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軟サンゴフトウネタケ抽出物（MC-1）の 抗炎症、抗アレルギー
博士論文 軟サンゴフトウネタケ抽出物（MC-1）の 抗炎症、抗アレルギー性皮膚炎作用発現メカニズムの解析 2016 年 崔 学 柱 目 次 緒 言 ················································································································· 1 第一章 MC-1 の in vitro 抗炎症. 抗アレルギー作用 ····················································· 4 第 1 節 材料ならびに実験方法 ··············································································· 7 1-1. 材料 ········································································································ 7 1-1-1.試薬 ······································································································ 7 1-1-2.機器 ······································································································ 8 1-2. Raw264.7 細胞実験 ······················································································ 8 1-2-1. 細胞増殖阻害活性 ·················································································· 8 1-2-2. 細胞内 reactive oxygen species (ROS)消去能 測定 ·········································· 8 1-2-3. Total Nitric oxide (NO) の生成量の測定 ························································ 9 1-2-4. サイトカインの定量 ··················································································· 9 1-2-5. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ··································· 9 1-3. Jurkat 細胞実験························································································· 10 1-3-1. 細胞増殖阻害活性 ················································································ 10 1-3-2. サイトカインの定量 ················································································· 10 1-4. THP-1 細胞実験 ························································································ 11 1-3-1. 細胞増殖阻害活性 ················································································ 11 1-3-2. サイトカインの定量 ················································································· 11 1-5. EoL 細胞実験 ··························································································· 11 1-3-1. 細胞増殖阻害活性 ················································································ 11 1-3-2. サイトカインの定量 ················································································· 11 1-6. 統計処理 ································································································· 12 第２節 結 果 ··································································································· 13 2-1.MC-1 の LPS 刺激 Raw264.7 細胞に及ぼす影響 ················································· 13 2-1-1. MC-1 の Raw264.7 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ······································· 13 2-1-2. 細胞内 ROS 抑制活性 ··········································································· 14 2-1-3. NO 産生抑制活性 ·················································································· 15 2-1-4. IL-1 産生抑制活性 ·············································································· 16 2-1-5. IL-6 産生抑制活性 ················································································· 17 2-1-6. IL-13 産生抑制活性 ··············································································· 18 2-1-7. MCP-1 産生抑制活性 ············································································· 19 2-1-8. TNF-産生抑制活性 ·············································································· 20 2-1-9. IL-1, IL-6,及び TNF- mRNA 発現に及ぼす影響 ········································· 21 2-2. MC-1 の DpE 刺激 Jurkat 細胞に及ぼす影響 ····················································· 22 2-2-1. MC-1 の Jurkat 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ············································ 22 2-2-2. IL-4 産生抑制活性 ················································································· 23 2-2-3. IL-5 産生抑制活性 ················································································· 24 2-2-4. TNF-産生抑制活性 ·············································································· 25 2-2-5. INF-r 産生抑制活性 ··············································································· 26 2-3. MC-1 の DpE 刺激 THP-1 細胞に及ぼす影響 ···················································· 27 2-3-1. MC-1 の THP-1 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ··········································· 27 2-3-2. IL-6 産生抑制活性 ················································································· 28 2-3-3. IL-8 産生抑制活性 ················································································· 29 2-3-4. MCP-1 産生抑制活性 ············································································· 30 2-4. MC-1 の DpE 刺激 Eo-L 細胞に及ぼす影響 ······················································ 31 2-4-1. MC-1 の Eo-L 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ············································· 31 2-4-2. IL-6 産生抑制活性 ················································································· 32 2-4-3. L-8 産生抑制活性 ·················································································· 33 2-4-4. MCP-1 産生抑制活性 ············································································· 34 第 1 章の 結果と考察 ························································································· 35 第２章 MC-1 のアレルギー皮膚炎動物モデルにおける薬理作用と作用機序 ······················· 37 第１節 材料ならびに実験方法 ·············································································· 40 1-1. 実験動物 ································································································ 40 1-2. 皮膚炎誘発と薬物処理················································································ 40 1-3. 臨床的肉眼薬効評価 ·················································································· 40 1-4. 肝臓機能検査 ··························································································· 41 1-5. 腎臓機能検査 ··························································································· 41 1-6. 血清中サイトカインの定量 ············································································ 41 1-7. 免疫グロブリンの定量·················································································· 41 1-8. 免疫関連細胞の分析 ·················································································· 42 1-8-1. 免疫グロブリンの定量 ············································································· 42 1-8-2. 蛍光フローサイトメトリー分析 ····································································· 42 1-8-3.血液中免疫細胞数の測定 ········································································· 42 1-9. 組織検査 ································································································· 42 1-10. 統計処理 ······························································································· 43 第２節 結 果 ··································································································· 44 2-1. 臨床的肉眼薬効評価 ·················································································· 44 2-2. MC-1 の肝臓機能に及ぼす影響 ····································································· 46 2-2-1. ALT 値の変動······················································································· 46 2-2-2. AST 値の変動 ······················································································· 47 2-3. MC-1 の 腎臓機能に及ぼす影響 ··································································· 48 2-3-1. Blood urea nitrogen (BUN) 値の変動··························································· 48 2-3-2. Creatinine 値の変動 ················································································ 49 2-4. MC-1 の血清中免疫グロブリン産生に及ぼす影響················································ 50 2-4-1.血清中 IgE 産生量の変動 ········································································ 50 2-4-2.血清中 IgG1 産生量の変動 ······································································ 51 2-5. MC-1 の血清中ヒスタミン産生に及ぼす影響 ······················································· 52 2-6. MC-1 の血清中サイトカイン産生に及ぼす影響 ··················································· 53 2-6-1.血清中 IL-5 産生量の変動 ······································································· 53 2-6-2.血清中 IL-6 産生量の変動 ······································································· 54 2-6-3.