血脈肥満細胞を多;止に調製することは困難であ
るため、受容体の結合実験のデータは得られていない。しかし癌化肥満細胞
と同級に、肥満細胞にも PGI2
叉'容体が存在しており、受符体数は
-30
由
-31-
受容 体
PGI2
か PGE受符体よりも多く、 CAMP.PE~t:.作用とそれに伴う細胞機能の調節作JI]
2
品)。しかし TxA2
受裕外;における成功例が多い 5
以外の P
Gに つ い て は 、 利 用
i
j
l
jを担っているものと考えられる
RJ
i
裂な役 ;
受 容 体 が}
においても、 PGI
2
可能なアンタゴニストがほとんどないこともあって、イi
効な光親和性標識リ
依イヂ的に
2によってアデニル般シクラーゼが、 GTP
小松においては、 PGI
I
(
I
L
ガンドの1)
1発の例は比般的少ない。報告されているものとしては、 PGE
2自体
t1it1:イヒされることが知られている 49) 。癌イヒ月巴満細胞)~たからの[3 H ] イロプロス
J
'
l
をa
i
'
J
d
op
h
c
na
c
y
l
c
st
c
r
に生えた P
の α}
GE受容体に対する光別府 l
性標識リガンド
トの解離が、 GTPとその J
I・水餅性の誘導体で促進されたこと、イロプロスト
7
)、 PGF2aの ω鎖に i
や5
基を結合した PGF
a
z
i
d
o
p
h
c
n
y
l
ωo
2a受 容 体 に 対 す る 光 親
依存的にアデニル般シクラーゼを活性化したことから、癌化肥満細胞
がGTP
8
)
l:線拡リガンドなどがある 5
不I
。 し か し 前 者 の PGE
2
I
f
の品導体では、もとの
レ般シクラーゼと
こGsを介してアデニ J
イ?と向様 l
位小板の桜i
受容体は、 l
のPGI
2
(
)
(
)
分の l
に低下しており、後者の
PGE2に比べて、受容体に対する親和性が約 I
機能的に会合し、この酵素を活性化して、 cAMPY( 'I~ を促進するものである
PGF
恋導体の場合でも、 PGF
分の 1
に低 Fしているなど、親
0
2a"
α
2 に比べて約 1
両
手I胞の PGE受 符 体 も ア デ ニ ル 般 シ ク ラ ー ゼ を
と与えられる。一点、州化 )J~ l
i
不
11''1:において問題があると以われる。
5
)
。したがって拍化肥満細胞においては、これら 2つの異なる PG
的性化する 2
受容体がいずれも、 cAMPの P，[ ~I: 促進系に関 tJ- していることになる。
第犯行では、 PGI 2受 ~i本に対しておt 不11 性と選択性が i:・~ <
、 イi
効な光親和性
2
)、これを用いて静化肥泊細胞および血小板に
4
5
J放リガンド APNI
Cを開発し 3
2
+
]
iの 上 昇 を 起
C
a
2
が直接、 [
ところで気管、心房や脂肪組織において、 PGI
1
) AP
おける PGI
2
受谷体を同定した 3
NI
Cの母体であるイソカルパサイクリン
) 紛化肥満細胞においては、第 3
0
.
S1
節の鮎来よ
こすことが示唆されている 5
は
、 PGI2
受容体に対する親不1t
。 ω鎖
f
Jく、化学的にも安定な化合物で あ る
lが 1
り、イロプロスト単独の刺激によっては、 [Ca2 +)i の I~JI・は制採されていない
に兆 1
l
J
f
.
詩人した 剛 山は、上述の αj
j
'
[
をa
に
I
J
tl:標識官能必を i
zi
d
o
p
h
e
n
a
c
y
le
s
t
c
r
2
+
動
(
(
接
、 Ca
GI
2
叉・容体が ，
したがって少なくとも焔化肥満細胞においては、 P
7
)から、
変えた P
1;導体の親和十t
の活しい低下の例 5
GE2，
v
主系は存主しないものと忠われる
同系を活性化する情報伝i
jが 布 利 で あ る と 与 え ら れ た か ら で あ る 。 総 化j
3H]
イロ
する )
肥満細胞膜への [
α
i
j
lよりも ω鎖 を 修 飾
プロスト鮎令に対する阻お作川の l
3耐f)は、
IC
5
0=
C50の比較から 、 APNIC(
総 々 な 受 容 体 を 研 究 す る 日的で、
J
l
不日性4
3
;
i
aリ ガ ン ド が 用 い ら れ て い
J
tf
!
主体 のイソ カ ルパサイクリン (
I
C5
I
C5
.
3nM)
0=32仙のや、 イロプロス ト(
0=9
る 30) 。このようなリガンドの開発においてもっとも，f(~ なよ，'.(~;t ，母体となる
l
j
jい親 和 性 を有 しており、 PG受 容体 に対する光親和性標 識 リガンド
るI
を卜~ 1
11
リガンドの構造に修飾を加えて、光親和性標識官能)};;を導入することにより、
としては、もっと も高 親不I
1:を有する 化合 物 の 一 つ で あ る と 言 える 。
J
t
h
i小限にすることで あ る。
3
H]
イロ
[
31
1]
APNI
Cの癌化肥満細胞膜に対する結合の Kdは4.
7nMであり 、 [
、
PGの受容体 に対する光親和性標滋リガ ン ドは、これまで多 くの報告があ り
プロストでは 1
0.
4nMであった。イロプロ ス トは 1
位 のm
6
e
t
h
y
l基 の立体 配置 が
2の
と くに強力なアンタゴニストが符ら れ、 それを出発原料に利用 で きる TxA
16Sと1
6
Rの2つの s
t
e
r
e
o
i
s
o
m
c
r
の混合 物 で あるが、 PGI
受符 体 に対 す る 親 和性
2
受容体に対する親和性と選択性が低下することを、
-32-
世
33-
は1
6
S
i
s
o
m
e
r
が高く、 16R品 omcrの親和性は小さいことが知られている 5
9
)
。実
吸治し、粕裂された貸t.1
1
'
l
の SOSPAGE
後の染色の結果も、非常に拡がった
験にJlJいた [
3
H]
イロプロストは、 1
6
S
i
s
o
m
c
rと16R
・
i
s
o
m
c
r
の 比 が お よ そ 4:6の
バンドであること 14)などが知られていることによる。
泌什物であるので、主に PGI2~立・符体に結合する、 16S-isomcrの [3H] イロ プロ
受符体の分子む;は、 [
プタの血小板の PGI
3H]APN
ICを用 いた結果から、がJ
2
ストにおける Kdは、約 4nMである考ーえられる。この 1
i
1は [3H ]APNIC の Kd1~I
51k
Daであった 。 またヒトの f
f
l
L小紋を用いた予備的な災験から、その PGI受
2
致する。このことは州者のリガンドが、 1
1
1
J ・の受容体に結合してい
料体の分子位は、 45kOaであった 。これら 3つの PGI受 谷 体 の 分 子 量ーの追い
2
とよく
a
は、純あるいは組織の述いによるか 6
3
)、おそらくイ手伝する、結鎖の分子むの
ることを示l
唆するものである。
鋭化肥満細胞膜に結合した [3H]APN
ICの放射活性の約 80%が
、 SOSPAGE
後
追 い に よ る も の で あ る と 思 わ れ る 。 一 点 PG0
2受 容 体 が 、 り ん 酸 化 お よ び 脱
のゲルの 43kOaのバンドから 1
1
l
1
1
31.されたことから、光!照射による親和性成品
りん般化されることによって、その機能が調節されるということが報告され
以泌により、共有名i
j介 が 形 成 さ れ る 効 率 は 、 約 80%であると考えられる。
桝
的
4
め
)
入
、 PGI
ており 6
受
手
符
千4
俳
体
+
本
;
も
削
￨
川 似ぷにりん般化きれる n
2
APNICのこの値は、 TxA2
1
;
]等以上である 5
2
.
5
5
))
受作休の光親和性結晶尖験と [
分 r-;此4:l』カカが{穴
y ~，なるもう
1
¥されたの kOaのバンドが、三1
:
[
3H]APNICによって、品、化肥満細胞膜に検 1
thAの PGI2u先 導 体 に よ り 選 択 的 に 消 失 す る こ と は 、 こ の バ ン ド の 蛋 (111か
PGI2を特民的に紡令する i
t
i
'(1
1
'
1であることをぶしている。しかしこれだけで
は PGI2
PySによ って減
受容体で、あるとはパえないが、 43kOaの バ ン ド がGT
ω
4
+
.つの(1吋
ザ
B
J
能f
刊
竹
1
:
北
と
し
て
、 りん般化のイ布i
無や程度が違うこと
により、 SOSPAGEの 際 に 移 動 広 が 見 な る た め で あ る と い う こ と が 考 え ら れ
る。
叉・容体の分 J
PGl2
.rl~~ に I却する研究には 、 [3H) イロプロストを用いた ta屯ct
s
i
z
ca
n
a
l
y
s
i
sにより、神経融介細胞 NCB・
20で 8
3kOaであるという報告の)や、ヒ
したことは、この蛍白質がG1
.
f
i'
1
1と会合体を形成する、笠谷体であることを
受容体を CI
J
-1
(
I
L
/
j
叶がの PGI
IAPSで n
n
B化し、ゲル地i
l
lカラムクロマトグラフイ
2
受容体であると与・えることができる。
強くぷすものであり、 _
!
.
'
H
P
GI
2
ーにより制べた結果、 1
5
0"
D
a以上であったという報:りがある 1
1
)
。これらの
a
のバンドは、分[-@:マーカーと比べても明らかにプロ ー ド
ところで43kD
抑半分子;誌は、 APNICをJ
I
Jいて SDSPAGEにより求めた伯よりもかなり大き
であるが、この原肉は、 PGI
2
受容体がおそらく者j
t
d
t
r
!
?
tであるためであると
く、受容体蛍 (
1
1
1と他のイ"
1らかの蛍ド 1
1
1との、会令体の分子むが求められて
1
1として、州化肥満細胞にイ子化する PGE
受符体には、
忠 わ れ る 。 そ の 時1
f先
日
いるのではないかと思われる。
される N-g
l
y
c
o
s
y
l
a
L
i
ons
i
t
cが 2ケ所あること 1
7
)、新釘i
イ
子J
!X:静止;阻害剤ツニカマ
イシンを用いた実験から粘蛍1
1
1
1であり、 WGA-agaroscに 吸 着 す る 性 質 が あ
第 3節においては、肥満細胞における PGI
受 容 体の役割について、トロン
2
6
2
)、 ま た ヒ ト お よ び マ ウ ス の 血 小 板 の
る こ と が 明 ら か に な っ て い る こ と ω・
ピンあるいは ATP
2
刺 激 に よ り 芯 起 き れ る 細 胞 内 Ca
+動 J
lに対する、 PGI2受 容
TxA2
受容体蛋白質にも N
g
l
y
c
o
s
y
l
a
t
i
o
ns
i
t
cが 2ケ所あり 1
5
.
