好熱性アーキア Thermoplasma acidophilum における DNA 複製

氏
名
論文題名
：尾木野
弘実
：Studies on the activation of the replicative helicase from the thermophilic
archaeon, Thermoplasma acidophilum
（好熱性アーキア Thermoplasma acidophilum における DNA 複製ヘリカーゼ
活性化機構に関する研究）
区
分
：甲
論
文
内
容
の
要
旨
DNA 複製の開始段階において二本鎖 DNA が解離した後、ヘリカーゼが装着されて複製前複合体
(pre-RC)が形成される。本研究は、pre-RC から複製フォークの進行に進む過程の分子機構解明を目
指したものである。真核生物ではヘリカーゼの本体である MCM が Cdc6、Cdt1 に依存して複製起
点上に pre-RC を形成し、DNA 上に乗った MCM は GINS、Cdc45 と共に「CMG complex」を形
成してヘリカーゼ複合体として活性化すると提唱されている。真核生物の GINS は 4 種類の異なる
サブユニットからなるヘテロ 4 量体のタンパク質複合体である。全てのサブユニット間でアミノ酸
配列の相同性が認められ、これらのタンパク質はパラログの関係にある。しかし多くのアーキアで
は、Gins タンパク質は 1 種類（Gin51）しか保存されておらず、アーキアにおける GINS 複合体の
機能解析は未だ不十分である。さらに、CMG complex の構成要素のうちの Cdc45 に相当するタン
パク質がアーキアには見つからないとされてきたが、最近、アーキアの持つ RecJ 様タンパク質 GAN
（GINS-associated nuclease）が Cdc45 と相同性を有することが指摘され、アーキアにおける複製
ヘリカーゼ複合体の正体の解明が急がれている。本研究では Gins51 のみを持つアーキアのうち、
Thermoplasma acidophilum をモデル生物として、Gins51 の構造及び機能の解析を行うことによ
って、Gins51 が DNA 複製において果たす役割を明らかにすることを目的とした。また、GAN が
存在する場合の MCM の活性化の有無についても調査した。
まず、T. acidophilum Gins51 タンパク質を高純度に精製し、ゲル濾過クロマトグラフィー及び
電子顕微鏡観察を行い、Gins51 が 4 量体を形成していることを明らかにした。配列比較の結果、
Gins51 しか持たないアーキアでは Gins タンパク質に広く保存された A、B 両ドメインの間に、変
性状態のリンカー領域が存在することがわかった。さらに変異体解析により、このリンカー領域が
４量体の形成に必須であることを示し、Gins51 のみを有するアーキアでは、ホモ４量体形成のた
めに特有の構造を獲得したことを提唱した。次に Gins51 が MCM の機能に与える影響を調べ、
Gins51 存在下で MCM の ATPase、ヘリカーゼ活性が促進されることを明らかにした。この結果は、
T. acidophilum においてホモ 4 量体の GINS が機能的に働いていることを示すものであり、同時に
ホモ４量体の機能的な GINS 複合体を初めて示した結果である。
T. acidophilum には複製起点認識因子である Cdc6/Orc1 様のタンパク質が２種類（Cdc6-1,
Cdc6-2）が存在するが、ゲルシフトアッセイによって、MCM、Gins51、Cdc6-2 は一本鎖 DNA 上
で複合体を形成することがを明らかにした。さらに興味深いことに、Gins51、Cdc6-2 の存在下で
は MCM の DNA 結合量が上昇しており、Gins51 と Cdc6-2 両方が存在する場合に MCM は最も安
定に DNA 上に存在した。また、Cdc6-2 と GINS の共存下では、両者が相乗的に MCM のヘリカー
ゼ活性を促進することも明らかにした。さらに、T. acidophilum 細胞抽出液を用いた免疫沈降実験
の結果、MCM、Gins51、Cdc6-2 は細胞内においても同じ複合体内に存在していることを示した 。
また、T. acidophilum には 2 種類の RecJ（RecJ1、RecJ2）が存在するが、RecJ1 は GINS と相
互作用せず、RecJ2 は GINS と安定な複合体を形成すること、その相互作用には Gins51 の B ドメ
インが必須であることを発見した。しかし、RecJ2 存在下で MCM のヘリカーゼ活性の上昇は検出
されなかった。Gins51 の野生型と B ドメイン欠損型は同じ効率で MCM のヘリカーゼ活性を促進
したことから、MCM の活性化には Gins51 の B ドメインと RecJ2 は関与していないことが示唆さ
れた。
以上の研究により、著者はアーキアの複製ヘリカーゼ複合体に関する多くの新しい知見を提供し、
アーキア・真核生物型の複製装置の構造と機能、および進化に関する我々の理解を大きく進展させ
た。Cdc6 ホモログの関与する MCM の活性化は現在までに他の生物種では観察された例のない現
象であることから、T. acidophilum は、アーキアと真核生物に分岐した後で Cdc45 ホモログ（少な
くとも RecJ 様タンパク質）を用いずに MCM を活性化する独特の機構を獲得したと予想される。