ヒト正常皮膚表皮及び悪性上皮性腫瘍におけるレクチソ結合部位

ただいま、ページを読み込み中です。5秒以上、このメッセージが表示されている場
合、Adobe® Reader®（もしくはAcrobat®）のAcrobat® JavaScriptを有効にしてください。
Adobe® Reader®のメニュー：「編集」→「環境設定」→「JavaScript」で設定できます。
「Acrobat JavaScriptを使用」にチェックを入れてください。
日皮会誌:93
(10),
1021一1026,
1983
(昭58）
ヒト正常皮膚表皮及び悪性上皮性腫瘍におけるレクチソ結合部位
なお、Adobe® Reader®以外でのPDFビューアで閲覧されている場合もこのメッセージが表
一ペルオキシダーゼ法による組織化学的検討−
示されます。Adobe® Reader®で閲覧するようにしてください。
宇野
明彦
大原
国章＊
堀 嘉昭
久木田 淳＊
要 旨
斎田
俊明
平野
寛＊＊
関 利仁＊
ら細胞膜複合糖質糖鎖構造の違いが推測された．
ヒト正常皮膚と皮膚の上皮性腫瘍である有辣細胞
癌, Bowen癌,
Bo wen病,基底細胞上皮腫を材料にし，
緒 言
これら細胞におけるレタチソ結合部位及び細胞膜にお
生体膜の構成成分である糖は糖蛋白や糖脂質として
けるレクチソ結合様式について，ペルオキシダーゼ標
主に膜の外表面に存在し糖衣を形成している．特に糖
識レクチソ（Ｃｏｎ Ａ,ＲＣＡ,ＷＧＡ,ＰＮＡ）を用い電顕
蛋白部の糖鎖は膜上に十分伸長し外界の刺激に対する
的に検索した．特に正常ケラチノサイトと悪性上皮性
受容体となっており，細胞内代謝に重要な役割を演じ
腫瘍細胞との比較検討を行い,下記の如き結果を得た．
ている．レクチソはこの糖鎖に結合することによって
尚，材料は全て前固定し，レクチソと反応させた凍結
種々の生物活性1）を引き起こす物質である．
切片の厚さは20μｍとした.
レクチソ受容体としての糖残基は，糖特異性の異な
1.レクチソ結合部位:Con
Ａでは細胞膜及び細胞
内膜系に結合部位が認められたがRCA,
WGA,
る種々のレクチソをhorseradish
PNA
peｒｏｘidase2）（以下
ＨＲＰと略記）やfeｒｒitin3）を標識することによって可
の結合部位は細胞腹に限局して認められた．これらの
視化出来る．この方法を用いて近年,細胞の機能状態4）
所見は全ての材料で同一であった.
や細胞の分化5)6)細胞の癌化7）に伴なうレクチン受容
2.細胞膜のレクチソ結合様式：ヒト正常皮膚表皮
体の分布の変化，結合量の増減が観察，検討され膜構
では４種類のレクチソ共細胞膜全周にわたり連続性に
造の研究に有効な手段として利用されている．
陽性反応が認められた．悪性上皮性腫瘍細胞では
今回我々は，細胞の分化や悪性化に際して，膜の糖
ＷＧＡ結合部位を示すＤＡＢ反応産物が正常ケラチノ
鎖構造の変化を明らかにするため,ヒト正常皮膚表皮，
サイトと比較して，厚く，豊富に観察された．基底細
皮膚悪性上皮性腫瘍を材料とし，細胞のレクチソ受容
胞上皮腫ではＰＮＡ結合部位を示すＤＡＢ反応産物が
体の存在部位並びに細胞膜におけるレクチソ結合様式
他の３種類のレクチソの場合と様相を異にし数珠状に
について糖特異性の異なる４種類のレクチソを用い電
連なって豊富に分布する傾向を呈した．これらのこと
顕的に観察し，比較検討した．
実験の材料及び方法
東京大学医学部附属病院分院皮膚科（主任 堀 嘉
使用したレクチン:Cohcanavalin Ａ（Ｃｏｎ
Ａ），
昭助教授）
j畝加郷communis
germ
＊東京大学医学部皮膚科学教室（主任 久木田淳教授）
agglutinin (WGA),
¨杏林大学医学部解剖学教室
Akihiko
Uno,
Yoshihito
and
Seki, Kuniaki
Hiroshi
membranes
in