1
6
)、 WGA
a
g
a
r
o
s
cに
5
)
0 PGI
体による調節作用について品ベた 3
受容体刺激により、
2
-34-
-35-
トロンピン刺
2
激時に起こる細胞内 Ca
+動員およびI
P
産生が阻害された。cAMPにより、 I
P
3
3
は、たとえばトロンピンの刺激によって起こる、ヒスタミンなどの炎症メデイ
産生が低下することが、いくつかの細胞で報告されている 66品)。 またトロン
エーターの分泌を抑制するものであると考えられる。 一例として、炎症アレ
ピンによる血小板の活性化が、 cAMPにより阻害されることが知られており、
ルギーが起こる場合に、血管内皮細胞が産生する PGI2が、肥満細胞の PGI
2受
ルI
P
依存性りん般化酵ぷが、ある特定の蛋白質をりん酸化するこ
これには cA
容体を刺激し、肥満細胞からの炎症メデイエーターの分泌が抑制されること
とが￨児号していることが報告されているが69・71)、詳細な機構は明らかにはさ
レギ一反応が鎮静化するという、細胞聞の相互作用の存在が
によって、アレ J
れていない 。
想定きれる 。
2+流入に対する、 PGI受容体による促進作用の
一方
、 ATPによる細胞内 Ca
2
機構は不明である 。 ATPはおそらく P2
受符体を介 してイオンチャンネ jレを活
以上、第 l章の実験結果は、肥満細胞の PGI
2
受容体を標的とした、新たな
抗炎症性薬物治療薬の開発における、基礎的な知見となるものと思われる。
2+
性化して、 Ca
流入を促進し、 I
P3民生を I
村人;させると考えられるが、この際
2+に依存している 。 しかし
P3産生は、 ionomycinの場合と [
[
i
]
緑に細胞外 Ca
のI
受容体の刺激により変化がないことから、
ionomycinによる I
P3産生は、 PGI
2
2+受容体刺激の作用点は、 ATPによる Ca
2
Ca
+流入系に特異的な部位であると
考えられる 。
2
トロンピンあるいは ATPは、肥満細胞において異なる Ca
+系を動員して、
ヒスタミン分泌を促進すると与えられるが、 PGI2受容体刺激による抑制ある
2+
勤只系が活性化されているかによって異なる
いは促進作用は、いずれの Ca
ことになる 。
PGl
2受容体は、刺激に応じて主に血管内皮細胞において産生され、血小板
凝集放出抑制作用や血管平滑筋弛緩作用など、循環動態の恒常性の維持に重
要な役割を果たしていることはよく知られている。また肥満細胞において、
細胞内 cAル伊の 上 昇 が 、 ヒ ス タ ミ ン の 分 泌 を 抑 制 す る こ と が 知 ら れ て い る
4
2
-44)。本研究において明らかにした、肥満細胞に存在する PGI
2受容体の刺激
-3
6-
-3
7-
吾o
第 2章
白岡
受存体とその↑古報伝達系に
第l
章においては、癌化肥満細胞における PGI
2
癌化肥満細胞の PGE受容体刺激に対する脱感作の解析
アゴニストによる刺激を受けた細胞が、時 I
I
Uの経過に伴って、そのアゴニ
刻
￨ して、
ストに対する反応性が滅剥するという現象が観察される場合があり、この現
(
1
) マウス焔化肥満細胞において、 Gsを介してアデニル般シクラーゼを活
民感作は、細胞が述続する刺激に対して
象は細胞の脱感作 と呼ばれている。 j
性化する、 PG I2~立・谷体かイ{イE することを IYJ らかにした。
応符を減弱あるいは停止する機構であり、別聞の環境に適応するための生体
(
2
) PGl2
受符体に %.R..f日性および選択性の l
f
:
iい、光税不1性標識リガンド APNIC
f
(安な調節以応である。アデニル般シクラーゼの活性化に関与する受容体
のi
受容体を分離・
を開発し、これを J
I
Jいて鋭化肥満創出血に分子 ;μ3kDa
のPGl
2
7
3
)。 肥
の脱感作については、。アドレナリン受容体でよく，調べられている 72，
l
i
i
J定 し た
イ
・(:が刻￨られているプタ ]
また PGI2
f
l
L
小紋股では、分
叉・作体のイ1
f泣51kDaの叉・存体を判定した 。
irli A:1II胞の PG 叉・容体の脱~~作については、 PGD 2 受容体のりん般化と脱りん酸
化が脱感作に関与するという報告があるが64)、PGE
受容体での詳しい検討は
(
3
) PGI2'又・作付C~ltl~立は、創111抱いJcAMPの I百六を介して、
トロンピンによる
Ca2 +動l~ を抑~Iìlj したが、単に ATP による Ca 2 +動jl を促進した。この作川は、
されていない。
'
戸においては、 PGE1による受存体刺激により脱感作が起こる際に、受
第2
PGI2'~託行体J;xJî:.，による肥満細胞の機能訓節の多似性を IJミ唆するものであ
容 体 がPGE1と安定な紡令状態となることが凡っかり、この安定な PGE1と受
る
容体の結令外を粘製することにより、 PGE
叉・符体の j
悦感作機構を解析するこ
とを ，
.
s
t
み
た。
-38-
-39-
〔癌化肥満細胞膜における [
3
H]
P
GE1と受容体の安定な結合状態の形成〕
ol
C
で刺激すると速やかに cAMPを産生し、 その細胞内
癌化肥満細胞を PGE1
100
壱
c
.
'う
。孟
レ型の変化をしながらもとのレ
cAMP
濃度の増加は、 l分以内に最大となるべ l
w
ベルに戻り、 PGE1
が存在するにも関わらずcA
ル伊が産生しない、 いわゆる細
IE
C
>
(
!
) C
.
Q. ol
円
、』
50
.
.
.
.
.
.
.
.
.
竺
=
に対する脱感作が起こる(図 1
胞のPGE1
8
)
。
旦長
.
ニ
‘
ーυ
ω
auT
一oEa)a24υ
(
ω
=
ω
ω
ω
O士
nu
0.
C
J
)
30
0
0
60
120
I
n
c
u
b
a
t
i
o
nt
i
m
e(
m
i
n
)
F
i
g
.1
9
. Time-course o
f[3H1
PGE) binding t
o and di
s
s
o
c
i
a
t
i
o
n
frommembrancf
r
a
c
t
i
o
n
s
.
3
1H]PGE (
5凶 1)w
i
t
ho
rw
i
t
h
o
u
t(
・)c
x
c
c
s
su
n
l
a
b
c
l
c
dPGE wasa
d
d
c
dt
o
20
，
10
，
c
. 10， 60， or120minaftcrthc
mcmbrancf
r
a
c
t
i
o
n
sa
n
di
n
c
u
b
a
t
c
da
t37o
。
。
.
，unlabclcdPGE，
(5μM)，w
i
t
h(
.
A
.)o
rw
i
t
h
o
u
t(ム)
a
d
d
i
t
i
o
nof[
3
H]PGE
20
40
60
Incubationtime(min)
・i
nducedcAMP ac
c
umulat
ion i
n
ecour
s
eo
fPGEt
Figure18. Tim
e
l
ls
.
mas
t
o
c
ytoma c
∞ylomacclls(2x106ωlls)wereincubatcda
t37o
cf
o
ri
n
d
i
c
a
t
c
dt
i
m
ei
n
Mぉt
s
n
d cAMP accum
u
1a
t
c
dw
e
r
cm
e
a
s
u
r
c
da
t
h
ep
r
e
s
e
n
c
eo
f 5.5μM PGE1a
c
xt
.
d
e
s
c
r
i
b
e
di
n山et
100μMGT
P
'
y
S
. wasa
d
d
c
d
.f
o
l
l
o
w
c
dbyf
u
n
h
c
ri
n
c
u
b
a
t
i
o
n
.A
l
lv
a
l
u
c
swc陀
c
o
r
r
c
c
t
c
df
o
rt
h
cn
o
n
s
p
c
c
i
f
i
cb
i
n
d
i
n
ga
n
da
r
cc
x
p
r
c
s
s
c
da
st
h
cmeanf
o
rt
r
i
p
l
i
c
a
t
c
c
x
p
c
巾n
c
n
t
sw
i
t
hv
a
r
i
a
b
i
l
i
t
ya
t<3% of山cm
c
a
n
.
([3H]PGE1
一受容体結合体の部分精製とその性質〕
3
次に、 総化肥満細胞膜 と1
、 370Cで60
分間インキュベ ー ション
H]pGE1を
受容体の[3
H]p
GE1
図1
9に示すように、 370Cにおける縮化肥満細胞膜のPGE
した後、形成される安定な [3H]PGE，と受符体の結合体を、 6%ジギトニンで
2
0
分の時点で非標識の
0
分
、 60
分
、 1
結合は、飽和性に増大した。 つぎに、 1
u
J溶化し、
0
分の場合には90%以
PGE1
3H)
PGE，の量を調べると、 1
を添加して、解離する [
ySの結合活性とともに
(
図2
0
)。その結果、 [3H]PGEjの放射活性は、 [35S]GTP
上の解離が見られたが、 60
分または 1
2
0
分後では約70%が結合したままであっ
溶出される、 分子泣200kD
a
以上の極分と、 67kDa
の分子量マ ー カーである
の解離する畳は増大した
3
H]PGE1
た
。 PGE1
に加えてGTP'ySを添加すると、 [
BSAよりもやや前に溶出される四分、 およびもっとも低分子側に溶出される
2
0
分で加えた場合では、 50%から 60%が結合状態、にあった。
が
、 60
分
、 1
画 分 に 分 か れ た 。 この最後の回分は、 受 容 体 に は 結 合 し て い な い 遊 離 の
世
40-
U
1t
r
o
g
e
lAcA44ゲ lレ減過カラムクロマトグラフィーにより分画した
-41-
Bされる (
I
f
i
j生
子は、
であると考えられる。 また BSAよりもやや前に浴 t
[3H]PGE1
生やかに減少する
不安定な t
J
j
令状態にあって、 これ以降の粕裂の操作中に、 i
ものであった 。 [3SSJGT町S の結合活性とともに溶 n~ される分イイ止2∞ kDa以 上
肥満細胞の PGE受符体は糖蛋白質であり、 WGA-agaroscに税不[J性が あ
地 化j
ることがう土かっていることから 62)、 つぎに WGA-agaroscカラムを別いて粕製
]
21
) その t
f
i来
、 0
.