血清中 IL-13 産生量の変動 ······································································ 55 2-7. MC-1 の脾臓細胞に及ぼす影響 ····································································· 56 2-7-1.脾臓細胞培養液中 IL-4 産生量の変動 ························································ 56 2-7-2.脾臓細胞培養液中 INF- 産生量の変動 ······················································ 57 2-8. MC-1 の血中の免疫細胞に及ぼす影響 ···························································· 58 2-8-1.白血球数の変動 ····················································································· 58 2-8-2.好中球数の変動 ····················································································· 59 2-8-3.リンパ球数の変動···················································································· 60 2-9. MC-1 の peripheral blood mononuclear cell (PBMC)中の免疫細胞に及ぼす影響 ·········· 61 2-9-1. CD4+細胞数の変動 ················································································ 61 2-9-2. CD8+細胞数の変動 ················································································ 62 2-9-3. Gr-1+/CD11b+細胞数の変動 ······································································ 63 2-9-4. CCR3+細胞数の変動··············································································· 64 2-9-5. B220+/CD23+細胞数の変動 ······································································ 65 2-10. MC-1 の axillary lymph node (ALN)中の免疫細胞 に及ぼす影響 ··························· 66 2-10-1. CD4+細胞数の変動 ··············································································· 66 2-10-2. CD8+細胞数の変動 ··············································································· 67 2-10-3. Gr-1+/CD11b+細胞数の変動 ···································································· 68 2-10-4. B220+/CD23+細胞数の変動 ····································································· 69 2-10-5. CD4+/CD25+細胞数の変動 ······································································ 70 2-11. MC-1 の delphian lymph node (DLN)中の免疫細胞に及ぼす影響 ··························· 71 2-11-1. CD4+細胞数の変動 ··············································································· 71 2-11-2. CD8+細胞数の変動 ··············································································· 72 2-11-3. B220+/CD23+細胞数の変動 ····································································· 73 2-11-4. CD4+/CD25+細胞数の変動 ······································································ 74 2-12. MC-1 の dorsal skin 中の免疫細胞に及ぼす影響 ··············································· 75 2-12-1. CD4+細胞数の変動 ··············································································· 75 2-12-2. Gr-1+/CD11b+細胞数の変動 ···································································· 76 2-13. MC-1 の dorsal skin における遺伝子発現の RT-PCR 解析 ···································· 77 2-13-1. IL-5 mRNA の遺伝子発現に及ぼす影響 ···················································· 77 2-13-2. IL-13 mRNA の遺伝子発現に及ぼす影響 ··················································· 78 2-14. MC-1 の H&E と toluidine blue 染色による抗炎症作用の解析································ 79 第 2 章の 結果と考察 ························································································· 81 総括 ················································································································· 85 謝辞 ················································································································· 89 参考文献 ··········································································································· 90 緒 言 日本をはじめとする先進国では、産業の発展に伴う大気汚染、食生活や生活環境の変化による アレルギー疾患の有病率が増加しており、韓国も産業化と都市化などの影響で、大人の喘息とアト ピー患者数は毎年増加している (1, 2)。アレルギーは、再発が頻繁で症状が悪化すると、通常の社 会活動に制約が生じるだけでなく、長期の通院や入院治療が必要となる。 このように、韓国や日本 など多くの国々でアトピー、喘息などアレルギー性疾患の増加が大きな社会問題になっている。アレ ルギー疾患を引き起こす原因物質には食物、ペットの毛、カビ、花粉などがあり、その中で、ダニは 家の中で最も強力なアレルゲンとして作用することが知られている (3-6)。アトピー性皮膚炎は、慢 性的に再発する炎症性皮膚疾患、皮膚乾燥症などで、激しいかゆみとともに組織学的には免疫細 胞の浸潤を特徴とする (7, 8)。また、アトピー性皮膚炎は、アレルギー炎症、気管支喘息とともに最 も代表的なアレルギー性疾患であり、近年、幼小児の有病率が 2〜3 倍に増加するととともに、大人 も同様の増加傾向にあり、社会的に大きな問題となっている。現在までアトピー性皮膚炎は、環境的 な要素と遺伝的な素因がすべて関与する複合的な疾患として知られており、まだ正確な発症原因 は明らかにされていない (9-12)。これまでの研究報告を基に、免疫学的側面から見ると、 T リンパ 球, 好酸球, 肥満細胞のようないくつかの細胞とサイトカイン, ケモカイン, 免疫グロブリンのような因 子によって誘導される CD4+/CD8+ 細胞の割合、Th2 細胞と Th1 細胞のバランスが崩れ Th2 サイトカ インである IL-4, IL-5, IL-10 と IgE の増加、肥満細胞の活性化や Th1 サイトカインである IFN-γ な どの減少が代表的な病理機序として理解されている (Fig. 1) (13-18)。 Fig. 1. Th1とTh2細胞のバランス これらの免疫学的機序に基づいて、現在までに知られているアトピー性皮膚炎の治療に使用され ている薬にはステロイド剤や抗ヒスタミン剤の塗布、及び、その服用の他、免疫抑制剤が使用されて おり、 ほとんどはステロイド剤で、大量または長期間の使用により全身的には副腎皮質機能低下、 局所的には皮膚萎縮、毛細血管拡張など重篤な副作用を起こす可能性が高く、安全性に問題があ る(19-21)。そこで、これらステロイド剤に代わる副作用の少ない伝統的漢方薬や天然物からアレル ギー性炎症を抑制する物質を単離、同定し、アトピーなど炎症性の疾患の治療に有効な生物応答 調節（BRM）剤の開発が望まれている。 本研究の研究対象である軟サンゴフトウネタケの主要成分であるセンブラン型ジテルペンにはマク ロファージ様細胞株である Raw264.7 細胞の LPS (lipo-polysaccharide) 刺激により産生する NO を顕著に抑制することを宮本等が報告している（22）。著者は漢方薬剤や天然物からアレルギー性 炎症抑制物質をマウスを用いたスクリーニングにより探索してきた。今回，軟サンゴ抽出エキスの抗 炎症，抗アレルギー作用を詳細に検討するため本研究を企画した。 本研究では、沖縄県沿岸に生息する軟サンゴフトウネタケのノルマルヘキサン抽出物（以下、MC1）を使用し、in vitro と in vivo での効果を解析した。なお、MC-1 にはセンブラン型ジテルペンで ある litophnol Ac (19.8% in MC-1), cembranoid C (5.3% in MC-1), denticulatolide (1.4% in MC-1)が含有されている (Fig. 2) (23)。 H O H O AcO O O O O H H O OAc Litophynol Ac (19.8% in MC-1) Cembranoid C (5.3% in MC-1) Denticulatolide (1.4% in MC-1) Fig. 2. MC-1の主な構成成分 第１章では MC-1 のマウスマクロファージ様細胞株である Raw264.7 細胞に対する LPS (lipopolysaccharide)刺激に対する、ROS (reactive oxygen species)、NO (nitric oxide)産生抑制、炎症サ イトカイン量の変動を解析した。次に、アレルギーの原因であるダニ粉末刺激（dermatophagoides pteronissinus: Dp）を介した、ヒト T 細胞株である Jurkat 細胞、ヒトマクロファジー細胞株である THP1 細胞、ヒト好酸球細胞株である EoL-1 細胞に対するアレルギー、炎症性サイトカイン量の変動を解 析した。 第 2 章では、皮膚疾患の動物モデルである NC/Nga マウスに Dp 粉末を塗布してアトピー性皮膚 疾患を誘発し、MC-1 経口投与による抗炎症作用を、臨床的肉眼薬効評価、肝臓、腎臓機能に及 ぼす影響、血中サイトカイン、免疫グロブリン産生量の変動、リンパ節や皮膚組織、血清中にお ける免疫細胞数の変動、及び、皮膚組織染色により検証した。 第１章 MC-1 の in vitro 抗炎症. 抗アレルギー作用 本章では in vitro での MC-1 の抗炎症、抗アレルギー作用について検討した。炎症反応が起 こると、ケラチノサイト から分泌される TNF-α と IL-1β などのサイトカインが内皮細胞層に存在す る受容体に結合した後、いくつかの炎症に関連するシグナル伝達を活性化させる。また、細胞接 着分子の分泌が増加されて、炎症細胞の血管外遊走が起こる (24, 25)。このような炎症細胞の浸 潤後、複数のサイトカインやケモカインなどの走化性因子によって炎症が起こった部位に移動し、 免疫反応を引き起こす。急性炎症では、特に、Th2 型サイトカインが重要な役割を果たしている。 外部のアレルゲンが侵入すると樹状細胞によって提示されている Th2 タイプの細胞によって IL-4, IL-5, IL-13 などが分泌される。 IL-4 と IL-13 は IgE への isotype-switching、細胞接着分子の発 現に重要な役割を果たしている。これらのプロセスは、深刻なかゆみの症状を誘導し、これによる scratching はアトピーを慢性的な状態に移行させる (26)。この時期には、Th2 型サイトカインであ る IL-5 が好酸球の活性に重要な役割を果たすだけでなく、IL-12, IL-18, TGF-β, IFN-γ, GM-CSF が皮膚リモデリング等を介して、慢性疾患の状態を維持させるのに重要な役割を果たしている。ケ モカインは、小さな走化性ペプチドに白血球を動員して活性化させる能力を持っており、自己免 疫疾患や、炎症反応、ウイルス感染、炎症反応で重要な役割を担うだけでなく、先天性免疫と適 応免疫を接続させる。特に、アトピー性皮膚炎症が起こった部位での白血球浸潤には CCL3, CCL4 などのケモカインが重要な役割を果たしている。 CCL27 はその受容体である CCR10 に結 合して記憶 T 細胞を皮膚に浸潤させ、アレルゲン特異的な皮膚のかぶれを誘導する(27-29)。 免疫学的恒常性を Th1/ Th2 の免疫機能から見ると、恒常性のバランスは、Th1 タイプと Th2 タイプ の免疫反応の平衡状態で理解されている。 Th1/ Th2 パラダイムによれば、T 細胞は、Th0 前駆体 で抗原提示細胞との結合を介した活性化過程で、抗原提示細胞の刺激の種類に応じて Th1 細胞 と Th2 細胞へ分化され、このように分化した Th1 細胞と Th2 細胞は、それぞれ特徴的なサイトカイ ンの発現を介して互いに相反する免疫機能を担当する (Fig. 3)。 Fig. 3. Th1/ Th2の免疫機能 つまり、Th1 細胞の場合、特異的に IFN-γ, TNF-β, IL-2 のようなサイトカインを発現して免疫系の CD8 陽性 T 細胞を活性化させ、 マクロファージの活性化および細胞性免疫に重要な機能を担っ ている。また、B 細胞を刺激して、IgM, IgG2a, IgG2b のような抗体を特異的に産生し、炎症性もしく は細胞性免疫反応を担当する (30-32)。これに対し、Th2 細胞の場合 IL-4, IL-5, IL-13 のようなサ イトカインを特異的に発現して、好酸球を増殖させ、肥満細胞と好塩基球が細胞内の水溶性物質の 放出を誘導し、B 細胞の isotype-switching を誘導して IgE および IgG1 のような抗体産生を促進す る (33-35)。Th1 細胞と Th2 細胞に特徴的な免疫反応は、IFN-γ または TNF-β などのサイトカイン の増加が伴う免疫反応の場合、Th1 免疫反応と呼ばれ、その逆の IL-4, IL-5 などのサイトカインの 発現増加が伴う免疫反応の場合 Th2 型免疫反応と定義されている。このような Th1 型免疫反応と Th2 型免疫反応は、バランスを伴い免疫学的恒常性を維持している (36, 37)。しかし、特定の病気 の発生過程では、Th1/ Th2 バランスの崩壊により免疫不均衡を招き、特異的免疫反応を過剰に起 こし、過剰な免疫反応は、最終的に、特定の T- helper タイプの自己免疫疾患を発症させる。これが 起因する免疫不均衡の代表的な疾患であるアレルギー性免疫疾患は、一般的に Th2 型免疫疾患 に分類される。これは、抗原として作用するアレルゲンが、免疫細胞に作用して特異的に Th2 型免 疫反応を促進し、発生した Th2 免疫反応は、ポジティブフィードバックによって Th2 型免疫反応をさ らに強化させ、最終的には Th2 型炎症性疾患を発生させる (38, 39)。現在、様々な炎症性疾患を Th1 および Th2 型の特徴に応じて分類をしており、Th1 型の炎症性疾患の例は、多発性硬化症、1 型糖尿病、炎症性腸疾患などであり、Th2 型炎症性疾患には、アトピー性皮膚炎、喘息、鼻炎など に分類することができる。したがって、Th1 免疫反応と Th2 免疫反応のバランスは、免疫恒常性維 持に重要な機能を担っており、これらのバランスの偏りも特異的タイプの炎症性疾患を誘発する原 因となる (40)。 第１節 材料ならびに実験方法 1-1. 材料 2010 年 11 月、沖縄県国頭村瀬底島、水深 1～2ｍにて採取した軟サンゴフトウネタケ（湿重量、 51 kg）を 5 cm 角に細切し、ノルマルヘキサンで抽出した(12 L x 3, overnight)。ノルマルヘキサン層 をエバポレーターで減圧濃縮し、ノルマルヘキサン抽出エキス（以下 MC-1, 767 g）を得て実験に使 用した (Fig. 4)。 1)細切 2)抽出 3)濃縮 n-hexane (36L) MC-1 (767g, 収率 1.5%) フトウネタケ(Lobophytum crassum) Fig. 4. フトウネタケのノルマルヘキサン抽出によるMC-1の調製 1-1-1. 