Yoshiaki Hori,
Hirano
in human
malignant
chemical
Oohara,
studies
by
Atusi
: Lectin-binding
normal
epidermal
peroxidase･labeling
Toshiaki
means
of the
Saida,
Kukita
cells and
cells―Histo･
horseradish
種類を使用した（Ｅ･Ｙ
Laboratories社製）．これらの
ソ, HRP共それぞれ100μg/ml,
あるＲＣＡ･HRP,
WGA-HRP,
HRP標識レクチソで
PNA-HRPでは200μｇ/
mlであった．それぞれのレクチソの原料，分子量，糖
試料：ヒト正常皮膚４例，有無細胞癌２例,
昭和58年３月15日受理
東京大学医学部附属病院分院皮膚科 宇野 明彦
Peanut agglutinin （ＰＮＡ）の４
特異性については第１表に示した．
technique･
別刷請求先:（〒112)東京都文京区目白台3
Wheat
最終濃度は，２段法で行なったＣｏｎＡの場合，ｙクチ
sites on the
epidermal
tumor
agglutinin (RCA),
−28−
6
癌２例, Bowen病２例，基底細胞上皮腫２例について
検討した．使用した試料の採取部位及び患者の年齢，
Bowen
宇野 明彦ほか
1022
表１ 使用したレクチソの分子量，原料，糖特異性．
レクチン
concanavalin
A (Con
原 料
分子量
104,000
A）
糖特異性
Jack bean:
glucose,
mannose
Canavalia
ensi/ormis
Ricinus
120,000
commun￡s agglutininCRCA)
galactose
Castor bean :
Ricintts communis
36,000
wheat germ agglutinin(WGA)
108,000
peanut agglutinin(PNA)
Triticum Kulsaris
N･acetyl-Dglucosamine,
sialic
acid
Arachis fi5*o2oea
β■D-galactose
wheat germ :
in a non･reducing
terminal position
表２ 使用した試料０採取部位及び患者の年齢，性別
年齢 性別
S.Y.
70
64
3.
N.M.
T.Y.
4.
5.
Y.T.
H.T.
19
6.
S.K.
64
7.
8.
9.
T.Y.
K.K.
79
41
10.
F.Y.
T.Y.
11.
K.Y.
74
12. M.A.
23
1.
2.
♀
吉
♀
害
♀
♀
♀
♀
♀
舎
61
47
79
61
採取部位
試 料
舎 正常皮膚
♀ 正常皮膚
正常皮膚
正常皮膚
頬部
上腕部
腹部
額部
有韓細胞癌
液には0.2M
Ｄ･galactoseをそれぞれ加え糖残基に対
する特異性を確認した．またレクチソと結合していな
いHRP,或いはＤＡＢのみと単独に反応させ，非特異
的及び内在性反応の可能性を吟味した．
結 果
1.細胞のレクチン結合部位の観察
口唇部
下腿部
レクチン結合パターンは用いたレクチンの種類によ
Bowen癌
Bowen癌
Bewen病
下腿部
り異なるが，同一レクチソを適用した場合，細胞レベ
Bowen病
腹郡
有錬細胞癌
大腿部
腹部
基産細胞上皮腫
基産細胞上皮腫
鼻部
鼻部
ルの局在性の点で正常表皮及び全ての悪性上皮性腫瘍
細胞との間で共通性をもち,下記の如き結果を呈した.
Con
Aは細胞膜，核膜，小胞体膜に結合した．細胞
膜の反応所見は膜表面に連続性に観察された(第１図，
Ａ).核膜も全周にわたり連続性にＤＡＢ反応産物を認
めた(第１図,
B).細胞膜内の結合部位は小胞体膜に
性別は第２表に示した.