2M GlcNAc によって浴出される山j~} に [3HJPGE 1 の
した(l1{
の回分について、 さらに柿製した。
放射的性と、 [3SSIGl内Sの結合活性が認められた。
10
40
20
0
10
一
60
Y{E こoEa)
人
A
20
C
lv
100
0
.
4
。c壱 玉 虫 色トOBS]
u-ド@
lv
u
U
N lv
-NM
N
ぷOO O
300
l
-
コODF凶O 仏 {ヱ 円]
﹄
)
空﹄
EE 二O E
500
40
30
20
Fractionnumber
+100
5
0
.
2 ~
。
口
E 80
。
0
40
.0
w 20
c
.
.
O
Z
c')
0.
8
a
.
3
て3
コ
。
E
E 60
c
1.
0
E
4 。
01
。
01
0
0
tt
2
1
01
5十
.0
t
巳
c
.
.
ト
ー
O
(/)
40
20
Fract
i
o
nnumber
o~
0.
6
I
0
∞
N
g
0.
4
0.
2
。
F
i
g
.2
0
. l
J
lt
r
ogelAcA44 c
o
lumn chromatography of di
gi
t
oni
nsol
ubi
li
1
.c
d PG Et r
ecept
o
r
s
.
F
i
g
. 21.、VGA-agar
osecol
umn chromat
ography ofPGEtrecep
tors
.
[
3H]
p
GE1bmding a
C
l
1v
i
l
y was s
o
l
u
b
i
l
i
z
c
d wiU
1 6% d
i
g
i
L
O
n
i
n(
2
0 mg of
官l
CP
p
r
o
l
c
in
/
ml)a
sdc
s
c
r
i
b
c
di
n山Cl
c
x
landwasf
r
a
c
t
i
o
n
a
t
c
donacolumnofUhrogcl
1Cc
q
u
i
1
ib
r
a
t
i
o
nb
u
f
f
c
r. Th
c
a
p
p
l
i
c
dt
oaWGAa
g
a
r
o
s
ccolumnc
q
u
i
J
i
b
r
a
t
c
dw
i
l
hU
AcA44c
q
u
i
l
i
b
r
.
11
C
dwi出 山cc
q
u
i
l
i
b
r
a
t
i
o
nb
u
f
f
c
ra
lU
1Cnowr
a
t
cof6ml
/
h
. and
column was c
x
t
c
n
s
i
v
c
l
y washcd w
i
l
hU
1Cb
u
f
f
c
rand t
h
c
nc
l
u
t
c
dw
i
l
h0
.
2M
.
5 mlcachwcrcc
o
l
l
c
c
t
c
d
. 甘l
Cr
a
d
i
o
a
c
l
i
v
i
t
yof100μIofc
a
c
h
f
r
a
c
t
i
o
n
sof2
o
r
s
s
a
y
c
df
f
r
a
c
t
i
o
n was c
o
u
n
l
c
d(
・)
. An a
Ji
q
u
o
t ofcach f
r
a
c
L
I
o
n was a
GlcNAc. F
r
a
c
t
i
o
n
sof4mlwcrcC
O
l
l
C
C
1
C
da
n
dL
h
cr
a
d
i
o
a
c
t
i
v
i
l
i
c
sof100μIofc
a
c
h
cl
i
n
c(ー)
[35SjGT門S b
i
n
d
i
n
ga
C
L
I
v
i
!
y(
0)a
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
n山c t
C
XI
. Th
c
n
o
t
c
s
r
c
p
r
c
s
c
n
t
s出ca
b
s
o
r
b
a
n
c
ca
l280nmofc
a
c
hf
r
a
c
t
i
o
n
. A shadcdboxd
a
c
t
i
v
i
t
y(
0
)
. 百 cl
i
n
c(ー)r
c
p
ω
s
c
n
t
s山ca
b
s
o
r
b
a
n
c
ca
t280nm. A shadcdbox
f
r
a
c
L
i
onswhicha
r
cp
o
o
l
c
dands
u
b
j
∞tedω 山cncxlSICp(Fig.2り.
世
42-
∞lcd fraclions from U1C Ultrogcl AcA44 column chromaLOgraphy wcrc
f
r
a
c
t
i
o
nwcrcc
o
u
n
l
c
d(
・)
. Anauquotwas assaycd f
o
r[35SIGT内
包 binding
dc
no
t
c
sf
r
a
c
t
i
o
n
swhicha
r
cp∞l
c
d加 ds
u
b
j
c
c
t
c
dt
o悦 n
c
x
ts
t
c
p(
F
i
g
.2
2
)
.
-43-
さらにこの治 :
B
l
l
h
j分を、止;:水性カラム ;
1
1
{
本である p
h
c
n
y
l
S
c
p
h
a
r
o
s
cCL-4Bカ
ラムクロマトグラフィーにより村製した(
1
ヌ1
2
2
)0Lubrol-PXの滋出勾配により
i
制 Bを行なったところ、
3
5S)GT
Lubr
o
lPX08%の付近に 1
内Sの結介活性と と
次に、これらの粕製によって符られた画分中に存在する、 GTP
結合蛋白質
l
i
J定するため、 11
4C]5'-p-FS0
GEにより そ
をI
4BzGuoで標識を行ない、 SDSPA
の分チ量を求めた(凶2
3
)
。その結果、各精製段階の両分および‘最終のp
h
e
n
y
l
-
4Bカ ラムクロマトグラフ
Scp
ha
r
o
s
cCL
P
GE1
の政射活性が治 :Bされた。
もに、 [
3
H)
J
ーの Lubrol-PXの溶出陣i
分に、分子
，:(
:
60kDaの蛍I'I
P
Iが検出された 。 これらの結果から、
4
1
.
5宅
。
r
ー
ー
ー
(
.
e
。60
3
E
・
J
コ
也
h
g 40
。
。
K
c
。
。
0
.
4E
R
3
a
c
g
_
U
J20
。
]
する可能性があることが示唆された 3
6
)
。
ol
0
.
5
コ
a
o
M
結 合 蛍'
1
1
P
Iと会合
は、脱感作 した 状態に移行する際、未知の機能をもっ GTP
)
)
Q
.
.
ヱ
F
・司
-
，
0
.
8
=
E
。
一受容体結合体
PGE1
1
:
g ~ 0.2
。
Mr:kDa
94~
67 ~
.
.
.
.60kDa
c
n
O~
凶
d
20
40
F
r
a
ct
i
o
nnu円
、b
e
r
J
0
60
Fi
g
.2
2
. Phenyl
S
epharo
s
c CL・4Bc
o
lumn chr
omatogr
aphy of
43~
•
e
・.
同.
30 ~
PGEtreccp
tors
.
Th
ef
r
a
c
i
LonsofWGA-agarosccolumnc
l
u
t
c
dwi山 0
.
2M GlcNAcwcrcp
o
o
l
c
d
a
n
dappuωωacolumno
fp
h
c
n
y
l
S
c
p
h
a
r
o
s
cCL
・
48whichh
a
d民 cnc
q
u
i
l
i
b
r
a
t
c
d
20 ~
・
wi
出 山cc
q山l
i
b
r
a
t
i
o
nb
u
f
f
c
r
. 1
1
1
Ccolumnwa
sc
x
t
c
n
s
i
v
e
l
ywashcdandPGE1
A
r
c
c
c
p
t
o
r
swcrcc
1u
t
c
df
r
o
m出ccolumnw
i
t
ht
h
cg
r
a
d
l
c
n
tof0t
o1
.
0
% Lu
b
r
o
lPX
i
nt
h
eb
u
f
f
cr.官l
Cc
l
u
a
t
cwcrcc
o
l
l
c
c
t
c
da
n
d山cr
a
d
i
o
a
c
L
iv
i
t
i
c
so
f200μIo
fc
a
c
h
f
r
a
c
t
i
o
n wcrc c
o
u
n
t
c
d(
・)
. An a
l
i
q
u
o
to
fc
a
c
hf
r
a
c
t
i
o
n was a
s
s
a
y
c
df
o
r
[35S]GT
門S(
つ).甘l
Cl
i
n
c( )r
c
p
r
c
s
c
n
t
st
h
ca
b
s
o
r
b
a
n
c
ca
t280nm.
B
C
D
F
i
g
.2
3
. A
f
f
i
n
i
ty
-I
a
bel
i
ng o
ft
he GTPbindi
ng p
r
o
t
e
i
nc
o・p
u
r
i
f
i
e
d
witht
he[
31
1)
PGEt・bound re
c
ep
tors
.
Samplcst
a
k
c
na
tc
a
c
hp
u
r
i
f
i
c
a
t
i
o
ns
t
c
pwcrc a
f
f
i
n
i
t
y
I
a
b
c
l
e
dwi山[1
4
C
]
5
'
p
C
Xl.甘l
Ca
f
l
i
n
i
t
y
I
a
b
c
l
c
dp
r
o
t
e
i
n
sv
i
s
u
a
l
i
z
c
don
FS02
BzGuoa
sd
c
s
c
r
i
b
c
di
n出ct
，
a
u
t
o
O
u
o
r
o
g
r
a
p
h ofa
nSDSp
o
l
y
a
c
r
y
l
a
m
i
d
cg
c
la
r
cshown.
Lr
o
g
c
lAcA44; C
.WG
A
a
g
a
r
o
s
c
;
A.s
ol
u
b
il
i
z
c
c
lc
r
u
d
cmcmbranc; B
. Ul
D
.p
h
c
n
y
l
S
c
p
h
a
r
o
s
cCL4
8
.
