alamarBlue Cell Viability Reagent

alamarBlue®Cell Viability Reagent
Catalog nos. DAL1025, DAL1100
Table 1. Contents and storage information.
Material
®
alamarBlue Reagent
Amount
25mL (Cat. No. DAL1025)
100mL (Cat. No. DAL1100)
Concentration
10X, ready-to-use
solution
Storage*
Stability
• 2-8˚C
• Protect from light
When stored as directed
this kit is stable until the
expiration date printed on
the product.
アッセイの数：下記のプロトコルに基づき、カタログ番号DAL1025については25枚（2,500アッセイ）のマイクロプレート、カタログ
番号DAL1100については100枚（10,000アッセイ）に十分な試薬が提供されています。
励起波長/蛍光波長：540-570/580-610 nm。モノクロメーター機器を使用する場合、560/590 nmを使用する。最大励起/蛍光波長
は、570/585 nmです。
吸収極大：570 nm(さらに、参照として600 nmをモニタリング)。
イントロダクション
細胞の健康状態は、多数の方法によってモニターすることができます。細胞膜の完全性、
DNA合成、DNA量、酵素活性、ATPの存在および細胞の酸化・還元状態は細胞の生存能力
および細胞死に関する既知の指標です。alamarBlue®生細胞試薬は、生きている細胞の還元
力を利用して、ヒトや動物、細菌、植物ならびに菌類といった様々な細胞系の増殖を定量的に
測定し、細胞の健康指標として様々な化学物質の相対的細胞毒性評価の確立を可能にしま
す。細胞が生存している場合、そのサイトゾル内は還元環境が維持されています。レサズリン
(alamarBlue® Reagentの有効成分)は青色で、ほとんど蛍光がなく、ほとんど毒性もない細胞
透過性化合物です。細胞内に入ったレサズリンは、赤色で強い蛍光を発するレゾルフィンに還
元されます（図1）。生細胞内ではレサズリンはレゾルフィンに変換され続け、その細胞周囲の
全体的な蛍光と色が強まります。
alamarBlue®生細胞試薬は、10Xのready-to-use溶液を培地中の哺乳類または細菌の細胞
に添加するだけで、細胞の生存率を評価できます（図2）。培地を除いたり最少培地に交換す
る必要がない場合、alamarBlue® Reagentは「no wash」でシングル・チューブまたはマイクロ
タイタープレートフォーマットで使用できます。サンプル量の10%のalamarBlue® reagentを加
えた後（すなわち、100 µｌサンプルに対して10 µｌのalamarBlue® reagentを添加）、37℃で1-4
時間インキュベートするだけです。細胞の健康を損なうことなく感度を上げるにはインキュベー
ション時間を長くします（図3およびよくある質問参照）。その後、蛍光をプレートリーダーまたは
蛍光分光光度計で蛍光を測定します。もう一つの測定方法としては、alamarBlue® Reagent
の吸光度を分光光度計で測定することもできます。測定後、化合物濃度に対して蛍光強度（あ
るいは吸光度）をプロットして結果を分析します。
Revised: 16-July-2008 | MP 01025
alamarBlue® reagentは、96-ウェルプレートの1ウェルあたりわずか50個の細胞でも検出
できます。alamarBlue® reagentの感度を評価するために、ブラッククリアボトム96ウェルプ
レートでHUVEC細胞の段階希釈を行いました。次に、細胞へalamarBlue® reagentを添加
し、40分後および18時間後に蛍光を計測しました。40分後、alamarBlue® reagentの蛍光
強度は500-50,000細胞の範囲で細胞数に比例していました。18時間後、alamarBlue®
reagentの蛍光強度は、50-5,000 細胞の範囲で細胞数に比例し、より高感度な検出につ
ながっていました（図3）。
蛍光発光 …(
吸光
)
(
)
図1A. alamarBlue®は、レサズリンからレゾルフィンへの変換によって細胞の生存率およ
び増殖の指標として機能する。レサズリン(非蛍光性化合物)は、代謝活性の高い細胞の
還元反応を利用して赤色蛍光性のレゾルフィンに変換される。産生される蛍光量は、生
細胞の数に比例している。
波長(nm)
図1B.レゾルフィンの吸光度および蛍光波長スペクトル
37℃で1～4時間
alamaBlue®
reagent
1)細胞に試薬を
加える
2)インキュベート
する
3)蛍光(あるいは吸光
度)を測定
4)データを処理する
図2. alamarBlue®細胞生存率アッセイプロトコル 細胞および被験化合物を含んでいる96ウェルプレートを標準的な方法で調製する。alamarBlue® reagentを直
接各ウェルに加え、37℃でインキュベートし、細胞の代謝活性によりレサズリンをレゾルフィンに変換させ、その蛍光(あるいは吸光度)を測定します。化合物濃度に
対して蛍光（あるいは吸光度）シグナルをプロットして結果を評価する。ここでは96 ウェルプレートでのアッセイについて記載するが、このプロトコルは他のフォーマ
