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(57)【要約】 - Questel
JP 2006-193527 A 2006.7.27 (57)【 要 約 】 【課題】天然のノイラミニダーゼに対応する抗原特性をもち、正確な作法で折り畳まれる 組換えインフルエンザノイラミニダーゼを提供すること。 【解決手段】ノイラミニダーゼ発現ベクターベクターで形質転換された宿主細胞、または ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な 培養培地中で培養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損し ているインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部 、またはその修飾バージョンが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連 結している）；該発現産物ノイラミニダーゼを培養培地から単離することによって得られ る組換えノイラミニダーゼならびに該組換えノイラミニダーゼを適用したワクチンおよび その製造方法ならびに精製方法を提供する。 【選択図】なし 10 (2) JP 2006-193527 A 2006.7.27 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ａ）ノイラミニダーゼ発現ベクターで形質転換された宿主細胞、またはノイラミニダー ゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培 養し（ここで、発現ベクターには、膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフル エンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる 機能的フラグメントをコードする、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメン トが含まれ、該コード領域に先立ち、シグナル配列が相内で連結している）；次いで ｂ）培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離する ことによって得られる実質的単離体である組換えノイラミニダーゼ。 10 【請求項２】 組換え発現ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ（ＬＭＢＰ２９７６）を用いてウイルスのゲノ ムの２重相同的組換えを行なってウイルスを形質転換し、該ウイルスに感染させた宿主細 胞を適当な培養培地中で培養し、次いで培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離す ることによって得られる、実質的単離体である組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダ ーゼ。 【請求項３】 組換え発現ベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ（ＬＭＢＰ３２２３）をトランスフェクト させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養することによって得られる、組換えインフルエ ンザＮＡ２ノイラミニダーゼ。 20 【請求項４】 さらに、培養培地から発現産物ノイラミニダーゼを単離することを含む請求項３に記載 の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。 【請求項５】 宿主細胞が下等真核生物由来であることを特徴とする請求項１、２、３または４に記載 の組換えインフルエンザノイラミニダーゼ。 【請求項６】 宿主細胞が昆虫細胞であることを特徴とする請求項１、２または５に記載の組換えイン フルエンザノイラミニダーゼ。 【請求項７】 30 昆虫細胞がｓｆ９昆虫細胞であることを特徴とする請求項６に記載の組換えインフルエ ンザノイラミニダーゼ。 【請求項８】 宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする請求項１、３、４または５に記載の組換え インフルエンザノイラミニダーゼ。 【請求項９】 インフルエンザワクチン用の請求項１∼８に記載の組換えインフルエンザノイラミニダ ーゼ。 【請求項１０】 ＮＡ２型インフルエンザワクチン用の請求項２∼８のいずれかに記載の組換えインフル 40 エンザノイラミニダーゼ。 【請求項１１】 ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているインフルエンザウイルスのノイラミニ ダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる機能的フラグメントをコード する、少なくとも一部のコード領域、またはそのフラグメント； ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列； ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター を含む、分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。 【請求項１２】 50 (3) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ａ）膜アンカーをコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７ ５」のインフルエンザＮＡ２のノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引 き起こしうるコード領域、またはそのフラグメント； ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列； ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター を含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター。 【請求項１３】 シグナル配列がインフルエンザＮＡ２ウイルス「Ａ／ビクトリア／３／７５」（Ｈ３Ｎ ２）の血球凝集素遺伝子由来であることを特徴とする請求項１１または１２に記載のベク 10 ター。 【請求項１４】 プロモーターがポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする請求項１１、１２ま たは１３に記載のベクター。 【請求項１５】 転写ターミネーターがＳＶ４０および／またはポリヘドリン遺伝子由来であることを特 徴とする請求項１１∼１４のいずれかに記載のベクター。 【請求項１６】 寄託番号がＬＮＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ。 【請求項１７】 20 ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードす る領域を欠損しているインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免 疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フラグメントをコードする領域、またはその フラグメント； ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列； ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するベクター。 【請求項１８】 ａ）ノイラミニダーゼの膜アンカーおよび少なくとも一部の柄部分をそれぞれコードす 30 る領域を欠損しているウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザノイラ ミダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうる領域をコードする機能的フ ラグメントをコードする領域、またはそのフラグメント； ｂ）コード領域の５’に位置し、相内でコード領域に連結されたシグナル配列； ｃ）シグナル配列の５’に位置するプロモーター；および ｄ）コード領域の３’に位置する転写ターミネーター を含む、酵母中で分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを発現するベクター 。 【請求項１９】 シグナル配列がサッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロシグナル配列である 40 ことを特徴とする請求項１７または１８に記載のベクター。 【請求項２０】 プロモーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩプロモーターであるこ とを特徴とする請求項１７、１８または１９に記載のベクター。 【請求項２１】 転写ターミネーターがピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼＩ遺伝子由来であ ることを特徴とする請求項１７∼２０のいずれかに記載のベクター。 【請求項２２】 寄託番号がＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓ。 【請求項２３】 50 (4) JP 2006-193527 A 2006.7.27 請求項１に記載の組換えインフルエンザノイラミニダーゼを含むワクチン。 【請求項２４】 請求項２∼１０に記載の組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼを含むワクチン 。 【請求項２５】 ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、 該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作にお いて防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アン カーをコードする領域および柄部分をコードする領域を欠損している）またはそのフラグ メントを含む発現ベクターを構築し； 10 ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養 培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 【請求項２６】 ａ）適当なプロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列および、 該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作にお いて防御免疫を引き起こしうるコード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アン カーをコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントを含む発現ベクターを構 20 築し； ｂ）得られた該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養 培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 【請求項２７】 ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列およ び、該シグナル配列に相内で連結するインフルエンザノイラミニダーゼ遺伝子のコード領 域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）または免疫感作にお 30 いて防御免疫を引き起こしうるそのフラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベク ターを構築し； ｂ）ウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手段によって 持ち込み； ｃ）得られた該形質転換ウイルスに宿主細胞を感染させ； ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地 中で培養し；次いで ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザノイラミニダーゼの製造方法。 【請求項２８】 40 ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列およ び、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフ ルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコ ード領域（該コード領域は、膜アンカーをコードする領域を欠損している）またはそのフ ラグメントからなる発現モジュールを含む発現ベクターを構築し； ｂ）組換えバキュロウイルスを得るために、野生型バキュロウイルスまたはそれから誘 導されたバキュロウイルスのゲノムに該ベクターの発現モジュールを二重相同的組換え手 段によって持ち込み； ｃ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ； ｄ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地 50 (5) JP 2006-193527 A 2006.7.27 中で培養し；次いで ｅ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 【請求項２９】 ａ）二重相同的組換え手段によって、寄託番号ＬＭＢＰ２９７６であるベクターｐＡｃ ２ＩＶＮＡｓの発現モジュールでバキュロウイルスを形質転換し； ｂ）該組換えバキュロウイルスに宿主細胞を感染させ； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該感染宿主細胞を培養培地 中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 10 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 【請求項３０】 ａ）適当な転写プロモーターおよびターミネーター配列の調節下に、シグナル配列およ び、該シグナル配列に相内で連結するウイルス株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフ ルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子の免疫感作において防御免疫を引き起こしうるコ ード領域（該コード領域は、ノイラミニダーゼの膜アンカーをコードする領域および柄部 分をコードする領域を欠損している）またはそのフラグメントからなる発現モジュールを 含む発現ベクターを構築し； ｂ）得られた該組換えベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養 20 培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 【請求項３１】 ａ）寄託番号ＬＭＢＰ３２２３であるベクターｐＰＰ１ＩＶＮＡｆｌｓでピチア・パス トリスを形質転換し； ｂ）該ベクターで宿主細胞を形質転換し； ｃ）組換えノイラミニダーゼの発現を可能にする条件下で、該形質転換宿主細胞を培養 培地中で培養し；次いで ｄ）組換えノイラミニダーゼを培養培地から単離する； 30 工程を特徴とする組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの製造方法。