試薬 Collagenase, RBC lysis solution, acetone, olive oil, trypan-EDTA, acetic acid, tris-base, tris-HCl、 paraformaldehyde dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), dexamethasone, 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH), 2',7'-Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) [Sigma (USA)]。2,4,6trinitrochlorobenzene (mite) [東亜製薬 (Korea)]。MTT assay kit (EZ CyTox) [Daeil Lab Service (Korea)]。NO assay kit [イントロンバイオ(Korea)]。Diff-Quick [Baxter (USA)]。Anti-CD3PE(phycoerythrin), anti-CD4-FITC(fluorescein isothiocyanate), anti-CCR3-PE, anti-B220-PE, antiCD8-FITC, anti-B220-FITC, anti-CD49b-FITC, anti-CD40mAb, anti-CD4-FITC, anti-CD11b-FITC, anti-Gr-1-PE [BD-Pharmingen (USA)]。IL-4, IFN-γ, IL-5, IL-13 ELISA kit [BioSource (California、 USA)]。IgE, IgG1 ELISA kit [SHIBAYAGI (Shibukawa, Japan)]。Anti-mouse CCR3 mAb, antimouse CD4 mAb [Santa-Cruz(California, USA)]。 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α Milliplex panel [Millipore (USA)]。Histamine ELISA kit [Biosource (USA)]。IgG1 ELISA kit [Bethyl Laboratories (USA )]。IgE ELISA kit [Shibayagi (Japan)]。その他、一般試薬は特級試薬を使用した。 1-1-2. 機器 CO2 incubator (Forma scientific Co., USA), deep-freezer(SanyoCo., Japan), 自動血球測定器 (MS9-5, France), real time quantitative RT-PCR (Applied Biosystems Co., USA), homogenizer (OMNI Co., USA), plate shaker (Lab-Line Co., USA), VarioMACS (Bergisch Gladbach Co., Germany), FACS caliber (BD Co., USA), ELISA reader (Molecular Devices Co., USA)。 1-2. Raw264.7 細胞実験 1-2-1. 細胞増殖阻害活性 Raw 264.7 cells は 96 well plates に 1 x 104 cells/ well で播種し、24 時間培養後(37℃, 5% CO2)、 MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4, 8 μg/ml の濃度で処理し、更に、24 時間培養した。培養後、10 l の WST solution を添加した後、 CO2 インキュベーター(37℃, 5% CO2)で 30 分反応させた後、450 nm での吸光度を測定し、細胞生存率を対照群のパーセントで表示した。 1-2-2. 細胞内 ROS 消去能測定 Raw 264.7 細胞内での ROS を測定するために 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA)を用 いた。48 well plate に Raw 264.7 細胞を 1.5 × 105 cells/ well となるように分注した。 24 時間培養後 (37℃, 5% CO2)、LPS および MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)をそれぞれの well に添加した。更に 24 時間イン キュベーターで培養した後、1,200 rpm で 5 分間遠心分離し、集めた細胞を冷 PBS で 2 回洗浄し た、DCF-DA (10 μM)を添加して 15 分間遮光後、室温で染色した。染色後、冷 PBS を加え、1,200 rpm で 5 分間遠心分離し、上清を除去し、再び PBS で 400 倍に希釈しフローサイトメトリーにより蛍 光強度の変化を分析した。 1-2-3. NO の生成量の測定 NO の濃度は、培養液内の nitrite 濃度を Griess Reagent System を用いて測定した。 Raw 264.7 cells は 96 well plates に 1 x 104 cells/well で播種し、24 時間培養後(37℃, 5% CO2)、MC-1(各 1, 2, 4 μg/ml)で処理し、LPS (1 μg/ml) を添加し、更に 24 時間培養した。 1N buffer (50 ml)を各 well に 添加後、10 分間室温で反応し、2N buffer (50 ml)を各 well に加え、10 分間反応させた後、540 nm で吸光度を測定した。 1-2-4. サイトカインの定量 Raw 264.7 cells を 6 well plates に 1.5 x 105 cells/well となるように分注し、24 時間培養後(37℃, 5% CO2)、MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4 μg/ml の濃度で処理した後、LPS (1 μg/ml)を添加した。24 時間 培養後、細胞培養液を回収し、培養液に含まれる IL-1β, IL-6, IL-10, IL-13, MCP-1, TNF-α を custom-made4-plex cytokine Milliplex panel を使用して定量した。分析には Milliplex analyst を使 用した。 1-2-5. RT-PCR Raw 264.7 cells で発現した mRNA を定量するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法( RT-PCR)を実 施した。 Raw 264.7 cells を 6 ×105 cells/ well で 6 well に分注し、24 時間培養した後、LPS (1 μg/ml)と MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)を添加し，更に 24 時間培養した。培養後、回収した細胞を trizol reagent (Invitrogen)を用いて total RNA を抽出した。抽出 RNA を RT-PCR kit (Bioneer)を用い cDNA を合成した。合成した cDNA (1 μg)と各 primer (1 μl)を混合し、PCR premix kit を用いて PCR 反応を行った。 PCR 産物は 1-2% agarose gel で電気泳動して、relative intensity で測定した。 一方、RT-PCR の精度を評価するために internal standard である β-actin の増幅を同時に実施した。 使用した primers を Table 1 に示す。 Table1. The primers for PCR Primer Sequences Sense 5'-GTGTCTTTCCCGTGGACCTT-3' IL-1β Sense 5'-TCGTTGCTTGGTTCTCCTTG-3' Sense 5'-CCTTCCTACCCCAATTTCCA-3' IL-6 Antisense 5'-CGCACTAGGTTTGCCGAGTA-3' Sense 5'-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3' TNF-α Antisense 5'-GTTTGCTACGACGTGGGCTA-3' Sense 5'-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3' β-actin Antisense 5'-CCTAGAAGCACTTGCGGTGCACGATG-3' 1-3. Jurkat 細胞実験 1-3-1. 細胞増殖阻害活性 Jurkat cells は 24 well plates に 1 x 106 cells/well で播種し、1 時間培養後 (0.5% FBSRPMI1640、37℃, 5% CO2)、MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4, 8 μg/ml の濃度で処理し、24 時間培養し た。培養後、10 μl の WST solution を添加し、更に CO2 インキュベーターで 30 分反応させた後、 450 nm での吸光度の変化を測定した。対照群に対する細胞生存率をパーセントで表示した。 1-3-2. サイトカインの定量 Jurkat cells を 24 well plates に 1 x 106 cells/ well となるように分注し、1 時間培養後 (37℃, 5% CO2)、Dp extract (DpE)10 μg/ml で処理した後、更に 6 時間培養し、MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4 μg/ml の濃度で処理した。 16 時間培養した後、細胞培養液を回収し、培養液に含まれる IL-4, IL-5, TNF- α を ELISA で定量した。 1-4. THP-1 細胞実験 1-4-1. 細胞増殖阻害活性 THP-1 cells は 24 well plates に 1 x 106 cells/ well で播種し、24 時間培養した後、MC-1 をそれぞ れ 1, 2, 4, 8 μg/ml の濃度で処理し、24 時間培養した。培養後、10 μl の WST solution を添加し た後、CO2 インキュベーターで 30 分反応させた後、450 nm での吸光度の変化を測定し、対照群 に対する細胞生存率をパーセントで表示した。 1-4-2. サイトカインの定量 THP-1 cells を 24 well plates に 1 x 106 cells/ well となるように分注し、1 時間培養した後、DpE (10 μg/ml) を処理した後、更に 6 時間培養し、MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4 μg/ml の濃度で処理し た。 16 時間培養した後、細胞培養液を回収し、培養液に含まれる IL-6, IL-8, MCP-1 を ELISA で定量した。 1-5. EoL 細胞実験 1-5-1.細胞増殖阻害活性 EoL cells は 96 well plates に 1 x 106 cells/ well で播種し、24 時間培養した後、MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4, 8 μg/ml の濃度で処理し、更に 24 時間培養した。培養後、10 μl の WST solution を添加し た後、 CO2 インキュベーターで 30 分反応させた後、450 nm での吸光度の変化を測定して、対照 群に対する細胞生存率をパーセントで表示した。 1-5-2.サイトカインの定量 EoL cells を 24 well plates に 1 x 106 cells/well となるように分注し、1 時間培養した後、DpE (10 μg/ml)で処理した後、更に 6 時間培養し、MC-1 をそれぞれ 1, 2, 4 μg/ml の濃度で処理した。24 時 間培養した後、細胞培養液を回収し、培養液に含まれる IL-6, IL-8, MCP-1 を ELISA で定量した。 1-6. 統計処理 各種実験データは、mean±standard error (S.E) を表示し、有意性の検証は、Student's t-test 分析法 を用いて解析した。 第２節 2-1. 結果 MC-1 の LPS 刺激 Raw264.7 細胞に及ぼす影響 2-1-1. MC-1 の Raw264.7 細胞に対する細胞増殖阻害活性 MC-1 (1, 2, 4, 8 μg/ml)でマウスマクロファージ様細胞株 Raw264.7 細胞を処理した結果、2 μg/ml の濃度では細胞阻害活性を示さなかった。また、4 μg/ml の濃度における細胞生存率 は 87±4%であり、若干 Raw264.7 細胞の増殖に影響を与え、8 μg/ml の濃度では細胞生存 率が 57±6%と低下することから、以後の実験には 1, 2, 4 μg/ml の濃度で実験を行った (Fig. 5)。 180 160 Cell viavility (%) 140 120 100 80 60 40 20 0 LPS(1μg/ml) MC-1(μg/ml) -0 - 1+ 1 2 + 2 4+ 4 8+ 8 Fig. 5. Effects of MC-1 on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with 1, 2, 4, 8 μg/ml of MC-1 in the presence of 1 μg/ml LPS or with LPS alone for 24 hrs. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±S.E. from three independent experiments. 2-1-2. MC-1 の細胞内 reactive oxygen species(ROS)抑制活性 Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による ROS の変動を解析した。MC-1 は LPS 刺激により産生し た ROS を 1, 2, 4 μg/ml の処理により、それぞれ、28.2%, 23.2%, 15.5%と有意な ROS 消去能 を示した (Fig. 6)。 Fig. 6. Effects of MC-1 on the ROS production in Raw 264.7 cells. The Raw 264.7 cells were stimulated with LPS (1 μg/ml) and treated with 1, 2, 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 24 hrs. The ROS production was analysed following incubation with DCFH-DA by flow cytometry. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001). 2-1-3. Total Nitric oxide (NO)産生抑制活性 Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による NO 産生量の変動を解析した。MC-1 は LPS 刺激により 産生した NO を 2, 4 μg/ml の濃度で処理した結果、それぞれ 56.0±9.3%, 35.0±8.0%と有意な NO 産生抑制活性を示した (Fig. 7)。 Fig. 7. Effects of LPS-induced nitrite (NO) production by MC-1 in RAW 264.7 cells. Cells were stimulated with LPS (1 μg/ml) and treated with 1, 2, 4 μg/ml of MC-1 in the presence of 1 μg/ml LPS or with LPS alone for 24 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001, ** : P <0.01). . 2-1-4. IL-1β 産生抑制活性 (Raw264.7) Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による IL-1β 産生量の変動を解析した。 対照群の IL-1β の産 生量は 10.4±1.4 pg/ml と上昇した。MC-1 は LPS 刺激により産生した IL-1β を 2, 4 μg/ml の濃 度で処理した結果、それぞれ 7.1±1.9 pg/ml, 3.6±1.3 pg/ml の有意な IL-1β 産生抑制活性を示 した (Fig. 8)。 Fig. 8. Effects of LPS-induced IL-1β production in RAW 264.7 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 24 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05). 2-1-5. IL-6 産生抑制活性 (Raw 264.7) Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による IL-6 産生量の変動を解析した。 対照群の IL-6 の産生量 は 24887.0±277.2 pg/ml と上昇した。MC-1 は LPS 刺激により産生した IL-6 を 1, 2, 4 μg/ml の 濃度で処理した結果、2 及び 4 μg/ml の濃度で、それぞれ 15468.0±3745.4 pg/ml, 8195.3±1665.1 pg/ml と有意な IL-6 産生抑制活性を示した (Fig. 9)。 Fig. 9. Effects of LPS-induced IL-6 production in RAW 264.7 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 4 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.001, * : P <0.05). 