ProteasomeinhibitorsincreasetheK v 1.5 channel

1
8
米子医誌
JYonagoMedAss5
3， 1
8
2
9，2
0
0
2
プロテアソーム間害薬は細胞内輸送を修飾することで
Kv1
.5チャネル活性を増加させる
鳥取大学医学部内科学第一教室(主任重政千秋教授)
加藤
克
Proteasomei
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b
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Masaru KATO
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1InternalMedicine，Totlori Universiか
F
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1
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1Medicine Yonago683-8504，Ja
ρan
ABSTRACT
One mechanism f
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n
はじめに
Kvl
.5チャネルは六回膜貫通型のイオンチャ
Kur とよばれる外向き K+ 電流を構
ネルであり， I
L血管平滑筋2)，小脳など
成する.これは主に心臓 l
の神経細胞 3， 4)，肺や骨格筋5)そして
F
垂体などの
プロテアソーム姐害薬と Kvl
.5
チャネル
1
9
内分泌器官 6，i)に多く発現し，その興奮性を司る
が示されおり，ユピキチン化された膜蛋白質がど
重要なイオンチャネルであり，心臓では心室より
も心房 8)に豊富に存在し心房筋の短い活動電位を
のような系で分解され，ブロテアソーム系が如何
に関与しているかは不明である 22) さらに， Kv
作る役割を担っている.近年，僧 1)自弁膜症を有する
1
.5チャネルはs
h
o
r
t
1
i
v
e
蛋白質 1
1
1に分類されてい
慢性心房細動患者の心房筋で、はKvl
.5チャネルの
.5チャンネ
減少が証明されており 9，10) このKv1
るが，その分解経路およびそれに伴う細胞内輸送
経路に関しては不明で、ある.
ルの減少が心房細動の難治化にも関連すると推定
今l
!
i
]，著者は Kvl
.5cDNAをCOS7細胞に遺伝
子導入して発現させ， Kvl
.5
チャネルの分解経路
されている.
一般的に，蛋白質の量は転写及び翻訳による合
と細胞内輸送経路について検討した.その結果，
成とライソゾームおよびプロテアソームによる分
Kv1
.5
チャネルはユピキチン化された後プロテア
解により規定されている.イオンチャネル蛋白質
ソーム系により急速に分解され，この過程におい
の合成に関する制御については多くの研究がある
ては 1
)ソソーム/エンドソーム系の関与はほとん
が，分解による制御についての研究は少ない.上皮
どないことが判明した.さらに，ユピキチン/プロ
Na+ チャネル
c
y
c
t
i
cf
i
b
r
o
s
i
stransmembrane
テアソーム系を阻害することにより Kvl
.5チャン
r
e
g
u
1
a
t
o
r (CFTR)と呼ばれるCl-チャネルやgap
ネル蛋白質は小胞体からゴルジ体，微小管を経て
j
u
n
c
t
i
o
nを構成する Connexin43などは，チャンネ
細胞膜へと輪 i
きされる最が増加し，機能的な Kv
ル蛋白質の分解が著しく速いs
h
o
r
tp
r
o
t
e
i
nである
ことが知られており 11にこの速い分解にはユビキ
1
.5チャネルが増えることも明らかにした.
方 法
f
fうこと
チン/プ口テアソーム系が重要な役割を:j:
が明らかになってきた.細胞膜蛋白質のプ口セッ
シンク市の過程では，まず核内で転写されたmRNA
薬剤と抗体
Lipofectamineキットは Gibco社よ
り
， ProteinGagaroseb
e
a
c
l
s，
ECLキットはAmer-
をもとに，細胞質のリボソームで翻訳された蛋白
sham;
社より， MG132，
B
r
e
f
e
1
c
l
i
n
eA，コルヒチンは
質が小胞体へ輸送される.そこでシグナル配列の
Shigl
1
1a社より，抗F1ag抗体，抗マウス IgG抗体，抗
切断とコア糖鎖の転移が行われた後，分子シャペ
ユピキチン抗体は Biotechno1ogy社より， Go1gi-
ロンにより品質管理を受け，完全な糖鎖の修飾を
GFP，
Enclosome-GFPはC10ntech
社より， F
1
u
o
r
eシ
受けた後，ゴルジ体を経て細胞膜へ輸送され
る1
2，1
3
) 小胞体で品質管理を受けた不完全な蛋
cent conjugate抗マウス IgG抗体は Mo1ecu1ar
p
1
0
b
e社より購入した.