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本発明は、組換えインフルエンザノイラミニダーゼ、組換えノイラミニダーゼを宿主細 胞中で発現しうる発現ベクター、組換えノイラミニダーゼの産生および精製方法、インフ ルエンザに対するワクチンおよび本発明の組換えノイラミニダーゼの用途に関する。 【背景技術】 【０００２】 イ ン フ ル エ ン ザ Ａ 型 お よ び Ｂ 型 ウ イ ル ス に よ る 流 行 性 感 冒 (イ ン フ ル エ ン ザ )は 、 感 染 者 40 に相当な被害を与え、社会生活および経済生活に大きな影響を及ぼす。インフルエンザは 高齢者および慢性疾患の患者において死亡率が高い。１９４０年代における流行の際に、 鶏卵中で培養されたウイルス物質に基づく不活性ワクチンがインフルエンザ感染に対して 明らかに効果があることがわかり、その結果、危険率の高い集団の死亡率が大きく低下し た。 インフルエンザウイルスは、その２つの表面抗原、すなわち血球凝集素ヘマグルチニン (Ｈ Ａ )と ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ (Ｎ Ａ )に お い て 有 意 な 抗 原 変 異 (い わ ゆ る 「 抗 原 ド リ フ ト 」 )を 起こすため、咽喉管に生存するウイルスのなかでもユニークである。 その上、特にインフルエンザＡ型ウイルスは、「抗原シフト」という現象によって効果 のある免疫を回避することができる。ヒトのウイルスにおいてこのような現象が出現する 50 (6) JP 2006-193527 A 2006.7.27 のは、インフルエンザ遺伝子の動物保菌者由来のＮＡ遺伝子に起因するものである。かく して、１９５７年に、それまで流行していたＮＡ１型のウイルスは新しいＮＡ２型のウイ ルスと置き換えられた。１９７７年以来、ＮＡ１型のウイルスがヒト集団に再び戻って来 ている。したがって、本発明ワクチンは好ましくはＮＡ１およびＮＡ２型ウイルスの両方 に対応しうるものを目指さねばならない。 ＮＡはグリコシル基の末端シアル酸残基の除去に触媒作用を及ぼし、それによってＨＡ の 可 能 な 受 容 体 が 破 壊 さ れ る (ゴ ッ チ ャ ル ク ， １ ９ ５ ７ ； バ ー ネ ッ ト お よ び ス ト ー ン ， １ ９ ４ ７ )。 ウ イ ル ス の 集 合 の 阻 止 お よ び 細 胞 間 に お け る ウ イ ル ス の 充 分 な 拡 散 に お い て Ｎ Ａ が 本 質 的 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ る (コ ー ル マ ン お よ び ワ ー ド ， １ ９ ８ ５ )。 そ れ ぞ れ の Ｎ Ａ 分 子 (Ｍ ｒ ＝ ２ ４ ０ ， ０ ０ ０ )は 、 ジ ス ル フ ィ ド 架 橋 に 結 合 し 、 非 共 有 結 10 合によって共に交互に保持しあう２組のダイマーで築き上げられた４個の同一のポリペプ チ ド 鎖 か ら な る キ ノ コ 様 構 造 を し て い る (ブ ッ チ ャ ー お よ び キ ル ボ ー ン ， １ ９ ７ ２ ； レ イ バ ー お よ び バ レ ン タ イ ン ， １ ９ ６ ９ ； バ ル ゲ ー ゼ ら ， １ ９ ８ ３ ； ワ ー ド ら ， １ ９ ８ ３ )。 ＨＡとは異なって、ＮＡは、非スプライス、ＮＡ末端、親油性配列、いわゆる膜アンカー に よ っ て 脂 質 膜 に つ な が れ て い る (フ ィ ー ル ズ ら ， １ ９ ８ ３ ； ブ ロ ッ ク ら ， １ ９ ８ ２ )。 構 造全体のうち最も大きな部分が膜の上に突き出ており、そこで伸長した「柄」領域の頂部 に 位 置 す る 末 端 ・ 箱 形 状 の 「 頭 部 」 領 域 を 形 成 す る (リ グ レ イ ら ， １ ９ ７ ３ )。 該 頭 部 の 内 側に、各モノマーはそれ自身の触媒部位をもち、少なくとも４個のＮＡ結合グリコシル基 が 含 ま れ る (コ ー ル マ ン ら ， １ ９ ８ ３ ； ワ ー ド ら ， １ ９ ８ ２ )。 Ｏ − グ リ コ シ ル 化 の 存 在 は 、現在のところまだ説明されていない。 20 外部に局在しているために、ＨＡおよびＮＡ抗原は、宿主の免疫系にとって最も重要な ウイルス標的構造となっている。ＨＡに特異的に結合する抗体はウイルスの感染性を中和 すると考えられ、それはおそらく早期段階の感染を遮断することによるものであろう（ハ ー ス ト ， １ ９ ４ ２ ； キ ダ ら ， １ ９ ８ ３ )。 Ｎ Ａ 特 異 的 抗 体 は 通 常 、 標 的 細 胞 の 初 期 感 染 を 阻 止 す る の で は な く (ジ ャ ヒ エ ル お よ び キ ル ボ ー ン ， １ ９ ６ ６ ； キ ル ボ ー ン ら ， １ ９ ６ ８ ； ヨ ハ ン セ ン ら ， １ ９ ８ ８ )、 ウ イ ル ス の 拡 散 を 阻 止 す る 。 さ ら に 、 競 合 メ カ ニ ズ ム に よ り、より頻繁に発生するＨＡ抗原のために、ＮＡに対する免疫応答が部分的に抑制される よ う に 思 わ れ る (ヨ ハ ン セ ン ら ， １ ９ ８ ７ ； キ ル ボ ー ン ， １ ９ ７ ６ )。 実 際 の と こ ろ 、 Ｎ Ａ 免疫の効果は、ほとんどが中和性のＨＡ抗体によって覆い隠されている。このために、ワ クチン設計者たちの注意は、長い期間にわたってもっぱらＨＡに焦点を向けられている。 30 しかし、多くの実験的観察結果から、インフルエンザに対する防御免疫の構築において 、 Ｎ Ａ が 実 際 に 重 要 な パ ー ト を 演 じ る こ と が 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ て い る (シ ュ ル マ ン ら ， １ ９ ６ ８ ； ヨ ハ ン セ ン お よ び キ ル ボ ー ン ， １ ９ ９ ０ ； ヨ ハ ン セ ン ら ， １ ９ ９ ３ )。 Ｎ Ａの免疫原能力に向けた基礎的な研究には、十分な量の非常に純粋な抗原を、正確な三次 元コンホメーションで利用できることが必要である。現在のところ、ＮＡはウイルスのエ ン ベ ロ ー プ を 界 面 活 性 剤 で 処 理 す る こ と (ギ ャ ラ ガ ー ら ， １ ９ ８ ４ ； キ ル ボ ー ン ら ， １ ９ ６ ８ )ま た は プ ロ ナ ー ゼ を 用 い る こ と が 多 い が 、 タ ン パ ク 質 頭 部 の タ ン パ ク 質 分 解 切 断 (セ ト ら ， １ ９ ６ ６ ； ロ ッ ト ら ， １ ９ ７ ４ )に よ っ て 製 造 さ れ 、 次 い で 精 製 さ れ て い る 。 あ る 程度までは利用可能であるけれども、これらの方法には収率および純度に関して無視でき ない限界がある。 40 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 【０００３】 したがって、本発明の目的は、天然のノイラミニダーゼに対応する抗原特性をもち、正 確な作法で折り畳まれる組換えインフルエンザノイラミニダーゼを提供することである。 【課題を解決するための手段】 【０００４】 このような実質的単離体である組換えノイラミニダーゼを、本発明にしたがって、 ａ )ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ 発 現 ベ ク タ ー で 形 質 転 換 さ れ た 宿 主 細 胞 、 ま た は ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ発現ベクターで形質転換されたウイルスに感染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培 50 (7) JP 2006-193527 A 2006.7.27 養 し (こ こ で 、 発 現 ベ ク タ ー に は 、 膜 ア ン カ ー を コ ー ド す る 領 域 を 欠 損 し て い る イ ン フ ル エンザウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修 飾 バ ー ジ ョ ン が 含 ま れ 、 該 コ ー ド 領 域 に 先 立 ち 、 シ グ ナ ル 配 列 が 相 内 で 連 結 し て い る )； 次いで ｂ )培 養 培 地 か ら 発 現 産 物 ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ を 単 離 す る こ と に よ っ て 得 る こ と が で き る 。 培養培地に分泌される本発明の組換えノイラミニダーゼは、たとえば基礎的研究に用い ることができ、そこでは、ワクチン中でのＮＡの役割を決定するために、ＮＡの単独のワ ク チ ン 接 種 が 行 わ れ る 。 し か し 実 際 問 題 と し て 、 ワ ク チ ン に よ る 防 御 の 度 合 (感 染 に 対 し て 効 果 的 に 防 御 さ れ る 接 種 集 団 の パ ー セ ン テ ー ジ )お よ び 防 御 の 持 続 性 (後 期 流 行 性 株 に 対 10 す る 防 御 )を 増 強 す る た め に 、 組 換 え Ｎ Ａ を Ｈ Ａ と 組 み 合 わ せ て 使 用 す る こ と は ま だ な い であろう。 【０００５】 さらに詳しくは、本発明は、宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、培養培地から発現 産物であるノイラミニダーゼを単離することによって得られる組換えインフルエンザＮＡ ２ノイラミニダーゼを提供する。これには実際問題として、たとえば、ｐＡｃ２ＩＶＡｓ からの組換え発現モジュールを、野生型バキュロウイルスまたはその誘導体に乗り換えさ せる操作が必然的に伴う。次いで宿主細胞をこの組換えバキュロウイルスに感染させる。 組換えインフルエンザノイラミニダーゼの産生に用いる宿主細胞は、昆虫などの下等真核 生物由来のもの、たとえば昆虫細胞系ｓｆ９が好ましいが、サッカロミセスまたはピチア 20 などの酵母細胞も使用しうる。 【０００６】 さらに本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したインフルエンザノ イラミニダーゼ遺伝子のコード領域の少なくとも一部、またはその修飾バージョン、コー ド 領 域 の ５ 'に 位 置 し 、 相 内 で コ ー ド 領 域 に 連 結 さ れ た シ グ ナ ル 配 列 、 シ グ ナ ル 配 列 の ５ ' に 位 置 す る プ ロ モ ー タ ー お よ び コ ー ド 領 域 の ３ 'に 位 置 す る 転 写 タ ー ミ ネ ー タ ー を 含 む 、 分泌可能なインフルエンザノイラミニダーゼを発現するための２種のベクターに関する。 さらに詳しくは、本発明は、複製起点、膜アンカーをコードする領域を欠損したウイルス 株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコー ド領域、またはその修飾バージョンを含む、分泌可能なインフルエンザＮＡ２ノイラミニ 30 ダーゼを発現するためのベクターを提供する。 【０００７】 昆虫細胞中で発現するには、このようなベクターを野生型バキュロウイルスまたはその 誘導体とともに細胞中に入れる。組換えバキュロウイルスは、二重相同的組換えによって 得られ、ここではベクターの発現モジュールがウイルスのゲノムに導入される。プラーク 精製後、組換えバキュロウイルスのストックが得られ、続いて、それを用いてｓｆ９細胞 などを感染させることができる。 【０００８】 シグナル配列は、インフルエンザＮＡ２ウイルス「Ａ／ビクトリア／３／７５」の血球 凝集素遺伝子由来のものであるのが好ましい。本発明は、ベクターｐＡｃ２ＩＶＮＡｓ( 40 ベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・レーデガンクストラート３５番、ラボラト リ ウ ム ・ ボ ー ア ・ モ レ キ ュ ラ イ ル ・ ビ ー オ ロ ジ ー − プ ラ シ ス デ ン コ レ ク チ エ (Ｌ Ｍ Ｂ Ｐ )に １ ９ ９ ４ 年 １ 月 ３ 日 に 提 出 さ れ 、 寄 託 番 号 は Ｌ Ｍ Ｂ Ｐ ２ ９ ７ ６ で あ る )を 用 い て 、 二 重 相 同的組換え手段によって、たとえばバキュロウイルスなどのウイルスを形質転換するのが 好ましい。ここでは、転写制御シグナル、シグナル配列およびコード領域からなるベクタ ーの発現モジュールを、ウイルスのゲノムに組み入れる。 【０００９】 本発明の他の具体例においては、本発明にしたがって第２のベクターを使用する。