2-1-6. IL-13 産生抑制活性 (Raw 264.7) Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による IL-13 産生量の変動を解析した。 対照群の IL-6 の産生 量は 12.9±1.1 pg/ml と上昇した。MC-1 は LPS 刺激により産生した IL-13 を 1, 2, 4μg/ml 濃度 で処理した結果、2 及び 4 μg/ml の濃度で、それぞれ 6.8±0.8 pg/ml と 6.6±1.4 pg/ml と有意な IL-13 産生抑制活性をを示した (Fig. 10)。 Fig. 10. Effects of LPS-induced IL-13 production in RAW 264.7 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 24 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01). 2-1-7. MCP-1 産生抑制活性 (Raw264.7 細胞) Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による MCP-1 産生量の変動を解析した。 対照群の MCP-1 の 産生量は 9842.5±1055.0 pg/ml と上昇した。MC-1 は LPS 刺激により産生した MCP-1 を 1, 2, 4 μg/ml 濃度で処理した結果、2 及び 4 μg/ml の濃度で、それぞれ 8508.9±1481.8 pg/ml と 7792.9±785.2 pg/ml の有意な MCP-1 産生抑制活性をを示した (Fig. 11)。 Fig. 11. Effects of lipopolysaccharide (LPS)-induced MCP-1 production in RAW 264.7 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 24 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test ((** : P <0.01, * : P <0.05). 2-1-8. TNF-α 産生抑制活性 (Raw264.7 細胞) Raw264.7 細胞に対する LPS 刺激による TNF-α 産生量の変動を解析した。 対照群の TNF-α の産 生量は 23799.0±483.9 pg/ml と上昇した。MC-1 は LPS 刺激により産生した TNF-α を 1, 2, 4 μg/ml 濃度で処理した結果、4 μg/ml 濃度で 15909.0±2826.4 pg/ml と有意な産生抑制活性を示 した (Fig. 12)。 Fig. 12. Effects of LPS-induced TNF-α production in RAW 264.7 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 24 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (* : P <0.05). 2-1-9. IL-1 β, IL-6 及び TNF-α mRNA に及ぼす影響 (Raw264.7 細胞) MC-1 は LPS 刺激により発現した IL-1β, IL-6 及び TNF-α の mRNA expression を 1, 2, 4μg/ml 濃度で処理した結果、IL-1β の場合、それぞれ、64.0±20.3%、55.0±15.0%、19.0±14.0%、IL-6 の場合、78.0±0.4%、73.0±15.0%、38.0±14.0%と濃度依存的に発現抑制が認められたが、 TNF-α の場合、1μg/ml では、逆に発現亢進作用が認められた (102.0±22.1%) (Fig. 13)。 MC-1 (g/ml) -actin IL-1 IL-6 TNF- LPS (1 g/ml) mRNA expression(% of control) 140 IL-1b IL-6 TNF-a 120 100 ** 80 * 60 * * 40 20 0 Normal LPS(1μg/ml) + Control - MC-1 1 + MC-1 2 + MC-1 4 + Fig. 13. Effects of MC-1 on LPS-induced mRNA production in RAW 264.7 cells. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of LPS (1 μg/ml) or with LPS alone for 24 hrs. Total RNA was isolated and the mRNA expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were detected by RT-PCR. Bar graph showed band intensity of PCR products. Results were expressed as means ± S.E. of three experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05). . 2-2. MC-1 の DpE 刺激 Jurkat 細胞に及ぼす影響 2-2-1. MC-1 の Jurkat 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ヒト T 細胞株である Jurkat 細胞に MC-1 を 1, 2, 4, 8 μg/ml 濃度で処理した結果、MC-1 は Jurkat 細胞に対し、4 μg/ml 以上の濃度で弱い増殖阻害活性を示した (90.0±8.0%, 68.0±7.0%) (Fig. 14)。 Fig. 14. Effects of MC-1 on the cell viability of Jurkat cells. Cells were treated with 1, 2, 4, 8 μg/ml of MC-1 for 24hr. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean ± S.E. from three independent experiments. Statistical significance is based on the difference when compared with 0 μg/ml. 2-2-2. IL-4 産生抑制活性 (Jurkat 細胞) Jurkat 細胞を DpE 刺激した対照群の IL-4 の産生量は 347.3±16.0 pg/ml と上昇した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IL-4 はそれぞれ、76.6±13.5 pg/ml, 74.9±4.4 pg/ml, 27.7±21.3 pg/ml であり、MC-1 に有意な IL-4 産生抑制活性が認められた (Fig. 15)。 Fig. 15. Effects of DpE-induced IL-4 production in Jurkat cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001). 2-2-3. IL-5 産生抑制活性 (Jurkat 細胞) Jurkat 細胞を DpE 刺激した対照群の IL-5 の産生量は 33.1±0.6 pg/ml と上昇した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IL-5 はそれぞれ、13.9±1.2 pg/ml, 13.5±4.2 pg/ml, 4.3±1.8 pg/ml であり、MC-1 に有意な IL-5 産生抑制活性が認められた m(Fig. 16)。 Fig. 16. Effects of DpE-induced IL-5 production in Jurkat cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001, ** : P <0.01). 2-2-4. TNF-α 産生抑制活性 (Jurkat 細胞) Jurkat 細胞を DpE 刺激した対照群の TNF-α の産生量は 21.2±1.9 pg/ml と上昇した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した TNF-α はそれぞれ、5.6±0.1 pg/ml, 6.1±1.8 pg/ml, 3.8±0.2 pg/ml であり、MC-1 に有意な IL-5 産生抑制活性が認められた (Fig. 17)。 Fig. 17. Effects of DpE-induced TNF-α production in Jurkat cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001). 2-2-5. IFN-γ 産生抑制活性 (Jurkat 細胞) Jurkat 細胞を DpE 刺激した対照群の IFN-γ の産生量は 52.4±4.6 pg/ml と上昇した。MC-1 (1 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IFN-γ は 20±13.5 pg/ml と有意な産生抑制 活性が確認されたが, 2, 4 μg/ml の濃度では IFN-γ 産生に影響を与えなかった (Fig. 18)。 Fig. 18. Effects of DpE-induced IFN-γ production in Jurkat cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/mlof MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml.) or with DpE. alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001, * : P <0.05). 2-3. MC-1 の DpE 刺激 THP-1 細胞に及ぼす影響 2-3-1. MC-1 の THP-1 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ヒトマクロファジー細胞株である THP-1 細胞に MC-1 を 1, 2, 4, 8 μg/ml の濃度で処理した結 果、MC-1 は THP-1 細胞の増殖に有意な阻害活性を示さなかった (Fig. 19)。 Fig. 18. Effects of MC-1 on the cell viability of THP-1 cells. Cells were treated with 1, 2, 4, 8 μg/ml of MC-1 for 24 hr. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±SEM from three independent experiments. Statistical significance is based on the difference when compared with 0 μg/ml. 2-3-2. IL-6 産生抑制活性 (THP-1 細胞) THP-1 細胞を DpE 処理した対照群の IL-6 の生成量は 168.0±1.7 pg/ml と増加した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IL-6 はそれぞれ 85.0±2.5 pg/ml, 60.3±3.6 pg/ml, 53.3±3.2 pg/ml であり、すべての濃度で有意な IL-6 産生抑制活性を示した (Fig. 20)。 Fig. 20. Effects of DpE-induced IL-6 production in THP-1 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001). 2-3-3. IL-8 産生抑制活性 (THP-1 細胞) THP-1 細胞を DpE 処理した対照群の IL-8 の生成量は 486.3±7.4 pg/ml と増加した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IL-8 は、それぞれ 490.4±11.9 pg/ml, 489.2±5.2 pg/ml, 413.1±14 pg/ml であり、4 μg/ml の濃度で処理した時、若干の IL-8 の産生抑 制活性が確認された (Fig. 21)。 Fig. 21. Effects of DpE-induced IL-8 production in THP-1 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (* : P <0.05). 2-3-4. MCP-1 産生抑制活性(THP-1 細胞) THP-1 細胞を DpE 処理した対照群の MCP-1 の生成量は 140.0±2.8 pg/ml と増加した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した MCP-1 は、それぞれ 119.0±4.2 pg/ml, 120.0±6.2 pg/ml, 95.0±9.8 pg/ml であり、すべての濃度で MCP-1 の産生抑制活性が確認 された (Fig. 22)。 Fig. 22. Effects of DpE-induced MCP-1 production in THP-1 cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 16 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001, ** : P <0.01). 2-4. MC-1 の DpE 刺激 Eo-L 細胞に及ぼす影響 2-4-1. MC-1 の Eo-L 細胞に対する細胞増殖阻害活性 ヒト好酸球細胞株である Eo-L 細胞を MC-1 (1, 2, 4, 8 μg/ml) の濃度で処理した結果、EoL 細 胞の細胞生存率は 118.0±12.0%、114.0±12.0%、93.0±9.0%、85.0±10.0%であり、顕著な細胞 増殖阻害活性は認められなかった(Fig. 23)。 Fig. 23. Effects of MC-1 on the cell viability of EoL cells. Cells were treated with 1, 2, 4, 8 μg/ml of MC-1 for 24 hr. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean ± S.E. from three independent experiments. Statistical significance is based on the difference when compared with 0 μg/ml. 2-4-2. IL-6 産生抑制活性(EoL 細胞) EoL 細胞を DpE 処理した対照群の IL-6 の生成量は 162.5±10.6 pg/ml と増加した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IL-6 は、それぞれ 105.0±9.2 pg/ml, 96.0±12.7 pg/ml, 92.0±14.1 pg/ml であり、すべての濃度で有意な IL-6 の産生抑制活性が確認 された (Fig. 24)。 Fig. 24. Effects of DpE-induced IL-6 production in EoL cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 6 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05). 2-4-3. IL-8 産生抑制活性(EoL 細胞) EoL 細胞を DpE 処理した対照群の IL-8 の生成量は 231.4±0.8 pg/ml と増加した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した IL-8 は、それぞれ 231.2±7.1 pg/ml, 231.0±15.8 pg/ml, 167.0±2.1 pg/ml であり、4 μg/ml 濃度で処理したとき、有意な IL-8 の産生 抑制活性が確認された (Fig. 25)。 Fig. 25. Effects of DpE-induced IL-8 production in EoL cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 6 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01). 2-4-4. MCP-1 産生抑制活性(EoL 細胞) EoL 細胞を DpE 処理した対照群の MCP-1 の生成量は 96.1±2.4 pg/ml と増加した。MC-1 (1, 2, 4 μg/ml)で処理した結果、DpE 刺激により増加した MCP-1 は、それぞれ 53.8±3.6 pg/ml, 45.3±2.7 pg/ml, 33.0±4.0 pg/ml であり、全ての濃度で濃度依存的な MCP-1 の産生抑制活性が 確認された (Fig. 26)。 Fig. 26. Effects of DpE-induced MCP-1 production in EoL cells by MC-1. Cells treated with 1, 2 or 4 μg/ml of MC-1 in the presence of DpE (10 μg/ml) or with DpE. alone for 6 hrs. The results were presented by the mean ± S.E. from three independent experiments. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001). 第 1 章の結果と考察 本研究では、まず、各種培養細胞株に対する MC-1 の細胞増殖阻害活性を検討した。MC1 を各細胞株に 1, 2, 4, 8 μg/ml 濃度で処理した結果、 全ての細胞株に対し、2 μg/ml 濃度で は増殖を阻害しなかった。