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Title 雌ラットにおける生殖機能の加齢性変化の発現メカニズム に関する研究( 本文(Fulltext) ) Author(s) 石井, 美沢 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第395号 Issue Date 2013-09-24 Type 博士論文 Version ETD URL http://repository.lib.gifu-u.ac.jp/handle/123456789/47359 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。 雌ラットにおける生殖機能の加齢性変化の 発現メカニズムに関する研究 2013 年 岐阜大学大学院連合獣医学研究科 （東京農工大学） 石 井 美 1 沢 目次 第1章 緒言 .................................................................................................................. 5 1-1 加齢に伴う生殖機能の低下 .................................................................................... 5 1-2 ラット ........................................................................................................................ 6 1-3 発情周期に伴う生殖関連ホルモンの変動 ............................................................ 6 1-4 kisspeptin ................................................................................................................. 8 1-5 1-6 胚・胎児の分化・発育 ............................................................................................ 9 本研究の目的 ............................................................................................................ 9 第2章 雌ラットにおける加齢に伴う生殖機能の変化 ........................................ 11 1. 背景と目的 .............................................................................................................. 11 2. 材料及び方法 .......................................................................................................... 11 2.1 使用動物 ................................................................................................................ 11 2.2 膣スメアの採取及び発情周期判定 .................................................................... 12 2.3 交尾率，受胎率及び胚・胎児の発達 ................................................................ 12 2.4 統計解析及びデータの評価 ................................................................................ 14 3. 結果 .......................................................................................................................... 14 3.1 発情周期 ................................................................................................................ 14 3.2 交尾率，受胎率，黄体数及び着床数 ................................................................ 15 3.3 胚・胎児の死亡率 ................................................................................................ 15 3.4 胎児の生存，発育及び形態学的異常 ................................................................ 16 4. 考察 .......................................................................................................................... 17 第 3 章 高週齢ラットの妊娠初期及び中期における胚・胎児の生存・発育に関 す る検討 ......................................................................................................................... 30 1. 背景と目的 .............................................................................................................. 30 2. 材料及び方法 .......................................................................................................... 30 2.1 使用動物 ................................................................................................................ 30 2.2 交配 ........................................................................................................................ 30 2.3 黄体数及び着床数の算出並びに着床部位の観察 ............................................ 30 2.4 実体顕微鏡下での観察 ........................................................................................ 31 2.5 統計 ........................................................................................................................ 32 3. 結果 .......................................................................................................................... 32 3.1 黄体数及び着床数 ................................................................................................ 32 3.2 着床部位の観察 .................................................................................................... 32 3.3 胚の形態学的検査 ................................................................................................ 33 2 4. 考察 .......................................................................................................................... 34 第 4 章 視床下部 kisspeptin 神経のエストロゲンに対する活性の低下が引き起 こす加齢性 LH サージの消 失 ...................................................................................... 47 1. 背景と目的 .............................................................................................................. 47 2. 材料及び方法 .......................................................................................................... 47 2.1 使用動物 ................................................................................................................ 47 2.2 血漿サンプルの採取方法 .................................................................................... 48 2.3 血漿中 LH 及びエストラジオール濃度測定 .................................................... 48 2.4 AVPV における Kiss1 mRNA 発現量及び kisspeptin 含有量の測定 .............. 48 2.5 GnRH 神経のヒト kisspeptin（Kp-54）に対する反応 ..................................... 49 2.6 卵巣を摘出したラットにおけるエストラジオールによる AVPV の kisspeptin 神経の活性化 ...................................................................................... 49 2.7 OVX+E2 MI における LH サージ測定 ............................................................... 50 2.8 ホルモン測定 ........................................................................................................ 50 2.9 Real-time PCR ....................................................................................................... 50 2.10 Enzyme immunoassay (EIA) ............................................................................... 51 2.11 抗 kisspeptin モノクローナル抗体の作製 ....................................................... 51 2.12 Two-site EIA ........................................................................................................ 51 2.13 Kiss1 mRAN 及び cFos の二重染色 .................................................................. 52 2.14 細胞数 .................................................................................................................. 53 2.15 統計解析 .............................................................................................................. 53 3. 結果 .......................................................................................................................... 53 3.1 LH サージ及び血漿中エストラジオール濃度測定 ......................................... 53 3.2 視床下部 AVPV における Kiss1 mRNA 発現量及び kisspeptin 含有量の測 定 ............................................................................................................................ 54 3.3 GnRH 神経の Kp-54 に対する反応 .................................................................... 54 3.4 卵巣を摘出したラットにおけるエストラジオールによる AVPV の kisspeptin 神経の活性化 ...................................................................................... 54 3.5 OVX+E2 MI における LH サージ測定 ............................................................... 55 4. 考察 .......................................................................................................................... 55 第 5 章 異常発情周期を発症した高週齢ラットの交尾排卵機構に関する検討 .. 68 1. 背景と目的 .............................................................................................................. 68 2. 材料と方法 .............................................................................................................. 68 2.1 使用動物 ................................................................................................................ 68 2.2 交尾能，受胎率，黄体数及び着床数 ................................................................ 69 3 2.3 交尾後の LH サージ ............................................................................................ 69 2.4 MI ラットにおけるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ Human Chorionic Gonadotropin: hCG）及び Kp-54 の投与による排卵誘起................................ 69 2.4 MI ラットの卵胞における LH 受容体遺伝子の発現局在 .............................. 70 2.5 統計 ........................................................................................................................ 71 3. 結果 .......................................................................................................................... 71 3.1 交尾率，受胎率，黄体数及び着床数 ................................................................ 71 3.2 MI ラットにおける交尾後の LH サージ .......................................................... 71 3.3 MI ラットにおけるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン及び Kp-54 の排卵作用.. 72 3.4 MI ラットの卵胞における LH 受容体遺伝子（Lhr）の発現局在 ................. 72 4. 考察 .......................................................................................................................... 72 総合考察 ........................................................................................................................... 81 総括 ................................................................................................................................... 89 謝辞 ................................................................................................................................... 