この ベクターは酵母中で使用されることを企図されており、たとえば複製起点、ノイラミニダ ーゼの膜アンカーおよび柄部分をそれぞれコードする領域を欠損しているウイルス株「Ａ 50 (8) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ／ビクトリア／３／７５」のインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼ遺伝子のコード領域 、 ま た は そ の 修 飾 バ ー ジ ョ ン 、 コ ー ド 領 域 の ５ 'に 位 置 し 、 相 内 で コ ー ド 領 域 に 連 結 さ れ た シ グ ナ ル 配 列 、 シ グ ナ ル 配 列 の ５ 'に 位 置 す る プ ロ モ ー タ ー お よ び コ ー ド 領 域 の ３ 'に 位 置する転写ターミネーターを含む。 【００１０】 プロモーターおよびターミネーター配列は相同的であり、メチロフィック酵母ピチア・ パストリス由来であることが好ましく、アルコールオキシダーゼＩ遺伝子配列などが該当 する。シグナル配列はたとえば、サッカロミセス・セレビシアエのプレプロ接合因子αの 分泌シグナルである。 【００１１】 10 このベクターｐＰＰ１ＩＶＶＡｆｌｓはベルギー、ベー−９０００ゲント、カー・エ・ レーデガンクストラート３５番、ラボラトリウム・ボーア・モレキュライル・ビーオロジ ー − プ ラ シ ス デ ン コ レ ク チ エ (Ｌ Ｍ Ｂ Ｐ )に １ ９ ９ ５ 年 １ 月 ３ 日 に 提 出 さ れ 、 寄 託 番 号 は Ｌ ＭＢＰ３２２３である。 【００１２】 本発明の組換えノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルス、特にＮＡ２型のインフ ルエンザウイルスに対する防御免疫を産生することが可能であることが見いだされている 。したがって、本発明はまた、組換えノイラミニダーゼを含むインフルエンザに対するワ クチンに関する。 【００１３】 20 さらにまた本発明は、組換えノイラミニダーゼの製造方法および精製方法に関する。 【００１４】 本 明 細 書 お よ び 請 求 の 範 囲 に お い て 語 句 「 Ｎ Ａ ｓ 」 は 、 分 泌 可 能 な (組 換 え )ノ イ ラ ミ ニ ダーゼを意味する。「ｐＮＡ」は、プロナーゼで処理された天然のノイラミニダーゼを意 味する。「ＮＡ」はノイラミニダーゼを意味する。 【００１５】 次に述べる実施例において本発明をさらに詳しく説明するが、この実施例は説明の手段 としてのみ意図されたものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 【実施例】 【００１６】 30 実施例１ 組換えインフルエンザＮＡ２ノイラミニダーゼの発現、精製および特性付け 材料および方法 １ .分 泌 さ れ る ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 構 築 お よ び そ の バ キ ュ ロ ウ イ ル ス発現系への組込み ａ .プ ラ ス ミ ド プ ラ ス ミ ド ｐ Ｖ ６ ／ ２ １ は 、 １ コ ピ ー の Ａ ／ ビ ク ト リ ア ／ ３ ／ ７ ５ (Ｈ ３ Ｎ ２ )イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ 遺 伝 子 を 含 む ｐ Ｂ Ｒ ３ ２ ２ の 誘 導 体 で あ る (ヴ ァ ン ・ ロ ム プ イ ら ， １ ９ ８ ２ )。 ｐ Ｓ Ｖ ５ １ お よ び ｐ Ｓ Ｖ ２ ３ ｍ と ｐ Ｓ Ｖ ２ ４ ｍ の両方は、それぞれ後期および初期ＳＶ４０置換ベクターであり、他の文献に記載されて い る (ヒ ュ イ ル ブ レ ッ ク ら ， １ ９ ８ ８ )。 ｐ Ｓ Ｒ Ｓ − ８ は 、 Ａ ／ ビ ク ト リ ア ／ ３ ／ ７ ５ (Ｈ 40 ３ Ｎ ２ )の 血 球 凝 集 素 (Ｈ Ａ )遺 伝 子 の 出 発 配 列 を 含 む ｐ Ｐ Ｌ ａ ２ ３ １ １ に 基 づ く プ ラ ス ミ ド で あ る (ヒ ュ イ ル ブ レ ッ ク ら ， １ ９ ８ ８ )。 バ キ ュ ロ ウ イ ル ス ト ラ ン ス フ ァ ー ベ ク タ ー ｐ Ｖ Ｌ ９ ４ １ が 、 ラ ッ コ ウ お よ び サ マ ー ズ に よ っ て 設 計 さ れ た (１ ９ ８ ９ )。 【００１７】 ｂ .Ｈ Ａ シ グ ナ ル ペ プ チ ド 配 列 の サ ブ ク ロ ー ニ ン グ (ｐ Ｉ Ｖ − プ レ Ｈ Ａ ) １ ８ ３ ０ ｂ ｐ の ｐＳＲＳ−８のＢｓｔＮＩフラグメントをクレノウ酵素で満たした。ＰｖｕＩＩリンカー (Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ )を 続 い て 配 列 し た 。 得 ら れ る フ ラ グ メ ン ト お よ び ｐ Ｂ Ｒ ３ ２ ２ を Ｐ ｖ ｕＩおよびＰｖｕＩＩで切断し、それぞれ７３１ｂｐおよび１６９９ｂｐのフラグメント を 単 離 し た 。 こ れ ら の ２ つ の フ ラ グ メ ン ト を 連 結 し て 、 Ｇ - 1 6 (Ａ Ｔ Ｇ ＝ ＋ １ ， ＋ ２ ， ＋ ３ )で 出 発 す る Ｈ Ａ 遺 伝 子 の ５ '非 翻 訳 領 域 、 次 い で 完 全 な Ｈ Ａ シ グ ナ ル ペ プ チ ド 配 列 お よ び 50 (9) JP 2006-193527 A 2006.7.27 成熟ＨＡの最初の２，３個のコドンを含むｐＩＶプレＨＡを作成した。 【００１８】 ｃ .分 泌 さ れ う る Ｎ Ａ を コ ー ド す る キ メ ラ 配 列 ： ｐ Ａ Ｔ Ｉ Ｖ Ｎ Ａ ｓ の 構 築 ｐ Ｖ ６ ／ ２ １ をＰｖｕＩで開環し、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼで処理した。この混合物にＨｉｎｄ ＩＩＩリンカーを連結し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで切断した。約１５００ｂｐのＮＡフラ グメントを選択し、ｐＳＶ２３ｍの非反復ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位でクローニングした( ｐ Ｓ Ｖ ２ ３ ｍ Ｉ Ｖ Ｎ Ａ )。 左 回 り の イ ン サ ー ト を も つ プ ラ ス ミ ド を Ｆ ｎ ｕ ｄ Ｉ Ｉ お よ び Ｓ ａｌＩで続いて切断し、膜アンカー配列の欠損したＮＡ遺伝子を含む１２９１ｂｐフラグ メントを回収した。ｐＩＶプレＨＡをＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩとともにインキュベート し、ＨＡシグナル配列をもつ８６１ｂｐのフラグメントを保存した。ＰｖｕＩＩ／Ｐｓｔ 10 Ｉブラント末端の連結によって、最終的に両方のフラグメントを結合し、ｐＡＴ１５３の ２２５３ｂｐ−ＳａｌＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入し、ｐＡＴＩＶＮＡｓを得た。こ のプラスミドは、成熟ＨＡの最初の２，３個のアミノ酸を含むＨＡのシグナルペプチド、 すぐに続いてシグナルペプチド／膜アンカーを欠損したＮＡ配列および「柄」をコードす る領域の一部をコードする配列を有している。ＨＡおよびＮＡフラグメントの連結によっ て 、 成 熟 Ｈ Ａ の ５ 位 に 対 応 す る 単 一 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 さ れ た (Ｇ ｌ ｙ か ら Ａ ｌ ａ へ )。 ミ ン ・ ジ ョ ウ ら (１ ９ ８ ８ )お よ び バ ン ・ ロ ム プ イ ら (１ ９ ８ ２ )の 文 献 に 記 載 の 情 報 に 基 づ き 、 ＮＡｓ中の連結部位に隣接する予測されたＤＮＡおよびアミノ酸配列を図２に示す。 【００１９】 ｄ .バ キ ュ ロ ウ イ ル ス ト ラ ン ス フ ァ ー ベ ク タ ー へ の Ｎ Ａ ｓ の 組 込 み 20 ｐＡＴＩＶＮＡｓの１３６８ｂｐ−ＸｂａＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＳＶ５１の ５５６２ｂｐ−ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントおよびｐＳＶ２４ｍの６２４ｂｐ−Ｅ ｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントに連結した。ＮＡｓ遺伝子を含む１６４７ｂｐ−Ｂａｍ Ｈ Ｉ フ ラ グ メ ン ト の １ コ ピ ー お よ び Ｓ Ｖ ４ ０ ポ リ (Ａ )部 位 を 、 ポ リ ヘ ド リ ン プ ロ モ ー タ ー に対する正確な方向を考慮しながらｐＶＬ９４１の非反復制限部位へ続いて挿入し、ｐＡ ｃ２ＩＶＮＡｓを得た。この構築物はＳｆ９細胞の同時トランスフェクション後の野生型 ＡｃＮＰＶのＤＮＡとの相同的組換えを可能にする。組換えウイルスの子孫は、サマーズ お よ び ス ミ ス (１ ９ ８ ７ )に 記 載 さ れ て い る 連 続 的 プ ラ ー ク 精 製 操 作 に よ っ て 単 離 し た 。 【００２０】 ２ .昆 虫 細 胞 培 養 − Ｎ Ａ ｓ の 産 生 30 ル ー チ ン 培 養 の た め に 、 昆 虫 細 胞 Ｓ ｆ ９ を 、 １ ０ ％ ウ シ 胎 児 血 清 お よ び ５ ０ μ g／ mlの ゲンタマイシンを含むＴＣ１００培地中で集密的細胞単層として維持した。組換えバキュ 2 ロ ウ イ ル ス に 感 染 さ せ る た め に 、 ８ ５ ０ cm の 回 転 ビ ン 内 に 培 養 物 を 移 し 、 ２ ５ rpmで 回 転 し て 懸 濁 液 ２ ０ ０ ml中 で 成 長 さ せ た 。 次 い で 、 対 数 増 殖 期 の 終 わ り に 、 懸 濁 細 胞 (２ x１ ０ 6 細 胞 ／ ml)を 組 換 え バ キ ュ ロ ウ イ ル ス に １ .０ モ イ (ｍ ｏ ｉ ： 感 染 多 重 度 )で 感 染 さ せ た 。 ２時間後、感染細胞を新鮮な血清フリーのＴＣ１００培地に移し、懸濁液をさらに４８時 間インキュベートした。下記のとおり、ＮＡｓを培地から精製した。 【００２１】 ３ .イ ン フ ル エ ン ザ Ｘ − ４ ７ ウ イ ル ス の 成 長 Ａ／ビクトリア／３／７５の天然のＮＡの製造源として、インフルエンザ株Ｘ−４７を 40 プロナーゼで処理した後に用いた。Ｘ−４７ウイルスは、１１日齢の胚の入ったニワトリ の 卵 の 卵 黄 嚢 空 隙 中 で 培 養 し た 。 ２ ５ .５ ℃ で ２ 日 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、 卵 を ４ ℃ で 一夜冷却し、次の処理に用いるため卵黄嚢液を採集した。 【００２２】 ４ .緩 衝 液 系 通 例 、 次 の 緩 衝 液 を 用 い た ： 緩 衝 液 Ａ ： ２ ０ mM ジ エ タ ノ ー ル ア ミ ン /Ｈ Ｃ ｌ ,ｐ Ｈ ８ .５ ； 緩 衝 液 Ｂ ： ５ ０ mM Ｎ ａ Ａ ｃ ,ｐ Ｈ ５ .５ ； 緩 衝 液 Ｃ ： １ ０ mM Ｎ ａ Ｐ ,ｐ Ｈ ７ .４ ， １ ５ ０ mMＮ ａ Ｃ ｌ ； 緩 衝 液 Ａ お よ び 緩 衝 液 Ｃ は 、 さ ら に ４ ％ ブ タ ノ ー ル (他 に 特 別 に 指 示 が な い 限 り )お よ び ２ 50 (10) JP 2006-193527 A 2006.7.27 mM Ｃ ａ Ｃ ｌ 2 を 含 む 。 【００２３】 ５ .Ｎ Ａ ｓ の 精 製 ａ .硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 分 画 植 え 付 け (上 記 参 照 )後 、 Ｓ ｆ ９ 懸 濁 培 養 物 (通 例 、 約 １ リ ッ ト ル )を 採 集 し 、 ４ ０ ０ ０ x ｇで１５分間遠心分離を行って細胞レムナントを沈降させた。すべての処理は４℃で行っ た 。 最 初 の 精 製 段 階 に お い て は 、 溶 液 に ５ mM Ｎ Ａ Ｎ 3 を 加 え る 。 透 明 に な っ た 粗 培 地 を ｐ Ｈ ７ .５ に て 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 分 画 に 付 し た 。 ２ ０ ％ か ら ６ ０ ％ の (Ｎ Ｈ 4 )2 Ｓ Ｏ 4 で 沈 殿 し た 物 質 を 遠 心 分 離 (１ ０ ０ ０ ０ xｇ ， ６ ０ 分 )に よ っ て 集 め 、 緩 衝 液 Ａ (ブ タ ノ ー ル な し )＋ ２ ０ mM Ｎ ａ Ｃ ｌ に 、 出 発 体 積 の １ ／ １ ０ の 量 に て 溶 解 し た 。 再 溶 解 し た 沈 殿 物 を 同 緩 衝 10 液 ５ ０ 体 積 に 対 し て ２ ４ 時 間 透 析 (ｍ ｗ ｃ ｏ 「 モ レ キ ュ ラ ー ・ ウ エ イ ト ・ カ ッ ト − オ フ 」 ) し た 。 こ こ で は 、 緩 衝 液 を ３ 回 連 続 的 に 交 換 し た 。 ２ ０ ０ ０ ０ xｇ で １ ５ 分 間 遠 心 分 離 し て不溶成分を除去した。 【００２４】 ｂ .セ フ ァ ロ ー ス Ｑ − ア ニ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 透 析 し た 溶 液 に 先 ず ４ ％ ブ タ ノ ー ル を 加 え 、 続 い て 緩 衝 液 Ａ ＋ ２ ０ mM Ｎ ａ Ｃ ｌ を 流 速 ２ ５ ml／ 時 間 で 通 し て 平 衡 化 し た セ フ ァ ロ ー ス Ｑ − カ ラ ム (２ .５ cmx１ ０ cm)に 流 し た 。 同 緩 衝 液 で カ ラ ム を 洗 浄 し た 後 、 洗 浄 緩 衝 液 か ら ２ ５ ０ mMま で の Ｎ ａ Ｃ ｌ の 直 線 濃 度 勾 配 で 溶 離 を 行 っ た (２ ５ ０ ml， ２ ５ ml/時 間 )。 Ｎ Ａ ｓ を 含 む 各 ２ .５ mlの フ ラ ク シ ョ ン を 酵 素 活 性およびＥＬＩＳＡレベルを測定することによって同定した。ＮＡ活性は単一ピークとし 20 てカラムから溶出した。 【００２５】 ｃ .Ｎ − (ｐ − ア ミ ノ フ ェ ニ ル )オ キ サ ム 酸 ア ガ ロ ー ス ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー (非 組 換 え )イ ン フ ル エ ン ザ Ｎ Ａ お よ び バ ク テ リ ア Ｎ Ａ 酵 素 の 精 製 の た め の こ の ア フ ィ ニ テ ィ ー マ ト リ ッ ク ス の 使 用 が 文 献 に 記 載 さ れ て い る (カ ト ル カ サ ス お よ び イ リ ア ー ノ ， １ ９ ７ １ ； ブ ッ チ ャ ー ， １ ９ ７ ７ )。 