ファイルを開く

Departmental Bulletin Paper / 紀要論文
蛍光光度法による珪藻の増殖速度の測定
野呂, 明美
技術官等による技術報告集. 1996, 4, p. 37-40.
http://hdl.handle.net/10076/9926
蛍光光度 法 によ る珪 藻
の
増殖速度 の 測定
野呂明 美
は じめ に
の
今 年4 月 よ り
効 果｣
( 卒研 生
シス テ ム 制御研 究室の 卒論 テ
,
中 谷)
:
ッ
フ と して 取 り 組 む こ と に な
の
生 長 曲線 を 作 成 した
,
蛍光 光 度法 に よ る 珪 藻
あ る 葉緑体 の
,
チラ
す る こと に よ り
細 胞の 平 均 世 代時間
gr
o v
t h)
から
,
イ ド膜 に 存 在 す る
比 増殖速度
,
い て
つ
実験 試 料 お よ び 装 置
ン
ク ト
ン よ
種頬 に
然
の
つ
紹介す る
い て は
ロ
-
ャ
,
,
u
ッ
短所
.
水 産微生物
.
い
た (野 生株
N
a
NO
N
a
rI
N
a
2
4
SiO
3
e
O
F
e
C1
3
栄養 剤を添加 して調 整 し
N
a
培 地は
.
.
.
ス キ
ャ
ビ ネ
"
.
ト内部
ッ
㈱ 日 本医 化 器 械 製 作
トN C 1 2 2 0 - S に よ り
86
.
4
E/
LL
20 ℃
.
2
m
/
s
)
時 期1 0 時 間 の サ イ ク ル で 静 置 培 養 し た
昼
,
,
･
2H
2
0
O
0
3
2
2 E D T A
T
r
i
30
' '
s
u
l
s
i
m e
S- 3
Vit
a n
S
W
e r
a
a
t
b
P -1
e
t
a
L
Ff
e r
n s
-
P -I
*
C
n
Cl
Z
□
C1
C
o
C1
C
u
C1
-P
Ni
c o
-A
Bi
ャ
ビネ
ッ
ト内 で 培 養 中
の
珪藻
37 一
a m
a
p
キ
-
.
.
組 成
O
m
ト
t
1
n
川
2
m
M
LJ
M
0
〟
M
O
IL
M
.
.
50 0
m
g
10
m
l
2
l OO O
7
.
Vi t
ス
.
-
p円
.
m e t a
l
1
【
コ
m
l
O
m
M
m
M
m
M
n
M
m
M
5
s
1
･
3
a
i
2
6 tI
2
0
1
2 t1
2 0
1
S-3
n t o t
h
ti n i c
o t
i
n
n o s
F
o
l i
i t
c
Thy
m
Vjt
a n
i
3
･
l
n o
0
4
B
i
2
･
2
n
m
I
4n
2
* *
ー
m um
明
M
グロ
i
10
‡
甘3 B O
写真1
の
2
3
PO
2
S
ロ
a x
測定精度 を上げ るた
.
液 体 倍 地 S 甘M 1 3
a
ー
珪 藻細胞中 に
,
定常期の 細胞数 (M
,
N
( 光量 千畳
x
天然の 植物
倍地 の組成 を表 1 に 示す
.
a g)
こ の 方法の 長 所
,
は
効果 を評
の
珪藻の 生 長曲線 より与えられ る
.
)
血e
方法
音響
.
か ら放 出 さ れ る 蛍光 轟 度 を 測 定
a
天
珪藻 は
.
ビネ
白 色 蛍 光 灯1 1 0 0 k l
期1 4 時 間
.
珪 藻培 養 中 の グ
スキ
ル
ィ
の 長 さ( T i
.
現 在 同 定 中 で あ る)
,
を 撮 影 した も の で あ る
所製 グ
フ
ロ
蓑 1
よ り 分 譲 して 頂 き 用
た 液 体 培 地 S W H - lll を 用 い た
,
ロ
た
っ
こ の
.
の 生 長 に及ぼす音 響
.
実験試料 として
海水を洩過 したもの に
写真 1 は
誘導期
り無 菌 分 離 し た野 生 株 を
学 研 究 室 ( 耳 塚 氏)
の
,
珪 藻細 胞 の 増殖 を 評 価 した
めの 工 夫点な ど に
プ ラ
ク
.