93 参考文献 ........................................................................................................................... 94 4 第1章 1-1 緒言 加齢に伴う生殖機能の低下 生殖機能は，哺乳類を含む全ての動物において子孫を残すために重要な機能 である。哺乳類では，一倍体の生殖細胞が異性の持つ生殖細胞と受精すること で，親とは異なる新たな 2 倍体を持つ受精卵を形成し多様性を獲得することで 進化してきた。 ヒトを初めとする多くの哺乳類は，加齢に伴い生殖機能が低下することが知 られており，月経周期，内分泌，卵細胞の染色体及び胚・胎児に異常をきたす ことが報告されている(1-3)。Menken らの報告によると，ヒトでは 30 歳以上で 受胎率が低下しはじめ，35 歳以上で不妊率が 30-50%となり，平均して 41 歳で 不妊になるという(4)。近年，我が国では女性の社会進出に伴い，合計特殊出生 率（一人の女性が一生に産む子供の平均数）の低下や第一子出生時年齢の上昇 が報告されている(5)。このように子を設けたいと望む年齢が上昇する一方で， 子を設けることができる期間は限られており，産みたい年齢と産める年齢の差 が狭まりつつある。これらの社会的背景から生殖機能の加齢性変化理解し，原 因を解明することは大変重要である。 また閉経は，生殖機能を失うばかりでなく内分泌的変化により様々な疾患が 発症するリスクを増加させる。例えば，卵巣から分泌されるエストロゲンは， 生殖機能に関与する他，血管保護や骨代謝において重要な働きを担っているた め，閉経後に血液中のエストロゲン濃度が低下すると動脈硬化や骨粗鬆症に罹 患するリスクが増加する(6)。 本研究では，加齢に伴い生殖機能がどのように低下していくのかを詳細に観 察し，早期にみられる生殖機能の加齢性変化について原因を解明することを目 的とした。 5 1-2 ラット ラットはヒトと同じく自然排卵動物であり，生殖機能に関するホルモン動態 もヒトと類似する点が多いことから生殖機能の研究にも汎用される。本研究で は，広く普及している系統である Sprague-Dawley（SD）系を実験に用いて，生 殖機能の加齢性変化を調べた。 1-3 発情周期に伴う生殖関連ホルモンの変動 自然排卵動物は，排卵間隔に周期性を示し，ヒトやサルでは約 28 日間隔で 排卵し，ラットでは，4 または 5 日間隔で排卵する。ステロイドホルモンの一 種であるエストロゲンは，卵胞を構成する顆粒層細胞から分泌され，卵胞が成 熟するに従ってその分泌量が増加する。また，卵胞は，排卵すると黄体を形成 しプロゲステロンを分泌するため，排卵後に血液中プロゲステロン濃度が上昇 する。このように，発情周期に伴って卵巣から分泌されるステロイドホルモン の血液中濃度にも周期的な変動が生じ，これはヒトとラットに共通してみられ る。 エストロゲンやプロゲステロンは膣粘膜上皮に作用し，組織学的な変化をも たらすため，膣内膜上皮の形態を反映する膣スメアを観察することで卵巣状態 を非侵襲的且つ継続的に把握することが出来る(7)。この膣スメアを基準に判断 すると，ラットの発情周期は，発情前期，発情期，発情後期及び発情休止期の 4 ステージに分類できる。発情前期の膣スメア像は，角化細胞と有核細胞が混 在することを特徴とし，発情期では多量の角化細胞が観察され，発情後期及び 休止期では角化細胞に加えて白血球が混じるようになる(8)。エストロゲンやプ ロジェステロンの分泌に異常が起こると，膣スメアに影響するため，膣スメア を継続的に観察することで卵巣機能の異常が捕らえられる。 6 ヒトもラットも共通して，卵胞の成熟や排卵は下垂体前葉から分泌される性 腺刺激ホルモンによってコントロールされており，下垂体前葉での性腺刺激ホ ルモン分泌は，その上位の視床下部からの性腺刺激ホルモン放出ホルモン （Gonadotropin-Releasing Hormone ：GnRH）によって促進される。さらに，視 床下部と下垂体前葉の機能は卵巣から分泌されるエストロゲン，プロジェステ ロン及びインヒビン等によって調整されている。未成熟な卵胞は下垂体から分 泌される黄体形成ホルモン（Luteinizing hormone：LH）や卵胞刺激ホルモン （Follicle Stimulating Hormone：FSH）によって発育を促進され，成熟卵胞とな る。卵胞が発育するにつれ血液中のエストロゲン濃度が増加し，これが引き金 となって視床下部が活性化されると GnRH が一過性に大量に分泌される（GnRH サージ） 。GnRH サージが下垂体のゴナドトロフに作用すると LH がサージ状に 分泌され（LH サージ），この LH サージが成熟した卵胞に作用して排卵が誘起 される(9)。血液中のエストロゲン濃度の上昇が LH サージの引き金となること はヒトとラットで共通している。雌ラットの場合，最も血液中のエストロゲン 濃度が増加するのは，発情前期の正午前後で，同日の夕方に LH サージが誘起 され数時間後に排卵が起こる。この血液中エストロゲン濃度の上昇が引き金と なって，視床下部-下垂体系に作用して GnRH と LH サージを誘起する現象をエ ストロゲンの正のフィードバック作用とよぶ。排卵を含む卵巣機能は，視床下 部及び下垂体の支配を受けており，同時に視床下部と下垂体はエストロゲンの 影響を受けている。このような，内分泌学的機構を視床下部-下垂体-性腺軸と よび，視床下部-下垂体-性腺軸いずれかの部位に異常をきたすと，発情周期や 排卵に異常が起こる。雌ラットにおいては，加齢に伴う生殖機能の低下の早期 マーカーとして LH サージの減弱が挙げられる (10-12)。また，ヒトにおいても 閉経前の閉経移行期では LH サージの減弱・消失がみられることが報告されて 7 いる(13)。 1-4 Kisspeptin kisspeptin は G protein-coupled receptor（GPR） 54 のリガンドとして，2001 年 に武田薬品工業によって発見された GnRH 神経のアクティベーターである(14)。 kissppetin は，神経ペプチドであり Kiss1 遺伝子によってコードされている。近 年，ヒトや齧歯類を初めとする雌性動物で，kisspetin は視床下部において GnRH 分泌を調整するホルモンとしての役割が明らかにされた(15-18)。雌ラットの kisspeptin 陽 性 神 経 細 胞 （ kisspeptin 神 経 ） は ， 視 床 下 部 の 前 腹 側 周 囲 核 （anteroventral veriventricular neucleus: AVPV）と弓状核 （arcuate nucleus：ARC） に局在しており(19, 20)，AVPV の kisspeptin 神経は，GnRH をサージ状に分泌さ せることで LH サージを制御し，ARC の kisspeptin は，GnRH のパルスジェネレ ータとして働くことで LH パルスを制御している。kisspeptin 神経は，エストロ ゲン受容体アルファ（estrogen receptor alpha：ER）を発現しており(19, 21, 22)， Kiss1 mRNA の発現は，エストロゲンによって調節されている。エストロゲンが， AVPV の kisspeptin 神経に作用すると Kiss1 mRNA の発現を上昇させ，反対に ARC の kisspeptin 神経に作用すると発現を抑制する。このため，雌ラットでは，血液 中エストロゲン濃度が上昇する発情前期の午後に AVPV の Kiss1 mRNA 発現量 が増加し(19)，エストロゲンの正のフィードバックにより AVPV の kisspeptin 神 経が活性化されると kisspeptin が放出される。AVPV の kisspeptin 神経は，GnRH 神経核が集合する視索前野（preoptic area: POA）に投射しており，放出された kisspeptin は，その受容体である GPR54 を介して GnRH 神経を活性化し，GnRH のサージ状分泌を惹起する(23-26)。この，GnRH サージによって下垂体前葉の性 腺刺激ホルモン分泌細胞から LH がサージ状に分泌される（Fig. 1-1)。 kisspeptin 神経の加齢性変化に関する報告は少なく(27, 28)，本研究では生殖機 能の加齢性マーカーの 1 つである LH サージの減弱・消失について kisspeptin 神 経の加齢による機能的変化に着目し研究を行った。 8 1-5 胚・胎児の分化・発育 LH サージにより卵胞から排卵された卵細胞は卵管膨大部で受精し，細胞分 裂を繰り返しながら子宮へと輸送される。後に胚葉へと分化する内部細胞塊を 形成した胚盤胞は子宮内膜に接着すると，胎盤の原基である外胎盤円錐が子宮 内膜へ侵食し，固着する(29)。この一連の現象を着床という。 着床後，胚を形成する細胞は更に増殖を繰り返し，外胚葉，内胚葉及び中胚 葉を形成して各器官へと分化する。器官形成期を経た後も，胎児は成長を続け ラットでは妊娠 22 日目に，ヒトではおよそ 290 日で分娩に至る。 ヒトもラットも母体の加齢より受胎率の低下(4)，胚の分化異常及び胎児の発 育遅延(3, 30-32)，異常分娩(33)など様々な影響をもたらすことが知られている。 1-6 本研究の目的 加齢により生殖機能がどのように低下するかを理解し，メカニズムを解明す ることは，社会的に極めて重要な課題である。本研究では， SD ラットを用い て，雌ラットの生殖機能が加齢に伴いどのように変化するか調べた（第 2 章）。 次いで，早期にみられる加齢性変化に着目し，胚の分化異常及び着床不全につ いて検討した（第 3 章）。また，早期にみられる別の加齢性変化である異常発情 周期の発生メカニズムを解明するために，LH サージの消失に着目し，視床下 部 AVPV の kisspeptin 神経の関与について検討した（第 4 章）。最後に，自然排 卵が停止した高週齢のラットについて，交尾排卵の可能性を確かめた（第 5 章）。 9 Figure 1-1：視床下部－下垂体－卵巣軸 ① 卵胞の成長に伴い，エストロゲン濃度が上昇する。 ② エストロゲンの正のフィードバック作用によって AVPV の kisspeptin 神経が活性化さ れる。 ③ kisspeptin は GnRH 神経を刺激し，GnRH のサージ状分泌を誘起する。 ④ GnRH サージにより下垂体前葉の性腺刺激ホルモン分泌細胞から LH がサージ状に分 泌される。 ⑤ LH サージは卵巣の成熟卵胞に作用し，排卵を誘起する。 ⑥ ARC の kisspeptin 神経は GnRH 神経のパルスジェネレータとして働く。 10 第2章 雌ラットにおける加齢に伴う生殖機能の変化 背景と目的 1. ヒトやラットをはじめとする雌性哺乳類では，加齢とともに生殖機能が低下 し，不規則な発情周期，排卵障害及び受胎率の低下などを示すことが知られて いる(11-13, 34-37)。しかし，これらの報告の多くは特定の現象について，若い 女性もしくは雌ラットと高齢の女性もしくは雌ラットを比較したものであり (32, 36, 37)，生殖機能の加齢性変化がどの段階から，どのような順番で発現す るかについて言及した報告は乏しい。また，ラットでは系統や飼育条件の違い は生殖機能の加齢性変化に影響を与えるため，異なる施設で異なる系統を用い て得られた結果を比較すことは難しい。よって，生殖機能の加齢性変化がどの ように始まるかを調べるためには，同一系統のラットを用いて同一施設内で経 時的に精査する必要がある。本研究では，同一時期に生産された Sprague-Dawley （SD）ラット（同一ロット）を用いて，春期発動に相当する 6 週齢から半数例 以上で発情周期に異常がみられる 40 週齢の間，発情周期，受胎，胚・胎児の生 存・発育に着目し，加齢に伴う生殖機能の変化を精査した。また，ラットでは 母動物の加齢が胎児の形態にどのような影響をもたらすかについて調べた報告 が乏しいことから，本研究では胎児の外表，内臓及び骨格観察も合わせて実施 した。 2. 材料及び方法 2.1 使用動物 日本チャールスリバー株式会社で生産された Spraque-Dawley 種 Crl:CD(SD) の雌ラット（入荷時週齢 5 週齢，同一時期に生産）及び雄ラット（入荷時週齢 13 週齢，生産及び購入時期は複数にまたがる）を購入し，それぞれ群飼ケージ ［1509 cm2 (底面積)×17.4 cm（高さ），3-5 匹/ケージ］及び単飼ケージ［647.7 cm2 11 （底面積）×17.4 cm（高さ）］で SPF 環境下で飼育した。動物室の照明時間は，12 時間/日（点灯時間：7 時～19 時）とし，飼料はγ線照射した固形飼料（CR-LPF， オリエンタル酵母株式会社，東京，日本）を与え，水道水を自由摂取下で飼育 した。雌ラットは入荷から 1 週間の馴化期間を経た後，各実験に使用する際に 単飼ケージに移動した。全ての動物は武田薬品工業株式会社が定める動物の取 り扱いに関するガイドラインに従って取り扱った。 2.2 膣スメアの採取及び発情周期判定 48 匹の雌ラットを用いて，6 週齢から 36 週間（43 週齢まで）毎朝 9-10 時の 間，膣スメアを採取して発情周期を判定した。採取した膣スメアは 5 分間アル コールで固定し，3％ギムザ染色液で染色した後に，顕微鏡下で観察した。発情 周期の判定は以下の通り実施した。 正常発情周期：4～5 日に 1 回発情期が観察される 異常発情周期：正常発情周期以外で，下記の 3 つに分類した。 延長型：発情期の間隔が 5 日以上要する 持続発情型：角化細胞有意なスメア像が 3 日間以上持続する 持続休止期型：休止期が 6 日以上持続する 評価は 2 週間を 1 期間とし，6-7, 8-9, 10-11, 12-13, 14-15, 16—17, 18-19, 20-21, 22-23, 24-25, 26-27, 28-29, 30-31, 32-33, 34-35, 36-37, 38-39, 40-41 及び 42-43 週齢 毎に発情周期を判定した。 2.3 交尾率，受胎率及び胚・胎児の発達 6, 8, 10, 15, 19, 23, 27, 31, 35 及び 40 週齢の未経産ラット（6-27 週齢 12 N=10/ 各週齢，31-40 週齢 N=20/各週齢）を用いて，1 週間発情周期を観察した後に， 最長 1 週間に渡って雄（交配時週齢：14-30 週齢）と 1 対 1 で同居させた。交 尾確認は膣栓の有無で行い，膣栓がみられた日を妊娠 0 日とし，週齢ごとに交 尾率を算出した。膣栓が確認された雌は雄から隔離し，単飼ケージで妊娠 20 日目まで飼育した。妊娠 20 日に CO2 麻酔下で腹大動脈を切開して安楽死させ， 放血後，肉眼で着床数，死亡胚・胎児数及び生存胎児数を数え，実体顕微鏡下 で黄体数を数えた。胎児の生死は外部からの刺激に対し反応するか否かで判断 した。これらの数値をもとに，週齢ごとに受胎率，平均着床前及び後死亡率を 算出した。各パラメータは以下の式に従って算出した。 交尾率＝膣栓が確認された雌数/交配雌数 受胎率＝着床が確認された雌数/膣栓が確認された雌数 一腹当たりの着床前死亡率＝（黄体数-着床数）/黄体数 一腹当たりの着床後死亡率＝（着床数-生存児数）/着床数 着床前・後死亡率は週齢毎に平均値±SD を算出し、週齢の値とした。 死亡胚・胎児は肉眼では胎盤が認められないが子宮壁に着床した形跡が認め られる吸収胚，肉眼で胎盤の形成が認められる胎盤遺残及び四肢の形成が認め られる状態まで発育し死亡した死亡胎児の 3 つに分類した。 生存児は全例について実体顕微鏡下で外表観察を実施し，体重を測定した。 さらに，半数の生存児について内臓観察を，残りの半数について骨格観察を実 施した。内臓観察に用いた生存児に，心臓を拡張したまま固定する目的で 10% マグネシウム溶液を胸腔内に注入し，その後 10%ホルマリンで固定した。作製 した内臓標本は実体顕微鏡下で観察し，Barrow's 及び Wilson 氏の評価方法に 13 基づき内臓異常及び変異を評価した (38, 39)。骨格観察に用いた生存児は，99% エタノールで固定した後に染色液（2 w/v%アリザリンレッド 10 mL＋KOH 12.5 g/純水 1L）に 2-3 日間浸漬させた。その後 20，50%グリセリン溶液に浸漬させ 観察に用いた（改 Dawson 氏の方法(40)）。作製した骨格標本は実体顕微鏡下で 観察し，骨格異常及び変異を評価し，さらに胎児の発育の指標の一つである仙 尾椎数を数えた。 胎児体重及び仙尾椎数は一腹当たりの平均値を各母動物の値として，週齢ご とに平均値を算出し評価した。 2.4 統計解析及びデータの評価 全データについて，10 週齢を対照群とし統計解析を実施した。発情周期は Wilcoxon 検定を，交尾率及び受胎率は 2x2Fisher の直接確立検定を実施した。 その他のデータについて，Bartlett 検定を実施して分散の均一性を確認し，分散 が均一で無かった黄体数，着床数，着床前死亡率，着床後死亡率，生存児数及 び仙尾椎数はノンパラメトリック Steel 検定を，胎児体重は分散が均一であった ため，パラメトリック Dunnett 検定を実施した。全ての統計解析は SAS function PROBMC (SAS/STAT ソフトウェア: Changes and Enhancements, through Release 6.11. Cary, NC: SAS Institute Inc.)を用いて実施した。 また，雌ラットの週齢と各パラメータの間に相関が認められるか確かめる為 に，相関係数（R2）を算出した。 3. 結果 3.1 発情周期 正常発情周期を示す動物の割合と週齢の間に相関がみられ（R2＝0.8133）， 雌動物が加齢するに従って正常発情周期を示す動物の割合は減少した。9-10 週 14 齢の間で 100%の動物が正常発情周期を示したのに対して，24 週齢以上の動物 では正常発情周期を示す動物の割合が有意に低下し，24-25 週齢の間で正常発 情周期を示した動物の割合は 81%であり，42-43 週齢の間では 19%であった。 26-27 週齢の間で最も多く認められた異常発情周期の型は延長型であり，次い で持続発情型及び休止期型がみられた。その後，週齢が高くなるにつれ，持続 発情型を示す動物が増え，次いで持続休止期型を示す動物が増加した。41-42 週齢の間では 27%が正常発情周期，6%が延長型異常発情周期，6%が持続発情 型異常発情周期及び 60%が持続休止期型異常発情周期を示した（Fig. 2-1）。 3.2 交尾率，受胎率，黄体数及び着床数 10 週齢のラットでは，交尾前に 100%の動物が正常発情周期を示し，どの週 齢と比較しても有意差は認められなかった（Fig. 2-2）。10 週齢のラットでは交 尾率及び受胎率は 100%であり，どちらも雌ラットの週齢に相関して（交尾率： R2=0.7398，受胎率：R2＝0.618）減少した。しかし，どの週齢と比較しても両 パラメータにおいて有意な差は認められなかった（Fig. 2-3）。また，10 週齢の 着 床 数 は 14.6 ± 1.9 で あ り ， 雌 ラ ッ ト が 加 齢 す る に 従 っ て 減 少 し た が （R2=0.3357），どの週齢と比較しても両パラメータにおいて統計学的な有意差 はみられなかった。10 週齢の黄体数は 15.7±1.6 であり，週齢との間に相関は 認められなかった（Fig. 2-4）。 3.3 胚・胎児の死亡率 着床前・後死亡率と母動物の週齢の間に相関がみられ（着床前死亡率： R2=0.4173，着床後死亡率：R2＝0.6057），母動物が加齢するに従って両パラメ ータ共に増加した。しかし，10 週齢の着床前・後死亡率（それぞれ 7.0±7.7 及 び 11.1±9.2%）と比較してもどの週齢も統計学的な有意差は認められなかった 15 （Fig. 2-5）。 死亡胚・胎児の状態を吸収胚，胎盤遺残及び死亡胎児に分類したところ，ど の週齢の母動物においても胎盤遺残が主であり，その数は母動物の週齢に比例 し増加した（R2=0.6024）。10 週齢でみられた胎盤遺残の割合は 1.5±1.2%であ り，どの週齢と比較しても統計学的な有意差は認められなかった。