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膜生物学グローバル COE 第 3 回ワークショップ 抄録集
膜生物学グローバル COE 第 3 回ワークショップ 抄録集 主催：神戸大学グローバル COE プログラム拠点 「総合的膜生物学の国際教育研究拠点」 1 膜生物学グローバル COE 第３回ワークショップ 日 時：平成２１年７月７日（火）∼８日(水) 場 所：淡路夢舞台国際会議場 レセプションホール B（2F） ◇１日目 (7/7) 14:00-14:05 ◆14:05∼ (※招聘者：発表 25 分・質疑 5 分／学内発表者：発表 20 分・質疑 5 分) 開会の挨拶 片岡 徹 座長：古瀬 幹夫 14:05-14:30 「膜局在型ジアシルグリセロールキナーゼ、DGKβの神経系における機能」 白井 康仁（バイオシグナル研究センター 准教授） 14:25-14:30 質疑応答 14:30-15:00 「運動する細胞のイノシトールリン酸群の局在」 清川 悦子（京都大学 医学研究科 講師） 質疑応答 14:55-15:00 15:00-15:30 15:25-15:30 15:30-15:45 ◆15:45∼ 15:45-16:15 16:10-16:15 16:15-16:40 16:35-16:40 16:40-17:05 17:00-17:05 17:05-17:30 17:25-17:30 「リン脂質フリップ・フロップと細胞運動の制御」 加藤 詩子（京都大学 化学研究所 助教） 質疑応答 ≪ コーヒーブレイク ≫ 座長：伊藤 俊樹 「イノシトールリン脂質の神経系における機能解析」 佐々木 雄彦（秋田大学 医学研究科 教授） 質疑応答 「PIP3 ホスファターゼ SKIP によるインスリンシグナル制御」 伊集院 壮（医学研究科 脂質生化学 助教） 質疑応答 「ホスホリパーゼ Cεの癌と炎症への関与に関する遺伝子改変マウスを用いた解析」 枝松 裕紀（医学研究科 分子生物学 助教） 質疑応答 「脈管形成と体液調節機構−マウス個体の表現型解析から膜生物学研究へ−」 平島 正則（医学研究科 血管生物学 ＧＣＯＥ特命准教授） 質疑応答 ◇１日目 (7/1・つづき) 17:30- ポスターセッションの準備等 17:45-18:30 ポスターセッション（奇数グループ） ※演題は 17 頁以降 18:30-19:00 ≪ 懇親会≫ 司会： 齋藤 尚亮 19:00-19:45 ポスターセッション（偶数グループ） ※演題は 17 頁以降 2 ◇２日目 (7/8) ◆8:45∼ 8:45-9:10 9:05-9:10 9:10-9:35 9:30-9:35 9:35-10:00 9:55-10:00 10:00-10:15 ◆10:15∼ 10:15-10:40 (※学内発表者：発表 20 分・質疑 5 分) 座長：片岡 徹 「絶食によって誘発されるキイロショウジョウバエの食欲増進機構」 石田 裕幸｛理学研究科 生体分子機構 GCOE 研究員（リサーチ・アソシエイト）｝ 質疑応答 「メタボロミクスの医学研究への応用」 篠原 正和｛医学研究科 脂質生化学 GCOE 研究員（リサーチ・アソシエイト）｝ 質疑応答 「活性化型変異体を用いた mTOR の機能解析」 大根 陽一郎（医学研究科 分子遺伝学 学術研究員） 質疑応答 ≪ コーヒーブレイク ≫ 座長：齋藤 尚亮 「極性上皮様細胞における頭頂部・基底側部の規定に関して」 田ノ上 拓自（医学研究科 神経情報伝達学 GCOE 特命助教） 10:35-10:40 11:25-11:30 質疑応答 「アミロイド形成蛋白質と脂質膜との相互作用と構造変化」 濵田 大三（医学研究科 構造生物学 GCOE 特命助教） 質疑応答 「ゴルジ体リボン形成における CG-NAP (AKAP350/450)の機能について」 高橋 美樹子（バイオシグナル研究センター 講師） 質疑応答 11:30-11:35 閉会の挨拶 10:40-11:05 11:00-11:05 11:05-11:30 齋藤 尚亮 3 「膜局在型ジアシルグリセロールキナーゼ、DGK の神経系における機能」 バイオシグナル研究センター 白井 康仁 脳高次機能や神経ネットワーク形成には、スパインの密度やその形態は重要な要素 であり、病態とも深く関わっている。実際、統合失調症や双極性障害においてスパイ ンの形態異常が報告されており、そのスパインの形態には、様々なタンパク質に加え、 脂質も重要な働きをしているが知られている。 ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は、ジアシルグリセロール(DG)をリン酸化 することにより、フォスファチジン酸(PA)を産生する脂質キナーゼである。哺乳類の DGK には、10 種のサブタイプが報告されているが、DGK は大脳皮質、海馬、線条 体の神経細胞質膜に存在し、シナプスネットワークが形成される生後１−２週間後か ら急激に増加する。また、ヒトにはＣ末端の約 ３０アミノ酸が欠損した DGK スプライスバリアントが存在し、双極性障害や統合失 調症との関連が報告されている。これらの事実は、神経ネットワーク形成や病態にお ける、DGK 、さらには DG 及び PA の重要性を示唆しているが、その神経系におけ る機能などは長年不明であった。 そこで、我々は DGK の神経系における機能を解明するために、まずマウス海馬 初代培養細胞にアデノウイルスを用いて GFP-DGK を発現させ、神経突起の数、分 枝の数、スパイン数を測定した。その結果、DGK を発現させると神経突起伸長が誘 起され、分枝やスパイン様構造が有意に増加した。