閾値の検討に関する共同研究 - MMS

2016.06.17
JEMS・MMS研究会
第68回定例会
提案
「変異原物質の閾値に関する共同研究」
須藤 鎮世（就実大学）
捏造された直線閾値なしモデル
（Linear no-threshold model = LNT）
1928: MullerはX線が突然変異を起こすことを発見
1934: 国際放射線防御委員会（ICRP)閾値：500 mGy/年
1945: 広島・長崎に原子爆弾投下
1946: Mullerにノーベル賞、閾値なし！と断言
石油成金のロックフェラー財団とマラーの結託
1954: 米国科学アカデミーに遺伝学委員会設置
まともな議論なし、データなし
グラス：閾値なしモデルは実験データがなく主に
ヒット説に基づいている
1956: 直線閾値なしモデルを勧告し、根拠の提示を拒否
Muller自説を通すためには誇大・歪曲を辞さな人、
優生学の信者、精子銀行の創設者
直線閾値なしモデルの捏造の根拠
1. Mullerはノーベル賞受賞講演前に「閾値あり」の論
文を読んでいた。しかし、閾値なしと宣言
2. 遺伝学委員会の16名の委員のうち12名の遺伝学者に
宿題：全アメリカ人に0.1 Svを照射したら何人の子
供に変異が生じるか？ 3人回答辞退、9名が回答
ばらつき大 → 小さな値の3名分を削除、6名分採用
3. 6名分は5,000,000前後で一致、差は1桁という
範囲：500,000〜50,000,000
実際の値：100,000〜200,000,000
(広島・長崎の結果：遺伝的影響はなし）
4. その他、閾値なしモデルを支持する実験データ無し
原爆被爆者について行なわれた遺伝調査
① 出生時の障害
② 性比
③ 染色体異常
77,000人（1948－1954）
140,000人（1948－1966）
16,000人（1967－1985）
④ 生化学的タンパク質調査
⑤ 死亡率調査
⑥ DNA調査
⑦ 臨床健康調査
23,000人（1975－1984）
80,000人（1946－継続中）
1,000家族（1995 - 継続中）
10,000人（2002－2006：継続中）
被曝による遺伝的影響は検出されない
直線閾値なしモデルの化学発癌への転用
1.1956年6月12日、直線閾値なしモデルの勧告
（ショウジョウバエの生殖細胞で実験）
Anonymous. Science, 123, 1157–1164, 1956.
2. 1956年6月13日、New York Times 1面トップで報道
(ロックフェラー財団の所有）
3. 1958: The National Council of Radiation
Protection and Measurement (NCRPM) 、放射線によ
る発癌（体細胞）に 直線閾値なし仮説を採用
4. 1958: FDA, Delaney Clause デラニー条項を制定。
食品中に発癌性物質の使用/検出されてはならない
→ このゼロリスク法案は1996年に廃棄
5.1972: EPA：発癌剤に閾値なしを適用した。同時に
リスク-ベネフィットの考えを導入、今日に至る
時計文字盤作業女工の骨肉腫
米国科学アカデミーの直線閾値なしという主張
0.1 Sv以下を一纏め（統計的まやかしの手段とか）
算数メモリ(低線量を矮小化）
2 Svまでの表示(問題は＜100 mSv、Downturnを隠蔽）
直線より直線-2次曲線がよく合致
被爆者の生涯調査がLNTという主張
3 Svまでの表示(Downturnを隠蔽）
直線より直線-２次曲線が合致
低線量では信頼限界の外
放射線影響研究所:生涯調査のベイズ法による新分析
シグモイド曲線、Downturnの顕現、閾値、ホルミシス、
0.4 Gy以下で7/12点が信用限界の内 (LNTでは1点）
自然放射能
寿命短縮
寿命延長
原虫ではγ線で増殖が促進
ハエではγ線1 Svが閾値
Mullerの閾値なしは誤り
マウスのγ線生涯照射で自然
線量の170-1,700倍なら長生き
放射線照射で
ホルミシスの例
広島・長崎の被曝者の
白血病では閾値が設定
でき、それは約 1 Sv
広島・長崎の被曝者の固形癌
では投下後に入市した者Bより
頻度が低く、入市者Bはさらに
対照群 Aより頻度が低い
アメリカにおける室内ラドンレ
ベルと肺癌は逆相関を示し、
LNT
とは相反する。
ホルミシスが見られる。
線量・線量率で
左右に振れる
ホルミシスは種々の生物、種々の現象（増殖、遺伝毒性、
寿命、発癌などで見られる：生体防御機構の一環だろう
