講演パワーポイント資料

ストレスに応答する二次代謝産物生合成とその利用の可能性
O
O
Coumarin
清水文一
植物の防御反応と防御物質
侵入者
植物
Secondary Metabolites
Cell-Wall Degrading Enzymes
Enzyme Inhibitors
Fungus, Bacteria, Insects...
Toxins
Degrading Ezymes
Chemical
Battle
兵器の研究
無駄なものは作っていないはず!
二次代謝と植物防疫
育種などで選抜されている�＞＞�あまり積極的に利用されていない？
生合成経路に関する情報
��������遺伝子資源としての利用
����������������������・・・・�組み換え体��抗ストレス植物の作出
��������薬剤の作用点としての利用
����������������������・・・・�一次代謝だけでなく二次代謝も
������������������������������薬剤のターゲットとして利用できないか？
�������������������������二次代謝産物の多様性�
����������������������������生物種によって固有のものが多い
�������������������������������������・・・・薬剤の選択性
Coumarins
Activities --
Antibacterial
Antifungal
Antioxidative
Allelopathic
HO
ex.)
O
O
HO
O
7
O
Umbelliferone
Coumarin
H3CO
HO
O
Bergamotin
HO
Esculetin
O
O
O
O
O
Psoraren
O
O
Scopoletin
OH
O
O
O
O
OH
O
O
Dicoumarol
O
Induced Resistance in Sweet Potato
Sweet potato in the infested field by Fusarium wilt
(caused by pathogenic Fusarium: PF)
No Treated
Non-Pathogenic Fusarium (NPF)
K. Ogawa, Bull. Nat. Agric. Res. Cent., 10, 1988
Resistance in Morning Glory Induced by
Non-pathogenic Fusarium
Symptom of Wilt-Disease
10 日目
(10サツマイモつる割れ病菌処理
days treatment with
PF)
Non-pathogenic
Fusarium
非病原性フザリウム（NPF）
(108 胞子/ml) 処理区
Mock
対照区
NPF: F. oxysporum 101-2
HPLC analysis of the stem extracts (UV 280nm）
Mock
NPF
NPF 処理 2 日後
蒸留水処理 2 日後
treated for 2 days
0
10
20
30
(min)
0
10
20
30
(min)
Identification of the induced components
H3CO
HO
O
O
HO
Scopoletin
O
O
Umbelliferone
H3CO
HO
HO
HO
O
O
OH
Scopolin
O
O
HO
HO
HO
O
O
O
O
OH
Skimmin
by NMR, LC/MS
ソライロアサガオ茎部の scopolin,
scopoletin 含量変化
Scopoletin/scopolin
induction
in morning glory
Scopolin (nmol/gFW)
400
HO
O
O
O
OH
O
H3CO
O
O
O
O
O
OH
Scopolin
300
200
100
0
HO
30
Scopoletin (nmol/gFW)
HO HO
HO
HO
HO
H3CO
HO
O
O
O
O
O
Scopoletin
20
10
0
0
10
20
30
40
0
50
処理後時間 (hr)
Time of treatment
10
20
30
40
50
処理後時間 (hr)
Time of treatment
Mock
蒸留水処理区
NPF
NPF
8胞子/ml）
処理区（10
(108 bud-cell/ml)
bar: SE (n=3)
Phenylpropanoid pathway and coumarin biosynthesis
Phenylalanine
Cinnamate
p-Coumarate
Caffeate
Ferulate
Ortho-hydroxylation, trans-cis
isomerization and lactonization
Umbelliferone
Esculetin
Scopoletin
Arabidopsis thaliana, the model plant
because:
1) reproduction cycle is short
2) easy to grow in labo.
3) good facilities
(genome information, data bases,
mutant libraries)
Scopoletin
accumulation
in Arabidopsis
Scopolin
部位別蓄積量
1200
1068.0
HO
HO
HO
1000
Scopolin (nmol/gFW)
H3C
O
OH
O
O
O
O
Scopolin
800
shoot
600
400
200
Bar: SE (n=3)
4.70
0
Root
Shoot
WT
root
Enzymes involved in scopolin biosynthesis
1． Glucosyltransferase
H3CO
H3CO
HO
O
HO
HO
HO
O
O
O
O
OH
2． 2ʼ(ortho)-Hydroxylation
COOH
COOH
O
[O]
OH
R
R
O
R
O
Phenylpropanoid pathway and coumarin biosynthesis
Phenylalanine
Cinnamate
p-Coumarate
Caffeate
Ferulate
Ortho-hydroxylation, trans-cis
isomerization and lactonization
Umbelliferone
Esculetin
Scopoletin
Ferulate 6′-hydroxylase (F6′H)
6′-Hydroxylation
O
R
O
R
[O]
O
MeO
MeO
OH
OH
Lactonization
R
OH
OH
6′
MeO
Trans-cis
isomerization
O
O
MeO
OH
OH
Tracer analysis using 18O2
O
18O
18O
LC/MS/MS analysis
2
Root discs of sweetpotato
18OH
The ortho-hydroxylase in
coumarin formation uses
MOLECULAR OXYGEN.