一致して認められ,
2)方法
部位とは反対側の槽面にみられた(第１図,
DAB反応産物はリボソーム付着
C).ミト
採取した組織片を細切し,直ちに2.5%グノレタールア
コンドリア膜にはＤＡＢ反応産物は認められなかった
ルデヒド，２％パラホルムアルデヒド混液にて４℃，
(第１図,
３時間前固定,
膜には認められたが,核膜,細胞内小器官にＤＡＢ反応
O.IM燐酸緩衝液(pH＝7.4)で数回洗
D).
RCA,
WGA,
PNAの結合部位は細胞
漱後，凍結切片(20μｍ)を作製した.ＣｏｎＡへのHRP
産物は認められなかった.第２図はＰＮＡ反応を示す.
(Sigma,
2.細胞膜におけるレクチン結合様式の観察
RCA,
type ｖl)の標識は２段法8)により行ない，
WGA,
PNAについてはＨＲＰ標識レクチン(Ｅ･
正常ケラチノサイトにおける細胞膜のレクチソ反応
Ｙ Laboratories社製)を使用した．これらに上記の凍
は４種類のレクチソ共細胞表面に反応産物が連続性に
結切片を20℃，5時間反応させた後diaminobenzidine
認められ，各レクチソ間における反応様式の違いは観
(ＤＡＢ)反応を経て，オスミウム酸後固定後，アルコー
察されなかった(第３図)．悪性上皮性腫瘍細胞でも正
ルにて脱水，エポン包埋．超薄切片を作製，無染色の
常ケラチノサイトと同様，連続性にＤＡＢ反応産物が
まま透過型電子顕微鏡(JEMIOOC)にて観察，撮影し
認められたが,
た．
上に特に豊富に認められた(第４図)．また基底細胞上
対照実験としてCon
Ｄ･mannoside,
反応液には0.2M
Ａ反応後には0.2Mα-methyl-
RCA反応液には0.2M
lactose, WGA
Ｎ･acetyl-D･glucosamine,
PNA反応
WGAについてはＤＡＢ反応産物が膜
皮腫のＰＮＡ反応においては，他の３種類のレクチソ
の細胞膜の陽性所見と比べて特異な反応所見が観察さ
れた(第５図)．
レクチソ結合部位
1023
Ｃ
図１ 正常ケラチノサイト（有辣層),
61歳，女，腹部.
Con Ａ 反応を示す電顕写真.
A ; Con A結合部を示すＤＡＢ反応は細胞膜に一致して陽性である.X30,000
B；ＣｏｎＡ反応は細胞膜のみならず核膜（矢印）及び，小胞体膜に一致して陽性で
ある.×5,000
C
'.Con A反応は小胞体膜，特に槽面に一致して陽性である.×40,000
D；細胞膜はCon
Ａ 反応陽性であるが，ミトコンドリア膜（矢印）には反応陰性で
ある.×30,000
考 按
では細胞膜のみならず小胞体膜，核膜にも結合部位を
レクチソ（細胞凝集素）は膜を構成する糖蛋白成分
認めたが，今回の実験ではＲＣＡ,ＷＧＡ,ＰＮＡの結合
の糖残基に結合する蛋白であり，動物及び植物中に広
部位は細胞膜に限局していた.ＣｏｎＡ結合部位は細胞
く分布している．現在糖特異性や化学的性質が明らか
表層のみならず細胞内膜系に存在することは従来の報
になったレクチソのうち数種類9）が市販されている．
告10)11)と同様である．我々の実験ではゴルジ膜には
レクチソを用いた研究は従来血球や培養細胞などを
ＤＡＢ反応産物を認め得なかった.