死亡胎児は 10 及び 35 週齢の母動物で少数みられたが母動物の週齢との間に相関はみられ なかった。また，吸収胚は 40 週齢の動物のみで確認された（Fig. 2-6）。 3.4 胎児の生存，発育及び形態学的異常 平均生存児数は母動物の週齢に相関して減少し（R2=0.4723），10 週齢の平 均生存児数は 13.0±2.3 であり，40 週齢では 5.9±5.2 と有意に低値であった（Fig. 2-7）。また，胎児体重及び仙尾椎数は母動物の加齢に従いどちらも低下した（胎 児体重(雌/雄)：R2=0.582/0.8095，仙尾椎数：R2=0.697）。10 週齢の母動物から 得られた胎児の平均重量は雄胎児及び雌胎児でそれぞれ 3.67±0.29 及び 3.48± 0.26 g であった。これに対して 35 週齢の母動物から得られた雌胎児の重量は 3.12±0.27 g であり，40 週齢の母動物から得られた雄及び雌胎児の重量はそれ ぞれ 2.99±0.61 及び 3.04±0.57 と 10 週齢の胎児と比べてそれぞれ有意に低値で あった（Fig. 2-8 A）。40 週齢の母動物から得られた胎児の仙尾椎数は 6.7±0.8 であり，10 週齢の母動物から得られた胎児（7.7±10.3）と比較すると統計学的 に有意な低値であった（Fig. 2-8 B）。 外表観察では，35 及び 40 週齢の母動物から得られた胎児で，齊ヘルニアが それぞれ 3/132 例（同週齢内の平均として 2.1％）及び 1/59 例（5.6％）にみら れた。内臓観察では膜性心室中隔欠損が 8，10 及び 19 週齢の母動物から得られ た胎児でみられ，発現頻度はそれぞれ 1.4，2.5 及び 1.6%であり，発現頻度と母 16 動物の週齢に相関がみられなかった。また，骨格観察では 31 及び 40 週齢の母 動物から得られた胎児で頚肋骨がそれぞれ 2.4 及び 2.9%の頻度でみられた （Table 2-1）。 4. 考察 本研究では，雌ラットにおける生殖機能の加齢性変化がいつからどのような 順で認められるかを明らかにする目的で，発情周期を 6-43 週齢に渡り経時的に 観察し，交尾の許容，受胎及び胚・胎児の生存性・発達を 6 週齢から 40 週齢の 雌ラットを用いて検査した。得られた生殖パラメータについて成績が良好であ った 10 週齢を対照群とし，その他の週齢と統計解析を実施した。その結果，24 週齢以上で正常発情周期を示す動物の割合が低下し，35 週齢以上の母動物から 得られた胎児では胎児体重の低下や仙尾椎数の減少が認められ，40 週齢の母動 物では生存児数が減少した。その他，黄体数を除く全てのパラメータ（交尾率， 受胎率，着床数，着床前・後死亡率，胎盤遺残数）に母動物の週齢と相関がみ られた。 雌ラットは 4-5 日の発情周期を示す自然排卵動物であり，膣スメアは卵巣の 内分泌状態（特にエストロゲンとプロゲステロンの分泌）を反映していること から膣スメアを経時的に観察することで排卵周期を知ることができる(7)。 24-25 週齢で最も多くみられた異常発情周期は延長型であったことから，排卵 間隔の延長を示すラットの割合が 24 週齢から増加したことが明らかとなった。 加齢に伴い異常発情周期を示したラットでは，初期に延長型もしくは持続発情 型を示し，その後持続休止期型を示す傾向がみられた。持続発情型及び持続休 止期型異常発情周期を示すラットの卵巣は萎縮し黄体数が減少していること から(41)，このような動物では排卵障害が起こり，自然排卵が停止していると 17 推察される。本研究では，42-43 週齢の間で正常性周期を示した動物の割合は 27%であり（Fig. 2-1），この結果は，Watanabe らの結果と概ね一致している(42)。 既報告によると，Long-Evans ラットでは 8 ヶ月齢以上で正常性周期を示した 動物の割合が 50%であり，Jcl:Wistar ラットでは 40 週齢以上で 80%の動物が正 常発情周期を示したとある(36, 37, 42)。また，未経産のラットは経産のラット に比べて早期に異常発情周期を示すことが報告されている(36, 37)。これらの 報告を踏まえると，加齢性にみられる排卵障害の発生時期はラットの系統及び 分娩経験の有無によって異なることが考えられる。SD ラットは他系統と比較 し早期に加齢性の排卵障害を示すことが推測された。 以上の結果から，本研究で使用した Crl:CD(SD)ラットでは 24 週齢から卵巣 機能が低下し始めたものと推察した。 本研究では，10 週齢の動物の交尾率が 100％だったのに対して，35 週齢の動 物では 80%であり，40 週齢の動物では 70％であったことから，交尾率は雌ラ ットの加齢に伴い減少することが示された。また，膣栓が確認出来た高週齢の 動物では，若い動物に比べてケージの底に落ちている膣栓の数が少ない傾向が あり（データ示さず），交尾回数が減少した可能性が示唆された。 本研究では，受胎率及び着床数に 10 週齢の動物と比較していずれの週齢で も統計学的な有意差は認められなかったが，両パラメータとも母動物の週齢と の間に負の相関が認められた。また，生存児数についても母動物の週齢との間 に負の相関が認められ，40 週齢では 10 週齢に比べて有意な低値を示した。着 床前・後死亡率も同様に母動物の週齢との間に負の相関が認められたが，黄体 数と母動物の間に相関が認められなかったことから受胎率，着床数及び生存児 数の減少は着床前・後死亡率の増加によるもと推察された。Matt らは，高週齢 の母動物で一腹児数が減少するのは，正常に発達する初期胚の数が減少するた 18 めであると報告している(37)。また別の既報告で，9-10 ヶ月齢の動物の受精卵 では，3-4 ヶ月齢に比べて卵割の遅延及び割球の断片化または変性が高頻度で みられることが報告されている(43)。さらに，本研究で死亡した胚・胎児を吸 収胚，胎盤遺残及び死亡児に分類したところ，胎盤遺残数と母動物の週齢に相 関が認められ，着床後の胚は主に妊娠中期で死亡した可能性が考えられた。こ のことから本研究で高週齢の母動物にみられた着床前・後死亡率の上昇は，母 動物が加齢することにより妊娠初期から中期胚の発生・分化に異常があり生存 性が低下した可能性が考えられた。一方，排卵したが受精せず，受胎率が低下 している可能性も否定できないことから，高週齢のラットでみられた受胎率低 下の原因を解明する目的で妊娠初期から中期の胚の発達に着目したさらなる研 究をおこない，その結果を本研究の第 3 章に記述した。また，胚の発生は正常 であるが母動物の妊娠維持機能が加齢により低下している可能性も考えられ， これについては今後の課題と考える。 胎児重量について 10 週齢を対照群とし比較したところ，35 週齢の母動物か ら得られた雌胎児及び 40 週齢の雌雄胎児の重量が有意に低値であった。胎児の 成長の指標として用いられる仙尾椎数は(44)， 40 週齢の母動物から得られた胎 児で 6.7 と 10 週齢の母動物と比較して有意に低値であった。したがって，胎児 の発育遅延は胎児体重の減少がみられた 35 週齢以上の母動物で起こるものと 推察した。 外表観察では，35 及び 40 週齢の母動物から得られた胎児で，齊ヘルニアが それぞれ 3/132 例（同週齢内の平均として 2.1％）及び 1/59 例（5.6％）にみら れた。過去 10 年間に同施設で 630 匹の Crl:CD(SD)ラットを用いて胎児の外表 観察を実施したが，齊ヘルニアがみられた胎児は 1 例もみられておらず，本研 究でみられた齊ヘルニアは母動物が加齢したことによるものと考えられた。 19 以上の結果から，雌 Crl:CD(SD)ラットでは加齢により発情周期，交尾率， 受胎率，生存児数及び胚・胎児の発生及び成長に影響がみられ，24 週齢から排 卵障害を示す動物の割合が増加し，生殖機能が減退することが明らかとなった。 本研究では，本章でみられた母動物の加齢に伴う胚の生存性の低下及び加齢 に伴う異常発情周期について原因を解明するため，それぞれ第 3 章及び第 4 章 でさらに検討した。 20 Figure 2-1：雌ラットの加齢による発情周期の変化 6-43 週齢の間膣スメアを採取し，発情周期を観察した（N=48）。 Normal (正常発情周期)：4～5 日に 1 回発情期が観察された場合，Prolonged estrous cycles (延長型異常発情周期)：発情期の間隔が 5 日以上延長した場合， Persistent estrus (持続発情型異常発情周期)：角化細胞有意なスメア像が 3 日間 以上持続した場合，Persistent diestrus (持続休止期型異常発情周期)：休止期が 6 日以上持続した場合，＊：P<0.05，vs 21 10-11 週齢 Figure 2-2：交配に使用した雌ラットの交尾前の発情周期の加齢性変化 6 から 40 週齢のラットについて，交尾前の 1 週間発情周期を観察した（6 から 27 週齢 N=10/各週齢，31 から 40 週齢 発情周期を示した雌ラットの割合を示す。 22 N=20/各週齢）。数値は正常 Figure 2-3：雌ラットの加齢による交尾率及び受胎率の変化 交配翌日の朝に膣栓が確認された雌ラットについて交尾が完了したと判断し，週例毎に 交尾率（copulation index: 膣栓が確認された雌数/交配雌数×100）を算出した（6-27 週 齢 N=10/各週齢，31-40 週齢 N=20/各週齢）。また，交尾が完了した雌ラットを妊娠 20 日で剖検し，妊娠したラットの割合を算出し受胎率（fertility index: 着床が確認され た雌数/膣栓が確認された雌数×100）とした（6，8，10，15，19，23，27，31，35 及び 40 週齢についてそれぞれ N=10，10，10，10，9，10，9，9，18，16 及び 14）。数値は 交尾または受胎が確認された雌ラットの割合を示す。 23 Figure 2-4：母動物の加齢による黄体数及び着床数の変化 妊娠 20 日目に剖検し，妊娠が確認されたラットについて母動物毎に黄体 数（No. of Corporalutea）と着床数（No. of implantation sites）を数え，週齢 毎に平均値及び SD を算出した（6，8，10，15，19，23，27，31，35 及び 40 週齢についてそれぞれ N=10，10，10，10，9，9，9，7，14，12 及び 10）。数値は平均値±SD を示す。 24 Figure 2-5：母動物の加齢による着床前死亡率及び着床後死亡率の変化 妊娠 20 日目に剖検し，妊娠が確認されたラットについてそれぞれ着床前死 亡率［A，Pre-implantation loss rate, 着床前死亡率=（黄体数‐着床数）/黄体 数×100］及び着床後死亡率［B，Post-implantation loss rate,着床後死亡率＝（着 床数－生存胎児数）/着床数×100］を個体ごとに算出し，週齢毎に平均値及 び SD を算出した。6，8，10，15，19，23，27，31，35 及び 40 週齢につい てそれぞれ N=10，10，10，10，9，9，9，7，14，12 及び 10，数値は一腹当 たりの平均値 ± SD を示す。 25 Figure 2-6：母動物の週齢別死亡胚・胎児の分類 妊娠 20 日の剖検時における胚・胎児の死亡を分化・発育の状態から，吸収 胚（Resorption），胎盤遺残（Placental remnant）及び死亡児（Dead fetuses） に分類し，一腹あたりにみられた各死亡胚・胎児の割合を算出した後，週例 毎に平均値及び SD を算出した。6，8，10，15，19，23，27，31，35 及び 40 週齢についてそれぞれ N=10，10，10，10，9，9，9，7，14，12 及び 10， 数値は一腹当たりの平均値±SD を示す。 26 Figure 2-7：母動物の加齢による生存児数の変化 妊娠 20 日に剖検し生存児数（No. of live fetuses）を数え，週例毎に一腹あた りの平均生存児数を算出した。使用した母動物数：6，8，10，15，19，23， 27，31，35 及び 40 週齢についてそれぞれ N=10，10，10，10，9，9，9，7， 14，12 及び 10，数値は一腹当たりの平均値±SD を示す。*：P<0.05 vs 10 週齢 27 Figure 2-8：母動物の加齢による胎児体重及び胎児の仙尾椎数の変化 妊娠 20 日目の剖検で得られた生存児について胎児体重を測定し，週例毎に一 腹あたりの平均胎児体重（Fetal body weight）を算出した（A）。また，半数の 生存児について骨格観察を実施し，仙尾椎数を数え，一腹あたりの平均仙尾 椎数（No. of ossified sacro-caudal vertebrae）を算出した（B）。使用した母動物 数：6，8，10，15，19，23，27，31，35 及び 40 週齢についてそれぞれ N=10， 10，10，10，9，9，9，7，14，12 及び 10，数値は一腹当たりの平均値±SD を示す。*：P<0.05 vs 10 週齢 28 Table 2-1 胎児の外表，内臓及び骨格観察 Age at mating (week) No. of dams External findings No. of fetuses examined Abnormality frequency (%) Abnormality type Umbilical hernia Visceral findings No. of fetuses examined Abnormality frequency (%) Abnormality type Membranous ventricular septal defect Interrupted aortic arch Persistent atrioventricular canal 29 Variation frequency (%) Variation type Left umbilical artery Dilated renal pelvis Dilated ureter Skeletal findings No. of fetuses examined Abnormality frequency (%) Abnormality type Variation frequency (%) Variation type Short supernumerary rib Bipartite ossification thoracic centrum Wavy rib Cervical rib Asymmetric sternebra 6 10 8 10 10 10 15 9 19 9 23 9 27 7 31 14 120 0 130 0 130 0 114 0 123 0 114 0 80 0 137 0 132 2.1 (3, 3) 59 5.6 (1, 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 2.1 (3, 3) 5.6 (1, 1) 64 0 71 1.4 72 2.5 (2, 2) 60 0 65 1.6 61 0 44 0 76 0 74 0 34 0 0 0 1.4 1.4 2.5 (2, 2) 0 0 0 1.6 0 (1, 1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.6 (1, 1) 0 0 0 0 0 (1, 1) (1, 1) 0 (1, 1) 35 12 40 9 2.7 (2, 2) 0 1.4 (1, 1) 0 1.6 (1, 1) 0 5.6 (4, 2) 1.4 (1, 1) 1.2 (1, 1) 0 2.7 (2, 2) 0 0 0 0 0 0 1.4 (1, 1) 0 0 0 0 1.6 0 0 (1, 1) 0 0 0 3.6 (2, 2) 1.8 (1, 1) 1.8 (1, 1) 1.4 (1, 1) 0 0 1.2 (1, 1) 0 0 0 0 0 53 0 59 0 58 0 54 0 58 0 53 0 36 0 54 0 48 0 18 0 21 (12, 6) 9.4 (5, 5) 12 (6, 5) 21 (13, 5) 16 (11, 7) 2.4 (1, 1) 5.7 (4, 4) 16 (9, 6) 2.9 (1, 1) 8.1 (4, 3) 13 (8, 6) 6.9 (4, 4) 7.7 (3, 2) 18 (10, 3) 14 (6, 5) 2.4 (1, 1) 0.9 (1, 1) 9.7 (6, 3) 1.9 (1, 1) 0 0 0 7.7 0 0 0 (4, 2) 2.5 (1, 1) 0 0 0 3.8 (3, 3) 0 0 0 5 0 0 0 8.2 0 0 0 (5, 2) 1.2 (1, 1) 1.2 (1, 1) 2.4 (1, 1) 0 4.2 (2, 2) 0 0 2.1 (1, 1) 9 (4, 5) 括弧内は胎児数，母動物数を示す。 29 (3, 2) 0 0 0 0 0 0 0 2.9 (1, 1) 0 第 3 章 高週齢ラットの妊娠初期及び中期における胚・胎児の生存及び発育 背景と目的 1. 第 2 章で，高週齢の母動物で生存児数の減少と受胎率の低下がみられ，これ らは妊娠初期から中期の胚の生存性の低下に起因している可能性が考えられた。 この加齢性変化を詳しく調べるため，高週齢ラットの妊娠初期及び中期の胚の 生存性及び形態について検査した。 2. 材料及び方法 2.1 使用動物 日本チャールスリバー株式会社で生産された Spuraque-Dawley 系の雌ラット （Crl:CD(SD)，5-8 週齢）及び雄ラット（13 週齢）を購入し，それぞれ群飼ケ ージ［1509 cm2 (底面積)×17.4 cm（高さ），3-5 匹/ケージ］及び単飼ケージ［647.7 cm2（底面積）×17.4 cm（高さ）］で SPF 環境下で飼育した。動物室の照明時間は， 12 時間/日（点灯時間： 7 時～19 時）とし，飼料はγ線照射した固形飼料（CR-LPF， オリエンタル酵母株式会社，東京，日本）を与え，水道水を自由摂取下で飼育 した。雌ラットは入荷から 1 週間の馴化期間を経た後，各実験に使用する際に 単飼ケージに移動した。全ての動物は武田薬品工業株式会社が定める動物の取 り扱いに関するガイドラインに従って取り扱った。 2.2 交配 または週齢の雌ラットを発情前期の夕方に雄と交配し，翌朝膣栓を 確認して交尾の有無を判定し，膣栓が確認された日を妊娠日とした。 2.3 黄体数，着床数，着床率及び着床前死亡率の算出並びに着床部位の観察 妊娠，，，または日目の時に，子宮外観から着床点を可視化し着床 30 を判定するため 3%エバンスブルーmL/匹（0.9%生理食塩水で調整）を静脈内 投与した。投与時間後に高濃度の CO2 を用いて安楽死し，卵巣及び子宮を摘 出して黄体数及び着床数を数え，受胎率，着床率お呼び着床前死亡率を下記の 式をもとに算出した。 受胎率＝着床がみられた雌数/膣栓がみられた雌数×100 着床率＝着床数/黄体数×100 着床前死亡率＝（黄体数－着床数）/黄体数×100 また，妊娠 6，7 及び 8 日の子宮について着床部位の外観を肉眼で観察した 後に，10w/v%ホルマリンを用いて固定した。ホルマリン固定から少なくとも 1 週間以降に，着床部位を切り出しパラフィンで包埋した。回転式ミクロトーム を用いて 10 m の薄切組織切片を作製し，HE 染色した。作製した組織標本は 光学顕微鏡下で観察した。 群構成 14 週齢（匹数 a） a 37～41 週齢（匹数 ） 5 日目 6 日目 3 4 5 4 妊娠日齢 7 日目 8 日目 12 日目 5 4 3 5 2 4 a：膣栓が確認された動物数 2.4 実体顕微鏡下での観察 黄体数及び着床数の算出並びに着床部位の観察に用いたラットとは別のラッ トを用いて，妊娠 11 日目の胚を実体顕微鏡下で観察した（14 及び 37-41 週齢， それぞれ N=2）。妊娠 11 日に高濃度の CO2 を用いて安楽死させ，速やかに子宮 31 を摘出して子宮角に沿って切開した。着床部位を確認した後，ピンセットを用 いてライヘルト膜を破り，胚を摘出した。得られた胚は直ちに 99%エタノール で固定した後，5%グリセリンに置換し実体顕微鏡下で観察した。 2.5 統計 各パラメータについて，妊娠日毎に t 検定を実施した。全てのデータは平均 値±標準誤差で表示し，P 値が 0.05 未満の場合に統計学的に有意な差であると 判定した。 結果 3. 