白質の一部はユピキチン化され，プロテアソーム
により分解される経路とゴルジまたは細胞膜から
プラスミドの作製と遺伝子導入
rat-Kv1，5
リソソーム/エンドソーム系により分解される経
cDNAのC末端に F1agのepitope-tag (5'-GAC-
路があるといわれている.このユピキチン/プ口テ
TACAAGGACGATGACGACAAG-3'; N5
/
ミ
-
アソーム系による分解はまずu
b
i
q
u
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i
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a
c
t
i
v
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i
n
g
DYKDDDDK-C末)を付けCMVpromoterを有
enzyme (
E
l
)
， u
b
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t
i
n
c
o
n
j
u
g
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t
i
n
genzyme (E
する真核細胞発現ベクター (pRC/CMV) に組み
2) ，および~ubiquitin-1igase (
E3
)の働きで際的蛋
込み込んだベクター (F1ag-Kv1，
5
) をCOS7細
白質の 1
)ジン残基に複数のユピキチン分子が共有
4，1
5
) ユビキチン化された蛋白はスレオ
結合する 1
胞に遺伝子導入し発現させた.遺伝子導入は
ニンプロテアーゼである 26Sプ口テアソームによ
5，1
6
) 最近の研究で，前述のイオン
り分解される 1
導入効率は 5-10%であった.
チ ャ ネ lレ 蛋 白 質 の ほ か に 細 胞 時 期 蛋 白 質 ，
NFKBI7)，
p5318)，
c-JunI9)などの核蛋自質もこの系
パルスーチェイス法による蛋白質分解速度の灘定
により分解制御を受けていることが明らかにされ
ている.一方，最近，チロシンキナーゼ受容体 20)や
1
i
p
o
f
e
c
t
al
1
1i
n
eキットを用いて行った.その遺伝子
培養したCOS7細胞にF1ag-KvL5を遺 i
去子導入
(
約 3時間)し，その後DMEMCDu1becco'sM
o
c
l
i
-
f
i
e
c
lEag1eM
e
c
l
i
ul11)と，ブロテアソーム阻害薬で
ピキチン化された後プ口テアソーム系ではなくリ
ある MG132 (
5
0f
1抗 /0 またはリソソーム/エン
0，4l
1
1M/O
ドソーム姐害薬であるク口ロキン (
ソソーム/エンドソーム系により分解されること
を含むDMEMにて培養した(37"C，
5%C02，
2
41
J
i
f
f
成長閤子受容体 2lJ膜輸送体などの膜蛋白質はユ
2
0
加藤
間).培養した細胞を phosphate-buffered
s
a
1
i
n
e(PBS)で 2回洗浄後，メチオニン (
M
e
t
)を含
， MG132(
50μM/L)またはクロ
まない DMEM と
ロキン (
0
.
4mM/L) 含有， Met
不含 DMEMで 4
時間培養した PBSで 2田後洗浄後:日 S-Metで細
抱内選白質を l時間標識 (
37
"C，
5%C02)した.そ
の後， PBSで 2回洗浄後，溶解液を加えて， 0，1，
3，6，1
2，1
8，2
4時間ごとに COS7細胞を回収した
(
3
5
S
1
a
b
e
1
e
dm
e
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n
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/
F
1
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g
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dp
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)
.
P
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i
n
Ga
g
a
r
o
s
eb
e
a
d
s~こ抗F1ag抗体を加え，
鼠で 1時間転倒混和し，特異的 F
1
a
g
抗体を結合さ
せた.その後，この抗 F1ag抗 体 結 合 ProteinG
a
g
a
r
o
s
eb
e
a
d
sをおS-Metで標識した試料に加え，
転倒混和し結合させた (
4 C，
2
4時間).免疫沈降後
0
の試料を採取して，電気泳動後，そのシグナルをフ
ルオログラムで検出した.
lag-Kvl.5の検
免疫沈降法によるユビキチン化 F
細胞に F
1ag-Kvl
.5
を遺依子導
出 培養した COS7
時間)し，その後MG132(50μM/L)添加 2
4
入(約3
克
を用い，電気泳動 (
2
0
0m V，
1
8
0m A，
4
0分)し，膜
に転写(18
0m A，
2
時間)した後，膜を PBSで 2回
洗浄後， 5%ミルク +0.1%Tween20を加え b
1
o
c
k
i
n
g
(4 C，
2
4時間)を行った.膜を TBSで 1回洗浄
0
後
， 5%ミルクで 1
0
0
0倍希釈した一次抗体(抗 F
1
a
g
抗体)を 4
5分間反応させた .TBSTで 2回洗浄，
TBSで 1閉洗浄後， 5%ミルクで 4
0
0
0倍希釈した
二次抗体(抗マウス IgG
抗体)で 3
0分間反応させ
た .TBSTで 3凹洗浄， TBSで l回洗浄後， ECLキ
ットを用いてそのシグナルを検出した.