珪 藻細胞の 増殖 を計測す る方法で あ る
,
藻類
｢
マ
ー
生 物 生 産 捜 械 学 講 座)
･
に技術 ス タ
価す るた め に
コ
( 生物 資源学部
b
e
.
.
.
.
V i t a m i
5
x
lO
2
3
6
O
x
10J
lO1
O
x
lO
O
x
- ff C I
e n a t e
a c
n z o
id
i
c
a c
id
10
I
a c
n
.
.
5
id
2
.
3
n e
i
B
1
4
n s
1
o
.
2
1
.
O
IL g
0
〟 g
.
0
.
0
0
皿g
〟 g
O
m
g
〟 g
,
グ
は
ロ
ス キ
ー
ビ ネ
ャ
I KS - 2 5 を 使 用 し 測 定 し た
測定 には
光量子量
の
小 型光 量 子 セ ン サ
小 糸工 業 製
,
ト内
ッ
蛍 光強度
.
S E Q U O I A - T U R N E 民社 製 蛍 光
,
光 度計 MODEL 450 を 使 用 した
2
に
の
内部
の
光源からで た 光は
通り
カバ
.
.
440
(c) を 通
n rn
た蛍 光は
ク
.
を通 し て
b
a n
フ
ロ
ッ
d フ
ル
ィ
トす る フ
ッ
ト( b ) を
ル タ
ィ
が発 し
a
以下
n m
ル タ
ィ
検 出 器 ( r) に 達 す る
,
ー
試 料( d ) に
の
垂 直 方 向 か ら6 6 5
,
光を カ
の
ロ
ス リ
,
室内
セ ル
.
ラ ン プ 室( a ) 内
.
n a r r o w
て
っ
照射され る
波長
を はず し た 蛍 光 光 度 計
ー
様子 を示す
の
写 真
.
の
( e)
ー
検出
,
器 に は光電 子増倍管が 使わ れて お り
感 度 良く 測 定 で き る
音波 は
ネ レ
工
-
夕を介し
実 験方法
300
m
分間滅菌処理 し た
培 養を 開 始 し た
専用
の ラ ウ ン
滅菌後
.
を選択し
z
に
コ
っ
た
サ ンプ )
I
.
っ
た
濃 度1
,
mg
ン
ン
プ リ
回 転 させ て 蛍 光 値 を 測 定 し
つ
フ
ィ
ル
M
g
が 4 個の ピ
て い る
a
の
ク
.
赤 色 部6 8 0
ロ
に
n m
.
い て
ロ
フ
強
-
ィ
ク
.
ロ
フ
ロ
,
ィ
ク
ロ
ロ
ル
a
は
囲 ま れ た 構 造を し
ル
は
,
青 色 部4 4 0
い 吸収を持 ち
波長側 に蛍光 を発光する
ク
.
.
ロ
赤色 部
ロ
フ
ィ
ル
細
ィ
ル量 を求め る ことが 出来る
胞敬とク
ロ
ロ
にあり
生 長 曲線
,
フ
ィ
ル の 量は
の
.
リ
ニ
に
ク リ
ー
グ
.
三
,
ロ
角
ン ル
プで
ー
純 薬製 ウ ラ
,
C 苫2
-
2 0 ℃
1
ス キ
ー
ビ ネ
ャ
フ ラ ス コ
内
ロ
ニ
(
ン
全て
マ
.
.
の
一
キ ン グ し た t)
の
CH
図 1
38 -
ク
ロ
試料を よ
ン ペ
ン チ
感度 は
を使用 した
,
の
ト内で
,
蛍光 値 を示 す よ
ア な関係
縦 軸 に 細 胞 数 の 対数
ッ
2 0
フ ル オ レ セ イ ン ナ ト リ ウ ム)
の セ ル が 同
-
ー
,
合わ せ を して か ら
よ く捜拝後 測定 し た
.
の
ム 内 の クリ
-
ン ジ
ョ
.
a
ク
フ
l 接種 し
暗期
.
トク レ
-
ク シ
ン
ァ
の 長
,
ロ
フ
.