放射線の影響の主体は活性酸素(ROS)の発生
生体には防御機構（ROS消去、DNA修復、アポトーシス、
免疫機構）で対処できる＝適応応答(ホルミシス）
免疫機構で記憶細胞が抗原刺激を記憶するように、
ホルミシスではエピジェネティックに記憶か？
適応応答(ホルミシス）はどのような時に見られるのか
1. 低用量では有益(+)、高用量で有害（ー）な反応
2. 低用量の前処理で、次の高用量には耐性が増す
3. A物質で前処理で、次のB物質処理に耐性が増す
直線閾値なしモデルはどんなに微量でも有害と規定、
反応は必ず0点より上の右上がり直線を想定する
放射線ホルミシスがある
化学ホルミシスもある
変異原ホルミシスを検討しよう
in vitro 小核ホルミシスを検討しよう
用量設定のため細胞毒性試験で検証しよう
直線閾値なしモデルは変異原や発癌剤に適用でるか？
実験例： 細胞毒性試験 (150203)： 同仁試薬
HeLa S3細胞、5,000 cells/50 μL well、50 μL の被験物質
処理、96 well plate使用、3 wells/dose、24時間後、同仁試
薬 （Cell Counting Kit-8 ）10 μL 添加、37℃、2 hr 保温
マイクロタイタープレートリーダーーで450 nmの吸光度測定
最大無作用量NOAELの濃度を決める目的であるが、
低濃度で、細胞増殖の刺激が見られる：ホルミシス
試験法概略（in vitro小核）第一三共、五十嵐美由紀
細胞
培地
培養容器
CHU/IU
10%FBS添加MEM
6 cm 培養皿
TK6
10%FBS添加RPMI1640
パルス処理：15 mL 培養
チューブ
連続処理:25 cm2 フラスコ
細胞計測（例） ・血球計算盤
（共通）
・ATP assay (ルミテスター、キッコーマン㈱）
・トリパンブルー排除法による画像解析
（Vi-CELL、ベックマンコールター：電気インピーダンス）
毒性評価の方法 RCC, RICC, RPD（計画書参照）
処理時間
代謝活性化6 h
代謝活性化3 h
非代謝活性化6 h
非代謝活性化3 h
非代謝活性化24 h 非代謝活性化
RCC: Relative cell count
RPD: Relative population doubling
RICC: Relative increase in cell count
試験法概略（in vitro小核）田辺三菱製薬、武藤重治: 1-CHU/IU
細胞
培地
培養容器
CHU/IU
10%FBS添加MEM
10 cm 培養皿
24 well プレート
細胞計測（例） ベックマン・コールター Multisizer3またはZ1）
毒性評価の方法 相対細胞増殖率（RICC）
処理時間
非代謝活性化 6 + 20 h
非代謝活性化 26 h
陰性対照：DMSO, 生食、蒸留水、陽性対象： MMC, Col
培地：445 mL MEM、50 mL FBS、5 mLのKM液
播種：4×104 cells/mLの細胞懸濁液を0.5 mL/well (24 well plate）
処理液組成： DMSO使用、792 μL培地+8 μL被験物質液→500 μL使用
生食・水、720 μL培地+80 μL被験物質液→500 μL使用
試験法概略（in vitro小核）田辺三菱製薬、武藤重治 : 2-TK6
細胞
培地
培養容器
TK6
10%ウマ血清添加RPMI1640
75 cm2フラスコ
24 well プレート
細胞計測（例） ベックマン・コールター Multisizer3またはZ1）
毒性評価の方法 相対細胞増殖率（RICC）
処理時間
非代謝活性化 4+22 h
非代謝活性化 26 h
陰性対照：DMSO, 生食、蒸留水、陽性対象： MMC, Col
培地：435 mL RPMI1640 、50 mL HS、5 mLのPC/SM液、5 mL Napyruvate （100 mmol/L)、5 mL L-glutamnine （200 mmol/L)
播種：4×105 cells/mL for 4+22 h、または3×105 cells/mL を0.5
mL/well (24 well plate）で播種する
処理液組成：DMSO使用、735 μL培地+15 μL被験物質液→500 μL使用
生食・水、600 μL培地+150 μL被験物質液→500 μL使用
試験法概略（CytB使用in vitro小核）食薬センター、山影康次
細胞
培地
培養容器
CHU/IU
10%CS添加MEM