3.1 受胎率，黄体数，着床数，着床率及び着床前死亡率（Table 3-1,及び 2, Fig. 3-1 及び 2） 受胎率は， 14 週齢のラットではいずれの妊娠日においても 100%であり，37-41 週齢のラットでは妊娠 5，6 及び 8 日で 100%，妊娠 7 日で 80%であったが，妊 娠 12 日で 33.3%と低値を示した。しかし，着床が確認できなかった 37-41 週齢 のラット（動物番号 139，177 及び 168）でも黄体が観察され，14 週齢のラット と 37-41 週齢のラットで黄体数に差はみられなかった。そのため，37-41 週齢の ラットの着床前死亡率は妊娠 5 から 8 日では 10%前後であったのに対して，妊 娠 12 日で 72.2%と高値を示した。 受胎が確認された動物について着床数及び着床率を算出した結果，いずれの 妊娠日についても 14 週齢のラットと 37-41 週齢のラットの間で差は認められな かった。 3.2 着床部位の観察 着床部位を肉眼で観察した結果，着床部位の大きさが妊娠 5 日目では 14 週齢 32 のラットと 37-41 週齢のラットで違いは認められなかったが，妊娠 6～8 日目で 37-41 週齢のラットの着床部位は 14 週齢のラットに比べて明らかに小さかった。 Figure 3-4 にある代表例について，着床部位間の子宮の太さに対する着床部位の 直径（子宮角に対して垂直方向）の比を，写真をもとに算出した結果，14 週齢 のラットでは妊娠 5，6，7，8 及び 12 日目で 1.0±0.18（測定した着床部位数 13）， 1.6±0.18（14），2.1±0.17（13），2.5±0.19（13）及び 3.3±0.8（15）であった のに対して，37-41 週齢のラットでは妊娠 5，6，7，8 及び 12 日目で 1.1±0.1 （13），1.2±0.2（12），1.5±0.3（14），2.0±0.4（10）及び 2.6±0.2（10）と妊 娠 5 日目を除くいずれの妊娠日においても 14 週齢のラットと比べて有意に低値 であった（妊娠日毎に T 検定を実施）。また，着床部位の間隔は 14 週齢のラッ トで概ね均等であったが，37-41 週齢のラットの着床部位の間隔はいずれの妊 娠日でも不均一であった。（Fig. 3-4）。 3.3 胚の形態学的検査 3.3.1 組織学的検査（妊娠 6，7 及び 8 日） 14 週齢のラットから得られた正常胚は，妊娠 6 日目で内部細胞塊（inner cell mass），卵黄嚢腔（yolk-sac cavity）及び外胎盤円錐（ectoplacental cone）の形成 がみられた。また，子宮内膜では細胞が肥大し脱落膜細胞化が認められた（Fig. 3-5）。14 週齢のラットでは子宮内膜上皮細胞の消失が認められ，着床部位周辺 の子宮内に毛細血管の浸潤が多くみられた（Fig. 3-6）。14 週齢のラットから得 られた胚では妊娠 8 日目で外胚葉，内胚葉及び中胚葉が確認出来た（Fig. 3-7）。 これに対して，37-41 週齢のラットから得られた胚では，妊娠 6 日目で内部細 胞塊や外胎盤円錐の区別がつかない構造異常を示す胚（妊娠 6 日，Fig. 3-5B） や発達遅延（妊娠 6 日，Fig. 3-5C）を示す胚がみられ，子宮内膜上皮細胞の単 33 層構造に変化はみられず，脱落膜の形成もみられなかった（Fig. 3-5）。妊娠 7 日目で，一部の子宮内膜の円柱上皮細胞は消失していたものの，14 週齢のラッ トと比べて毛細血管の浸潤が少なく外胎盤円錐内に赤血球の浸潤がみられない 胚が観察された。さらに，胚の大きさも 14 週齢のラットに比べて小さく，外胎 盤円錐も未発達であった（Fig. 3-6）。妊娠 8 日目では，死亡胚が観察された（Fig. 3-7）。 3.3.2 実体顕微鏡下での観察（妊娠 11 日） 14 週齢のラットでは頭褶（head fold），体節（somite）及び心臓原基（heart rudiment）の形成がみられたのに対して（Fig. 3-8 A 及び B），37-41 週齢のラッ トから得られた異常胚では頭褶及び心臓原基が確認できず体節の低形成がみら れた。さらに，37-41 週齢のラットから得られた胚では外胎盤円錐の発生位置 に異常がみられた（Fig. 3-8 C 及び D）。また，別の異常胚では胚の構造が確認 できないものもあった（Fig. 3-8 E）。 4. 考察 ラットでは，排卵後の卵子は卵管膨大部に輸送され妊娠 0 日午前中に卵管膨 大部で受精する。受精卵は卵割を繰り返しながら卵管内を移動し妊娠 4 日目に 子宮に到達する。妊娠 5 日目に，卵巣から分泌されるエストロゲン及びプロゲ ステロンによって胚受容能が整った子宮内膜上皮と接着し，着床が開始する (45)。従って，本研究で観察を開始した妊娠 5 日目では正常な動物において胚 の着床が開始されている胎日齢である。 妊娠初期では着床部位のふくらみが小さく，外観から着床部位を判断するこ とは困難であるが，エバンスブルー溶液を静脈内投与すると着床部位の血管新 34 生が盛んな部位にエバンスブルーが蓄積することで子宮の外観から着床部位を 特定することが出来る。本研究でもこの手法を用いて妊娠初期から中期の着床 部位を特定した。その結果，37-41 週齢のラットの受胎率は，妊娠 5 から 8 日 目に剖検した動物について 80 から 100%と高い値であったが，妊娠 12 日に剖 検した動物については 33%（1/3 例）と低値であった。着床がみられなかった 妊娠 7 日の 1 例（F139）及び妊娠 12 日の 2 例（F168 及び 177）においても黄 体数は減少しておらず，着床前死亡率は妊娠 5 から 8 日で 10%前後であったの に対し，妊娠 12 日では 72%と高値を示した。 着床部位を組織学的に検査した結果，37-41 週齢のラットから得られた胚で は発達遅延及び外胎盤円錐の低形成を特徴とする形態学的な異常がみられた。 正常な胚では，着床開始からすぐに外胎盤円錐の形成が始まり，外胎盤円錐は 子宮内膜へと浸潤し，基底部にある二倍体栄養外胚葉細胞が増殖して，胚体外 外胚葉になり将来胎盤へと分化することから胎盤系の組織幹細胞と考えられて いる(45)。また，本研究では 37-41 週齢ラットで妊娠 8 日目に子宮内膜側に吸収 される中途思われる死亡胚が確認されたことから，これらの異常胚では外胎盤 円錐の低形成により，正常に胚が子宮内膜へ浸潤することができず，胎盤を形 成する前に死亡し，子宮内膜に吸収されたと考えられた。そのため妊娠中期以 降まで着床痕が残らず，妊娠 12 日の剖検では見かけ上受胎率が低下し着床前 死亡率が上昇したと考えられた。 また，37-41 週齢ラットでは着床部位のふくらみが小さく，妊娠 7 日目の子 宮内膜を組織学的に観察すると，毛細血管の浸潤が乏しく脱落膜の形成がみら れなかった。脱落膜とは妊娠の成立に伴い変化し，分娩時に胎盤とともに剥脱 する子宮内膜組織の一部であり，子宮内膜間質細胞が胚の着床によって形態学 的および機能的に分化をする過程を脱落膜化という(46, 47)。この分化過程は絨 35 毛細胞の浸潤，胎盤形成に重要な役割を果たしていると考えられている(48)。 子宮内膜の毛細血管の拡張・新生，間質の浮腫や脱落膜化等は胚が子宮内膜に 浸潤し発育・分化することで進行することから，37-41 週齢ラットでは外胎盤 円錐の異常を伴った胚が子宮内膜へ正常に浸潤できず，脱落膜化が正しく引き 起こされなかったと推察した。 正常な動物では，子宮に到達した胚の着床間隔は均一に保たれるのに対して， 本研究では，37-41 週齢ラットでいずれの妊娠日でも着床間隔が不均等であっ た。着床間隔を決定するメカニズムは未だ明らかとなっていない部分が多いが， アラキドン酸カスケードが重要な役割を果たすことが知られている。COX-2 は アラキドン酸カスケードで遊離アラキドン酸を代謝しプロスタグランディンを 合成する。COX-2 を抑制するためにインドメタシンを投与したラットでは，子 宮の着床間隔に異常がみられることが報告されている(49)。また，近年の研究 でリゾホスファチジン酸（LPA）受容体 LPA3(50, 51)及び細胞質型フォスフォリ パーゼ A2（cPLA2）(52)が着床時期及び配列に関与していることが明らかと なった。LPA3 は G タンパク質共役型受容体であり，アラキドン酸カスケード において重要な役割を果たすことが知られている。また，cPLA2はアラキドン 酸代謝と密接に関連しており，生体膜リン脂質からアラキドン酸を選択的に遊 離する。LPA3 または cPLA2のホモ欠損マウスでは，着床時期の遅延，着床部 位の配列の異常及び一腹あたりの胎児数が減少することが報告されている(50, 52)。今のところ高週齢のラットの子宮におけるアラキドン酸カスケードに関す る報告はみあたらないが，本研究で明らかとなった加齢に伴う着床間隔の異常 にもアラキドン酸カスケードの異常が関与する可能性が考えられた。 妊娠 11 日の 37-41 週齢ラットから得られた胚を形態学的に観察した結果，外 胎盤円錐の形態異常だけでなく頭褶及び心臓原基の形成がみられなかった。こ 36 のことから，胚の構造異常は特定の器官ではなく，様々な器官にわたることが 確認された。また，別の胚では器官の構造が確認できないものがあったことか ら，胚の構造異常は複数の因子によるもので，同一母体でも胚によって異常な 発生に関わる因子は異なる可能性が考えられた。 以上のように，37-41 週齢のラットでは妊娠初期から中期にかけて着床及び 胚の発育・分化に異常がみられた。しかし，これらの異常が母動物の子宮環境 や内分泌状態と胚のどちらに起因するものなのか明らかではない。本研究でみ られた異常が母動物由来か胚由来か明らかにするには，37-41 週齢のラットと 14 週齢のラットで受精卵の交換移植をする等のさらなる研究が必要である。 37 Table 3-1：14 週齢のラットにおける受胎率（Fertility index），黄体数（No. of corpus luteum）, 着床数（No. of implantation site） 及び着床率（implantation rate） No. of imprantation site No. of corpus luteum implantation site (%) Pre-implantation loss (%) Gestation day Animal No. Fertility index (%) Day 5 F1 F2 F3 100.0 15 13 17 15.0 ± 2.0 14 13 12 13.0 ± 1.0 93.3 100.0 70.0 87.8 ± 15.7 6.7 0.0 29.4 12.0 ± 15.4 Day 6 F11 F12 F13 F14 100.0 15 16 20 14 16.3 ± 2.6 14 14 20 12 15.0 ± 3.5 93.3 87.5 100.0 85.7 91.6 ± 6.5 6.7 12.5 0.0 14.3 8.4 ± 6.5 Day 7 F4 F5 F6 F15 F16 100.0 15 13 17 16 12 2.1 14 11 17 16 12 2.5 93.3 84.6 100.0 100.0 100.0 6.8 6.7 15.4 0.0 0.0 0.0 4.4 ± 6.8 Day 8 F17 F18 F19 F20 100.0 15 13 16 13 14.3 ± 1.5 14 11 15 13 13.3 ± 1.7 93.3 84.6 93.8 100 92.9 ± 6.3 6.7 15.4 6.3 0.0 7.1 ± 6.3 Day 12.5 F7 F8 F9 100.0 15 21 20 18.7 ± 3.2 15 12 19 15.3 ± 3.5 100 57.1 95.0 84.0 ± 23.4 0.0 42.9 5.0 16.0 ± 23.4 individual data individual data mean±S.D mean±S.D individual data mean±S.D individual data mean±S.D 38 14.6 ± 14.0 ± 受胎率＝着床がみられた雌数/膣栓がみられた雌数，着床率＝着床数/黄体数 38 95.6 ± Table 3-2：37-41 週齢のラットにおける受胎率（Fertility index），黄体数（No. of corpus luteum）, 着床数（No. of implantation site） 及び着床率（implantation rate） Gestation day Animal No. Day 5 175 179 128 FA-5 FA-6 Day 6 FA-7 FA-9 FA-10 H18 Fertility index (%) No. of corpus luteum individual data No. of imprantation site mean±S.D individual data ± 1.1 13 15 14 13 11 1.7 13 15 7 12 11.0 14.0 100.0 14 15 11 13 Day 7 178 116 165 149 139 (NP) 80.0 13 16 16 13 13 14.2 ± 1.6 13 16 14 12 0 Day 8 FA-4 F217 100.0 12 19 15.5 ± 4.9 10 18 Day 12.5 177 (NP) 168 (NP) 143 25.0 13 16 12 13.7 ± 2.1 10 39 100.0 16 15 14 16 17 15.6 13.3 ± implantation site (%) mean±S.D individual data ± 1.5 81.3 100 100 81.3 64.7 3.4 92.9 100 63.6 92.3 ± 6.3 100.0 100.0 87.5 92.3 0 76.0 ± 5.7 83.3 94.7 89.0 13.2 11.8 ± 10.0 83.3 85.5 87.2 Pre-implantation loss (%) mean±S.D individual data ± 14.9 18.8 0.0 0.0 18.8 35.3 14.6 ± 14.9 16.1 7.1 0.0 36.4 7.7 12.8 ± 16.1 ± 42.8 0.0 0.0 12.5 7.7 0 4.0 ± 5.8 ± 8.1 16.7 5.3 11.0 ± 8.1 100 100.0 16.7 72.2 ± 48.1 ± 83.3 mean±S.D NP：不妊動物（non-pregnancy），-：不妊動物のためデータ無し，受胎率＝着床がみられた雌数/膣栓がみられた雌数， 着床率＝着床数/黄体数 39 Figure 3-1：14 週齢ラットと 37-41 週齢ラットの受胎率の比較 14 週齢及び 37-41 週齢の妊娠ラットについて妊娠 5，6，7，8 及び 12 日目 に剖検し，受胎率（Fertility index：着床がみられた雌数/膣栓がみられた雌 数）を妊娠日毎に算出した（14 週齢：妊娠 5，6，7，8 および 12 日 N＝ 3，4，5，4 および 3，37-41 週齢：妊娠 5，6，7，8 および 12 日 5，2 および 4）。 40 N＝5，4， Figure 3-2：14 週齢ラットと 37-41 週齢ラットの着床前死亡率の比較 14 週齢及び 37-41 週齢の妊娠ラットについて妊娠 5，6，7，8 及び 12 日目 に剖検し，着床前死亡率（Pre-implantation loss：（黄体数-着床数）/黄体数 ×100）を妊娠日毎に算出した（14 週齢：妊娠 5，6，7，8 および 12 日 ＝3，4，5，4 および 3，37-41 週齢：妊娠 5，6，7，8 および 12 日 4，5，2 および 4）。 41 N N＝5， B C D E F G H I J 42 A Figure 3-4：14 週齢のラットと 37-41 週齢のラットの子宮 A-E：14 週齢のラット，F-J：37-41 週齢のラット，A・F：妊娠 5 日目，B・G：妊娠 6 日目，C・H：妊娠 7 日目，D・I： 妊娠 8 日目，E・J：妊娠 12 日目，矢印：エバンスブルー陽性（着床部位） 42 A C B Figure 3-5：妊娠 6 日目の胚の組織像 A：14 週齢のラットから得られた正常な胚，ep：ectoplacental cone（外胎 盤円錐）, imc：inner cell mass（内細胞塊）, ysc：yolk-sac cavity（卵黄嚢空）， ＊脱落膜，B・C：37-41 週齢のラットから得られた異常胚（▲），B：構造 異常を示す胚，C：発達遅延を示す胚 43 Figure 3-6：妊娠 7 日目の胚の組織像 A-C：14 週齢のラット，D-F：37-41 週齢のラット，A・D：着床部位の断面（x4）， A’・D’：14 週齢のラットでは着床周囲の子宮内膜に毛細血管（△）の新生が多 くみられるが（A’），37-41 週齢のラットでは毛細血管の新生が乏しい（B’），B・ E（x20）：14 週齢のラットでは外胎盤円錐が発達し胚が子宮内膜へ浸潤する様 子がうかがえるが（B，＊：脱落膜），37-41 週齢のラットでは外胎盤円錐の発 達が乏しく，子宮内膜への浸潤も 14 週齢に比べて弱い（E）。C・F（x40）：14 週齢のラットの外胎盤円錐（ep:ctoplacental cone）には赤血球（△）の浸潤が認 められるが（C），37-41 週齢のラットの外胎盤円錐に赤血球の浸潤は認められ ない（F）。 44 A B Figure 3-7：妊娠 8 日目の胚の組織像 A：14 週齢のラットでみられた正常胚，B：37-41 週齢のラットでみられた 異常胚，ep：ectoplacental cone（外胎盤円錐），ec：ectroderm（外胚葉），m： mesoderm（中胚葉），en：endoderm（内胚葉），ep：ectoplacental cone（外胎 盤円錐） 45 Figure 3-8：妊娠 11 日目の胚の写真 A・B：14 週齢でみられた正常胚，B は A を赤矢印方向からみた写真，C-E：37-41 週齢でみられた異常胚，C：正常胚でみられる頭褶，心臓原基及び体節は確認出来 ず，外胎盤円錐は正常胚に比べて小さく形態学的な異常が認められる。D：C を赤 矢印方向からみた写真，E：全体的な構造異常が認められた胚，hf：head fold（頭褶）， hr：heart rudiment（心臓原基），somite：体節，ep：ectoplacental cone（外胎盤円錐） 46 第 4 章 視床下部 kisspeptin 神経のエストロゲンに対する活性の低下が引き起こ す加齢性 LH サージの消 失 背景と目的 1. 第 2 章で，雌ラットの加齢に伴う生殖機能の低下のうち発情周期の異常が早 期にみられ，排卵障害が起きていることが推測された。LH サージは排卵に必須 であり，LH サージの消失は排卵障害を引き起こす。また，ラットでは LH サー ジの減弱は早期の加齢性マーカーとして知られている(10-12)。しかし，LH サー ジが加齢に伴い減弱する詳細なメカニズムは明かではない。 視床下部前腹側周囲核（anteroventral periventricular nucleus：AVPV）に分布す る kisspeptin 神経は GnRH 神経を活性化して GnRH を放出させることで，LH サ ージを誘起することが最近の研究で明らかとなった(53, 54)。 本章では AVPV に分布する kisspeptin 神経に着目し，雌ラットの老化過程にお ける LH サージ減弱のメカニズムについて検討した。 2. 材料及び方法 2.1 使用動物 日本チャールスリバー株式会社で生産された雌 Crl:CD(SD)ラットを購入し， 単飼ケージ［647.7 cm2（底面積）×17.4 cm（高さ）］で SPF 環境下で飼育した。動物 室の照明時間は 12 時間/日（点灯時間： 7 時～19 時）とし，飼料はγ線照射し た固形飼料（オリエンタル酵母株式会社，東京，日本）を与え，水道水を自由 摂取下で飼育した。実験開始の週間前から単飼ケージにて飼育し，第章と同 様の方法で膣スメアを採取し発情周期を観察した。発情周期及び月齢に基づい て雌ラットを，正常発情周期を示す若いラット（Young rats with Normal estrous cycles: YN，3-4 ヶ月齢），正常発情周期を示す高週齢のラット（Middle-age rats with Normal estrous cycles: MN，9-13 ヶ月齢）及び異常発情周期（持続発情型異常発 情期）を示す高週齢のラット（Middle-age rats with Irregular estrus: MI，9-13 ヶ月 齢）の 3 グループに分けた。