と
M
の 発 す る蛍 光 強 度 を 測 定 す る こ と に よ り
ロ
オ
,
最 も 良い 方向 を
,
ル で
a
m
臥
セ ル は 標 準試 料 を用 い て
図 l に
構造 を示 す
ロ
を入れ
試料 を注 入 し
/1 に 調 製 し た 和 光
う 少 しづ
校 正 し た
低部 に取 り付け
蒸 留水を ブ ラ ン ク に し て ゼ
,
ン グ し た
い て
蛍光光度法 に
l
グお よ び 接 種 は
水溶液を用
つ
m
日 目 の 試 料 を5
蛍 光 強 度は
.
コ
明 期 に1 4 時 間 連 続 照 射 し た
.
借 地1 9 5
前培 養4
,
ド型セ ル に サ
標準試料 として
AC トl を 直 接 三 角 フ ラ ス
フラ ス
角
l の 三
無 菌 操作 に よ り 行
.
ー
サ ン プリ ン グ は 2 4 時間 毎 に 3
.
く 捜 挿 した 後 行 な
で
カ
ー
周 波 数1 0 0 0 H
.
内 部
の
.
三菱 製 ス ピ
.
蛍 光 光 度 計
写 真 2
,
ロ
フ
ィ
ル
a
の
構 造
.
,
代わ り に
蛍光光 度法
測定 は
ロ ロ フ ィ ル a
ク
,
蛍光強度
の
の短 所と長所 に
対数 を用
の
血 球 計 算 盤)
力を要 し た
を用
い
い て
んで あ
へ
っ
た
ら 測 定 す る 抽 出 蛍光 法 と
,
試料 中の 植物プラ
こ の
方法 は
ン の
相対的な分布特性 を把握す る
容易で あるが
い る
また
.
にく い と 言 わ れ て い る
る 利点が ある
微細藻類
,
の
( ト
方法 は
この
.
,
増殖
-
マ の
時間と 労
含まれ るク
今回 採用 し た 測 定法 は
.
で
従来
,
海洋
,
高 感 度 に す る 必 要 があ り
,
しかし
.
サ ン プ ル を 前処 理 無 し に
,
植物 プラ
の
こ の た め測定精
,
非常
ンク ト
測定 が 簡便で
.
い ため
,
の 工夫
安定 した 蛍光
,
簡単
に
に 測
定で き
点
以 前作成 された生長曲
図 2 (b) に
5
先月実 験 した
,
Ei i Z
Ei i Z
> く
結 果 か ら作 成 し た 生 長 曲 線 を 示 す
.
【∃
=
=
ヽ
善 し た 点を 以 下 に 記 す
① 生 長速 度 に 合
たサ
.
ンプリ ン
E惑
衣
グ間 隔
鶴
溝
#
#
.
ン ク に純
す る蛍光
のみ
水を用
い
,
ン
ス リ
,
整しなおした
試 料 か ら発
を計測す る よう に し た
③ 感 度 良く 測定 す る た め に
ゲイ
/
_
管
に した
②ブ ラ
っ
4
)
改
ッ
.
3
2
1
8
8
,
ス パ ン
ト幅 を 最 適 値 に
,
2
4
6
時
,
調
lII
C
10
8
間
o nt r o l
(d
+
Scu
◆
S
a y
)
r KI
Ap pl リ
h
u
′
④セ
ル の
.
個 体 差 を なく す よ う
に
,
標準
E i ■i ⊇
> く
Z
試 料 を用 い て セ ル 補正 を 行
っ
た
7
6 i
q
G
.
･ ･
■■
■■
■
6
■
iZ! ■ :i
⑤測 定精度 を論 ずる
,
に
増や し た
以上
の
タ
ばら
か ら
M
ax
i
,
き るよ う
サ ンプリ ン グ数を 1 回 か ら 3 回
に
の
こ とが で
m u m
G
r o v
と が 出来た
こ と に より
きが 少 なく なり
増殖速度
e
5
4
連出
.
点を改善す る
つ
a
衣
,
,
度 良く
,
デ
ー
生長曲線
平 均世代時 間
th を 精
,
萄
#
#
3
2
時
,
E)
求める こ
図 2
.
-
39
-
C
o nt ro
(
間
l
の
現 場 蛍光 法 で あ る
,
有効 な方法と して 利 用 され て きた
,
濃 度を そ
ロ ロ フ ィ ル
.
,
の
で 植物 色素を抽 出 して か
抽 出法 に 比 べ 透 明 で 均 質 な 試 料 で な
,
精度の 良い 生長曲線を得 る た め
.
