DFS70 ELISA Kit

CODE 7808
研究用試薬
＊
2010 年 10 月改訂
2009 年 2 月作成
抗 DFS70 抗体測定試薬
DFS70 ELISA Kit
操作説明書
キット構成
Code 7808
構成試薬
容量
DFS70 感作マイクロカップ (DFS70 MICROWELL STRIPS）
8wells x 12strips
キャリブレータ (Calibrator (Index=100))
1.5 mL x 1
酵素標識抗体 (Conjugate Reagent)
15 mL x 1
反応用緩衝液 (Assay Diluent)
50 mL x 2
洗浄用緩衝液 (Wash Concentrate (20x))
50 mL x 1
酵素基質液 (Substrate (TMB/ H2O2))
20 mL x 1
反応停止液 (Stop Solution (0.25mol/L sulfuric acid))
20 mL x 1
使用目的
血清中の抗 DFS70 抗体の測定
操作法
□検体について
（１）検体は血清を用います。
検体を保存する場合は血清を小分けして
1 箇月以内の場合 ： -20℃以下で凍結保存し、凍結融解の繰り返しは検体の反応性を低下させる可
能性がありますので避けて下さい。
長期保存の場合
：-70℃以下で保存して下さい。
-20℃以下で半年以上保存した場合及び凍結融解を繰り返した場合、IgG の変性などで、非特異反応
が強くなることがあります。
希釈した検体は、即日測定してください。
（２）共存物質の影響
自社施設において、検体における共存物質の影響を試験したところ、ヘモグロビン（494.0 mg/dL）
、
ビリルビン C（21.6 mg/dL）
、ビリルビン F（19.1 mg/dL）
、乳び（1,590 ホルマジン濁度）、RF（550IU/mL）
の添加において測定値に影響は見られませんでした。
極端な乳びや溶血が認められる検体は非特異反応が生じる可能性があるので使用しないで下さい。
1
CODE 7808
□準備するもの
･マイクロプレートリーダー
･プレートウォッシャーまたは洗浄ビン
･マイクロピペット
･マルチチャンネルマイクロピペット
･一次反応準備用マイクロプレート
･マイクロカップ専用ホルダー
･リザーバー
･精製水
□試薬の調製法
キット構成品は室温（20～30℃）に戻してから使用してください。
１）洗浄液の調製
洗浄用緩衝液を精製水にて 20 倍希釈し、洗浄液とします。洗浄液は 2～8℃で２週間安定です。
例）洗浄用緩衝液 50 mL に精製水 950 mL を加えて 20 倍希釈します。
２）その他の試薬はそのまま用います。
□操作方法
（１）検体の希釈
検体を反応用緩衝液で 101 倍希釈して下さい。希釈済みの検体を、１検体につき 300μL 使用します。
多数検体の場合には、希釈した検体を 150μL ずつ一次反応準備用マイクロプレートに実際と同じよう
に添加し、その後、DFS70 感作マイクロカップに 100μL ずつ移すと時間差を少なくすることができま
す。
（２）一次反応
１）反応用緩衝液（ブランクとして使用します）
、キャリブレータ及び希釈した検体を DFS70 感作マ
イクロカップに 100μL ずつ移します。
注意）DFS70 感作マイクロカップに検体を添加した時点から反応が始まりますので、操作は短時
間のうちに行って下さい。
２）室温（20～30℃）で 60 分静置反応させます。
（３）洗浄
自動洗浄機（マイクロプレート専用機）または洗浄ビンを用いて洗浄液でマイクロカップを洗浄し
ます。
洗浄回数： 自動洗浄機・・・４回
洗浄ビン・・・４回
注意）自動洗浄機を用いた場合、使用する自動洗浄機によって設定方法及び最適洗浄回数が異なる場
合があります。あらかじめ各施設で用いる自動洗浄機の設定方法及び最適洗浄回数を確認する
ことをお勧めします。
洗浄液は必ず室温（20～30℃）のものを使用して下さい。
（４）二次反応
１）マイクロカップに残った洗浄液を完全に除去した後、リザーバーに移した酵素標識抗体を 100μL
ずつ添加します。
注意）酵素標識抗体は、試薬ボトルから必要量をリザーバーに移して使用して下さい。一度、リ
ザーバーに移した酵素標識抗体は、試薬ボトルに戻さないで下さい。
2
CODE 7808
２）室温（20～30℃）で１時間静置反応させます。
（５）洗浄
（２）と同様に洗浄します。
（６）酵素反応
１）酵素基質液をリザーバーに移し、100μL ずつ添加します。
注意）酵素基質液は、試薬ボトルから必要量をリザーバーに移して使用して下さい。また、一度
リザーバーへ移した酵素基質液は試薬ボトルへ戻さないで下さい。
酵素標識抗体を入れたリザーバーと酵素基質液を入れるリザーバーは、必ず別のものを使
用して下さい。
２）室温（20～30℃）で 30 分間静置反応させます。
（７）反応停止