全ての動物は武田薬品工業株式会社が定める動物 の取り扱いに関するガイドラインに従って取り扱った。 47 2.2 血漿サンプルの採取方法 無麻酔下で頚静脈からヘパリン加注射筒を用いて採血し，速やかに遠心分離 （g，4℃，2 分間）して血漿サンプルを得た。採取した血漿サンプルはホ ルモン測定に用いるまで-50℃で保存した。 2.3 血漿中 LH 及びエストラジオール濃度測定 YN（N=7）及び MN（N=38）について，発情前期の 16 時，17 時，18 時及び 19 時に採血し，全ポイントのサンプルについて LH 濃度を測定し，16 時のサン プルについてのみエストラジオール濃度を測定した。MI（N=30）は膣スメアに 周期性がみられないため，YN 及び MN と同時刻に採血を実施した。また，MN については採血から 3-4 週間発情期を観察し，採血後 3-4 週間以上正常発情期を 示したラットを MN-Normal（MN-N，N=31）とし，採血後 3-4 週間以内に異常 発情期を示したラットを MN-Irregular（MN-I，N=7）とした。 また，別のラット（YN，MN 及び MI：N=7/群）を用いて発情休止期の 18 時， 発情前期の 8 時，10 時，12 時及び 14 時に採血し，血漿中エストラジオール濃 度の変化を調べた。血漿中 LH 濃度の測定と同様で MI は YN 及び MN と同時に 採血を実施した。 2.4 AVPV における Kiss1 mRNA 発現量及び kisspeptin 含有量の測定 YN，MN 及び MI 群のそれぞれ 9，7 及び 5 例について，Real-time PCR を用い て AVPV の Kiss1 mRNA を測定した。YN 及び MN 群は発情前期の午後に，MI 群は YN 及び MN 群と同じ時間帯に CO2 麻酔下で放血し，大脳を摘出した。摘 出した大脳は速やかに脳スライサー（ブレインサイエンスイディア株式会社， 大阪，日本）を用いて前頂 0 mm から尾側へ 2 mm の厚さで切り出した。そして， 直径 1.5 mm の生検パンチ（カイインダストリーズ株式会社，東京，日本）を用 いて， AVPV を含む領域をパンチアウトした。得られた脳サンプルは Kiss1 mRNA を測定するまで-80℃で保存した。残った脳切片は一晩 10％ホルマリンで固定し， その後 4℃で 30%グルコース溶液に 2 日間置換した後に，冠状面で 40 µm の厚さ 48 に薄切した。作製した脳切片を Thionin 染色し，AVPV を含む領域が適切にパン チアウトされているかどうかを確認した結果，全例について適切に AVPV が採 材されていることを確認した。 YN，MN 及び MI それぞれ 7 匹の動物から AVPV を含む脳サンプルを採取し し，enzyme immunoassay（EIA）により kisspeptin 含有量を測定した。剖検時間 及び AVPV を含む脳サンプルの採取は，上記の Kiss1 mRNA 測定と同様に実施 した。 2.5 GnRH 神経のヒト kisspeptin（Kp-54）に対する反応 Kp-54 は Ohtaki らの方法により合成した(14)。YN 及び MN 群は発情前期の 11 時に，MI 群は他の 2 群と同じタイミングで 10 または 100 nmol/kg の kisspeptin を背部に単回皮下投与し，投与前，投与 1，2 及び 4 時間後の血漿中 LH 濃度を 測定した。kisspeptin は 0.9%生理食塩水で溶解し，対照群には 0.9%生理食塩水 を同様に投与した。 2.6 卵巣を摘出したラットにおけるエストラジオールによる AVPV の kisspeptin 神経の活性化 in situ hybridization（Kiss1 mRNA）及び免疫染色（cFos）の二重染色を実施し， AVPV における kisspeptin 神経の活性化の程度を評価した。 YN，MN 及び MI のそれぞれ 4，5 及び 5 例の両側の卵巣を摘出し，その 1 週 間後に粉末のエストラジオール（Sigma-Ardrichi Japan，東京，日本）を充填した シリコンチューブ（株式会社カネカメディックス，大阪，日本，内径 2.0 mm， 外径 3.0 mm，長さ 2.5 cm）を背部皮下に移植した。全ての外科的施術は 2%イソ フルラン麻酔下で実施した。なお，卵巣を摘出しエストラジオールチューブを 移植したラットを以下 OVX+E2 ラット（Ovariectomized rats with supplementation of estradiol-17）と表記した。エストラジオールチューブ移植 3 日後に採血し，血 漿中エストラジオール濃度を測定した。さらに，大脳サンプルを得るため，採 血後の 14-15 時の間にチオペンタール麻酔下で 4%パラホルムアルデヒド 49 （paraformaldehyde: PFA）を用いて全身潅流を実施した。得られた大脳サンプル は 4％PFA を用いて一晩 4℃下で固定した後に，30％スクロース溶液で約 1 週間 置換した。その後，O.C.T. コンパウンド（サクラファインテックジャパン株式 会社，東京，日本）を用いて凍結ブロックを作製した。凍結ブロックは Kiss1 mRNA 及び cFos の二重染色を実施するまで-80℃で保存した。 2.7 OVX+E2 MI における LH サージ測定 OVX+E2 MI において LH サージが生じるかどうか調べるために，OVX+E2 YN 及び MI について（N=7/各グループ） ，エストラジオールチューブ移植 3 日後の 15 時，16 時 30 分，17 時 30 分，18 時 30 分，19 時 30 分及び 21 時に採血し，血 漿サンプルを得た。 2.8 ホルモン測定 血漿中LH濃度にはNIDDKのラットLH RIAキット（Harbor-UCLA Medical Center，CA, USA）を，血漿中エストラジオール濃度測定にはDPC E2 キット（三 菱化学メディエンス株式会社，東京，日本）を使用した。LH 及びエストラジオ ールのRIAキットの最小測定限界はそれぞれ0.08 ng/ml及び10 pg/mlであった。 2.9 Real-time PCR 解析にはABI PRISM 7900HT（PE Applied Biosystems，CA, USA）を使用した。 AVPV を 含 む 脳 サ ン プ ル か ら RNeasy Mini kit 及 び ribonuclease-free deoxyribonuclease set （Qiagen，CA, USA）を用いてDNA-free total RNAを抽出し， High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits（アプライドライフテクノロジージ ャパン株式会社，東京，日本）を用いてcDNAを合成した。得られたcDNAを TaqManプローブ（アプライドライフテクノロジージャパン株式会社，東京，日 本），Actin beta（ID: Rn00667869_m1）及びKiss1（ID: Rn00710914_m1）のプライ マー（それぞれアプライドライフテクノロジージャパン株式会社，東京，日本） と反応させたKiss1遺伝子のコピー数はActin betaの値で補正し，fold changeは下 記の式を用いて算出した。 50 各個体の値＝2ΔΔCT CT = threshold cycle，ΔCT = CT (Actin beta) - CT (Kiss1)， ΔΔCT = ΔCT (個体) - ΔCT (対照群平均)， ΔCT (対照群平均)は YN の ΔCT を平均した値 2.10 Enzyme immunoassay (EIA) AVPV を含む脳サンプルが入ったマイクロチューブに 0.2 ml の蒸留水を加え， 10 分間煮沸し，その後氷上に 3 分間静置した。次いで，酢酸及びペプスタチン （Roche Applied Science，Mannheim, Germany）をそれぞれ 1M および 10 g/ml になるように添加した。その後，超音波式ホモジナイザーを用いて脳サンプル をすりつぶし,得られた懸濁溶液は 19000 g で 15 分間遠心した後，上澄を採取し 凍結乾燥機を用いて乾燥物を作製し，EIA 測定に使用した。 抗 kisspeptin モノクローナル抗体の作製 2.11 18 36 抗原として[Cys ] rat kisspeptin (18-30)及び[Cys ] rat kisspeptin (36–52) (570 nmol)を 10 nmol の抗 KLH と反応させた。抗原 40 g を 8 週齢の雌 Crj:BALB/c に 3 週間隔で投与した。200 g の抗原を静脈内投与した 4 日後に脾臓の細胞を とりマウス骨髄腫細胞である P3-X63Ag8-U1 と融合させた。抗ラット kisspeptin モノクローナル抗体 である M#9-1 (IgG2b, ) 及び C#123-3 (IgG1, )を選択し， 固定化 Protein A カラム(IPA-300, Repligen, MA, USA)を用いて精製した。M#9-1 はラット kisspeptin の中間領域に対する，C#123-3 はラット kisspeptin の C 末端 に 対 す る 抗 体 で あ る 。 抗 体 反 応 は horseradish peroxidase (HRP)-labeled 36 18 [Cys ]-kisspeptin (18-30)または[Cys ]-kisspeptin (36–52) を用いて検出した。 2.12 Two-site EIA Suzuki らが報告した方法を用いて，M#9-1 と標識 2 次抗体である HRP の複合 体を作製した(55)。上記の方法で作製した脳サンプルを C#123-3 を感作した固相 （96 ウェルプレート）に反応させた後，さらに HRP 標識化中間部(18-30)認識 51 抗体（KIC-1C）と反応させ，固相に結合した HRP 活性から kisspeptin を定量し た。 2.13 Kiss1 mRAN 及び cFos の二重染色 二重染色は浮遊法で実施した。クリオスタットを用いて厚さ 40 m の脳切片 （冠状断）を作製し，O.C.T コンパウンドを洗い流すため PBS で洗浄した。そ の後，1 g/ml Proteinase K (タカラバイオ株式会社，滋賀，日本) 溶液で 37°C 下 15 分間処理した後，0.25%無水酢酸で 10 分間処理した。そして，10 g/ml の DIG で標識した anti-sense cRNA probe (1：200，sequence position 3-358, GenBank accession No. AY196983.1，ジェノスタッフ株式会社，東京，日本) を 60°C 下で 一晩反応させた。次に，脳切片を 50%ホルムアミドを含む 2×SSC，2×SSC 及び 0.5×SSC の順で洗浄し，DIG-1 バッファー[組成：100 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl and 0.01% Tween 20] で 5 分間反応させた。次いで，1.5% ブロッキン グリージェント (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) を含む DIG-1 buffer で 1 時間反応させた後，抗 DIG 抗体 (1：1000，Roche Applied Science, Mannheim, Germany) で 1 時間反応させた。その後，DIG-1 バッファーで洗浄し， DIG-3 buffer [組成：100 mM Tris-HCl (pH9.5), 100 mM NaCl and 50 mM MgCl2] で 3 分間置いた後，3.5 l/ml の 4-nitroblue tetrazolium chloride 及び 3.5 l/ml の 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate を添加した DIG-3 バッファーで 4 時間発色さ せた。続いて cFos を免疫染色するために，in situ hybridization で Kiss1 mRNA を 染色した切片を PBS で洗浄し，1% bovine serum albumin (BSA)で 1 時間反応させ た後，ウサギ抗 cFos 抗体（1:4,000, #SC-253 K-25 Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA）で一晩反応させた。PBS で洗浄後，ビオチンで標識されたヤギ抗ウサギ IgG 抗体（1:300, Vector Laboratories Inc., CA, USA）で 2 時間反応させた。PBS で 洗浄後，avidin-biotinylated HRP complex（Vectastatin® ABC kit, Vector Laboratories Inc., CA, USA）で 30 分間反応させた。次いで，PBS で洗浄後 0.02% DAB 溶液 5 分間発色させた。最後に，プリスチンマウント（株式会社ファルマ，東京，日 本）を用いて封入した。 52 2.14 細胞数 前頂から尾側へ約 0-0.3，0.3-0.6 及び 0.6-1.0 mm でそれぞれ 3 枚ずつ，計 9 枚 の脳切片を観察し，Kiss1 mRNA 陽性細胞及び Kiss1 mRNA/cFos 陽性細胞の数を 数えた。 2.15 統計解析 Kiss1 mRNA 陽性細胞全体に占める Kiss1 mRNA/cFos 陽性細胞の割合は対数変 換し統計解析に用いた。Kiss1 mRNA 発現量，kisspeptin 含有量 Kiss1 mRNA 陽性 細胞全体に占める Kiss1 mRNA/cFos 陽性細胞の割合及び Kiss1 mRNA 陽性細胞数 について一元配置分散分析を実施した。血漿中 LH 及びエストラジオール濃度に ついてグループと採血時間を因子とした反復測定分散分析を実施した。Kp-54 投 与後の血漿中 LH 濃度推移について Kp-54 の用量と採血時間を因子とした反復測 定分散分析を実施した。Kp-54 投与後のピーク LH 濃度及び AUC（the area under the curve，曲線化面積）について，グループと投与量を因子とした二元配置分散 分析を実施した。これらの分散分析の結果，差がみられた場合に 3 グループの 平均を Fisher の LSD 検定によって比較した。OVX+E2 YN 及び MI のピーク LH 濃度及び AUC について t 検定を用いて比較した。全てのデータは平均値±標準 誤差で表示し， P 値が 0.05 未満の場合に統計学的に有意な差であると判定した。 3. 結果 3.1 LH サージ及び血漿中エストラジオール濃度測定 YN 及び MN（MN-N 及び MN-I）では，発情前期の 16 時から 19 時の間で， LH サージがみられたが，MI では LH サージは検出されなかった。また，MN-N の血漿中 LH 濃度はどの採血時間においても（16-19 時）YN と比べて有意差が みられなかったのに対して，MN-I ではどの採血時間においても有意な低値を示 した。これらの動物の 16 時の血漿中エストラジオール濃度を比較したところ， MN-N 及び MN-I は YN に比べて統計学的に有意な差はみられなかったのに対し 53 て，MI は有意な低値を示した（Fig. 4-1）。 また，別の YN 及び MN の血漿中エストラジオール濃度を発情休止期（18 時） と発情前期（8，10，12 及び 14 時）で比べたところ，発情前期で発情休止期よ りも高値を示した。しかし，MI では血漿中エストラジオール濃度に上昇はみら れず，YN 及び MN の発情休止期と同等の値を持続的に示した（Fig. 4-2）。 3.2 視床下部 AVPV における Kiss1 mRNA 発現量及び kisspeptin 含有量の測 定 AVPV の Kiss1 mRNA 発現量及び kisspeptin 含有量を測定した結果，3 群の間 に有意差はみられなかった（Fig. 4-3）。 3.3 GnRH 神経の Kp-54 に対する反応 3 群のラットで Kp-54 投与後に用量依存的な血漿中 LH 濃度の有意な上昇がみ られた（Fig. 4-4）。投与 1，2 及び 4 時間後の血漿中 LH 濃度で最も高い値をピ ーク値とし，投与前，投与 1，2 及び 4 時間の血漿中 LH 濃度の値を用いて AUC を算出した。その結果，ピーク値及び AUC で MI は YN と同等の値を示したが， MN は YN 及び MI と比べて統計学的に有意な高値を示した（Fig. 4-5）。 3.4 卵巣を摘出したラットにおけるエストラジオールによ る AVPV の kisspeptin 神経の活性化 エストラジオールチューブ移植 3 日後の血漿中エストラジオール濃度を測定 したところ，YN（N=4），MN（N=5）及び MI（N=5）でそれぞれ 292.5±28.9， 110.8±13.6 及び 232.3±26.0 pg/ml であった。視床下部 AVPV について Kiss1 mRNA 及び cFos の二重染色を実施した結果，全 Kiss1 mRNA 陽性細胞の数は 3 グルー プで差はみられなかったが Kiss1 mRNA/cFos 陽性細胞が占める割合は MI で YN 及び MN と比較して統計学的に有意な低値を示した（Fig. 4-6 及び 4-7）。 54 3.5 OVX+E2 MI における LH サージ測定 エストラジオールチューブ移植 3 日後に，OVX+E2 YN 及び MI の血漿中 LH 濃度を測定したところ，OVX+E2 YN では 16:30 時から 19:30 時に LH サージが みられたが， MI ではいずれの時間帯でも LH サージはみられなかった（Fig. 4-8A）。 また，ピーク LH 濃度及び AUC においても OVX+E2 MI は OVX+E2 YN に比べて 有意に低値を示した（Fig. 4-8B 及び C）。 4. 考察 本研究では，初めに YN，MN 及び MI の LH サージを確認した。MN は血漿 中 LH 濃度測定後 3-4 週間以内に異常発情期を示した動物（MN-I）と 3-4 週間以 上に渡り正常発情期を示した動物（MN-N）の 2 種類に分類した。発情前期の 16 から 19 時の間に YN，MN-N，MN-I はそれぞれ LH サージを示したが，MN-I の LH サージは YN 及び MN-N に比べて減弱していた。しかし，YN，MN-N 及 び MN-I で血漿中エストラジオール濃度に差はみられなかったことから，LH サ ージの減弱は異常発情期発症の 3-4 週間前には始まっていることが明らかとな り，LH サージの減弱は血漿中エストラジオール濃度の減少を伴わず起こること が判明した。また，MI は LH サージを示さず，血漿中エストラジオール濃度は 正常発情期を示す動物（YN，MN-N 及び MN-I）と比べて低値であった。 AVPV における kisspeptin 神経は LH サージを制御している主要因であること から，次に YN，MN 及び MI の AVPV における Kiss1 遺伝子及びタンパクの発 現量を測定した。その結果，3 群間で遺伝子及びタンパクの発現量に差はみられ なかった。Neal らは，卵巣を摘出しエストロゲンベンゾエイト（estrogen benzoate: EB）及びプロゲステロン（Progesterone: P）を処置した場合，LH サージが減弱 した高週齢のラットで AVPV の Kiss1 遺伝子の発現が若いラットに比べて低下し ていることを報告している(27)。本研究と Neal らの実験の結果の違いは，使用 した動物の生理条件の違いによるものと考えられる。Neal らの実験では，卵巣 を摘出しステロイドホルモンで処置した動物を使用しているのに対し，本研究 では無処置の動物を用いた。また，本研究では，脳サンプルを LH サージ開始時 55 点（16:00 時）で採取したが，Adachi らは，Kiss1 遺伝子は LH サージのピーク 付近で最も発現量が高くなるという報告をしている(19)。