1.大 腸菌ゲノムプロジェク トの歴史

は じめ に
が,最
大 腸 菌 の ゲ ノ ム解 析 の 目的 は,一
め て い る 能 力,つ
に生 物 を生 物 た ら し
ま り1つ の細 胞 を2つ の 細 胞 にす る能
Database Center for Life Science Online Service
力 の 完 全 理 解 で あ る.完 全 理 解 とは,そ
の 能 力 を遺 伝 子
も全 体 像 解 明 に 近 い ゆ えん で あ る.こ の作 業 に よ
っ て,ま ず 生 き る た め に 必 要 な 遺 伝 子 セ ッ トとそ の 機 能
ネ ッ トワ ー クの 統 合 体 の 解 明 が な され,最 終 的 に は細 胞
内 部 の生 命 活 動 の シ ミュ レ ー シ ョ ンに よ る再 現 が そ の 目
の 機 能 ネ ッ トワー クの 総 体 と して理 解 す る こ とで あ り,
標 と な ろ う.し か しこ れ は 「言 う は 易 く,行 な うは 難 し」
大 腸 菌 は そ の た め の 最 適 な生 物 の1つ で あ ろ う.こ の 目
で,解 析 しつ くされ た感 の あ る大 腸 菌 で も無 理 か も しれ
的 は,以 前 は た だ の夢 にす ぎ なか っ た.し
な い.し
か し,そ れ を
達 成 で き る の で は な い か と思 わ せ る 時代 に な った.ゲ
ノ
か し,大 腸 菌 だ か ら こ そ で きる か も しれ な い と
い う壮 大 な夢 を も って ゲ ノ ム解 析 を進 め て い る,
ム解 析 の 時 代 の到 来 で あ る.
ヒ トゲ ノ ムが 解 明 さ れ た 現 在 に お い て も,大 腸 菌 や 枯
1989年 に 始 ま っ た 日本 の 大 腸 菌 ゲ ノ ム 配 列 決 定 プ ロ
草 菌,出 芽 酵 母,線
虫,シ
ョ ウ ジ ョウバ エ とい った い わ
ジ ェ ク トは,組 織 の再 編 成 な ど を経 なが ら,最 終 的 に は
ゆ る モ デ ル生 物 に お け る ゲ ノ ム解 析 の 重 要 性 は増 え る一
1997年1月
方 で あ る.モ デ ル生 物 の 遺 伝 子 機 能,細 胞 機 能 の解 明 に
に 堀 内 ら を 中 心 とす る グ ル ー プ に よ り,そ
の 全 体 像 が 明 らか に され た.こ れ は 全 体 か ら見 れ ば 第 一
よ る,他 の 生 物 の ゲ ノ ム研 究 へ の 寄 与 は非 常 に大 きい.
歩 で あ る.と い うの は,こ れ ほ ど研 究 しつ くさ れ た 感 の
こ こ で は,大 腸 菌 にお け る ゲ ノ ム研 究 の これ まで,現 状,
あ る 大 腸 菌 で す ら,半 数 の 遺 伝 子 しか 解 析 さ れ て い な か
そ して今 後 の 見 通 しを,筆 者 らの 取 組 み を 中心 に紹 介 し
っ た こ とが ゲ ノム 配 列 か ら判 明 した か ら で あ る.こ れ に
た い.
ひ き続 い て,機 能 未 知 の 遺伝 子 の 機 能 を 明 らか に しな く
て は,完 全 理 解 に は ほ ど遠 い.こ の 作 業 は,ち
ょう ど ジ
1.大 腸菌 ゲ ノム プ ロジ ェク トの歴 史
グ ソ ー パ ズ ル を順 々 に完 成 させ て ゆ く過 程 に た と え る こ
とが で き る.個 々 の ピ ー ス は 遺伝 子 で あ り,配 列 決 定 に
よ る全 遺 伝 子 構 造 の解 明 は,全
ピー ス が 裏 向 きで 出そ ろ
1980年 代 半 ば に ゲ ノ ム 解 析 研 究 の 重 要 性 が 急 速 に 論
じ ら れ 出 した 背 景 と,1987年
に 小 原 ら に よ る大 腸 菌 染
っ た こ とを 意 味 す る.個 々 の遺 伝 子 の 機 能 解 析 は 各 ピ ー
色 体 の 物 理 地 図 と コ ン テ ィ グ ク ロ ー ンの 完 成1)が契 機 に
ス を表 に 向 け る こ とで あ り,表 に な れ ば ピー ス ど う しを
な り,日 本 で も大 腸 菌 ゲ ノ ム研 究 へ の 取 組 み が 始 ま っ
組 み 合 わせ る こ とが で き る,つ ま り遺 伝 子 間 の機 能 ネ ッ
た.文 部 省 に よ る重 点 領 域 研 究 の1つ
トワー ク を 結 ぶ こ とが で き る.大 腸 菌 の 場 合,多 くの ピ
ー ス が す で に 表 を向 い て お り,さ らに そ の ピ ー ス が組 み
あ っ た.当 時 は 自動DNAシ
合 わ さ って 多 数 の 島 が で きて い る状 態 で あ る.今 後 の 機
で,ま
能 解 析 で ピ ー ス が表 に 向 け ば,島
と 島 とが 一 気 につ な が
っ た.そ れ と と も に機 能 不 明 な 領 域 の塩 基 配 列 決 定 を 行
っ て い くだ ろ う,全 ピー ス が1つ
に な り全 体 像 が で きれ
な う こ との 意 味 自体 の議 論 が 不 十 分 な ま ま に プ ロ ジ ェ ク
ば 完 成 で あ る,遺 伝 子 機 能 が よ く解 析 され て い る 大 腸 菌
トが ス タ ー トした,当 初 は 参 加 研 究 者 が 対 象 と して い る
Hirotada
Mori,奈
Wada,京
都 大 学 ウ イ ル ス 研 究 所,Shigehiko
端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 遺 伝 子 教 育 研 究 セ ン タ ー,Takeshi
大 腸 菌 ゲ ノ ム 機 能 解 析 グ ル ー プ[現
所),松
在 の メ ン バ ー:上
田 秀 雄(大 阪 大 学 基 礎 工 学 部),三
Post sequence
由良 隆 を代 表 と して ス タ ー トした の が1989年
genome analysis
Ara,Hiraku
記 の ほ か に,井
木 健 良(九 州 大 学 薬 学 部),山
of Escherichia
の こ とで
ー ケ ンサ ー が 出 始 め た こ ろ
だ まだ 大 規 模 配列 決 定 に 利 用 で き る状 態 で は な か
良 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 遺 伝 子 教 育 研 究 セ ン タ ー,Takashi
神 戸 大 学 理 学 部,Chieko
と して京 都 大 学 の
Horiuchi,基
Kanaya,山
礎 生 物 学 研 究 所,Katsumi
形 大 学 工 学 部,Masashige
Kitagawa,奈
Isono,
良先
Ohshima,CREST
口 八 郎(京 都 大 学 理 学 部),加
藤 潤 一(東 京 大 学 医 科 学 研 究
本 義 弘(兵 庫 医 科 大 学)]
coli
蛋 白質
核 酸 酵 素Vol.46No.13(2001)
1977
領 域 の 配列 決 定 をで きる か ぎ り広 げ る こ とで 配 列 決 定 を
DNAの
進 め る一 方,企
が あ り,効
業 に委 託 す る形 で シ ス テ マ テ ィ ッ ク な配
率 化 とい う点 で 考 え る と最 善 の 方 法 と は い え
列 決 定 が 進 め られ た2,3).そ の 成 果 と して,111,4kbの
な か っ た.大
連 続 した 大 腸 菌 の 配 列 が デ ー タバ ン ク に登 録 され た が,
ら れ て い た の で,こ
そ の 配 列 長 は そ れ まで の 登 録 配 列 の 最 長 記 録 を 更 新 し
不 可 能 で あ る こ と は 明 ら か で あ っ た,ま
た4).ま た,プ
ゲ ノ ム 研 究 の 一 環 と し てDNAシ
ロ ジ ェ ク トの なか で トラ ン ス ポ ゾ ンを 用
腸 菌 ゲ ノ ム は お お よ そ4,700kbと
見 積 も
の ま ま で す べ て を や り終 え る こ と は
た こ の 間,ヒ
ト
ー ケ ンサ ー な ど の 技 術
い た効 率 的 な シ ス テ マ テ ィ ッ ク な新 しい 配 列 決 定 の方 法
革 新 も 進 み,そ
の 開発 も行 な わ れ た.個
々 の 研 究 者 の登 録 も含 め る とか
で の や り 方 を 見 直 し,徹
な りの 長 さに な るが,シ
ス テ マ テ ィ ッ クな 配 列 決 定 の 成
列 決 定 の 方 法 を 分 担 作 業 か ら分 業 に 変 え る こ と を 検 討 し
果 と して は11Okbあ
ま り と,決
して 満 足 で き る もの で
は な か っ た とい わ ざ る を え な い.