反応終了後、リザーバーに移した反応停止液をマルチチャンネルマイクロピペットで 100μL ずつ
添加します。
（８）吸光度測定
自動分光光度計（マイクロプレート専用機：垂直透過型）にマイクロカップをセットして、波長
450nm の吸光度（副波長 620nm）を測定します。
注意）吸光度測定は反応停止後 20 分以内に行って下さい。
プレートの底に汚れが無いこと、液の表面に気泡がないことを確認してください。
（９）結果の判定
下記の式を用いて Index 値を算出します。
Index 値＝
検体の A450－反応用緩衝液の A450
×100
キャリブレータの A450－反応用緩衝液の A450
*A450 は波長 450nm における吸光度です。
◆参考基準範囲
蛍光抗体法（IF）および WesternBlot 法（WB）で抗 DFS70 抗体陰性であった 50 例について、
平均＋3SD 値は Index 値 15 となりました。
使用上または取り扱い上の注意
1.
本品は研究用試薬です。ヒト体内に用いたり、ヒトの疾病の診断目的に使用しないで下さい。
2.
有効期限切れの試薬は使用しないで下さい。
3.
試薬類は皮膚、目、衣服などに付けないように注意してください。もし、皮膚などにかかったときは
大量の水で洗い流して下さい。反応停止液には 0.25 mol/L 硫酸が含まれています。
4.
キャリブレータ及び反応用緩衝液には 0.09%アジ化ナトリウムを添加してあります。誤って目や口に
入ったり、皮膚に付着した場合は水で十分に洗い流す等の応急措置を行い、必要があれば医師の手当
てを受けて下さい。また、アジ化ナトリウムは、配管中で爆発性のアジ化銅やアジ化鉛を形成するこ
とが報告されています。これらの物質の形成を防ぐため、アジ化ナトリウムを含んだ廃液は十分量の
水で洗い流して下さい。
5.
DFS70 感作マイクロカップ、酵素標識抗体及びキャリブレータについては異なる製品ロットの試薬を
組み合わせて使用しないで下さい。
3
CODE 7808
6.
キットの構成品は、室温（20～30℃）に戻してから使用して下さい。
7.
保存及び使用中は、試薬に直射日光を当てないで下さい。
8.
検体、試薬への微生物の混入や試薬間のコンタミネーションを避けて下さい。
9.
反応温度、反応時間、検体の希釈率は厳守して下さい。
10. 酵素基質液は金属イオンにより酸化されやすいのでディスポーサブルの新しい器具を使用し、試薬ボ
トルからリザーバーへ酵素基質液を移す際にもディスポーサブルのピペットを使用して下さい。また、
一度リザーバーへ移した 酵素基質液は試薬ボトルへ戻さないで下さい。
11. 洗浄が適当でない場合、偽陽性を生じることがありますので、十分洗浄を行って下さい。
12. マイクロカップ間のコンタミネーションを防ぐため、液の泡立ちや、周囲への付着が起こらないよう
にして下さい。
13. 使用しないマイクロカップは直ちにチェックつきのアルミ袋に戻して下さい。DFS70 感作マイクロカ
ップは湿気を嫌いますので、開封後はアルミ袋のチャックを確実に閉めて保存して下さい。
14. 洗浄用緩衝液は、２～８℃で保存したとき、白濁を認める場合がありますが、試薬性能に影響はあり
ません。洗浄液調製時、十分に溶解してから使用して下さい。
15. 検体は感染の可能性があるものとして注意して取り扱って下さい。検査に使用した器具は、次のいず
れかの方法で処理した後、廃棄して下さい。
・最終濃度２％ グルタルアルデヒド溶液に１時間以上浸漬する。
・0.5％次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素
約 5000ppm）に１時間以上浸漬する。
・121℃で 20 分間以上高圧蒸気滅菌する。
貯 法
２～８℃で保存
有効期間
*
製造後 12 カ月
包装単位
CODE No. 7808
96 ウエル
＊
問い合わせ先
株式会社
医学生物学研究所
URL https://ruo.mbl.co.jp
e-mail [email protected],
TEL 052-238-1904
4
CODE 7808
Revised: October 12, 2010
Printed February 9, 2009
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
DFS70 ELISA Kit
Code No. 7808
INTENDED USE
The DFS70 ELISA Kit is a semi-quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the
detection of anti- DFS70 antibodies in serum. The DFS70 ELISA Kit is intended for research use only.