従って，LH サージの ピーク付近の Kiss1 遺伝子発現量を測定することで LH サージ消失と Kiss1 遺伝 子の関係性がより詳細に分かるかもしれない。いずれにしても，MI の AVPV に おける Kiss1 遺伝子およびタンパク発現量が大幅に減少していないことが明か となった。 次に，MI が kisspeptin に対し反応性を維持しているか否かを調べるために， Kp-54 を単回皮下投与し投与後の血漿中 LH 濃度を測定した。その結果，3 群全 ての動物で Kp-54 投与後に用量依存的に血漿中 LH 濃度の上昇がみられ，MI に おける血漿中 LH 濃度の上昇の程度は YN と同等であった。Kp-54 を皮下投与す ると視床下部の GnRH 神経が活性化される(54)ことから，本研究により MI の GnRH 神経は外因性 kisspeptin に対する反応性を維持していることが判明した。 本研究では，MN における Kp-54 投与後の血漿中 LH 濃度が YN 及び MI より も有意に高値であった。このメカニズムは未だ明らかではないが，視床下部の GnRH 含有量や下垂体の GnRH に対する反応性という点では説明が困難である (56-60)。さらに，卵巣を摘出しエストラジオール及びプロゲステロンを投与し た動物では，Kp-10 に対する GnRH 神経の反応性に若齢ラットと高週齢のラット で差はみられないと報告されている(27)。 本研究のこれまでの結果を総括すると，MI は AVPV の Kiss1 遺伝子及びタン パク発現量が減少していないにも関わらず，LH サージが消失していた。また， MI の GnRH 神経は Kp-54 に対する反応性を有していたことから，MI では AVPV に分布する kisspeptin 神経から kisspeptin の放出が減少している可能性が考えら れた。このことは，GnRH 神経体の分布する POA に Kp-10 を直接投与すると高 週齢のラットでみられる LH サージの減弱が回復すると報告した Neal らの研究 結果と一致する結果である(27)。 上述の通り，MI は Kiss1 遺伝子及びタンパクの発現量に異常はなく，GnRH 神経の Kp-54 に対する反応性を維持していた。このことから，AVPV の kisspeptin 神経が活性化していない可能性が考えられた。AVPV の kisspeptin 神経の活性化 56 には血漿中エストラジオール濃度の上昇が必須であるが，MI の血漿中エストラ ジオール濃度は発情前期の YN や MN に比べて有意に低値であった。そこで， 本研究ではさらに高濃度エストラジオール存在下で，MI の AVPV における kisspeptin 神経が活性化されるかどうか検討した。その結果， OVX+E2 YN と MN では cFos を共発現した kisspeptin 神経が多くみられたのに対して，OVX+E2 MI ではその割合が著しく減少していた。この結果から，MI の AVPV における kisspeptin 神経は高濃度エストラジオール存在下でも活性化されていないものと 推察した。さらに，このような条件下で OVX+E2 YN はサージ様の血漿中 LH 濃 度の上昇を示したのに対して，MI では血漿中 LH 濃度の上昇はみられなかった。 また，OVX+E2 MN についても YN と同様な血漿中 LH 濃度の上昇を確認した (n=3,データ示さず)ことからも，MI の AVPV における kisspeptin 神経がエストロ ゲンの正のフィードバックに対して活性化されず，LH サージが消失したものと 推察した。kisspeptin 神経のエストロゲンに対する反応性が低下した理由につい ては明らかではないが，その原因の一つとして kisspeptin 神経内のエストロゲン 受容体である ERに変化が生じている可能性が考えられる。Chakraborty らは若 齢ラットと高週齢のラットでは AVPV の ER発現量に差がないと報告している (61)。しかし，kisspeptin 神経の ER発現量に関する報告はない。また，kisspeptin 神経における ERの転写活性機能に関する研究を実施する事で，kisspeptin 神経 のエストロゲン感受性低下に関してより詳しい情報を得ることができるであろ う。 Le らは，AVPV における神経で cFos を共発現している数が高週齢のラットで 減少し，それは GnRH 神経の活性化の低下を伴うことを報告している(62)。また， Rubin ら及び Lloyd らによる別の報告では，LH サージの減弱を示す高週齢のラ ットでは GnRH 神経数は若いラットに比べて差はないが，活性化した GnRH 神 経の数が減少することを明らかにしている (63, 64)。本研究の結果をふまえると， 加齢性にみられる GnRH 神経の活性の低下は kisspeptin 神経の放出が減少してい ることに起因している可能性が考えられる。 57 以上の結果から，無処置の MI では LH サージが消失していたにもかかわらず， AVPV の Kiss1 遺伝子及びタンパクの発現は YN と同等であった。さらに，MI の GnRH 神経は Kp-54 にたいする反応性を有していることからも，kisspeptin 神 経からの kisspeptin 放出が減少あるいは消失しているものと推察した。さらに， MI の AVPV の kisspeptin 神経は高濃度エストラジオール存在下でも活性化され る神経数が減少し，サージ様の血漿中 LH 濃度の上昇がみられなかった。本章の 結果から，考察したことを Figure 4-9 にまとめた。MI では AVPV の kisspeptin 神経のエストラジオールによる活性化が低下したため，kisspeptin 放出が減少し， その結果 LH サージが消失したと推察した。 58 Figure 4-1：発情前期または異常発情周期の血漿中 LH 濃度推移 YN：Young Normal (若齢で正常発情期を示すラット，N=7)，MN-N：Middle-age Normal-Normal (加齢して採血時に正常発情期を示し且つ採血 3-4 週間以上正常 発情期を維持したラット，N=31)，MN-I：Middle-age Normal-Irregular (加齢して 採血時には正常発情期を示したが採血 3-4 週間後に異常発情期を発症したラッ ト，N=7)，MI：Middle-age Irregular (加齢した異常発情期を示すラット，N=30)， ＊：P<0.05 vs 各時点の YN，数値は平均値±SD を示す。 59 Figure 4-2：血漿中エストラジオール濃度 A：発情前期または異常発情期の 16 時の血漿中エストラジオール濃度（Fig. 4-1 と同一の動物），B：血漿中エストラジオール濃度推移（Fig. 4-1 と異なる 動物であり，NM は NM-N 及び NM-I を含めた動物，N=7/各グループ）， ‘D’： Diestrus (発情休止期)，‘P’：Proestrus（発情前期），異なるアルファベットは 統計学的に有意な差を示す，#：P＜0.05 vs それぞれの発情休止期 18:00，＊： P＜0.05 vs 各時点の YN，数値は平均値±SD を示す。 60 Figure 4-3：AVPV における Kiss1 mRNA の発現及び kisspeptin 含有量 発情前期または異常発情周期の 16 時に脳サンプルを採取し，AVPV におけ る Kiss1 mRNA 発現量（A：YN，MN，MI N=9，7，5）及び kisspeptin 含 有量（B：N=7/各群）を測定した。数値は平均値±SD を示す。 61 A B C Figure 4-4：Kp-54 投与後の血漿中 LH 濃度 発情前期または異常発情周期の 11 時に Kp-54 を背部に単回投与し，投与 前，投与 1，2 及び 4 時間後の血漿中 LH 濃度を測定した。A：YN，B： MN，C：MI，N=6/各グループまたは各濃度，＊：P＜0.05 vs 対照群，数 値は平均値±SD を示す。 62 Figure 4-5：Kp-54 投与後の血漿中 LH 濃度から算出したピーク LH 値 （A）及び AUC（B） ■：YN， ：MN，□：MI，＊：P<0.05 vs 各 kisspeptin 投与量の YN の値，#：P<0.05 vs 各群の 0 nmol/kg の値，数値は平均値±SD を示す。 63 Figure 4-6：OVX+E2 ラットの AVPV における kisspeptin 神経の cFos 発現 A：ブレグマ-0.12 mm の脳地図，B：ブレグマ-0.12 mm 付近のチオニン染色，C： ブレグマ-0.12 mm 付近の二重染色（Kiss1 mRNA 及び cFos），D：YN，E：MN， F：MI，ac：anterior commissure（前交連），AVPV: anterioventral periventricular nucleus （前腹側周囲核），VMPO: ventromedial preoptic nucleus（腹側視索上核），och: optic chiasma（視交叉）, 3V: third ventricle（第三脳室）， B 及び C：x4，D-F：x40， バー：25 m，赤矢印 Kiss1 mRNA/cFos 共発現細胞，黒矢印：Kiss1 mRNA 陽性 細胞 64 Figure 4-7：AVPV における cFos の共発現がみられた kisspeptin 神経数（A） 及びその割合（B） A：全 Kiss1 mRNA 陽性細胞に対する Kiss1 mRNA/cFos 共発現細胞の占める 割合，B：全 Kiss1 mRNA 陽性細胞数，YN， MN, MI N=4，5，5，＊：P<0.05， 数値は平均値±SD を示す。 65 Figure 4-8：OVX+E2YN 及び MI の血漿中 LH 濃度 A：血漿中 LH 濃度推移，B：ピーク LH 値，C：AUC15-21，N=7/各グループ， ＊：P<0.05 vs YN，数値は平均値±SD を示す。 66 Figure 4-9：雌ラットにおける加齢性に LH サージが減弱・消失するメカニズム ① AVPV の kisspeptin 神経のエストロゲンに対する感受性の低下 ② kisspeptin 放出量の減少･欠如 ③ LH サージの消失 67 第 5 章 異常発情周期を示す高週齢ラットの交尾排卵機構 背景と目的 1. 第 4 章の結果から，異常発情周期を示した高週齢のラットでは LH サージが 消失しており，また過去の報告によると，持続発情型及び休止期型異常発情周 期を示したラットの卵巣では黄体数が顕著に減少していることから自然排卵が 停止していると考えられる(41)。しかし，持続照明により持続発情を誘発した雌 ラットが，交尾刺激により排卵する報告があることから(65)，加齢性異常発情周 期を示す雌ラットにおいても，交尾刺激により排卵し子孫を残す能力を維持し ている可能性が考えられた。 そこで，本章では高週齢で持続発情型異常発情周期をを示した雌ラットを雄 と交尾させることで排卵し，受胎するかどうかについて検討した。さらに，こ れらのラットの卵巣が LH サージに対してどのような反応を示すかを検討した。 2. 材料と方法 2.1 使用動物 日本チャールスリバー株式会社で生産された雌雄 Crl:CD(SD)ラットを購入し， 単飼ケージ［647.7 cm2（底面積）×17.4 cm（高さ）］で SPF 環境下で飼育した。動物 室の照明時間は 12 時間/日（点灯時間：7 時～19 時）とし，飼料はγ線照射した 固形飼料（オリエンタル酵母株式会社，東京，日本）を与え，水道水を自由摂 取下で飼育した。雌ラットは入荷から 1 週間の馴化期間後に各実験に使用し， 第 2 章と同様の方法で発情周期を判定し，発情周期及び月齢に基づいて，正常 発情周期を示す若齢のラット（Young rats with Normal estrous cycles: YN，3-4 ヶ 月齢），正常発情周期を示す高週齢のラット（Middle-age rats with Normal estrous cycles: MN，9-13 ヶ月齢）及び異常発情周期（持続発情型異常発情期）を示す高 週齢のラット（Middle-age rats with Irregular estrus: MI，9-13 ヶ月齢）の 3 グルー プに分けた。また，雄ラットは 13-20 週齢の間で交配に使用した。 全ての動物は武田薬品工業株式会社が定める動物の取り扱いに関するガイドラ インに従って取り扱った。 68 2.2 交尾能，受胎率，黄体数及び着床数 YN，MN 及び MI（N=10，44 及び 16）を最長 1 週間に渡って雄と 1 対 1 で同 居させた。交尾の有無は第 2 章と同様に膣栓で判定し，交尾率を算出した。ま た，膣栓がみられた日を妊娠 0 日とし，妊娠 20 日に CO2 麻酔下で腹大動脈を切 開し安楽死させた。放血後，肉眼で着床数を，顕微鏡下で黄体数をそれぞれ数 え受胎率を算出した。 交尾率＝膣栓がみられた雌数/全雌数 受胎率＝着床がみられた雌数/膣栓がみられた雌数 2.3 交尾後の LH サージ 第 4 章と同様の方法で MI ラットの両側の卵巣を摘出し，卵巣摘出 1 週間後に 粉末のエストラジオール（Sigma-Ardrichi Japan，東京，日本）を充填したシリコ ンチューブ（株式会社カネカメディックス，大阪，日本，内径 2.0 mm，外径 3.0 mm，長さ 2.5 cm）を背部皮下に移植した。エストラジオールチューブ移植 3 日 後に動物を非交尾群（N=6）及び交尾群（N=10）に群分けし，交尾群は 20 から 21 時の間雄ラットと同居させた。第 2 章の結果から，MI ラットの交尾率が 70％ 以下になる可能性が考えられたため，交尾許容動物を統計学的に十分な匹数確 保する目的で非交尾群に比べ交尾群の匹数を多く設定した。交配当日の 18 時， 交配終了後直後（0 分），交配終了 15，30，45，60 及び 120 分後に無麻酔下で頚 静脈から採血し，血漿中 LH 濃度を測定した。また，非交尾群についても交尾群 と同じ時間帯で採血を実施した。両群とも 18 時の血漿中 LH 濃度が高い動物に ついては，高濃度のエストラジオールにより LH サージが誘発された可能性が考 えられるため，データの解析には使用しなかった。また，交尾群は雄ラットと 同居後ビデオ撮影し交尾行動を 2 回以上行ったことを確認した。 2.4 MI ラットにおけるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（Human Chorionic 69 Gonadotropin: hCG）及び Kp-54 の投与による排卵誘起 MI ラットに hCG または Kp-54 を投与する事で，排卵が誘発できるかどうか検 討する目的で hCG（ゴナトロピン®1000，あすか製薬，東京，日本）100 IU/kg （N=7）または Kp-54（Lot No. 013，武田薬品工業，東京，日本）100 nmol/kg（N=5） を背部皮下に単回投与した。また，対照群には 0.9%生理食塩水（N=3）を同時 刻に投与した。投与は 16 時に実施し，翌日の 12 時に CO2 麻酔下で放血して安 楽死した。安楽死後直ちに卵管を摘出し，実体顕微鏡下で卵管膨大部を観察し 排卵の有無を確認した。また，卵巣は 10 w/v%ホルムアルデヒドを用いて固定し， 組織標本を作製した。 2.4 MI ラットの卵胞における LH 受容体遺伝子の発現局在 MI ラットの卵胞における LH 受容体（LH receptor: Lhr）遺伝子の発現分布を 調べるために，in situ hybridization (ISH)を実施した。ラットはラボナール麻酔下 （注射用チオペンタールナトリウム，田辺三菱製薬，神奈川，日本）でホルム アルデヒド固定液 (Cat. No. STF-01，ジェノスタッフ株式会社，東京，日本)を用 いて潅流固定を行い，卵巣を採取した。固定後の卵巣をパラフィン包埋し，6 m の薄切切片を作製した。キシレンを用いて脱パラフィン処理し，エタノール (in PBS)を用いて脱水処理を行い，4%PFA で 15 分固定し，その後 PBS で洗浄した。 8 g/mL Proteinase K (in PBS)を用いて 37℃で 30 分間処置し，洗浄後 4％PFA で 再固定した。洗浄後，0.2N HCl を用いて 10 分間処置した。洗浄後，0.1M tri-ethanolamine-HCl, pH8.0, 0.25% acetic anhydride で 10 分間処置し，洗浄した後 エタノールで脱水処理を行った。300 ng/mL のプローブ溶液（Lhr：position 2562-2898, GeneBank Accession#: NM_012978）を用いて 60℃で 16 時間ハイブリ ダイゼーションを行った。5×HybriWash，5×SSC を用いて 60℃で 20 分間洗浄し た。50％ホルムアミド (in 2×SSC)，2×HybriWash を用いて 60℃で 20 分間処理し た。50 g/mL RNaseA (in 10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1M NaCl and 1 mM EDTA)を用い て 37℃で 30 分間処理した。その後，2×HybriWash を用いて 60℃で 20 分間洗浄 し， 2 回，0.2×HybriWash を用いて 60℃で 20 分間洗浄を 2 回し，その後 TBST (0.1% 70 Tween20 inTBS)で洗浄した。0.5％ブロッキングリージェント (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) を用いて 30 分間処置後 TBST で 1000 倍希釈した 抗 DIG AP を用いて室温で２時間処理した。その後，TBST で 2 回洗浄し，100 mM NaCl, 50 mM MgCl2 0.1% Tween 20, 100 mM Tris-HCl, pH9.5 でインキュベートし た。NBT/BCIP で染色後，PBS で洗浄し切片を封入した。作製した組織標本を顕 微鏡下で観察し，卵胞における Lhr 遺伝子の発現局在を調べた。 2.5 統計 MN と MI の交尾率及び受胎率について 2x2Fisher の直接確立検定を実施した。 黄体数，着床数並びに着床率についてパラメトリック Tukey 型多重比較を実施 した。血漿中 LH 濃度についてグループと採血時間を因子とした反復測定分散分 析を実施した。ピーク LH 濃度及び AUC（the area under the curve，曲線化面積） について t 検定を実施した。全てのデータは平均値±標準誤差で表示し，P 値が 0.05 未満の場合に統計学的に有意な差であると判定した。 3. 結果 3.1 交尾率，受胎率，黄体数及び着床数 YN，MN 及び MI の交尾率はそれぞれ 100，81.8 及び 77.8%であり，YN，MN 及び MI の受胎率はそれぞれ 100，75 及び 66.7%であった。交尾率及び受胎率の 両パラメータについて，どちらも MN と MI の間に有意な差は認められなかった。 YN，MN 及び MI の黄体数はそれぞれ 15.7±1.6，15.0±1.9 及び 15.4±2.4 であり， 着床数はそれぞれ 14.6±1.9，12.8±3.0 及び 10.6±4.9 であった（Table 5-1）。黄体数 及び着床数について群間で有意な差は認められなかった。 3.2 MI ラットにおける交尾後の LH サージ 交尾群では全例で交尾行動が 2 回以上成立した。また，交配前の 18 時の時点 で血漿中 LH 濃度が上昇しなかった動物のデータのみを解析に用いた。非交尾群 と交尾群の間で血漿中 LH 濃度，ピーク LH 値及び AUC について有意な差は認 71 められなかった。個体毎の値では，交尾群の 3/9 例（2F1, 2 及び 10）で交尾後に 血漿中 LH 濃度の上昇が見られ，また非交尾群では 1/5 例（1F1）が 21 時から 23 時の間で血漿中 LH 濃度の上昇を示した（Table 5-2）。 3.3 MI ラットにおけるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン及び Kp-54 の排卵作用 hCG 及び Kp-54 投与群では，全例で投与翌日に排卵が観察されたのに対して， 対照群ではどの動物にも排卵はみられなかった（Table 5-3）。 