か らな い 領 域 のDNA配
た.第3期
列 の 決 定 か ら,予 想 以 上 に種 々
の 能 力 が 格 段 に 増 し た.そ
こ で,こ
れま
底 的 な 効 率 化 を 図 る た め に,配
の 始 ま りで あ る 子
1994年
しか し,こ の プ ロ ジ ェ ク トの最 大 の 成 果 は,意 味 の わ
Database Center for Life Science Online Service
断 片 化 か ら始 ま る す べ て の 工 程 を処 理 す る必 要
の3月
の の ち,す
っ た.こ
で 終 了 し た 第2期
ゲ ノ ム プ ロジ ェ ク ト
ぐ に は 正 式 な サ ポ ー トを 得 る こ と が で き な か
の 間,そ
れ まで に 得 られ た デ ー タ の解 析 とデ ー
の情 報 が 発 掘 で きる こ と を 内 外 の研 究 者 に示 した こ とで
タ ベ ー ス 化 を 行 な い な が ら,効
率 的にゲ ノム配列 を決定
あ ろ う.新 た な 興 味 深 い 遺 伝 子 の 発 見 と して はfix遺 伝
す る 方 法 の 検 討 を 行 な っ た.と
くに 当 時 イ ン フル エ ンザ
子 群 が あ る.大 腸 菌 に Azorhizobium
の窒 素
caulinodans
菌 の ゲ ノ ム 配 列 決 定 を 行 な っ て い たTIGR研
固 定 に機 能 す る遺 伝 子 に 高 い 相 同性 を もつ 遺 伝 子 が オ ペ
し,新
ロ ン構 造 を保 存 した形 で 存 在 して い る.大 腸 菌 にお け る
非 常 に 大 き な 参 考 に な っ た.こ
生 理 機 能 に 関 して は不 明 で あ る が,個
見 直 し,新
分 に 魅 力 あ る材 料 で あ る.ま
た,そ
別研 究 の た め の 十
れ まで にGenBank
究 所 に訪 問
しい ゲ ノ ム配 列 決 定 の シス テ ム を 見 学 した こ とは
れ まで の体 制 を徹 底 的 に
し い 方 法 を 取 り 入 れ,効
秋 の こ と で あ る.体
制 を整 え な が ら
な どの デ ー タベ ー ス に登 録 さ れ て い た大 腸 菌 の 配 列 デ ー
試 行 的 に ス タ ー ト し て い た が,1996年4月
か らは正 式
タに 多 くの 問 題 が 含 まれ て い る こ と も明 らか に な った.
に 堀 内 を 代 表 と す る プ ロ ジ ェ ク トが 発 足 し た.第3期
技 術 的 な 問 題 と 人 為 的 な ミス と考 え ら れ る が,ベ
あ る.前
ク ター
制 を 整 え た.-994年
率 的な配列決 定の体
述 の よ う に,効
配 列 の 混 入,配 列 断 片 の 結 合 ミス な どで あ る.染 色 体 地
底 的 な 分 業 化 を 行 な っ た.す
図 の2分
腸 菌 ゲ ノ ム 部 分 だ け を,longPCR法
領域 に外 膜 合 成 に 関 与 す る 遺 伝 子 群 が 非 常 に 大
き な オ ペ ロ ン を形 成 して い た が,他
の微生物の ゲノム と
で
率 化 を 図 る た め 各 ス テ ップ の 徹
な わ ち,小
原 ク ロー ンの 大
に よ り 増 幅 し,得
ら れ た 産 物 を 超 音 波 破 砕 に よ る 断 片 化 の の ち,M13フ
の 比 較 か ら,そ の オペ ロ ン構 造 が 種 を こ え て よ く保 存 さ
ァ ー ジ ベ ク タ ー で シ ョ ッ ト ガ ン ・シ ー ケ ン ス 用 の ラ イ ブ
れ て い た.そ
ラ リ ー の 作 製 を 行 な っ た.こ
の プ ロ ト コ ー ル に 沿 っ て,
小 原 ク ロ ー ン のlongPCRに
よ る ラ イ ブ ラ リ ー 作 製 を1
100kb程
の ほ か,反
復 配 列 のBⅠMEの
度 で は あ る が,大
とが で きた.ひ
分布 状 態 も
きな領 域 で の分 布 を見 る こ
とつ と し てORFの
内部 には存在 しない
こ と も示 され た.
研 究 室,各
小 原 ク ロ ー ン あ た り250サ
ス 用M13サ
こ れ ら に触 発 され た 研 究 者 が 集 ま り,第2期
ェ ク トが 発 足 した.溝 渕(電
研 究 チ ー ム で,1992年4月
の プロジ
気 通 信 大 学)を 代 表 とす る
の こ と で あ る.予 算 の 問 題
以 上,そ
ンプ ル の シ ー ケ ン
ブ ク ロ ー ン の 作 製 とDNA精
れ ら の 配 列 決 定 を 基 生 研,九
先 端 大 の3研
製 を5研
究 室
州 大 学 そ して 奈 良
究 室 で 行 な う と い う 分 業 体 制 を と っ た.配
列 決 定 を リ ダ ン ダ ン シ ー8以
上 で 行 な う た め に,小
原 ク
ロ ー ン あ た り250ク
ロ ー ン の 配 列 決 定 を 行 な っ た.筆
らが 小 原 ク ロー ン単 位 で 配 列 決 定 領 域 を分 担 す る とい う
ら の 目 標 は,第2期
まで に決 定 を終 えて い た染 色 体 約
方 式 が 取 ら れ た.意
13分
もあ り,企 業 委 託 とい う方 法 は と らず に,参 加 研 究 者 自
約400kbの
識 の 高 ま り も手 伝 い,2年
配 列 が 決 定 さ れ た.当
然新 た な知識が 発掘
され た こ と は い う ま で も な い.RSAと
規 の 反 復 配 列 の発 見 も そ の1つ
monella
typhimulium
や Erwinia
の間 に
名づ け られた新
で あ る.こ の 配 列 はSalcarotovora
に も 存 在 し,
か ら ス タ ー ト し て,米
ー プ が す で にGenBankに
国 ウ ィス コ ン シ ン大 の グ ル
登 録 し て い た 約70分
こ の 方 法 で 決 定 す る こ と で あ っ た.1996年
ミ ー テ ィ ン グ に 招 か れ た 際,米
非 常 に 安 定 な2次 構 造 を と る こ とが 予 想 され る.第1期
の 進 捗 状 況 を 知 る 機 会 を 得 た.同
と合 わ せ て600kbあ
状 況 を 知 り,こ
ま りの 連 続 し た 配 列 を得 る こ とが
で き た が,こ の 方 法 で は参 加 研 究 者 が 配 列 決定 の た め の
1978
蛋 白質
核 酸 酵 素Vol.46No.13(2001)
い う の は,の
時 に,彼
まで を
の秋 に米国 で
毎 年 開 催 さ れ て い る 米 国 微 生 物 学 会 の “E.coli and
Genomes”
者
Smal l
国 グル ー プ
ら も筆 者 ら の
の あ と は 本 当 に 競 争 に な っ た よ う だ.と
ち にScienceの
掲 載 記 事 に よ っ て,彼
らの
造 や 性 質 を 有 す る 株 で あ る.最
も大 き な 違 い の 一 つ は,複
在 す るrRNA遺
数存
伝 子 間 で の 逆
位 で あ る10).一
方 で これ ら 近 縁
の2株
の 配列 を比 較 す る こ と
で,非
常 に短 時 間 に起 きる ゲ ノ
ム の 変 化 を知 る こ とが 可 能 とな
る11,12).完 成 し た 大 腸 菌 ゲ ノ ム
配 列 の 解 析 か ら,蛋
白質 を コ ー
ドす る 遺 伝 子 は 約4,300個
積 も ら れ た.Rileyら
と見
の 機能 分
類121に 従 っ て 分 類 し た 結 果 を 図
予測ORFの
図1
予測 され た全ORlを
Database Center for Life Science Online Service
ORlが
機能 分 類
1に 示 す.こ
類 似 性 検 索 を 基 に機 能推 定 お よび機 能 分 類 を行 な った.半 数 に も 上 る 予 測
も 蓄 積 さ れ て い る 生 物 の1つ
機 能 未 解析 で あ る.