ついで、Sleeping beauty トラン スポゾン法を用いて作製したＫＯマウスから海馬初代培養細胞を調製し、その形態を 調べたところ、分枝数及びスパイン数が有意に減少していた。また、この形態異常は DGK の過剰発現により改善した。さらに、KO マウスの表現形を解析したところ記 憶障害が認められた。そこで、海馬 CA1 領域の LTP とスパイン密度を野生型と比較 したところ、KO マウスでは LTP が抑制され、スパイン数が減少していた。これら のことから、DGK はスパインといった神経細胞特有の形態を制御することにより神 経ネットワーク形成、ひいては記憶などの脳高次機能において重要な働きをしている ことが明らかになった。一方、細胞質に発現するスプライスバリアントはスパイン形 成や神経突起伸長といった形態変化を誘起しなかったことから、DGK の神経特異的 な機能にはその細胞膜局在が深く関与することも明らかになった。 4 ｢運動する細胞のイノシトールリン酸群の局在」 京都大学大学院医学研究科・病態生物分野 清川 悦子 細胞運動時の極性形成機構は、発生や組織再生あるいは炎症反応の細胞遊走など、生 体内の様々な事象を制御する共通の現象として大きな注目を集めている。なかでも、ア クチン骨格系を直接あるいは間接に制御するイノシトールリン脂質群がどのような細 胞内分布をしているのか、またそれらを合成する酵素群が空間的にどのように制御され ているのかは、細胞極性形成機構の解明にもっとも重要なテーマの一つである。これま での研究から、イノシトール環の三位をリン酸化する PI3 キナーゼおよびその産物ホ スファチジルイノシトール (3,4,5) 三リン酸 [PI(3,4,5)P3]が細胞の進行方向先端部に 集積することが知られているが、それ以外のリン脂質についての情報は限られており、 定説となるに至っていない。そこで我々は FRET（fluorescence resonance energy transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を用いた分子プローブを作成し、細胞運動時のイ ノシトー ルリン脂 質群の時空間制御機構 を明らかにするこ とにし た。 PI(3,4)P2 、 PI(4,5)P2、PI(3,4,5)P3 は、運動する細胞の前半部に局在しているのに対し、PI(4)P は 均一に分布していた。この不均衡な分布を理解するために、脂質代謝酵素の特異的阻害 剤を用いて酵素群の活性分布を求め、また、過去の文献より得た細胞内脂質濃度、拡散 速度を用いてコンピュータ上で脂質代謝マップを作成したところ、多くの脂質の濃度差 は最大でも 2 倍程度であり、運動する細胞の前半部は後半部に比べて脂質が速く代謝さ れていることがわかった。 5 「リン脂質フリップ・フロップと細胞運動の制御」 京都大学化学研究所・超分子生物学領域 加藤 詩子 生体膜を構成するリン脂質は、側方拡散だけでなく、脂質二分子膜を横切っておこる 反転運動（フリップ･フロップ）により、膜内でダイナミックに分子運動を行っている。 その一方で、真核細胞の形質膜ではリン脂質の非対性が広く保存されおり、個々のリン 脂質分子の挙動制御が細胞の生存に必須であることが示唆される。しかし、その生理的 な役割はいまだ不明な点が多い。我々は、フリップ・フロップの制御分子に注目し、そ の機能解析を通して、リン脂質の動態が関与する細胞機能の解明をめざしてきた。今回 我々は、フリップ･フロップを行うリン脂質輸送体が細胞運動の制御に関与することを 見出したので、ここに最近の結果を報告する。 これまでに、タイプⅣ P 型 ATPase ファミリーに属する分子群が、ホスファチジルセ リンやホスファチジルエタノールアミン（PE）などのアミノリン脂質を内向きにフリ ップ・フロップ輸送するアミノリン脂質トランスロケースとして同定されている。我々 は、形質膜リン脂質の動態に異常をきたした出芽酵母変異株から Ros3p/Lem3p を同定 し、その哺乳動物ホモログ mROS3 が、CHO 細胞においてタイプⅣ P 型 ATPase である ATP8A1（ATPaseII）と結合すること、また、ATP8A1 の局在制御を介して形質膜リン 脂質のフリップ・フロップを制御していることを明らかにしている。RNAi 法により、 mROS3 や ATP8A1 の発現を抑制したところ、細胞の運動能が低下し、ATP8A1 発現抑 制細胞では PE のフリップ･フロップ輸送が減少した。また、リン脂質に特異的に結合 する分子プローブを用いて形質膜表面のリン脂質をトラップすると、PE 結合プローブ で処理した場合にのみ細胞運動の阻害が観察された。PE 量が減少した変異細胞株にお いても運動低下が観察されたことから、細胞運動の制御には PE の配向性変化が関与し ていると考えられた。一方、細胞運動時に ATP8A1 は先導端に強く局在し、アクチン と共局在した。我々はこれまでに、PE の配向性変化が細胞分裂時のアクチン骨格の制 御に関与することを見出している。以上のことから mROS3 と ATP8A1 が、フリップ・ フロップによる PE の配向性変化を介して、先導端におけるアクチン骨格の再編を制御 し、細胞運動の制御に関与していることが示唆された。 6 「イノシトールリン脂質の神経系における機能解析」 秋田大学大学院医学系研究科・微生物学講座 佐々木 雄彦 ホスファチジルイノシトールが可逆的なリン酸化を受ける結果、8 種類のイノシトー ルリン脂質（PIs）が生成され、細胞膜に存在する。細胞は PIs のリン酸化・脱リン酸 化を介して外部環境の変化に応答している。細胞内には各 PIs 分子種に特異的に結合す る蛋白質が存在する。それらの活性や局在を制御することで、PIs は多彩な細胞機能の 発現に関与すると考えられている。