scentis® E - Sigma

アセンティス
エクスプレス
Ascentis Express 2.7 μm & 5 µm Columns
with Fused-Core® Particles
®
2
アセンティス
®
エクスプレス
アセンティス
Ascentis Express
Ascentis
0.6 µm
0.5 µm
非多孔性の核
~5 µm 3.3 µm
非多孔性の核
2.7 µm 1.7 µm
2.7 µm
5 µm
Fused-Core 粒子
全多孔性粒子 3, 5, 10 µm
2.7 μm Fused-Core® カラムは、sub-2 μm 並みの高理論段数で 3 μm より 25% 程高い低背圧です。
5 μm Fused-Core カラムは、3
μm 並みの高理論段数で 5 μm 並みの低背圧です。
®
2.7 μm
μm Fused-Core
Fused-Core® カラムは、sub-2
カラムは、sub-2 μm
μm 並みの高理論段数で3
並みの高理論段数で3μmより25%程高い低背圧です。
μmより25%程高い低背圧です。
2.7
5
μm
Fused-Core
カラムは、3
μm
並みの高理論段数で5
μm
並みの低背圧です。
5 μm Fused-Core カラムは、3 μm 並みの高理論段数で5 μm 並みの低背圧です。
20.00
20.00
Fused
Core
2.7um
Fused
Core
2.7um
Column:
150
4.6mm
Column:
150
xx4.6mm
Porous
3
um
Mobile
Phase:
60%
Acetonitrile
Porous
3 um
Mobile
Phase:
60% Acetonitrile
Temperature:
35ºC
Fused
Core
5um
Temperature:
35ºC
Fused Core
5um
Sample:
10μLToluene
Porous
um
Sample:
10μLToluene
Porous
55um
18.00
18.00
16.00
16.00
14.00
14.00
5µm全多孔性粒子
全多孔性粒子
5µm
H
H
12.00
12.00
←このグラ
←このグラ
10.00
10.00
3µm全多孔性粒子
全多孔性粒子
3µm
8.00
8.00
6.00
6.00
5500psi（380bar）
5500psi（380bar）
5µmFused-Core粒子
Fused-Core粒子
5µm
3200psi（220bar）
3200psi（220bar）
4.00
4.00
2.7µmFused-Core粒子
Fused-Core粒子
2.7µm
2.00
2.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.50
0.50
1.00
1.00
1.50
1.50
2.00
2.00
2.50
2.50
3.00
3.00
3.50
3.50
4.00
4.00
4.50
4.50
flow (mL/min)
(mL/min)
flow
12000
12000
Fused
Core
2.7um
Fused
Core
2.7um
Column:
150
4.6mm
Column:
150
xx4.6mm
Porous
um
Porous
33um
Mobile
Phase:
60%Acetonitrile
Acetonitrile
Mobile
Phase:
60%
Temperature:
35ºC
Temperature:
35ºC
FusedCore
Core5um
5um
Fused
Sample:
Sample:10μLToluene
10μLToluene
Porous
Porous 55um
um
Pressure (psi)
(PSI)
psi
Pressure
(PSI)
10000
10000
8000
8000
6000
6000
2.7µmFused-Core粒子
Fused-Core粒子
2.7µm
Sub-2µm粒子
Sub-2µm粒子
3µm
3µm全多孔性粒子
全多孔性粒子
一般的なHPLCの
一般的なHPLCの
圧力上限
圧力上限
←このグラ
←このグラ
5µm
5µmFused-Core粒子
Fused-Core粒子
4000
4000
（275bar）
（275bar）
5µm
5µm全多孔性粒子
全多孔性粒子
2000
2000
00
0.00
0.00
0.50
0.50
1.00
1.00
1.50
1.50
2.00
2.00
2.50
2.50
flow
flow (mL/min)
(mL/min)
3.00
3.00
3.50
3.50
4.00
4.00
4.50
4.50
アセンティス
3
エクスプレス
Ascentis Express 5 μm による分析時間短縮および溶媒削減の検討
®
はじめに
2006 年シグマアルドリッチでは sub-2 μm 充填剤を
®
超越した 2.7
μm Fused-Core
粒子を採用した高速・
アセンティス
エクスプレス
column : 5 μm, 4.6 x 150 mm
た。それ以降、多くのお客様から盛大な反響と高いご
flow rate : 1 mL/min or 2 mL/min
® Express 5μmによる分析時間短縮および溶媒削減の検討
Ascentis
高分離能 HPLC
カラム Ascentis
Express を発売しまし
mobile phase : water : acetonitrile = 50 : 50
評価を頂いております。
はじめに
2006年シグマ アルドリッチではsub-2µm充填剤を
2012 年に新たに登場した
Ascentis Express 5 μm は、
超越した 2.7µm Fused-Core®粒子を採用した高速・
従来の HPLC カラムからサイズを変更せずに溶媒使用
高分離能カラムAscentis Expressを発売しました。そ
量を大幅に削減することが可能です。今回は、シック
れ以降、多くのお客様から盛大な反響と高いご評
価を頂いております。
ハウスの原因物質であるホルムアルデヒドやアセトア
2012年に新たに登場したAscentis Express 5µm
ルデヒドの DNPH
誘導体化物について分析時間短縮と
は、従来のカラムからサイズを変更せずに溶媒使
用量を大幅に削減することが可能です。今回は、
溶媒削減効果を検証しました。
シックハウスの原因物質であるホルムアルデヒドや
アセトアルデヒドのDNPH誘導体化物について分析
実験
時間短縮と溶媒削減効果を検証しました。
temp. : 40 °C
detector : UV 360 nm
column ： 5µm, 4.6 x 150mm
injection
20 μL
mobile
phase：:water：acetonitrile
= 50：50
flow rate
： 1 mL/min
or 2 mL/min
sample
: 100 ng/mL
in mobile phase
temp. ： 40℃
detector ： UV 360nm
injection ： 20µL
sample : 100ng/mL in mobile phase
Ascenits C18,
C18, pressure
pressure ：: 5.1
5.1 MPa
Ascenits
MPa (740