ア フ ィ ニ テ ィ ー マ ト リ ッ ク ス の 正 確 な 分 画 は 、 初 め に 推奨された緩衝液条件を適用した場合にのみ達成された。セファロースＱによる分離後に 活 性 画 分 を 集 め 、 等 量 の ２ ０ ０ mM Ｎ ａ Ａ ｃ ， ｐ Ｈ ５ .５ を 加 え た 。 続 い て 、 該 活 性 画 分 を 、 緩 衝 液 Ｂ と １ ０ ０ mM Ｎ ａ Ｃ ｌ で 平 衡 化 し た Ｎ − (ｐ − ア ミ ノ フ ェ ニ ル )オ キ サ ム 酸 ア ガ 30 ロ ー ス カ ラ ム (１ .５ x５ cm)に 通 し た 。 続 い て 、 平 衡 化 緩 衝 液 で カ ラ ム を 洗 浄 し 、 緩 衝 液 Ｂ で脱塩した。次いで、緩衝液Ａで第２の洗浄段階を行った。最後に、１Ｍ ＮａＣｌを加 え た 緩 衝 液 Ａ を 用 い 、 流 速 １ ０ ml／ 時 間 で Ｎ Ａ ｓ を 溶 出 し た (２ mlの 画 分 を 集 め た )。 【００２６】 ｄ .ス ー パ ー デ ッ ク ス ２ ０ ０ ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー Ｃ entriprep(登 録 商 標 )濃 縮 機 (ア ミ コ ン ； ｍ ｗ ｃ ｏ ： ３ ０ ｋ ｄ )を 用 い て ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム の 溶 出 物 を ２ .０ mlに 濃 縮 し た 。 次 い で 、 濃 縮 物 を 体 積 １ .０ mlの サ ン プ ル 画 分 に て、緩衝液Ｃおよび４％ブタノールで平衡化したスーパーデックス２００ゲル濾過カラム (１ .５ cmx６ ０ cm)を 用 い る ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に 付 し た 。 流 速 １ ０ ml／ 時 間 に て カ ラ ム を 平 衡 化 緩 衝 液 で 溶 離 し 、 １ .０ mlの 画 分 を 集 め た 。 長 期 貯 蔵 す る た め に 、 − ２ ０ ℃ で 関 連 40 画分を集め、前述のように濃縮し、続いて最終濃度が５０％になるまでグリセロールを加 えた。 【００２７】 精 製 タ ン パ ク 質 の 分 子 量 を 評 価 す る た め に 、 ウ マ の 脾 臓 か ら 得 た ア ポ フ ェ リ チ ン (４ ４ ３ ｋ ｄ )、 サ ツ マ イ モ か ら 得 た β − ア ミ ラ ー ゼ (２ ０ ０ ｋ ｄ )、 酵 母 か ら 得 た ア ル コ ー ル 脱 水 素 酵 素 (１ ５ ０ ｋ ｄ )、 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン (６ ７ ｋ ｄ )お よ び 炭 酸 デ ヒ ド ラ ー ゼ (２ ９ ｋ ｄ )で ゲ ル 濾 過 カ ラ ム を 測 定 し た (す べ て シ グ マ ・ ケ ミ カ ル ・ コ ー ポ レ イ シ ョ ン か ら 入 手 ) 。 【００２８】 ６ .ｐ Ｎ Ａ の 製 造 お よ び 精 製 50 (11) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ａ .プ ロ ナ ー ゼ 処 理 Ｘ − ４ ７ に 感 染 し た 鶏 卵 の 卵 黄 嚢 液 を ま ず 低 速 (１ ０ ０ ０ xｇ ， １ ０ 分 )で 遠 心 分 離 し て 透 明 化 し 、 次 い で １ ３ ０ ０ ０ xｇ で １ ６ 時 間 遠 心 分 離 し て ウ イ ル ス を 沈 降 さ せ た 。 ウ イ ル ス 沈 降 物 を １ ０ ０ 感 染 卵 等 価 物 当 た り １ ０ mlの 緩 衝 液 Ｃ に 再 懸 濁 し 、 ウ イ ル ス を こ れ 以 上 精 製 を す る こ と な く 、 ２ mg/mlま で の プ ロ ナ ー ゼ を 加 え た 。 軽 く 振 と う し な が ら 、 混 合 物 を２０℃で１６時間インキュベートした。続いて、残りのウイルスコアおよび不溶のプロ ナ ー ゼ 成 分 を ４ ℃ に て 超 遠 心 分 離 (１ ０ ０ ０ ０ ０ xｇ ， １ 時 間 )に よ っ て 除 去 し た 。 次 い で 、放出されたＮＡ頭部を含上清をカラムクロマトグラフィーにて精製した。 【００２９】 ｂ .セ フ ァ ロ ー ス Ｓ − カ チ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 10 クロマトグラフィー操作は、４℃にて行った。粗ｐＮＡサンプルを５倍に希釈し、５０ mM Ｎ ａ Ａ Ｃ ， ｐ Ｈ ５ .５ 、 ２ mM Ｃ ａ Ｃ ｌ 2 お よ び １ ％ ブ タ ノ ー ル を 加 え た 。 次 い で 、 溶 液 を 緩 衝 液 Ｂ ＋ １ ％ ブ タ ノ ー ル お よ び ５ ０ mM Ｎ ａ Ｃ ｌ で 平 衡 化 し た セ フ ァ ロ ー ス Ｓ カ ラ ム ( １ .５ cmx１ ０ cm)に 流 す 。 同 じ 緩 衝 液 か ら ５ ０ ０ mM Ｎ ａ Ｃ ｌ ま で 直 線 勾 配 を 用 い て 結 合 し た 物 質 を 溶 離 し た 。 ピ ー ク の 酵 素 活 性 を 示 す 画 分 を 集 め 、 Ｃ entriprep(登 録 商 標 )濃 縮 機 ( ア ミ コ ン ； ｍ ｗ ｃ ｏ ： ３ ０ ｋ ｄ )を 用 い て ２ .０ mlに 濃 縮 し た 。 【００３０】 ｄ .ス ー パ ー デ ッ ク ス ２ ０ ０ ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー Ｎ Ａ ｓ の 場 合 と 同 様 に し て ス ー パ ー デ ッ ク ス ２ ０ ０ ゲ ル 濾 過 を 行 っ た (ブ タ ノ ー ル 濃 度 が １ ％ で あ る 以 外 )。 純 ｐ Ｎ Ａ を ５ ０ ％ グ リ セ ロ ー ル 中 に − ２ ０ ℃ で 貯 蔵 し た 。 20 【００３１】 ７ .Ｎ Ａ 酵 素 ア ッ セ イ ポ テ ィ ア ら (１ ９ ７ ９ )の 方 法 に 基 づ い て 、 Ｎ Ａ の 触 媒 活 性 の ア ッ セ イ を 行 っ た 。 簡 単 に 述 べ る と 、 １ ０ ０ μ lの 反 応 体 積 に て 、 基 質 と し て １ mMの ２ '− (４ − メ チ ル ウ ン ベ リ フ ェ リ ル )− α − Ｄ − Ｎ − ア セ チ ル ノ イ ラ ミ ン 酸 の 存 在 下 、 − ２ ０ ０ mM Ｎ ａ Ａ Ｃ ， ｐ Ｈ ６ .５ 、 ２ mM Ｃ ａ Ｃ ｌ 2 お よ び １ ％ ブ タ ノ ー ル を 用 い て 酵 素 試 験 を 行 っ た 。 ３ ７ ℃ で ３ ０ ∼ ６ ０ 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、 ０ .５ mlの １ ３ ３ mMグ リ シ ン 、 ８ ３ mMの Ｎ ａ Ｈ Ｃ Ｏ 3 、 ６ ０ mM Ｎ ａ Ｃ ｌ ,pＨ １ ０ .７ を 加 え て 反 応 を 停 止 し た 。 ３ ６ ５ ｎ ｍ の 吸 光 度 を 測 定 す る こ と に よ って、遊離の４−メチルウンベリフェロンを測定した。１ユニットは、１分間に１モルの ４−メチルウンベリフェロンを放出する酵素量として定義した。 30 【００３２】 ８ .免 疫 学 的 技 術 ａ .ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 ｐ Ｎ Ａ Ｉ ｇ Ｇ の 製 造 精製ｐＮＡに対するポリクローナル抗血清をニュージーランド系の３カ月齢のウサギで 作 製 し た 。 一 次 免 疫 感 作 は 、 そ れ ぞ れ 投 与 量 当 た り ５ ０ μ gの ｐ Ｎ Ａ と ７ ５ ％ の フ ロ イ ン ト ア ジ ュ バ ン ト を 含 む ５ ０ ０ μ lを 四 肢 に 筋 肉 内 投 与 し て 行 っ た 。 ６ 週 間 後 、 動 物 は ２ つ の対応する二次免疫注射を後肢に受けた。ＩｇＧ画分を製造するために、タンパク質Ａセ フ ァ ロ ー ス (フ ァ ル マ シ ア Ｌ Ｋ Ｂ )に 吸 着 さ せ る こ と に よ っ て 集 め た 血 清 を 精 製 し た 。 【００３３】 ｂ .Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 40 マイクロタイタープレートにウサギの抗ｐＮＡＩｇＧを塗布した。試験するサンプルを ０ .１ ％ ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン を 含 む Ｐ Ｂ Ｓ で 希 釈 し た 。 ウ サ ギ の ビ オ チ ン 化 抗 ｐ Ｎ Ａ Ｉ ｇ Ｇ 、 次 い で ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン − ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 複 合 体 (ベ ー リ ン ガ ー )を 用 い て 結 合 し た 抗 原 を 検 出 し た 。 該 プ レ ー ト を ｐ − ニ ト ロ フ ェ ニ ル ホ ス フ ェ ー ト (シ グ マ ・ ケ ミ カ ル ・ コ ー ポ レ イ シ ョ ン )と と も に イ ン キ ュ ベ ー ト し て 酵 素 反 応 を 促 進 し た 。 マ イ ク ロ タ イタープレートリーダーで４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。 【００３４】 ９ .分 析 方 法 レ ム リ 法 (１ ９ ７ ０ )に 従 い 、 １ ０ ％ 分 離 ゲ ル 上 で Ｓ Ｄ Ｓ ／ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ を 行 っ た (他 に 特 記 し た も の 以 外 は )。 他 に 特 記 し た も の 以 外 は 、 β − メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル の 存 在 下 に 全 サ 50 (12) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ン プ ル を 変 性 し た 。 １ ０ ％ ゲ ル 中 で 、 マ ー カ ー タ ン パ ク 質 と し て 、 ホ ス ホ リ ラ ー ゼ ｂ (９ ４ ｋ ｄ )、 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン (６ ７ ｋ ｄ )、 卵 白 ア ル ブ ミ ン (４ ３ ｋ ｄ )、 炭 酸 脱 水 素 酵 素 ( ２ ９ ｋ ｄ )お よ び ト リ プ シ ン イ ン ヒ ビ タ ー (２ ０ .１ ｋ ｄ 、 常 に 可 視 で は な い )(フ ァ ル マ シ ア )を 用 い た 。 勾 配 ゲ ル に 次 の 質 量 標 準 を 展 開 し た ： ミ オ シ ン (２ ２ ｋ ｄ )、 β − ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ (１ １ ６ ｋ ｄ )、 ホ ス ホ リ ラ ー ゼ ｂ 、 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン お よ び 卵 白 ア ル ブ ミ ン ( バ イ オ ラ ド ） 。 モ リ シ ー (１ ９ ８ １ )に 記 載 の 方 法 の 変 更 法 に よ っ て ゲ ル 上 で 銀 着 色 を 行 っ た 。 ブ ラ ッ ド フ ォ ー ド (１ ９ ７ ６ )の 方 法 に よ り 、 ニ ワ ト リ の 卵 白 ア ル ブ ミ ン を 標 準 と し て タンパク質濃度を定量した。 【００３５】 １ ０ .架 橋 分 析 10 3 １ ０ mM Ｈ ｅ ｐ ｅ ｓ 中 の １ .０ Ｍ 溶 液 (ｐ Ｈ ７ )と し て 、 架 橋 分 子 Ｂ Ｓ を 新 た に 調 製 し た 3 。 濃 度 ０ .５ mMの Ｂ Ｓ を 、 反 応 量 ３ ０ μ lに て 加 え 、 タ ン パ ク 質 を 架 橋 し た 。 室 温 に て １ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 続 い て 、 ５ μ lの １ .０ Ｍ ト リ ス (ｐ Ｈ ８ .０ )を 加 え て 反 応 を 停 止した。ポリペプチドのパターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。 【００３６】 １ １ .糖 質 分 析 タ ン パ ク 質 サ ン プ ル (０ .１ μ g∼ １ μ g)を ５ ０ ０ mMト リ ス ／ Ｈ Ｃ ｌ (ｐ Ｈ ８ .０ )、 ５ ％ Ｓ Ｄ Ｓ 、 ５ ０ mMβ − メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 中 で 煮 沸 し て 変 性 し た 。 最 終 Ｓ Ｄ Ｓ 濃 度 の 少 な く と も ７ 倍 過 剰 と な る よ う に ２ .５ ％ の Ｎ Ａ − オ ク チ ル グ ル コ シ ド を 加 え た 後 、 Ｎ Ａ − グ リ カ ナ ー ゼ を 加 え (約 ０ .５ ユ ニ ッ ト ； 製 造 者 に よ る ユ ニ ッ ト )、 反 応 混 合 物 を ３ ７ ℃ で １ ６ 20 時間インキュベートした。消化パターンをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。 【００３７】 結果 １ .ｐ Ｎ Ａ の 精 製 ここに記載した実験においては、合計１８６個の感染卵を処理した。異なる精製段階と その結果を表１にまとめた。卵黄嚢液およびウイルスの沈積物を収穫し、プロナーゼを濃 度 ２ mg/mlで 加 え 、 混 合 物 を ２ ０ ℃ で １ ６ 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 超 遠 心 分 離 後 、 上 清 におよそ６０％のＮＡ活性が見られた。