第二講座執筆論文対訳プリント

Ganglioside GD3 promotes cell growth and invasion through p130Cas and
paxillin in malignant melanoma cells
ガングリオシド GD3 はメラノーマ細胞において p130Cas と paxillin を通じて細胞増殖と
浸潤を促進する
PNAS（米国科学アカデミー紀要）|August 2, 2005|vol. 102|no. 31|11041-11046
Kazunori Hamamura et al.
注・翻訳に当たり，訳文を読むのに妨げにならない長さの訳注はカッコで括って（訳文の）本文中に挿入し，長くなるものは脚注に回した．また，
原論文中に著者名への言及があった場合のみ訳文中で参考文献情報を明示した．また，図は本文の後にまとめて示した．（訳者）
Summary 要約
Although ganglioside GD3 levels are highly elevated in malignant melanomas, the role
of GD3 in melanomas’ malignant properties has not been clearly shown. To investigate
this problem, we genetically generated GD3-positive (GD3+) transfectant cells from a
GD3-negative (GD3 − ) mutant line SK-MEL-28-N1 and analyzed the phenotypic
changes in the transfected cells. GD3+ cells showed markedly increased cell growth and
invasive characteristics. Two bands that underwent stronger tyrosine phosphorylation
in GD3+ cell lines than in controls after treatment with FCS were found with molecular
masses of 130 and 68 kDa. They were identified as p130Cas and paxillin by sequential
immunoprecipitation. Their roles in cell growth and invasion were analyzed with a
small interfering RNA (siRNA) approach. Cell growth, as analyzed by BrdUrd uptake,
was strongly suppressed in GD3+ cells to near the levels of GD3− cells when treated
with siRNA for p130Cas but not when treated with siRNA for paxillin. However,
treatment with siRNAs of either p130Cas or paxillin resulted in the marked
suppression of the invasive activity of GD3+ cells almost to the levels of control cells.
These results suggested that these two molecules function as effectors of GD3 ‐
mediated signaling, leading to such malignant properties as rapid cell growth and
invasion.
メラノーマ
（悪性黒色腫）
においてはガングリオシド GD3 のレベルが大きく上昇するが，
その悪性形質の上で GD3 が果たしている役割についてははっきりと示されていない．この
点 を 明 ら か に す る た め ， 我 々 は GD3 を 持 た な い （ GD3 − と 表 記 ） 変 異 株 で あ る
SK-MEL-28-N1 から GD3 を持つ（GD3+）形質転換細胞を遺伝子操作により生成し，それ
らの表現型の変化を分析した．GD3+細胞は細胞増殖と浸潤能が有意に増大した．FCS 処理
をすると GD3+細胞では対照に比して強いチロシンリン酸化を受けている 130 と 68 キロド
ルトン（kDa）の質量を持つ二つのバンド（物質の作る帯）が見られた．それらはシーケン
シャル免疫沈降法により p130Cas と paxillin と同定された．それらが細胞増殖と浸潤に関
1
して果たす機能を低分子干渉 RNA（siRNA）を用いた手法で分析した．BrdUrd uptake
により分析したところ，p130Cas に対する siRNA で処理した GD3+細胞では，GD3−細胞
に近いレベルまで細胞増殖が強く抑制された．一方，paxillin に対する siRNA で処理して
も抑制は見られなかった．これに対し，GD3+細胞の浸潤能は p130Cas か paxillin かいず
れかに対する siRNA で処理してやれば対照（GD3−）とほとんど同じレベルにまで有意に
抑制される結果となった．これらの結果は二つの分子が，急速な細胞増殖や浸潤といった
悪性形質をもたらす GD3 媒介性のシグナル伝達におけるエフェクター（訳注・酵素の活動
を促進または阻害する物質）として働いていることを示唆している．
（以下，本文）
Malignant melanoma is very difficult to cure because of its rapid growth, high
tendency of metastasis, rigorous invasion into surrounding tissues, and resistance to
chemotherapy and/or radiation. Therefore, a number of therapeutic approaches to
overcome the malignant properties of the disease have been attempted. By identifying
melanoma-specific antigens, it has been possible to apply antibody therapies and induce
melanoma-specific cytotoxic T cells. Vaccination therapy with melanoma-associated
gangliosides combined with a unique adjuvant has also been studied.