(740psi)
psi)
まず同一分析条件にて、全多孔性 5 μm の Ascentis
実験
C18 カラムと Fused-Core
5 μm の Ascentis Express C18
まず同一分析条件にて、全多孔性5μmの
Ascentis
C18カラムとFused-Core
5μmのAscentis
カラムとを比
較しま
し た。 次 に、5 μm の
Ascentis
Express C18カラムとを比較しました。次に、5μmの
Express C18 カラムにおいて、流速を 2 倍にした検討
Ascentis Express C18カラムにおいて、流速を2倍に
を行いました。
した検討を行いました。
結果
結果
5μmのAscentis Expressは、全多孔性5μmの
5 μm の Ascentis Express は、
全多孔性 5 μm の Ascentis
Ascentisと同等の低背圧を示しつつも、同一流速で
と同等の低背圧を示しつつも、同一流速で分離能を損
分離能を損なわずに分析時間は半分になりました。
また、移動相消費量も半分となりました。
なわずに分析時間は半分になりました。また、移動相
次に、 5μmのAscentis Expressの流速を2倍にし
消費量も半分となりました。
て検討を行いました。分離能を損なう事なく、分析
時間をさらに半分にすることが出来ました。また、
次に、5 μm
の Ascentis Express の流速を 2 倍にして
背圧も通常のHPLC装置の使用範囲内に容易に入
検討を行いました。分離能を損なう事なく、分析時間
りました。
をさらに半分にすることが出来ました。また、背圧も
通常の HPLC 装置の使用範囲内に容易に入りました。
まとめ
Ascentis Express 5μmは、汎用カラムAscentis
5μmと同一カラムサイズにも関わらず、分析時間
まとめ
は1/4へ短縮、移動相消費量は1/2へ削減可能です。
また、低背圧のため、
Ascentis
Express55μmはカラ
Ascentis Express 5 μm は、汎用カラム
Ascentis
μm
ム長さ25cmまで対応可能となりました。
と同一カラムサイズにも関わらず、分析時間は 1/4 へ
実サンプル
スタンダード
1
ホルム
アルデヒド
2
4
8
6
1 mL/min
2
3
アセトン
アセトアルデヒド
10
12
14 min
Ascenits Express
Express C18, pressure
Ascenits
pressure：: 5.9
5.9 MPa
MPa(855
(855psi)
psi)
1
実サンプル
スタンダード
1 mL/min
8
12
2
3
2
4
6
10
14
min
Ascenits
AscenitsExpress
ExpressC18,
C18,pressure
pressure :：11.9
11.9MPa
MPa(1726
(1726 psi)
psi)
1
実サンプル
スタンダード
2
2 mL/min
3
短縮、移動相消費量は 1/2 へ削減可能です。また、低
背圧のため、Ascentis Express 5 μm はカラム長さ 25 cm
まで対応可能となりました。
2
3
4
6
8
10
12
12
14 min
14
↑これらのグラフはそのまま使用してく
アセンティス
エクスプレス
Ascentis Express を用いて高速分析するためのキーポイント
®
はじめに
Table 1. Evolution of HPLC Particles
分析時間とは出来上がった分析系や新しいサンプル
1970s
1970s
1980s
1980s
1990s
1990s
10µm
µm
10
(Porous)
55 µm
µm
(Porous)
3 µm
3 µm
(Porous)
Modern
Modern
を分析するために要する時間のことです（グラジエン
ト分析はシステムの再平衡化時間も含みます）。HPLC
分析の重要な目標は分析時間を短縮しながらも分離は
維持することにあります。分離度（Rs）は式（1）に
Fused-Core
Fused-Core
andand
sub-2
sub-2
µmµm
示すように 3 つの項目で構成されています。
RS =
N
4
k
1+k
α-1
α
（1）　分離度とは 2 本のピーク間隔の程度を表します。最
も良好な分析はピークが完全分離することです（Rs =
1.5 がベースライン分離と定義されています）。保持
係数（k）と分離係数（選択性）（α）はカラム長さに
依存しないが、理論段数（N）はカラム長さが短くな
ると充填剤粒子径を小さくしない限り低下してしまい
Table 2. Comparison of Three Column Particles
Particle Size (µm)
Column
Length (mm)
Bed Efficiency
(N/mm)
Total Number
of Plates (N)
150
100
50
100
50
30
100
50
30
20
100
100
100
150
150
150
250
250
250 250
15,000
10,000
5,000
15,000
7,500
4,500
25,000
12,500
7,500
5,000
5
5
5
3
3
3
2.7 Fused-Core
2.7 Fused-Core
2.7 Fused-Core
2.7 Fused-Core
ます。粒子径の小さい充填剤を用いた短いカラムであ
れば、同等の理論段数を保ったままなので分離を悪く
することなく分析時間を縮めることが可能となります。
Table 1 に HPLC カラムで用いられてきた充填剤粒子の
Figure 1. van Deemter Plots (Efficiency versus Flow
Velocity) and Pressure Plots for Different Particle Types
変移の歴史を示しました。Table 2 では一般的なカラ
16,000
ム長さと粒子径における典型的な 1 mm 辺りの理論段
35.00
数と長さ辺りの理論段数を示しました。より短いカラ
30.00
H
ムで同等の理論段数を得るため、より小さい充填剤粒
子を用いることは、アイソクラティック条件において、
H =
L
N
N ∝
10 µm
20.00
5 µm
15.00
より分析時間を短縮する秘訣です。
3 µm
10.00
近年における HPLC の分析スピードは、より短いカ
1.7 µm
5.00
ラムとより小さい充填剤粒子を組み合わせ、より速い
2.72.7
µmµFused-Core
-Core
流速を用いることによって改善されました。しかしな
2
4
6
を損なうことにより肝心の分離が達成されない恐れが
あります。その原因を、異なる充填剤粒子径の van
Deemter plot（Figure 1）を比較することから読み取る
16,000
ことが可能です。VanDeemter plot の傾きは粒子径を
14,000
小さくした場合や Fused-Core® 粒子の場合に劇的に減
12,000
このことは、高流速においてカラム長さを短くしても
分離度を損なうことなく高分離を保つことができるこ
とを表しています。
8
10
12
Mobile Phase Flow Velocity (mm/sec.)