くv1
.5
チ
ホールセルパッチクランプ法による発現 i
1ag-Kvl
.5
およびg
r
e
e
nf
l
u
o
r
e
s
ャネルの測定 F
c
e
n
tp
r
o
t
e
i
n(GFP)を含んだプラスミドを COS7
細胞に遺伝子導入し，培養 48~72 時間後にホール
セルパッチグランプ法を用いて全膜電流を記録し
0m Vより十 6
0m Vまで 2
0m V
た.保持電位一 6
毎の脱分極パルス (
5
0
0msec)を与えた.Kv1
.5
チ
ャネルの選択的問害剤である 1 m
抗 4
ーアミノピ
リジン (
4-AP)の存在下および非存在下でそれぞ
時開後，試料に溶解液を加え，ピペットで撹枠後遠
れ膜電流を記録し， 4-AP
感受性成分を Kv1
.5
由来
心し，上清を採取した.その後， P
r
o
t
e
i
n
Ga
g
a
r
o
s
e
beads結合抗 F1ag抗体を加え 1時間免疫沈時さ
amp1eb
u
f
f
e
rを加えた.
せ，沈殿には電気泳動用 s
10%SDS-PAGEゲ jレを用い，電気泳動 (
2
0
0mV，
の IKur電流とした.脱分極直後のピーク電流値
180 m A，40分 ) 後 ， ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜
C
I
n
m
o
b
i
l
o
n
eP
) に転写した後(18
0m A，
2
時間)
，膜を PBSで 2剖洗浄後， o
.5%glutara1dehyde/
0
.
1M p
o
t
a
s
s
i
u
mp
h
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s
p
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eb
u
f
f
e
r(
p
H
7
.
0
)に
2
0分浸し， PBSで 2回洗浄後， 5 %ミルクにて
b
1
0
c
k
i
n
g(4 C，
2
4時間)した.膜を T
r
i
s
b
u
f
f
e
r
e
d
s
a
l
i
n
e(TBS)で 1回洗浄後， 1
0
0
0倍希釈した一次
抗体(抗ユピキチン抗体)を含む 0.5% ミルク十
O
.1
% Tween20で4
5分間反応させた.TBST(
lx
TBS+0.05%Tween20)で 2間洗浄， TBSで l回
0
0
0倍希釈した二次抗体(抗マウス IgG
洗浄後， 3
抗体)を含む TBSTで3
0分間反応た.その後TBST
で3田洗浄， TBSで l
回洗浄後， ECLキットを用い
C
l
z，0
.
5
;N-2-hydroxyethy1piperazine-N'-2e
t
h
a
n
e
s
u
l
f
o
n
i
cacid(HEPES)，5
.
0 (pH=7.4，
NaOH で滴定) ，細胞内液として電極内液:
K
A
s
p
a
r
t
a
t
e，140.0;MgC
，
b 5
.
0
;K2-ATP，5
.
0
;
EGTA，
5
.
0
;HEPES，5.0(pH =7.2，
KOHで滴
0
てそのシグナルを検出した
を計測し，電流電庄曲線を求め，電流値を比較し
た.実験には，細胞外液として Tyrode's液
(mM/L) :NaC1，1
4
0
;KC1，5
.
4
;CaC
，
b 1
.8
;Mg
定)を用いた.
共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫蛍光抗体染色
による検討 カバーガラス上に COS7
細胞を培養
.5を遺伝子導入(約 3
時間)し， M G
し
， F1ag-Kv1
1
3
2 (50μM/L)存在下，非存在下で 2
4時間培養
後
， 4%パラホルムアルデヒドで固定した.一次抗
F
1
a
g抗体 Z
:1時間，二次 F
1
u
o
r
e
s
c
e
n
tc
o
n
j
u
g
a
t
e抗
抗体でさらに一時間反応させた後，共
マウス IgG
焦点レーザー顕徴鏡を用いてそのシグナルを観察
ウエスタンプロット法による F
lag-Kv1
.5
蛋自の
細胞に F
1ag-Kvl
.5
を遺伝子
検出 培養した COS7
導入(約3
時間)し，その後班 G
132(50μM/L)を加
え2
4時間後，試料に溶解液を加え，ピペットで撹持
後遠心し，上清を採取した .10%SDS-PAGEゲ lレ
し
， F1ag-Kv1
.5
の縮胞内局在を観察した.ゴ jレジ
体の染色には G
o1gi-GFPを，エンドソーム染色に
1ag-Kv1
.5とともに発現さ
はEndosome-GFPをF
せた.