・
-44-
-45-
考
察
あると与・えられる 。従って、 PGE1刺激による掛化肥満細胞の c
AMP
産生にお
ける脱感作状態への移行と、 PGE
受符体がPGE1との安定な結合状態に移行す
戸においては、組化j
肥満細胞の PGE
受容体の脱J
t
長作について検 討した 3
6
)。
知 2"
ることに、 おそらく関述があると与-えられる 。
r3H JPGE 1 と受容体を 1~1I与問インキユベーションすると、安定な結合状態に
受容体にも比牧的強い親不1性を有し
ところで第 l市において、 PGE1がP
GI
2
移行した。 これと同秘な結果は、大脳皮質、副腎髄質、赤血球、その他の椛
0・7 M
以下においては、 PGI2
受容体への
ている結果を作ているが、凶 5より 1
3H]PGE1と受容体
受容体においても報告されている 7
4
7
7
)
。 この [
益細胞の PGE
との結合は、
J
ト標識の過剰 ;
1
2のPGE1を添加 lしても解離しないもので、
おそら
く解雄定数および結合定数の比が 一定のまま、両_f;-ともに小さくなっている
"(Sを添加しでも、1.ef
eな結令状態が失われる
ものと与-えられる 。 さらに GTP
受存体に粘介し
GI
ことはなか った。 この ことは第 l市の実験でぶされた、 P
2
y
Sによって右しく促進された結果と比べ
た(
3H]
イロプロストの餅維が、 GTP
て人きく異なるものである 。
の範聞においては、
結合 h
iは小さく、第 2章において用いた [
3
H]
PGE1の数十品4
ほとんど P
GE受符体に選択的に結合していると与・えられる 。
1
[
3
I
I]
PGE1とPGE受容体との結合体の 1
1
4
I製過れにおいて、 この受符体の蛋 (
イヒ学的な f
h
f
tを知 lる下掛かりとなる、 いくつかの有用な知見が符られた 。 ま
ずゲ J
レ協過カラムクロマトグラフィ ーによる分 I
l
f
l
iでは、 [
3H]
PGE1の肱射活性
は
、
∞
2 k
Da
P
JIの l
f
:
j分
r
;
止に溶 t
Hされており、
おそらく PGE受容体は、それ
以外の i
f
i白 質 成 分 と の 会 介 休 と し て 存 在 す る こ と が 抑 定 さ れ た 。 WGA-
'
1と会合する受容体においては、 GTPやその誘導体を添加する
-般に G蛍 1
と、受容体のよ';Jl見和性粘介がm~ することが知られている 78)
Gsが関ワ-する
アデニル般シクラーゼ机性化系の場合、 まずアゴニストにより受容体が刺激
されると、 Gsのαサプユニット (
G
s
α
)から、それまで払介していた GDPか進雄
して、代わりに GTPが結合する 。GTPが結令した G
s
α は活性化状態になり、
レ般シクラーゼを活1'1:化す
y
サプユニットと解離して、 アデニ J
受平手休や Gsの s
'
:
1
が大きく減少して、
る。 Gsと解離した受符体は、 リガンドに対する親不11
a
g
a
r
o
s
cカラムに吸おする刊質は、料$J'
l
を有していることを示しており、第 l
1
2の与・然で述べたように、
2
)
0Ph
c
n
y
l
S
c
ph
a
r
o
s
c
致する 606
これまでの報告と -
J
t1
1
l
が疎水ゲ1
:
蛍向質であることを示してい
CL・
48カラムへの吸おは、 この蛋 '
る。 .JI，J べた ~r~OH において、 JI: イオンtI.界面ii百判t斉IJ である しubrol-PX の波度勾配
>
[のLubr
o
1
-PXではじめて溶出さ
による治/Hがも っ ともイi
幼であったが、 高波 J
:
I
れ、ことが予怨される。
れたことから、 この受裕外の疎水性が .
市 .
a
Jι
容体からリガンドが解約する 。
刈分にはい
各カラムクロマトグラフィーの [
31
1
)P
GE1の政射活性のピークの l
3
SSjGTPyS結介前性が検出された 。 このことは PGE受 容 体 が、何ら
ずれも、 1
GT
町Sを加えても、安定にリガンドを鮎令している紛化J巴渦細胞の PGE受
容体の状態、は、通常の受容体ー Gs
ーアデニ J
レ般シクラーゼ系の相互作川の椋
式では説明されないもので、 アデニル酸シクラ ーゼを前性化 でき ない状態に
-46-
かの GTP
結合蛍 (
1
1
1との会令体として存在することを I
J
ミ
I
唆するものである 。
[
I4C
]
5
'
pFS0
B
λGuoを
)
J
Jいた親不II'~H:~ 誠実験により、 60 kD
aのGTP
結合間性
2
を持つiIfÎJ1~ と会介している可能性が示唆された。 GTP粘合蛋白質としては、
-47-
Gs、G
iなどの分子 ;
1
:
-がおよそ 405
0kDaのGiIf白や、 r
託
(
]
質79)などの分子孟a
s
i
が20
30kDaの、いわゆる低分子性G蛍 自 80)がある
-
京
芸
毛色
己問
Gs、Giは掛化肥満細胞に
9
.
8
1
)
。また i
位近、モ l
レモットおよびラット肝より、分子此
も存イ1':している 2
∞
ゅaおよび74kDaのGTP*h令 蛋 ['111が凡つか っており 82・側、多様な分子量
2
1
5
2
t
pにおいては、
f
i
l
a
i化J
日
'
)
i
t
l
l
l胞の PGE受作体刺激に対する脱感作機仇に
巴I
?
1
￨刀して、
の分子 5
結合蛋 f
'
J質が知られてきている。しかし、 6
0印 a
2のGTP結 合
のGTP
(1)総化 j
肥満剥I
I
J
Y
dにPGl
ユlを作JIjさせると、細胞内 c
:
j
:は 1
川P
A1
分以内に i
止大
結合蛋白質であると忠われる。
蛋白質の報告はなく、これは新規の GTP
以上、第 2市においては、脱!長作状態に移行する際に形成されると与えら
の安定な結令状態を見いだし、その部分粕製を
れる、 PGE
受符体と [3H]PGE1
行なうことにより、受容体蛍向質としての性質の一 部を
I
Y
lらかにし、脱感作
-のGTP結合蛋1'1
受符体が、新規の分子 U
質と会合すること
状態において PGE
となるが、すぐにもとのレベルに以る、脱!長作現象が J~ い/1\された。
(
2
) そこで、細胞膜[
I
h
j分と r
3
1
1j
PGEをインキユベートし結合反仏、を調べる
1
1
と、経1
主的に、 PGE1
とGTP
ySでも
P
f
O悲しない、
安定に結合した 1
3H]PGE
1
U
料介 J
l
f
i
がi
大 した
n
(3)この安定な PGE1
ー受作 f
f
:
十
、
を 6%ジギトニンで口 作化し、村々のカ
払イ7
1
ラムクロマトグラフィー (
U
h
r
o
g
c
l八cA4、以'
G
A
a
g
a
r
o
s
c、p
h
c
n
)I
S
c
p
h
a
r
o
s
c
を示唆する結来を符た。
;
4B)により i
CL
・
S
う〉粘出した 。
l
.
(
4
) ~!:'られた II h j 分には (35SIG1 ・ PyS の紡介前十 1: があり、 [ 14
CJ5 ・ -p- FS0 2 BχGuo
により t
川よされる、分
j
:
_
60"
r;
D
aの折焼な GTP
払令長L
1
1
1が検/l¥された。
これらの tillJ44 から、 PG ヒ叉・ 2手イイくは!日 ~!~~fl: した状態に移千
J
能を持つ GTP*r'i イ汁長r' 11'i
4
8-
と会イ干することが /1~ 唆された。
-49-
する際、本支11 の機
実験の部
〔試朱、他〕
イロプロスト
AmcrshamCo叩
・
・mc
y
lc
s
t
c
r
、カルパサイクリン
PGEl
L
h
2
2、 PG0
2、 PGF
2
α 、 PGI
、 PGE
(
1) 動 物 お よ び 試 薬
フナコシ楽品
'ぷ!技にJI1いた動物およびぷ柴の購入先は、次の通りである。
寸P
GTP、dGTP、T
ヤマサ醤油
i
g
i
l
o
n
i
n
GOP、GMP、d
取JJ
t
純楽
dGOP、cGMP、GppNHp
Sigma
、 AppNHp、 AT
GT町S、GOPsS、 ATP
内S
BochringerMannheim
AD
P
Ko
h
ji
n
[
3H]イロプロスト (
1
4
.
1Ci/mmol)
・2
F
u
r
a
/AM
H1て
1
2
51
]a
C
y
c
l
i
cAMP[
s
s
a
ysystcm
1
1
1
cNAc、WGA-agarose
'
11
広tjJよ (PT)、 Gl
/1.. 化学 L~
3f
1I
I
n
o
s
i
t
o
l(80・120Ci/mmol)
1
Thrombin
1\~'I1I製薬
Ul
L
r
o
g
c
lAcA44
LKB
〔動物〕
マウス
BOFl
1
1
5
水実験動物
プタ血液
京都中央省 pa 副 ~I=. 物街j 協同組合
〔ラジオアイソトープ〕
以上、 AmcrshamCo巾
・
Phcnyl-ScpharoscCL斗 B、 分
[
5
.
6
.
8
.
1
1
.
1
2，
14.15-3HIPGE2(
185Ci/mmol)
f
J
s
fマ ー カ ー キ ッ ト 円larmacia
レ(4-20%) TEFCO
SOS-濃 度 勾 配 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ J
3H)PGE (60Ci
6
/
mmol)
[
5，
l
o
l
c
c
u
l
a
rw
c
i
g
h
lmarkcr
Pr
c
s
t
a
i
n
c
dm
Bio-Rad
[15S)GTP
/mmol)
i
y
S(65C
EN311ANCE
OuPont-NEN
1
4C)Ouor
【
5
'p
-l
g
u
a
n
o
s
i
n
c
)
s
u
l
f
o
n
y
l
b
c
n
z
o
y
l
g
u
a
n
o
s
i
n
c(534.2mCi/mmol)
ク リ ア ゾ Jレ(液体シンチレーションカクテル)
平井テスク
GF/Cガ フ ス フ ィ ル タ -
WM~~
ートロセルロースフィルター
c
h
u
c
l
l
S
c
h
l
c
i
c
h
c
r&S
4Cl5・
BzGuo)
(
11
p-FS0
2
4
C
l
a
b
c
l
c
dm
2・20μCi
r
o
t
c
i
n
)
Mc
L
hy
l
a
t
c
d1
o
l
c
c
u
l
a
rwcightmarkcrs(
/mgp
l
_
l
4
C
)m
v
i
n
cs
c
rumalbumin，
c
t
h
y
l
a
t
c
d
p
h
o
s
p
h
o
r
y
l
a
s
cB，以)
([Mc山 y
j
t品を j
日いた。
その他の試支は、通常のh
V2で 人 予 吋 能 な 最 尚 純J
ovalbumin，c
a
r
b
o
n
ica
n
h
y
d
r
a
s
e
)
以上、DuPont-Ncw EnglandNuclear(NEN)
(
2
) 癌化肥満細胞の維持
は、 POl
マウス紛化肥満細H
包(masl
α:ytomaP81
5)
l
c
rN
l:
1(NationalCanccr
31
1
5
I)APNIC(
1
5Ci/mmoりは、小芥野 t~ 司博士、
APNICお よ び [
マウスのj
肱股内で経代維持して
I
ns
t
i
t
u
t
c，NIH)より提供されたものを、 BOFl
鈴木正昭博士、野依良治博 1
位 のs
5
t
e
r
eoisomcrの
:により合成され、また 1
分離は、伊藤誠て博
使川した
1
:により行なわれた。
6倒を無的的に腹腔注射し、 7日
P-815
細 胞 を BOFl
マ ウ ス に 2X 1
0
8
例)を肱腔より回収し、氷冷した PBSで 2回 洗 浄
後に期航した細胞(約 3X 1
0
して尖験に)fjいた。
泡数の，iI・数には、 Coul
社製の細胞数計測機(モデ jレZ
)を用いた。
剥I
t
c
r
J
-50-
-51
申
_
.