Materials provided
Quantity
Name
DFS70 MICROWELL STRIPS
8wells x 12strips
Calibrator (100)
1.5 mL x 1
Conjugate Reagent
15 mL x 1
Assay Diluent
50 mL x 2
Wash Concentrate (20x)
50 mL x 1
Substrate (TMB/ H2O2)
20 mL x 1
Stop Solution (0.25mol/L sulfuric acid)
20 mL x 1
Storage and Stability
・ All kit components must be stored at 2-8°C. All reagents are stable for 12 months after manufacturing
when stored at 2-8°C. Do not use the kit beyond the expiration date.
・ When Microwell strips are not immediately required, it should be returned to the ziplock pouch. The
pouch must be carefully resealed to avoid moisture absorption and stored at 2-8°C.
・ Do not freeze Conjugated reagent.
PRECAUTIONS
1) This product is for research use only.
2) Do not use kit components beyond the stated expiration date.
3) Avoid contact of reagents with eyes, skin and clothing. Reagents on skin must be washed away with
plenty of water. TMB contains irritant and Stop Solution consists of a 0.25mol/L sulfuric acid, which
is a poison and corrosive.
4) Calibrator and Assay Diluent contain sodium azide (0.09%) as a preservative and must be handled
5
CODE 7808
with caution - do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide may
react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azides. Therefore, always
flush with plenty of water when disposing materials containing sodium azide into a drain.
5) Some kit components contain animal origin materials, which are from non-infectious animals. These
components, however, should be treated as potential biohazards in use and for disposal.
6) Matching lot numbers of Microwell strips, Conjugate and Calibrator must be used together in the
assay. Do not substitute reagents from other kits.
7) All reagents must be brought to room temperature (20-30°C) before starting the assay.
8) Do not expose the kit to direct sun during assay and storage.
9) Avoid microbial and cross contamination of reagents or samples.
10) Incubation temperatures above or below normal room temperature (20-30°C), shorter or longer time
periods of incubation and inaccurate dilution may give erroneous results.
11) The wells must be rinsed with Wash Solution properly enough to avoid false positive.
12) Carefully pipette not to foam each sample and reagent to avoid cross contamination between
microwells.
13) All microwell strips, which are not immediately required, should be returned to the zip lock pouch,
which must be carefully resealed to avoid moisture absorption.
14) Wash concentrate may become turbid at 2-8°C, which does not cause inconsistent results.
15) Implement used for the test should be disposed or treated as shown below.
Soak in 2% final conc. glutaraldehyde solution for more than 1 hour
or soak in 0.5% Sodium hypochlorite solution (available chlorine: approx. 5000ppm) for more than 1
hour
or autoclave at 121°C for more than 20 minutes.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Microplate reader(wavelength: 450nm, 620 nm/reference)
Multichannel micropipette (e.g. 100µl – 300µl)
Single channel pipette (10µl & 100µl)
Reagent reservoir
Autowasher or wash bottle
Deionized or distilled water
One liter graduated cylinder for preparation of wash solution
Test tubes for patient sample dilutions (e.g.1000µl)
Disposable pipette tips
Paper towels
Basin and disinfectant
Microplate cover
PROCEDURE
PREPARATION OF REAGENTS
1) Bring all assay materials to room temperature (20-30°C) prior to use.