この条件下では、活性の損失の主たる原因は、ウ イルス粒子のＮＡ頭部の除去が不完全なことであることがわかった。プロナーゼ濃度を高 くすること、インキュベーション時間を長くすること、またはインキュベーション温度を 30 上げることは、ＮＡが徐々に失活するのが促進されるため、これらによって収量が増加す る こ と は な か っ た (デ ー タ は 示 さ ず )。 続 い て 、 粗 ｐ Ｎ Ａ 物 質 を 希 釈 し 、 ｐ Ｈ ５ .５ に し た 。次いで、セファロースＳ−カチオン交換を行った。ｐＮＡを最大収量で得るために、す べての溶液に１％ブタノールを加えた。ほとんどのタンパク質は、セファロースＳカラム に し っ か り と は 固 定 さ れ ず 、 勾 配 溶 離 に お い て 、 Ｎ ａ Ｃ ｌ が ４ ０ ０ mMの 時 点 に お い て 、 ひ と つ の ピ ー ク が 記 録 さ れ た だ け で あ っ た (示 さ ず )。 Ｓ Ｄ Ｓ ／ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ に お い て コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン バ ン ド が 観 察 さ れ な か っ た の で 、 こ の 物 質 は 、 実 質 的 に 純 粋 な Ｎ Ａ で あ っ た (図 ３ Ａ 、 レ ー ン ３ )。 さ ら に 、 銀 着 色 で は 、 セ フ ァ ロ ー ス Ｓ プ ー ル と セ フ ァ デ ッ ク ス ２ ０ ０ ゲ ル 濾 過 工 程 の 間 に 少 し も 差 異 が な か っ た (図 ３ Ａ 、 レ ー ン ３ と ４ を 比 較 せ よ )。 最 後 の カ ラムでは、画分６０において分子量２１０ｋｄに対応する単一の鈴形状のピークが得られ 40 た (示 さ ず )。 連 続 精 製 工 程 を 図 ３ Ａ に 示 す 。 【００３８】 ＳＤＳ／ＰＡＧＥでは、それぞれ約５４ｋｄと約５２ｋｄに対応する２本のバンドとし てｐＮＡを実際に目視することができた。ここで後者は、銀着色の相対的強度から判るよ うに、最も頻繁に現れるものであった。おそらく、この２つは、柄領域の異なる２カ所の 部位でプロナーゼによる好適な切断を受けたことから誘導されたものである。化学製剤Ｂ 3 Ｓ との架橋から、ｐＮＡが真正の四量体タンパク質として回収されることが確認された( 図 ３ Ｂ )。 【００３９】 ２ .Ｎ Ａ ｓ の 構 築 お よ び 発 現 50 (13) JP 2006-193527 A 2006.7.27 インフルエンザＮＡ２株「Ａ／ビクトリア／３／７５」のＮＡ遺伝子を、そのＮＡ末端 膜アンカーから分離し、代わりにシグナルペプチドスプライシング部位を含むＡ／ビクト リ ア ／ ３ ／ ７ ５ Ｈ Ａ 遺 伝 子 の ５ '配 列 に 結 合 し た 。 こ れ に よ っ て 、 分 泌 可 能 で 可 溶 性 産 物 の合成が可能になった。得られるキメラ遺伝子は、成熟ＨＡの最初の４個の末端アミノ酸 の コ ド ン を 含 む Ｈ Ａ シ グ ナ ル 配 列 、 す ぐ に 続 い て 膜 通 過 部 分 (ア ン カ ー )お よ び 柄 領 域 の 一 部 (ア ミ ノ 酸 １ ∼ ４ ５ )を 欠 損 し た Ｎ Ａ 配 列 か ら な る 。 両 方 の Ｄ Ｎ Ａ 配 列 は 、 同 じ 読 み 取 り 枠内にあり、余分のアミノ酸は導入されなかった。連結の結果として、成熟ＨＡタンパク 質 の ５ 位 に 対 応 す る た だ ひ と つ の ア ミ ノ 酸 置 換 が 行 わ れ た (図 ２ )。 ｐ Ｖ Ｌ ９ ４ １ を 移 入 ベ クターとして用いて、このキメラ配列の１個のコピーをＡｃＮＰＶバキュロウイルスのポ リヘドリンプロモーターの後に組み込んだ。Ｓｆ９昆虫細胞の植え付け後、可溶性タンパ 10 ク質が実際に産生されたことを示すＮＡ活性を培地中で迅速に検出した。感染後およそ４ ８時間で培地中のＮＡｓ活性がプラトーレベルに達したことを図４に見ることができる。 さらにインキュベーションを行うと、おそらく細胞溶解が拡大する結果と考えられるが、 総タンパク質濃度が劇的に低下しはじめるので、よい結果を生まなかった。親Ｓｆ９単層 と広範囲の懸濁培養物間の中間の運搬が最小に制限される場合に、発現が最も盛んである ら し い こ と が 見 出 さ れ た (デ ー タ 示 さ ず )。 種 々 の 精 製 実 験 に 基 づ き 、 Ｎ Ａ ｓ は ６ ∼ ８ mg/l で変化する濃度および適度に低い産生能力で発現されるが、なおしかし、他の分泌される 複 合 体 糖 タ ン パ ク 質 に つ い て 報 告 さ れ た 収 量 (ジ ャ ー ビ ス ら ， １ ９ ９ ０ )と 比 較 可 能 な レ ベ ルであることを決定した。 【００４０】 20 ３ .Ｎ Ａ ｓ の 精 製 ＴＣ１００培地を、可溶性タンパク質内容物の特異的酵素活性がピークに達する感染の ４ ８ 時 間 後 に 収 穫 し た (図 ４ )。 Ｎ Ａ ｓ 精 製 の 種 々 の 工 程 を 表 １ に ま と め た 。 粗 培 地 に 対 し 、２０％∼６０％飽和硫酸アンモニウム沈殿法を行うと、適度に２倍の濃度の増加が得ら れ、物質の濃縮を行うことができた。大規模な透析および不溶生成物の除去を行った後、 ４％ブタノールを加えた。ブタノールを添加することが、ＮＡｓの収量の増加に非常に有 利な影響があり、特にタンパク質濃度が低い場合に効果的であることが見出された。培地 の疎水性の程度を限定することが、不溶性凝集物の形成を避けるのに必要であることも考 慮しうることである。続いて、溶液をセファロースＱ−アニオン交換クロマトグラフィー に よ っ て 分 画 し た (図 ５ )。 塩 勾 配 の 開 始 時 に 適 度 に 対 称 的 な ピ ー ク で Ｎ Ａ 活 性 が 溶 出 し た 30 。ＥＬＩＳＡ試験より、残りの画分にはＮＡ関連物質が含まれないことがわかった。この 時 点 で 、 出 発 時 の タ ン パ ク 質 の 量 の お よ そ ９ ７ .５ ％ が 除 去 さ れ 、 ほ ぼ ２ ０ の 要 因 に よ っ て 特 異 的 活 性 が 増 加 し た 。 次 い で 、 Ｎ − (ｐ − ア ミ ノ フ ェ ニ ル )オ キ サ ム 酸 ア ガ ロ ー ス カ ラ ム に 通 す た め に 、 溶 液 の ｐ Ｈ を ５ .５ ま で 下 げ た 。 初 期 の 実 験 か ら 、 Ｎ Ａ 置 換 オ キ サ ム 酸 が 、 イ ン フ ル エ ン ザ Ｎ Ａ の 強 い 可 逆 的 イ ン ヒ ビ タ ー で あ る こ と が 知 ら れ て い る (エ ド モ ン ド ， １ ９ ６ ６ )。 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス ま た は バ ク テ リ ア の ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ に 対 す る 選 択 的 吸 収 体 と し て Ｎ − (ｐ − ア ミ ノ フ ェ ニ ル )オ キ サ ム 酸 ア ガ ロ ー ス を 使 用 す る こ と は 、 最 初 に カ ト ル カ サ ス お よ び イ リ ア ー ノ (１ ９ ７ １ )に よ っ て 、 後 に ブ ッ チ ャ ー (１ ９ ７ ７ )に よ っ て 証 明 さ れ た 。 最 初 の 操 作 に し た が っ て 、 高 ｐ Ｈ の 緩 衝 液 (１ ０ ０ mM Ｎ ａ Ｈ Ｃ Ｏ 3 ， ｐ Ｈ ９ .１ )で ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ を 溶 離 し た 。 し か し 、 我 々 の 実 験 で は 、 こ れ ら の 条 件 で は 40 、ＮＡｓの溶出は不完全で、遅い結果しか得られなかった。しかし、ｐＨを高め、かつ塩 濃度を高めることによって、効果的な放出が達成できた。溶出に先立って、低濃度の塩の 存 在 下 、 ｐ Ｈ ８ .５ で 追 加 の 洗 浄 工 程 を 行 う こ と に よ っ て 、 多 量 の 非 特 異 的 に 結 合 し た タ ンパク質をカラムから除去した。緩衝剤としてＮａＨＣＯ3よりもジエタノールアミンの 方 を 選 ぶ こ と に よ っ て 、 沈 殿 す る こ と な く ２ mM Ｃ ａ Ｃ ｌ 2 を 吸 収 す る こ と が 可 能 に な っ た 。ＮＡ活性の保持力が、Ｃａ + + イオンに幾分左右されることが繰り返し報告されている( チ ョ ン ら ， １ ９ ６ ６ ； ヂ モ ッ ク ， １ ９ ７ １ )。 こ の こ と が 本 実 験 に 相 当 す る か ど う か は 詳 細に調査しなかった。 【００４１】 痕跡量の残留混濁物を除去するために、溶出液を限外濾過によって濃縮し、スーパーデ 50 (14) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ッ ク ス ２ ０ ０ ゲ ル 濾 過 に 付 す (図 ６ ） 。 Ａ 2 8 0 測 定 で は 、 そ れ ぞ れ 約 ２ ０ ０ ｋ ｄ 、 約 １ ３ ０ ｋｄおよび約５４ｋｄにおいて溶出した吸光度の異なる３つのピークが生じた。ＥＬＩＳ Ａ法によって測定された溶出液の免疫反応性パターンは、記録された３つの各ピークのＡ 2 8 0 プロフィールを正確に表現していることがわかったが、これはすべての物質がＮＡｓ 特異的であることを示唆している。 【００４２】 ピーク画分のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析では、分子量の僅かな減少および画分数の増加が認 3 め ら れ た が 、 予 測 し た 領 域 で あ る 約 ５ ５ ｋ ｄ に 強 い バ ン ド が 現 れ た 。 (図 ７ )。 Ｂ Ｓ を 用 いた架橋分析によって２２０ｋｄピークは四量体のＮＡｓであると同定された。一方、分 子サイズが小さい方の２つのピークは、それぞれ二量体および単量体のＮＡｓであること 10 が わ か っ た 。 た だ し 、 こ こ で 後 者 の 形 体 は 定 量 的 重 要 性 に 限 定 さ れ る (図 ７ Ｂ )。 球 形 体 を もつと考えられる四量体や単量体ＮＡｓとは異なり、二量体ＮＡｓは、その棒様の構造の ために、その現実の分子量よりも僅かに上で溶出すると考えられる。より注目すべき事は 、完全に組み立てられた四量体構造のＮＡｓしか触媒活性を示さないことであった。四量 体形状は、酵素活性に必須とされる色々な局在的コンホメーション変化を引き出すことが 可能である。精製過程の工程表を表２に示す。 【００４３】 ４ .Ｎ Ａ ｓ の 特 性 ＮＡｓをβ−メルカプトエタノールの存在下にＳＤＳと煮沸して変性すると、ＮＡｓは 完全解離して分子量約５５ｋｄの単量体鎖になった。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの銀着色によ 20 り四量体および二量体ＮＡｓは、均質に精製されることがわかった。単量体ＮＡｓについ ては、痕跡量の混濁物が目視されるので、僅かに質の低いものであった。還元剤のない条 件下で変性を行うと、四量体および二量体ＮＡｓは、約１１０ｋｄの二量体鎖として移動 し た (示 さ ず )。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 Ｎ Ａ ｓ 二 量 体 は ジ ス ル フ ィ ド 架 橋 に よ り 内 部 で 結 合 し ており、さらに非共有結合的相互作用を介して会合することができ、それによって、天然 のＮＡの構造に対応する四量体タンパク質が形成されることが示された。 【００４４】 昆虫細胞が、哺乳類および他の高等細胞のＮＡグリコシル化パターンとは幾らか異なる パ タ ー ン を 生 み 出 す こ と が 繰 り 返 し 報 告 さ れ て い る (ヒ シ ア お よ び ロ ビ ン ス ， １ ９ ８ ４ ； バ タ ー お よ び ヒ ュ ー ， １ ９ ８ １ ； バ タ ー ら ， １ ９ ８ １ ； ク ロ ダ ら ， １ ９ ９ ０ )。 し た が っ 30 て、組換えＮＡｓと会合したＮＡ結合糖質の量が、天然のｐＮＡと比較して調査された。 代表的なタンパク質サンプルをＮＡグリカナーゼ酵素で処理し、続いてＳＤＳ／ＰＡＧＥ 法 で 分 析 し た (図 ９ )。 バ ン ド が 相 対 的 に 置 き 換 わ っ て い る こ と か ら 、 Ｎ Ａ ｓ と 会 合 し た Ｎ Ａ 結 合 糖 質 の 合 計 量 は 、 天 然 の 分 子 と 比 べ て 僅 か に 少 な い と 結 論 付 け る こ と が で き る (図 ９ Ａ と 図 ９ Ｂ を 比 較 せ よ )； こ の 系 で 発 現 す る 他 の 糖 タ ン パ ク 質 に 対 し て 行 わ れ た 結 果 と 一 致 す る 知 見 で あ る (ク ロ ダ ら ， １ ９ ８ ６ ； ド ミ ン ゴ お よ び ト ロ ウ ブ リ ッ ジ ， １ ９ ８ ８ ； ヴ ァ ン ・ ド ル ネ ン ・ リ ッ テ ル ら ， １ ９ ９ １ )。 変 性 、 酵 素 的 脱 グ リ コ シ ル Ｎ Ａ ｓ 体 が 、 そ のオリジナルのオリゴマー構造にかかわらず、同じ電気泳動的挙動で移動することも確立 され、このことから、一次ＮＡｓが一様な鎖長のポリペプチドとして合成されたことが確 認 さ れ る (図 ９ Ｂ 、 レ ー ン ３ ， ５ お よ び ９ を 比 較 せ よ )。 Ｎ Ａ グ リ カ ナ ー ゼ で 処 理 さ れ た ポ 40 リ ペ プ チ ド 鎖 の 分 子 量 は 、 ４ ７ .５ ｋ ｄ と 見 積 も ら れ 、 こ れ は 予 測 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 か ら計算された理論的分子量４７，７１７ｄに一致する。十分興味深いことに、グリコシル 化二量体および単量体ＮＡｓと一致するバンドはゲル内で、グリコシル化四量体ＮＡｓか ら誘導されたバンドよりもやや急速に移動するので、ＮＡグリコシル化の度合は、四量体 を 形 成 す る 能 力 と 関 係 し て い る よ う に 思 わ れ た (図 ９ Ｂ 、 レ ー ン ２ に 対 し て レ ー ン ４ お よ び ６ ； 図 ７ Ａ も 参 照 せ よ )。 