.
.
.
.
.
町
-
異的結合 11:は、車内イ~ IX.J，Î5 法に 1 ，∞0 倍量の非標識のイロプロスト、 PG~ また
(
3
) 癌化肥満細胞の粗膜画分および原形質膜画分の調製
:
1を氷冷下で 1
iなった
すべての符lI'
はPGE1を)
J
I
Iえることにより d
!IJ定した。また特異的結合此は、総結合 1
1
:
治、ら非
P別 5判I
J
H
;
包を 10m MT
r
i
s・HCl.pH7.
4
， 1m¥
l
lEDTA. 1
0m MMg
C
l2・1m M
特典的結令;止を I~~ しり|いて;lとめた 。
d
i
t
h
i
o
l
h
r
c
i
l
o
l
.0
.
1m MPMSF
および 20~V1 i
n
d
o
m
c
t
h
a
c
i
nよりなる b
u
f
l
訂正調I
J
J
J
包
i
I
:
伎
(
6
)
が 1X 1
08c
c
l
l
s
/
m
lに な る よ う に 懸 渇 し 、 Ul
t
r
a
s
o
n
i
c
a
t
o
r(
BransonSOnJC Powcr
n
Co・)を川いてJlli 波破砕を行なった
[
3H]APNIC結合活性の測定
∞μlの buffcrAllで 、 静 化 肥 満 細 胞 の 原 形 質 膜 両 分 (2∞μg)を 13nM
f
!
?られた細胞ホモジネ-t
'
を 1.000Xg
l
で 10分
I
l
l
J法'
L
、し、その l
引J
をさらに 26.000Xgで30分
!
日j
述心した沈殿を刷版
[3H]APNI
C(
2
0n
C
i
)と30<
C
、 60分 間 イ ン キ ュ ベ ー 卜 し た 後 、 以 下
幽-分とし、 1
0m MpOla
s
s
i
u
mp
h
o
s
p
h
a
t
c
.pH6
.
0
.
1m MEDTAおよび 10m MMg
C
l2
様のノi
法により測定した
f
f
c
r(
b
u
f
f
c
rA)に懸泊して)!jいた。
を合む bu
Mg
C
1
2を除いた b
u
f
f
c
rAをJ
I
Jいた 。
LI
I
G
(
5
)と同
ただし反応の停止およびフィルターの洗浄には、
また似 )I~ 1
'
{Jj史 11111 分の;州製は、担lJ~ I
l
l
j
J分 を 459
も(
w
/
v
)J.ii:軌を合む 20m M
T
r
i
s・I
IClに懸測し、この 1
.に 36%(w/v)庶杭を合む 20mMT出・ I
IClを i
T
O
:
1し
、
(
7
) アデニル酸シクラーゼ活性の測定
fM化 肥I
?
有利￨胞の羽 L
J
l
失1
(
I
1
j
分(約 20μg)または原形質朕画分(約 2μg)を
、 50mM
66.000Xgで60
分I
¥
I
J
述心してれJ'られた芥 I
f
l
Iをとり、 20mMTm
・
I
1C
Iで洗浄した
II~j分を以 )r~1J~ Jj~'f 1
:
l
i
j分とし、 b
u
f
f
c
rAtこ懸濁してJI)いた 。
Hcpcs-NaOH，pl
l8
.
0， 1m MEDTA， 10m MMgα2
， 1m Md
i
t
h
i
o
t
h
r
c
i
l
o
l， 1m M
IBM X，1mMAT
P，2m Mc
r
c
a
u
n
cphospha
t
c
. 2μgc
陀a
山1
Cp
h
o
s
p
h
a
t
ck
i
n
a
s
c
∞
(
4
) ブタ血小板の原形質膜画分の調製 14.l
S5)
43u
n
i
t
s
)およひ GTPとPGを合む 1 μ
lのb
u
f
f
c
r中で、 370C、 10分間インキユ
(
0.
プタ I
l
(
l
'
(
也
を 2α)Xgで 1
5分 H
J
l述心した l
二
日1を
、 1.000Xgで 1
7分 H
I1辿心する投
作を欽i【|絞り返して Ifll小1li を I'J'~製した。次に Ifll小.fk
ベートした後、 100μlの 10%l
r
i
c
h
l
o
r
o
a
c
c
u
ca
c
i
dを加えて反応を停止した
r5m¥1T出-IiCl. pH7.4.
次に
凍結融解を行なった後、 1.000Xgで 10分間遠心して t泌をとり、水を飽和さ
5m MEGT
人 1m Mb
cn/amidincHC
.
l0.
4
3mY
lP~1SF に懸制した後、起 1T波破
せた d
i
c
t
h
y
lcthcdこより t
r
i
c
h
l
o
r
o
a
c
c
t
i
ca
c
i
dを 抽 出 除 去 した。 f
f
jられた標品 I
t1の
砕をむな った。 fりられた紺IJYti ホモジネートを 27%(w/v)J.ìi:杭i子市誌の 1-. にjf(^~し、
cAMP~，:をAm crsham の cyclic AMP[
1
2
51
}a
s
s
a
ysystcmを用いて測定 した。
66.000Xgで60
分 間 法 心 し た 後 、 界i
国のJl!
I
J
分をとり洗浄し、以ドの尖験にJ
I
J
(
8) 光親和性標誠実験
いた 。
品紺￨胞または l
I
f
l
小 松 の 原 形 質 膜 回 分 (200μg)をb
u
f
f
c
rAqlで 1
3仙 4
州 化 肥j
∞Xgで
(
5
) [
3
H
]イロプロスト、 [3H]PGE
2および [3H]PGE1結合活性の測定
[
3H]
AP
NI
C(
2
0nCi
)
と 300C、60分間インキユベートした後、 300，
0
∞
1
0
0
μi
のb
u
f
f
c
rA!
r1で、 f
品化)肥満細胞の粗膜 l
i
l
l
I
分(
2 μ
g
)を20nM[
31
11
イロ プ
1
5分 I
U
j述心した沈殿を川ぴ、 b
u
f
f
e
rAに懸濁し、波長 25
40
0
1の紫外線を UVlamp
0
2
9n
C
i
)、5nMr 3 H伊G~(93 n
C
i
)または 5凶 ，
f[3H}PGE1
(
3
0n
C
i
)と37 C、
ロスト (
(
V
i
l凶 r
Lourmatmodc
lVL・6C
，Ccdcx，Fr
a
n
c
c
)を用いて 2cmの距離から照射した 。
60分間インキ ユベートした後、 氷 冷 したb
u
f
f
c
rAを2mlを加えて J
i
.応を停止し、
そ の 後 、 再 び300，
0
すぐに GF/Cガラスフィ jレターを用いて吸引滅過した。さらに b
u
f
f
c
rAでフィ
し
、 4-20%設 皮 勾 配SDSPAGEを行なった。電気泳動した後、ゲルを La
s
ky
ルターを 4悶洗浄し、フィルターの放射活性をクリアゾル 5mlを
J
l
Jいて、液
らの方法 86)によりフルオログラフィーを行なった。すなわちゲ J
レを水で 10
分
体シンチレ ーションカウンターにより測定し、 これを総結合 ;
1
:
:
とした。 非 特
ime
t
h
y
ls
u
1f
o
x
i
dc(
DM
SO)中 で 1
5分 2回 振 と う し 、 次 に 2
0
%
(
w
/
v
)
間、 d
∞Xgで 15分間遠心した沈殿を、
-52-
-53
由
4・
』ーー
SDSsamplcbuf
f
c
r
に溶解
(
1
1
) [3H]IP3産生量の測定
2，
5・
d
i
p
h
c
n
y
l
o
x似 o
l
c(
i
nDMSO)r
!
'
で1
5分間、さらに水で 30
分 2凶振とうした後、
また、屯気泳動後の
7c
紺J
I
胞を 1X 10
c
U
s
/
m1になるように!怒渇し、 2μC
i
/
mlの [
3H)
i
n
o
s
i
t
o
1と3
r
c、
ゲルを 3mm の 1lilti に切って、 Protoso1 を加えて 50 0C 、 111~1山インキュベートした
2
f
時間インキュペートして細胞を 4
1
1
μ 注した後、 1
IEPES-buffcreds
a
l
i
n
c
で 3回 洗 浄
乾燥させ、 -800CでX線 フ ィ ル ム に 約5日￨吋暴露させた
後、その放射的性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。
し
、 10m MLiC1を合む HEPES-buffcrcds
a
l
i
n
c中で 370C、 10
分間プレインキュペ
ー ト 後 、 試 薬 を 添 加 し て )x応を開始した。 T
r
i
c
h
1
o
r
o
a
c
c
l
i
ca
c
i
dを 添 加 し て 反 応
(
9
) 可溶化膜画分に結合した [3H]イ口プロストの解雛に対する GTP
ySの作用
を停止し、 [3HIIP3を8io-RadAG・IX8クロマトグラフィーを用いて分離し、そ
に関する実験
の放射的性を測定した 8
9
)
。
的化肥満細胞肢に [
3HI
イロプロストを結介させた後、 b
u
f
f
c
rAで洗浄し、 20
∞Xgで20分
m MCHAPSお よ び20%g
ly
c
c
r
o
1を合む b
u
f
f
c
rAで可溶化し、 400，
0
I
I
I
J辿 心 し た 。 件 ら れ た
(12) 細 胞 内 cAMP量の測定
n
I溶 化 1
.
i
N(2m1)をSupcrosc6HR fastprotcin1iquid
向調I
I
J
似 1X 106c
c
l
l
s
)を0
.
5m MIBMXおよび PGを合む PBS0
.
5m]中で、
約 化J出
.
2
5ml/minの 1
0m M
chromatographyco1umn(
1X30cm)(
P
h
a
r
m
a
c
i
a
)により、流述0
37OC~- おいて・定 n，j HlJ 刺激し、 0.5 m1の 10%l
r
i
c
h
1
o
r
o
a
c
c
l
i
ca
c
i
dを)
J
1
1えて反応を
CHAP
Sを合む b
u
f
f
c
rA で分 i叫した 。 12i 分 f-J，i唱に溶/Bされた画分を~め、その
停止した
以ト、 (7) と llij.t~ の方法を )IJ いて cAMPの定祉を行なった。
寸S
Iには 500μMGTP
ySを添、力1して、 300C、10分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 次
にNcgishiらの )
j法 87)に従い、 l
'
I
7
符化 l
l
h
j分のI'H]
イロプロスト結合;止を測定し
(
1
3
) [3HJPGE，結合受容体の可溶化
的化 Jl~?前創IJJ抱羽 u民凶分を buffcr 8 (
2
5m MT
r
i
s
m必a
t
c
，pH5
.