がら、3 μm 充填剤粒子を用いた場合でさえ理論段数
少し、H と N は高い線速度でもフラットになります。
1
dp
25.00
Pressure (psi)
4
P∝
1
2
dp
1.7 µm
ca. 1 mL/min.
10,000
8,000
2.7 µm Fused-Core
6,000
3 µm
4,000
2,000
2
4
6
8
10
Mobile Phase Flow Velocity (mm/sec.)
12
5
分析時間を短縮するためにカラム長さを短く
Figure 2 に、一般的なカラムサイズ 150 × 3 mm、5 μm、流
速 0.4 mL/min での分析を、高性能な 2.7 μm Fused-Core 粒子
®
を充填したより短いカラムサイズ 50 × 3 mm にメソッド移行
して高分離を達成した例を示します。この場合、Fused-Core
粒子は 5 μm 粒子に比べて長さ辺り約 3 倍の理論段数を持って
Figure 2. Example of using Shorter Columns and Higher
Flows with Smaller Particles to Increase Speed
column: C18, 150 x 3 mm, 5 µm
mobile phase: 20:80, water:acetonitrile
flow rate: 0.4 mL/min (ca. 1.5 mL total volume per run)
temp.: 35° C
inj.: 1.5 µL
pressure: 885 psi (61 bar)
N (naphthalene): ~11000
k (naphthalene): 1.78
elution order: uracil, phenol, acetophenone, benzene, toluene, naphthalene
いるので、1/3 のカラム長さで同じ分離を達成できることを示
しています。特筆すべき点としては、溶媒消費量はカラム長さ
に比例するので、溶媒も 1/3 で済むことです。また、カラム長
さがより短いことにより、同じ線速度で 3 倍の分析スピード
150 mm length
0.4 mL/min.
(about 2 mm/sec. velocity)
になります。Fused-Core カラムの場合、より速い 0.6 mL/min
の流速（線速度 3 mm/sec）にすることで、最終的に 1/4 の分
析時間まで短縮可能でした。
1.0
分析時間を短縮するために流速を速く
Figure 2 では、50 × 3 mm カラムで流速を 1.2 mL/min（線速
度 6 mm/sec）へ上げることにより更なる高速化と処理数増加
を実現できたことも示しています。式（2）にアイソクラティッ
ク分析における速度の定義式を示します。
Speed = L/u (1 + k)
（2）　2.0
Time (min)
3.0
4.0
column: Ascentis® Express C18, 50 x 3 mm, 2.7 µm
mobile phase: 31:69, water:acetonitrile
flow rate: as shown (0.5 mL total volume per run)
temp.: 35° C
inj.: 0.5 µL
pressure: 1750 psi (121 bar)
N(naphthalene):~11000
k(naphthalene):1.75
Rs(acetophenone):3.2
50 mm length
0.6 mL/min.
(about 3 mm/sec. velocity)
L はカラム長さ、u は線速度（通常、未保持ピークに対する
0.2
0.4
0.6
Time (min)
保持時間から測定）を表します。50 mm カラム長さで 6 mm/
0.8
1.0
sec の線速度で流した場合では、k = 0（ボイドボリューム）は 8.3
sec となり、k 値が 10 以下の分離は 90 秒以内で終了すること
ができます（式（2）より）。50 mm × 3 mm カラムの場合、k
= 0 から k = 2 の間で全てのピークが溶出するため、25 秒以内
で分離が完了します。特筆すべき点は、分離度が犠牲になるこ
とはほぼないため、高流速でもピークの全体的な精度は維持さ
れます。
まとめ
1. Fused-Core 粒子と全多孔性 sub-2 μm 粒子は長さ辺り高い理
論段数を誇るので、全多孔性 5 μm 粒子や 3 μm 粒子よりも
短いカラム長さで同等の分離が可能です。
2. 2.7 μm Fused-Core 粒子は全多孔性 sub-2 μm 粒子と同等の
性能であるにもかかわらず、全多孔性 3 μm 粒子より 25%
程背圧が高いだけです。
3. Fused-Core 粒子と全多孔性 sub-2 μm 粒子は高流速で流して
も理論段数と分離度を損なうことがありません。
さらに、Fused-Core 粒子は、高流速において低背圧であ
るため、より速い流速を用いて高速分析が可能です。
50 mm length
1.2 mL/min.