ットにも簡単に適応できる（384 ウェルプレートおよび様々な容量のチューブなど）。チューブを使用する場合、サンプルを光学的分析の前にキュベットに移す。
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A
B
蛍光強度
蛍光強度
細胞/ウェル
細胞/ウェル
図3. HUVEC細胞に対するalamarBlue® reagentの直線性および感度。A) alamarBlue® Reagent試薬と細胞を40分インキュベーションした場合、~500～5万細胞
の範囲において直線性の関係を持つ。B) 同じ96 ウェルプレートの細胞をインキュベーションの18時間後に測定し、alamarBlue® reagentの感度を示す。~450 RFU
での水平線は実験中のバックグラウンドの蛍光を示す。これは”no cell”コントロールの標準偏差の3倍と計算された。.差し込みグラフは、細胞をreagentと18時間イン
キュベートした後、50～5000細胞/ウェルの範囲で直線性を持つことをであることを示している。エラーバーは、±SEMとして示している。
alamarBlue®Reagentの利点
alamarBlue®アッセイは、従来の分光光度的または放射性細胞毒性アッセイよりも次の点で優れ
ています：
短時間：ready-to-use、添加し測定するだけの形式は、サンプル処理ステップを減らします。
複数のフォーマット：真核生物または原核生物細胞、シングルチューブまたはマイクロタイタープ
レートアッセイ、蛍光または吸光度測定機器を使ってもデータを記録することができます。
エンドポイントまたはカイネティック測定：細胞生存または化合物毒性の分析のためにエンドポイン
トまたはカイネティックアッセイを行えます。
便利：96または384ウェルフォーマットでのハイスループットスクリーニングにも適したready-to-use
溶液として販売してます
マルチプレックス化： 生存指標として核酸を検出するためのCyQUANT® NF Cell Proliferation
Assay Kit（カタログ＃C35006）等、その他のアッセイ方法とのマルチプレックス化に対応していま
す（図4）。
注記：使用される細胞タイプに基づいて、CyQUANT® NF Cell Proliferation Assay Kitとマルチプ
レックス化できるかどうかを検討する必要がある場合もあります。
安価：インビトロジェンのalamarBlue® Reagentは、5Xではなく、10Xとして処方されており、競
合他社製品の倍のアッセイができます。
安全：非毒性試薬は細胞の代謝および生存1のリアルタイムモニタリングを可能にし、有害な溶剤
を使用せず、シンチレーションカクテルおよび放射性廃棄物を処分する必要がありません。
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A
B
蛍光強度
蛍光強度
Tamoxifen (Log M)
Tamoxifen (Log M)
C
蛍光強度
Tamoxifen (Log M)
図4. alamarBlue® ReagentのCyQUANT® NFとのマルチプレックス化 A) alamarBlue® reagent B) CyQUANT® NFまたはC) alamarBlue® reagentおよび
CyQUANT® NF。 それぞれの試薬を添加する前にHepG2 細胞をTamoxifenと24時間インキュベートした。alamarBlue® Reagentはその他の細胞毒性指標とマル
チプレックス化でき、それでもなお正確な結果が得られることがIC50値から実証されている。
開始する前に
ご用意いただくもの
• 適切な培地で培養された哺乳類または細菌細胞
• 適切な96または384ウェルプレート
• オプション：3% SDS 含有リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4
細胞の準備 哺乳類細胞 - 接着細胞：アッセイを始める前に、細胞培養フラスコまたはディッシュに哺乳
類細胞をプレートし、37℃、5% CO2で約 4-24 時間接着、増殖させます。
哺乳類細胞 – 浮遊細胞：細胞培養フラスコまたはディッシュに哺乳類細胞をプレートし、細
胞を直ちにアッセイに使用するか、アッセイを始める前に、37℃、5% CO2で最大24時間増
殖させます。
細菌細胞：詳細は、参考文献2および3参照。
®
注記 • alamarBlue Reagentは複数回の凍結/融解に対して安定であり、凍結させても活性への
影響はありません。
• よくある質問（6ページ）もご参照ください。
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・alamarBlue® reagentでアッセイできる細胞タイプは、哺乳類、細菌2（バイオフィルム
含む3）、植物4、魚類細胞5などです。また、alamarBlue® reagent は初代細胞5の他、
HepG2 などの肝細胞でもテストされています。
一般的なガイドライン
• 必ず適切なコントロールを実施してください。実験誤差を最小にするために、実験サン
プルと無細胞コントロールサンプルを最低4-8回反復した測定値をとることを推奨しま
す。
• 各細胞の種類についてalamarBlue® アッセイのプレーティング密度とインキュベーシ
ョン時間を決定し、アッセイが直線性をもつ領域内であるような条件を使用する必要
があるかもしれません。
• インキュベーション時間を長くする（一晩）場合、試薬添加中およびインキュベーション