あ る 大 腸 菌 で さ え も,ほ
のORFの
筆 者 ら に 対 す る 恐 れ を 初 め て 知 っ た か ら で あ る.
と も か く 筆 者 ら は,1997年1月
プ の70分
に 目標 の 大 腸 菌 マ ッ
ま で の 配 列 決 定 を 行 な い,既
り込 む 形 で,大
は,同
じ く1月
の 全 配 列 決 定 を 行 な っ た こ と を,米
の 後,日
る た め,日
にす る こ とが で
の 機 能 解 明 が 今 後 の 目標 で あ る.
に,大
ら に 約20%も
の
れ ら機 能 未 知 遺 伝 子 群
ゲ ノ ム配 列 が 決 定 さ れ遺 伝 子 が 予 測 さ れ る と,種 間 で
腸菌 ゲ ノム
国 で の ゲ ノム の ミー
ぼ半数
な どか らの 機 能 推 測 が む ず
か しい こ とが 明 らか と な っ た.こ
の ゲ ノ ム比 較 が 可 能 と な る,そ
こで,オ
ル ソログとよば
れ る 共 通 祖 先 か ら派 生 した遺 伝 子 群 の ゲ ノ ム に お け る位
米 が 用 い た 大 腸 菌 の 菌 株 に は違 い が あ
置 の 比 較 を 行 な う こ と で ゲ ノ ム の 動 きの 解 析 を 行 な っ
文 は そ の 年 の9月
本 で 用 い た 株 の 全 配 列 を 決 定 し よ う と,残
の 領 域(70分
機 能 が 未 解 析 で あ っ た.さ
が 相 同性 や モ チ1フ
で
に発 表 され
テ ィ ン グ で 発 表 し,論
た9).そ
ORF群
知 の デー タ を取
腸 菌 の ゲ ノ ム 配 列 を1本
き た5∼8).Blattnerら
れ まで の研 究 が 最
∼100分)の
配 列 決 定 を 行 な っ た.現
り
在 では
た13).イ ン フ ル エ ンザ 菌 との比 較 の 結 果,そ
れ までの予
想 に反 して ゲ ノム の ダ イナ ミ ック な動 きが 明 らか とな っ
終 了 し解 析 中 で あ る 子日本 の 株 は,大 腸 菌K-12のW3110
野 生 株 で あ り,一
方,米
野 生 株 で あ る.こ
れ ら2株
国 の そ れ はK-12のMG1655
は 約50年
ほ ど前 に同 一 の 株
か ら 分 離 さ れ た 非 常 に 近 縁 で は あ る が,異
な るゲ ノ ム構
図3
図2
rRNAオ
rRNAオ
ペ ロン とter配 列 の 染色 体上 の位 置
ペ ロ ン は青 の 三 角 で 、ter配 列 は 赤 の 三 角で 示す.rRNA
は 複製 起 点 のoricを
向 で,ter配
中 心 に して.複 製 フ ォー クの 移 動 と 同 じ方
列 は 複 製 終 結 点 のtercを
中 心 と して 複 製 フ ォー ク
が 進行 して くる 反 対の 方 向 性 を も って 位 置 して い る.
大 腸菌 予 測全ORFの
アーカイ ブクロー ン作 製
予 測 さ れたORFをPCRで
増 幅 しクロ ー ン化 を 行 な う.ク ロ ー ン
の構 造 はIPTG誘
導 可 能 な プ ロ モー タ-,Hisの
タ グ がN末 端 に
結 合 しC末
端 側 に はGlPが
結 合 した融 合 蛋 白質 を 産 生 す る.ま
た,ク ロー ン 化 部 位 にはsfi1の
制 限 酵 素 部 位 が再 生 し,ク ロ ー
ン 断片 の 移 動 を 容 易 に す る.
蛋白質
核 酸 酵 素Vol.46No.13(2001)
1979
た 子 活 発 な ゲ ノ ム の 再編 成 が 起 きて い る ので あ る.し
し,rRNAを
か
コ ー ドす る遺 伝 子 やter配 列 の ゲ ノ ム の 位
の 蛋 白質 を トレー ス で き る イ ン ジケ ー ター と して 利 用 を
行 な っ て い る.ク
ロ ー ン 化 の 方 法 は,PCRに
置 と方 向 な どは 活 発 な動 きの 中 で も制 約 を受 け て い る こ
全ORFの
と も明 らか とな っ た(図2),個
た に 開 発 し た ベ ク タ ー(archive
が,ゲ
々の 遺 伝 子 群 は 動 き回 る
ノム 全 体 の構 造 に は何 らか の 制 約 が 存 在 す る と い
全 部 ま た は 一 部 を 増 幅 し,ゲ
行 な っ た.ク
vector)に
各ORFの
ロ ー ン化 の 方 法 と そ の 構 造 を 図3に
増 幅 用 合 成DNAの5'側
塩 基 を 付 加 し,ク
Ⅱ.機 能解 析 に 向 けて
ゲ ノ ム の 全 体 を 得 る こ と に 成 功 し た.そ
い え ど も 約470万
Database Center for Life Science Online Service
示 す.
に2塩
基 あ る い は3
ロ ー ン 化 の の ち にSfiⅠ
制 限酵 素部位
が 再 生 す る よ う に 工 夫 を 施 し た.SfiⅠ
こ の よ う に し て プ ロ ジ ェ ク ト開 始 か ら8年
のAGCTの
後 に大腸 菌
こには大腸菌 と
配 列 が存 在 して い る た
の 開 始 コ ド ン と終 始 コ ド ン を 除 く,2番
リ ゴDNAを
ノ ム 研 究 を 通 じ て 語 られ 続 け て き た よ う に,情
報 とバ イ
を 行 な っ た.増
設 計 し,予
測 さ れ た す べ て のORFの
る こ と で,自
ほ ど 大 量 の 情 報 の 蓄 積 が 急 速 に 進 行 し て い る.大
限 酵 素 の サ イ トが 再 生 す る.
ケ ン ス の プ ロ ジ ェ ク ト を 目 指 し,12の
ら な る チ ー ム の 編 成 を行 な っ た,こ
研 究 グル ー プか
れ ま で の 実 験 とバ イ
オ イ ン フ オ マ テ ィ ク ス の 融 合 を 目 指 し,チ
4つ の グ ル ー プ,①
リ ソ ー ス 構 築,②
デ ー タ ベ ー ス,そ
ッ ク 機 能 解 析 に 分 け,研
ー ム を大 き く
バ イオ イ ン フ ォ
し て,④
シ ス テマ テ ィ
究 開 発 を 進 め て い る(図A,本
誌
GFPと
動 的 に ク ロ ー ン 化 両 末 端 部 位 にSfiⅠ の 制
の 融 合 蛋 白 質 は,細
胞 内の 局在 性 の解 析 に利
用 で き る こ と が わ か っ て お り,こ
の 系 を 用 い て,網
な 蛋 白 質 の 細 胞 内 局 在 性 の 解 析 も 進 め て い る.ま
タ グ を 利 用 し た,非
で あ る.な
増 幅
幅 断 片 を 平 滑 末 端 の ま ま で ク ロ ー ン化 す
オ の 融 合 な く して ゲ ノ ム研 究 の進 展 は あ りえ な い・ そ れ
腸 菌 ゲ
目の コ ドンか ら
最 終 ア ミ ノ 酸 を コ ー ドす る 領 域 を 増 幅 す る た め の 合 成 オ
れ まで ゲ
ノ ム の 全 体 像 解 明 を 目 標 に し た 大 腸 菌 ポ ス トゲ ノ ム シ ー
の切 断部 位 の性
質 よ り一 方 向 で の ク ロ ー ン 化 が 可 能 で あ る.全 予 測ORF
の 目 や 手 で 処 理 で き る も の で は な い.こ
マ テ ィ ク ス,③
ク ロ ー ン化 を
ク ロ ー ン化 断 片 の 簡 便 の 移 し換 え を 可 能 に す る た め に,
う こ と で あ ろ う.