メラノーマ（悪性黒色腫）は増殖が早く，転移する傾向も高く，周りの組織に頑固に浸
潤し，化学療法や放射線治療も効きにくいといった性質のため，極めて治療が難しい癌で
ある．このためこの癌の悪性形質を抑えようと多くの治療法が試みられてきている．メラ
ノーマ特異抗原の発見により抗体療法への応用や，メラノーマ細胞傷害性 T 細胞を誘導す
ることも可能となっている．固有のアジュバント（免疫賦活剤）と結び付けたメラノーマ
に関係するガングリオシドによるワクチン療法も研究中である．
In particular, ganglioside GD3, which is widely expressed on melanomas, has been a
common target of these studies. Anti-GD3 mAb has been used in clinical trials in
melanoma patients. Based on the expression pattern of GD3 in normal and malignant
cells, its role in cell proliferation and/or activation has been postulated for a long time.
For example, GD3 is expressed almost exclusively among gangliosides in the early stage
of the brain development of mice and rats. GD3 is also detected in the T cell malignant
leukocytes, such as acute lymphoblastic leukemia cells, adult T cell leukemia cells, and
activated normal human T lymphocytes. However, no clear function of GD3 in the
malignant tumor cells has been demonstrated, although anti-GD3 antibody was
reported to suppress the cell growth of cultured melanoma cells, and a GD3-negative
cell isolate, SK-MEL-28-N1, was found to have slower growth and tumorigenic
2
properties than the parent cell line .
とりわけガングリオシド GD3 はメラノーマにおいて広範に発現しておりこれら研究の共
通の対象であり続けている．抗 GD3 モノクローナル抗体（mAb）はメラノーマ患者に対し
て治験が行われている．正常細胞とがん細胞における GD3 の発現パターンに基づき，GD3
の機能は細胞増殖と活性化，あるいはそのいずれかであろうと長い間想定されてきた．例
えば，マウスやラットの脳発生の初期段階のガングリオシドを調べるとほぼ例外なく GD3
が発現している．GD3 は急性リンパ性白血病細胞，成人 T 細胞白血病細胞のようながん化
した T 細胞や，活性化された正常 T 細胞からも検出される．しかし，抗 GD3 抗体が培養メ
ラノーマ細胞の増殖を抑制することや，SK-MEL-28-N1 株の GD3 を持たない単離細胞で
はそれを有する親細胞株に比して増殖や発癌の傾向が緩やかであることが報告されている
にもかかわらず，がん細胞における GD3 の機能がはっきりと示されたことはない．
In this study, we have generated GD3+ transfectant cells from the GD3− mutant of
SK-MEL-28 designated N1 by using cloned GD3 synthase cDNA, and we have analyzed
the phenotypic changes in GD3+ transfectant cells and molecular mechanisms for
GD3-mediated biosignals. Subsequently, we identified p130Cas and paxillin as effector
molecules involved in the increased cell growth and_or invasion activity observed in the
GD3+ transfectant cells. To our knowledge, this report is the first to clearly elucidate the
mechanisms whereby GD3 expression influences the malignant properties of melanoma
cells.
本研究において我々は，SK-MEL-28-N1 系統の GD3 を持たない（GD3−）変異体から
GD3 合成酵素クローン cDNA を用いて GD3 を有する（GD3+）形質転換細胞を得て，その
表現型の変化や GD3 が担う生体シグナルの分子メカニズムを分析した．その結果，GD3+
形質転換細胞で観察される細胞増殖能と浸潤能，またはそのいずれかの増大に関わるエフ
ェクター分子としての p130Cas と paxillin を同定することに成功した．我々の知る限り，
本論文は GD3 の発現がメラノーマ細胞の悪性形質に影響を与えるメカニズムを明らかにす
る最初のものである．
Materials and Methods 材料と手法について
Antibodies. Anti-rabbit IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) was
purchased from Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-phosphotyrosine mAb
(PY20) and anti-paxillin (mouse mAb IgG1) were from Transduction Laboratories
(Lexington, KY). Anti-p130Cas (rabbit IgG C-20) was from Santa Cruz Biotechnology.
3
Anti-mouse IgG conjugated with HRP was from Amersham Pharmacia Biotech.