また，組織学的検査を実施したところ対照群の卵巣に黄体は観察されず，正 常な卵胞に比べて大きく，顆粒層細胞層が薄い嚢胞状の卵胞が多数みられたの に対して，hCG 及び Kp-54 群の卵巣では新鮮な黄体と嚢胞状の卵胞が混在して いた（Fig. 5-1）。 3.4 MI ラットの卵胞における LH 受容体遺伝子（Lhr）の発現局在 組織学的に正常な成熟卵胞と嚢胞化した卵胞では Lhr 遺伝子の局在に違いが 認められた。正常な成熟卵胞では，Lhr 遺伝子の発現が顆粒層細胞及び卵胞膜内 膜細胞に認められたのに対して，嚢胞化した卵胞では卵胞膜内膜細胞のみに発 現が認められ顆粒層細胞には発現が認められなかった（Fig. 5-2）。 4. 考察 哺乳類の雌は排卵方法により 2 種類に分類することができる。一つは自然排 卵動物でヒト，サル及びラット等が属し，もう一つは交尾排卵動物でウサギ， ネコ及びスンクス等が属する。自然排卵動物は周期的なホルモンの変動に伴い 排卵し，交尾排卵動物は交尾刺激により排卵する。どちらの動物も LH サージに よって排卵するが，LH サージを誘起する要因が異なる。自然排卵動物は周期的 に血液中エストロゲン濃度が上昇し，視床下部に作用することで LH サージが誘 起される。これに対し，交尾排卵動物は交尾による子宮頚管への機械的刺激が 神経性に視床下部に伝わり LH サージが誘起される。 本研究で MI を雄と交配させたところ，77.8%の動物で交尾が確認され，その 72 うち 66.7%の動物で妊娠が確認された。第 4 章で明らかにしたとおり，MI では LH サージが消失し自然排卵が停止していると考えられることから，MI では交 尾刺激が，LH サージを誘起して排卵を惹起し，受胎したと推察した。 正常発情周期を示すラットは，発情前期にのみ交尾を許容する。これは，雌 ラットの交尾行動にエストロゲンが重要な役割を果たし，血液中エストロゲン 濃度が上昇する発情前期に交尾を許容するためと考えられている。しかし，第 4 章で示したように MI は血漿中エストラジオール濃度の上昇を示さず，正常の発 情周期を示すラットの発情休止期と同レベルの血漿中エストラジオール濃度を 持続した。低濃度のエストラジオールにもかかわらず，多くの MI 動物が交尾を 許容した理由は明らかではないが，持続発情を示す高週齢のラットが雄を許容 しロードシスを示したという報告が他にもあることから(66, 67)，MI では血漿中 エストラジオール濃度の上昇とは違う要因で交尾を許容したと考えられたが， 詳細は明らかとなっていない。 また， 本研究では，交尾を許容した MI のうち 66.7%の動物で受胎がみられた。 第 3 章において示唆したとおり，高週齢のラットでは着床痕を形成する前に胚 が死亡・吸収され，その結果受胎率が低下している可能性がある。したがって， 本章で交尾が確認された MI のうち 66.7%よりも多くの動物で排卵が起こった可 能性が考えられた。 第 4 章で示した通り，MI では周期的な LH サージが消失していたことから， MI は交尾によって LH サージが誘起され排卵したと推察した。この可能性を検 討する為に，MI を雄と交尾させ交尾後の血漿中 LH 濃度を測定したところ，血 漿中 LH 濃度の上昇を示す動物と示さない動物がみられ，30％の動物が交尾後に 血漿中 LH 濃度の上昇を示した。この数値は，無処置の MI を雄と交配して得ら れた受胎率（66.7％）に比べて低く，これにはいくつかの原因が考えられた。ま ず，1 つに採血時間が考えられる。本章では交尾時間を 1 時間で設けた。しかし， 交尾後に血漿中 LH 濃度の上昇を示した 2F1 及び 2 は交尾直後に既に血漿中 LH 濃度のピークを示した。また，2F10 は交尾 15 分後に血漿中 LH 濃度のピークを 示しているものの，交尾 120 分後には基礎レベルにまで低下していた。さらに， 73 2F3 及び 8 は 18 時より交尾直後の血漿中 LH 濃度が高く，交尾後の時間が経過 するとともに低下していったことが判明した。これらの事実から，交配開始直 ぐに交尾をした動物は，交尾時間中に血漿中 LH 濃度が上昇し採血時にはすでに 低下していた可能性があり，このため血漿中 LH 濃度の上昇が捕らえられなかっ た可能性が考えられた。各動物が交尾を許容するタイミグは必ずしも同時では ないため，交尾後の血漿中 LH 濃度の上昇をより詳細に捕らえるためには，動物 毎に交尾時間と採血時間を考慮する必要がある。また，別の理由として生理学 的条件の違いが考えられた。交尾後の血漿中 LH 濃度を測定する目的で OVX+E2 動物を使用したが，受胎率を確認する為に用いた動物は無処置であった。第 4 章で無処置の YN と OVX+E2 YN の血漿中 LH 濃度を測定したが，OVX+E2 YN のサージ様 LH の上昇は無処置の YN の LH サージの 1/10 程度と極めて低くかっ た。本章では交尾刺激による血漿中 LH 濃度の変化を検討したが，第 4 章と同様 で，生理的条件の違いにより OVX+E2 動物の血漿中 LH 濃度はそれほど上昇しな かった可能性が考えられた。また，交尾群の中には交尾刺激に反応せず血漿中 LH 濃度に変化がみられない動物がいた（2F4-7）。無処置の MI でも受胎率が 100% でなかったことから，MI の中には交尾を許容するものの，交尾刺激によって LH サージが惹起されず，排卵しない動物が含まれている可能性が示唆された。交 尾刺激によって LH サージが惹起される動物と惹起されない動物の違いは明か ではない。しかし，本実験では，少なくとも 30%の MI で交尾後に血漿中 LH 濃 度の上昇が確認された。 MI の卵巣が LH サージに反応し排卵する成熟した卵胞を有しているかどうか を確かめる為に，MI に Kp-54 または hCG を単回皮下投与した。その結果，全例 で排卵が確認され，MI の卵巣は LH サージに反応し排卵する成熟した卵胞を有 していることが判明した。組織学的検査の結果，Kp-54 または hCG 投与後の卵 巣には，排卵後に形成された新鮮な黄体と嚢胞状の卵胞が混在する像が観察さ れた。このことは，LH サージまたは多量の hCG 投与によっても囊胞化した卵 胞は排卵しなかったことを示している。囊胞化した卵胞が LH サージや hCG の 投与で排卵しなかった原因を検討する為に，卵胞の LH 受容体遺伝子（LH 74 receptor: Lhr）を in situ hybridaization で染色した。その結果，組織学的に正常な 成熟した卵胞では Lhr が顆粒層細胞と卵胞膜内膜細胞に発現していたのに対し， 囊胞化した卵胞では卵胞膜内膜細胞にのみ発現し顆粒層細胞には Lhr の発現が みられなかった。正常な卵胞は成熟に伴い LH 受容体の局在が変化し，LH サー ジを受けて卵胞が排卵するには LH 受容体が顆粒層細胞に発現していることが 必須である(68)ことから，囊胞化した卵胞は顆粒層細胞に LH 受容体が正常に発 現しておらず，LH サージに対して反応して排卵出来なかったものと推察した。 以上の結果から，MI の卵巣には LH サージに反応できる正常な卵胞と，反応出 来ない囊胞化した卵胞があることが判明した。 以上の結果をまとめると，MI は雄との交尾によって LH サージが惹起されて 排卵し，受胎する可能性が示唆された。また，MI の卵巣は LH サージに反応し， 排卵する成熟した卵胞を有していることが明らかとなった。正常発情周期を示 す若いラットでも，雄と交尾することで LH サージが惹起されるという報告があ る(69)。このことから，雌ラットはエストロゲンの正のフィードバックの他に， 交尾刺激によっても LH サージが惹起される機構を有していると考えられる。加 齢し自然排卵が停止した高齢ラットでは，エストロゲンの正のフィードバック に対し視床下部の反応性が低下した後でも，交尾刺激により LH サージが惹起さ れる機構を維持していると推察した。 本章では自然排卵機能が失われた高週齢ラットの中には雄と交尾することで LH サージが惹起され排卵が誘発される動物がいることが判明した。 75 Table 5-1：交尾率（Copulatory rate），受胎率（Fertility），黄体数（No. of corpora lutea）及び着床数（No. of implantation site） Animals No. of animals YN 10 MN 44 MI 16 Copulatory Index (%) (No. of animal) a) Fertility Index (%) (No. of animal) b) 100 100 (10/10) (10/10) 81.8 75 (36/44) (27/36) 77.8 66.7 (12/16) (8/12) No. of corpora lutea No. of implantation site 15.7 ± 1.6 14.6 ± 1.9 15.0 ± 1.9 12.8 ± 3.0 15.4 ± 2.4 10.6 ± 4.9 YN：正常発情周期を示す若いラット（Young rats with Normal estrous cycles），MN：正常発情周期を示す高週齢のラット 76 （Middle-age rats with Normal estrous cycles），MI：異常発情周期を示す高週齢のラット（Middle-age rats with Irregular estrus）， a：受胎率＝着床がみられた雌数/膣栓が確認された雌数，b：着床率＝着床数/黄体数，黄体数及び着床数について数値は平 均値±SD を示す。 76 Table 5-2：MI における交尾後の血漿中 LH 濃度 (ng/mL) の変動 Non-mating Group Animal No. 1F1 1F2 1F3 1F4 1F6 Mean SD 77 Mating Group Animal No. 2F1 2F2 2F3 2F4 2F5 2F6 2F7 2F8 2F10 Mean SD 18:00 21:00 21:15 21:30 21:45 22:00 23:00 Peak AUC0-120 (ng/min/mL) 0.778 1.445 0.746 0.333 0.995 0.841 0.405 2.109 0.600 0.477 0.332 0.257 0.755 0.768 1.974 0.357 0.197 0.250 0.332 0.622 0.758 1.687 0.433 0.451 0.095 0.092 0.551 0.658 1.036 0.351 0.249 0.186 0.134 0.391 0.370 1.525 0.259 0.362 0.440 0.191 0.556 0.550 0.600 0.212 0.189 0.219 0.205 0.285 0.176 2.109 0.600 0.477 0.440 0.332 0.792 0.743 161.459 37.690 36.278 33.532 23.619 58.516 57.809 18:00 pretreatment 0.508 1.475 0.521 0.449 0.377 0.443 0.936 0.505 1.499 0.746 0.450 21:00 21:15 21:30 21:45 After mating (min) 30 45 1.487 0.997 0.790 0.618 0.747 0.394 0.316 0.260 0.178 0.180 0.218 0.168 0.383 0.402 0.808 0.642 3.235 2.502 0.907 0.685 0.964 0.731 22:00 23:00 Peak AUC0-120 (ng/min/mL) 2.512 2.086 1.023 0.377 0.258 0.353 0.908 1.357 4.310 1.465 1.322 121.291 89.080 55.573 30.981 19.185 23.061 48.627 74.418 288.343 83.396 83.700 0 2.512 2.086 1.023 0.364 0.258 0.353 0.908 1.357 2.622 1.276 0.930 15 1.550 1.944 0.869 0.377 0.250 0.236 0.442 1.210 4.310 1.243 1.300 77 60 0.803 0.412 0.313 0.266 0.147 0.130 0.315 0.364 2.443 0.577 0.727 120 0.395 0.256 0.200 0.133 0.087 0.206 0.386 0.357 0.879 0.322 0.236 Table 5-3：MI における hCG または Kp-54 投与後の排卵の有無 Test article Dose No. of animal No. of animal exhibiting ovulation Control - 3 0 hCG 100 IU/kg 7 7 Kp-54 100 nmol/kg 5 5 78 A B * * * * * * Figure 5-1：kisspeptin 投与後の卵巣 A：0.9%生理食塩水投与，B：Kp-54 投与，バー：200 m，＊：嚢胞状の卵胞（代表例）， ▲：黄体（代表例），△：正常な卵胞 79 A B x10 x10 x40 x40 Figure 5-2：MI ラットの卵胞における LHr 遺伝子の発現局在 A：正常な成熟卵胞，B：嚢胞化した卵胞，＊：顆粒層細胞層，矢印：Lhr 遺伝 子陽性細胞，バー：50 m 80 総合考察 1．背景 女性における閉経とは卵巣にある卵胞が消失したことによる永久的な月経の 停止と定義されている。生殖機能は閉経に達するまでに徐々に低下し始め，約 50 歳で閉経に達する(70-72)。基礎疾患の無い健康的な夫婦を対象にした調査に よると，女性の年齢が 19-26 歳の場合 8%，27-34 歳の場合 13%，35-40 歳の場合 18%の夫婦が不妊症と判断され，男性側の影響も考慮する必要があるにしろ，女 性の年齢が増加するに伴い不妊症と診断された夫婦の割合は増加した(34)。 厚生労働省の調べによると，日本の女性の第一子出生時年齢は昭和 50 年では 25.7 歳であったが，平成元年では 27.0 歳，平成 21 年では 29.7 歳と，時代が進 むとともに晩産化が進んでいる(5)。また，合計特殊出生率（一人の女性が一生 に産む子供の平均数）は昭和 49 年に 2.05 であったのに対し，平成 21 年では 1.37 まで減少した。女性の第一子出生時年齢の上昇及び合計特殊出生率の減少の理 由の一つに，女性の社会進出があげられる。晩産化及び合計特殊出生率の低下 は日本だけでなく，アメリカやヨーロッパなど国際的に同様の傾向がみられて いる(5)。このように，女性の社会進出が進み第一子をもうけたいと考える年齢 が上昇する一方で，加齢による不妊症のリスクも増加するという問題がある。 よって，加齢による生殖機能の変化を考える事が重要視されている。 女性における生殖機能の加齢性変化について，生殖機能を獲得し閉経に至る までの期間を経時的且つ様々な生殖機能の指標を用いて多面的に調べることは 困難である。ラットとヒトでは，生殖様式について産児数の違いや胎盤の形態 的・機能的違いなど異なる点もあるが，共通点も多い。例えば，ラットもヒト も自然排卵動物であり，排卵を調節する内分泌機構が類似している（第 1 章 1-3 参照） 。また，どちらも胚・胎児の分化・発達過程が類似している。よって，本 研究では SD 系ラットを用いて第 2 章で加齢に伴い「どのような」生殖機能が「い つから」低下していくかを検討した。その結果，発情周期の乱れや停止といっ た排卵障害を示唆する現象が最も早期にみられ，次いで妊娠初期から中期の胚 の生存性の低下による生存児数の減少がみられた。この結果から，第 3 章では 81 妊娠初期から中期の胚の生存性及び分化・発育について詳しく調べるために， 形態学的な検査を実施した。また，第 4 章では 最も早期にみられた加齢性変化 である発情周期の乱れや停止について，LH サージの消失と視床下部前腹側周囲 核（Anteroventral periventricula necleus：AVPV）に分布する kisspeptin 神経の関与 に着目し検討した。最後に，第 5 章で自然排卵が停止した高週齢のラットにお ける交尾排卵の可能性について検討した。 2. 加齢に伴う生殖機能の変化 本研究では，生殖機能を獲得したばかりの 6 週齢から半数例以上で自然排卵 の停止が認められる 43 週齢までを対象に，生殖機能の加齢性変化を経時的に観 察した。その結果，初期の変化として発情周期の乱れ/停止が認められ，次いで 胎児の発育遅延及び形態異常が認められ，さらに週齢を重ねると妊娠初期から 中期の胚の生存性の低下による生存児数の減少が認めらた。ヒトでは，本研究 のように生殖機能の加齢性変化について経時的に観察した報告はなく，各指標 についての断片的な疫学調査が多い。また，調査の対象となった女性の人種や 生活環境も様々であり，一概に生殖機能の加齢性変化を試験管で比較すること はできない。しかし，ヒトでも加齢に伴う不妊率の上昇(4)，月経サイクルの乱 れ(70, 73-76)及び胎児の発育遅延(3, 30-32)などといった本研究でみられた事象 が数多く報告されている。 3．加齢に伴う排卵間隔の乱れ及び停止 第 2 章で示した通り，ラットは加齢に伴い異常発情周期を示すが，ヒトと違 って閉経を示さない動物であると考えられている。上述の通り「閉経」とは「卵 巣における卵胞の消失による永久的な月経の停止」と定義づけられるが，第 5 章で示した通り，自然排卵が停止したラットでも，hCG 投与や交尾刺激によっ て排卵する成熟した卵胞を有している。しかしながら，ラットはヒトと同じく 自然排卵動物であり，排卵間隔の延長や自然排卵の停止などヒトと類似する点 もある。第 2 章で明らかにした通り，本研究では 24 週齢から異常発情周期を示 82 す個体が増加した。加齢に伴い，まず排卵間隔の延長がみられ，次いで持続発 情期や持続休止期などを示し自然排卵の停止がみられた。これらの段階的な変 化 は ， ヒ ト で も 報 告 さ れ て お り ， Soulse ら (73) が 2001 年 に 発 表 し た STRAW(Stages of Reproductive Aging Workshop) staging system では，閉経開始時 点（最終月経）を中心として，生殖可能年齢から閉経後までを月経周期のパタ ーンに基づき 7 つのステージに分類している。これによると，閉経は急激に起 こるものでは無くいくつかの段階を経て閉経に達する。最も初期にみられる変 化として，月経周期が 2-3 日短縮または延長する。その後，加齢伴い月経間隔が 7 日以上延長したり，月経サイクルが不定期なる。この期間を閉経移行期 （Menopausal Transition）とよび，閉経移行期に達する平均年齢は 46 歳で，34-54 歳の間でみられる(70, 74-76)。また，自然排卵が停止したラットでも，更に週齢 を重ね卵巣が著しく萎縮した状態では，hCG を投与しても排卵が認められない ことを予備的な実験で確認した（データ示さず）。このような状態のラットで は，成熟卵胞が消失していると考えられ，ヒトの閉経に類似した現象が起きて いると言える。これらのことから，ラットとヒトでは閉経に至る過程に多少の 違いがあるものの，どちらも排卵周期の延長や短縮がみられたのち自然排卵が 停止し，やがて卵胞が永久的に消失するといった点で共通している。 4．加齢に伴う視床下部-下垂体-性腺軸における内分泌学的変化 加齢に伴う排卵異常の発現メカニズムにはラットとヒトで異なる点がある。 ラットでは LH サージの消失が加齢性の排卵障害における重要な要因であると 考えられ，LH サージの減弱は早期の加齢性マーカーとして知られている(10-12)。 ラットでは，発情前期の午前に血液中エストロゲン濃度が上昇し，これが正の フィードバック作用となり視床下部前腹側周囲核（Anteroventral periventricula necleus：AVPV）に分布する kisspeptin 神経を活性化する。