め,人
よ り予 測
ノム解析 用 に新
お,高
え る た め に,通
羅的
た,His
常 に 簡 便 な 融 合 蛋 白 質 の 精 製 も可 能
発 現 に よ る宿 主 細 胞 へ の 増 殖 阻 害 を抑
常lacIq遺
伝 子 に よ り発 現 を 抑 制 し,必
要 な と き は ラ ク トー ス オ ペ ロ ン の 強 力 な 誘 導 物 質 で あ る
ホ ー ム ペ ー ジhttp:kyoritsu-pub-topica.nejppnepne.
IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)に
htmlに
現 誘 導 で き る 工 夫 を 行 な っ て い る 。 こ の 工 夫 に よ り,通
掲 載).以
下,ポ
ス トゲ ノ ム シ ー ケ ン ス に お け る
各 グ ル ー プ の 取 り 組 み を 紹 介 す る.
常,コ
ピー 数 の 増 加 が 原 因 で ク ロ ー ン化 で き な い 遺 伝 子
も ク ロ ー ン 化 が 可 能 と な り,最
1.リ
ソー ス開発
ORFの
ポ ス トゲ ノ ム シ ー ケ ンス 解 析 にお い て,質 の 揃 っ た研
よ っ て 発
終 的 に 数 個 を残 して 予 測
ク ロ ー ン化 を 達 成 す る こ と が で き た.ORF領
を挟 む形で 卵
域
Ⅰ制 限 酵 素 サ イ ト が 再 生 す る た め,そ
れ
究 材 料 は 非 常 に 重 要 で あ る.こ れ ま で の 遺 伝 学 や 生 化
を 利 用 し,簡
学,分 子 生 物 学 で の 研 究 に お け る 変 異 株,遺 伝 子 ク ロ ー
る.現
ン な どの 重 要 性 は 述 べ る まで もな い が,そ れ ら とゲ ノ ム
グ が 除 か れ る も の,C末
研 究 との 違 い は,す べ て を網 羅 す る と ころ にあ る.そ
そ し て 蛋 白 質 相 互 作 用 解 析 を 可 能 に す る 酵 母two-hy-
こ
便 に 他 の ベ ク ターへ の 移 し替 え も可 能 で あ
在 ま で に,移
し替 え る こ と で,N末
端 側 のGFPが
で,日 本 の 大 腸 菌 ゲ ノ ム機 能 解 析 プ ロ ジ ェ ク トに お い て
bridシ
は,研 究 材 料 構 築 を最 重 要 課 題 と し,予 測 全ORFの
合 ドメ イ ン が 融 合 さ れ る も の な ど,目
ク
ロ ー ン化 と破 壊 株 の作 製 を進 め た.
A,予
測 全ORFの
除 か れ る も の,
ス テ ム の ア ク チ ベ ー タ ー ドメ イ ン お よ びDNA結
的に あった各種ベ
ク タ ー を 開 発 し て い る.
こ の 方 法 に よ り ク ロ ー ン さ れ たORFは,N末
ク ロー ン作 製
ク ロ ー ン を得 る こ と に よ り,①
必 要 な と きに 簡 便 に 増 幅,②
端 側 のHisタ
目的 の 遺 伝 子 断 片 を
目的 とす る遺 伝 子 産 物 を
びC末
端 へ の 余 分 な ア ミ ノ 酸(1あ
さ れ る.そ
る い は2残
れ に よ り失 う こ と よ り も,全
ク ロ ー ン化 し,す
端 お よ
べ て を揃 え る こ との 価 値 の ほ う が 比 較
簡 便 に 精 製,③ タ グ と してGFPを
結 合 しイ ン ジ ケ ー タ
ー と して 利 用 ,を 当面 の 目標 と して 開発 を行 な っ た.そ
に な ら な い く ら い 大 き い と 考 え て い る.全
れ ぞ れ,①
こ と の 重 要 性 が ゲ ノ ム 研 究 に は 求 め ら れ る.
はDNAチ
ッ プ 開 発 を 行 な う こ と,②
白 質 チ ッ プ の 開 発 お よ び 蛋 白 質 の3D構
て,③
1980
は蛋
造解 明 へ 向 け
は そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 産 物 の細 胞 内 局 在 お よ び 個 々
蛋 白質
核酸
酵 素Vol.46No.13(2001)
ORFク
基)が 付 加
体 を 同 じ方 法 で
ロ ー ン を 利 用 し て,DNAマ
製 を 宝 酒 造 と 共 同 で 行 な っ た.こ
体 を見 て い く
イ ク ロ ア レ イ の作
の 大 腸 菌DNAマ
イク
ロ ア レ イ は 宝 酒 造 よ り購 入 可 能 で あ る.マ
を 用 い た 解 析 に つ い て は 後 述 す る.一
部 の クロ ー ンか ら
蛋 白 質 精 製 の 系 の 開 発 を 行 な っ て い る が,今
な 蛋 白 質 解 析 を 展 開 す る.こ
こ の ク ロ ー ン セ ッ ト は,種
イク ロア レ イ
後 は網 羅 的
の よ う に 筆 者 らの 作 製 し た
々 の 目 的 に 利 用 可 能 で あ り,
今 後 の 大 腸 菌 ゲ ノ ム の 機 能 解 析(functional
genomics)
に と っ て 非 常 に 有 用 な ク ロ ー ン セ ッ ト と な ろ う.
B.破
壊 株作製
ゲ ノム 配 列 が 解 明 され た 現 在 で も,遺 伝 子 の 機 能 を 同
定 す る最 も有 効 な方 法 の1つ
は,変 異 株 の 分離 とそ の 解
析 で あ る こ と は 間 違 い な い で あ ろ う.あ る 遺伝 子 の 機 能
に変 化 や 欠 損 を き た した 生 物 の 異 常 か ら,そ の遺 伝 子 の
Database Center for Life Science Online Service
機 能 を探 ろ う とい う もの で あ る.大 腸 菌 ゲ ノ ム機 能解 析
図4
破壊株作製方法
小 原 ク ロー ンの 大 腸 菌 染 色 体 部 分 に ラ ン ダ ム に トラ ン ス ポ ゾ ン を
に お い て も,網 羅 的 に遺 伝 子 を破壊 し,消 失 した機 能 を
挿 入 さ ぜ,遺 伝 子破 壊 を行 な う.大 腸 菌 に 溶 原 化 さ せ 部分2倍 体
網 羅 的 に ス ク リー ニ ン グす る こ とで,機 能 未 知 の 遺 伝 子
を作 製 す る.こ の 間 に相 同 組 換 え に よ り部 分2倍 体 が1倍 体 に 戻
群 の 機 能 解 析 を進 め て い る.さ
ら に後 述 す るDNAチ
ッ
るが.溶 菌化 させ る こ とで フ ァー ジ が な くな り,か つ トラ ンス ポ
ゾ ンに よ り遺 伝 子 破 壊 が 起 こ って い る も の を 選 別 す る,破 壊 の 位
プ解 析 に お い て も遺 伝 子 破 壊 株 を用 い た 発 現 パ ター ンの
置 は 小 原 フ ァ-ジ ク ロ-ン 上 で トラ ン ス ポ ゾ ン か らの 配 列 決 定 で
解 析 は,遺 伝 子 ネ ッ トワ ー クの 解 明 に重 要 な もの で あ
確 認 す る.
る.そ の 意 味 で も,破 壊 株 作 製 は ゲ ノ ム 解析 に お い て最
も重 要 な リ ソ ー ス の1つ で あ る.
中 の 完 成 を 目標 に進 め て い る.