THP-1 細胞に対しては 4 μg/ml 以上の濃度で増殖阻害活性を示し た。Raw264.7 細胞と Jurkat 細胞に対しては、8 μg/ml の濃度で強い細胞増殖阻害活性を示し たが、EoL 細胞に対しては、8 μg/ml の濃度で有意な増殖阻害活性を示さなかった (Fig. 5, 14, 19, 23)。 次に、各種培養細胞に対する MC-1 の抗酸化、抗炎症活性を評価した。マウスマクロファ ージ由来細胞株である Raw264.7 細胞を LPS で刺激し、産生した ROS と NO 生成抑制活性 を検討した結果、MC-1 は濃度依存的な産生抑制活性を示した (Fig. 6, 7)。また、MC-1 は炎 症や発熱を起こし、リンパ球や好中球などを活性化する IL-1β の産生に対し、ELISA 測定と mRNA 発現解析により、濃度依存的な抑制活性を有することが確認された (Fig. 8, 13)。ま た、MC-1 は LPS 刺激による Raw264.7 細胞での IL-13 産生を抑制した。IL-13 は B 細胞の 増殖、分化、IgE 産生促進と好塩基球のヒスタミン放出刺激や大食細胞の活性化など、成熟 細胞の機能亢進により炎症に関与するサイトカインである (Fig. 10)。更に、MC-1 は単球、 マクロファージ、血管内皮細胞などから産生され IL-6, IL-8 などの産生を誘導し、細胞膜表 面の TNF receptor に結合して炎症をおこす TNF-の産生と TNF- mRNA の発現を Raw264.7 細胞及び Jurkat 細胞株に対し著しく抑制した (Fig. 12, 13, 17) (41-44)。 外部のアレルゲンが侵入すると樹状細胞によって提示されている Th2 タイプの細胞によっ て IL-4, IL-5, IL-13 などのサイトカインが分泌され、B 細胞を活性化させ、IgE を分泌してア レルギーを増悪化することが知られている (45)。ヒト T 細胞株である Jurkat 細胞に対し、 MC-1 は IL-4, IL-5 の産生を著しく抑制した (Fig. 15, 16)。一方、IgE の産生を抑制する IFNγ の生成は 2,4μg/ml で促進した (Fig. 18)。T 細胞と単球、マクロファージなどの細胞により 生産される炎症サイトカインである IL-6 は B 細胞や形質細胞 (プラズマ細胞)を増殖させる ことにより、 IgE, IgG1, IgA の産生を促進し、アレルギー反応に深く関与している。更に、 皮膚の神経細胞の分化と成長を促進し、アレルギー性疾患を含む炎症を慢性的段階に進展さ せる (46-48)。 MC-1 はマウス由来のマクロファージ細胞株である Raw264.7 細胞で IL-6 の 産生や IL-6 の mRNA 発現を抑制した。また、ヒト単球細胞株である THP-1 細胞とヒト好酸 球細胞株である EoL-1 細胞で、濃度依存的に IL-6 の産生を抑制した。血管内皮細胞の刺激 により分泌される IL-8 や MCP-1 は単球と好中球を誘引する遊走性因子でアレルギー性炎症 を起こす (49)。THP-1 と EoL-1 細胞は、末梢血の単核球と好酸球と同様の性質を有してお り、これらの細胞の機能解析に有用である。好酸球と単核球は、免疫反応に関与する細胞で あり、刺激によって、いくつかのサイトカインなどの炎症パラメーター物質を放出して炎症 反応を示す (50-52)。Lee らは DpE を処理によって THP-1 と EoL-1 から IL-6 や IL-8, MCP-1 が生産されることを報告している (53, 54)。MC-1 はヒト単球細胞株である THP-1 細胞に 対して、 4 μg/ml 濃度で有意な IL-8 の産生抑制活性を示し、MCP-1 の分泌は全濃度で有意 な抑制を示した (Fig. 21,22)。ヒト好酸球細胞株である EoL-1 細胞に対しても、THP-1 細胞 と同様に IL-8 は 4 μg/ml 濃度で有意な産生抑制活性を示し、MCP-1 の分泌は全ての濃度で 抑制する傾向を示した (Fig. 25, 26)。 以上の実験結果より、MC-1 が Th2 細胞により増殖や活性化されるマクロファージ、好酸 球からのサイトカイン産生を抑制し、Th1 細胞による IFN-γ の産生を増加させるなど、免疫 バランス調節を介して抗炎症、抗アレルギー作用を示すことが示唆された。 第2章 MC-1 のアレルギー性皮膚炎症動物モデルに対する薬理作用と作用機序 アトピー性疾患は過去数十年の間に室内に滞在する時間の増加と室内環境の変化に応じ て発生率が徐々に増加している。これにより、空気媒介性抗原 (airborne allergens)への露 出も増加している (55)。空気を媒介する抗原には、屋内塵性ダニ (house dust mite: HDM)、犬、猫などのペットの毛などがあり、これら空気媒介性抗原とアトピー性疾患に 密接な関係があることが明らかになっている (56,57)。空気媒介性抗原に一度露出される と、アトピー性皮膚炎を発症する可能性が高まり、引き続きアレルギー性鼻炎と喘息のリ スクが増加することも報告されている (58)。 HDM はアトピー性疾患を発症する主な空 気媒介性抗原であり、その排泄物や死骸などもアレルギー関連疾患を誘発する (59)。更 に、HDM にはアレルギー抗原と非アレルギー性抗原によって皮膚、肺および血液内の細 胞を刺激して炎症反応を起こす (60) 。また、HDM は角質細胞、繊維芽細胞、内皮細 胞、マクロファージ、肥満細胞、そして好酸球などの様々な細胞で付着分子を発現させ、 炎症性サイトカインの分泌を誘導し、皮膚、鼻および肺などの臓器に応じてアレルギー性 疾患を誘発することも報告されている (61,62)。 NC/Nga マウスは 1957 年名古屋大学の近藤らによって樹立され、アトピー性皮膚炎のモデ ル実験動物として使用されている (63)。 NC/Nga マウスは無菌的な SPF 環境で飼育する と肉眼的に何ら異常は見られないが、通常の環境では、抗原に接触しなくもアトピー性皮 膚炎様の炎症を起こし、出血、浮腫、痂 皮は、人のアトピー性皮膚炎の臨床所見と類似 している (64,65)。また、松田らは、通常環境で飼育された NC/Nga マウスは、何らかの 環境因子でアトピー性皮膚炎が発症して血中の IgE 濃度が異常に高くなり、これが多様な アレルゲン暴露による高 IgE 血症のアトピー性患者の所見と一致することも報告している (66)。 アトピー患者は、肥満細胞や好塩基球の表面に存在する IgE に高い親和性を持つ FcεR1b 受容体が表皮や末梢血に多く存在しており、少量の IgE にも大きく反応を示し、IgE が媒 介した免疫反応を活発に誘導することになる (67,68)。更に、外部のアレルゲンが皮膚を 介して体内に侵入すると、最初に抗原提示細胞 (Antigen presenting cell : APC)によって吸 収され、前駆 T 細胞との相互作用によって Th2 細胞に分化 される。これより、大量の Th2 タイプのサイトカインが分泌され、その中でも特に IL-4 によって B 細胞が活性化さ れイムノグロブリンが iso タイプ switching により多くの IgE が分泌される。IgE は肥満細 胞や好塩基球の表面の FcεR1 に結合し、ヒスタミンやプロスタグランジンの遊離と炎症関 連サイトカインの分泌により炎症反応を誘導する。ヒスタミンなどケミカルメディエータ ーは痒みや発赤、紅斑などアレルギーやアトピー症状を起こす (Fig. 27)。IgE の産生は、 主に Th1 細胞の IFN-と Th2 細胞の IL-4 のバランスにより制御されていることが知られ ている。 Fig. 27．アレルギー発生メカニズム アトピー性皮膚炎は、様々な免疫細胞が関与するものと考えられる。 T 細胞をはじめラン ゲルハンス細胞、好酸球、好塩球、角質細胞が病変部位で増加していることが観察され、 様々なサイトカインと免疫媒介物質もアトピー性皮膚炎に影響を与えることが知られている (69)。アトピー性皮膚炎の誘発における T 細胞は、主に Th2 細胞が関与し、細胞が分泌する IL-4, IL-5, IL-13 のような Th2 媒介サイトカインが他の免疫細胞に影響を与えてアトピー性 皮膚炎を誘発する (70)。更に、B 細胞が分泌する IgE および肥満細胞の活性化がアトピー性 皮膚炎に関与することも報告されている (71,72)。 第１節 1-1. 材料ならびに実験方法 実験動物 実験動物にはオスの 6 週齢の NC/Nga マウスを使用した。韓国中央実験動物 (Seoul, Korea) 供給を受け、実験当日まで固形飼料（抗生物質無添加三洋飼料 Co. Korea）と水を十分に供 給し、温度 22±2℃、湿度 55±15%、12 時間-12 時間 (light-dark cycle)の環境で 1 週間適応さ せた後、実験に使用した。なお、本実験は大田大学動物実験倫理委員会 (IACUC： Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を受けた(DJUARB2010-027)。 1-2. 皮膚炎誘発と薬物処理 7 週齢になった NC/ Nga マウスの背部を脱毛した後、皮膚の微細傷治癒のため、24 時間放 置した。 1% House dust mite (HDM) 溶液 200 l を塗布し（アセトン：オリーブオイル=3： 1）、4 日後に 0.4% HDM 溶液 150l を再塗布し、2 日後から 1 週間に 3 回 0.4% HDM 溶液 150l を 3 週間塗布した。実験は、4 つの群に分けて、通常群、対照群には蒸留水を、実験 群である MC-1 投与群は 200 mg/kg、400 mg/ kg の濃度で 3 週間毎日経口投与した。 1-3. 臨床的肉眼薬効評価 薬物処理後、3, 4, 5 週間時にアトピー性皮膚炎で一般的に使用される臨床的肉眼評価及び官 能評価を実施した。評価項目は、紅斑 (Erythema)、かゆみや乾燥肌 (Pruritus＆Dry skin)、浮 腫と血腫 (Edema＆Hematoma)、すりきず (Excoriation)、苔癬化 (Lichenification)などで 5 つ のである。それぞれの項目は、なし (0)、弱 (1)、重症度 (2)、激しい (3)で採点した。 1-4. 肝臓機能検査 実験終了後、NC/ Nga マウスから心臓穿刺を介して採血した後、ALT, AST 検査は Biotoxtech 社 (Ochang、Korea)に測定を依頼した。 1-5. 腎臓機能検査 実験終了後、NC/ Nga マウスから心臓穿刺を介して採血した後、BUN 検査は Biotoxtech 社 に測定依頼した。 1-6. 血清中サイトカインの定量 実験終了後、ジエチルエーテルで麻酔下、心臓穿刺法を用いて採血し、6,500 rpm で 20 分 間遠心分離して血清を分離した。 IL-6, IL-13, TNF-α は、custom-made 6-plex サイトカイン Milliplex panel を、ヒスタミンは ELISA kit を用いて次のように測定した。Well に血清 25 l ずつ分注し、assay buffer と matrix buffer、antibody-immobilized beads を各 25 l ずつ加えて混 合した後、2 時間室温で反応させて washing buffer を用いて 2 回洗浄した。これを再び 25 l の detection antibody を加え、1 時間室温で反応させ、さらに 25 l の streptavidinphycoerythrin を加え、30 分間室温で反応させた後、washing buffer を用いて 2 回洗浄した。 洗浄後、PBS を 150 l 加え 5 分間 shaking した後、Luminex を用いて測定した。 1-7. 免疫グロブリンの定量 IgG1 と IgE の生成量の測定は、ELISA kit を用いて次のように測定した。抗体を coating 緩 衝溶液に希釈して microwell に coating した後、4℃で一夜放置した。各 well を 3 回 washing 緩衝溶液で洗浄した後、血清 (100 倍希釈)を 100 l ずつ分注した。これを 1 時間室温で放 置して washing 緩衝溶液で 2 回洗浄した後、avidin-HRP conjugated antibody 100 l を処理し て 1 時間室温で放置した後、再度洗浄した。ここに TMB substrate を 100 l ずつ分注し、室 温で 30 分間放置した後、50 l の stop 溶液を処理した後、ELISA reader 450 nm で吸光度を 測定した。 1-8. 免疫関連細胞の分析 1-8-1.免疫グロブリンの定量 実験終了後、HDM に誘発された NC/ Nga マウスの皮膚組織一定量を細かく chopping した 後、1 mg/ml collagenase in 2%FBS+ RPMI1640 を添加し、37℃shaker (140 rpm, 20 min)インキ ュベーターから培養して上清を回収する方法を 4 回繰り返した。これらの細胞に blood lysis buffer を入れ室温で 5 分間処理し、赤血球を溶解させ、再び D-PBS で 2 回洗浄した後、cell strainer を通過させた細胞をフローサイトメトリー分析に使用した。 1-8-2. 蛍光フローサイトメトリー分析 分離した細胞を 5×104 cells/ml の濃度に調整した後、4℃で免疫蛍光染色を行った。それぞれ の anti-CD4-FITC, anti-CD11b-FITC, anti-CD69-FITC, anti-CD3-PE, anti-CD8-PE, anti-Gr-1-PE を 加え、30 分間 0℃で反応させた後、3 回以上のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して flow cytometry で分析した。 1-8-3. 血液中免疫細胞数の測定 実験終了後、NC/ Nga マウスから心臓穿刺法を用いて採血した後、全血を Biotoxtech 社に依 頼して、血液中の白血球や好中球、リンパ、単球の含有量を計測した。 1-9. 組織検査 投与終了後、皮膚をはがし、10% formaldehyde で 24 時間固定した。固定が終わった組織を パラフィンに包埋し、5 m の厚さで block を作った。これを epidermis, dermis, kerarinocytes, neutrophilis/ eosinophils その他の細胞と浮腫を識別する hematoxyline/ eosin (H&E)染色および 肥満細胞 (mast cells)を染色する toluidine blue 染色を実施して、組織内の肥満細胞の浸潤を 観察した 1-10. 統計処理 様々な実験から得られた結果は、mean±standard error (S.E.)で表示し、有意性の検証は、 Student's t-test 分析法を用いて決定した。 第２節 結 果 2-1. 臨床的肉眼薬効評価 7 週齢の NC/ Nga マウスを脱毛した後、HDM を 3 週間塗布して皮膚炎を誘発させ、実験群 の MC-1 を 3 週間投与した。Fig. 28 は 12 週、15 週の皮膚炎誘発の程度と改善の程度を示す 写真で、対照群では紅斑、浮腫、 痂皮、苔癬化などの症状が確認され、MC-1 投与群は対 照群に比べて紅斑、浮腫、痂皮、苔癬化などの症状が顕著に抑制されたことが確認できた。 皮膚炎指数はアトピー性皮膚炎を誘発した後、最終的な 3 週間後に皮膚炎の深化の程度を肉 眼にて評価した結果、対照群は 6.8±0.9、MC-1 (200 mg/kg)投与群は 3.2±0.8、MC-1 (400 mg/kg)投与群は 2.7±0.8 で対照群に比べて有意な皮膚炎指数の減少を示した (Fig. 29)。 12week 15week Control MC-1 200 mg/kg MC-1 400 mg/kg Fig.28. Comparison of skin manifestation in NC/Nga mice between control and experimental group. Atopic dermatitis was induced by mite treatment in the dorsal skin. Clinical skin severity score 14 Control MC-1 200 MC-1 400 12 10 8 6 4 ** ** 2 0 12weeks 14weeks 15weeks Fig. 29. Effects of MC-1 on clinical skin features and severity in HDM-induced NC/Nga mice. Clinical skin index of dermatitis was defined as the sum of the individual scores graded as 0 (none), 1 (mild), 2 (moderate), 3 (severe) for each of five signs and symptoms (Erythema, Pruritus & Dry skin, Edema & Hematoma, Excoriation, Lichenification) ; Symptoms were evaluated by skin dryness, eruption and wound on the three parts of the body; ear, face and back. The results represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with Control group by student's t-test (**, p<0.01) 2-2. MC-1 の肝臓機能に及ぼす影響 2-2-1. ALT 値の変動 肝機能測定の指標成分である ALT は正常群が 54.2±20.1 (U/L)、対照群が 59.3±19.9 (U/L)であ り、正常群に比べて対照群で若干の増加を示した。 MC-1 (200 mg/kg) 投与群では 68.4±3.3 (U/ L)、MC-1 (400 mg/kg ) 投与群では 64.7±14.8 (U/ L)であり、MC-1 が肝機能に及ぼす影響 は認められなかった (Fig. 30)。 