21
プロテアソーム阻害薬と Kvl
.5
チャネル
A
B
対照
o
21
8 24
1 3 6 1
・
・10 2141・
1
・
2
0
2
2
2
4
・
MG1
3
2
o
1
024
3 61
21
8 24(hr)
(
h
r
)
唱
O
対照
MG132
C
D
N
.
S
.
対照
MG132
N
.
S
.
対照
MG132
80kD
図1.パルスーチェイス法による i
くv1
.5チャネル蛋白質分解速度測定 (A，
B
)，
免疫沈降法による
.5チャネル蛋白質定量 (C)，ウエスタンブロ ッ ト法による l
くv1
.5チャネ
ユビキチン化 Kv1
ル蛋白質の検出 (
D
)
時間，デー タ未提示)•
結 果
プロテアソーム阻害による Kv1
.5チャネル蛋白質
プ口テアソーム阻害による￨く v1
.5
チャンネル蛋白
の分解速度時間の変化
質とユビキチン化の増加
非存
免疫沈降法によりユビキチン化 された F
lag
-Kv
在下でのパルス ーチェイス法により検出された
1
.5
蛋白質量を示したものである(図 1C).
F
l
ag-
F
lag
-Kv1
.5チャネル蛋白質の時間に伴う減少を
示す(図 1A) .対照では 1
2時間後には F
lag-Kv
Kv1
.5を組み込んでいない プラスミ ドを遺伝子導
入した COS7細胞 (
N.
S
.)に比べFlag-Kv1
.5を
1
.5
チャネル蛋白を示すバンドの輝度が著明に減
組み込んだプラス ミドを遺伝子導入した C
OS7
細
少しているが， MG13
2存在下 1
2
時間後でも明 らか
胞 (
対照)ではユビキチン化に特有のスメアを認
なバンドの輝度の減少を認めなかった.デンシト
めた .さらに， M G1
3
2を前処置下することにより
メトリ ーを用いてグラフ化し， F
l
a
g-K
v1
.5
の半減
スメアの増強が認められたこの結果は F
lag-Kv
.
2時間で，
期を算 出 したもので，対照の半減期は 9
1
.5
チャンネルがユビキチン化を受けており， さら
プロテアソーム阻害剤の MG13
2存在下
MG13
2の前処置の半減期は 2
5
.
4時間と 2
.
8倍に延
にプロテアソームを阻害するとその分解が止ま
長した(図 1B) .同様な実験4例を行 った結果，
り，ユビキチン化 した F
lag
-K
v1
.5
チャネルが蓄積
MG13
2はF
l
agKv1
.5
の半減期を有意に延長した
(
P<O.05
)
.一方，リソソーム/エンドソーム 阻害
することを示す.ウエスタンプロット法による
薬であるクロロキンの前処置では， F
l
a
gKv1
.5
の
半減期の有意な延長は認めなかった (
t
I
/2
=12.9
F
lagKv1
.5チャネルを示す(図 1D).
対照では
8
0kDaのF
lag
-Kv1
.5
チャネルのバンドが認めら
2前処置下で、バンドの増強が
れる.さらに， MG13
2
2
克
加藤
A
B
C
D
図2
.共焦点顕微鏡による￨く v1
.5チャネル蛋白質 (A，
C)，ゴルジ体 (
8)，
エ ンドソーム
(
0)の局在.
認められ，プロテアソームを阻害すると分解され
るという 2種類の分布を示す核周囲に存在する
.5チャネルが減少し，結果として Kvl
.5チ
るKvl
ャネル蛋白質が増加することを示している
Kvl
.5は，ゴルジ体と局在が一致しているまた，
細胞質の Kvl
.5
は網目状の小胞休に存在す る 図2
Dは点状に分布しているエンドソームの局在を示
.5チャネル蛋白質
プロテアソーム阻害による Kv1
し，図 2
Cに示す同一細胞での Kvl
.5
の局在と一致
の細胞内局在変化
共焦点レーザー顕微鏡により COS7細胞で の
しないことより， Kvl
.5はエンドソームには存在
Flag-Kvl
.5の局在とゴルジ体，エンドソームの
マーカ ー との位置的な関係を調べた .
図 2Bはゴル
は
， Kvl
.5が小胞体で合成された後コ、ルジ体へと
輸送されてプロセッシングを受けるものと考えら
ジ体の細胞内局在 を示し，ゴルジ体は核の周囲 に
れる.図 3はMG132で前処置した時の Kvl
.5の局
存在する.図 2
Aは同一細胞での Kvl
.5の細胞 内局
在を示すが，小胞体とゴルジ体のどちらでも増加
在を示すが，核の周囲と細胞質に網目状に存在す
している .