破 壊 株 作 製 は 基 本 的 に トラ ンス ポ ゾ ン挿 入 に よる 破 壊
の 方 法 を と っ て い る。 小 原 ク ロー ンは,λ フ ァー ジベ ク
ター に大 腸 菌 ゲ ノム 由 来 のDNA断
片 が 挿 入 され た もの
2,バ イオイ ンフ ォマテ ィクス
ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トの進 展 に よ り,公 開 さ れ て い る だ
で あ る.そ の 大 腸 菌 由 来 部 分 に ラ ン ダ ム に トラ ンス ポ ゾ
け で も30種
ン を挿 入 し,フ
れ て い る[表A,本
ァー ジ ク ロ ー ンの 上 で 遺 伝 子 の破 壊 を行
を こ え る 微 生 物 の ゲ ノ ム 配 列 が 明 らか に さ
誌 ホ ー ムペ ー ジ に掲 載(Pl-980参 照)].
な う.破 壊 され た 遺伝 子 の トラ ンス ポ ゾ ン に特 異 的 な プ
これ らの 配列 解析 か ら,微 生 物 界 に お け る 生 命 シス テ ム
ラ イ マ ー を 用 い て 配 列 決 定 を行 な う こ とで 挿 入 破 壊 の 位
の 普 遍 性 と多 様性 を遺 伝 子 レベ ル で把 握 す る こ とが 可 能
置 を確 認 す る.特 定 の 遺 伝 子 が破 壊 され た フ ァー ジ ク ロ
ー ンを 大腸 菌 に 感 染 させ ,フ ァー ジ に の っ た 破壊 さ れ た
とな っ た.生 物 種 に共 通 な シス テ ム と多 様 な シ ス テ ム を
体 系 的 に理 解 す る こ とが バ イ オ イ ンフ ォマ テ ィク ス の役
遺 伝 子 と宿 主 側 の 染 色 体 の 相 同遺 伝 子 と を組 換 え で 置 き
割 の ひ とつ で あ る と考 えて い る.そ
こ で,大
換 え る こ とで 破 壊 株 を 得 る(図4).
知 遺 伝 子 群 の 機 能 解 明 を 目的 に,こ
れ ま で①ORFの
詳 細 は別 の 機 会 に譲 る と して,基 本 原 理 は 上述 の と お
りで あ る.こ の 破 壊 株 作 製 にお いて も多 くの 工夫 ・開 発
が 必 要 で,挿
良,溶
入 が ラ ン ダム な トラ ン ス ポ ゾ ンの 開 発 ・改
菌 フ ァー ジ で あ る小 原 ク ロー ンの 溶 原 化 の た め の
ラ ス ター 解 析 と,②
ク
多 変 量 解 析 法 に 基 づ い た コ ド ン利
用 に よる ゲ ノ ム解 析 を 中 心 に進 め て き た.今
るDNAチ
腸菌機 能未
後 は後 述 す
ップ解 析 か らの 遺 伝 子 発 現 制 御 ネ ッ トワ ー ク
を明 らか にす る こ とを 目的 と した 開 発 ・解 析 を 進 め る.
シ ス テ ム 開 発,破
壊 の位置確 認のための配列決定 の方法
個 別 の 遺伝 子 解 析 の み な らず 生 物 全 体 の シス テ ム を体 系
論 の 開 発 な ど,多
くの 準 備 が 必 要 で あ っ た.こ の 破 壊 株
的 に理 解 す る こ とが 今 後 の バ イ オ イ ン フ ォマ テ ィ ク ス の
作 製 は破 壊 株 を得 る だ け で は な く,破 壊 株 の 分 離 不 能 で
使 命 で あ ろ う.
あ る もの の 解 析 か ら必 須 遺 伝 子 の候 補 遺伝 子 を同 定 す る
A.ク
こ とが 可 能 で あ る.現 在,筆 者 らは 各小 原 ク ロー ンあ た
遺 伝 子 とい う もの は そ れ 自体 が 最 小 の 単 位 で は な く,
ラ ス ター 解 析
り192株 の独 立 な 挿 入 破 壊 を受 け た フ ァー ジ を集 め,そ
さ ら に 小 さ な 部 品 の 組 合 せ に よ り構 築 さ れ て い る(図
の 破 壊 の 位 置 を 決 定 して い る.大 腸 菌全 体 で は お お よ そ
5).し
10万 ク ロ ー ンで あ る.こ の 数 で95%以
か に な れ ば,遺 伝 子 の 構 造 と機 能 は そ れ らの 組 合 せ で 説
上 の確率 で全遺
伝 子 の 破 壊 を 得 る こ とが 可 能 と考 え て い る子2001年
度
たが っ て,も
し これ らの 部 品 の構 造 や 機 能 が 明 ら
明 で き る と考 え られ る.大 腸 菌 を 含 む,17種
蛋 白質
核 酸 酵 素Vol.46No.13(2001)
の微 生 物
1981
か ら のORFの
た.ク
DNA配
情 報 を 用 い て,ク
ラ ス タ ー 解 析 と は,基
ラ ス タ ー 解 析 を行 な っ
本 的 に ア ミ ノ酸 あ る い は
列 に よ る 相 同 性 を 利 用 し て,ク
ラ ス タ1と
して
方 法 は 最 初 にblastな
ど の 相 同性 検 索 ソ フ トを利 用 し
ン グ ル リ ン ケ ー ジ ク ラ ス タ ー 解 析 を 行 な う.こ
解 析 は 簡 単 に い う と,「
接 ・間 接 を 問 わ ず,あ
のORFを1つ
る.こ
の ク ラ ス タ ー に 含 ま れ るORF群
用 い て,似
整 理 解 析 を 行 な う.こ
Database Center for Life Science Online Service
を グ ラ フ理 論 に
て いる領 域 の詳細 な
の 解 析 に よ り遺 伝 子 部 品 の 候 補 の
同 定 を 行 な う,ま
た,こ
け ら れ たORFの
由 来 す る 種 を 解 析 す る こ と で,そ
の 方 法 に よ り,ク
普 遍 性 と 多 様 性 が 明 ら か に な る.解
う ち75%に
遍 性 の 高 いORF群
含 む も の が37ク
で あ り,リ
遺 伝 子 な ど が 含 ま れ て い る.一
方,大
で 構 成 さ れ て い る ク ラ ス タ ー が84個
の
析 の 結 果,
のORF
の ク ラ ス ター
毛遺
深 い15).
B.コ
ドン 利 用 頻 度 に よ る 解 析
コ ド ンは64種
す る も の は61種
類 あ るが,そ
類 で あ る.こ
の う ち ア ミ ノ酸 を コー ド
れ を 利 用 す る と 各ORF
は61次 元 の ベ ク トル 関 数 と捉 え る こ と が 可 能 で あ る.
コ ドン使 用 に基 づ い た 生 物 種 の個 性 を表 現 す る こ とで 大
腸 菌 の もつ 遺 伝 子 群 の 特 徴 を解 明 す る こ とを 目指 し,6次 元 のベ ク トル 関数 を非 線 形 的 に2次 元 の マ ップ 上 に 表
現 す る方 法 を開 発 し た(図7).全
い る19種
塩 基 配 列 が 決 定 され て
のバ ク テ リ ア,35,907個
析 を進 め た結 果 を示 す.枯
の 遺 伝 子 を対 象 に 解
草 菌 を代 表 とす る グ ラ ム 陽性
細 菌 の 有 す る 遺伝 子 ほ ど 中心 部 に分 布 す る傾 向が あ る.
一 方 ,プ ロ テ オ バ ク テ リ アお よ び古 細 菌 の 遺 伝 子 につ い
す べ
て は 周 辺 に分 布 す る.こ の 解 析 法 で は 中 心 部 に存 在 す る
ラス ター存 在 す
遺 伝 子 ほ ど コ ドン使 用 に お け る 偏 りが 小 さい こ と を意 味
ラ ス タ ー 内 に 解 析 を 行 な っ た17種
て の 生 物 種 のORFを
る.普
ラ ス ター に分
相 当 す る28,952個
が 互 い に 何 ら か の 類 似 性 を 示 し,2,684個
を 形 成 し た.ク
と くに そ
ピ ー に も達 して い る(図6).繊
伝 子 は感 染 性 に 大 き な役 割 を 果 た して お り,大 腸 菌 の 生
友 達 の 友 達 は 友 達 」 方 式 で,直
る閾 値 以 上 の 類 似 性 を 示 す す べ て
基 礎 を お くMDS法14)を
ORFの
の
の クラ ス ター と して ま とめ る もの で あ
38,301のORFの
の な か に は繊 毛 関 連 のORFが
の 数 を増 や し,11コ
活 環 の 変 化 に大 き くか か わ っ て きた可 能 性 が あ り,興 味
ま と め る 解 析 で あ る.