(about 6 mm/sec. velocity)
0
10
Time (sec)
20
30
6
脱法ハーブを用いた LC-MS 感度への移動相添加剤の影響検討
Xiaoning Lu, Craig Aurand, and David S. Bell
はじめに
初期の検討段階では、LC-MS を用いてバスソルトとして知られる脱法ドラッグの成分を、様々な化学修飾型固定
相カラムの選択性を利用した結果を報告しました 1。本報告では、移動相成分の重要性について、特にイオン性成分
について検討しました。LC/MS/MS 分析の最適化において、脱法ドラッグであるカンナビノイドを用いて様々な移動
相添加剤による感度と選択性の最適化について検討しました。特に HPLC カラムの選択性、溶媒の純度、効果的な試
料前処理、標準品の 4 点について検討しました。
背景
LC-UV 分析法で最適であった移動相が、LC-MS 分析法においても有用であるとは限りません。通常 LC-UV でのメソッ
ド開発において重要視されるのは、低い UV バックグラウンドにていかに目的成分を最適な保持で分離するかです。
LC-MS（ESI）を使用する場合は、加えて移動相がイオン化に与える影響についても考えなければなければなりません。
かつ、移動相は揮発性があり、バックグラウンドを低く感度を高くするためにアダクトを形成するような不純物が少
ないものを選択する必要があります。LC-MS 分析で典型的に用いられる添加剤として、ギ酸アンモニウムや酢酸ア
ンモニウム、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸（TFA）があります。
合成カンナビノイド（Figure 1）は、脱法ドラッグである新規のデザイナードラッグです 2。2011 年初期、米国麻
薬取締局は、JWH-018 や JWH-073 のようないくつかの合成カンナビノイドを Schedule 1 リストに加え、所有や消費
を違法としました。しかし、化合物構造を少し変えることにより、新規の合成カンナビノイドは増える一方です。迅
速にかつ正確にこのような脱法ドラッグを使用者の血液や尿から検出することは大きな挑戦です。
実験
メソッド開発において様々な化学修飾型固定相カラムを検討した結果、Ascentis® Express F5 がアイソクラティック
条件において合成カンナビノイド（Figure 1）に対して最も良い分離を示しました。
添加剤検討において、5 mM 酢酸アンモニウム、5 mM ギ酸アンモニウム、0.05% 酢酸、0.05% ギ酸を 50 : 50/ 水 :
アセトニトリル移動相で ESI-MS での感度の違いを評価しました。Figure 2 に検討結果のクロマトグラムを示します。
4 つの異なる条件において、5 種類の目的化合物はベースライン分離しました。溶出順序は JWH-200 を除き、同じ
でした。JWH-200 は酸性移動相条件下において保持が強くなりました。これは、F5 固定相と JWH-200 のモルホリン
官能基との強いイオン交換相互作用によるためと推測されます。検出感度に関しては、ギ酸系が酢酸系よりも高感度
を示し、ギ酸アンモニウムが最もバランスの良いクロマトグラフィーを示しました。Table 1 に結果をまとめました。
Figure 1. Representative Spice Compounds
Table 1. Relative Response (Peak Height) in ESI(+) Mode of the
Spice Compounds under Different Mobile Phase Conditions
O
5 mM
5 mM
Ammonium Ammonium
Formate
Acetate
O
N
N
CH3
O
H3C
CH3
HO
JWH-073 metabolite
O
JWH-250
O
O
N
N
N
CH3
JWH-200
N
JWH-073
O
CH3
JWH-018
0.05%
Formic
Acid
0.05%
Acetic
Acid
1. J WH-073
metabolite
1
0.28
0.97
0.81
2. JWH-200
1
0.27
0.23
(no elution)
3. JWH-250
1
0.61
1.20
1.02
4. JWH-073
1
0.35
1.08
0.90
5. JWH-018
1
0.38
1.21
0.99
7
LC-MS での検出感度を論じる際に、アダクト形成につ
いても配慮が必要です。ESI(+) において特にナトリウムや
カリウムと目的化合物がアダクトを形成してしまうと、目
的化合物のプロトン化（イオン形成）を阻害し、結果として
検出感度が低下し、スペクトルも複雑となってしまいます。
別の研究報告でアダクト形成について論じており、LC-MS
CHROMASOLV®・LC-MS Ultra CHROMASOLV（UHPLC 用）
シリーズの溶媒・添加剤の有用性が示されています 3。
標準品で決定した最適分析条件にて、血漿に添加した合
成カンナビノイド（Figure 1）を分析しました。試料中の
内因性タンパク質やリン脂質は、HybridSPE®-Phospholipid
Figure 2. LC-MS/MS Resolution and Response of Spice
Cannabinoids with Various Ionic Mobile Phase Additives
column: Ascentis® Express F5, 5 cm x 2.1 mm, 2.7 µm (53567-U)
mobile phase:(50:50) acetonitrile:water containing various ionic additives as
shown in figure
flow rate: 0.3 mL/min
temp.: 35 °C
pressure (column): 1296 psi (89.4 bar)
detector:MS, ESI(+), MRM, m/z 344/155 (JWH-073 metabolite), 385/155
(JWH-200), 336/121 (JWH-250), 328/155 (JWH-073), and 342/155
(JWH-018)
injection: 2 µL
sample: 5 ng/mL each compound in 50/50 water:methanol
system: Agilent 1100 HPLC, 3200 QTrap (AB/Sciex)
1.
2.
3.
4.
5.