5，2m MEDTA)
たー すなわち、 u
Ji作化 l
I
I
l
j
分 200μiに40μlの 20mg
/
m1r
a
b
b
i
ly
g
l
o
b
u
l
i
nお よ び
3
r
c、 1時 IIIJイ ン キ ユ ベ
200μlの 30%(w/v)p
o
1
y
c
t
h
y
1
c
n
cg
l
y
c
o
l6，
α)0を合む b
u
f
f
c
rAを加えて混合し、 j
J
<
冷トに 10分
u
日
j
立i
r
i
:
後
、
GF/Cガラスフィルターを
mいて l
吸引独過し、
に40mg/m1になるように懸濁し、 20nM[3H1PGE)と
8%(w/v)
000Xgで90
分j
i
l
j
i
本心した 。沈殿を 6%d
i
g
i
t
o
n
i
nを合む b
u
f
f
c
rB
ー卜した後、 100，
こj
怒消し、 40C、 1
n
，
jm
Jインキュベートして l
リ・治化した後、 100，
000Xg、 90
分
L
p
o
1
y
c
t
h
y
1
c
n
cg
1
y
c
o
16，
000を合む b
u
f
f
c
rAでフィルターを 5
1
"
1洗浄し、フィ J
レター
1
:の政射活性を測定した 。
の述心により
2+濃 度 の 測 定
(10) 細 胞 内 Ca
"
J
i
?i化上7
，¥を付た 。
(
1
4
) 可 溶 化 [3HJPGE，結合受容体蛋白質の精製
，
jをc
1
.
.
(
1
3
)の I
I
J?持化1.
:
.
1l
q
u
i
1
i
b
r
a
l
i
o
nb
u
f
f
c
r(
2
5m MT
r
i
s
m
a
1
a
t
c
，pH5
.
5，2m M
1
1[
制I
J
H
包を HEPES-buffcrcds
a
1
i
n
c(
1
5m MHEPES-NaOH，pH7.
4
， 140m MNaC1，
4
.
7m MKC1，2
.
2m MCaCI2，1
.2m MMgC12・1.2m MKJI2P04，1
1m Mg
l
u
c
o
s
c
)
EDTA， 100m MNaC1， 0.02%d
i
g
i
t
o
n
i
n
)で、ド衡化した U
l
t
r
o
g
c
lAcA44 カラム
で 1X 108c
c
l
l
s
/
m
lになるように j
怒泌し、 3μMfura-2/AMと370C、 30分 間 イ ン
(
2
.
9cm，i
n
n
c
rdiamctcr
，X 84cm，550mりにより分画した。 [3H]PGE，結合受谷
キ ュ ベ ー ト し た 。 0.5%BSAを 合 む HEPESb
u
f
f
c
r
c
ds
a
L
i
n
cで 2
1
u
l洗浄し、
1j
1
1を合む 1
分を集め、 c
q
u
iH
b
r
a
t
i
o
nbuf
f
c
r
で 手 衡 化 し た WGA-agaroseカ
体蛋i'1
6c
HEPES-buffercds
a
l
i
n
eに 2X 10
c
l
l
s
/
m
lになるように懸濁し、蛍光スペクト J
レ
ラム(1.5cm，i
n
n
c
rd
j
a
m
c
l
c
r
，X 5
.
5cm，1
0m
1
)に 吸 着 さ せ た 。 カ ラ ム を 洗 浄 し
フォトメーター(Jasco，CAF-loo)を
J
l
Jい て 、 励 起 波 長 340nmお よ び 380nm、
た後、 0.2M G1cNAcを合む c
q
u
i
l
i
b
r
a
t
i
o
nbuffcd
こより、 [
3
11
]PGE1
紡令受容体蛍
蛍 光 波 長 510nmにより測定した 88)。
1
白質を治 /
l
lした c 次 に こ の 締 出 1
]
1
;分 を phcny1-ScpharoscC・
し48カラム (
0
.
9cm，
i
n
n
c
r
d
i
a
m
c
l
c
r
，X 3
.
1cm，2
.
0m1)に吸必させ、叫u
i
l
i
b
r
a
t
i
o
nb
u
f
f
c
r
で洗浄した後、
-55-
-54-
.
.
.
.
・
一
Lubrol-PX 0から1.0%の浪皮勾配により浴/11，した。
詞j
辞
(
1
5
) [35S1GTP
ySの結合活性の測定
上旬己(14
)の 各 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー の 面 分 の 一部をとり、 50凶 4
[35S)GTP
y
S(0.1μCi)を合む、 20m MTris-HCI，pH8.0， 100m MNaCl，25m M
MgCI2
，1m MED
TA お よ び 0
.
5m Ms
・m
c
r
c
a
p
l
∞ 由 加o
l
'
'
tで37 C、 1
1
1
与I
I
Uインキユ
ノド研究に際しまして、終始御親切な御指 '
{
fと御鞭拡を賜わりました、
点 都 大f
y
-築学部、
d
i川 j字数以・に・怯んで深く感謝いたします。
0
ベートした後、 [35SJGTPySの結合活性をニトロセルロースフィ jレター上に吸
引独過しておn~ し、その肱身、tii5 fl: を液体シンチレーションカウンターを JIJ い
また、.i.1~ ífi な御助~.fを 1f1 きました、京都大?公:学部、福井哲也助教授、
組岸学助手、 1
1本 た ば こ 比 業 株 式 会 社 l
返楽 L
i
i
従研究所、八浪公夫博士、
て測定した卯)。
神奈川大学理学部、斎藤光文教授に深く感謝致します
主主ーな御助
本 研 究 の 第 1れにおいて、イi
(
1
6
) [14C]5
・
-p-FS02BzGuoによる親和性原誠9
1
)
1
，
_i
i
G(
1
4
)の 各 1
可分を
1
4cI5・
62μMr
-p-FS02
BλGuo(
1J
.
1
C
i
)を合む、 75m M
Jを凶きました、大阪バイオサイエ
ンス研究所、伊j除 誠「
てi
事1:
・
に 、 ま た 光J
.
J
l
.
f
日
刊t
;剛氏化合物の合成を遂行され
T
r
i
s・I
I
C
I，pH7
.
5，1
2
.
5m MMgCI
.5m MEDTAq.で
、 1
50C、 3
M
}
I
I
I
Jインキュ
2.1
u
f
f
c
rを加えて )
x
J
.
じ・を停止した
ベートした後、 SDSsamplcb
10%の SDSPAGE
の後、ゲルに EN3HANCEを処理して、フルオログラフィーを行なった。
.
i
jFi~: 大 γ Jlll;:: r.IS 、 ~'1'依 H.dì 教綬、 IIiJ 学化学測定機器センタ一、
ました、才i
鈴木 l
En
(
{助教佼、 I
l
i
J学 !
I
J
I'
'
1
'l~'IS 、小芥野博 iiJ t
忠士に涼く感謝致します。
J
mきました、荻野主;:手学1:、佐伯谷i'[学士、
さらに本研究の ・-部に御協ノI
(
1
7
) 蛋白定量
蛍自定量は、 Lowry法 9
2
)および、 Bradford1L9
3
)に よ り 行 な い 、 牛 I
f
l
l
1
i!iアルプ
r7
:上、ならびに教不 1
1の )j々にほく御礼 11し '-，げます。
j
雄原イq
l
ミンを漂準 i
f
f
'
[
J
1'Iとして)fJいた
(
1
8
) SOSポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 (SOSPAGE)と分子量マーカー
SDSPAGEはLa
cmmliの )
j法 94Hこより、 10%ポリアクリルアミドゲルまたは
4-20%の浪皮勾配ポリアクリ J
レアミドゲ J
レを)1]いて行なった。分子量マーカ
ーは、 Pharma
c
i
aの分子区マーカーキット、 Bio
RadのP
r
c
s
t
a
i
n
c
dm
o
l
e
c
u
l
a
rwcight
4
C
_
標識分
markcrあるいは NENの 1
f
h
t
マーカーを用いた。
-56-
-57-
引用文献
1
6
) Namba，T
.，SugimOlo，Y.，H
i
r
a
t
a，M.，Ha
y
a
s
h
i，Y.，Honda，A.，
1
) Murayama，T
.，Kajiyama，Y.，andNomura，Y. (
1
9
9
0
) J.Bio
l
.Chcm.
265，4290-4295
Watabe，A.，N
c
g
i
s
h
i，M.，I
chikawa，A.，加d Narumiya，S
.(
1
9
9
2
)
Biochcm.s
i
o
p
h
y
s
.R
c
s
.Commun. 184， 1197-1203
，P
.R
.，McれZ，L
.F
.，a
n
dB
a
c
n
z
i
g
e
r
，N.L
.(
1
9
8
2
)C
c
l
l 30，
2
) B
c
c
h
c
r
c
r
243-251
.，Honda，A.，Hayas
h
i，Y.，N
c
g
i
s
h
i，M.，
1
7
) SugimolO，Y.，Namba，T
I
c
h
i
k
a
w
a，A.，a
n
d Narumiya
，S
.(
1
9
9
2
)1
.Bio
l
.Chcm. 267
，6
4636466
・
r
c
v
i
a
r
i
o
，F
.，Ghczzi，P
.， 恥:
j
a
n
a，E
.，and M
a
n
t
o
v
a
n
i，A.
3
) R
o
s
s
i，Y.，B
(
1
9
8
5
)S
c
i
c
n
c
c229， 174-176
.，O
a
n
i
l
o
w
i
c
z，R.M.，a
n
dE
1
i
n
g，T
.E
.(
1
9
8
8
)
4
) Nolan，R.0
.1
.
， K
orbut
，R
.，Oc
c
t
k
i
c
w
i
c
z
，A. (
1
9
7
8
)N
a
t
u
r
c 273，
1
8
) Gryglcwskl，R
765-767
.，G
r
y
g
1
c
w
s
k
i，R
.，B
u
n
t
i
n
g，S
.，and Y加 e，
1
.R
.(
1
9
7
6
)
1
9
) Mon
c
a
d
a，S
r、~aturc
Mo
l
.Pharmaco
.
l 33，650-656
Iannigan.G.E.and W
i
l
l
i
a
m
s
，B.R.G. (
19
9
1
)S
c
i
c
n
c
c 251， 204-207
5
) l
.a
n
d Mamcll
，L
.1
. (
19
9
1
)B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a 1083，
6
) Smith，W.L
263，663-665
2
0
) Kadowilz，P
.1
.
， C
h
a
p
n
i
c
k
.B.M.，F
c
i
g
c
n
.L
.P
.
.f
lyman，A.L.