て,シ
群 で あ るが,そ
ボ ソー ム蛋 白質 の
す る.す
なわ ち,グ
ラ ム 陽 性細 菌 の 遺 伝 子 で は種 間で の
腸 菌 のORFの
み
コ ドン使 用 の 偏 りは 小 さ い と考 え られ る.こ の 解 析 か ら
存 在 し た.こ
れ ら
水 平 伝 達 遺伝 子 の伝 達 の 方 向 を探 る こ とが 可 能 に な る と
は 大 腸 菌 の 中 だ け で そ の コ ピ ー 数 を 増 や し て き たORF
考 え られ る.大 腸 菌 のORFに
も他 の 微 生 物 の 特 性 を も
っ た もの が存 在 して い る.こ れ らは 機 能 が 明 らか に され
て い る もの もあ る が,多
く機 能 未 知 遺 伝 子 も含 まれ て い
る,機 能 解 明 の ほ か に,な ぜ 他 の微 生 物 の 特 性 を もっ て
い るの か,伝
達 され て き た遺 伝 子 の 同 化 な ど解 明 すべ き
点 は 多 い.
図5
ORFの
ク ラス ター解析
類 似性 検 索 に よ り互 い に類 似 な 遺 伝 子 群 を ク ラ ス タ ー と して 集 め
図6
る.そ の集 合 を ア ライ ン メ ン トと い う作 業 で 相 同 部 分 を 並 べ直 す.
そ れ ぞれ の 遺 伝 子 ク ラ ス タ ー が 染 色 体 上 の 違 っ た位 置 に存 在 して
こ れ に よ り遺伝 子 は機 能 や 構 造 を も つ 部 分 か ら構 成 さ れ て い る こ
い る.緑:シ
と が 明 らか と なる.
レ ー:機
1982
蛋 白質
核 酸 酵 素Vol.46No.13(2001)
大 腸菌染 色体 上 のpili関 連 遺伝 子群
ャ ペ ロ ン,青:Pili蛋
能不明・
白 質,赤:usher蛋
白 質.グ
め る に あ た り,大
3.デ
ー タベー ス
こ れ ま で の 生物 学,と
腸 菌 ゲ ノム の ど こが 決 定 済 み で ど こが
未 決 定 な の か 整 理 を 行 な っ た も の が,そ
くに遺 伝 学 土生 化 学 ・分 子 生 物
る.こ
の 始 ま りであ
れ を 基 に ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トを 進 め た の が 初 期 の
学 に お い て,モ デ ル 生 物 と して 大 腸 菌 の 果 た して き た役
プ ロ ジ ェ ク トで あ る.こ
割 は非 常 に大 きい.大 腸 菌 の 遺 伝 子 と構 造 的 に類 似 す る
製 を 進 め て い る ク ロ ー ン や 破 壊 株 な ど,リ
他 の 生 物 の 遺 伝 子 の機 能 を 類推 す る う え で の重 要 な 指 標
報,バ
と な っ て きた こ とは い う まで もな い.今
ら生 み 出 さ れ る で あ ろ う 体 系 的 な 機 能 解 析 の 実 験 結 果,
同 様,大
後 もこ れ まで と
腸 菌 にお け る遺 伝 子 機 能 の 解 明 が 他 の 生 物 種 に
お い て も非 常 に重 要 な知 見 とな る こ と は 明 らか で あ る.
現 在,行
な っ て い る解 析 か ら得 られ た 実 験 デ ー タを取 り
ソ ー ス群 の 情
れか
そ して過 去 の 文 献 か らの 知 識 を体 系 的 に ま とめ た デ ー タ
ベ ー ス と し てGenoBaseの
拡 張 を 進 め て い る.新
た に拡
張 を 進 め て き た 文 献 情 報 は,“Linkage Map of Escherichia
coli,K-12,Edition10”16)に
ま とめ て きた.
た.GenoBaseは
も と も と大 腸 菌 ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トを進
在作
イ オ イ ン フ ォ マ テ ィ ク ス 関 連 の 解 析 結 果,こ
入 れ,か つ これ まで の 大 腸 菌 に お け る 蓄 積 を整 理 し,デ
ー タベ ー ス を構 築 して い る.そ れ ら をGenoBaseと
して
GenoBaseは
の デ ー タ ベ ー ス を 基 に,現
し,検
収 録 さ れ て い る 文 献 を 収 録
索 機 能 を も た せ た デ ー タベ ー ス と し て 整 備 し て き
イ ン ター ネ ッ トを通 じて公 開 を行 な っ
て い る(http://ecolLaist-nara.ac.jp/).ホ
ー ムペ ー ジか
Database Center for Life Science Online Service
らの デ ー タベ ー ス検 索 シ ス テ ムの 基 本 設 計 は 国 立遺 伝 学
研 究 所 と の 共 同 開 発 で 行 な い,Genome
Broakerと
Informatio
れ て い る(http://gib.genes.nig.ac.jp/).現
在 は登録 す る
デ ー タ の 違 い な ど か ら独 自 に 開 発 を 進 め て お り,そ
伴 い,検
n
して 複 数 の ゲ ノ ム 閲 覧 シ ステ ム と して 公 開 さ
れに
索 シ ス テ ム な ど も 新 規 に 開 発 を 進 め て い る.ホ
ー ムペ ー ジで 公 開 さ れ て い る デ ー タベ ー ス を活 か す 方 法
の1つ
に,関
連 す る サ イ トへ の リ ン ク が あ る.GenoBase
の 場 合 も そ の 方 法 を と っ て お り,と
ン ク を は っ て い る,西
図7
コ ドン利 用頻度 を利 用 したORF各
ECO,BSUな
GTOP(genome
種 の特 性
ど は 各 微 生 物 種 を 示 す.基 本 的 に Ｅscherichia
coliの よ うに3文 字 での 省 略形 を利用 して い る.
くに 各 遺 伝 子 か ら リ
川(遺 伝 研)ら
to protein
structure
に よ り開 発 さ れ た
and function,http
//www.nig.ac.jp/home.html)は
蛋 白 質 の構 造 と機 能 との
関 連 を ま と め た も の で あ り,非
常 に 有 用 な も の で あ る.
現 在 の
シ ス テ ム 構 成 はSun
Microsystems社
製Unixの
小
規 模 サ ー バ ー を 用 い て,リ
レー
シ ョ ナ ル デ ー タ ベ ー ス のPostgreSQL(http://postgresgl.nucba.
ac.jp/)に
よ りデ ー タ を 管 理
て い る.検
し
索 シ ス テ ム はPHP
(http://www.php.net/),Java
(http://java.sun.com/)お
よ び
Perl(http://wwwlperl.org/)を
用 い て 開 発 を 行 な っ て い る.デ
ー タ ベ ー ス の 模 式 的 な 表 示 は
Javaお
4,機
よ びPerlを
用 い た.
能解 析
上 述 の リ ソー ス を用 い て,機
図8
KEGG経
路 データベ ー スを利 用 したDNAチ
ップ解 析 の視 覚化
能 未 知 遺 伝 子 群 の 機 能解 明,こ
蛋白質 核酸
酵 素Vol.46No.13(2001)
1983
れ まで は解 析 が むず か しか っ た 全 遺 伝 子 の転 写 や 翻 訳 の
状 態 の 推 測 か ら,多
動 き な どを網 羅 的 に進 め て い る が,こ
こ で は,ゲ
ノ ム研
が 推 測 可 能 に な る.た
究 が 始 ま っ て注 目 さ れ て い るDNAチ
ッ プ(DNAマ
イク
とえ ば,あ
の役割
る特 定 の 遺 伝 子 を 欠損
胞 内 の 遺 伝 子 群 の う ちTCA回
路 に関与 す
ロ ア レイ)解 析 と マ ス ス ペ ク トロ メ ト リー を利 用 した 蛋
る遺 伝 子 の 発 現 が 変 化 す る(図8).こ
白質 解 析 へ の 取 組 み を紹 介 す る.