A. 5 mM ammonium acetate
(A) 10 mM ammonium acetate in water, pH 6.8
(unadjusted); (B) acetonitrile; (50:50; A:B)
JWH-073 metabolite
JWH-200
JWH-250
JWH-073
JWH-018
1 2
3
4
を用いて予め除去しました 4。Figure 3 にクロマトグラム
を示します。
0
Figure 3. LC-MS/MS Analysis of Spice Compounds from Plasma
on Ascentis® Express F5 after SPE using HybridSPEPhospholipid
Conditions same as Figure 2, Panel B except as follows:
sample/matrix:rabbit plasma, unfiltered K 2-EDTA, spiked with spice
cannabinoids (5 ng/mL each)
SPE: HybridSPE-Phospholipid, 96-well plate (575656-U)
sample addition:to each well add 100 µL plasma, followed by a 300 µL of 1%
formic acid in acetonitrile, agitate on orbital shaker for
two minutes
elution:attach collection plate and apply vacuum at 10” Hg for
four minutes
1
1. JWH-073 metabolite
2. JWH-200
3
3. JWH-250
4. JWH-073
2
5. JWH-018
2
1
4
6
B. 5 mM ammonium formate
(A) 10 mM ammonium formate in water, pH 6.8
(unadjusted); (B) acetonitrile; (50:50; A:B)
2
3
0
5
4
2
1
5
4
6
C. 0.05% formic acid
(A) 0.1% formic acid in water, pH 2.7 (unadjusted);
(B) acetonitrile; (50:50; A:B)
4
3
4
5
5
2
0
2
Min
4
6
まとめ
0
2
1
LC-MS で分析をする際は、移動相成分に配慮する必要
4
6
D. 0.05% acetic acid
(A) 0.1% acetic acid in water, pH 3.3 (unadjusted);
(B) acetonitrile; (50:50; A:B)
があります。本報告では脱法ハーブである合成カンナビノ
イドを用いて検討を行い、ギ酸系添加剤が酢酸系添加剤よ
3
りも優れた MS 感度および分離を示しました。また、溶媒
4
5
には高純度である LC-MS CHROMASOLV シリーズを、血漿
試 料 の 前 処 理 に は HybridSPE-Phospholipid を、HPLC カ ラ
ムには Ascentis Express を、標準品には Cerilliant® ブラン
ドを用い、いずれも最新技術を採用している製品で検討を
2
0
2
Min
4
6
行いました。
Reference
1. Brandes, Hillel. Topics in LC-MS, Part 1. Leveraging Column Selectivity. Supelco Reporter, 2012, 30.2, 13-15.
2. DrugFacts: Spice (Synthetic Marijuana). http://www.drugabuse.gov/publications/drugfacts/spice-synthetic-marijuana (accessed June 11,2012).
3. Kohling, Rudolf. Selective adduct formation in electrospray ionisation with alkali citrates. Analytix (Fluka), 2008, 4, 4-5.
4. Aurand, Craig. Understanding, Visualizing, and Reducing the Impact of Phospholipid-Induced Ion Suppression in LC-MS. Supelco Reporter,
2012, 30.2, 10-12.
8
アセンティス
エクスプレス
合成色素の分析：Ascentis Express C8 での色素の高速分離
®
背景
色素は日常的に私達の生活の至る所に存在します。色素は雑誌や本の印刷用インクや、プラスチック、織物、革製
品のような一般的なものだけではなく、ディーゼル燃料やタトゥー顔料のような意外なところにも存在します。この
ような合成色素の大部分は、ヘテロ原子を含む芳香環構造に基づいており、癌を引き起こす高い可能性があります。
このため、食品色素としては使用されません。しかし、2003 年以降、混合香辛料であるチリパウダーに合成色素で
あるスーダンⅠが混入するという事件が幾度か発生しました。このような状況により、合成色素が混入しているかを
判断するために、混合香辛料の分析が必要となりました 1, 2。
また、高感度な HPLC 分析法は、色素の品質管理や副生成物の同定に必要とされています。Supelco® の Ascentis
Express HPLC カラムは、このようなアプリケーションに対し、優れた感度と分離を提供します。
実験：色素の分析法開発
Table 1 は、メタノールとアセトニトリルの混合溶液に溶解させた色素試料の一覧です。調整した色素試料は、最
良の分離パラメータを決定するために、様々な移動相条件下で Ascentis Express C8 HPLC カラムに注入されました。
温度、注入量、検出器の設定や流量は一定に保って検討を行いました。
色素の化学的性質や物理的性質は大きく異なるので、最適な HPLC 分析法開発の第一段階として、25% アセトニ
トリル（B）のグラジエントで 0.1% ギ酸水溶液（A）を使用しました。UV 360、550、620 nm の波長を重ね描きし
たクロマトグラムより、17.35 分で溶出したスダン 410（ピーク 7）の不十分なピーク形状を除いて（Figure 1A）、全
ての化合物で良いクロマトグラフィーを示しました。
スダン 410 のピーク形状を最適化するために、有機溶媒移動相にメタノールを加えて（アセトニトリル：メタノー
ル /90：10）同様にグラジエントを行うと、より良いピーク形状が得られました（Figure 1B）。最終的には、グラジ
エント条件を変更して最適な分析条件が達成できました（Table 2、Figure 1C）
。Figure 1 は、検討段階ごとにクロマ
トグラフィーが改善されていく様子を示しています。
最終的な分析法を得るのに、3 回の条件検討で済みました。これは、Ascentis Express カラムを用いて分析法の開発・
検討を行うと、いかに速くて簡単かを実証しています。さらに、Ascentis Express カラムは、より短い分析時間を可能
とする Fused-Core® 粒子を使用しています。標準的な HPLC 装置で行う分離でさえ、30% の分析時間短縮が可能です。
Table 1. Structure and Mass of the Dyes in the Sample Mixture. Most of the Compounds are Detected as [M+H]+ Ions except
(5), which gives [M]+ Ions
Peak No.
Structure
1
G004779
2
G004780
3
G004781
4
G004782
Name / Exact Mass
Parafuchsin
C19H17N3
287.142247
Basic Fuchsin
C20H19N3
301.157897
Methylfuchsin
C21H21N3
315.173547
Newfuchsin
C22H23N3
329.189197
Peak No.
Structure
5
G004783
6
G004784
7
G004785
Name / Exact Mass
Malachite Green
C23H25N2
329.201773
Sudan III
C22H16N4O
352.132411
Sudan 410
C26H24N4O
408.195011
9
Table 2. Initial and Final HPLC Method Settings for Separation of the Seven Dyes Listed in Table 1, After Optimization
Fixed Parameters
column:
flow rate:
temp:
UV DAD:
MS:
injection volume:
run time:
Ascentis Express C8, 10 cm × 4.6 mm I.D., 2.7 µm particles
0.8 mL/min
55 °C
200–950 nm
ESI(+), SPS target 500 m/z, stability 100%, trap lvl. 100%, optimize normal,
range 100–1500 m/z, nebulizer 50 psi, dry gas 12 L/min, dry temp. 365 °C.