抗体 … 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識された抗ウサギ IgG は Cell Signaling
Technology 社（マサチューセッツ州ビバリー）より購入した．抗リン酸化チロシンモノク
ローナル抗体（PY20），並びに抗 paxillin 抗体（マウスモノクローナル抗体 IgG1）は
Transduction 研究所（ケンタッキー州レキシントン）から得た．抗 p130Cas 抗体（ウサギ
IgG C-20）は Santa Cruz Biotechnology 社から，HRP で標識された抗マウス IgG は
Amersham Pharmacia Biotech 社から得た．
Reagents. Protein G-Sepharose or A-Sepharose beads were from Amersham Pharmacia
Biosciences.
試薬 … G セファロース並びに A セファロースタンパクビーズは Amersham Pharmacia
Biosciences 社より得た．
Cell Cultures. SK-MEL-28-N1 was established as described in ref. 17 and maintained in
DMEM supplemented with 7.5% FCS at 37°C in a humidified atmosphere containing
5% CO2.
細胞培養 … SK-MEL-28-N1 株は Nakano, J., Raj, B. K., Asagami, C. & Lloyd, K. O.
(1996) J. Invest. Dermatol. 107, 543–548 にあるようにして確立されたものである．これ
を二酸化炭素を 5%含む過湿空気中に置かれた，7.5%の FCS（ウシ胎仔血清）を加えた
DMEM（訳注・代表的な細胞培養培地の名）中で管理した．
Construction of a cDNA Expression Vector. Human α2,8-sialyltransferase cDNA clone
pD3T-31 was digested by XhoI and inserted into the XhoI site of pMIKneo (provided by
K. Maruyama, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo) to obtain the
pMIKneo/D3T-31.
cDNA 発現ベクターの作成 … ヒトα2,8−シアル酸転移酵素（sialyltransferase）の cDNA
クローンである pD3T-31 は制限酵素 XhoI を用いて切り出されたもので，これを東京医科
歯科大 学の丸山氏から得 た pMIKneo ベクターに同 じく XhoI を 用いて埋 め込んで
pMIKneo/D3T-31 ベクターを得た．
Gene Transfection and Selection. SK-MEL-28-N1 cells used for cDNA transfection were
plated in a 60-mm plastic plate (Falcon). The cDNA expression vectors were transfected
4
with Effectene (Qiagen, Valencia, CA). Stable transfectants were selected in the
presence of 400μg/ml G418 (Sigma).
遺伝子導入と選別 … cDNA による形質転換に用いた SK-MEL-28-N1 株は Falcon 社製の
60mm のプラスチック皿に塗り付けた．cDNA 発現ベクターには Qiagen 社（カリフォルニ
ア州ヴァレンシア）の Effectene（訳注・電気的な相互作用で細胞に核酸を取り込ませるリ
ポフェクション法のための装置の名）を用いた．安定した形質転換体は Sigma 社製の G418
（訳注・形質転換していない細胞を殺す作用のある抗生物質 genetisin の品名）濃度 400μ
g/ml の存在下で選別した．
Flow Cytometry. The cell surface expression of GD3 and other gangliosides was
analyzed by flow cytometry (Becton Dickinson) as described in Yoshida, S. et al. (2001)
Cancer Res. 61, 4244–4252. Control samples were prepared by using nonrelevant mAbs
with the same subclasses for individual mAbs.
フローサイトメトリー法（訳注・微細な粒子を流体中に分散させ，その流体を細く流して，個々
の粒子を光学的に分析する手法） … 細胞表面における GD3 やその他のガングリオシドの発
現は Yoshida, S. et al. (2001) Cancer Res. 61, 4244–4252 にあるようなフローサイトメト
リー法（Becton Dickinson 社による）によって分析した．各ガングリオシドに対する個々
のモノクローナル抗体と同じサブクラスに属するが無関係な抗体を用いて対照を用意した．
Preparation of Cell Lysates. Cells (2 × 105) were plated in a 6-cm dish and
serum-starved for 12 h before the treatment with FCS or recombinant proteins such as
human platelet-derived growth factor, basic FGF, or EGF. Cells were treated with FCS
or recombinant proteins for 0–60 min at 37°C. Then, cells were lysed with a lysis buffer
(20mM Tris･HCl, pH 7.5／150mM NaCl／1mM Na2EDTA／1mM EGTA／1% Triton
X-100／2.5mM sodium pyrophosphate／1mM β-glycerophosphate／1mM Na3VO4／1
μ g/ml leupeptin ／ 1mM PMSF), and insoluble materials were removed by
centrifugation at 4°C at 10,000 × g for 10 min.