Fig. 30. Effects of MC-1 on ALT of serum in mite-induced dermatitis models of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were presented by the mean ± S.E. 2-2-2. AST 値の変動 肝機能測定の指標成分である AST は正常群が 80.8±16.8 (U/ L)、対照群が 83.2±4.6 (U/ L)で あり、正常群に比べて対照群に有意な差は認められなかった。 MC-1 (400 mg/kg) 投与群で は、AST は 101.9±12.3 (U/ L)であり、MC-1 投与により、AST が若干増加することが確認さ れた (Fig. 31)。 Fig. 31. Effects of MC-1 on AST of serum in mite-induced dermatitis models of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were presented by the mean ± S.E. 2-3. MC-1 の 腎臓機能に及ぼす影響 2-3-1. Blood urea nitrogen (BUN)値の変動 腎機能の測定の指標成分である BUN 濃度を測定した結果、正常群は 31.9±2.1 (mg/dl)、対照 群は 30.7±0.7 (mg/dl)であり、MC-1 (200 mg/kg)投与群は 26.4±1.0(mg/dl)、MC-1 (400 mg/kg)投与群は 27.3±0.4 (mg/dl)であったことから、MC-1 投与により BUN は若干抑制され るが有意差は認められなかった (Fig. 32)。 Fig. 32. Effect of MC-1 on the BUN of serum in mite-induced dermatitis models of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were presented by the mean ± S.E. 2-3-2. MC-1 の Creatinine 数値への影響 腎機能の測定の指標成分である creatinine 濃度を測定した結果、正常群は 0.377±0.033 (mg/dl)、対照群は 0.293±0.007 (mg/dl)、MC-1 (200 mg/kg)投与群は 0.310±0.030 (mg/dl)、MC1 (400 mg/kg)投与群は 0.353±0.038 (mg/dl)であり、すべての投与群で正常群に比べて低い数 値をすことから MC-1 投与により顕著な腎毒性は確認されなかった (Fig. 33)。 Fig. 33. Effect of MC-1 on the creatinine of serum in mite-induced dermatitis models of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were presented by the mean ± S.E. 2-4. MC-1 の血清中免疫グロブリン産生に及ぼす影響 2-4-1. 血清中 IgE 産生量の変動 MC-1 投与終了後、血清中の IgE を測定した結果、正常群は 8 weeks で 58.9±35.0 (ng/ml)、 12 weeks で 68.5±12.6 (ng/ml)、 15 weeks で 72.0±4.8 (ng/ml)、対照群では 8 weeks で 96.2±10.9 (ng/ml)、12 weeks で 99.0±5.2 (ng/ml)、15 weeks で 101.0±7.1 (ng/ml)であり、 8 weeks で血清中の IgE に顕著な増加が確認された。一方、MC-1 (200 mg/kg)投与群は、8 weeks で 102.8±3.9 (ng/ml)、12 weeks で 101.0±3.0 (ng/ml)、15 weeks で 63.8±11.0 (ng/ml)、 MC-1 (400 mg/kg)投与群は 8 weeks で 85.2±8.6 (ng/ml)、12 weeks で 100.2±2.8 (ng/ml)、15 weeks で 61.0±7.9 (ng/ml)であり、MC-1 投与により 15 weeks で血清中の IgE はほぼ正常値 に改善された (Fig. 34)。 IgE level in serum (ng/ml) 120 100 80 ** ** 60 Normal 40 Control MC-1 200 20 MC-1 400 0 8 weeks 12 weeks 15 weeks Fig.34. Effect of MC-1 on the level of IgE in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. The levels of IgE were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (**, p<0.01). 2-4-2 MC-1 の血清中 IgG1 生成量への影響 MC-1 投与終了後、血清中の IgG1 を測定した結果、正常群は 1261.0±141.0 (ng/ml)、対照群 は 3712.5±302.5 (ng/ml)であり、IgG1 の顕著な産生が確認された。一方、MC-1 投与群は、 200 mg/kg では 3418.5±406.6 (ng/ml)、400 mg/kg 投与群は 3315.5±99.5 (ng/ml)であり、若干 の減少傾向が確認されたが、正常値までは改善されなかった (Fig. 35)。 Fig. 35. Effect of MC-1on the level of IgG1 in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of IgG1 were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. 2-5. MC-1 の血清中 Histamine 産生に及ぼす影響 MC-1 投与終了後、血清中の histamine を測定した結果、正常群は 56.8±5.5 (ng/ml)、対照群 は 103.4±22.2 (ng/ml)であり、血清中顕著な histamine の産生が確認された。一方、MC-1 (200 mg/kg)投与群では 58.3±8.6 (ng/ml)、MC-1 (400 mg/kg)投与群では 69.5±8.2 (ng/ml)であり、 MC-1 (400mg/kg)投与により，血清中 histamine レベルはほぼ正常値に改善された (Fig. 36)。 Fig. 36. Effect of MC-1on the level of histamine in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of histamine were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05). 2-6. MC-1 の血清中サイトカイン産生に及ぼす影響 2-6-1. 血清中 IL-5 産生量の変動 MC-1 投与終了後、血清中の IL-5 の産生量を測定した結果、正常群は 10.8±0.8 (pg/ml)、対 照群では 207.3±8.3 (pg/ml)であり、対照群では IL-5 の顕著な産生が確認された。一方、 MC-1 (200 mg/kg)投与群は 133.8±92.8 (pg/ml)、400 mg/kg 投与群は 109.6±7.0 (pg/ml)であ り、対照群に比べて、有意な IL-5 産生抑制活性が確認された (Fig. 37)。 Fig. 37. Effect of MC-1 on the level of IL-5 in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of IL-5 were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test ( ***, p<0.001) 2-6-2.血清中 IL-6 産生量の変動 MC-1 投与終了後、血清中の IL-6 を測定した結果、正常群は 18.2±2.7 (pg/ml)、対照群では 75.1±19.3 (pg/ml)と対照群において IL-6 の顕著な産生が確認された。MC-1 投与群では、200 mg/kg 投与群で 42.6±3.2 (pg/ml)、400 mg/kg 投与群は 21.0±13.7 (pg/ml)であり、対照群に比べ て MC-1 (400 mg/kg)投与群で有意な IL-6 産生抑制活性が確認された (Fig. 38)。 Fig. 38. Effect of MC-1on the level of IL-6 in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of IL-6 were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05). 2-6-3.血清中 IL-13 産生量の変動 MC-1 投与終了後、血清中の IL-13 を測定した結果、正常群は 40.0±38.7 (pg/ml)、対照群では 675.1±119.8 (pg/ml)と対照群に顕著な IL-13 産生が確認された。一方、MC-1 (200 mg/kg) 投 与群では 373.3±68.3 (pg/ml)、400 mg/kg 投与群では 209.8±70.7 (pg/ml)と IL-13 の濃度依存的 な産生抑制活性が確認された (Fig. 39)。 Fig. 39. Effect of MC-1on the level of IL-13 in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of IL-6 were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05, **, p<0.01). 2-7. MC-1 の脾臓細胞に及ぼす影響 2-7-1.脾臓細胞培養液中 IL-4 産生量の変動 MC-1 投与終了後、脾臓細胞内 IL-4 を定量した結果、正常群は 20.4±10.0 (pg/ml)、対照群で は 230.7±36.9 (pg/ml)であり、対照群の IL-4 産生量は約 11 倍増加した。一方、MC-1 投与群 は 200 mg/kg の投与で 132.8±22.9 (pg/ml)、400 mg/kg 投与は 91.1±14.1 (pg/ml)を示し、用量 依存的な IL-4 産生抑制活性が確認された (Fig. 40)。 Fig. 40. Effect of MC-1on the level of IL-4 in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of IL-4 were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05). 2-7-2.脾臓細胞培養液中 INF- γ 産生量の変動 MC-1 投与終了後、脾臓細胞内 INF-γ を測定した結果、正常群は 401.2±313 (pg/ml)、対照群 では 492.2±266.0 (pg/ml)であり、対照群に顕著な INF-γ 産生は確認されなかった。一方、 MC-1 投与群では 200 mg/kg 投与群は 2127.2±743.1 (pg/ml)、400 mg/kg 投与群は 3121.2±279.0 (pg/ml)と脾臓細胞培養液において、INF-γ の顕著な産生が確認された (Fig. 41)。 Fig. 41. Effect of MC-1on the level of IFN-γ in the serum of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The levels of IFN-γ were determined using a commercially available ELISA kit. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05, *** : P <0.001). 2-8. MC-1 の血中免疫細胞に及ぼす影響 2-8-1.白血球数の変動 MC-1 投与終了後、血液中の白血球数を測定した結果、正常群は 2.33±0.89 (×103 cells/μl)、 対照群では 6.64±1.23 (×103 cells/μl)であり血中での顕著な白血球の増加が確認された。MC1 投与群では、200 mg/kg 投与群は 5.62±1.03 (×103 cells/μl)、400 mg/kg 投与群は 4.45±0.54 (×103 cells/μl)であり、MC-1 の投与により対照群に比べ白血球の減少が確認された (Fig. 42)。 Fig. 42. Effect of MC-1on the level of WBC in the blood of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were represent the mean ± S.E. 2-8-2.好中球数の変動 MC-1 投与終了後、血中の好中球数を測定した結果、正常群は 18.83±2.78%、対照群では 14.1±2.62%であり、対照群に好中球の減少が確認された。MC-1 投与により、200 mg/kg 投 与群は 23.4±1.11 %、400 mg/kg 投与群は 24.33±1.33%と好中球数が増加した (Fig. 43 )。 Fig. 43. Effect of on the level of neutrophil in the blood of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (*** : P <0.001, ** : P <0.01). 2-8-3.リンパ球数の変動 MC-1 投与終了後、血中のリンパ球数を測定した結果、正常群は 74.6±3.39%、対照群では 79.3±2.67%であり、リンパ球数に変化は確認できなかった。MC-1 投与群は 200 mg/kg 投与 群が 69.4±0.47%、400 mg/kg 投与群は 65.5±1.28%であり、対照群に比べて若干リンパ球数は 減少した (Fig. 44)。 Fig. 44. Effect of MC-1on the level of lympocyte in the blood of mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the administration of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. The results were represent the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (*** : P <0.001, ** : P <0.01). 2-9. MC-1 の Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC)中の免疫細胞に及ぼす影響 2-9-1. CD4+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、PBMC 内の CD4+免疫細胞数をフローサイトメトリーにより解析した。 正常群は 5.20±1.50 (×105 cells)、対照群では 16.30±1.72 (×105 cells)であり、PBMC 中の CD4+ 細胞の顕著な増加が確認された。MC- 1 投与群では、200 mg/kg 投与群は 15.90±0.25 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 13.70±3.26 (×105 cells)であったが、有意な変動は確認されなかっ た (Fig. 45)。 Fig. 45. Effect of MC-1 on CD4+ cell count of PBMC in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from PBMC with anti-CD4 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. 2-9-2. CD8+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、PBMC 内 CD8+免疫細胞数をフローサイトメトリーにより解析した。正 常群は 2.50±1.13 (×105 cells)、対照群では 9.30±0.82 (×105 cells)であり、PBMC 中の CD8+免疫 細胞数は約 5 倍に増加した。MC- 1(200 mg/kg)投与群は 6.00±0.06 (×105 cells)、MC-1400 mg/kg 投与群は 7.00±1.93 (×105 cells)であり、対照群に比べて 200 mg/kg 投与群で有意な減少 を示した (Fig. 46)。 Fig. 46. Effect of MC-1on CD8+ cell count of PBMC in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from PBMC with anti-CD8 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***, p<0.001). 2-9-3. Gr-1+/CD11b+細胞数の変動 MC-1 投与終了後 PBMC 中の Gr-1+/CD11b+免疫細胞数をフローサイトメトリーにより解析し た。正常群は 5.80±1.40 (×105 cells)、対照群では 61.0±4.82 (×105 cells)であり、PBMC 中の Gr1+/CD11b+免疫細胞数の顕著な増加が確認された。MC-1 (200 mg/kg)投与群は 29.30±2.70 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 25.90±7.31 (×105 cells)であり、対照群に比べて、すべての投 与群で Gr-1+/CD11b+免疫細胞数の有意な減少が確認された (Fig. 47)。 