PIs の相互変換には 16 の反応経路が知られている。 これに対して PIs 代謝酵素は既知のものだけでも 50 を上回る。我々は、個々の PIs 代 謝酵素に特異的な機能の解析から、最終的には PIs 代謝本態の生理的、病態生理的意義 を理解することを目指した研究を進めている。PIs の中でホスファチジルイノシトール 3,4,5-三リン酸 [PI(3,4,5)P3] については、細胞極性、増殖、アポトーシスを司ること、 また、その蓄積が癌をはじめとする疾患の基盤となることなどが、これまでの研究で明 らかになった。一方、他の PIs、特に PI(3,4)P2 に関しては、その生理機能はよく理解さ れていない。 哺乳類には、L-PIPase と P-PIPase という二種類の PI(3,4)P2 脱リン酸化酵素（分解酵 素）が存在する。PI(3,4)P2 代謝の意義を理解するために、L-PIPase ならびに P-PIPase の 遺伝子欠損マウスを作製した。L-PIPase 欠損マウスの線条体神経細胞では、野生型マウ スと比して PI(3,4)P2 レベルが上昇していた。このマウスは全例が、ジストニア、舞踏 病様の不随意運動を呈し、生後 5 週までに死亡した。組織学的には、ハンチントン舞踏 病との類似、即ち、線条体での中型有棘神経細胞死の亢進と顕著な神経膠症を表した。 一方、PI(3,4,5)P3 分解酵素である PTEN の神経系特異的欠損マウスは、大頭症の表現型 を示した。これらの結果は、L-PIPase による PI(3,4)P2 代謝が線条体神経細胞の生存、錐 体外路の動作に重要であることを示している。また、これらの知見は、PI(3,4)P2 と PI(3,4,5)P3 が生体内で異なる役割を担うことを示唆する。 7 「PIP3 ホスファターゼ SKIP によるインスリンシグナル制御」 大学院医学研究科・脂質生化学分野 伊集院 壮 ホスファチジルイノシトール３リン酸（PIP3）は、増殖因子やインスリン刺激依存的 に産生されるイノシトールリン脂質であり、Akt や PDK1 など脂質結合分子と結合する ことによって、その活性をモジュレートしている。PIP3 ホスファターゼは PIP3 を脱リ ン酸化することによってインスリンシグナルを終結させるが、10 種類存在する PIP3 ホ スファターゼのうち、どの分子がその役割を担うかは明らかでない。既に PTEN や SHIP2 がインスリンシグナルを負に制御することが知られている。我々は骨格筋に多く存在す る PIP3 ホスファターゼ SKIP (Skeletal muscle and kidney enriched inositol polyphosphatase phosphatase)を単離した。SKIP のインスリンシグナル制御機構を検討する目的で、１) SKIP の遺伝子ノックアウトマウスの作製と機能解析、２) PIP3 ホスファターゼ SKIP、 PTEN、SHIP2 において、インスリンシグナル制御機能の比較検討を行った。 SKIP のヘテロ遺伝子ノックアウトマウスの解析の結果、１）SKIP へテロノックアウ トマウスの骨格筋でインスリンシグナルが亢進していること。２）SKIP へテロノック アウトマウスで全身の糖代謝が上昇していること。３）高脂肪食摂食時の体重上昇や高 血糖に対して抵抗性を示すこと、が明らかとなった。この結果は、SKIP が恒常的に骨 格筋細胞のインスリンシグナルを制御していることを示唆している。これは PTEN や SHIP2 のノックアウトマウスでは認められない結果である。 次に、筋芽細胞を用いて SKIP、PTEN、SHIP2 のインスリンシグナルへの影響を検討 した。SKIP の発現を RNAi によって抑制すると、インスリン刺激依存的な細胞内 PIP3 量や Akt2 のリン酸化の上昇、細胞外からの糖取り込みの促進が起こったが、PTEN や SHIP2 の発現抑制ではそのような現象は認められなかった。また、グルコーストランス ポーターGLUT4 の細胞膜への輸送についても顕著に亢進していた。GLUT4 の細胞膜へ の融合には PIP3 が必要である。そこで細胞内の SKIP、GLUT4、PIP3 の局在を観察した ところ、インスリン刺激依存的に細胞膜で共局在することが明らかになった。これは SKIP が時間的、空間的な細胞内 PIP3 量の制御を介して GLUT4 小胞の輸送を制御して いることを示唆している。 以上の結果は、SKIP が骨格筋細胞においてインスリンシグナルを優位に制御する PIP3 ホスファターゼであり、糖尿病に対する新しい薬物ターゲットとなる可能性を示す 結果である。 8 ｢ホスホリパーゼ C の癌と炎症への関与に関する遺伝子改変マウスを用いた解析｣ 大学院医学研究科・分子生物学分野 枝松 裕紀 ホスホリパーゼ C （PLC ）は、低分子量 GTP 結合蛋白質 Ras および Rap のエフェク ターとして当研究室において同定されたホスホイノシチド特異的 PLC である。これま でに、PLC が皮膚二段階化学発癌実験での腫瘍の形成とその悪性化に関与することを、 ノックアウトマウスを用いた研究により明らかにしてきた。さらに、ホルボールエステ ル（TPA）によるプロモーション過程で重要である皮膚炎の誘導に、PLC が炎症性サ イトカインの発現制御を介して関与する事を示し、PLC が炎症応答の促進を介して広 く発癌に関与する可能性を示唆した。そこで、皮膚癌以外の腫瘍形成における PLC の 関与を明らかにする為に、癌抑制遺伝子 Apc に変異を持ち腸管腺腫を多発する ApcMin/+ マウスを用いた解析を行った。