2) Microwell Strips: Remove required microwell strip from pouch and place them in the frame. Promptly
return unused strips to refrigerated storage.
6
CODE 7808
3) Wash Solution: The Wash Concentrate must be diluted prior to use. Dilute the Wash Concentrate 1:20
by adding 50 ml of the concentrate to 950 ml of distilled water. The diluted wash solution is stable for
2 weeks at 2-8°C.
4) Do not dilute the other kit components which are ready- to-use.
PREPARATION OF SAMPLES
1) Use fresh sera. If storage is needed, they should be aliquot and frozen below -20°C for up to one month,
below -70°C for any longer storage. Do not repeat freezing and thawing.
*In case of being stored below -20°C for more than 6 months or freezing and thawing repeatedly,
nonspecific results are obtained because of IgG denaturation.
2) Dilute each serum 1:101 by adding 10µl of serum to 1ml of Assay Diluent.
*Diluted samples must be used within a day.
ASSAY PROCEDURE
STEP 1. (SAMPLE INCUBATION)
Pipette 150 µl of Assay Diluent (for blank), Calibrator and each diluted sample to the appropriate
polyvinyl plate well, then pipette 100 µl each with multichannel pipette into the appropriate microwell
coated with antigen.
*Incubation starts on pipetting to the antigen-coated microwells. Pipetting should be completed as
quickly as possible.
Cover wells with a plate sealer and incubate at room temperature (20-30°C) for 60 minutes.
STEP 2. (WASHING)
Aspirate or discard the well contents. Fill the well with Wash Solution and then completely aspirate or
discard the contents. Wash 4 times. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash
Solution. When autowasher is used, wash 4 times.
*Each laboratory is recommended to confirm its own appropriate washing times and another
conditions.
*Washing solution should be used at 20-30°C.
STEP 3. (CONJUGATE INCUBATION)
Pour Conjugate solution into a reservoir. Add 100 µl of working Conjugate solution to each well with
multichannel pipette. Cover wells with a plate sealer and incubate at room temperature (20-30°C) for 60
minutes.
STEP 4. (WASHING)
Wash the microplate following the STEP 2 procedure.
STEP 5. (SUBSTRATE INCUBATION)
Pour Substrate into a reservoir. Add 100 µl of substrate to each well with multichannel pipette.
*This reservoir should be different from the one, which was used for pouring conjugate solution.
A new disposable reservoir should be used because Substrate is easily oxidized by metal ion.
Cover wells with a plate sealer and incubate at room temperature (20-30°C) for 30 minutes.
7
CODE 7808
STEP 6. (STOP REACTION)
Pour Stop Solution into a reservoir. Add 100 µl of the solution to each well with multichannel pipette.
READING
Read the absorbance of each well at 450 nm. If a dual wavelength platereader is available, set the test
wavelength at 450 nm and the reference at 620 nm.
*Reading should be done as quickly as possible after stopping the reaction.
*Ensure that the bottom of the plate is clean and dry, and that no air bubbles are present on the
surface of the liquid in the wells before reading the plate.
CALCULATION OF RESULT
Unit value (U/ml)=
( A450<Sample> - A450<Assay Diluent>)
(A450<Calibrator> - A450<Assay Diluent >)
x 100
*A450 is abbreviation of absorbance value at 450 nm.
*Any reference material for anti-DFS70 antibody is not available, the assay is calibrated in relative
arbitrary units.
REFERENCE VALUE
50 people with anti-DFS70 negative both Immunofluorescenct assay and Immunobloting assay were
measured by DFS70 ELISA. The overall value of average+3SD(Standard Deviation) was 15 unit/mL.
INTERFERING SUBSTANCES
Hemoglobin (up to 494 mg/dl), Bilirubin F (up to 19.1 mg/dl), Bilirubin C (up to 21.6 mg/dl) chyle (up
to 1,590 unit as Formazine) and/or Rheumatoid factor (up to 550 IU/ml) are not affective on the assay
result, but avoid using highly hemolysed or highly lipemic samples.
Manufactured by:
MBL MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
URL https://ruo.mbl.co.jp
e-mail [email protected]
TEL 052-238-1904
8