Fig. 47. Effect of MC-1 on Gr-1+/CD11b+ cells count of PBMC in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg , 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from PBMC with anti-CD11b and anti-Gr-1 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (**, p<0.001) 2-9-4. CCR3+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、PBMC 中の CCR3+免疫細胞数をフローサイトメトリーにより解析した。 正常群は 5.30±1.64 (×105 cells)、対照群では 46.20±6.93 (×105 cells)であり、PBMC 中の CCR3+ 免疫細胞数の増加が確認された。MC- 1 投与群は 200 mg/kg 投与群で 25.60±2.29 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 22.40±8.52 (×105 cells )であり、対照群に比べて、すべての投与群 で CCR3+免疫細胞数の有意な減少を示した (Fig. 48)。 Fig. 48. Effect of MC-1on CCR3+ cell count of PBMC in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from PBMC with anti-CCR3 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05). 2-9-5. B220+/CD23+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、PBMC 中の B220+/ CD23+免疫細胞数をフローサイトメトリーにより解析 した。正常群は 6.20±3.40 (×105 cells)、対照群では 55.30±2.23 (×105 cells)であり、PBMC 中の B220+/ CD23+免疫細胞数は顕著に増加した。MC-1 の投与により 200 mg/kg 投与群は 22.10±3.91 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 14.70±1.16 (×105 cells)と、対照群に比べて、すべ ての投与群で PBMC 中の B220+/ CD23+免疫細胞数の用量依存的な減少が確認された (Fig. 49)。 Fig. 49. Effect of MC-1on B220+/CD23+ cell count of PBMC in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-B220 and anti-CD23 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001). 2-10. MC-1 の axillary lymph node (ALN)中の免疫細胞に及ぼす影響 2-10-1. CD4+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、ALN 中 CD4+免疫細胞数をフローサイトメトリーにより解析した。正常 群は 2.00±0.38 (×105 cells)、対照群では 14.30±0.76 (×105 cells)と ALN 中 CD4+免疫細胞数の 顕著な増加が確認された。MC- 1 投与群では、200 mg/kg 投与群は 12.50±3.74 (×105 cells)、 MC-1400 mg/kg 投与群は 6.30±1.05 (×105 cells)であり、対照群に比べて MC-1400 mg/kg 投与 群で有意な減少を示した (Fig. 50)。 Fig. 50. Effect of MC-1on CD4+ cell count of ALN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from ALN with anti-CD4 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***, p<0.001). 2-10-2. CD8+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、ALN 中の CD8+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。正常 群は 1.20±0.17 (×105 cells)、対照群では 10.50±1.77 (×105 cells)であり、MC-1 200 mg/kg 投与群 は 6.90±2.96 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 3.50±0.74 (×105 cells)であり、対照群に比べて MC-1 400 mg/kg 投与群で、ALN 中の CD8+免疫細胞の有意な減少を示した (Fig. 51)。 Fig. 51. Effect of MC-1on CD8+ cell count of ALN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from ALN with anti-CD8 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (**, p<0.01). 2-10-3. Gr-1+/CD11b+への影響 MC-1 与終了後、ALN 中の Gr-1+/CD11b+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。 正常群は 0.90±0.18 (×105 cells)、対照群では 8.60±0.49 (×105 cells)であり、MC-1 200 mg/kg 投 与群は 4.70±1.82 (×105 cells)、MC-1 400 mg/kg 投与群は 2.70±0.59 (×105 cells)であり、対照群 に比べて、すべての投与群で Gr-1+/CD11b+免疫細胞の有意な減少を示した (Fig. 52)。 Fig. 52. Effect of MC-1on Gr-1+/CD11b+ cells count of ALN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD11b and anti-Gr-1 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001, * : P <0.05). 2-10-4. B220+/CD23+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、ALN 中の B220+/ CD23+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析し た。、正常群は 2.00±0.76 (×105 cells)、対照群では 19.40±1.27 (×105 cells)であり、 MC-1 200 mg/kg 投与群は 9.80±1.39 (×105 cells)、MC-1 400 mg/kg 投与群は 4.30±0.94 (×105 cells )とな り、対照群に比べて、すべての投与群で B220+/ CD23+免疫細胞の用量依存的な減少を示し た (Fig. 53)。 Fig. 53. Effect of MC-1on B220+/CD23+ cells count of ALN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-B220 and anti-CD23 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001) 2-10-5. CD4+/CD25+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、ALN 内 CD4+/ CD25+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。 正常群は 2.60±0.51 (×105 cells)、対照群では 16.40±3.39 (×105 cells)であり、 MC-1 200 mg/kg 投与群は 16.80±4.77 (×105 cells)、MC-1 400 mg/kg 投与群は 7.50±1.61 (×105 cells )となり、対 照群に比べて MC-1 400 mg/kg 投与群で CD4+/ CD25+免疫細胞の有意な減少を示した(Fig. 54)。 Fig. 54. Effect of MC-1on CD4+/CD25+ cells count of ALN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD4 and anti-CD25 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05) 2-11. MC-1 の Delphian lymph node (DLN)中の免疫細胞に及ぼす影響 2-11-1. CD4+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、DLN 内 CD4+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。正常群 は 8.40±1.44 (×105 cells)、対照群では 3.10±0.86 与群は 11.50±2.45 (×105 cells)であり、MC-1 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 9.70±2.12 200 mg/kg 投 (×105 cells )となり、対照群 に比べて、すべての投与群で CD4+免疫細胞の有意な増加を示した (Fig. 55)。 Fig. 55. Effect of MC-1on CD4+ cells count of DLN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD4 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (**, p<0.01). 2-11-2. CD8+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、DLN 中の CD8+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析した。正常 群は 3.00±0.16 (×105 cells)、対照群では 1.10±0.43 (×105 cells)であり、MC-1 200 mg/kg 投与群 は 5.60±1.92 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 4.30±0.78 (×105 cells )となり、対照群に比べて、 すべての投与群で CD8+免疫細胞の 有意な増加を示した (Fig. 56)。 Fig. 56. Effect of MC-1on CD8+ cells count of DLN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD8 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05). 2-11-3. B220+/CD23+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、DLN 中の B220+/CD23+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析し た。正常群は 11.70±2.35 (×105 cells)、対照群は 4.0±1.51 (×105 cells)であり、MC-1 200 mg/kg 投与群は 13.2±0.2 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 14.1±4.58 (×105 cells )となり、対照群に比 べて、すべての投与群で B220+/ CD23+免疫細胞の 有意な増加を示した (Fig. 57)。 Fig. 57. Effect of MC-1on B220+/CD23+ cells count of DLN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-B220 and anti-CD23 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001, * : P <0.05) 2-11-4. CD4+/CD25+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、DLN 中の CD4+/CD25+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析し た。正常群は 13.10±3.37 (×105 cells)、対照群では 3.80±1.49 (×105 cells)であり、 MC-1 200 mg/kg 投与群は 17.20±4.87 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 15.80±4.82 (×105 cells )となり、対 照群に比べて、すべての投与群で CD4+/ CD25+免疫細胞の有意な増加を示した (Fig. 58)。 Fig. 58. Effect of MC-1 on CD4+/CD25+ cells count of DLN in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD4 and anti-CD25 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05) 2-12. MC-1 の Dorsal skin 中の免疫細胞に及ぼす影響 2-12-1. CD4+細胞数の変動 MC-1 投与終了後、Dosal skin 中の CD4+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解析し た。正常群は 1.50±0.47 (×105 cells)、対照群では 23.90±9.99 (×105 cells)となり、MC-1 200 mg/kg 投与群は 9.00±2.23 (×105 cells)、400 mg/kg 投与群は 6.40±0.30 (×105 cells)であり、対 照群に比べて Dosal skin 中の CD4+免疫細胞の減少が認められた (Fig. 59)。 Fig. 59. Effect of MC-1 on CD4+ cells count of dosal skin in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD4 and positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. 2-12-2. Gr-1+/CD11b+ 細胞数の変動 MC-1 投与終了後、Dosal skin 中の Gr-1+/CD11b+免疫細胞をフローサイトメトリーにより解 析した。正常群は 5.40±1.58 (×105 cells)、対照群では 86.50±2.23 (×105 cells)であり、MC-1 200 mg/kg 投与群は 32.80±0.24 (×105 cells)、MC-1 400 mg/kg 投与群は 30.70±3.53 (×105 cells)とな り、対照群に比べて、すべての投与群で Gr-1+/CD11b+免疫細胞は有意な減少を示した (Fig. 60)。 Fig. 60. Effect of MC-1on Gr-1+/CD11b+ cells count of dosal skin in mite-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. At the end of the experiment, the cells from Skin stained with anti-CD11b and anti-Gr-1 positively stained cells were analyzed by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*** : P <0.001) 2-13. MC-1 の Dorsal skin における遺伝子発現の RT-PCR 解析 2-13-1. IL-5 mRNA の遺伝子発現に及ぼす影響 MC-1 投与終了後、Dosal skin での IL-5 遺伝子発現を RT-PCR で解析した。正常群は 0.476±0.035 RQ、対照群では 1.024±0.02 RQ となり 、MC-1 200 mg/kg 投与群は 0.829±0.004 RQ、400 mg/kg 投与群は 0.619±0.030 RQ であり、対照群に比べて、すべての投与群で IL-5 遺伝子発現が有意に減少した (Fig. 61)。 IL-5 mRNA RQ of Control 1.2 1 *** 0.8 *** 0.6 0.4 0.2 0 Normal Control MC-1 200 MC-1 400 Fig. 61. Effect of MC-1on IL-5 mRNA expression in dosal skin tissue with atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 (200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. IL-5 mRNA synthesized by RT- PCR was analyzed. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***, p<0.001). 2-13-2. IL-13 mRNA の遺伝子発現に及ぼす影響 MC-1 投与終了後、Dosal skin での IL-13 遺伝子発現を RT-PCR で解析した。正常群は 0.584±0.165 RQ、対照群では 0.989±0.012 RQ であり、MC-1 200 mg/kg 投与群は 0.841±0.073 RQ、MC-1400 mg/kg 投与群は 0.605±0.117 RQ となり、対照群に比べて、すべての投与群で IL-13 遺伝子発現が有意に減少した (Fig. 62)。 