3 µL
25 min (5 min posttime)
Variable Parameters
Initial Conditions
Final Conditions
solvents: (A) water with 0.1% formic acid
(B) acetonitrile
gradients: Time%A%B
0.0 7525%
1.5 7525%
15.0
0100%
22.0
0100%
25.0 7525%
(A) water with 0.1% formic acid
(B) acetonitrile:methanol (90:10)
Time%A%B
0.0 7525%
1.5 7525%
15.0 2 98%
22.0 2 98%
25.0 7525%
Figure 1. UV Chromatograms of Sudan III and Sudan 410.
(A) Initial Conditions, (B) Addition of Methanol to Mobile
Phase, (C) Final Conditions after Adjusting Gradient
Figure 1 は 3 段階の最適化ごとのスダンⅢ（ピーク 6）
およびスダン 410（ピーク 7）の UV クロマトグラムを
示します。メタノールとアセトニトリル（10：90）の
有機溶媒移動相とグラジエントの最終移動相組成を
Figure 1A
98% 有機溶媒移動相とした時、スダン 410（ピーク 7）
は最少のテーリングとなり（Figure 1C）、全化合物にお
い て も 最 良 の ピ ー ク 形 状 と な り ま し た（Figure 2）。
Figure 2 は、HPLC 分析法の最適化の最終的な UV クロマ
トグラムを示します。全ての化合物に対し、分離、感度、
ピーク対称性が最適となりました。標準の HPLC 装置
Figure 1B
（Agilent 1100）での分析時間は 25 分でした。UHPLC 装
置を用いると分離はより速く行う事が可能です。
Figure 2. UV Chromatogram of the Final HPLC Method
Figure 1C
G004786
G004787
10
まとめ
標準の HPLC、Fast LC、UHPLC 装置で Ascentis® Express
カラムを使用すると、高感度を得ることが可能です。
Figure 3. Expanded View of UV Chromatogram Showing
Unknown Impurity at 7.7 min. and Malachite Green (5)
The inset shows the UV spectra of malachite green (blue) and the unknown impurity
(red). The mass spectra are of malachite green (top) and unknown impurity (bottom).
LC-MS システムの質量検出器は、溶媒中の汚染物質お
よびカラムブリードにとても敏感です。高純度である
Fluka® の LC-MS 溶媒と添加剤に、低ブリードの Ascentis
Express カラムを組み合わせることで、これら両方を低
減できます。低濃度の分析対象物の微量分析や、色素の
応用・品質に非常に影響する恐れのある副生成物の同定
の際は、HPLC カラムの高理論段数と低ブリードカラム
が必須な基本条件です。Figure 3 は、非常に複雑な混合
物中における低濃度の副生成物を同定した例を示します。
保持時間 7.68 分の未知化合物は、マラカイトグリーン
（8.10 分のピーク 5）とほぼ同じ UV スペクトルを示し
ますが、質量は 14 Da 低い物質です。これは、発色団
に影響が無いマラカイトグリーン分子内のメチル基が水
素基に置換された化合物と一致します。また、UV 分析
および質量分析の結果と一致した分子構造は、Figure 3
に示した化合物しかありませんでした。
シグナル／ノイズ比の高い不純物の正確な UV スペク
トルおよび質量スペクトルや LC-MS システムから最適
な結果を得るためには、Fluka の高純度 LC-MS 用溶媒と
Supelco® の Ascentis Express のような高性能 HPLC カラ
ムを使用することを推奨します。
Reference
1. Commission Decision. Official Journal of the European Union. L154/114. June 10, 2003.
2. Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF). 2004. Annual Report. European Commission of Health & Consumer Protection Directorate
General.
G004788
11
Ascentis® Express 2.7 μm HPLC カラム
・推奨操作最大圧
9,000 psi（60 MPa, 600 bar）
・使用温度～ 60 °C（ES シリーズ～ 100 °C）
内径
長さ
C18
C8
Phenyl-Hexyl
（mm）
（cm）
CAT.NO.
価格（¥）
CAT.NO.
価格（¥）
CAT.NO.
価格（¥）
分析カラム
2.1
2
53799-U
63,000
53795-U
63,000
53798-U
63,000
2.1
3
53802-U
68,000
53839-U
68,000
53332-U
70,000
2.1
5
53822-U
68,000
53831-U
68,000
53334-U
70,000
2.1
7.5
53804-U
72,000
53843-U
72,000
53335-U
74,000
10
53823-U
80,000
53832-U
80,000
53336-U
82,000
2.1
2.1
15
53825-U
85,000
53834-U
85,000
53338-U
87,000
3.0
3
53805-U
68,000
53844-U
68,000
53341-U
70,000
3.0
5
53811-U
68,000
53848-U
68,000
53342-U
70,000
3.0
7.5
53812-U
72,000
53849-U
72,000
53343-U
74,000
3.0
10
53814-U
80,000
53852-U
80,000
53345-U
82,000
3.0
15
53816-U
85,000
53853-U
85,000
53346-U
87,000
4.6
3
53818-U
68,000
53857-U
68,000
53347-U
70,000
4.6
5
53826-U
68,000
53836-U
68,000
53348-U
70,000
4.6
7.5
53819-U
72,000
53858-U
72,000
53351-U
74,000
4.6
10
53827-U
80,000
53837-U
80,000
53352-U
82,000
85,000
53353-U
87,000
4.6
15
53829-U
85,000
53838-U
ガードカートリッジ、3 個入り ※ガードカートリッジホルダー（Cat.No.53500-U）は別売りです。
2.1
3
53501-U
50,000
53509-U
50,000
53524-U
50,000
3.0
3
53504-U
50,000
53511-U
50,000
53526-U
50,000
4.6
3
53508-U
50,000
53512-U
50,000
53531-U
50,000
内径
長さ
HILIC
OH5
ES-Cyano
（mm）
（cm）
CAT.NO.