していないことが判 明した.以上の形態学的所見
プロテアソーム阻害薬と Kvl
.5
チャネル
2
3
図3
.共焦点顕微鏡による MG132前処置時 l
くv1
.5
チャネル蛋白質の局在.
.5チャ ネルに
プ口テアソーム阻害が細胞膜の Kv1
及ぼす効果
Flag-Kv1
.5を発現させた COS7
細胞の MG13
2
前処置・非前処置での Kv1
.5チャネル電流を記録
したものである(図 4
) 保持電位
6
0m Vから
+20mV間隔で'
50
0ms
e
cの脱分極刺激を 3秒に I
度与えて得た Kv1
.5
電流を記録した後， Kv1
.5チ
ャネ jレの選択的阻害剤の 4
-APを投与に より，減
少した電流成分を Kv1
.5チャネルとした.対照に
比 べ MG13
2前処置では電流が増大し，さらに 4
APで抑制 されない電流成分 を差しヲ ￨
し
、
た Kv1
.5
の電流も MG13
2の前処置で増大していることが
わかる(図 4A，
図 4B).
4-AP感受性の電流成分と
膜電位との関係をプロットしたものである(図 4
C).
-2
0m Vより脱分極側で
， M G前処置群では有
意に電流の増大が認められた .この事実はプロテ
アソームを抑制 することにより，細胞膜の Kv1
.5
チャネルが増加す ることを示す
プロテアソーム阻害による Kv1
.5チャネル電流増
加作用に対する B
r
e
f
e
l
d
i
n
eA及びコルヒチ ンの影
響
前述の細胞内局在の結果 から， Kv1
.5チャネル
Bre
f
e
l
d
i
n
eAは小胞体からゴルジ体への蛋白質輸
送を選択的に阻害するが， Bre
f
el
d
i
n
eAで前処置
すると MG13
2による Kv1.5チャネルの増加が有
意に 抑制 されることより(図 5
)，MG13
2のKv1
.5
チャネルの増加は小胞体からゴ、ルジ体への輸送量
の増加によると考えられるまた，コ jレヒチンは微
小管を切断する作用を有しているが，コルヒチン
で前処置でも MG13
2のKv1
.5チャネル増加作用
が減弱さ れることがわかる(図 5
).このことは，ゴ
ルジ体から細胞膜への輸送は微小管を介している
可能性を示し， MG13
2前処置による Kv1
.5チャネ
ル増加は，ゴルジ体から微小管を 介して の輸送の
増加により生じることによると考えられる.
考 察
イオンチャネルの半減期に関しては半減期の短
いs
h
o
r
t
l
ivedp
r
o
t
e
i
nのイオンチャネルと長い
l
ongl
ivedp
r
o
tei
nのイオンチャネルの 2種の報
告があるが， S
h
o
r
t
l
i
v
e
dprot
e
inについては gap
j
u
n
c
t
i
o
nを構成するチャネルである c
onnexi
n4
3が
1
.3
時間 11)，
下垂体細胞 での Kv1
.5
チャネルが 4
時
間6)，また上皮Na+チャネル (
EnaC)が 1
時間の半減
期 23)と報告されている .
Longl
i
vedp
r
o
te
i
nの半減
は小胞体 からコゃルジ体へと輸送され， MG13
2によ
8neuroblastomac
elsのvo
l
t
a
g
e-gat
e
d
期は， N1
Na+チャネルが 2
6時間 24)であり， 神経 ・筋のアセ
りこの輸送系路が促進 されるのみならず Kv1
.5
電
チルコリン受容体が 1日25)，
vol
t
a
g
e
-g
a
t
e
dCa2+チ
流の増 加 が引 き起こされることを示している .
ャネルが 1
5から 2
0時間 26)と報告されている本研
2
4
加藤
克
A:対照
匡雪
以
主
一
戸一
r.......~.....-
5
0
0msec
b
a
s
a
l
4-APs
e
n
s
i
t
i
v
ec
u
r
r
e
n
t
(
n
A
)
3
C
2
…)
7
'
1
*
frE
対 照 (n=14)
8
06
00
4
0 ・2
駒
2
04
06
08
0
(
m
V
)
くv1
園4
.ホールセルパッチクランプ法による発現 i
.5
チャネルの測定.
，
材
(
*
P
<
0
.
0
5 P<O.01
)
.