中心に行われ，組織細胞を用いた報告は少なく，とり
マウス精巣上体細胞などを用いた実験でＲＣＡがゴル
わけヒト皮膚を材料とした報告は稀である．
ジ膜に結合することを見出し,
Yokoyamaら12)は
RCAがゴルジ装置の新
電顕的に観察したレクチソ結合部位は実験に供した
たな細胞化学的マーカーになり得るとしているが，
全ての材料を通じて同じ種類のレクチソであれば細胞
我々の実験ではＲＣＡの結合部位は細胞膜のみであっ
内局在性の点で同様の結果を示した.すなわち,
ConA
た．このことは使用したレクチソ濃度，反応時間，細
1024
宇野 明彦ほか
スはコア糖部分を構成しているためCon
体膜に結合したと考えられる．ＣＯ
Ａのみ小胞
ｎＡ以外のレクチソ
に特異性のある椚鎖はゴルジ装置，細胞膜で付加され
るためＲＣＡ,Ｗ(;Λ,ＰＮＡは小胞休膜に結合しないと，
考えられる．一般にＣｏｎΛ受容体は附M的に分布して
いることが知られている.ＲＣΛは川 ･細胞内において
も部位差があり，各細胞間でも賢なるといわれてい
る15)しかし今回の我々のヒト皮膚ケラチノサイトで
は，いずれの細胞においても一定の傾向を示した．
細胞膜については，特にレクチソ結合様式を正常ケ
ラチノサイトと各種上皮性悪性腫瘍細胞とで比較検討
した．結果は正常ケラチノサイトでは４種類のレクチ
ソ共全周にわたり連続性に陽性反応が認められ，異な
図２ 正常ヶラチノサイト(有無層),
ＰＮＡ反応を示す電顕写真．
19歳，女，額部．
ＰＮＡ結合部位を示すＤＡＢ反応は細胞膜に一致し
て陽性に認められるが，核膜，細胞内小器官には認
められない.×8,000
るレクチソ相互間における反応の違いはなかった．悪
性上皮性腫瘍細胞では,
WGA反応でＤＡＢ反応産物
が厚く，集塊を形成し，正常ケラチノサイトと対比を
示した.また基底細胞上皮腫のＰＮＡ反応では,数珠状
に連なった豊富な反応所見を認め，他の細胞とは異な
る所見が観察された．
胞の固定条件等でレクチソの細胞内への透過性が問題
レクチソによる癌細胞膜の研究はＡｕbら16)が最初
になるため，今後更に検討しなければならない．
で，彼らは癌細胞膜が正常細胞に比較してＷＧＡによ
レクチソの種類により結合部位の異なる理由は膜の
る凝集性が高いことを発見した．その後,
糖蛋白合成過程と関連している10)13)―15)糖蛋白合成の
同様の現象17)を見出して以来，正常細胞膜にはレクチ
第１段階は小胞体で行われ，この部分では糖蛋白のコ
ソ受容体はないか，あっても凝集を可能にある種の数
ア糖部分が作られる.ＣｏｎＡに特異性のあるマソノー
はないとする考え方や，蛋白分解酵素により取り除か
図３ 正常ケラチノサイト（有難層).
64歳，女，上腕部，電顕写真.
ａ）ＣｏｎＡ； b）ＲＣＡ ；ｃ）ＷＧＡ；d）ＰＮＡ.いずれのレクチソの場合も結合部位を
示すＤＡＢ反応産物が細胞膜表面に連続性に分布している.×30,000
Con Aにも
1025
レクチソ結合部位
Ｓ
、､
゛‥‥
？………i ゛
‥‥‥‥‥……:｀゛｀ブ11]]ｽﾞ
‥‥ ｱﾜ
?
?
……………゜……………………………:……
万万
……]゛
…………:…
犬=1
…
りへ、−
図４ Bowen癌，79歳，女，大腿部電顕写真.
ａ）ＣｏｎＡ; b）ＲＣＡ；ｃ）ＷＧＡ;d）ＰＮＡ.いずれの場合もレクチソ結合部位を示
すＤＡＢ反応産物が細胞膜表面に連続性に認められる.
WGAでは正常ケラキノサ
イトと比較してＤＡＢ反応産物が豊富に分布する.×25,000
量によるものであるとした．またOgataら2o)は単にシ
アル酸の増量によるものではなく，ガラクトースとＮ−
アセチルグルコサミンをも含んだ側鎖の増加が関与し
ていることを推定している．我々の実験結果では正常
細胞にもレクチソ受容体が存在することは明らかで
あったが，細胞膜上における受容体の分布については
ＷＧＡを除いて悪性上皮性腫瘍細胞と明僚な違いは認
められなかった．しかしＷＧＡ反応で悪性上皮性腫瘍
細胞膜においてＤＡＢ反応産物が豊富に認められたこ
とから，悪性上皮性腫瘍細胞ではＷＧＡ結合量が増加
していることが示唆される．シアル酸，Ｎ−アセチルグ
ルコサミンに反応特異性をもつＷＧＡ反応で特徴あ
る所見を示したことは,上記のWarren,
Ogataらの報
図５ 基底細胞上皮腫，74歳，女，鼻部．ＰＮＡ反応を
告と合わせると興味深い．
示す電顕写真．
ＤＡＢ反応産物は細胞膜表直iで数珠状に連なって認
基底細胞上皮腫のＰＮＡ反応においても，他の３種
められる. 25,000
類のレクチソの細胞膜の陽性所見，及び正常ケラチノ
サイト，有韓細胞癌,
Bowen癌,
Bowen病の細胞膜の
陽性所見と比較し特異な所見が観察された.