価格（¥）
CAT.NO.
価格（¥）
CAT.NO.
価格（¥）
分析カラム
2.1
2
－
－
53779-U
63,000
53494-U
63,000
2.1
3
53933-U
70,000
53748-U
76,000
53468-U
70,000
2.1
5
53934-U
70,000
53749-U
76,000
53470-U
70,000
2.1
7.5
53938-U
74,000
53755-U
82,000
53472-U
74,000
2.1
10
53939-U
82,000
53757-U
88,000
53473-U
82,000
2.1
15
53946-U
87,000
53764-U
98,000
53475-U
87,000
3.0
3
53964-U
70,000
53766-U
76,000
53476-U
70,000
3.0
5
53967-U
70,000
53767-U
76,000
53478-U
70,000
3.0
7.5
53969-U
74,000
53768-U
82,000
53479-U
74,000
3.0
10
53970-U
82,000
53769-U
88,000
53481-U
82,000
3.0
15
53972-U
87,000
53771-U
98,000
53483-U
87,000
4.6
3
53974-U
70,000
53772-U
76,000
53484-U
70,000
70,000
4.6
5
53975-U
70,000
53774-U
76,000
53486-U
4.6
7.5
53977-U
74,000
53775-U
82,000
53489-U
74,000
4.6
10
53979-U
82,000
53776-U
88,000
53491-U
82,000
4.6
15
53981-U
87,000
53778-U
98,000
53492-U
87,000
ガードカートリッジ、3 個入り ※ガードカートリッジホルダー（Cat.No.53500-U）は別売りです。
2.1
3
53520-U
50,000
53780-U
50,000
50592-U
50,000
3.0
3
53521-U
50,000
53781-U
50,000
50593-U
50,000
4.6
3
53523-U
50,000
53782-U
50,000
50597-U
50,000
RP-Amide
CAT.NO.
価格（¥）
CAT.NO.
価格（¥）
53797-U
53910-U
53911-U
53912-U
53913-U
53914-U
53915-U
53916-U
53917-U
53918-U
53919-U
53921-U
53922-U
53923-U
53929-U
53931-U
63,000
76,000
76,000
79,000
87,000
89,000
76,000
76,000
79,000
87,000
89,000
76,000
76,000
79,000
87,000
89,000
53592-U
53566-U
53567-U
53568-U
53569-U
53571-U
53574-U
53576-U
53577-U
53578-U
53579-U
53581-U
53583-U
53584-U
53590-U
53591-U
63,000
76,000
76,000
82,000
88,000
98,000
76,000
76,000
82,000
88,000
98,000
76,000
76,000
82,000
88,000
98,000
53514-U
53516-U
53519-U
50,000
50,000
50,000
53594-U
53597-U
53599-U
50,000
50,000
50,000
Peptide ES-C18
CAT.NO.
価格（¥）
－
53299-U
53301-U
53304-U
53306-U
53307-U
53308-U
53311-U
53312-U
53313-U
53314-U
53316-U
53318-U
53323-U
53324-U
53328-U
－
68,000
68,000
72,000
80,000
85,000
68,000
68,000
72,000
80,000
85,000
68,000
68,000
72,000
80,000
85,000
53536-U
53537-U
53542-U
50,000
50,000
50,000
キャピラリーカラム
内径
（μm）
75
100
200
300
500
1000
75
100
200
300
500
1000
長さ
（cm）
5
5
5
5
5
5
15
15
15
15
15
15
C18 (90Å)
CAT.NO.
価格（¥）
53982-U
90,000
53985-U
90,000
53989-U
90,000
53992-U
90,000
53998-U
90,000
582711-U
90,000
54219-U
98,000
98,000
54256-U
54261-U
98,000
54271-U
98,000
54273-U
98,000
－
－
C8 (90Å)
CAT.NO.
価格（¥）
53983-U
90,000
53987-U
90,000
53991-U
90,000
53997-U
90,000
53999-U
90,000
－
－
54229-U
98,000
54260-U
98,000
54262-U
98,000
54272-U
98,000
54275-U
98,000
－
－
Peptide ES-C18 (160Å)
CAT.NO.
価格（¥）
53543-U
90,000
53544-U
90,000
53545-U
90,000
53546-U
90,000
53548-U
90,000
53547-U
90,000
53549-U
98,000
53552-U
98,000
53553-U
98,000
53554-U
98,000
53558-U
98,000
53561-U
98,000
※その他の固定相についてもカスタムにて 5 cm あるいは 15 cm 長さのキャピラリーカラムをご提供できます。
分取カラム
固定相
C18
内径（mm） 長さ（cm）
10
15
CAT.NO.