交配により異なる PLC 遺伝子型を持つ ApcMin/+マウスを 作出したところ、PLC -/-背景では PLC +/+背景と比べ、腫瘍形成と悪性化の抑制が認め られた。低異型度腺腫の形成時には、腫瘍での炎症は認められなかったが、PLC -/-背景 での腫瘍血管形成の抑制と、それと相関して腫瘍細胞の細胞死の亢進と増殖能の低下が 認められた。一方、高異型度腺腫では、PLC -/-背景での炎症応答の抑制が認められたが、 腫瘍血管形成の明らかな異常は認められなかった。以上のことから、PLC が腫瘍血管 形成と炎症応答の促進という、二つの異なった様式で腫瘍形成に関与することが示唆さ れた。次に、TPA 誘発性皮膚炎以外の炎症への PLC の関与とその機構について検討し た。ノックアウトマウスに、デキストラン硫酸ナトリウム摂取による潰瘍性大腸炎、お よび 2,4-ジニトロフルオロベンゼン塗付による接触性皮膚炎を誘導したところ、いずれ においても PLC -/-マウスでの炎症の抑制が認められ、PLC が広く炎症応答に関与する ことが示された。さらに、後者の炎症モデルの解析の結果から、これら PLC -/-マウス での炎症抑制は、炎症性サイトカイン産生の低下に起因することが示された。さらに PLC を組織特異的に強発現するトランスジェニックマウスも作成した。表皮特異的、 あるいは全身に PLC を強発現させた場合、慢性皮膚炎が生じた。この皮膚炎は、鱗屑 の発生や T 細胞の異常な浸潤、表皮における STAT3 の活性上昇など、ヒト尋常性乾癬 に酷似した特徴を有していた。トランスジェニックマウスから調製した初代培養角化細 胞を用いた解析などから、PLC の過剰発現によるその下流のシグナルの異常な活性化 が、樹状細胞やヘルパーT 細胞などを活性化する因子の発現の上昇を表皮で引き起こし、 それにより顆粒球などの炎症細胞の浸潤が促進されるという機構が考えられた。この結 果は、T 細胞が関与する慢性炎症における PLC の役割を示唆するものである。 9 「脈管形成と体液調節機構−マウス個体の表現型解析から膜生物学研究へ−」 大学院医学研究科・血管生物学分野 平島 正則 血管系は、血液を全身に輸送し、末梢組織で酸素や栄養素などの物質交換を促す器官で ある。リンパ管系は、血管系と密接な位置に存在し、毛細血管領域から漏出したタンパ クや組織間液を吸収して血管系に戻す役割を果たしている。この 2 つからなる脈管系は 体液の恒常性維持に寄与しており、機能の不均衡は組織で浮腫を引き起こす原因となる。 超音波検査で認められるヒト胎児の項部浮腫は、染色体異常を示唆する所見であるが、 原因不明のまま浮腫が自然消失し出生後は正常に発育する症例も多い。我々は、内皮細 胞特異的に発現する分子 Aspp1 のノックアウト（Aspp1-/-）マウスを作製・解析し、正 常に成体まで発育するが胎生 13∼15 日目頃に項部浮腫をきたすことを見出し、胎生期 リンパ管形成の異常に基 づいてリ ンパ管 機能が低下す ることを報告した。 また、 Flt1/VEGFR1 のヘテロ変異（Flt1+/-）マウスが、胎生期に同様の一過性項部浮腫を示す ことを見出したが、Flt1 はリ ンパ管形成 に異常を認めない。 現在までの解 析で、 Aspp1-/-;Flt1+/-ダブル変異マウスでは、Aspp1-/-マウスあるいは Flt1+/-マウスと比べて胎生 期浮腫の程度が増大し、胎生後期から新生仔期にかけてほとんどが致死となることを見 出している。これらのことから、Flt1+/-マウスと Aspp1-/-マウスは異なる機序で浮腫が生 じていると考えられる。Aspp1 を欠損するリンパ管内皮細胞は多数の突起を形成してお り、Aspp1 がリンパ管内皮細胞の細胞間接着や細胞運動などを制御していることが強く 示唆される。Flt1+/-マウスでは、毛細血管透過性が亢進しており、Flk1/VEGFR2 シグナ ルの過剰な活性化が原因であると考えられる。 本発表では、脈管形成や体液調節機構に異常をきたすマウスに関する解析結果を紹介し、 細胞・分子レベルで重要な研究課題と将来の遺伝学的検査の可能性について議論したい。 10 「絶食によって誘発されるキイロショウジョウバエの食欲増進機構」 大学院理学研究科・生体分子機構分野 石田 裕幸 絶えず変化する食環境への適応と摂食調節は、生物の生命維持にとって必要不可欠で ある。食物摂取は、体内環境の栄養状態からのフィードバックを受けた脳による神経系、 内分泌系のみならず刺激物質を直接感受する味覚感覚子からも調節制御される。 摂食調節機構を解析するために、行動と味覚感覚子の応答変化を容易に観察でき、脊 椎 動 物 に み ら れ る 代 謝 系 遺 伝子 も 保 存 さ れ て い る こ と か ら 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ (Drosophila melanogaster)をモデル動物として選択した。自然変異体の中から吻伸展反射 テスト、ショ糖-水の 2 者択一試験により、24 時間絶食後、顕著な食欲増大を示した Taiwan 系統と、示さない Mel6 系統を単離した。 非絶食条件下と絶食条件下で双方の系統で変動する遺伝子をマイクロアレイ法によ り俯瞰し、同定遺伝子の発現量を RT-PCR 法で定量した。対照区(Mel6 系統)では、トリ アシルグリセロールリパーゼ、シトクローム P450、エステルヒドラーゼの代謝関連遺 伝子の発現が有意に上昇した。一方 Taiwan 系統ではその変動は見られなかった。 食欲増大の原因として味覚感覚子の感度上昇も考えられる。両系統を絶食後、唇弁に おける L タイプ感覚子のショ糖に対する応答を調査した。Taiwan 系統において糖受容 細胞の感受性の有意な上昇が確認された。