PNAは
れる他の表面構造の存在により受容体が隠れている等
未分化あるいは分化の途中にある細胞と強く結合する
の仮説18)が出されていた．
レクチソ21)であることは良く知られている．基底細胞
一方，細胞の癌化に際しての糖蛋白，糖鎖構造の変
上皮腫の腫瘍細胞は皮膚附属器，特に毛嚢脂腺系への
化を生化学的に分析し，癌細胞の膜構造の特徴を解明
分化能を有する未分化なprimany
しようとする報告もある. Warrenら19)は細胞の悪性
由来する細胞であるとされており，このために豊富に
化に伴なう糖ペプチドの分子量の増加がシアル酸の増
結合したものと推測されるが，この点に関しては更に
epithelial germに
宇野 明彦ほか
1026
症例を重ね検討してみる必要があると思われる．
学教室高田邦昭講師，技術的援助を頂いた本学皮膚科名城
以上皮膚の上皮細胞のレクチン反応を電顕的に観察
浄子技官に深謝いたします．
し，検討を加えた．
なお本研究の一部は文部省科学研究費（課題番号
本論文の要旨は日本皮膚科学会第587回研究東京地方会
5777068),昭和57年度日本皮膚科学会基礎医学研究基金,昭
（昭和56年７月18日）及び第81回日本皮膚科学会学術大会
和57年度日本リディアオリリー協会研究基金の研究助成金
（昭和57年４月２∼４日）で発表した．
により行った．
稿を終えるにあたり，御助言頂いた杏林大学医学部解剖
献
文
1)
Lis,
M.
&
Sharon,
N.: Lectins
: Their
chemis･
try and application to immunology,
Ａボｉｇｅれ!S,IV
2)
: 429-529,
Avrameas,
with
jugates
for
:
Nicolson,
43-52,
G.L.
jugated
stains
for
electron
Hori,
T.,
amoto,
U.S.A.,
by
Matsutani,
Saiio,
of
the
of
the
Ter･
preimplantation
mammalian
Kawai,
N.,
Changes
of
lectin･binding
bryonic
muscle
cell
Aub,
in
the
the
the
in
human
Ｈｈtｏｃｈｅｍ
and
rat
urologic
Ｃｙtｏｃｈｌｅｍ･，13
:
carbohydrate-binding
with
try,
cells,
1969.
19)
177
10)
:
949-959,
1972.
H.,
Parkhouse
&
charide
residues
for
Bretton,
69
:
G.L.,
S.J.:Distribution
on
membrane
of
fragments
:
Its
Len･
eptides
Ｓａｃ･
580-582,
from
implication
biogensis,Ｐｒｏｃ. Ｎａt，Ａｃａｄ. Ｓｄ.
:
R.,
2945-2949,
Rouchon,
: A
Ogata,
membrane
J.:
cells,
Ａ
Biochem￡s一
in the
architecture
of normal
defference
&
Buck,
of normal
J.P.
and
determined
and
virally
Sd.ｕ.ｓ'.A.,
S., Muramatsu,
by
sialic
erase,
69 : 1838-1842,
T.
characteristic
from
C.A.: Sｕr･
transformed
sialyltransf
&
acid
Proc.
1972.
Kobata.A.: New
of
transformed
the
cells,
large
glycop-
Nature｡259
:
1976.
Reisner,
Y., Israeli,
on,
N.: Separation
two
subpopulations
M.L.