F6′H attributes
？
O
R
O
R
OH
MeO
MeO
OH
OH
・Expressed in roots（roots ＞ shoots）．
Scopolin 部位別蓄積量
1200
1068.0
Scopolin (nmol/gFW)
1000
・Induced by 2,4-D treatment ．
・Uses molecular oxygen
H3C
HO
HO
HO
O
O
Scopolin
600
400
200
Bar: SE (n=3)
4.70
Root
Shoot
WT
2-Oxoglutarate-dependent dioxygenase
Flavin monooxygenase
Candidate genes are selected using databases,
MPSS (http://mpss.udel.edu/at)
OH
800
0
Cytochrome P450 monooxygenase
O
O
O
Selection of the candidate of F6ʼH
Candidate genes
from ATTED*
At4g13770
Enzyme
type
mpss signiture information**
Inflorescence Leaf
Cytochrome P450
monooxygenase
Root
Silique
0
118
29
0
At1g06640
2-Oxoglutarate dependent
dioxygenase
28
43
112
33
At2g17720
2-Oxoglutarate dependent
dioxygenase
150
134
419
86
At3g13610
2-Oxoglutarate dependent
dioxygenase
6
12
261
3
* http://www.atted.bio.titech.ac.jp,
** http://mpss.udel.edu/at
2,4-D (100 μM) treatment
Actin
Ro
Sh
At3g13610
ot
Response against 2,4-D
in shoots
oo
Comparison of roots
and shoots
t
Expression pattern of the At3g13610 gene
cycles
（hr） 0
12
24
48
cycles
28
At3g13610
28
23
Actin
23
2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Plant Journal, 55, 989-999, 2008
T-DNA inserted mutants of At3g13610
(SALK_132418)
T-DNA
At3g13610
5'
1 19
91
LB
LB
(SAIL_1252_A10)
T-DNA
(SALK_129938 )
T-DNA
LB
706
exon1
1089 1169
exon2
3'
824
LB
T-DNA
(SALK_005264 )
RT-PCR analysis
At3g13610
cycles
28
Actin
23
Mutants
Plant Journal, 55, 989-999, 2008
Endogenous level of scopolin in
the At3g13610 mutants
(4 week-old plants)
WT
mutants
SALK_005264
O
O
SALK_129938
OH
HO
HO
SALK_132418
O
OMe
O
OH
Scopolin
SAIL_1252_A10
0
100 200 300 400 500 600 700 800
Scopolin (nmol/gFW)
Bar: SE (n=3)
Plant Journal, 55, 989-999, 2008
Fluorescence
in roots
White light
UV
Plant Journal, 55, 989-999, 2008
WT
SAIL_1252_A10
cru
Enzyme assay
100 mM BisTris-HCl pH 6.5
5 mM FeSO4
50 mM Sodium ascorbate
50 mM 2-Oxoglutaric acid
6 - 192 mM Substrate
1.2 μg protein
total 100 μl
E. coli BL21 carrying F6′H/pET28a
0.5 mM IPTG induction
Homogenize
Ni-Sepharose column
SDS-PAGE
Reversed-phase HPLC
O
MeO
36.0 ± 4.27
SCoA
HO
O
MeO
O HO
MeO
HO
* N.D. : Product not detected.
11.0 ± 0.45
N.D.*
OH
HO
Feruloylquinic acid
kcat (sec-1)
Km (μM)
Substrate
Ferulic acid
43 kDa
30°C, 1~5 min.
30 μl 3N NaOH
r.t., 30 min
30 μl 3N AcOH
His-tagged protein
Feruloyl CoA
Ni-
de
ext
r
a
ct
Aft
e
Se
ph r
aro
se
Activity of the recombinant F6ʼH
OH
O
HO
COOH
N.D.
Plant Journal, 55, 989-999, 2008
二次代謝の利用に向けた今後の課題
二次代謝産物の生物学的役割�
������生合成欠損株（過剰発現体）の
�����������������������������病害抵抗性、ストレス耐性の変化
������生理活性発現メカニズムの解明
�����������������������������なぜ抗菌性があるの？
謝辞
京都大学
�化学研究所
���坂田完三�博士
���水谷正治�博士
農学部
���石原享 博士
信州大学繊維学部
田口悟朗�博士
茨城県農業総合センター
���渡邊健�博士
生存研
���甲斐光輔�博士
���梅澤俊明 博士
�����������������（現大阪府大） ���中坪朋文 博士
小泉商店
���玉井道子�氏
���小泉邦夫�氏
���山口晃�氏
���川村直裕�氏
���山本亮太郎�氏
ご静聴、ありがとうございました.
���松本征太郎�氏