kisspeptin 神経は GnRH 神経細胞体が分布している POA に投射しており，kisspeptin は GnRH 神経を刺激 することで GnRH の放出を促進する。GnRH は下垂体門脈を経由し，下垂体前 葉のゴナドトロフを刺激して LH サージが惹起される（第 1 章 1-3）。第 4 章で 83 明らかにした通り，正常発情周期を示す高週齢ラット（middle-age rats exhibiting normal estrous cycles: MN）においても LH サージの減弱がみられ，異常発情周期 を示す高週齢ラット（middle-age rats exhibiting irregular estrous cycles: MI）では， LH サージが消失していた。さらに，卵巣を摘出し高濃度のエストラジオールを 投与（ovariectomy with suplementation of high estradiol: OVX+E2）した MI 群でも LH サージがみられなかった。このことから，高週齢ラットではエストロゲンの 正のフィードバックに対し視床下部の感受性が低下し，LH サージが消失したも のと推察した。また，第 5 章で無処置の MI に hCG を投与すると排卵が誘起さ れたことから，LH サージの消失が排卵障害の一因であると考えられた。以上の ことから，ラットみられた加齢に伴う自然排卵の停止は，視床下部のエストロ ゲンに対する反応性が低下し LH サージが消失したことに起因することが判明 した。一方，ヒトの場合，LH サージがあるにもかかわらず排卵が誘起されない 場合があり(13)，加齢に伴う生殖機能の衰えは，発育する卵胞の質と量に密接に 関係しているとされている(77)。閉経移行期にみられる，月経期間の延長や周期 の乱れは正常な成熟卵胞の数が不足した場合にみられる(78)。抗ミューラー管ホ ルモン（Anti Mullerian hormone: AMH）は，発達過程にある卵胞から分泌される ホルモンで，血液中の AMH 濃度は前胞状卵胞数を反映しており，閉経移行期に ある女性では血液中の AMH 濃度が低下することが報告されている(79, 80)。 このように，ラットとヒトでは視床下部-下垂体-卵巣軸における加齢性変化の 発生順序が異なるとされている。しかし，Yeh らは繁殖成績が落ちた 8-9 ヶ月齢 の SD ラットの血清中及び卵胞の AMH 値は 26 日齢や 65-75 日齢のラットに比 べて低値であることを報告しており，雌ラットにおいても生殖機能の低下と AMH 値の低下に関連があることを示唆している(81)。閉経移行期の女性を対象 として視床下部-下垂体-卵巣軸のどの部分に問題があるかについて調べた Weiss （2004）の報告によると，閉経移行期の女性では，内分泌学的に下記の 3 タイ プに分類できる。1) 尿中の estoronestrone conjugate（E1c）の上昇がみられ且つ LH サージもみられる。2) 尿中 E1c の上昇はみられるが LH サージはみられない。 3) 尿中 E1c の上昇及び LH サージがみられない(13)。2)については，視床下部が 84 エストロゲンの正のフィードバックに対して反応できず，LH サージが消失して いる可能性が考えられる。以上の様に，閉経移行期の女性に 3 タイプのホルモ ン異常がみられたことから，一概に閉経が卵巣機能の低下によるものであると は言い難い。これまで生殖機能の加齢性変化についてヒトとラットでは大きな 違いがあると考えられてきたが，本研究の結果を考慮すると閉経のメカニズム にはヒトとラットで共通する点がある可能性が考えられた。ヒトでは加齢に伴 う視床下部のエストロゲン感受性低下に関する詳細は明かとなっておらず，老 齢ラットの研究がヒトの視床下部のエストロゲン感受性低下に応用できる可能 性がある。 本研究により，ラットではエストロゲンの正のフィードバックに対する視床 下部 AVPV の kisspeptin 神経の反応性が低下し，kisspeptin の放出が低下したこ とで，LH サージが消失することが示唆された。加齢による LH サージの減弱・ 消失のメカニズムを理解する上で，kisspeptin 神経と並んで，視床下部の GnRH 神経及び下垂体の LH 放出機能に対する加齢の影響について知る必要がある。本 研究では，LH サージが消失した高週齢ラットでも，GnRH 神経は外因性 kisspeptin に対する反応性を維持していることを明らかにしたが，視床下部の GnRH 含有 量については未検討である。視床下部の GnRH 含有量については異なるいくつ かの結果が報告されており，若齢ラットと高週齢ラットで差がみられないとい った報告(56)や，低下しているといった報告(57)，逆に上昇しているといった報 告がある(58)。このことから，加齢に伴う GnRH 含有量の変化については，さら なる検討が必要である。また，Smith らは，正常発情周期を示す加齢ラットの下 垂体は，若いラットに比べて GnRH に対する反応性が低下していると報告して いる(60)。発情前期に下垂体を摘出し，得られた下垂体組織に GnRH を作用させ ると，加齢したラットの LH 放出量は若いラットより低く，また加齢したラット の方が LH 放出量がピークに達するまでに有した時間が長かったという報告が ある(60)。このように，kisspeptin 神経以外の部位にも加齢性の異常がみられ， 複合的なメカニズムにより加齢性の LH サージ消失が引き起こされると考えら れる。本研究で，MI では外因性の kisspeptin に対し YN と同等の LH 放出を示し 85 たことから，様々なメカニズムの中でも，kisspeptin 放出の減少は LH サージ消 失において重要な早期に出現するメカニズムの一つと言える。 6．母動物の加齢による胎児の生存・発育に対する影響 本研究で用いたラットでは，35 週齢から胎児の発育遅延及び形態学的な異常 が認められ，40 週齢で妊娠初期から中期の胚の生存性の低下によると考えられ る生存児数の減少がみられた。ヒトにおいても同様の傾向が見られ，平成 22 年 に発表された厚生労働省の調べによると 30 歳以降で受胎率が低下しはじめ，35 歳以上では不妊率が 30-50%になり，平均して 41 歳で不妊になるという(4)。さ らに， 40 歳以上の初産の場合胎児の発育遅延が増加するという報告が多数あり (3, 30-32)，本研究のラットの結果と一致する。また，本研究では母動物の加齢 と死亡児の発生頻度の間に相関は認められなかったが，ヒトでは高齢の母親で 死産の頻度が増加するという報告がある(33)。 ヒト疫学調査の場合，人種，生活習慣，基礎疾患など加齢以外のファクター が含まれるため，高齢の母親でみられた現象が母体の加齢性変化のみによるも のかどうか慎重に考えるべきである。Odibo ら（2006）は，これらの加齢以外の ファクターを排除しても，母親の加齢に伴い胎児の発育遅延や死産の頻度が増 加すると報告している(30)。そのメカニズムについて詳細は分かっていないが， 一つの可能性として低酸素が挙げられる。Naeye らの 44,386 人の女性を対象に した疫学調査によると，20 歳未満の母親に対して 39 歳の母親で死産や胎児体重 の低下の頻度が増加した。その原因として，14%で胎児の先天的形態異常がみら れ，50％で胎盤剥離，肥大胎盤梗塞及び胎盤の発育異常などにより子宮-胎盤間 で血液循環に異常が認められた。さらに，動脈硬化の頻度が 20 未満の母親に比 べて 39 歳の母親で増加していることから，子宮筋動脈の硬化が考えられた。こ のことから，胎児への酸素供給が不充分であり，死産や出生児体重の低下の頻 度が 39 歳の母親で増加した可能性が考えられると報告している(82)。しかし， 上述のとおり高齢の母親で胎児の発育遅延や死産が増加する詳細なメカニズム は未だ不明な点が多い。第 2 及び 3 章の結果から，ラットにおいて受胎率・生 86 存児数の低下は妊娠初期から中期の胚の分化・発達異常によるものと考えられ るが，ヒトの場合受胎率の低下がどのようなメカニズムで引き起こされるのか は，未だ不明な点が多い。ラットを用いた研究は，ヒトの受胎率低下のメカニ ズムを解明する為の一助となるであろう。 本研究では 35 及び 40 週齢の母動物から得られた胎児で臍ヘルニアが高頻度 で観察された。奇形の発現メカニズムには，染色体異常を伴う場合と伴わない 場合がある。ヒトの疫学調査よると，胎児に染色体異常がみられるリスクは， 20-24 歳の母親と比べると 25 歳以上から加齢とともに増加し(83)，ダウン症のリ スクは 40 歳以上の母親で急激に増加する(2)。また，染色体に異常がみられない 場合でも 35 歳以上の母親の死亡児（死産）や生存児で腹壁破裂，多指症，心奇 形，内反足/彎曲足，横隔膜ヘルニアといった奇形の発現頻度が増加すると報告 されている(83)。本研究でみられた胎児の齊ヘルニアについて，発現メカニズム は明かではないが，他に実験動物を用いた研究で，加齢に伴い胎児の形態異常 の発現頻度を調べた報告が無いことから，更なる研究の積み重ねが求められる。 6．まとめ 本研究では，雌ラットの生殖機能の変化を経時的に研究することで，加齢性 変化の初期段階として視床下部 AVPV の kisspeptin 神経の活性が低下し，LH サ ージが減弱・消失することを明らかとした（①）。この LH サージの減弱及び消 失が発情周期の乱れや自然排卵停止の主要因の 1 つである可能性が示唆された （②）。さらに週齢を重ねると，胎児に発育遅延及び形態学的異常が認められ （③），次いで妊娠初期から中期に胚の生存性が低下することを明らかにした （④）。しかしながら，自然排卵が停止した高週齢の雌ラットでも，交尾刺激 や kisspeptin/hCG 投与により排卵する発育した卵胞を有していることを示し，ヒ トの閉経とは異なる点を確認した（Fig. 6-1）。 87 88 Fig. 6-1：雌ラットの加齢による生殖機能の変化 88 総括 1．背景 本研究では，ラットを用いて生殖関連ホルモン，卵巣機能及び胚・胎児の発 育の観点から生殖機能の加齢性変化について調べた。また，排卵に必須である LH サージが加齢性に減弱・消失するメカニズムについて，近年発見された視床 下部に分布する kisspeptin 神経を中心に検討した。さらに，LH サージが消失し 自然排卵が停止した老齢ラットについて，交尾排卵の可能性について検討した。 2．雌ラットにおける加齢に伴う生殖機能の変化 雌ラットの加齢に伴う生殖機能の変化を，発情周期，交尾の許容，受胎及び 胚・胎児胚・胎児の生存・分化及び胎児の発育に着目しその経時的変化につい て調べた。 6 から 43 週齢まで発情周期を経時的に観察し結果，正常発情周期を示すラッ トの割合は 24 週齢から減少し，43 週齢では正常発情周期を示したラットの割合 は 27％であった。 次に，6 から 40 週齢のラットを用いて加齢による生殖成績，胚・胎児の生存・ 分化及び胎児の発育に関する影響を調べた。その結果，交尾率，受胎率，着床 数，着床前・後死亡率，胎盤遺残数，生存児数，胎児体重及び胎児の仙尾椎数 は雌ラットの週齢と相関が見られたが，黄体数に加齢性変化はみられなかった。 35 週齢以上の母動物から得られた胎児では胎児体重及び胎児の仙尾椎数が 10 週齢の母動物から得られた胎児と比較して有意に低値であった。このことから， 35 週齢以上の母動物から得られた胎児では発育が遅延していると考えられた。 また，40 週齢の母動物では生存児数が 10 週齢の母動物と比較し有意な減少を 示し，着床数及び受胎率と母動物の週齢の間に負の相関が確認された。同じく 着床前・後死亡率と母動物の週齢との間に正の相関が確認されたが，黄体数に 変化がなかったことから，母動物の加齢にともなう生存児数の低下は胚・胎児 の死亡率の増加が原因であると考えられた。 89 胎児の形態観察では 35 及び 40 週齢の母動物から得られた胎児に齊ヘルニア がみられた。 以上の結果から，雌 SD ラットでは 24 週齢から生殖機能の低下がみられ，排 卵機能の低下は最も早期にみられる生殖機能の加齢性変化の 1 つであることが 明らかとなった。 3．高週齢ラットの妊娠初期及び中期における胚・胎児の生存及び発育 胚・胎児の死亡率の上昇について詳しく調べるため，加齢したラットの妊娠 初期及び中期の胚の発達・分化及び着床について調べた。正常発情周期を示す 高週齢ラットを雄と交配させ，妊娠 5，6，7，8 及び 12 日の受胎率及び着床前 死亡率を算出した結果，両パラメータについて妊娠 5-8 日では若いラットと比べ て差はみられなかったが，妊娠 12 日では受胎率が 33%と低値であり，着床前死 亡率は 72.2%と高値であった。また，妊娠 6，7 及び 8 日の着床部位を組織学的 に観察したところ，高週齢ラットの子宮内膜は若いラットと比べて発達が悪く， 発育遅延を示す胚や形態学的異常を示す胚が確認出来た。形態学的異常を示す 胚では胎盤系の組織幹細胞である外胎盤円錐の低形成がみられた。さらに，妊 娠 8 日目の高週齢のラットでは子宮内膜へ吸収される途中と思われる死亡胚が 観察された。これらのことから，高週齢ラットでは受精卵は着床するものの妊 娠初期に胚の分化・発達に異常があり，子宮内膜への浸潤や胎盤系の形成が正 常に行われず着床痕を形成する前に死亡し，母動物側に吸収された可能性が示 唆された。このため，見かけ上妊娠 20 日の受胎率が低下し，着床前死亡率が上 昇したものと推察した。また，高週齢ラットで死亡児数の増加がみられなかっ たことから，高週齢ラットでは妊娠初期から中期にかけて胚・胎児に異常がお こり，生存児数が減少したものと推察した。 4．視床下部 kisspeptin 神経のエストロゲンに対する活性の低下が引き起こす加 齢性 LH サージの消失 視床下部前腹側周囲核（AVPV）に分布する kisspeptin 神経を中心に加齢性の 90 LH サージ減弱のメカニズムを検討した。雌ラットを月齢及び発情周期のパター ンに基づき，若い正常発情周期を示すラット（YN），加齢し正常発情周期を示 すラット（MN）及び加齢し持続発情を示すラット（MI）の 3 種類に分類した。 本研究ではまず初めに，YN，MN 及び MI の LH サージを確認した。MN は血漿 中 LH 濃度測定後 3-4 週以内に異常発情期を示した動物（MN-I）と 3-4 週以上に 渡り正常発情期を示した動物（MN-N）でさらに 2 種類に分類した。発情前期の 夕方に YN，MN-N，MN-I は LH サージを示したが，MN-I の LH サージは YN 及び MN-N に比べて減弱していた。しかし，YN，MN-N 及び MN-I で血漿中エ ストラジオール濃度に差はみられなかったことから，LH サージの減弱は異常発 情期発症の 3-4 週前には起きていることが明らかとなり，LH サージの減弱は血 漿中エストラジオール濃度の減少を伴わず起こることが判明した。また，MI は LH サージを示さず，血漿中エストラジオール濃度は正常発情期を示す動物（YN， MN-N 及び MN-I）と比べて低値であったにもかかわらず，AVPV の Kiss1 mRNA 発現量及び kisspeptin 含有量に減少はみられなかった。また，MI にヒト kisspeptin を投与したところ，用量依存的に血漿中 LH 濃度の上昇が YN と同等にみられた ことから GnRH 神経の kisspeptin に対する反応性は維持されていると判断した。 以上の結果から，MI では AVPV からの kisspeptin の放出が欠如しているものと 推察した。 無処置の MI では血漿中エストラジオール濃度が低値であるため，AVPV の kisspeptin 神経が活性化されていない可能性が示唆された。そこで，卵巣を摘出 し高濃度のエストラジオール（OVX+E2）を持続投与したモデルラットを作製し， エストラジオールに対する kisspeptin 神経の活性化について検討した。その結果， OVX+E2 MI では神経活性マーカーである cFos を共発現する kisspeptin 神経の割 合が YN 及び MN に比べて低く，kisspeptin 神経のエストラジオールによる活性 化が低下している事実を明らかにした。また，OVX+E2 MI ではサージ様の LH 濃度の上昇がみられなかった。 これらの結果から，MI はエストロゲンの正のフィードバックに対して AVPV の kisspeptin 神経の活性化が不十分であり，LH サージを惹起するのに十分な量 91 の kisspeptin が AVPV から放出されず，その結果 LH サージが消失するものと推 察した。 5．異常発情周期を発症した高週齢ラットの交尾排卵機構 加齢性異常発情周期を発症した雌ラットにおける交尾排卵機構について検討 した。ラットは自然排卵動物であり，血液中のエストロゲン濃度が上昇するこ とにより LH サージが惹起され，周期的に排卵する。MI は自然排卵が停止して おり，高濃度のエストラジオール存在下でも LH サージを示さなかった。このよ うな高週齢ラットについて交尾排卵機構を有しているかどうかを確認する為に， MI を雄ラットと交配したところ，受胎が確認された。また，一部の動物で交尾 後に血漿中 LH 濃度の上昇がみられた。さらに，MI に hCG または kisspeptin を 投与すると全動物で排卵が確認出来たことから，MI は LH サージに反応し排卵 する成熟卵胞を有していることが明らかとなった。以上の結果から，加齢性異 常発情周期（持続発情）を発症し自然排卵機構を失った高週齢ラットでも，交 尾排卵機能を有していることが明かとなった。 本研究では，雌の SD ラットを用いて加齢に伴う生殖機能の変化を経時的に精 査した結果，1) LH サージの減弱・消失，2) 発情周期の変化，3) 胎児の発育及 び形態の異常，4) 生存児数の低下の順で加齢性変化が認められた。また，自然 排卵が停止した高週齢の雌ラットでも，LH サージにより排卵する発育した卵胞 を有していることを示した。最も早期にみられた加齢性変化の 1 つである LH サ ージの消失は，エストロゲンの正のフィードバックに対する視床下部 AVPV の kisspeptin 神経の活性化の低下によることを示唆した。よって本研究の結果から， 雌ラットの加齢に伴う生殖機能の低下は視床下部 AVPV の kisspeptin 神経のエス トロゲンによる活性化が低下することから始まるものと推察した。 92 謝辞 本研究の遂行および本論文の作成にあたり，始終懇切なるご指導を賜り，数 限りない御助言と惜しみない御厚意を頂きました，東京農工大学農学部共同獣 医学科獣医生理学研究室の田谷一善教授，渡辺元教授，永岡謙太郎助教に心よ り感謝申し上げます。本論文の審査過程において，数々の御助言と御指導を賜 りました，帯広畜産大学の鈴木宏志教授，岩手大学の橋爪一善教授，東京農工 大学の下田実教授，岐阜大学の村瀬哲磨教授に深謝致します。 また，本研究のほぼ全ては武田薬品工業薬剤安全性研究所生殖発生毒性グル ープで実施されたものであり，本研究を遂行するにあたり多くの武田社員に惜 しみない協力を頂きました。特に，第 2 章を遂行するにあたり生殖発生毒性グ ループ山内俊明所員の協力は欠かせないものであり，動物飼育から各検査，胎 児観察に至るまで多大なご指導を頂き，大変感謝しております。また，第 3 章 を遂行するにあたり，動物飼育及びモデル動物の作製について生殖発生毒性グ ループ関将章所員，Kiss1 遺伝子測定について癌 DDU 石川香所員，kisspeptin 含 有量測定について開拓研松本寛和主席研，更に実験手技のサポートにとどまら ず研究の方向性・理論構築などを一からご指導して頂いた癌 DDU 松井久典主研 には心から感謝しております。また，生殖毒性グループ杉本武志主研，和泉祐 子主研，城塚康毅所員，市川あおい所員，山下輝芳所員，左海友美所員及び木 村真弥所員には多方面で実験をサポートして頂きました。生殖毒性グループ松 本主席研及び茶谷文雄旧 RM（現：新日本科学）につきましては，本研究全般に 渡って多大なご指導とご協力をして頂きましたことを心から感謝申し上げます。 本研究の遂行は家族の支えなしでは成しえなかったものであり，家族にも深 く感謝しております。 最後に，本研究は，多くの貴重な命の犠牲の上で遂行されました。本研究に 貢献して頂いたすべての動物たちに深く感謝申し上げます。 93 参考文献 1. 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