次に様々な濃度のショ糖を含む培地に絶食後 の両系統を放ち、生存率を調べた。その結果、低濃度のショ糖を感受できる Taiwan 系 統の生存率が有意に高いことが分かった。 飢餓状態のショウジョウバエは、エノサイトで蓄積されている脂質を代謝し、エネル ギー源として脂肪酸を組織に供給する。しかし Taiwan 系統では、脂質代謝遺伝子（群） の発現不全のため組織の飢餓状態が続く。その状態を回復するためには摂食による栄養 回復が必須であり、ショ糖受容細胞の感度上昇は低濃度ショ糖の検出に有利に働くに違 いない。以上のように Taiwan 系統の食欲増進は複合的な制御により誘発されたと考え られた。 11 ｢メタボロミクスの医学研究への応用｣ 大学院医学研究科・脂質生化学分野 篠原 正和 生体内には糖・有機酸・アミノ酸・脂肪酸などの低 分子物質が存在しており、その多くは酵素などの代謝 活動によって作り出された代謝物（メタボライト）で ある。 近年、低分子代謝物総体（メタボローム）に基づく 新しいオミックス科学としてメタボロミクス（メタボ ローム解析）が注目されている。従来のオミックス科 学であるゲノム、トランスクリプトーム、プロテオー ムは遺伝情報を実行するための「媒体の流れ」である が、メタボロームは生体が実行した表現形に最も近く、表現形での変化が観察しやすい。 したがってある疾患表現形に関連して変化したメタボロームの中に、新規の生理活性物 質・代謝パスウェイ解明への鍵が隠されていると考える。またある疾患表現形に関連し て変化するメタボロームを臨床的なバイオマーカーとして用いることも可能であろう。 しかし観測対象となる代謝物の種類・化学的性質が多種多様にわたるため、計測手法 の標準化が困難であり、また得られた膨大なデータから有用な結論を導くためには、サ ンプリング条件・抽出前処理条件・分離測定条件・データ変換条件・多変量解析を用い たデータマイニング手法等、多くのステップで条件検討が必要とされる。メタボロミク スは従来、農学領域で品質管理・品種改良等に応用されていたが医学研究への応用はま さに緒についたところである。 質量分析総合センターではガスクロマトグラフィー質量分析計(GCMS)並びに液体ク ロマトグラフィー質量分析計(LCMS)、さらに多変量解析を基盤としたメタボロミクス 研究のワークフローを開発中である。ヒト由来の血液・尿・呼気濃縮液等の臨床サンプ ル、実験小動物由来の組織ホモジネート、培養細胞由来のホモジネートなどを用い、疾 患表現型・薬剤負荷等に応答して変化しているメタボロームを同定し、その生理学的・ 病理学的意義を検討中である。 今回のグローバル COE ワークショップでいくつか代表的な解析結果をご紹介する予 定としております。メタボロミクスにご興味頂ければ、各研究分野における諸先生方の 研究と共同研究を進めさせて頂きたく存じます。 12 「活性化型変異体を用いた mTOR の機能解析」 大学院医学研究科・分子遺伝学分野 大根 陽一郎 免疫抑制剤ラパマイシンの標的因子として見出された TOR キナーゼは、真核生物に 広く保存されたシグナル伝達因子である。哺乳類 TOR（mTOR）はアミノ酸や増殖因子 により活性化し、多様な細胞応答を誘導して細胞の適切な成長を可能にしている。これ まで多くの知見がラパマイシンやノックダウンによる mTOR の機能阻害実験により得 られており、タンパク質合成の制御やオートファジーの抑制などの細胞内機能に関わる ことが示されてきた。その一方で、gain of function 実験による mTOR 機能の解析はこれ までほとんど行なわれていない。本研究では、高い活性を示す mTOR 変異体を単離し、 これを用いて gain of function による mTOR の細胞内機能の解析を目指した。 酵母の分子遺伝学的トリックを利用して単離した mTOR の活性化型変異体は実際に in vitro で高いキナーゼ活性を示した。この活性化型変異体を培養細胞に導入し、mTOR の関与が示唆される種々の細胞内機能に関して解析を行なった。通常アミノ酸飢餓条件 下で見られる ribosomal S6 kinase (S6K)や eIF4E-binding protein 1 (4EBP1)のリン酸化レベ ルの低下や細胞サイズの縮小、オートファジーの誘導といった応答は活性化型 mTOR の導入により阻害されており、これらの機能について mTOR が主導的な役割を担うこ とを明確にすることができた。一方、活性化型 mTOR は NIH3T3 細胞に対して形質転 換能を示さないことが明らかになった。mTOR の阻害が細胞の形質転換に対し抑制作用 を持つことがすでに示されていたが、ここで得られた結果は、mTOR 経路の活性化は発 癌には必須ではあるものの充分ではないことを示すものだった。 このような細胞レベルの機能解析に加え、個体レベルでの mTOR 機能の解明を目指 し、我々は現在、骨格筋特異的に活性化型 mTOR を発現するトランスジェニックマウ スの作成・解析を行なっている。本発表ではこのマウスに関してすでに得られている知 見についても併せて報告する。 13 「極性上皮様細胞における頭頂部・基底側部の規定に関して」 大学院医学研究科・神経情報伝達学分野 田ノ上 拓自 多細胞生物の形態形成の過程では、細胞のシートがたわんだり、折りたたまれたり、陥 入したり、さまざまな形状変化を示す。多細胞生物の形態形成は細胞のシートの形状変 化の過程である、と言い換えても過言ではない。シート状の細胞の一つ一つは、極性上 皮様の形状をとっている。極性上皮細胞は、頭頂部領域と側底部領域が細胞間接着構造 によって明確に分離されており、頭頂部領域と側底部領域の大きさ（広さ）のバランス によって個々の細胞の形状が決まる。