6 cm 培養皿
TK6
10%FBS添加RPMI1640
パルス処理：15 mL 培養
チューブ
連続処理:25 cm2 フラスコ
細胞計測（例） ・血球計算盤？
（共通）
・ベックマンコールター？
毒性評価の方法 Replication Index（RI）＋
処理時間
詳細は略
非代謝活性化28* h 非代謝活性化の場合**
*
1.2×104個/mLの細胞懸濁液とし、5 mL（6×104個）/皿、2日後に実験
連続28 h with CytB (3 μg/mL)
** 14×104個/mL 、最終細胞密度：約10×104個/mL、詳細は略
＋ RI
=処理群[（2核細胞数＋2x多核細胞数）／全細胞]/対照群 x 100
試験法概略（in vitro小核）ビー・エム・エル 、関
細胞
培地
培養容器
博
CHU/IU
10%CS添加MEM
継代 25 cm2培養フラスコ
処理 6 cm 培養皿
細胞計測（例） ・播種 血球計算盤
・処理 細胞計数-ScepterTM2.0
毒性評価の方法 RICC 相対的細胞数増加
（Relative increase in cell count）
細胞計数装置 ScepterTM2.0 -319-905 PHCC20060 .......... ¥198,000
マイクロピペット感覚で細胞の計数が可能
わずか50 Lのサンプルで手軽に細胞の濃度管理が可能
計数方式には電気的検知帯法(コールター法)を採用
測定可能細胞数：10,000~500,000個/mL
3-319-901 計測チップ(50枚入)PHCC60050.................... ¥19,800
試験法概略（in vitro小核）武田薬品、橋本 清弘
細胞
培地
TK6 （ATCCより購入）
10%ウマ血清添加RPMI1640
Na-pyruvate 2 mM、PC/SM 100 U/mL final
培養容器
6ウェルプレートに 3 mL/mLの細胞懸濁液
（1×105cells/mLに調整）を播種
細胞計測（例） コールターカウンター
コールターカウンター使用不可の時、血球計算盤
毒性評価の方法 ICHS2Rガイドライン：Relative Population
処理時間
非代謝活性化3 h処理、21 h回復
非代謝活性化24 h処理
試験法概略（in vitro小核）花王、大士
細胞
CHL/IU
コメント：ホルミシスにp53が関与している可能性を考えるので
あれば、CHLよりもp53コンピテントなTK6細胞が良いかもしれません
培地
MEM with 10%FBS
培養容器
6 well plate
細胞計測
全自動細胞カウンター TC20 (BioRad社)
毒性評価の方法 RICC：Relative increase in cell count
処理時間
代謝活性化 6 h
+ 18 h回復
非代謝活性化 24 h
TC20
試料：10 μL
哺乳動物細胞を30秒でカウント
オートフォーカス付き顕微鏡
6～50μmの細胞径の細胞をカウント
5X104～1×107 cells/mL の濃度範囲に対応
変異原物質の閾値に関する共同研究の提案
In vitro小核試験の前段階として、用量を決める
このとき、細胞増殖を指標としたホルミシスを検討する
低用量では有益(+)、高用量で有害（ー）な反応は？
できるだけ簡単な系を用いる
・非代謝活性化、連続処理を行う
・CHLを用いる（要すればTK6細胞を用いる）
・ 細胞播種24時間後に、被験物質で24時間処理した後、
細胞数を数える
自分で最もやりやすい方法を用いる （要議論）
・ 播種細胞数の測定（例：血球計算板）
・ 細胞増殖の測定(生化学的、コールター、、、）
被験物質として同一MMCを用いる（要議論）
納得のゆくまで実験を繰り返し、濃度を絞り込む
参加希望者/思案中の方
＜2016年6月18日（土）＞
8:00～8:30 フリータイムにご参集ください
（場所は追って連絡）
45回JEMSで発表予定ですので、参加希望者は和文・英文
の氏名、所属を用意してください
発表は共同研究の趣旨と締め切りまでに得られた
予備データなどで適宜、構築します。
A proposal for a collaborative study of thresholds in
mutagenesis and some preliminary supportive data
revealed by cell growth as an indicator
皆様の積極的なご参加を期待します