中の無菌状態を必ず維持し、微生物による汚染を避けて下さい。汚染微生物も
alamarBlue® Reagentを還元するので、汚染された培養物は誤った結果につながり
ます。
• ウシ胎児血清(FBS)および牛血清アルブミン(BSA)は蛍光を消光させる可能性があり
ます。これを確認するため、コントロールにも同じ血清濃度を用いることを推奨しま
す。フェノールレッドのような他の培地成分は、アッセイに影響をあたえません。
実験プロトコル
alamarBlue®Cell Viability
プロトコル
オプション：alamarBlue®cytotoxicityアッセイを行う前に、細胞を被験化合物で24-72時間処
理します。
1.1 表2に示すように培養液に対して1/10量のalamarBlue® Reagentを加えます。
表2. アッセイ量
フォーマット
Cuvette
96-well plate
細胞+培地の量
添加する10XalamarBlue®の量
1 mｌ
100 µｌ
100 µｌ
10 µｌ
40 µｌ
4 µｌ
384-well plate
1.2 遮光し、細胞培養インキュベーターで37℃、1～4時間インキュベートします。
注記：より長いインキュベーション時間にすると検出感度が向上します。細胞数の少ないサン
プルについては、最大24時間までインキュベーション時間を延ばすことも可能です。
1.3 蛍光または吸光度を使って次のように測定します：
蛍光：540-570 nmの励起波長を用い(最大励起波長=570 nm）、580-610 nmの蛍光を測
定する (最大蛍光波長=585 nm)。
吸光度：600 nmをリファレンス波長（600 nmの値で標準化）として使い、alamarBlue®の吸
光度を570 nmでモニターする。
注記：蛍光測定のほうが高い感度が得られます。蛍光測定機器が使えない場合、
alamarBlue® Reagentの吸光度で測定します。アッセイプレートまたはチューブはホイルに
包み、4℃で保管すれば、蛍光または吸光度に対する影響がなく1～3日まで測定することが
できます。
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1.4 オプション：反応を停止するために、50 µｌの3% SDSをalamarBlue® reagent中の細胞
100 µLに直接加えます。
データ処理
蛍光
2.1 被験化合物の濃度に対して蛍光強度をプロットします。
2.2 オプション：実験ウェルの蛍光値から細胞培養培地のみ（バックグラウンド）の平均蛍光値
を減じます。
吸光度
2.3 実験ウェルの570 nm吸光度の値から、細胞培養培地のみ（バックグラウンド）の平均
600 nm吸光度を減じます。
2.4 バックグラウンドを差し引いた570 nm吸光度を被験化合物の濃度に対してプロットします。
他のアッセイ方法との
比較
alamarBlue® reagentは他の細胞生存率および増殖アッセイと比較試験されており、同様
の薬理データをもたらすことが示されてます（図4、5）。
FAQ：
一般的な質問
Q：alamarBlue®はどのように機能しますか？
A：健康な生細胞のサイトゾル内は還元状態を維持してます。細胞のこの「還元能力」は
alamarBlue® reagentを検出可能な蛍光(あるいは吸光性)物質に変換します。
Q：alamarBlue® reagentには毒性がありますか？
A：いいえ。alamarBlue® reagentはサンプルとユーザーの両方に対して安全な毒性のない
試薬です。
Q：alamarBlue® reagentは溶解する必要がありますか？
A：いいえ、alamarBlue® reagentは、10Xのready-to-use溶液です。
Q：浮遊細胞でもalamarBlue® reagentは使えますか？
A：はい。alamarBlue® reagentは接着および浮遊哺乳類細胞に使用可能です。
Q：細菌など、哺乳類以外の細胞でalamarBlue® reagentは使えますか？
A：はい。alamarBlue® reagentは細菌2および植物細胞4でも試用できることがわかってます。
Q：alamarBlue® reagentは市販されているものの中では最も高価ではないですが、それは
他の試薬ほど機能しないということですか？
A：実際にはalamarBlue® reagentは他のより高価な細胞毒性試薬に匹敵することが多い
です。比較データは図5を参照してください。
Q：alamarBlue®は吸光または蛍光測定なので、発光製品ほど感度はよくないのですか？
A：alamarBlue® reagentは、96 ウェルプレートの一つのウェルで50未満の哺乳類細胞を
検出するのに十分な感度があります。詳細は表3と図3を参照してください。
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保管に関する質問
Q：もしalamarBlue®原液reagentを一晩室温で放置したらどうなりますか？
A：室温(~22ºC)で保管した場合、reagentは12ヶ月までは安定です。
Q：うっかりalamarBlue®原液reagentを凍結してしまったが、まだ使えますか？
A：はい。alamarBlue® Reagentは、複数回の凍結/融解の繰り返しに対して安定です。必
ず使用前にreagentを37℃のウォーターバスで加温、撹拌し、均質な溶液になるようにし
て下さい。
Q：alamarBlue® reagentを光から保護する必要がありますか？