Ｎ Ａ 結 合 糖 質 、 さ ら に 詳 し く は Ａ ｓ ｎ 2 0 0 に 結 合 す る オ リ ゴ 糖 質鎖が、隣接するサブユニットとの相互作用に介入することによって四量体構造の安定化 に 一 部 役 割 を 担 う こ と が で き る と い う こ と が 示 唆 さ れ て い る (バ ル ゲ ー ゼ ら ， １ ９ ８ ３ ； バ ル ゲ ー ゼ お よ び コ ー ル マ ン ， １ ９ ９ １ )。 【００４５】 50 (15) JP 2006-193527 A 2006.7.27 四量体タンパク質のみがＮＡｓの触媒特性を有した。単離された四量体ＮＡｓは、ほと ん ど 精 製 ｐ Ｎ Ａ と 同 一 の 特 異 的 活 性 レ ベ ル を 呈 し た (表 １ お よ び 表 ２ )。 【００４６】 各単量体は触媒部位を有しているが、低次構造のＮＡｓ体が酵素活性をもたないという 知見は、おそらくインフルエンザＮＡの機能性における四次相互作用にとっての重大な役 割を反映している。 【００４７】 ＮＡｓの抗原特性を確かめるために、等しい濃度のタンパク質サンプルを作り、続いて ２倍希釈し、ポリクローナル抗ｐＮＡＩｇＧに基づくサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した (図 １ ０ )。 四 量 体 Ｎ Ａ ｓ で は 、 ｐ Ｎ Ａ の 参 考 グ ラ フ と 同 様 の 滴 定 曲 線 が 得 ら れ た が 、 こ れ 10 は、両方が同一かまたは非常によく似た抗原特性をもつことを示している。抗原性に小さ なシフトが認められるけれども、論証できるような酵素活性がないにもかかわらず、二量 体および単量体ＮＡｓの抗原活性は実質的にそのまま残っていた。抗原性におけるこの小 さな差異は、抗原活性／Ａ280比が僅かに上回っている四量体ピークのゲル濾過プロフィ ー ル か ら 同 様 に 明 ら か で あ っ た (図 ６ )。 天 然 の 四 量 体 構 造 に 対 し て 産 生 さ れ た 多 数 の 抗 体 分子は、不完全に組み立てられたＮＡｓに効率的に結合すること、たとえば隣接するサブ ユニット間の接触領域を認識することが不可能であったということも有り得る。四量体フ ォーメーションによって誘発される局部的な変化もまた、多数の微細な抗原差異を引き起 こす。 【００４８】 20 論考 本発明の主たる目的は、分泌され、正確に折り畳まれたタンパク質としてのインフルエ ンザノイラミニダーゼの合成、およびワクチン用剤として使用しうる均質な生成物を得る ための精製操作の決定であった。ＮＡ２インフルエンザウイルス株Ａ／ビクトリア／３／ ７ ５ の Ｎ Ａ 遺 伝 子 か ら 、 シ グ ナ ル 配 列 (膜 ア ン カ ー 機 能 )を 有 す る 元 の Ｎ Ａ 末 端 領 域 が 、 イ ンフルエンザＨＡ遺伝子の５’配列の一部と置き換えられたキメラ遺伝子を構築した。続 いて、ＨＡから誘導された切断可能なシグナルペプチドにより実質的に分泌可能なＮＡ( Ｎ Ａ ｓ )を コ ー ド す る 、 得 ら れ る 構 築 物 を 、 強 力 な ポ リ ヘ ド リ ン プ ロ モ ー タ ー の 転 写 調 節 下にバキュロウイルス発現ベクターに組み込んだ。宿主昆虫細胞Ｓｆ９の感染後、培養培 地 中 に Ｎ Ａ ｓ が 分 泌 さ れ た 。 精 製 結 果 に 基 づ い て 、 ６ ∼ ８ mg/lの 範 囲 で 発 現 の レ ベ ル を 評 30 価した。バキュロウイルスに感染している間に、分泌による宿主細胞のタンパク質切断能 力 が 劇 的 に 減 少 す る こ と が 論 証 さ れ た (ジ ャ ー ビ ス お よ び サ マ ー ズ ， １ ９ ８ ９ )。 そ れ に も かかわらず、記載された産生系は実験室スケールの予防接種の研究に適用可能であり、相 当なスケールアップにも好適である。 【００４９】 ＮＡｓの精製は、第１の硫酸アンモニウム分画段階、それに続く３種のクロマトグラフ ィー段階を含む実質的に４段階の操作からなった。酵素活性の獲得については、精製タン パク質としておよそ２５％のＮＡｓが回収されることを評価した。ゲル濾過カラムクロマ トグラフィーにより、ＮＡｓを予分別して、架橋分析によりそれぞれ四量体、二量体およ び 単 量 体 Ｎ Ａ ｓ (こ こ で 後 者 は ほ ん の 少 量 し か 存 在 し な い )と し て 同 定 さ れ る 分 子 サ イ ズ の 40 異なる３つの集団に分けた。主要な２つの形体、四量体および二量体ＮＡｓは、約等量で 得られ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび銀着色で審査したところ均質であった。 【００５０】 ＮＡｓの酵素および免疫特性を評価するために、比較対称タンパク質として天然のＮＡ を単離することが必要であった。Ｘ−４７ウイルスのＡ／ビクトリア／３／７５ＮＡの頭 部をプロナーゼ処理により切断し、次いでカチオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィ ーにより精製した。架橋後、ｐＮＡが完全な膜結合ＮＡの四量体構造を保持していること を確認した。 【００５１】 ＮＡｓの触媒特性は、四量体タンパク質のみが酵素活性を呈するという非常に変わった 50 (16) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ものであった。四量体ＮＡｓは、ほどんどｐＮＡに相当する特異的活性を有した。二量体 および単量体ＮＡｓが変性タンパク質であるという理由で単純に不活性であったというの は可能性が低いことである。なぜなら、精製操作中これらの形体もまた、基質結合部位に 基づくアフィニティークロマトグラフィーによってしっかりと補足されたからである。こ れは、酵素の触媒部位は機能的に完全にちがいないが、次に続く触媒への移行が明らかに できないことを示唆している。 【００５２】 ＮＡグリカナーゼ処理により、概してＮＡｓの糖質含量がｐＮＡの糖質含量と比べて僅 かに低いこと示されたが、これはこの系で発現する他の糖タンパク質においても認められ る こ と で あ っ た (ク ロ ダ ら ， １ ９ ８ ６ ； ド ミ ン ゴ お よ び ト ロ ウ ブ リ ッ ジ ， １ ９ ８ ８ ； バ ン 10 ・ ド ル ネ ン ・ リ ッ テ ル ら ， １ ９ ９ １ )。 ハ イ ポ グ リ コ シ ル 化 は 、 二 量 体 お よ び 単 量 体 Ｎ Ａ ｓにおいて明らかに、より顕著であった。Ｘ線回折分析による構造の研究から、Ａｓｎ20 0 に結合した糖質鎖が隣接するサブユニットの接触をより接近したものにすることが示さ れたが、これは、その鎖が、四量体構造を強化するためのさらなる相互作用を提供したこ と を 示 唆 し て い る (バ ル ゲ ー ゼ ら ， １ ９ ８ ３ ； バ ル ゲ ー ゼ お よ び コ ー ル マ ン ， １ ９ ９ １ )。 【００５３】 精製ｐＮＡに対して産生されたポリクローナルＩｇＧとの四量体ＮＡｓの反応性は実質 的に完全であったが、これは、両方のタンパク質が非常に類似した抗原特性をもつことを 示している。二量体および単量体ＮＡｓの場合に抗原性の小さいシフトを認めることは可 能であった。これまでに述べてきたことから、四量体構造のインフルエンザＮＡのみに結 20 合するモノクローナル抗体を単離することが可能であると推論することができた。このよ うな抗体は、おそらく隣接するサブユニットから誘導された表面の抗原決定基との相互作 用に入るか、あるいは別の考え方として、四量体形成中のコンホメーション再構成後に形 成されたエピトープを認識する。さらに、糖質組成における差異もまた抗原特性を変更す る。 【００５４】 実施例２ ピチア・パストリスによる組換えノイラミニダーゼの分泌 序論 昆虫細胞に加えて、酵母が組換えインフルエンザノイラミニダーゼ産生用の宿主細胞と 30 して使用しうるかどうかを判定するために、ノイラミニダーゼの酵素的「帽子」部位を含 む発現ベクターを構築した。 【００５５】 材料および方法 １ .ベ ク タ ー お よ び 宿 主 ピチア・パストリスのプラスミドｐＰＩＣ９（インビトロゲン製）を用いて発現カセッ トを構築した。このプラスミドは、ピチア・パストリスの誘導可能なアスコールオキシダ ーゼＩ（ＡＯＸＩ）遺伝子の複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、プロモーターおよびタ ーミネーター領域、サッカロミセス・セレビシアエのα因子のプレプロ分泌シグナル、な らびにピチア・パストリスのＨＩＳ４マーカーを含む。宿主としては、メチロトロフィッ 40 クな酵母菌ピチア・パストリス（インビトロゲン）を用いた。 【００５６】 ２ .発 現 カ セ ッ ト の 構 築 部位特異的突然変異誘発法によって、Ａ／ビクトリア／３／７５のノイラミニダーゼ遺 伝子のｃＤＮＡ配列にＳｔｕＩ制限部位を導入した。制限部位の位置はＰｒｏ７９とした 。この制限部位を用いて、酵素的活性中心を含むノイラミニダーゼ遺伝子の免疫原性「帽 子配列」を、ＳｔｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離し、ピチア・パストリスのプラス ミドｐＰＩＣ９のＳｎａＢＩ制限部位にクローニングすることができた。図１５はｐＰＩ Ｃ９プラスミドの模式図を示す。図１６はプレプロシグナル配列と組換えノイラミニダー ゼの融合領域である。プロペプチドは外来性のＫＥＸ２プロテアーゼによって後期ゴルジ 50 (17) JP 2006-193527 A 2006.7.27 体内で切断される。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）2ジペプチドはＳＴＥ１３型のジペプチジルアミ ノペプチドによって除去される。外側のチロシン残基は切断されず、組換えノイラミニダ ーゼ上でＮ末端に残るが、これは不必要である。 【００５７】 ＳａｌＩ切断法によってＨＩＳ４選択マーカーの位置で得れらるプラスミドを直線化し 、 続 い て ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル の 存 在 下 に ピ チ ア ・ パ ス ト リ ス の Ｇ Ｔ Ｓ １ １ ５ （ his４ ）原形質体に形質転換した。形質転換体から単離されたＤＮＡをサザン分析に付した。こ の 分 析 に よ り 、 内 部 （ し か し 欠 失 あ り ） his４ 座 の 位 置 に 相 同 的 組 換 え を 介 し て 組 み 込 ま れた発現ベクターが示された。大部分の形質転換体は１∼２コピーのプラスミドを有して いるが、高度分泌能力をもつ形質転換体は、タンデム構造で宿主ゲノムに全体を組み込ま 10 れた複数コピーのプラスミドを持つことがわかった。該コピーの数は形質転換体当たり２ ５に達していた。 【００５８】 ３ .ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ の 発 現 最小グリセロール緩衝培地（ｐＨ６．０）中で形質転換体を予備成長させ、４８時間後 に、０．５％メタノールを含む最小緩衝培地に移した。この結果、アルコールオキシダー ゼＩプロモーターが誘導され、ノイラミニダーゼの「帽子」が発現した。公知のノーザン 分析法を用いて、細胞中のノイラミニダーゼのｍＲＮＡ量を評価した。この結果、非常に 効果的に誘導がなされたことがわかった。 【００５９】 20 細胞上清のウエスタン分析から、分子量約７０ｋＤａの組換えノイラミニダーゼが分泌 されたことがわかった（図１７参照）。 【００６０】 ＰＮＧアーゼＦを用いて分泌産物を脱グリコシル化した。これによって、予測された４ ３ｋＤａという大きさの「コア」産物が産生された。コピー数に応じて培地中の組換えノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ の 収 量 が １ ∼ １ ． ５ mg/リ ッ ト ル の 間 で 変 動 す る こ と が わ か っ た 。 【００６１】 実施例３ 材料および方法 １．実験動物 30 免 疫 感 作 開 始 時 に ８ 週 齢 の 雌 性 同 系 繁 殖 系 Ｂ ａ ｌ ｂ ／ ｃ マ ウ ス （ Ｓ Ｃ Ｋ Ｍ ol、 ベ ル ギ ー）を用いた。受動免疫感作実験において、被検マウスは１２週齢であった。１ケージ（ 2 ４ １ ０ cm ） あ た り ３ 匹 の グ ル ー プ に 分 け 、 食 餌 と 水 を 任 意 に 与 え た 。 【００６２】 ２．ウイルス インフルエンザ株は、Ａ．ダグラス博士およびＪ．スケール博士から入手した（ＭＣＲ ・ラボラトリーズ、ミル・ヒル、ロンドン）。実験用ウイルスＸ−３１およびＸ−４７は Ｈ３Ｎ２抗原組成物を含み、該組成物は、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を遺伝子的に 再編成することにより、それぞれＡ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ビクトリ ア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）として誘導される。両方のウイルスのストックを、マウスが死 40 亡する程度に肺を通して何回も注入することによって順応させた。 【００６３】 ３．組換え分泌可能ＮＡ（ＮＡｓ） インフルエンザＮＡ Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）を、実施例１で記載した バキュロウイルス昆虫細胞発現系で産生された精製組換えタンパク質として投与した。こ こで記載する免疫感作実験で使用する精製ＮＡｓ票品には、リン酸緩衝塩溶液として四量 体と二量体分子の混合物が含まれていた。 【００６４】 ４．アジュバント 我々自身の実験室で行った組換えインフルエンザＨＡの免疫感作研究に基づいて、適当 50 (18) JP 2006-193527 A 2006.7.27 なアジュバントを選んだ。Ｒｉｂｉアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）、 トレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）、スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０を含 む）とサルモネラ・チフィムリウムＭＰＬＡの入ったビンを製造者の指示書（Ｒｉｂｉイ ムノケム・リサーチ）にしたがって満たした。ムラミル・ジペプチド（ＭＤＰ）はシグマ ・ケミカル・コーポレイションから購入した。 