2時間であり
究での Kv1
.5チャネ lレの半減期は 9
.5
チャネルは s
Kv1
h
o
r
t
l
i
v
e
dp
r
o
t
e
i
n
'こ属し，時間
研究と，ラット培養心筋細胞を用いて半減期を測
定した研究では差を認めていないこと 11)から，
単位でその発現量が制御されていると考えられ
た.しかし，この半減期は培養下垂体細胞を用いた
報告 6)の4
時間よりも少し遅い速度で分解されて
いる.この差は Takimotoら6)が培養下垂体細胞そ
回の半減期の差は用いた細胞による差ではなく，
測定法の違いによると考えられる.理想的には心
筋細胞の n
a
t
i
v
eKvl.5チャネル蛋白の半減期をパ
.5
のものの n
a
t
i
v
ec
e
l
lを用いて Kv1
チャネルの分
解の半減期を測定しているのに対して，著者は培
.5
チャネルを
養COS7細胞に遺佳子導入した Kv1
用いて半減期を測定しており，用いた細胞，実験条
件の違いによる可能性が考えられる.さらに，
.5
Takimotoら6)はKvl
蛋自の半減期を，免疫沈降
法を用いて測定しているのに対して，本実験では
パルスーチェイス法を用いている点が異なる.使用
、
は
した細胞の差については，例えば Conexin43で
s
2
0細胞を用いて半減期を測定した
CHO細胞や t
ルスーチェイス法で追跡することが望ましいが，
チャネ lレは胎児培養心筋細胞では発現が少
.5
Kv1
なく，さらに Kv1
.5チャネルは心房筋に有意に発
現していることから心筋細胞を用いての n
a
t
i
v
e
.5
チャネル蛋白の半減期を測定することが難
Kv1
しい.そのため，本研究では培養 COS7細胞に Kv
1
.5チャネルを遺伝子導入した条件での半減期の
検討を行った.
多くの s
h
o
r
t
l
i
v
e
d細胞質蛋白質は複数のユピ
キチンが共有結合した後 20Sプロテアソームを含
んだ 26Sプロテアソームによりすみやかに分解さ
プロテアソーム阻害薬と Kvl
.5
チャネル
2
5
3
k
*
3
円
ぷ
(
﹀ε
oω 百︿ C)
nコ17
﹂コ﹀-
。
C
o
n
t
r
o
l
MG132 MG132 MG132
+Bre
+
コ jレヒチン
圏5.MG132前処置時￨く v1
.5
電流増加作用に対しての B
r
e
f
e
l
d
i
n
e
A(
B
r
e
)
およびコルヒチンの作用. (*P<0.05)
れる 14. 27)今回の実験系では， Kvl
.5チャネルは
ネl
レ
はu
b
i
q
u
i
t
i
n
a
c
t
i
v
a
t
i
n
genzyme (El
)
， u
b
i
-
ユピキチン化後速やかに分解された.この分解速
一c
o
n
j
u
g
a
t
i
n
genzyme (E2
)，u
b
i
q
u
i
t
i
n
lト
q
u
i
t
i
n
gase (
E
3
)の働きで標的蛋白質のリジン残基に一
)
，
ユ
個または複数のユピキチンが共有結合し 14. 日
度はブロテアソーム阻害剤である MG132により
半減期が 2
.
8倍延長する事実から， Kvl
.5
チャネル
はユピキチン/プロテアソーム系で主に分解され
ピキチン化された蛋白質はスレオニンフ。ロテアー
ることが判明した.近年，チロシンキナーゼ受容
体20)や成長因子受容体 21)などの膜蛋白質はユピキ
ゼである 26S ブ ロ テ ア ソ ー ム に よ り 分 解 さ れ
.5
チャネルにはリジン残基が複
る15. 16) 実際 Kv1
チン化された後，プロテアソーム系ではなく，リソ
数個存産しており，そのリジン残基を標的にして
ソーム/エンドソーム系での分解が主であると報
NaC23)やconnexin4311)の半
告されている.また E
ユピキチン化が起きると推定される.どのリジン
残基がユピキチンの標的であるかについては，
害により共に延長することから，リソソーム/エン
s
i
t
e
d
i
r
e
c
t
e
dmutagenesisで作成した点変異の Kv
1
.5
チャネルを使用した検討が今後必要である.本
ドソーム系のみならずプロテアソーム系により分
研究は s
h
o
r
t
l
i
v
e
d膜蛋白質である Kv1
.5チャネ
解されると報告された .ENaCやconnexin43のよ
ルはユビキチン化され，その後小胞体において品
うに一つのチャネル蛋白質に 2つの分解系が作用
質管理を受けた後にプ口テアソーム系により細胞
内分解を受けることを示している.この結果は，
減期はブロテアソーム阻害およびライソゾーム盟
する機序として小胞体で不完全に修飾された蛋白
質はプロテアソーム系で，完全に修飾された蛋白
質はリソソーム/エンドソーム系で分解される場
合が考えられ，完全に修飾された蛋白質と不完全
に修飾された蛋白質はそれぞれ独立した系で分解
されているとしている 2
3
) 本研究では，リソソーム
ENaCやconnexin43のようにプロテアソーム系と
リソソーム/エンドソーム系の 2つの系で，不完全
な蛋白質と完全な蛋白質とが独立した系で分解さ
れるのに対して， Kvl.5
チャネルはユピキチン/プ
阻害剤であるクロロキンの前処置ではその半減期
ロテアソーム系のみで分解されていると考えられ
る.