さらに、その形状変化に応じて細胞シートのゆが みや曲りなどの形状も変化する。つまり、極性上皮様細胞の形状変化のメカニズムを解 明することによって、多細胞生物の形態形成を理解することが可能である。我々は現在、 細胞の形状変化を制御するマスター分子群について解析を進めており、いくつかの面白 い知見を得ている。本研究発表では、極性上皮細胞の形状制御の分子メカニズムに関し て、我々がごく最近得た研究知見を紹介します。 1. 極性上皮細胞の一種である神経上皮細胞の頭頂部領域の面積を制御する分子機構に ついて。ごく最近我々が発表した論文の内容を中心に。 （Ishiuchi et al., JCB, 2009） 2. 極性上皮細胞の形状変化、特に、柱型からボトル型へと変化する際（cuboidal to bottle-shaped morphological change）のマスター分子に関して、ごく最近我々が得た 研究結果。 (Nakajima and Tanoue, submitted) 以上の 2 つに関して、未発表データーを含めて要点を簡潔に解説いたします。 14 「アミロイド形成蛋白質と脂質膜との相互作用と構造変化」 大学院医学研究科・構造生物学分野 濵田 大三 生体内で合成される蛋白質は、通常、そのアミノ酸配列に特異的な立体構造を形成し、 それぞれに特異的な機能を発揮する。しかしながら一部の蛋白質が、本来取るべき立体 構造を形成せず、アミロイド線維と呼ばれる線維状凝集体を形成することがアミロイド 病に関連することが示されてきた。さらに最近の研究では、アミロイド線維よりも高い 細胞毒性を示す種々の蛋白質凝集体が発見されている。このような背景から、現在、ア ミロイド形成蛋白質が種々の凝集体を形成し、それらが細胞膜へ直接／間接的に結合す ることで細胞死を引き起こすという、アミロイド病発症の新たな機構が提唱されている。 アミロイド線維形成蛋白質の様々な形状の凝集体と細胞膜との相互作用の機構につ いて明らかにすることは、種々のアミロイド病の治療・予防法を開発する上で、必要不 可欠であると考えれられる。我々の研究室では、構造生物学的／物理化学的手法を用い て、リン脂質膜とアミロイド形成蛋白質の形成する様々な凝集体との相互作用機構を明 らかにすることを目指して、研究を行っている。 本講演では、II 型糖尿病関連する Islet Amyloid Polypeptide（IAPP）をモデル系として 行った「濁度測定並びに水晶発振子マイクロバランス測定法（QCM）を用いた IAPP 凝 集体とリン脂質膜結合機構に関する解析」及び、AL アミロイドーシスに関与する免疫 グロブリン軽鎖可変領域(VL REI)を用いて行った「膜結合に伴う蛋白質の立体構造変 化」に関する研究結果について報告する。 前者においては、IAPP が脂質膜において、アミロイド線維に似たクロスβ構造を持 った凝集体を形成し、流動性などの膜の物理特性の変化させる現象を定量的に解析する ことに成功した。脂質膜の流動性変化とアポトーシスに関連性があることが、種々の実 験から示されており、IAPP による場合でも、同様な変化が、細胞死を引き起こす際に 起きていると考えられる。 VL REI の研究においては、そのジスルフィド結合欠損変異（CysLess REI）により、 天然状態が不安定化され変性構造へとほどける頻度が高くなることで、毒性を有する凝 集体が形成されやすくなることが示された。一方、CysLess REI は、容易にリン脂質膜 に浸潤し、膜の成分組成による流動性などの物性に応じて、異なる立体構造を形成する ことが、低分解能の分光学的解析により明らかになった。これらのことから、細胞毒性 を有する CysLess REI の構造状態には、バリエーションが存在することが示唆された。 15 「ゴルジ体リボン形成における CG-NAP (AKAP350/450)の機能について」 バイオシグナル研究センター 高橋 美樹子 ゴルジ体は酵母や昆虫細胞では細胞質に散在しているのに対し、哺乳類細胞では中心 体近傍にリボン状のオルガネラとして形成される。このような構造を取る意義としてゴ ルジ体における蛋白質修飾やポストゴルジ網の輸送の効率化等が考えられているがほ とんど明らかにされていない。最近、意義の１つとして細胞移動の際にゴルジ体がリボ ン状の形状を維持したまま中心体と共に配置を変え、それが移動に必須であることが報 告されている。ゴルジ体リボンは層板状のゴルジ体ミニスタックが相互に（側方で）融 合することにより形成される。この過程は融合に直接関わる蛋白質の他に、微小管、中 心体等が関与していると考えられるが、それらを仲介する分子や制御については不明な 部分が多く残されている。 CG-NAP (centrosome and Golgi localized PKN-associated protein、別名 AKAP450/350) は 蛋白質リン酸化酵素 PKN と結合する蛋白質として当研究室でクローニングされたコイ ルドコイル蛋白質で、中心体とゴルジ体に局在する。CG-NAP は PKA などのシグナル 伝達分子とも結合し、これらのオルガネラに特異的に局在させるアンカリング蛋白質で ある。そのユニークな局在からゴルジ体形成に関与する可能性を検討している。中心体 およびゴルジ体への局在は CG-NAP の別々の領域が司り、中心体へは微小管非依存的 に局在するが、ゴルジ体へ細胞質ダイニンによる微小管上の移動を経て局在することを 明らかにした。さらに、ゴルジ体局在領域の過剰発現により内在性 CG-NAP はゴルジ 体から解離し、このような細胞、あるいは siRNA により CG-NAP の発現を抑制した細 胞において、ゴルジ体が中心体近傍で断片化していることを見出した。