伝 子 が エ ネ ル ギ ー 合 成 経 路 を コ ン トロ ー ル し て い る こ と
A.ト
ラ ン ス ク リ プ トー ム解 析
れ は,欠 損 し た遺
を示 して い る.
トラ ンス ク リ プ トー ム とは 転 写(ト ラ ンス ク リプ シ ョ
Database Center for Life Science Online Service
した場 合,細
くの 遺 伝 子 のか か わ りや,そ
この よ う に代 謝 経 路 情 報 と発 現 パ タ ー ンの デ ー タの 組
ン)と ゲ ノ ム が 融 合 して で き た造 語 で あ り,ゲ ノ ム 全 体
合 せ に よ る解 析 か ら,薬 剤 の作 用 機 作 や,毒
に わ た る広 範 な 遺 伝 子 の 転 写 解 析 を い う.こ の 解 析 は,
謝 経 路,も
これ ま で行 な わ れ て きた 個 別 遺 伝 子 の解 析 と は異 な り,
索 な ど に 関 す る成 果 が 得 ら れ,産 業 に 対 す る 貢 献 も大 き
大腸 菌 の生 命 現 象 につ い て 転 写 レベ ル で の 網 羅 的 な解 析
い で あ ろ う.
物 な どの 代
し くは 有 用 な物 質 の効 率 的 な生 合 成 経 路 の 探
を行 な う こ とが 可 能 で あ る。 す な わ ち,複 数 の 条 件 にお
B.プ
け る 全 遺 伝 子 の転 写 状 態 を細 胞 レベ ルで モ ニ ター し,発
大 腸 菌 ゲ ノ ム の プ ロ テ オ ー ム 解 析(プ ロ テ オ ミ ク ス)の
ロテ オ ー ム 解 析
現 制 御 状 態 を知 りう る点 に お い て,非 常 に強 力 で か つ 新
基 盤 と な る 遺 伝 子.蛋 白 質 の イ ン デ ッ ク ス は,Neid-
しい視 点 を供 給 して くれ る.こ
hardt20)ら
の 点 に注 目 し,筆 者 ら は
に よ っ てOLFarellの2次
元電 気泳動 法 に よる
さ ま ざ まな 培 養 条 件 や 遺 伝 子 破 壊 株 を用 い た トラ ンス ク
デ ー タ を 基 に 作 ら れ た も の がSWISSーPROTに
リ プ トー ム 解 析 を,マ
て お り,イ
イ ク ロ ア レイ を用 い て 行 な っ て い
公 開 され
ン タ ー ネ ッ ト上 で 見 る こ と が で き る.日
本 に
る17).大 腸 菌 マ イ ク ロ ア レ イ は,前 述 の大 腸 菌 ク ロ ー ン
お け る 大 腸 菌 ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トの 一 環 と し て,筆
者 ら
よ りPCR増
は プ ロ テ オ ミ ク ス に 従 来 の2次
幅 さ れ た 断 片 を ス ラ イ ドグ ラ ス上 に 高 密 度
で貼 りつ け た もの で あ る.す
で に宝 酒 造 よ り市 販 さ れ て
い る こ と は前 述 の とお りで あ る.こ
の マ イ ク ロア レイ に
は な く,RFHR(radical-free
元 電 気 泳 動 法 を使 うの で
and
電 気 泳 動 法 を 用 い た21).現
highly
染 色 に よ り 同 定 で き る 蛋 白 質,つ
る い は 同 じ条 件 下 で培 養 し た 野 生 株 と変 異 株)か ら抽 出
現 量 の 多 い も の(細 胞 あ た り 約50分
さ れ た 全RNAをCy3dUTPあ
300個
ベ ル し たcDNAを
ハ イ ブ リ ダ イ ズ させ,2つ
ラ
の 条 件(あ
る い は2種 類 の 株)に お け る 発 現 状 態 を比 較 す る.ハ
イ
元
在 まで に こ の 方 法 で ク マ シ ー
対 して,た と え ば2つ の 異 な る条 件 下 で 培 養 した 菌株(あ
る い はCy5dUTPで
reducing)2次
ま り大 腸 菌 で 比 較 的 発
子 以 上)に つ い て 約
を 同 定 し た(詳 細 はhttp://eco-i.aist-nara.acjp/
proteome/dam/,http://www.osaka-med.ac.jp/ yhide
/rfhr_2-d_page.htmを
参 照).こ
の 方 法 の 最 大 の 特 徴
ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ンお よ び 洗 浄 条 件 に つ い て も,何 ら特
は,こ
殊 な点 は な く,通 常 の ノ ー ザ ン解 析 や サ ザ ン解 析 と同 様
や 低 分 子 量 の 分 離 が 改 善 さ れ た こ と,ま
で 非 常 に簡 便 な操 作 で 多 くの 遺 伝 子 の 発 現 状 態 を モ ニ タ
ー で き る.一 方,解 析 に よ り得 ら れ る 発現 デ ー タ は非 常
の せ ら れ,泳
に 大 量 で あ り,一 目 で そ の 状 況 を把 握 す る こ と は困 難 で
と,経
費 が 安 価 で あ る こ と,な
あ る.そ こ で,こ れ ま で 使 わ れ て きた マ イ ク ロ ア レ イ デ
ー タ解析 法 の 問 題 点 を 考 慮 し,新 しい情 報 解 析 シス テ ム
り,新
た な 蛋 白 質 の 同定 とそ れ らの 遺 伝 子 の 決 定 に 成 功
の 開発 を行 な っ て い る.基 本 的 な 解 析 は以 下 の 手 順 で 行
い 蛋 白 質,膜
な わ れ る.
troの 翻 訳 系 の 使 用 な ど が 有 効 で あ る.し
か し,細
1)統 計 的手 法 を用 い た デ ー タの 標 準 化
の 全 蛋 白 質 の 動 態 を 把 握 す る た め に は,こ
れ らの 問 題 を
2)発 現 量 の 変化 の 大 きい 遺 伝 子 群 の抽 出
3)デ1タ
マ イ ニ ン グ ソ フ ト(Genespring)を
謝 デ ー タベ ー ス(KEGGI8))やEcoCycl9)な
ど),お
ど),大 腸
よ びPUBMED
な ど の文 献 デ ー タベ ー ス を利 用 した デ ー タの 解 釈
解 析 の 効 率 化 を図 る た め に 自動 処 理 化 を 進 め て い る.
解 析 され た 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル に よる 大腸 菌 の 生 理
蛋白質 核酸
た試料 が多量 に
サ ー や 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 器 に よ る解 析 が 容 易 で あ る こ
し て い る.イ
ど で あ る.こ
の方 法 に よ
ン デ ッ ク ス の 作 成 に あ た り,発
現量 の少 な
蛋 白 質 な ど の 不 溶 性 の も の に つ い て はin
が 必 要 で あ り,試
vi
胞 内
料調整 法や泳動 法な どの改良
み て い る.大
腸 菌総 遺 伝 子 の ネ ッ トワ
ー ク 解 明 に は 転 写 と翻 訳 を 同 時 に 網 羅 的 に 解 析 す る こ と
菌 デ ー タベ ー ス(Genobaseな
1984
ル カ リ性
動 後 の 蛋 白 質 ス ポ ッ トの ペ プ チ ド シ ー ケ ン
克 服 し な け れ ば な ら ず,試
用 いた情 報
の可 視 化
4)代
れ ま で 分 離 が む ず か し か っ た 強 酸 性,ア
酵 素Vol.46No.13(2001)
が 必 要 で あ り,遺
い る.す
で に4amを
伝 子 破 壊 株 な ど を用 い て 解 析 を進 め て
は じめ い くつ か の 遺 伝 子 の 欠 損 変
異 株 に お け る 解 析 は 終 了 し た(Oshima,T.etal.:投
一方
,蛋
白 質 の 修 飾 に よ る 活 性 調 節 は,遺
稿 中).
伝子 の転写 や
翻 訳 な ど に よ る 量 的 な調 節 に 対 して 質 的 な 調 節 機 構 と し
て 重 要 で あ る.大 腸 菌 にお い て も この 問 題 は未 解 決 で あ
り,今 後 の 大 きな 課題 で あ る.
