豚サルモネラ症の保留検査におけるLAMP法の利用H23［PDF

豚サルモネラ症の保留検査における LAMP 法の利用
長崎県諫早食肉衛生検査所
○早瀬
長崎県川棚食肉衛生検査所
嶋田
理恵
圭一、樋渡
佐知子
はじめに
分子生物学的手法の向上により、現在様々な疾病の診断に遺伝子検査が利用されている。
PCR 法は最も広く普及している遺伝子検査法であり、当県においても、豚サルモネラ症の
検査日数の短縮化を目的として PCR 法の利用を検討している。しかし、その反応には高
額な機械が必要であり、結果の確認には電気泳動を行わなければならない。このため、す
べての食肉衛生検査所では実施できないのが現状である。
近年、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法という新たな遺伝子増幅
法が開発された。LAMP 法は、恒温装置があれば反応が可能であり、結果を白色沈殿とし
て確認できるため、PCR 法に代わる簡易・迅速な遺伝子増幅法として注目されている（ １ ）。
そこで今回、PCR 法を実施できない検査所での検査日数短縮化を目的として、豚サルモ
ネラ症の保留検査における LAMP 法の有用性について検討した。
材料及び方法
１．市販キットを用いた LAMP 法によるサルモネラ属菌検出法の検討
当検査所で分離した Salmonella Choleraesuis（ S . C）について、Loopampサルモネラ
検出試薬キット（栄研）によるサルモネラ属菌検出法を検討した。
（１）LAMP反応液の作製
試薬コストを削減するために、説明書で指示されている量の半分量で LAMP法を実施し
た。すなわち、1検体あたりマスターミックス10.5 μｌ に対し、DNA抽出液2.5 μｌを添加
し、LAMP反応液とした。また、反応液の蒸発防止を目的として、ミネラルオイル50 μｌ
を重層した。
（２）LAMP反応
ウォーターバスにて、65℃、1時間の条件で反応させた。
（３）LAMP増幅産物の検出、判定
目視による判定を容易に行うため、反応チューブ内の白色沈殿量を増加させるポリエチ
レンイミン（PEI）の効果について検討した （ ２ ）。LAMP反応後、PEIを0.1 μmol添加し、
チューブ内の白色沈殿量について、PEIを添加しない場合と比較した。
２．特異性の検証
サルモネラ属菌 2 株( Salmonella Typhimurium（ S . T）、Salmonella Enteritidis（ S . E））
及びサルモネラ属菌以外の 8 株（ Streptococcus suis 、 Escherichia coli 、 Erysipelothrix
rhusiopathiae 、 Arcanobacterium
pyogenes 、 Brachyspira
hyodysenteriae 、
Campylobacter coli 、 C. jejuni 、 Micrococcus luteus ）を用いて、LAMP 法によるサルモ
ネラ属菌検出の特異性を検証した。
３．検出限界の検証
S . C を 8×10 0 ～8×10 8 CFU/g となるように添加した豚肝臓及び脾臓 1 g に緩衝ペプト
ン水（BPW）9 ml を加えて、37℃、一晩培養を行った。培養前及び培養後の BPW より、
アルカリボイル法にて DNA を 抽出し、LAMP 法を実施した。
成績
１．市販キットを用いた LAMP 法によるサル
モネラ属菌検出法の検討
S . C について LAMP 法を行った結果、PEI
添加の有無に関わらず白色沈殿が認められた。
しかし、PEI 無添加のチューブでは白色沈殿
量が少なく、目視判定が困難であった。一方、
PEI を添加したチューブでは、PEI 無添加の
チューブより多量の白色沈殿を認めた（図 1）。
従って、以下の実験では、LAMP 反応
後に P EI を添加し実施した。
２．特異性の検証
サル モネラ属菌 2 株及びサルモネラ
属菌以外の 8 株を用 いて、LAMP 法を
行った結果、サルモネラ属菌のみで白
色沈殿が認められた。
３．検出限界の検証
サ ル モ ネ ラ 属 菌 が 検 出 さ れ た S. C
の検出下限値は、培養 前では、肝臓で
8×10 3 CFU/g、脾臓で 8×10 4 CFU/g
であった。培養後では、すべての接種
菌量でサルモネラ属菌が検出された
（図 2）。
考察
今回、LAMP 反応後に PEI を添加した結果、チューブ内の白色沈殿が明瞭に可視化され、
目視での判定が容易となった。従来、この市販キットは、結果の誤判定を避けるため、専
用の濁度測定装置の使用を推奨している。しかし、今回検討した方法により、測定機器を
使用せずに結果判定を行うことが可能であると考えられる。
また、 S . C を添加した肝臓及び脾臓を検体として LAMP 法 を実施したところ、培養前
で は、検出限界は 8×10 3 ～8×10 4 CFU/g であった。以前、我々が検討した PCR 法におけ
る検出限界は 8×10 5 CFU/g であり、また Real-Time PCR 法では 8×10 3 CFU/g であった
。従っ て、LAMP 法の検出感度は、PCR 法より高感度であり、Real-Time PCR 法 と同
（３）
程度であることが示唆された。
また、我々は、一晩培養した BPW を用いて LAMP 法を行うことにより、初期菌量 8×
10 0 CFU/g の臓器からサルモネラ属菌検出が可能であることを示した。この方法により、
保留の翌日にサルモネラ感染の有無を目視で判定できるため、PCR 法を利用できない検査
所においても、合格判定までの日数を短縮することができる。今後は、今回の結果を豚サ
ルモネラ症の検査マニュアルの作成に活かし、すべての検査所で遺伝子検査を利用できる
体制を整備したい。
引用文献
（ １）牛久保
宏：LAMP 法の原理、ウイルス、54、107-112（2004）
（２）Yasuyoshi Mori et al．：Sequence specific visual detection of LA MP reaction by
addition of cationic polymers，BMC Biotechnology（2006）
（３）樋渡
佐知子：PCR 法および Real-Time PCR 法による豚 サルモネラ症の迅速診断
法の検討、第 30 回全国食肉衛生検査所協議会微生物部会研修会（2010）