【００６５】 ５．免疫感作プロトコル １ μ ｇ の Ｎ Ａ ｓ を ２ ０ ０ μ lの 用 量 で ３ 回 、 ３ 週 間 間 隔 で 皮 下 注 射 に て マ ウ ス に 投 与 し た。最初の免疫感作では、通常マウスに用いるＲｉｂｉ用量の半分量中（２５μｇのＭＰ Ｌ Ａ 、 ２ ５ μ ｇ の Ｔ Ｄ Ｍ 、 ２ μ lの ス ク ア レ ン お よ び ０ ． １ ％ の Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ８ ０ に 相 当 ） 10 に、ＮＡｓを乳剤化した。２５μｇのＭＰＬＡと２５μｇのＭＤＰをＮＡｓに加えてブー スター注射を行った。対照動物にはアジュバントのＰＢＳ溶液を投与した。 【００６６】 ６．受動免疫感作 ３回目の免疫感作後３週間目に、心臓穿刺によってドナーマウスから採血し、同様に処 理 さ れ た マ ウ ス の 血 清 標 品 を 集 め た 。 被 検 マ ウ ス に ４ ０ ０ μ lの 免 疫 ま た は 対 照 血 清 を １ 回投与の腹腔内注射を行った。 【００６７】 ７．インフルエンザチャレンジ ブースター注射後３週間目または受動免疫感作後１日目、軽度にエーテル麻酔したマウ 20 スに、２０ＬＤ50の即位的ウイルスを鼻孔内接種した。次いで、接種後１０日間の直腸の 温度と体重を測定することによって、感染の進行の程度を追跡した。 【００６８】 ８．血清学的方法 ワクチン接種開始前１日（免疫前血清）および各免疫感作後２週間目の血液サンプルを 尾部動脈から採血した。ＥＬＩＳＡ法により、ＮＡ特異的抗体について個々の血清サンプ ル を 試 験 し た 。 マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト （ Nunc Maxisorp） に 精 製 Ｎ Ａ ｓ を 塗 布 し （ ５ ０ ng/ウ エ ル ） 、 血 清 を ５ 倍 に 希 釈 し た 。 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ （ シ グ マ ・ ケ ミ カ ル ・ コーポレイション）と複合したウサギの抗（マウスＩｇＧ）抗体を加え、次いでｐ−ニト ロフェノール基質溶液（シグマ・ケミカル・コーポレイション）をプレートに加えてイン 30 キュベートすることによって特異的抗体の結合を定量した。マイクロタイタープレートリ ー ダ ー に て ４ ０ ５ nmに お け る Ｏ Ｄ 値 を 測 定 し た 。 対 照 ウ エ ル （ 免 疫 前 血 清 で 処 理 ） よ り も ０．５高い吸光度が得られるｌｏｇ5血清希釈の逆数としてＮＡ抗体の力価を表した。 【００６９】 結果 １．実験設計 上記免疫感作プロトコルに従い、１グループ１２匹のマウスのグループ３つに、ＮＡｓ のワクチン接種を行った。同数の対照マウスを平行してＰＢＳで処理した。続いて、ワク チン接種マウスと対照マウスからなる対のグループをマウス順応Ｘ−４７またはＸ−３１ にチャレンジさせた。一方、該対グループを受動免疫感作実験の血清ドナーとした。 40 【００７０】 ２．血清応答 各ケージから１匹ずつ取り出した、１２匹のワクチン接種動物と１２匹の対照動物から ランダムに選択した血清で行うＥＬＩＳＡによってＮＡｓに対する抗体応答を追跡した。 マウスにおいてＮＡｓ免疫感作を行うと、血清中のＮＡｓ抗体が著しく増加した。最初の ブースター注射は、およそｌｏｇ5量の３倍のＮＡｓ抗体を増加したが、第２のブースタ ー注射ではＮＡｓ抗体の力価がさらにまた約５倍の増加を示した。対照マウスにおいては 、アジュバントの１回投与では、ＮＡｓと反応する特異的抗体の有意な産生はなされなか った。 【００７１】 50 (19) JP 2006-193527 A 2006.7.27 ３．ＮＡｓによるホモ変異防御 ワクチン接種後３週間目のワクチン接種マウスと対照マウスに対し、２０ ＬＤ50量の ホモＮＡ変異ウイルスＸ−４７を投与することにより、免疫を検定した（図１２）。体温 の低下および体重の減少が測定されたことからわかるように、すべての対照マウスは重篤 な罹患状態に陥った。感染後４日目に、最初の死亡マウスが現れ、すべての対照マウスは ウイルス接種後９日以内にすべて死亡した。 反対に、ＮＡｓワクチン接種マウスにおける臨床パラメーターは、一時的かつ小さく低 下しただけであった。すべてのワクチンマウスは感染から助かった。 第３の免疫感作を行わない場合、同レベルの防御免疫が達成されうるのかどうかという 点についても調べた（ＮＡｓおよび／またはアジュバントの用量を増加することによって 10 補償されるという可能性があると考えられる）。これらの試験は実質的に同一の実験計画 に沿って行った。この作法で免疫感作したマウスは一般に良好な耐性を呈したが、少数の 個体は重篤な罹患状態に陥った。また、生存率が８０％以下になることは殆ど無かったが 、ワクチン接種マウスにおいて死亡するものも時折あらわれた。しかし、３回の免疫感作 によって達成された防御免疫のレベルは、全般にわたって優れたものであることがわかっ た。 【００７２】 ４．ＮＡｓによるヘテロ変異防御 ７年抗原ドリフトによってＡ／ビクトリア／３／７５から誘導されたＮＡｓから分離さ れるＮＡを含むヘテロ−ＮＡ−変異ウイルスＸ−３１の２０ ＬＤ50量を、ワクチン接種 20 マウスおよび対照マウスの別のグループに感染させて免疫性を試験した（図１３）。Ｘ− ４７免疫感作実験においても観察されたように、臨床結果は劇的なものであった。対照動 物は感染後５日目で既に死亡するものがあらわれ始めた。死亡率は８日目に最大値に到達 し、その後生存したのは１匹だけであった。ＮＡｓで免疫感作したマウスは、通常は致命 的なヘテロ変異ウイルスに感染したにもかかわらず、１００％の生存率を示した。ホモ変 異免疫実験の場合と同様に、ワクチン接種マウスは体温を適度に正常レベルで維持するこ とができた。体重の損失は、ホモ変異の場合と比べて幾らかは顕著であったが、すべての マウスが６日目以降回復を始めた。 【００７３】 ５．防御免疫はＮＡｓ免疫血清の受動伝達によって獲得することができる 30 受動免疫感作による動物防御が、誘発される防御免疫に対して主に応答可能である体液 性防御メカニズムであるかどうかを決定するために、該動物防御を試験した。この目的の ために、標準的操作にしたがってドナーマウスを免疫感作した。該ドナー動物から採血し て 、 １ 個 体 あ た り 平 均 約 ４ ０ ０ μ lの 血 清 を 得 た 。 対 照 血 清 と 免 疫 血 清 を そ れ ぞ れ 集 め た 後 、 ４ ０ ０ μ lの 血 清 を 被 検 マ ウ ス に 腹 腔 内 注 射 に て １ 回 で 投 与 し た 。 適 合 さ せ た Ｘ − ４ ７ウイルスの２０ ＬＤ50量にチャレンジさせる前に、抗体分子がマウス内で満遍なく拡 散しうるように２４時間の間隔をあける。対照血清を接種された動物は、すぐに急性の低 体温症になり、体重が激しく減少し、最終的に死亡に至ったが、ＮＡｓ免疫血清を投与さ れたマウスは、能動的に免疫感作された動物と実質的に同程度に防御された（図１４）。 したがって、ＮＡ抗体を予め循環させておくことにより完全な防御が得られるという結 40 論を下すことができる。 【００７４】 論考 インフルエンザに対する免疫は、長い間ほとんどＨＡ抗体の機能についてのみ研究され ていたが、免疫に寄与するＮＡの重要性は実質的に無視されてきた。この状況は、ＨＡを 結合しうる抗体のみがウイルスを直接中和する能力をもつという観察結果に一部由来する ものであった（ハースト，１９４２；デイブンポートら，１９６４；キダら，１９８３） が、ＮＡに対する抗体が、広範囲の濃度において一次感染を防御しうることはわかってい なかった（ジャヒエルおよびキルボーン，１９６６；キルボーンら，１９６８；ヨハンソ ン，１９８９）。この寛容はおそらく、インフルエンザウイルスのライフサイクルの後期 50 (20) JP 2006-193527 A 2006.7.27 部分で、新たに形成されたウイルスが感染細胞の表面で凝集するのを妨げるように働くＮ Ａｓを反映している（コールマンおよびウォード，１９８５；ブラウンおよびレイバー， １９６８）。ＨＡとは逆に、ＮＡはインフルエンザウイルスのエンベロープの成分のうち で少ないほうの成分であり、ＮＡ抗体の非中和効果に寄与しうるという事実がさらに発見 された（シュルマンら，１９６８）。この存在モル比率の相違が、同様に個々の抗原に対 する相対的抗体応答に影響を及ぼす。全インフルエンザウイルスと連続的に対決するため に、ＮＡと比べてＨＡが相対的に過剰に提供されることが繰り返されると、おそらくＮａ 特異的Ｔ細胞の援助が覚醒される結果として、ＮＡ抗体の産生を抑制することができた（ キルボーン，１９７６；ヨハンソンら，１９８７；キルボーンら，１９８７；ヨハンソン ら，１９８７）。 10 【００７５】 したがって、防御ＮＡ免疫を研究するために、ＨＡ抗体を中和することに対する妨害が 排除され、ＨＡ抗原およびＮＡ抗原の競合を介したＮＡ免疫応答の阻害が回避されるとい うシステムを発展させることが必要である。古典的アプローチは、天然のＮＡ成分の単離 に基づいて行われる（シュルマンら，１９６８；ヨハンソンおよびキルボーン，１９９０ ；ギャラガーら，１９８４）かまたは別の場合では限定されたシリーズのインフルエンザ 株と血清学的に異なるＨＡおよびＮＡ抗原との組み合わせ投与に基づいて行われる（ロッ トら，１９７４；キルボーン，１９７６）かのいずれかであった。しかし、本明細書に記 載した結果は、精製、組換えＮＡタンパク質を用いる防御免疫感作を直接に説明するもの である。Ａ／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのＮＡ遺伝子は、膜アンカーを 20 コードする領域がインフルエンザ血球凝集素遺伝子のシグナル配列と置換されることによ って分泌可能なタンパク質（ＮＡｓ）をコードする遺伝子に形質転換された（実施例１を 参照）。 【００７６】 ＮＡ抗体がウイルス粒子の放出および拡散を阻害することによりウイルス成長の収率を 効果的に抑制することができるというインビトロ技術がすでに確立されている（ジャヒエ ルおよびキルボーン，１９６８；キルボーンら，１９６８）。 【００７７】 肺におけるウイルス力価の低下および肺機能障害の進行の抑制を測定することにより、 ＮＡで免疫感作された動物から、同様の結論が引き出された（１１，１２，１３）。肺で 30 のウイルス複製におけるＮＡ免疫の効果に大きな注意が向けられていたけれども、純粋な ＮＡタンパク質による免疫感作が、臨床疾患の症候を予防しうるか、または潜在的に致命 的なインフルエンザに感染した後の生存チャンスを改良しうるかどうかは疑わしかった。 この疑問に対する満足のいく答えはまだ得られていなかった。しかし、本明細書で示す結 果は、通常致命的なインフルエンザ感染に対する完全防御が、純粋な組換えＮＡｓで免疫 感作することによって達成されうることをを明確に説明しており、ここでは、既往の抗Ｈ Ａ免疫メカニズムまたは保存された内部ウイルスタンパク質の抗原に対する細胞性記憶免 疫効果は排除される。 【００７８】 本明細書で説明した実験においては、３週間の間隔をおいて、１μｇのＮＡｓを３回投 40 与してマウスの免疫感作を行った。ワクチン接種した動物は全部インフルエンザウイルス の致命的感染から生還することができた（ここでウイルスはホモまたはヘテロ変異ＮＡを 発現した）。感染ウイルスの投与量が多くても、非常に驚くべきことに、体温および体重 の変化によって示されるように、免疫感作した動物は臨床疾患の症候を示さないままであ った。ＮＡｓとともに投与されるアジュバントがすべて低い反応原特性を有することに注 意することが重要であり、そのために、ここで述べた免疫感作操作がヒトのワクチン接種 に直接適用しうるのである。さらに、本発明ワクチンは、他の哺乳動物および鳥類に適用 可能である。 【００７９】 無垢の被検マウスにＮＡｓで免疫感作したマウスの血清を受動伝達しても、同レベルの 50 (21) JP 2006-193527 A 2006.7.27 防御が得られたが、このことはＮＡｓ免疫感作の防御効果が、ＮＡ抗体の循環に基づいて 説明できることを示している。 【００８０】 ここに記載したヘテロ変異防御に関し、ワクチンＡ／ビクトリア／３／７５のＮＡ抗原 と変異感染ウイルスＸ−３１に存在するＡ／アイチ／２／６８のＮＡの間の構造的関係を 考慮することが重要である。残念なことに、Ａ／アイチ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のＮＡに 関しては、適用できる配列データはないが、アイチ株と同年に単離されたＡ／ＮＴ／６０ ／６８（Ｈ３Ｎ２）（ベントレーおよびブロウニー，１９８２）のＮＡ配列と比較するこ とはできる。両方のＮＡ変異体の頭部領域を綿密に調査すると、２８位にアミノ酸の置換 が発見される（その点で、主要部は分子の表面にある）。 10 【００８１】 本発明ワクチンは、さらになお移転したドリフト変異体に対する防御をも提供しうる可 能性がある。さらに、ＮＡの遺伝子修飾によって遺伝子の変化をその抗原構造にアレンジ しうることが考えられる。このことから、たとえば異なるバージョンのＮＡの「カクテル 」を製造することが可能になり、したがって、異なるインフルエンザ株に対する広範な防 御が獲得できる。 【００８２】 【表１】 20 この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２００ゲル 濾過後の液量は、２行程のクロマトグラフィーによる精製物を合わせたものである。 【００８３】 30 (22) JP 2006-193527 A 2006.7.27 【表２】 10 20 この表は、代表的な精製実験を示す（詳細は本文参照）。スーパーデックス２００ゲル 濾過後の特定の液量は、２行程のクロマトグラフィーからのＮＡｓ画分を合わせたもので ある。 【００８４】 参考文献 30 ベ ン ト レ イ , D. R. お よ び ブ ラ ウ ン リ ー , G. G. 「 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス Ａ ／ Ｎ Ｔ ／ ６ ０ ／ ６ ８ 由 来 の Ｎ ２ ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ の 配 列 」 Nucl. Acids. Res. 10. 5033 (1982)； ブ ロ ク , J.、 エ ア , G. M. レ イ バ ー , W. G.、 ウ ォ ー ド , C. W.