6)
お わ りに
ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トの 構 想 が 現 実 に 走 り 出 して10年
に な る.1980年 代 の終 わ りか ら1990年
体 的 な 計 画 と して ス ター トした が,当
と は い え なか っ た 面 も多 々 あ っ た.し
で ゲ ノ ム 生 物 学 が 認 知 され,成
は,誰
初 頭 にか けて 具
初 は 必 ず し も順 調
か し,こ の10年
7)
果 も 上 が っ て きた こ と
もが 認 め る と こ ろで あ ろ う,ゲ
ノ ム 計 画 自身,ア
メ リ カ か ら提 唱 され た こ と もあ る の か も しれ な い が,ア
メ リ カ の 強 さ を見 せ つ け られ た感 は ぬ ぐ え な い.そ の 原
因 を筆 者 自身 考 え て み る こ とが 多 い の だ が,わ
れわれ 自
8)
身 反 省 し な け れ ば な ら な い こ とが 多 くあ る よ う に 思 え
Database Center for Life Science Online Service
る.1つ
に は,わ れ わ れ 自身 が 新 しい もの に 対 す る挑 戦
に腰 が ひ け て い る こ とが あ る.ま ず ア メ リ カ な どの 様 子
を 見 て,と い う現 状 が か な りあ る の で は な い だ ろ うか.2
つ 目に,現 在 の大 学 に お け る 体 制 で は ゲ ノ ム研 究 は む ず
か しい 側 面 が 多 か っ た.ど
う して も配 列 決 定 にか か る 労
9)
力 が 確 保 しに くい こ と,情 報 科 学 との 連 携 な ど問 題 点 が
浮 き彫 りに な っ た.こ れ ま で 日本 で は ま ず 体 制 が あ り,
そ の な か で い か に進 め るか が 問 わ れ て き た.ま ず 目的 が
あ り,そ れ に は どの よ う な体 制 が 必 要 か,と
10)
い う観 点 か
ら進 め て い か なけ れ ば 迅 速 な対 応 は む ず か しい.筆 者 が
ス タ ンフ ォ1ド 大 学 の ゲ ノ ム セ ン タ ー を訪 問 した 際,驚
11)
い た の は 生 物 学 者 と と も に工 学 者 と情 報 科 学 者 が と もに
12)
13)
同 じ研 究 室 で研 究 開 発 を行 な っ て い た こ と で あ る.こ れ
14)
か らの 生 物 学 を考 え る に,多
くの境 界 領 域 で の研 究 が 必
須 で あ り,今 後 実現 に 向 け た 具 体 策 を早 急 に 考 え な けれ
ば な ら な い こ とで は な い だ ろ うか.
15)
16)
to, Y., Yano, M., Horiuchi, T. : DNA Research, 3, 137-155
(1996)
Aiba, H., Baba, T., Hayashi, K., Inada, T., Isono, K., Itch, T.,
Kasai, H., Kashimoto, K., Kimura, S., Kitagawa, M., Kitagawa, M., Makino, K., Miki, T., Mizobuchi,K., Mori, H.,
Mori. T., Motomura, K., Nakade, S., Nakamura, Y., Nashimoto, H., Nishino, Y., Oshima, T., Saito, S., Sampei, G., Seki,
Y., Sivasundaram, S., Tagami, H., Takeda, J., Takemoto, K.,
Takeuchi, Y., Wada, G., Yamamoto, Y., Horiuchi, T. : DNA
Research, 3, 363-377 (1996)
Itoh, T., Aiba, H., Baba, T., Hayashi, K., Inada, T., Isono, K.,
Kasai, H., Kimura, S., Kitagawa, M., Kitagawa, M., Makino,
K., Miki, T., Mizobuchi, K., Mori, H., Mori, T., Motomura, K.,
Nakade, S., Nakamura, Y., Hashimoto, H., Nishino, Y.,
Oshima, T., Saito, N., Sampei, G., Seki, Y., Sivasundaram, S.,
Tagami, H., Takeda, J., Takemoto, K., Wada, C.,Yamamoto,
Y., Horiuchi, T.: DNA Research, 3, 379-392 (1996)
Yamamoto, Y., Aiba, H., Baba, T., Hayashi, K., Inada, T.,
Isono, K., Itoh, T., Kimura, S., Kitagawa, M., Makino, K.,
Miki, T., Mitsuhashi, N., Mizobuchi, K., Mori, H., Nakade, S.,
Nakamura, Y., Nashimoto, H., Oshima, T., Oyama, S., Saito,
N., Sampei, G., Satoh, Y., Sivasundaram, S., Tagami, H.,
Takahashi, H., Takeda, J., Takemoto, K., Uehara, K., Wada,
C., Yamagata, S., Horiuchi, T. : DNA Research, 4, 91-113
(1997)
Blattner, F. R., Plunkett, G. 3rd., Bloch, C. A., Perna, N. T.,
Burland, V., Riley, M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode,
C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick,
H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., Shao, Y. : Science,
277, 1453-1474 (1997)
Hill, C. W., Harnish, B. W. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,
7069-7072(1981)
Itch, T., Okayama, T., Hashimoto, H., Takeda, J., Davis, R.
W., Mori, H., Gojobori, T.: FEBS Lett., 450., 72-76 (1999)
Riley, M.: Microbiol. Rev., 57,862-952 (1993)
Watanabe, H. M Mori, H., Itch, T., Gojobori, T. J.: Mol.
Evol., 44 (suppl. 1) S57-S64 (1997)
Matsuda, H. : JEICE Trans. Fundamentals, E83A, 713-721
(2000)
Soto, G. E., Hultgren, S. J.: J. Bacteriol., 181, 1059-1071
(1999)
Berlyn, M. K. B.: Microbiol Mol. Biol. Rev., 62, 814-984
(1998)
17)大
島 拓 ・森
浩 禎:ゲ
ノ ム 機 能 発 現 プ ロ フ ァ イ ル と トラ
ン ス ク リ プ ト ー ム(松 原 謙 一 編),pp.54-69,中
1)
2)
3)
4)
5)
Kohara, Y., Akiyama, K., Isono. K.: Cell, 50, 495-508
(1987)
Yura, T., Mori, H., Nagai, H., Nagata, T., Ishihama, A., Fujita, N., Isono, K., Mizobuchi, K., Nakata, A.: Nucl. Acids
Res., 20, 3305-3308 (1992)
Fujita, N., Mori, H., Yura, T., Ishihama, A.: Nucl. Acids
Res., 22,1637-1639 (1994)
http://www.ddbj.nig.ac.jp,
DDBJ r5') i ' entry=
eco110 k
Oshima, T., Aiba, H., Baba, T., Fujita, K., Hayashi, K.,
Honjo, A., Ikemoto, K., Inada, T., Itch, T., Kajihara, M., Kanai, K., Kashimoto, K., Kimura, S., Kitagawa, M., Makino, K.,
Masuda, S., Miki, T., Mizobuchi, K., Mori, H., Motomura, K.,
Nakamura, Y., Nashimoto, H., Nishino, Y., Saito, N., Sampei,
G., Seki, Y., Tagami, H., Takemoto, K., Wada, C., Yamamo-
18)
19)
20)
21)
森
山 書 店(2000)
Kanehisa, M., Goto, S. : Nucl. Acids Res., 28, 27-30 (2000)
Karp, P. D., Riley, M., Saier, M., Paulsen, I. T., Paley, S. M.,
Pellegrini-Toole, A. : Nucl. Acids Res., 28, 56-59 (2000)
Neidhardt, F. C., Vanghu, V., Phillips, T. A., Bloch, P. L.
Microbiol. Rev., 47, 231-284(1983)
fQ W 6A : -t4E;*, 59, 1035-1059(1986)
浩禎
略 歴:1985年
京 都 大 学 理 学 研 究 科 修 士 課 程 修 了.1996年
よ
り奈 良 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 遺 伝 子 教 育 研 究 セ ン ター 生 体
情 報 学 教 授,研
究 テ ー マ:ゲ
ノ ム 生 物 学,と
くに微生 物 を
中 心 と した 情 報 お よ び 実 験 か ら の ゲ ノ ム 解 析.関
心 事 ・抱
負:バ
積極的 に
イオ サ イ エ ン ス の 中 に 情 報 科 学 を 取 り入 れ
境 界 領 域 の 研 究 を 進 め て い き た い.
蛋 白質
核酸
酵 素Vol.46No.13(2001)
1985