A：はい。alamarBlue® reagentは光にさらされると、時間とともに非常にゆっくりと蛍光物質
に変換され、高いバックグラウンド値につながります。遮光して試薬を保管して下さい。
方法に関する質問
Q：alamarBlue® reagentの場合、細胞の最適なインキュベーション時間および温度は？
A：37℃で1-4時間alamarBlue® reagentと細胞をインキュベートさせます。少ない細胞で検
出感度を上げるには、インキュベーション時間を最大24時間に延ばします。詳細は図6参照
してください。
Q：alamarBlue® reagentと細胞を一晩インキュベートさせてもいいですか？
A：はい。しかし、細胞密度の高いサンプルからのシグナルが飽和する可能性もあり、これは
試薬の直線性がプラトーに達したことを意味します。こうなった場合、インキュベーション時間
を短縮して下さい。
Q：蛍光を読みとるのに適した機器がない場合は？
A：細胞生存率および増殖によりalamarBlue® reagentの吸光度も変化するので、600 nm を
リファレンス波長として用いて570 nmでreagentの吸光度を測定して下さい。
Q：alamarBlue®は完全にエンドポイントアッセイですか？
A：いいえ。alamarBlue®は細胞集団のエンドポイントアッセイに使用できますが、この
reagentはリアルタイムで細胞の生存と増殖を継続的に測定するのにも使うことができま
す。alamarBlue® reagentは非毒性なので、reagentと細胞をインキュベートさせ、同じサン
プルで長期的に蛍光(あるいは吸光度)を観察できます。
トラブルシューティングに関する
質問 Q：高いバックグラウンド蛍光値の問題点は？
A：露光のため、reagentが分解しているかもしれません。alamarBlue® Reagentは必ず暗
所で保管し、長期間reagentを直射日光に曝さないようにして下さい。
Q：なぜ蛍光強度が低いのですか？
A：alamarBlue® reagentとの細胞のインキュベーション時間を延ばし、機器の「gain」設定を変
更し、機器のフィルター/波長設定をチェックして下さい。トラブルシューティングのため、ポジテ
ィブコントロール（生細胞）を必ず用意して下さい。
Q：蛍光値が高く、機器の線形範囲を超えている場合はどうすればよいですか？
A：インキュベーション時間を短縮するか、または実験に用いる細胞の数を減らしてみて下さ
い。
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References
1.Invest Ophthalmol Vis Sci 38, 1929 (1997); 2.Infect Immun 65, 3193 (1997); 3.J Antimicrob Chemother 57, 1100 (2006);
4.Phytochem Anal 12, 340 (2001); 5.Anal Biochem 344, 76 (2005).
発光強度
蛍光強度
Tamoxifen (LogM)
図5. alamarBlue® reagent とCellTiter® Gloの比較 細胞毒性アッセイを行う前にHUVEC細胞をTamoxifenで24時
間処理した。メーカーの使用説明書に従い、alamarBlue® (AB) およびCellTiter® Glo (CTG)アッセイを行った。
alamarBlue®アッセイは、CellTiter® Gloの何分の１かのコストでほぼ同様の結果をもたらした。
表3. 96ウェルプレートにおけるalamarBlue® Reagentの検出限界。
検出限界*
Cell Line
40分
3時間
一晩
(18 時間)
HASmC (primary)
~195
<48
<48
HUVEC (primary)
~781
<48
<48
HPAEC (primary)
~390
<48
<48
HEK 293
~390
~390
<48
HepG2
~1563
~195
<48
SH-SY5Y
~1563
<48
<48
* 単位は、細胞数/ウェル
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蛍光強度
蛍光強度
細胞/ウェル
細胞/ウェル
蛍光強度
細胞/ウェル
図6. alamarBlue® Reagentでの蛍光シグナル生成に対するインキュベーション時間の影響。異なる細胞密度で、SH-SY5Y細胞を96-Well Platesにプレートした。
alamarBlue® Reagentはプレートに加えられ、A）3時間、B）19時間、C）3時間と１９時間、37ºCでインキュベートされ、ウェル、N =、±SEM 4について細胞の少数で
働く場合にalamarBlue®感度の差が示すために再プロットされた。
製品リスト (価格は弊社ウェブサイトもしくは弊社営業部までお問い合わせください)
Cat.
Product Name
Unit Size
®
DAL1025 alamarBlue cell viability reagent, 10X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
25 mL
®
DAL1100 alamarBlue cell viability reagent, 10X
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mL
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