細胞の微小管構 造に大きな変化は見られなかったことから微小管に沿った小胞輸送の欠陥ではなく、ま た断片化されたゴルジ体は層板構造を保持し蛋白質の輸送や修飾はほぼ正常であり、融 合に関わるとされる蛋白質も断片上に保持されていた。 以上より CG-NAP はゴルジ体層板が相互に近づき融合してリボン状構造を形成する 直前の段階に必要であると考えられた。この段階における CG-NAP の役割についてさ らに解析を続けておりその結果も合わせて報告する。 16 ポスター演題 (7/7) P-1 (※自由討論形式) 「Importace of Rim2a in insulin granule exocytosis」 安田 貴雄（細胞分子医学 GCOE RA） P-2 「Induction of cyclic AMP responsiveness in pseudoislets constituted from β-cell-β-cell interaction」 岩崎 真宏（細胞分子医学 GCOE RA） P-3 「Identification of new components of epithelial cell-cell junctions using the localization-basedexpression cloning.」 明石 昌也（細胞生物学 GCOE RA） P-4 「Role of endothelial cell-selective adhesion molecule (ESAM) in atherosclerosis」 井上 通彦（循環器内科学 GCOE RA） P-5 「WWP1 overexpression influences muscle differentiation via abberant regulation of MyHC expression」 松本 大和（農学研究科 応用動物学 GCOE RA） P-6 「Glioblastoma Formation from Cell Population Depleted of Prominin1-expressing Cells」 西出 賢次（理学研究科 発生生物学講座 GCOE RA） P-7 「Functional analysis of the Ror-family receptor tyrosine 0kinases during development」 任 大勇（細胞生理学 GCOE RA） P-8 「Structural analysis of the novel state1 conformation of Ras protein」 松本 耕祐（分子生物学 GCOE RA） P-9 「Role of endothelial nectin-afadin cell adhesion system in angiogenesis」 衣笠 允雄（循環器内科学 GCOE RA） P-10 「Roles of vascular endothelial growth factor receptors in vascular development and fluid homeostasis」 佐野 圭吾（血管生物学 GCOE RA） P-11 「Therapeutic intervention to inflamation for prevention of cardiovascular diseases.」 中島 健爾（循環器内科学 GCOE RA） P-12 「Molecular analysis of the bidirectional IgG transport by FcRn」 敖剛花（消化器内科学 GCOE RA） P-13 「The Role of CagPAI in Membrane Dynamics」 山本 幸司（消化器内科学 GCOE RA） P-14 「Identification of specific substrates of Influenza virus neuraminidase on the mast cell」 P-15 「Possible involvement of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) -induced growth inhibition of human melanoma cells」 坂口 正展（皮膚科学 GCOE RA） P-16 「Molecular characterization of the septin complex in the neuronal membrane」 田中 智子（人獣共通感染症学 GCOE RA） Maowulan Maimaitiyiming（理学研究科 生体分子機構講座 GCOE RA） P-17 「Psoriasis-like phenotype in the mice overexpressing phospholipase Ce in epidermal keratinocytes」 竹中 延之（分子生物学 特別研究員） P-18 「Genetics study of cis4 zinc transporter in fission yeast」 烏仁図雅（薬剤学 GCOE RA） P-19 「Role of endotherial-restricted guanine nucleotide exchange factor FGD-5 in endotherial function」 銕 佑介（循環器内科学 大学院生） P-20 「Role of the small GTPase Rac1 in insulin-dependent glucose uptake in skeletal muscle cells」 野崎 真輔（分子生物学 GCOE RA） P-21 「Prevention and regression of atherosclerosis via modulating immune cell functions.」 