の に
試 料 を 濃 縮 せ ず測 定 す る た め
,
度 は低い とされ て
線を 示す
ンク ト ンに
採取 し た 海水を処理 せず に直接測定す るの
,
て い た
っ
で は
の ス ライ ドグ ラ ス
漉 過 試 料 か ら 溶 媒 ( ア セ ト ン)
,
まま 蛍光 光度計 で 測 定 す る現 場 蛍光法が あ る
図 2 ( a) に
計数専 用
.
.
蛍光強度を測 定する 方法 に は
値を得
,
目 で 見なが ら計数す る方法 で 行
,
出来 る
蛍光 光度計 を導 入 す る ま
…
希釈 し た 試料中の 細胞 数を光学顕 微 鏡で
,
い る ことが
o
ou rd
r
)
A pp l リ
珪 藻 の 生 長 曲 線
12
14
.
結果 と考察
前述の 改善を加え
図 2 ( b)
測定 し 取得 した
て
生 長 曲線 か ら計算し て 求 め た
の
珪 藻細胞 の 増殖 の 評 価 を表 2
誘 導期
4
14
.
か
っ
時間 は
の
コ
,
た
最 大 増殖量 は
.
次
の
細胞分裂ま
コ ン
ト
ン トロ
コ
ロ
ー
.
時間
時間
67
誘導期
,
た
z
,
10 0 H
z
い
(h o
lag
me
M a xi
u nd
A ppl y
)
4
ur
.
14
0
G r o wth
X t)
6 1 12
6 17 5
平 均世 代時間 T
( h o u r)
10 75
9 67
比 増殖速度 〟
( l n 2 / T)
0 0 64 5
mum
(1
差平 均世代
,
時間
75
.
n
.
.
.
.
の
時間が短くなる
た海水
た
0 717 で
.
こと
しかし
.
あ
た
っ
音 波照 射
,
と 変化 させ て も音波照 射側 と
以 上 の 結果 か ら
.
音 波を 照 射す
,
増殖が 促進 さ れ 増殖速 度が 速 く な り
,
状 態 に よ る差 な ど に 比
の
.
,
音 波 照 射 側 で は0
っ
0 0 7 17
.
普
,
,
世 代 時 間 は 短く な る こ と が 判
え ば 倍地 作製 に 用
So
ルで
ー
比 増殖速度 は
,
0 6 45
.
trol
細胞分裂から
.
ル で は1 0
ー
ル で0
る こ とにより
た
っ
での
ロ
波 照 射 側 で は9
500H
Ti
ル で は
ー
n
.
.
差 は 見ら れ な か
ト
す
Co
音 波 照 射 側 で は6 1 7 5 と 大 き
,
い
時間 は
に示
生長 曲線 よ り与えられ る 細 胞 増殖 の 評価
,
音 波照 射側 で は観 測 さ れ な
,
は6 1 1 2
コ ン
ントロ
時間
.
表2
,
コ ン
ト
効果 は
の
非 常 に小さく
べ て
ロ
例
ル
ー
音波以 外
,
の
の
平 均
,
培養 条件
周 波 数 を 1 0 0 0 Ⅲz
,
間 に大 きい 差 はみ ら れ な か
.
参考文献
1)
御橋虞民地著
,
㈱学会出版セ
日 本 分光 学 会 測 定 法 シ リ
ンタ
1 9
ー
,
3
ズ 3
,
蛍光測 定
気象庁編
3)
林
4)
西洋
俊
,
千原光雄編
,
藻 類 研 究法
,
共立 出版㈱
5)
平 本幸男
,
毛 利秀雄 編
,
生 物学概論
,
放送大 学教材
6)
高 辻 正 基編
孝三 他著
-
,
,
植物色 素
( 財)
,
一
実験
一
生物科学
へ
の
8
0
応用
.
2)
,
海洋観測 指針
8
ー
日本 気象協会
･
研究
地 球を救う バ イ オ テ クノ
へ
ロ
-
の
ジ
40
,
1
手引 き
ー
,
-
9
,
1
,
㈱オ
9
0
.
㈱ 養賢堂
-
,
ー
,
9
8
1
9 9 4
ム 社
5
,
,
1
9
.
1
.
9 9 1
.
.
-
,
例
,
っ