.K.，a
n
d Spannhakc，E
.W. (
1
9
7
8
)1
.App.
lP
h
y
s
i
ol
. 45，
Nc1son，P
408-413
1-17
1
9
9
1
)B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a 1083， 1
2ト 1
3
4
7
) O
c
W
i
t
t
.O
.し (
2
1
) Karim，S
.M.M.a
n
dF
i
1
s
h
i
c，G.M. (
1
9
7
0
)L
a
∞11， 157-159
1
9
9
1
) Am.J
.Physio
l
. 260，L13-L28
8
) S
i
g
a
1，巳 (
2
2
) Karim，S
.M.M.a
n
d Sharma.S
.O
.(
1971
) Lan
∞t2，47-48
9
) R
o
b
c
r
t
s
o
n
.R.P.(
1
9
8
6
)P
r
o
s
t
a
g
1
a
n
d
i
n
s 31，395-411
o
n
i
s
h
i，Y.，Wakatsuka
，H.
，Miyakc
，H.，Ko
凡 S.
，a
n
d
2
3
) Suga，H.，K
.H
a
r
t
z
c
l
l，C.1
.
， a
n
d Dc，B
.(
19
8
5
) AdvP
r
o
s
l
a
g
1
a
n
d
i
n
1
0
) Andcrscn N.H，
c
u
k
o
ll
Ic
nR
c
s
. 14， ト 43
lllfomboxancL
1
1
) T
s
a
i，A・L
.，I
Is
u，M-J.，Y
i
j
j
c
s
w
a
r
a
p
u，H
.
.a
n
d Wu，K.K. (
1
9
8
9
)
1
1 (
1
9
7
8
)P
r
o
s
l
u
g
1
a
n
d
i
n
s 15，907
H
a
y
a
s
h
i，¥
2
4
) P
u
1
k
k
i
n
c
n
.M.O. (
1
9
7
8
)P
r
o
s
l
a
g
1
a
n
d
i
n
s 15， 161-167
c
h
i.
i
la
w
a
.A.，andTomila，K. (
1
9
81
)
2
5
) Yat
s
u
n
a
m
l
.K ，I
Biochcm.Pharmaco.
l 30
，1
325-1332
1
.B
io
1
.Chcm. 264，61-67
a
n
i
g
u
c
h
i，S
.，A
r
a
t
a，Y.，
1
2
) Walanabc，T.，Shimizu，T.，Nakao，A.，T
Tcramolo，T，Scyama，Y.，Ui，M.，a
n
d Kurokawa，K. (
1
9
9り
s
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a 1074
，3
98-405
.，Go1dync，M.，Granstrom，E
.，Hambcrg，M.
，
1
3
) Samuc1sson，s
l
IammarSlrom，S
.，a
n
d Ma1mstcn，C
.(
1
9
7
8
) Ann.R
c
v
.Biochcm. 47，
c
hikawa，A.，andTomita，K. (
19
8
3
)P
r
o
s
l
a
g
1
a
n
d
i
n
s 26，
2
6
) Miλuno，Y.，I
785 795
四
2
7
) l
Ia
s
h
i
m
o
l
o
，1
1.
，N
c
g
i
s
h
i，
ルf.
，a
nd I
c
h
i
k
a
w
a，A. (
1
9
9
0
)P
r
o
s
l
a
g
1
a
n
d
i
n
s
9
1 50S
40，4
四
2
8
) Ncgishi.M.，l
Ia
s
h
i
m
l
o，H.，Y
a
l
s
u
n
a
m
i，K.，Kurozumi，S
.，a
n
d
1
9
9り P
r
o
s
l
a
g
l
a
n
d
i
n
s42，225-237
I
chikawa，A. (
997-1029
.，Nak吋ima，M.，H
i
r
a
t
a
，M.，Okuma，M.，F
u
j
i
w
a
r
a，M.，and
1
4
) U
s
h
i
k
u
b
i，F
Narumiya，S
.(
1
9
8
9
)1
.B
io
l
.Chem. 264， 1
6496-16501
1
5
) H
i
r
a
t
a，M.，I
laya
s
h
i，Y.，U
s
h
i
k
u
b
i，F
.，Yokota，Y.，Ka
gcyama，R
.，
N
a
k
a
n
i
s
h
i，S
.，a
n
d Narumiya，S
.(
1
9
9
1
)N
a
t
u
r
c349，617-620
-58-
Iashimmo.1
1.
，t
l
n
dI
chikawa，A
.(
1
9
9
2
)1
.B
io
l
.Chcm.
2
9
) N
c
g
i
s
h
i
.M.. l
267. 2364-2369
n
d O'
O
o
n
n
c
l
l
.
J
.
P
.(
1
9
8
4
)
3
0
) F
c
d
a
n
.J.
S
.，Hogabuom，G.K.，a
.
l 33， 1
167-1180
Biochcm.Pharma
co
-59-
3
1
) l
L
o，S.
，H
ashimolo，H.，N
c
g
i
s
h
i，M.，S
u
z
u
k
i，M.，Koyano
，H.，
Noyori
，R
.，a
n
dI
c
h
i
k
a
w
a
，A. (
19
9
2
)J
.B
i
o
l
.Chcm. 267，20326-20330
c
g
i
s
h
i，M.，
3
2
) S
u
z
u
k
i，M.，Koyano，H.，Noyori，R.，Hashimolo，H.，N
I
c
h
i
k
a
w
a，A.，a
n
dI
l
O，S
.(
1
9
9
2
)Tcu
油 凶r
o
n48
，2635-2658
n，E
.a
n
dMarx，G. (
1
9
8
4
)1
.Immuno
l
. 133，3
282-3285
3
3
) R位 i
，S
.a
n
dGompcrts
，B
.D. (
1
9
8
0
)B
i
o
c
h
c
m
.1
. 188
，789-798
3
4
) C
o
c
k
c
r
o
f
t
3
5
) N
c
g
i
s
h
i，M.，Hashimolo
，H.
，a
n
dl
c
h
i
k
a
w
a，A. (
1
9
9り
B
i
o
c
h
c
m
.B
i
o
p
h
y
s
.R
c
s
.Commun. 176， 102-107
3
6
) HashimOlo，H.，Ogino
，R
.，S
a
c
k
i，H.，Y
a
l
s
u
n
a
m
i，K.，a
n
dI
c
h
i
k
a
w
a，A.
(
1
9
9
1
)B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
C
l
a 1095， 140-144
m
i
l
h，
1
.B
.，S
i
l
v
c
r
，M.1
.
， N
i
c
o
l
a
o
u，K.C.，a
n
d
3
7
) S
i
c
g
l，A.M.，S
Ah
cm，D. (
1
9
7
9
)J
.C
l
i
n.I
n
v
c
sl
. 63
，215-220
3
8
) B
l飢I.A.a
n
d MacDcnnol
，
1
.(
1
9
8
1)B
r
.1
.P
hannaco
l
. 72，4
35-441
， Mac民 n
n
o
t
，1
.
， B
l
a
i
r
，I
.A.，a
n
d Lcwis，P
.1
.(
19
8
1
)
3
9
) S
h
c
p
h
c
r
d，G.し
i
c
o
s
i
a，S
.，P
a
o
l
c
l
t
i，R.，Wh
i
t
t
l
c，B
.1
.R
.，Moncada，S
.，
4
9
) Lombroso，M.，N
a
n
d Vanc
，1
.R
.(
1
9
8
4
)P
r
o
s
t
a
g
l
a
n
d
i
n
s 27，32ト 333
c
s
s
a
r
i，F
.，a
n
dD
o
r
i
g
o
，P
.(
1
9
8
3
)
5
0
) F
a
s
s
i
n
a，G.，T
l
.R
c
s
.Commun. 15，735-749
Phannaco
.G
a
i
l
l
a
r
d，0.，A
il
h
a
u
d，G.
，加dN
e
g
r
c
l，R. (
1
9
9
2
)
5
1
) Vassaux，G，
J
.B
i
o
l
.Chem. 267， 1
1
0
9
21
1
0
9
7
司
5
2
) Kauclman，E
.J
.，A
r
o
r
a，S.K.，Lim，C.T
.，Vcnton，D.し
， a
n
d
LcB
r
c
l
o
n，G.C
.(
1
9
8
7
) FEBSLcll. 213， 179-183
5
3
) Zch
c
n
d
c
r
，H.，Wiuc，
巳
・C
.，WOlff
，H
.・
P
.，a
n
dP
a
l
s
c
h
c
k
e
，H. (
1
9
8
8
)
B
i
o
c
h
c
m
.Pahnnaco
l
. 37，49ト 4
95
.E
.，Yoa
k
.
im，C.，Guindon，Y.，G
i
l
1
a
r
d，
1
.W.，Rokach，J
.，a
n
d
5
4
) Mais，D
.V. (
1
9
8
9
)B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
C
l
a 1012，184-190
H
a
l
u
s
h
k
a，P
.，L
i
c
l，N.，a
n
dH
a
l
u
s
h
k
a，P
.V. (
1
9
9
0
)B
i
o
c
h
c
m
.P油 nnaco
l
.
5
5
) Mais，D.E
40，1457-1461
.，Bowling，N.L
.
， T
ruc，T
.A.，Naka，M.，M
o
r
i
n
c
l
l
i，T
.A.，
5
6
) Mais，D.E
C
l
i
n
.Sc
i
. 61，29P
4
0
) Ruckcr
，W.a
n
dS
c
h
r
o
r
，K
.(
1
9
8
3
)B
i
o
c
h
c
m
.Phannaco.
l 32，2405-2410
O
a
l
i
s，
1
.E
.J
r
.
， Hamanaka，N.，a
n
dH
a
l
u
s
h
k
a，P
.V
.(
1
9
9
1
)
4
1
) I
s
h
i
z
a
k
a，T
.，Conrad，0.11
.
， Schulman，
E
.S
.，S
t
c
r
k，A.R.，
1
.Mcd.Chcm. 34
，1
511-1514
Ko，C.G.L
.
， a
n
dI
s
h
i
z
a
k
a，K. (
1
9
8
4
) FcdcmuonP
r
o
c
. 43，2840-2845
4
2
) Loc
f
O
c
r
，L
.1
.
， L
ovcnbcrg，W.，a
n
dS
j
∞rdsma，A.(197り
B
i
o
c
h
e
m
.Phannaco
l
. 20，2287-2297
a
y
a
s
h
i，1
1
.，M
i
n
創n
i，M.，a
n
dT
o
m
i
t
a
，K. (
1
9
7
2
)
4
3
) I
c
h
i
k
a
w
a，A.，H
B
i
o
c
h
e
m
.Phannaco
l
. 21
，3
17-331
4
4
) K
a
l
i
n
e
r
，M.a
n
dA
u
s
t
c
n，K.F
.(
1
9
7
4
)J
.Jmmuno
l
. 112，664-674
，O
.V.a
n
dGonnan，R.R. (
1
9
7
9
)J
.Phannaco
l
.E
x
p
.百1
c
r
. 210，
4
5
) M
i
l
l
c
r
5
7
) M
i
c
h
a
l
a
k
，M.，W
andlcr
，E
.L
.，S
l
r
y
n
a
d
k
a，K.，Lopaschuk，G.L
.，
Njue，W.M.，L
iu，H
.