、 リ レ イ , G. G. ウ ッ ズ , E. F.、 ロ ク ス バ ー フ , C. M. お よ び イ ン グ リ ス , A. S. (1982)「 Ａ 型 イ ン フ ル エ ン ザ ウイルス由来のノイラミニダーゼ（ＮＡ）の大きさ、化学組成および部分配列の研究によ る、ウイルス膜上においてＮＡのＮ末端領域が切断されず、ＮＡをつなぎ止めるのを補助 す る こ と の 解 明 」 Virology, 119, 109∼ 121； ブ ラ ッ ド フ ォ ー ド , M. M. (1976)「 タ ン パ ク 質 − 色 素 結 合 の 原 理 を 用 い る 微 生 物 の タ ン パ ク 質 量 の 迅 速 か つ 鋭 敏 な 定 量 方 法 」 Anal. Biochem. 72, 248∼ 254： ブ ッ チ ャ ー , D. J. (1977)「 ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る イ ン フ ル エ ン ザ 40 ウ イ ル ス 由 来 の ノ イ ラ ミ ニ ダ ー ゼ の 精 製 」 Biochim. Biophys. Acta, 482, 393∼ 399； ブ ッ チ ャ ー , D. J. お よ び キ ル ボ ー ン , E. D. (1972)「 Ｘ − ７ イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 組換え体のＡ２（Ｎ２）ノイラミニダーゼ：分子サイズの決定およびの活性ユニットのサ ブ ユ ニ ッ ト 組 成 」 J. Virol. 10, 60∼ 66； バ ー ネ ッ ト , F. M.、 ス ト ー ン , J. D. (1947)「 ビ ブ リ オ ・ コ レ ラ エ の 受 容 体 破 壊 酵 素 」 Aust. J. Exp. Biol. Med. 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Dis. 1980, 141, 362。 【図面の簡単な説明】 【００８５】 【図１】分泌可能なＮＡ遺伝子の構築およびバキュロウイルス運搬ベクターへのその組込 みのための方策を示す。関連する制限部位のみを示す。一本線は細菌プラスミド配列を示 すが、濃い部分はＨＡ特異的（ベタ塗り）またはＮＡ特異的（点付き）配列を示す。ＨＡ 40 シグナル配列をシングルハッチングで示す。ＮＡシグナル配列／膜アンカー配列をダブル ハッチングで示す。 【図２】正のｃＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列およびＨＡシグナルペプチドとそのＮＡ膜ア ンカーを除去されたＮＡの間の連結部位のフランキング領域のアミノ酸配列を示す。図２ Ａは非切断ＨＡ、詳しくはＡｌａ16とＧｌｎ17間のシグナルペプチダーゼ制限部位（垂直 破線）を含む非切断ＨＡを示す。ＮＡｓの分泌に用いるＮＡ末端セグメントを矢印で示す 。図２ＢはＮＡの「柄」領域を示す。ＮＡｓの構築に必要とされる先端切断配列を矢印で 示す。図２ＣはＡおよびＢからＮＡｓ配列がどのように構築されるかを示す。ここに詳細 に示されるのは、ＨＡ特異的配列およびＮＡ特異的配列間の融合領域である。ＮＡｓはお そらく成熟ＨＡの４個のＮＡ末端アミノ酸で開始し、突然変異コドン（点線の下線）がそ 50 (28) JP 2006-193527 A 2006.7.27 れに続く。 【図３】精製ｐＮＡのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。図３Ａは精製段階の異なるｐＮＡか ら得られるタンパク質サンプルの分析結果である。レーン１はマーカータンパク質を示す ； レ ー ン ２ は 粗 ｐ Ｎ Ａ を 示 す （ １ μ g； ｐ Ｎ Ａ バ ン ド は 検 出 可 能 レ ベ ル 以 下 で あ る ） ； レ ー ン ３ は セ フ ァ ロ ー ス Ｓ に よ る 精 製 物 を 示 す （ １ μ g） ； レ ー ン ４ は ス ー パ ー デ ッ ク ス ２ 3 ０ ０ に よ る 精 製 物 を 示 す （ １ μ g） 。 図 ３ Ｂ に 示 す の は 、 Ｂ Ｓ 法 に よ り 架 橋 し た １ μ gの ｐＮＡの５．０％∼７．５％の勾配ゲルである。レーン１はマーカータンパク質を示す； レーン２は架橋後のｐＮＡを示す。余分のバンドが約１０５ｋｄ（二量体）、約１６０ｋ ｄ（三量体）および約２１０ｋｄ（四量体）に現れている。 【図４】Ｓｆ９細胞に組換えバキュロウイルスを植え付けた後の、酵素活性レベル（○） 10 および総タンパク質濃度（◇）から誘導される、培養培地中に検出される特異的活性（□ ）の時間経過にともなう変化を示す。 【図５】セファロースＱによるアニオン交換クロマトグラフィーを示す。（２０∼６０） ％ の （ Ｎ Ｈ 4 ） 2 Ｓ Ｏ 4 沈 殿 を 溶 解 し 、 透 析 し た 後 、 溶 液 （ ９ ７ ． ５ mgタ ン パ ク 質 、 １ １ ７ , ０００Ｕ）をセファロースＱカラムに通した。出発緩衝液にＮａＣｌを添加して濃度２５ ０ mMへ 向 か う Ｎ ａ Ｃ ｌ の 直 線 勾 配 （ 点 線 ） に よ る 溶 離 を 行 う 前 に 、 非 結 合 物 質 を 洗 い 流 し た 。 溶 出 液 の タ ン パ ク 質 濃 度 を Ａ 2 8 0 （ − ） を 測 定 し て 追 跡 し た 。 ２ ． ５ mlの 画 分 を 集 め 、酵素活性（○）およびＥＬＩＳＡにおいて抗原性活性（△）を試験した。 【図６】スーパーデックス２００によるＮＡｓのゲル濾過を示す。Ｎ−（ｐ−アミノフェ ニ ル ） オ キ サ ム 酸 ア ガ ロ ー ス 分 離 後 の 溶 離 液 （ ２ ． ６ ３ mgの タ ン パ ク 質 、 ４ ９ ， １ ０ ０ Ｕ 20 ） を ２ ． ０ mlま で 濃 縮 し 、 続 い て サ ン プ ル 量 １ ． ０ mlの 画 分 に て 流 速 １ ０ ml／ 時 間 の ス ー パーデックス２００カラムのクロマトグラフィーに付した。Ａ280を継続的に追跡した（ − ） 。 個 々 の 画 分 （ １ ． ０ ml） を 酵 素 活 性 （ ○ ） お よ び 抗 原 性 活 性 （ △ ） を 試 験 し た 。 矢 印は較正タンパク質の溶出液量を示す（本文参照）：４４３ｋｄ（１）、２００ｋｄ（２ ）、１５０ｋｄ（３）、６７ｋｄ（４）および２９ｋｄ（５）。 【図７】精製ＮＡｓのＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を示す。各レーンはスーパーデックス２００ ゲ ル 濾 過 の 特 定 の 画 分 番 号 に 対 応 す る 。 図 ７ Ａ は １ ０ μ lの サ ン プ ル を 変 性 （ β − メ ル カ プトエタノール添加）した後のＳＤＳ／ＰＡＧＥパターンを示す。レーンＡおよびＢはマ 3 ーカータンパク質を示す。図７Ｂでは、タンパク質サンプルをＢＳ で架橋し、続いてＳ ＤＳが存在するけれども非還元的な条件下で、５．０％∼７．５％の勾配ゲルの電気泳動 30 に よ っ て 分 離 し た 。 画 分 ５ ７ ∼ ６ ８ は 、 １ ０ μ lの サ ン プ ル 液 量 ； 画 分 ７ ０ ∼ ７ ７ は ２ ５ μ lの サ ン プ ル 液 量 で あ る 。 四 量 体 の Ｎ Ａ ｓ は 約 ２ ２ ０ ｋ ｄ （ 四 量 体 ） お よ び 約 １ １ ０ ｋ ｄ（二量体）でバンドを形成する。二量体および単量体ＮＡｓは、それぞれ約１１０ｋｄ および約５５ｋｄのバンドとして現れる。 【図８】精製段階の異なるＮＡｓからのタンパク質サンプルのＳＤＳ／ＰＡＧＥの結果を 示 す 。 レ ー ン １ は マ ー カ ー タ ン パ ク 質 ； レ ー ン ２ は 粗 培 地 （ ５ μ g） ； レ ー ン ３ は （ ２ ０ ∼ ６ ０ ） ％ （ Ｎ Ｈ 4 ） 2 Ｓ Ｏ 4 沈 殿 （ ５ μ g） ； レ ー ン ４ は セ フ ァ ロ ー ス Ｑ 精 製 物 （ ２ ． ５ μ g） ； レ ー ン ５ は Ｎ − （ ｐ − ア ミ ノ フ ェ ニ ル ） オ キ サ ム 酸 ア ガ ロ ー ス 分 離 後 の 精 製 物 （ １ μ g） ； レ ー ン ６ は ス ー パ ー デ ッ ク ス ２ ０ ０ ゲ ル 濾 過 後 の 四 量 体 お よ び 二 量 体 Ｎ Ａ ｓ 画 分 （ １ μ g） を 示 す 。 40 【図９】ＮＡ−グルカナーゼ切断およびＳＤＳ／ＰＡＧＥから評価される、ｐＮＡとＮＡ ｓに結合した糖質含量の比較分析を示す。酵素ＮＡ−グルカナーゼは３５ｋｄのバンドと して現れる。図９Ａでは、レーン１はマーカータンパク質；レーン２は非切断ｐＮＡ（１ μ g） ； レ ー ン ３ は Ｎ Ａ − グ ル カ ナ ー ゼ 処 理 し た ｐ Ｎ Ａ （ １ μ g） を 示 す 。 図 ９ Ｂ で は 、 レ ーン１および８はマーカータンパク質；レーン２は非切断四量体ＮＡｓ；レーン３はＮＡ −グルカナーゼ処理した四量体ＮＡｓ；レーン４は非切断二量体ＮＡｓ；レーン５はＮＡ −グルカナーゼ処理した二量体ＮＡｓ；レーン６は非切断単量体ＮＡｓ；レーン７はＮＡ −グルカナーゼ処理した単量体ＮＡｓを示す。 【図１０】ＮＡｓとｐＮＡ間の抗原的な近同一性を説明する。ｐＮＡとＮＡｓのサンプル を等しいタンパク質濃度とし、続いてＥＬＩＳＡにおいて２倍に希釈した。図は特異的抗 50 (29) JP 2006-193527 A 2006.7.27 原に対して測定されたＳ字型の抗原性カーブを示す。ｐＮＡは○；四量体ＮＡｓは◇；二 量体ＮＡｓは□；および単量体ＮＡｓは△で示される。 【図１１】ＮＡｓに対する抗体応答を説明する。各免疫感作後１４日目に（矢印で表示） 、 マ ウ ス か ら 血 液 サ ン プ ル を 採 血 し 、 Ｎ Ａ ｓ 抗 体 の 存 在 を Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ に て 測 定 し た (実 験 詳 細 に つ い て は 本 文 参 照 )。 ベ タ 塗 り バ ー お よ び ハ ッ チ ン グ バ ー は 、 そ れ ぞ れ ワ ク チ ン 接 種 お よ び 対 照 動 物 の 平 均 血 清 力 価 (± Ｓ ． Ｄ )を 表 す 。 【図１２】ホモ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは点線；ＢおよびＣでは黒 三角］および対照マウス［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］を２０ ＬＤ50のホモ変異， マウス順応Ｘ−４７ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録し、直腸温度（Ｂ ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡した（実験詳細については 10 本文参照）。データ点は平均値±Ｓ．Ｄで得る。 【図１３】ヘテロ変異体防御を示す。ワクチン接種マウス［Ａでは点線；ＢおよびＣでは 黒三角］および対照マウス［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］を２０ ＬＤ50のヘテロ変 異，マウス順応Ｘ−３１ウイルスにチャレンジさせた。生存率（Ａ）を記録し、直腸温度 （Ｂ）および体重（Ｃ）を測定することによって感染の進行を追跡した（実験詳細につい て は 本 文 参 照 ） 。 デ ー タ 点 は 平 均 値 ± Ｓ .Ｄ で 得 る 。 【図１４】受動免疫感作による防御を示す。ＮＡｓ免疫血清［Ａでは点線；ＢおよびＣで は黒三角］および対照血清［Ａでは−；ＢおよびＣでは黒丸］の腹腔内注射によってマウ スのグループを受動的に免疫感作した。２４時間後に、マウスは２０ ＬＤ50のマウス順 応Ｘ−４７ウイルスへのチャレンジを受けた（実験詳細は本文を参照）。生存率、直腸温 20 度 お よ び 体 重 を そ れ ぞ れ Ａ 、 Ｂ お よ び Ｃ に 示 す 。 デ ー タ 点 は 平 均 値 ± Ｓ .Ｄ で 得 る 。 【図１５】ＡＯＸＩプロモーターおよびターミネーター配列に加えて、ピチア・パストリ スのＨＩＳ４マーカーおよびサッカロミセス・セレビシアエのα因子遺伝子のプレプロ分 泌シグナルを含むプラスミドｐＰＩＣ９の模式図を示す。多重クローニング部位は分泌シ グナルの後に位置する。 【図１６】プレプロ分泌シグナルとノイラミニダーゼの組換え「帽子」部分の間の融合領 域である。「ＫＥＸ２」は、後期ゴルジ体において外来性ＫＥＸ−２プロテアーゼによっ てプロペプチドが切断される位置を示す。（Ｇｌｕ−Ａｌａ）2ジペプチドはＳＴＥ１３ 型のジペプチジルアミノペプチダーゼによって除去される。チロシン残基はノイラミニダ ーゼ由来ではないが、除去されない。次のプロリンはＸ−４７ノイラミニダーゼの７９位 に一致する。 【図１７】個々の形質転換体の５個の培地サンプルについての１２．５％ポリアクリルア ミドゲルのウエスタンブロットである。レーン１は非形質転換体のピチア・パストリス株 の 培 地 サ ン プ ル を 含 む 。 Ｔ Ｃ Ａ で 沈 殿 し た 培 養 培 地 １ ml中 の タ ン パ ク 質 マ テ リ ア ル を レ ー ン毎に展開した。 30 (30) 【図１】 【図２】 【図３】 【図４】 【図６】 【図５】 【図７】 JP 2006-193527 A 2006.7.27 (31) 【図８】 【図１０】 【図９】 【図１１】 【図１２】 JP 2006-193527 A 2006.7.27 (32) 【図１３】 【図１４】 【図１５】 【図１６】 【図１７】 JP 2006-193527 A 2006.7.27 (33) JP 2006-193527 A 2006.7.27 フロントページの続き (72)発明者 ヴァルター・シャルル・フィールス ベルギー、ベー−９０７０ デステルベルゲン、ビューケンドレーフ３番 (72)発明者 トム・マリア・デロー ベルギー、ベー−８５２０ クールネ、レイクスヴェーグ５番 (72)発明者 ヴィリー・アルフォンス・ミン・ジョウ ベルギー、ベー−９０７０ デステルベルゲン、ヤーガースストラート１１番 Ｆターム(参考) 4B024 AA01 BA12 BA31 CA01 CA11 DA02 DA05 DA12 EA04 FA02 FA07 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 4C085 AA03 BA55 DD06 DD24 DD62 EE01 FF24 GG01