に差を認めなかったことから， Kvl
.5
チャネルの
Kv1
.5チャネル蛋白質の細胞内輪送についての
分解はユピキチン/プロテアソーム系が主に担っ
.5
チャ
ていると考えられる.前述したように， Kv1
報告はないため，今回の共焦点レーザー顕微鏡を
用いて細胞内小器官のマーカーと Kv1
.5
チャネル
2
6
加藤
との{立霞関係を検討した今回の研究結果は， Kv
1
.5
チャネルはエンドソームには無く，小胞体とゴ
ルジ体に存在することが明らかとなった.この結
果は小胞体で種々の分子シャペロンにより品質管
理を受けた Kv1
.5チャネルは，小胞体からゴルジ
体へと輸送されていることを示している 12，13)
つまり， Kv1
.5チャネルは一般の蛋自質と同様，小
胞体内でシグナル配列切断とコア糖鎖転移，さら
に糖鎖、のブロセッシンク、、を受けた後，分子シャベ
.5
ロンにより折りたたまれ正常な構造をもっ Kv1
チャネル蛋白質がゴルジ体へと輪送されていると
推測できる.この段階で， Kv1
.5
チャネルは小胞体
から細胞質へと送り出されユピキチン化の後にプ
ロテアソームにより速やかに分解されると推定で
きる.実際，ブロテアソーム阻害薬である MG132
の前処置により Kv1
.5
チャネルの局在はゴルジ体
と小胞体に増加していた.このことは Kv1
.5チャ
ネルが小胞体からゴルジ体へと輸送されている
が，プロテアソームを阻害すると分解されない Kv
1
.5蛋白質の量が増加し小胞体からゴルジ体へと
輸送が増加することを示す.この事実はパッチグ
ランプにより電気生理学的にも確認された， M G
1
3
2は膜の Kv1
.5
チャネル活性を有意に上昇させ，
r
e
f
e
l
d
i
n
eA及びコルヒチン
この MG132の作用は b
.5チ
により減弱された， MG132の作用により Kv1
ャネル活性が増加したことはプ口テアソームで分
解されている完全な糖鎖修飾を受けた蛋白の分解
が阻害され，結果的に正常な機能をもった Kv1
.5
チャネルの発現が増加することを意味し， Kv1
.5
チャネルはユピキチン/ブロテアソーム系のみで
不完全な糖鎖、修飾を受けた蛋白震と完全な蛋白質
とが分解されているとする前述の仮説を支持する
ものである， b
r
e
f
e
r
d
i
n
eAは新たに作られた蛋自
:
1
)こ
費の小胞体からゴlレジ体への輸送を阻害する 2
r
e
f
e
r
d
i
n
eAがMG132の作用を減
とを考えると， b
弱させたことは，プロテアソームを阻害すると小
胞体からゴルジ体への輸送蛋白量が増えて膜の
Kv1
.5チャネル活性が増加することを示唆する.
さらにコルヒチンは微小管を破壊する 28)ので，コ
ルヒチンが MG132の作用を減弱したことは，プロ
テアソームを阻害すると小胞体からゴルジ体を経
て微小管を通して膜への輸送蛋白量が増える結
果，膜の Kv1
.5チャネル活性が増加することを示
している.しかし，コルヒチンも MG132のKv1
.5
チャネル増加作用を完全には阻止していない.こ
克
の結果はユピキチン/プ口テアソーム系が小胞体
に関連しているのみならず，細抱膜に輸送された
Kv1
.5チャネルが i
n
t
e
r
n
a
l
i
z
a
t
i
o
nした後にユピキ
チン/プロテアソーム系で分解されている可能性
も否定できないことを訴す.