J
.，a
n
dO
l
l
c
y，P
.M. (
1
9
9
0
) FEBSL
e
t
t
. 265，
117-120
，A.K.，R
cxroad，C
.E
.J
r，Kawada，K.，Wau，D.S
.，a
n
d
5
8
) B
a
1
a
p
u
r
e
F
i
l
Z
，T
.A. (
1
9
8
9
)B
i
o
c
h
c
m
.Phannaco
.
1 38，2375-2381
.・
L
.
， V
i
j
j
c
s
w
a
r
a
p
u，H.，a
n
d Wu，K.K. (
1
9
8
8
)
5
9
) T
s
a
i，A
B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a 942，220-226
6
0
) Walanabe，T.，Umcgaki，K.，a
n
d Smi
L
h，W.L
.(
1
9
8
6
)1
.BioLChem.
1
3
41
4
0
由
4
6
) S
k
u
b
a
l
l
a
，W.a
n
d Vorbruggcn，H. (
1
9
8
3
) AdvP
r
o
s
l
a
g
l
a
n
d
i
n官 l
r
o
m
b
o
x
a
n
c
261
，1
3430-13437
t
o，S
.，Tanaka，T
.，Yokohama
，H.，H
a
y
a
s
h
i，H.，K
a
t
a
d
a
，T
.，
61
) N
c
g
i
s
h
i，M.，l
L
c
u
k
o
t
r
i
e
nR
c
s
. 11，299-305
4
7
) Blackmore，P
.F
.，B
o
c
c
k
i
n
o，S
.B
.，Wa
戸lIc
k，L
.E
.，a
n
dExton，J
.H.
(
19
8
5
)1
.B
i
o
l
.Chcm. 260， 1
4477-14483
19
8
7
)1
.N
crochcm. 49，1634-1643
4
8
) E
b
e
r
h
a
r
d，D.A.and Holz，R.W. (
-60-
Ui，M.，a
n
dH
a
y
a
i
s
h
i，O. (
1
9
8
7
)1
.B
io
l
.Chem. 262， 1
2077-12084
s
a
w
a，1
.，H
ashimoto，H.
，K
imura，K.，T
a
k
a
h
a
s
h
i，S
.，
6
2
) Y
a
t
s
u
n
a
m
i，K.，F吋i
a
n
dI
c
h
i
k
a
w
a，A. (
1
9
9
0
)B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a 1051，94-99
-61-
6
3
) A
n
n
s
t
r
o
n
g
.R.A
.
.L
a
w
r
c
n
c
c
.R
.A
.
.J
o
n
c
s，R.L
.
，W
i
1
s
o
n
.N.H.，a
n
d
7
8
) Gi1man，A.G. (
1
9
8
7
) Ann
.R
c
v
.B
i
o
c
h
c
m
. 56，615-649
C
o
l
li
c
r
，
A. (
1
9
8
9
) Br
.1
.Phannaco
l
. 97，657-668
7
9
) B
a
r
b
a
c
i
d，
M. (
1
9
8
7
)Ann.R
c
v
.B
i
o
c
h
c
m
. 56，779-827
6
4
) Yoshimura，S
.，Mizuno.Y.，Kimura，K.，Y
a
t
s
u
n
a
m
i，K.，F
u
j
i
s
a
w
a，J
.，
Tomita
，K.，a
nd I
c
h
i
k
a
w
a，A. (
1
9
8
9
)B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.Aαa981，69 76
四
6
5
) L
c
i
g
h，P
.J
.，Cramp
，W.A
.，and MacDcnnot
，
1
.(
1
9
8
4
)1
.Bio
l
.Chcm.
8
1
) T
a
k
a
h
a
s
h
i，S
.，I
I
a
s
h
i
d
a，K.，Y
a
L
<
;
u
n
ω
n
i，K.，F
u
k
u
i，T
.，N
c
g
i
s
h
i，M.，
K
a
t
a
d
a，T
.，U
i，M.，Kanaho，Y.，Asano，T
.，andI
c
h
i
k
a
w
a，A. (
1
9
9
1
)
B
i
o
c
h
i
m
.B
i
o
p
h
y
s
.A
c
t
a 1093，207-215
259，12431-12436
6
6
) K
a
i
b
u
c
h
i
.K
.
.T
a
k
a
i，Y
.
. Ogawa，Y.，Kimura，S
.，and N
i
s
h
i
z
u
k
a
，Y
.
(
1
9
8
2
) Biochcm.B
i
o
p
h
y
s
.R
c
s
.Commcn. 104，105-112
6
7
) T
a
k
a
i，Y.，K
a
i
b
u
c
h
i，K，Sano，K.，and i
、
li
s
h
i
z
u
k
a，Y. (
1
9
8
2
)J
.B
i
o
c
h
c
m
.
n
dR
o
d
b
c
l
l，M. (
1
9
9
0
)P
r
o
c
.Nau.A
c
a
d
.Sc
i
.USA 87，
8
2
) U
d
r
i
s
a
r，D. a
6321-6325
8
3
) 1m，M
.
J
. andGraham，R.M. (
19
9
0
)1
.B
io
l
.Chcm. 265，1
8944-18951
8
4
) 1m，M
.
J
.，R
i
c
k，R
.P
.
.a
n
c
l Graham.R
.M. (
1
9
9
0
)1
.s
io.
lChcm. 265，
，403-406
91
6
8
) A1ava，M.A.，D
c
B
c
l
l，K.E
.，C
o
n
t
i，A.，Hoffman，T
.，and B
o
n
v
i
n
i，E
.
(
1
9
9
2
) Biochcm.J
. 284， 1
8
ト1
9
9
18952-18960
v
c
n
s
s
o
n
.J.
.Wakabayashi，T
.，a
n
d Samuclsson，B.
8
5
) Hambcrg，M.. S
6
9
) Fox，J
.E
.B
.，R
c
y
n
o
l
d
s
.C.C.，a
n
dJohnson，M.M. (
1
9
8
7
)
J Bio.
lChcm. 262. 1
2627-12631
(
1
9
7
4
)P
r
o
c
.Natl
.A
c
a
d
.Sc.
iUSA 71
，3
45-349
.A.and M
i
l
l
s，A.D
.(
19
7
5
)E
u
r
.J
.B
i
o
c
h
c
m
. 56，335-341
8
6
) Laskcy，R
7
0
) Kurosawa.M. a
n
dP
a
r
k
c
r
.C.W. (
1
9
8
7
)B
i
∞hcm.Phannacol
. 36，
1
3
1 140
8
7
) N
c
g
i
s
h
i
.M.. l
t
o
.S
.，Yokohama.H.，H
a
y
a
s
h
i，H
.
.K
a
t
a
d
a，T.，Ui，M.，
a
n
dl
Ia
y
a
i
s
h
i，O. (
1
9
8
8
)J
.B
io.
lChcm. 263，6893-6900
世
.R
.，Wincgar
，D
.A.，No1an，R
.0.，O
b
c
r
d
i
s
s
c，E
.，a
n
d
7
1
) L
a
z
a
r
o
w
s
k
i，E
La似~tina.E.G.
.D
.(
1
9
8
9
)T
r
c
n
d
sB
i
o
c
h
c
m
.Sc.
i 14，394-396
8
0
) Burgoync，R
(
1
9
9
0
)J
.B
io
l
.Chcm. 265， 13118-13123
Ia
r
d
c
n，T.K. (
1
9
8
3
) Phannaco
l
.R
c
v
.3
5
. 5-32
7
2
) l
7
3
) Bcnovic，J
.L
.，P
i
k
c，L
.J
.，C
c
r
i
o
n
c，R
.A.，S
t
a
n
i
s
χ
c
w
s
k
i，C.，Yoshimasa
，
T
.，Codina，J
.
.C
aron，M.G.，a
n
dL
c
f
k
o
w
i
t
z，R.J
.(
1
9
8
5
)
8
8
) G
r
y
n
k
i
c
w
i
c
χ ，G.，P
o
c
n
i
c，M.，.
m
dT
s
i
c
n，R
.Y
.(
1
9
8
5
)1
.Bio
l
.Chcm.
260. 3440-3450
.
l
w
s
o
n
.R
.M.C
.
. Downcs，C
.P
.，Hcs10p，J
.P
.a
n
d
8
9
) B
c
r
r
i
d
g
c
.M.J
.，D
I
r
v
i
n
c，R
.F
.(
1
9
8
3
)B
i
o
c
h
c
m
.J
. 212
. 473-482
，
1
.K.，S
m
i
g
c
l
.M.0
.
.a
nd Gilman，A
.G. (
1
9
8
2
)1
.B
io
l
.Chcm.
9
0
) Northup
257， 11416-11423
J
.B
iol
.Chcm. 260
，7
094-7101
7
4
) B
r
u
n
t
o
n
.しし， Wiklund，R
.ん， VanA
r
s
d
a
l
c，P
.M.，andGilman，A.G.
i
m
b
i
r
d
.し E
.
. suhrow，S
.A
.
.S
p
c
c
k
.1
.L
.，a
n
dS
t
a
r
o
s，
1
.V
.(
1
9
8
3
)
9り L
J
.Biol
.Chcm. 258. 10289-10293
.B
iol
.Chcm. 2S1
，3037-3044
(
1
9
7
6
)J
7
5
) しc
f
k
o
w
i
t
z
，R J
.，M
u
l
l
i
k
i
n，D.，Wood，C.L
.，Gorc，T
.B.，a
n
d
.(
1
9
5
7
)i
nMCU
1
α
J
si
nEnzymo10gy(
C
o
l
o
w
i
c
k
.S
.P
.a
n
d
9
2
) Laync，E
Mukhcり
c
c，C. (
1
9
7
7
)J
.Bio
l
.Chcm. 252，5295-5303
l
.3，pp.447-454，A
cadcmicP
r
c
s
s，
K
a
p
l
a
n
.N.0
.
.E
d
s
.
) Vo
n
dP
o
w
c
l
l，W.S
.(
1
9
8
1
)J
.B
io
l
.Chcm. 256，
7
6
) K
a
r
a
p
l
i
s，A.C. a
2414-2419
NcwYork-London
1
9
7
6
) Ana
.
lB
i
o
c
h
c
m
.72，248-254
9
3
) B
r
a
d
f
o
r
d，M.M. (
7
7
) Yumoto.N.，Watanabe
，Y.，W
atanabc
，K
.，Watanabc
，Y.，a
nd
9
4
) L
a
c
m
m
l
i
.U.K. (
1
9
7
0
)N
a
t
u
r
c 227，680-685
1
9
8
6
)J
.N
ucrochcm. 46， 1
2
5132
H
a
y
a
i
s
h
i，O. (
・
-62-
-63-