&
Sharon,
of mouse
by
lutinin, Cell. Ｉｍｍｕｎｏｌ.,25
1972.
M. ＆ Bariety,
21)
the
1969.
ａ growth･dependent
20)
of
concanavalin
difference
L., Frhrer,
structural
Ｂ｡Nicolson,
L.: Interaction
transformed
glycoproteins
Nat.Ａｃａｄ'.
Cell･agg-
protｅｉｎｓ, Ｓｃtｅ≪ｃｅ,
homogenate
membrane
び'.S.A.,
11)
Singer,
myeloma-cell
H.: Lectins
sugar-specific
Hirano,
nox,E-S.
ａ
& Lis,
to
associated
eel＼８,Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓtｒｙ,69
: 994-1001,
Warren,
face
and
and
and
63 : 1418-1425,
1980.
cells
N.
surfaces
and
protein
the surface
1981.
Sharon,
A.: Reac･
cell
lipase
Sachs,
Burger,M.M.: A
細胞化学1981,日本組織細胞化学編，学際企画，
9)
&
normal
transformed
8）平野 寛：レクチンの組織細胞化学的応用．組織
lutinating
Lankester,
tumor
1963.
M.
their
tumor
139-153,
and
wheat-germ
: 613-619,
of
and
C. &
normal
ｅｍ･
developing
sites
Tieslau,
of
Inbar,
18)
lectin-binding
1981.
1977.
J.C,
17)
M.: An electron microscopic
on
Ａｄａ
16)
H.:
1979.
Yokoyama,
mobility
: おぼえがき,
50
on
cells, ￡ゆ．
mucopolysaccharides,Ｐｒｏｃ. Ｎａt. Ａｃａｄ. Ｕ.Ｓ.Ａ｡
aｕｒａｎtiｕｍ, Ｅつ<＊, Cell Ｒｅｓ･，
: 293-304,
study
Ann.
Hirano,
sites
surface
ascidtａｎ, Ｈ山ｃｙthia
122
F.
tissue
1977.
enzymes,
1979.
Nishiyama,
mice
1980.
13）田代 裕：蛋白質の合成と細胞内輸送，代謝，14:
1743-1754,
:
embryos,
&
15）平野 寛：細胞表面の糖鎖と細胞認識，代謝，14:
biochemistry
: 443-470,
N.
membranes
agglutinin-horseradish
in
R!６｡125:47-53,
118
pituitar-
ferritin-label-
M.I.: Developmental
communis
of Golgi
合成過程とレクチソ結合部位，医学のあゆみ，
Hirano,
human
:
14）高田邦昭，平野 寛：細胞膜のできかた，膜系の生
M.,
&
con-
F.,Kawai,
staining
conjugate
1754-1768,
1971.
K.
ricinus
tions
Ｒｅむ. Ｂtｏｃｋｅｍ., A8
7)
942-945,
D.,
means
to
Proc.
1982.
Sherman,
of
6)
:
M｡Nishiyama,
H.: The
Cell.
technique,Ａｄａ ＮｅｕｒoiJathol，(Ｂｅｒl)，Ｓ
67-74,
Yokoyama,
peroxidase
: Application
F.,
sites
cells
12)
with
Ｃｙtｏｃｈｅｍ.，27
1979.
Hirano,
saccharide
membranes,
68
Nishiyama,
adenoma
specific
cell
A｡Takakura,
ing
5)
as
to
Ｈ.: Lectin-binding
y
ｃｏｎ･
S.J.: Ferritin･Ｃｏｎ･
microscopy
bound
Ｎａt. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ.
the
glomerulone-
ultrastructurally
A,/.Hiｓtｏｃｈｅｍ，
with
Singer,
aggultinins
saccharides
of
antigeＴＶＳ, Ｉｍｍｕｎｏ-
1969.
&
plant
of
aminonucleoside
investigated
1588-1595,
Use
detection
in
phritis
canavalin
glutaraldehyde.
the
ｃｈｅｍｉｓtｒy.6
4)
1977.
S.: Coupling of enzymes to
proteins
3)
Podocytes
Ｔｈｅ
the
N.: Shar･
thymocytes
use
of peanut
: 129-134,
1976.
into
ａｇｇ･