53793-U
価格（¥）
350,000
F5
Ascentis® Express 5 μm HPLC カラム
・推奨操作最大圧
9,000 psi（60 MPa, 600 bar）
・使用温度～ 60 °C（ES シリーズ～ 100 °C）
内径
長さ
C18
C8
Phenyl-Hexyl
ES-Cyano
F5（PFP）
HILIC
OH5
（mm） （cm） CAT.NO. 価格（¥） CAT.NO. 価格（¥） CAT.NO. 価格（¥） CAT.NO. 価格（¥） CAT.NO. 価格（¥） CAT.NO. 価格（¥） CAT.NO. 価格（¥）
分析カラム
2.1
2
50507-U 63,000 50362-U 63,000 50442-U 63,500 50557-U 63,500 50603-U 64,000 50255-U 63,500 50313-U 64,000
2.1
3
50508-U 65,000 50363-U 65,000 50443-U 65,500 50558-U 65,500 50604-U 66,000 50256-U 65,500 50314-U 66,000
2.1
5
50509-U 68,000 50364-U 68,000 50446-U 68,500 50559-U 68,500 50605-U 69,000 50257-U 68,500 50317-U 69,000
2.1
7.5
50511-U 72,000 50367-U 72,000 50451-U 72,500 50562-U 72,500 50607-U 73,000 50258-U 72,500 50321-U 73,000
2.1
10
50517-U 80,000 50368-U 80,000 50454-U 81,000 50563-U 81,000 50612-U 82,000 50260-U 81,000 50322-U 82,000
2.1
15
50518-U 85,000 50372-U 85,000 50455-U 86,000 50564-U 86,000 50613-U 87,000 50261-U 86,000 50327-U 87,000
2.1
25
50521-U 97,000 50373-U 97,000 50456-U 98,000 50566-U 98,000 50614-U 99,000 50262-U 98,000 50328-U 99,000
3.0
3
50522-U 65,000 50376-U 65,000 50459-U 65,500 50567-U 65,500 50615-U 66,000 50264-U 65,500 50329-U 66,000
3.0
5
50523-U 68,000 50377-U 68,000 50464-U 68,500 50568-U 68,500 50616-U 69,000 50265-U 68,500 50335-U 69,000
3.0
7.5
50525-U 72,000 50378-U 72,000 50466-U 72,500 50569-U 72,500 50619-U 73,000 50268-U 72,500 50336-U 73,000
3.0
10
50526-U 80,000 50381-U 80,000 50469-U 81,000 50570-U 81,000 50622-U 82,000 50269-U 81,000 50338-U 82,000
3.0
15
50527-U 85,000 50382-U 85,000 50470-U 86,000 50574-U 86,000 50623-U 87,000 50270-U 86,000 50339-U 87,000
3.0
25
50528-U 97,000 50385-U 97,000 50472-U 98,000 50575-U 98,000 50624-U 99,000 50276-U 98,000 50341-U 99,000
4.6
3
50529-U 65,000 50386-U 65,000 50474-U 65,500 50577-U 65,500 50625-U 66,000 50278-U 65,500 50343-U 66,000
4.6
5
50530-U 68,000 50389-U 68,000 50477-U 68,500 50581-U 68,500 50626-U 69,000 50284-U 68,500 50344-U 69,000
4.6
7.5
50533-U 72,000 50390-U 72,000 50479-U 72,500 50583-U 72,500 50627-U 73,000 50286-U 72,500 50345-U 73,000
4.6
10
50536-U 80,000 50391-U 80,000 50482-U 81,000 50585-U 81,000 50628-U 82,000 50288-U 81,000 50346-U 82,000
4.6
15
50537-U 85,000 50392-U 85,000 50483-U 86,000 50588-U 86,000 50631-U 87,000 50289-U 86,000 50347-U 87,000
4.6
25
50538-U 97,000 50394-U 97,000 50487-U 98,000 50591-U 98,000 50632-U 99,000 50294-U 98,000 50348-U 99,000
ガードカートリッジ、3 個入り ※ガードカートリッジホルダー（Cat.No.53500-U）は別売りです。
2.1
0.5
50539-U 50,000 50395-U 50,000 50496-U 50,000 50592-U 50,000 50633-U 50,000 50295-U 50,000 50349-U 50,000
3.0
0.5
50541-U 50,000 50396-U 50,000 50497-U 50,000 50593-U 50,000 50634-U 50,000 50297-U 50,000 50350-U 50,000
4.6
0.5
50542-U 50,000 50399-U 50,000 50498-U 50,000 50597-U 50,000 50635-U 50,000 50298-U 50,000 50355-U 50,000
※分取カラムは内径 10 mm、長さ 5 cm、10 cm、15 cm、25 cm にてカスタムで承ります。
品名
Ascentis Express ガードカートリッジホルダー（チタニウム製 Hybrid フェラル付）
交換用チタニウム製 Hybrid フェラル、10 個入り
Ascentis
3, 5, 10 µm
*
*
*
*
*
*
2)
3)
Ascentis Express
2.7 µm
5 µm
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
固定相
タイプ
結合密度 1)
µmol/m2
C18
3.5
Peptide ES-C18
3.4
C8
3.7
RP-Amide
3.0
Phenyl-Hexyl
3.4
ES-Cyano
2.5
F5(PFP)
3.6
HILIC(Silica)
n/a
OH5(Pentahydroxy)
3.5
pH
範囲
2～9
1～9
2～9
2～9
2～9
1～8
2～8
2～8
2～9
CAT.NO.
53500-U
51391-U
エンド
キャッピング
あり
なし
あり
あり
あり
あり
あり
なし
なし
価格（¥）
38,000
34,000
USP
コード
L1
L1
L7
L60
L11
L10
L43
L3
－
1) 結合密度は Ascentis Express の値、2) Ascentis は Phenyl-butyl、3) Discovery® HS シリーズ
ホルダー
ガードカートリッジ
Ascentis カタログ
（SAJ1360）
Ascentis Express 2.7 µm
カタログ（SAJ1304）
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use. Additional terms and conditions may apply. Please see product information on the Sigma-Aldrich website at sigma-aldrich.com. Ascentis, CHROMASOLV, Discovery and HybridSPE are registered trademarks of
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弊社ファインケミカル事業部までお問合せ願います。
お問合せは下記代理店へ
シグマ アルドリッチ ジャパン
〒140-0002 東京都品川区東品川2-2-24 天王洲セントラルタワー4階
製品に関するお問い合わせは、弊社アナリティカル製品グループへ
TEL：03-5796-7440 FAX：03-5796-7355
E-mail：[email protected]
在庫照会・ご注文方法に関するお問い合わせは、弊社カスタマーサービスへ
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E-mail：[email protected]
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