Fig. 62. Effect of MC-1 on IL-13 mRNA expression in dosal skin tissue with atopic dermatitis model of NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1(200 mg/kg, 400 mg/kg) for 3 weeks. IL-13 mRNA synthesized byRT- PCR was analyzed. The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (** : P <0.01, * : P <0.05). 2-14. MC-1 の H&E と Toluidine blue 染色による抗炎症作用の解析 MC-1 投与終了後、皮膚組織に H&E 染色と toluidine blue 染色を実施した。正常群は、 epidermis が薄く分布し、肥満細胞がほとんど観察されなかった。これに比べて対照群は、 epidermis の厚さが過形成、展開されていた（矢印）。また、その周辺に色素沈着、顆粒の 増加、不全角化症、肥満細胞の浸潤が上群に比べて顕著に増加した（矢印）。 MC-1 200 mg/kg 投与群の一部は、対照群に比べて、正常群の近くに epidermis の厚さが減少し、その 周辺に細胞変形と放棄の症状、肥満細胞の浸潤の減少が認められた。 MC-1 400 mg/kg 投与 群も対照群に比べて epidermis の相対的な厚さが減少し、色素沈着、顆粒の増加、肥満細胞 の浸潤などが著しく減少した (Fig. 63, 64)。 表皮 Normal Control MC-1 (200mg/kg) MC-1 (400mg/kg) Fig.63. Histologic examination of dorsal skin lesion in mite-induced NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 for 3 weeks. Dorsal skin biopsies were stained with hematoxylin and eosin (H&E) for examining inflammatory cells. The stained tissue was observed by bright microscopy (Nikon, Japan, original magnification, ×100). Fig.64. Histologic analysis of dorsal skin lesion in mite-induced NC/Nga mice. NC/Nga mice model followed by the treatment of MC-1 for 3 weeks. Dorsal skin biopsies were stained with toluidine blue for examining mast cells. The stained tissue was observed by bright microscopy (Nikon, Japan, original magnification, ×100). 第 2 章の結果と考察 第 2 章では、屋内塵性ダニ (HDM) 粉末を背部皮膚に塗布して誘起した皮膚炎 NC/Nga マ ウスを用い、MC-1 の抗炎症作用と作用機序を解析した。MC-1 の経口投与により、臨床的 肉眼薬効評価では MC-1 投与群で対照群に比べて 紅斑、浮腫、痂皮、苔癬化などの症状が 顕著に抑制された。これらの変化は SCORAD 法 (73)を使用した臨床指数に反映され、対照 群に比べて MC-1 投与群で有意な改善效果を示した (Fig. 28, 29)。MC-1 の毒性については、 肝機能指標である ALT は正常群との差は認められなかったが、AST 数値は、投与量の増加 により若干増加することが確認された (Fig. 30, 31)。腎臓機能指標である BUN 数値は若干 抑制されることが確認されたが、クレアチニン数値に顕著な腎毒性は確認されなかった (Fig. 32, 33)。 アトピー性皮膚炎により、Th2 細胞によって発現した IL-4, IL-13 のようなサイトカイン は、B 細胞の分化を促進し、isotype- switching を誘導して IgE および IgG1 のような免疫グロ ブリンの分泌を促進させる (74)。アトピー性皮膚炎患者だけでなく、ダニの抽出物でアトピ ー性皮膚炎を誘発させた NC/ Nga マウスの血淸は IgE が大幅に産生している (75)。MC-1 投 与により 15 weeks で血清中の IgE は両量共にほぼ正常値に改善された (Fig. 34)。これは、 MC-1 が IgE の抑制を介してアレルギー性アトピー性皮膚炎を抑制したものと考えられる。 IgG1 は若干の減少傾向が確認された (Fig. 35)。Histamine はかゆみなどを誘発し、アトピー 性皮膚炎を悪化させる役割をする物質で IgE などの刺激を受けた肥満細胞などから分泌され る (76)。MC-1 の投与により、アトピー性皮膚炎で痒みなどを起こす histamine の血清中のレ ベルはほぼ正常値に改善された(Fig. 36)。 Th2 細胞の代表的な炎症性サイトカインである IL-5 と IL-13 は、IgE への isotype-switching、細胞接着分子の発現に重要な役割をして、好酸 球を活性化させることが知られている (77,78)。本研究では、MC-1 が血清中の IL-5, IL-6, IL13 の産生を濃度依存的に減少させ、高用量 (400 mg/ kg)投与群で有意な産生抑制効果を示し た (Fig. 37-39)。 CD3/CD28 で誘導した脾臓細胞培養液で IL-4 のと INF- γの産生量を測定し た結果、Th2 細胞サイトカインである IL-4 の用量依存的な産生抑制活性が見られたが、 Th1 細胞のサイトカインである INF-γ には顕著な産生亢進作用が確認された (Fig. 40, 41)。 これは、第 1 章の Jukat 細胞を用いた実験結果と同様、多くのアトピー性疾患に見られる特 徴的な IL-4 産生亢進と IFN-γ 産生低下と一致する (79,80)。 また、Lee 等も喘息動物実験モ デルを用い同様の結果を報告している (81)。したがって、MC-1 が Th1 細胞と Th2 細胞のバ ランスに関与してアトピー性皮膚炎の改善効果を示したと考えられる。 血液中の免疫細胞の変化は MC-1 の投与により、対照群では白血球の顕著な増加が確認さ れたが MC-1 の投与により、白血球数は減少し、好中球数は増加し、また、リンパ球数は対 照群に比べて、有意な減少を示した (Fig. 42-44)。PBMC を分離し CD4+免疫細胞数を解析 したが、有意な変動は確認されなかった。更に、ALN と Dosal skin 中の免疫細胞数は、対 照群に比べて MC-1 の投与群で有意な減少を示した (Fig. 45, 50, 59)。しかし、 DLN 中の CD4+免疫細胞については、すべての投与群で CD4+免疫細胞の有意な増加が確認された (Fig. 55)。CD8+免疫細胞数は PBMC や ALN, Dosal Skin 中で、対照群に比べて有意な減少を 示したが(Fig. 46,51)、DLN 中の CD8+免疫細胞は、対照群に比べてすべての投与群で CD8+ 免疫細胞の有意な増加を示した (Fig. 56)。これは背部のアトピー性皮膚炎発症部位に近い DLN 中の T 細胞が活性化されたためと考えられる。 好中球やマクロファージの前駆細胞で顆粒球や単核球を表現する Gr-1+/CD11b+免疫細胞数 は MC-1 の投与により、PBMC, ALN, Dosal skin 中で対照群に比べて有意な減少が確認され た (Fig. 47, 52, 60) (82)。 好酸球の Eotaxin 受容体である CCR3 はケモカイン系受容体の一種であり、MCP-3, MCP-4, RANTES のようなケモカインとも反応をする。これらのケモカインは好酸球遊走性有し、類 似なケモカインは好酸球だけでなく肥満細胞の活性化や好塩球を刺激し脱顆粒化させアレル ギー症状を起こす (83, 84)。MC-1 の経口投与により、すべての投与群で CCR3+免疫細胞数 の有意な減少が確認された (Fig. 48)。 成熟した B 細胞を示す B220+/ CD23+細胞は PBMC と ALN 中では 対照群に比べて、すべ ての投与群で有意な減少を示したが、DLN 中では対照群に比べて有意な増加を示した (Fig. 49, 53, 57)。これは背中のアトピー性皮膚炎発症部位に近い DLN 中の B 細胞が活性化され たためと考えられる。 Regulatery T リンパ球は CD4+ T 細胞の上流で免疫反応を抑制し、自己寛容を維持する役割 を担い、高レベルの CD25 を発現している CD4+/ CD25+免疫細胞は ALN 中では MC-1 (400 mg/kg) 投与群で有意的な減少を示したが、DLN 中ではすべての投与群で有意な増加を示し た (Fig. 54, 58)。これは背中のアトピー性皮膚炎発症部位に近い DLN 中の Regulatery T リ ンパ球 が活性化されたことによると考えられる。 アトピー性皮膚炎で Th2 細胞によって発現した IL-4, IL-13 のようなサイトカインは、B 細 胞の分化を促進し、IgE を生産することができるように isotype switching を起こし、免疫グ ロブリンの分泌を促進させる (85)。Dosal skin での IL-5 と IL-13 の遺伝子発現はすべての MC-1 投与群で 有意に減少した (Fig. 61, 62)。 アトピー性皮膚炎患者の皮膚には、リンパ球をはじめ、肥満細胞、好酸球などの免疫細胞が 多数浸潤しており、epidermis と dermis が肥厚し、瘙痒感による負傷の刺激によって出血な ど組織の損傷が起こり、免疫細胞数の変動と組織変性はアトピー性皮膚炎を評価する重要な 指標となる (86)。皮膚組織を H＆E 染色と toluidine blue 染色により解析した結果、対照群 は、epidermis の厚さが過形成、展開されていた。また、その周辺に色素沈着、顆粒の増 加、不全角化症、肥満細胞の浸潤がの上群に比べて顕著に増加したが、MC-1 (200 mg/kg) 投与群では、対照群に比べて、正常群の近くに epidermis の厚さが減少し、その周辺に細胞 変形と放棄の症状、肥満細胞の浸潤の減少が認められた。 MC-1 (400 mg/kg) 投与群も対照 群に比べて epidermis の相対的な厚さが減少し、色素沈着、顆粒の増加、肥満細胞の浸潤な どが著しく減少した (Fig. 63, 64)。 総括 本研究では、培養細胞や NC/Nga 皮膚炎動物モデルを用いた解析により、 炎症やアレルギ ー性皮膚炎おける軟サンゴフトネタケの抽出物 (MC-1)の機能について新知見を得た。 Raw264.7 細胞株で ROS, NO の生成を抑制し、IL-1, IL-6, IL-13, MCP-1 の産生抑制と IL1, IL-6 の mRNA 発現を抑制した。THP-1 細胞株では、IL-6, IL-8, MCP-1 の産生を抑制し、 EoL 細胞株では、IL-6, IL-8, MCP-1 の産生を抑制した。さらに Jurkat 細胞株では、IL-4, IL5, TNF-の生成を抑制し、INF-γ の生成を増加させた (Table 2)。 Table 2. 細胞株 Raw 264.7 Jurkat THP-1 EoL MC-1 の各種培養細胞に対する抗炎症・抗アレルギー作用 サイトカイン or ケモカイン 対照群 (in vitro) MC-1 (μg/ml) 1 2 4 IL-1 ↑↑↑ - ↓ ↓↓ IL-6 ↑↑↑ ↓ ↓ ↓↓ IL-13 ↑↑↑ - ↓↓ ↓ MCP-1 ↑↑↑ - ↓ - TNF- α ↑↑↑ - ↓ - IL-4 ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ IL-5 ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓ ↓↓↓ TNF- α ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ INF-γ ↑↑↑ ↓↓↓ - ↑ IL-6 ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ IL-8 ↑↑↑ - - ↓↓ MCP-1 ↑↑ ↓↓ ↓↓ ↓↓↓ IL-6 ↑↑ ↓↓ ↓ ↓↓ IL-8 ↑↑ MCP-1 ↑↑↑ ↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ ↓↓↓ これは MC-1 が Th2 細胞からのサイトカイン産生を制御し、炎症やアレルギー皮膚炎を抑 制し、 INF-γ の産生を増加させ免疫バランスを維持する機能を有する可能性を示唆した。 一方、皮膚疾患動物モデル NC/ Nga を用いた実験では、IgE、ヒスタミンの生成を抑制し、 血清中では IL-5, IL-6, IL-13 の産生を抑制し、脾臓細胞では IL-4 の産生を抑制し、INF- γ の 産生を更新したことから、細胞レベルの実験結果と同様に、Th1 と Th2 細胞のバランスに寄 与している可能性が示唆された (Table 3, Fig. 65)。 Table 3. MC-1の各サイトカインなどに対する抗炎症・抗アレルギー作用 区分 血清中 サイトカイン 免疫グロブリン サイトカイン or MC-1 (mg/kg, p.o.) 200 400 IL-5 ↑↑↑ - ↓↓↓ IL-6 ↑↑↑ - ↓ IL-13 ↑↑↑ ↓ ↓↓ IgE ↑↑↑ ↓↓ ↓↓ IgG1 ↑↑↑ - - ↑↑ - ↓ ↑↑↑ ↓ ↓↓ - ↑ ↑↑↑ ヒスタミン 脾臓細胞培養液 サイトカイン 対照群 (in vivo) IL-4 INF-γ Fig. 65. MC-1 の抗炎症・抗アレルギー作用 また、MC-1 は血液中の白血球などの免疫細胞の産生抑制、PBMC の Gr-1+ /CD11b+細胞 (顆粒球、単球)、CCR3+ (好酸球)、B220+/ CD23+ (B 細胞)の産生抑制、ALN 中の免疫細胞の 産生抑制、DLN 中の免疫細胞の産生亢進、Dosal skin 中の 顆粒球、単球 (Gr-1+ /CD11b+細 胞)の産生を抑制や IL-5, IL-13 mRNA 発現を抑制したことから、 MC-1 は生体における免疫 バランスに寄与しているが示唆された。 Table 4. MC-1 の各細胞に対する抗炎症・抗アレルギー作用 細胞 区分 血液中免疫細胞 400 - - リンプ球 ↑↑ ↓↓ ↓↓↓ 好中球 ↓ ↑↑ ↑↑↑ ↑↑↑ - - ↑↑↑ ↓↓↓ - ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ ↑↑↑ ↓↓ ↓ ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ ↑↑↑ - ↓↓↓ ↑↑↑ - ↓↓ ↑↑↑ ↓ ↓↓↓ ↑↑↑ ↓↓ ↓↓↓ ↑↑↑ - ↓ ↓↓↓ ↑↑ ↑↑ ↓↓↓ ↑ ↑↑ ↓↓↓ ↑↑↑ ↑ ↓↓↓ ↑↑ ↑ ↑↑↑ - - + CD8+ + Gr-1 /CD11b + CCR3+ B220 /CD23 CD4 + + CD8+ + Gr-1 /CD11b + B220+/CD23+ + CD4 /CD25 + CD4+ DLN中免疫細胞 200 ↑↑↑ + ALN中免疫細胞 MC-1 (mg/kg, p.o.) 白血球 CD4 PBMC 中 免疫細胞 対照群 (in vivo) CD8 + + B220 /CD23 + CD4 /CD25 + + + Dorsal skin中 免疫細胞 CD4 Gr-1+/CD11b+ ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ Dorsal skin中 遺伝子発現 IL-5 mRNA ↑↑↑ ↓↓↓ ↓↓↓ IL-13 mRNA ↑↑ ↓ ↓↓ Fig. 66. MC-1 の免疫細胞に対する抗炎症・抗アレルギー作用 また、アトピー性皮膚組織の染色では、MC-1 投与により、表皮の厚さが薄くなったこと から、臨床での MC-1 の皮膚炎治療薬としての可能性も示唆された (Fig 63,64)。 以上で MC-1 は Th1 と Th2 細胞の バランスや免疫細胞の調節の寄与によって 抗炎症、抗 アレルギー作用 している可能性が示唆された。 本研究によって得られた知見が炎症やアレルギー性皮膚炎の病態解明ならびに新しいクラ スの薬剤の創生に繋がり、炎症やアレルギー性皮膚炎に苦しむ患者の治療に一助になること を願う。 謝 辞 終わりに臨み、本研究の機会をいただき、ご指導とご鞭撻を賜りました九州大学大学院薬学研究 院宮本智文准教授と田中千晶博士に深く感謝申し上げます。また、多くの関心とアドバイスをくれた 株式会社サウスプロダクトの伊波匡彦博士と株式会社アライアンス社の美濃部秀雄社長に感謝申し 上げます。また、博士論文に関し、有益なご助言をいただきました、九州大学大学院薬学研究院、 森元聡教授、田中宏幸准教授、渡公佑准教授に感謝申し上げます。 さらに、博士論文の研究をできるように配慮と応援をくれた大田大難治性自己免疫疾患の東西医学 研究センターの金東照センター長と研究員の方々にも感謝いたします。 何よりも心から応援してくれた妻と娘 BoGum、二人の母親と家族一同に感謝します. 박사 논문을 마치며, 본 연구의 기회를 주시고, 지도와 편달을 아끼지 않으신 큐슈대학교 약학연구원 미야모토 교수님과 다나카 조교님께 깊이 감사드립니다. 그리고 많은 관심과 조언을 준 오키나와의 이하선배와 후쿠오카의 미노베 사장님께도 감사드립니다. 그리고 박사논문 연구를 할수 있도록 배려와 응원을 아끼지 않으신 대전대 난치성면역질환의동서생명의학연구센터의 김동희 센터장님과 연구원들께도 감사드립니다. 무엇보다 마음으로 응원해준 아내와 딸 보금이, 그리고 두어머니와 가족들 모두에게 감사드립니다. 학위과정에 들어간 것을 누구보다 기뻐하신 하늘에 계신 아버지께 감사드립니다. 参考文献 1. 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