北 智之（循環器内科学 GCOE RA） P-22 「Regulation of Cell Movement by Afadin」 南 晶洋（消化器内科学 GCOE RA） P-23 「Autophagy can regulate the colonic inflammation」 井上 潤（消化器内科学 GCOE RA） P-24 「Role of intraflagellar transport 20 in Wnt5a-Ror2 signaling」 李 欣（細胞生理学 GCOE RA） 17 ポスター演題 (7/7・つづき) P-25 (※自由討論形式) 「The functional analysis of nectins in the palate formation and malformation」 吉田 美登里（口腔外科学 GCOE RA） P-26 「IgG administration inhibit the allergic inflammation.」 岡本 朱矢（呼吸器内科学 GCOE RA） P-27 「The roles of tight junction in the pathogenesis of inflammatory bowel disease」 西田 真之（消化器内科学 GCOE RA） P-28 「Analysis of morphogenesis based on cell sorting mediated by nectin/afadin」 P-29 「Impaired vascular network formation in mice lacking the Rap1 guanine nucleotide exchange factor RA-GEF-1」 金村 星余（分子生物学 大学院生） P-30 「Silencing of ErbB3/ErbB2 signaling by immunoglobulin-like Necl-2」 小南 賀乃子（分子細胞生物学 GCOE RA） 河野 智（分子細胞生物学 特別研究学生） P-31 「 Search for compounds that modulate tight-junction activity:structural biology and computational approaches」 間瀬 省吾（構造生物学 大学院生） P-32 「The analysis of essential components regulating shape of mammalian epithelial cells」 中嶋 洋行（神経情報伝達学 GCOE 研究員） P-33 「Molecular mechanisms underlying Aspp1 function in lymphatic vessel morphogenesis」 森脇 一将（血管生物学 GCOE 研究員） P-34 「The Role of PLCγ２ in Separation between Blood Vessels and Lymphatic Vessels」 丁 国（血管生物学 GCOE 研究員） P-35 「Binding of islet amyloid polypeptide to lipid bilayer and amyloid aggregation.」 笹原 健二（構造生物学 GCOE 研究員） P-36 「Actin cytoskeletal rearrangement in apical junction of epithelial cells.」 東 智仁（細胞生物学 GCOE 研究員） P-37 「Structural and functional analysis of Nuclear VCP-like Protein NVL2」 藤原 芳江（構造生物学 GCOE 研究員） P-38 「SH3YL1 regulates membrane ruffles through inositol phospholipid metabolism.」 長谷川 純矢（膜生物学 GCOE 研究員） P-39 「Carboxyl terminus of HSP70 interacting protein (CHIP) interacts with and ubiquitinates PKCgamma, a kinase implicated in spinocerebellar ataxia type 14」 高橋 英之（バイオシグナル研究センター GCOE 研究員） P-40 「 Dorsal telencephalon-specific RA-GEF-1 knockout mice develop heterotopic cortical mass and commissural fiber defect」 Shymaa El-shawadfy Mohamed Bilasy（分子生物学 GCOE 研究員） P-41 「A putative regulatory mechanism of prothoracicotropic hormone secretion in the American cockroach, Periplaneta americana; melatonin signal transduction and phosphorylation of Rab protein by protein kinase C」 平垣 進（農学研究科 農環境生物学 GCOE 技術員） 18