細胞内蛋白質輸送障害が原因で発症する疾患
9)
y
s
t
i
cf
i
b
r
o
s
i
s2
，
先
は，イオンチャネル病である c
0
)，高血圧を発症する L
i
d
d
l
e
天性 QT延長症候群3
症候群2
3
)，
lowd
e
n
s
i
t
yl
i
p
o
p
r
o
t
e
i
nr
e
c
e
p
t
o
rの異
常で発症する家族性高コレステ口ール血症， Na+
/
glucose~命送体の異常で発症する glucose-galac­
1
l，その他の先天性疾患など
t
o
s
emalabsorption3
がある.今回，プ口テアソーム阻害剤が細胞内チャ
ネル蛋白質の量を増加させ，細胞膜への輸送を促
進して膜の機能的な Kv1
.5
チャネルの活性を上昇
させることを明らかにした.この事実は c
y
s
t
i
c
fibrosis2
'l)や遺伝性 QT延 長 症 候 群 (N470D
HERG，G601SHERG，Y611HHERG，
V822M
2，3
3
)，
L
i
d
d
l
e症候群2
3
)などのチャンネ
HERG)30，3
ル蛋白質の輸送障害により生じる遺伝病を薬理学
的に制御できる可能性を示唆する， Zhouらぬ)は
HERG型K+チャネルが減少して致死性不整脈を
発症する 2
型遺伝性 QT延長症候群において，変異
HERGチャネル (N470D)がコア糖鎖転移のみ修
飾された未熟チャネルが増加し，一方で、完全に糖
鎖修飾された成熟チャネルが出来ないために
HERGチャネルが膜へ適正に輸送できないこと
を示した.さらに， HERGチャネル遮断剤 (E4
0
3
1，a
s
t
e
m
i
z
o
l
e，c
i
s
a
p
r
i
d
e
)が分子シャペロンと
して作用して完全に糖鎖修飾された成熟チャネル
を増加させることを示した， c
y
s
t
i
cf
i
b
r
o
s
i
sはc
y
s
t
i
cf
i
b
r
o
s
i
stransmembranec
o
n
d
u
c
t
a
n
c
er
e
g
u
l
a
t
o
r (CFTR)の細胞膜上での減少が原悶で生じ
るは)， S
a
t
o らお)は c
y
s
t
i
cf
i
b
r
o
s
i
sのcommonm
u
t
a
t
i
o
nであるムF508CFTRは
，w
i
l
dt
y
p
eと異なり p
r
e
G
o
l
g
i
lこ蓄積し分解される結果 CFTRが減少する
ことを示し，さらに g
l
y
c
e
r
o
lが完全に糖鎖修飾さ
れた成熟チャネルを増加させることを示した.こ
のように遺伝性膜蛋白質輪送異常症では，小胞体
での蛋白質の品質管理を制御することがその治療
に繋がると考えられる 36) 本研究でユピキチン/プ
ロテアソーム系を制御することで、機能的な Kv1
.5
チャネルを増加で、きた.心房の Kv1
.5
チャネルは
心房細動においてその発現が減少するため， Kv
1
.5
チャネルが減少し薬剤不応性の心房細動とな
プロテアソーム臨害薬と Kvl
.5
チャネル
ってしまう.そこでユピキチン/プロテアソーム系
を制御できる薬剤を探査できれば，薬剤の標的と
しての Kv1
.5チャネルを増加させることが，薬剤
不応性の心穿細動を治療できる新たな薬理学的治
療となり得ることが期待される.
結 論
① Kv1.5チャネルは速やかにユピキチン化さ
れ，プ口テアソームにより分解される s
h
o
r
t
1
i
v
e
d
p
r
o
t
e
i
nであり，その分解にはリソソーム/エンド
ソーム系の関与は少ない.②ブロテアソームを阻
害すると Kv1
.5チャネルの半減期が延長し，結果
としてチャネル蛋白質が増加する.③Kv1
.5
チャ
ネルの細胞内局在及び電気生理学的解析から Kv
1
.5
チャネルは小胞体，ゴルジ体，徴小管を経て細
胞膜に輸送され，プロテアソームを阻害すると小
胞体，ゴルジ体，微小管への輸送が増加し，細抱膜
で、の機能的 Kv1
.5
チャネルが増加することが判明
した.
稿を終えるにあたり，懇切なる御指導と御校聞を賜
りました鳥取大学医学部内科学第一教室重政千秋教
授，また御校閲楊りました鳥取大学医学部解剖学第ニ
教室井上費央教授，同生化学教室山田一夫教授に深甚
なる謝意を捺げます.直接御指導頂きました同神経生
物学教室二宮治明助教授，間内科学第一教室久留一郎
助教授，井 )
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多講師，佐々木紀仁先生，谷口晋一先生，大
田原顕先生をはじめ，御協力頭いた教室員各位に深く
御礼申し上げます.
文 献
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