細胞溶解物の生成 … ２×105 個の細胞を 6cm の皿に塗り，ウシ胎仔血清（FCS）または
ヒト血小板由来増殖因子，線維芽細胞増殖因子（FGF），上皮細胞増殖因子（EGF）といっ
た組み換えタンパクを与える前に，12 時間の血清飢餓状態においた．その上で，37℃で 0
∼60 秒の間，上述の FCS ないし組み換えタンパクを与え，それから，20mM Tris-HCl（ト
リス塩酸）, pH 7.5，150mM NaCl（塩化ナトリウム），1mM Na2EDTA（エチレンジア
ミン四酢酸ナトリウム），1mM EGTA（グリコールエーテルジアミン四酢酸），1% Triton
5
X-100（トリトン X100（界面活性剤）），2.5mM sodium pyrophosphate（ピロリン酸ナ
トリウム），1mM β-glycerophosphate（β‐グリセロリン酸），1mM Na3VO4（オルト
バナジウム酸ナトリウム），1μg/ml leupeptin（ロイペプチン），1mM PMSF（フッ化フ
ェニルメチルスルホニル）を含む溶解緩衝液の中で細胞を溶解させた．溶解液中の不溶物
は 4℃の条件下で 10 分間，10000Ｇの遠心分離にかけて取り除いた．
Western Immunoblotting (IB). Lysates were separated by SDS/PAGE using 7.5‐12%
gels. The separated proteins were transferred onto an Immobilon-P membrane
(Millipore). Blots were blocked with BSA in PBS containing 0.05% Tween 20. The
membrane was first probed with primary antibodies. After being washed, the blots were
incubated with goat anti-rabbit IgGs or goat anti-mouse IgGs conjugated with
horseradish peroxidase (1:2,000). After the membranes were washed, bound conjugates
were visualized with an enhanced chemiluminescence detection system (PerkinElmer).
To analyze the band intensities in IB, bands were scanned with PHOTOSHOP 6.0
(Adobe Systems, San Jose, CA) and quantified by using NIH IMAGE 1.61.
Western 免疫ブロット法1 … 細胞溶解液はドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミド
エスディーエスページ
（7.5∼12％含有）ゲル（SDS-PAGE）内での電気泳動を用いて分離した．これにより個々
のタンパク質は Millipore 社製のタンパク質転写膜イモビロン P の上に移された．膜は
0.05％の Tween（界面活性剤）を含んだリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のウシ血清アル
ブミン（BSA）によってブロッキング（訳注・抗体が膜に非特異的に結合して，観察した
い特異的結合のノイズとなるのを防ぐ操作）されている．この膜をまず初めに一次抗体を
使って探索した．それらを洗い流した（訳注・特異的に結合した抗体だけは流されない）
後，ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサギ IgG またはヤギ抗マ
ウス IgG（いずれも抗体）を用いてより大きく（インキュベート）した．膜を再度洗った後，
標識酵素を化学発光検出装置（パーキンエルマー社製）で視覚化した．免疫ブロットによ
り表れたバンドの強さ（どれだけ濃い帯が表れるか）を分析する上で，バンドのスキャン
は Adobe Systems 社（カリフォルニア州サンジョゼ）の PHOTOSHOP6.0（画像編集ソフ
ト）を，その定量は NIH IMAGE 1.61 を用いた．
1 訳注・膜上に転写された DNA を特異的抗体を使って検出する方法をサザンという名の研究者が開発したので，その手法はサザンブロッティン
グと名付けられた．同様の仕組みで RNA を検出する方法が開発されたとき，洒落を利かせてサザン（南）の反対側という意味でノーザン（北）
ブロッティングと名付けられた．次に，タンパク質を検出する方法が開発されたとき，残りのイースタン（東），ウェスタン（西）のうち，西を取
ってウェスタンブロッテイングと名付けられた．これが本項目のウェスタンブロッティングである．ちなみに，うちの生化学第二講座が同様の仕
組みで糖を検出する方法をイースタン〃と名付けようとしたが，人口に膾炙せず失敗したらしい（笑）．そんなわけで，イースタンブロッティング
は定着した用語としては存在しない．
6
Immunoprecipitation (IP). The lysates were immunoprecipitated with mAb or
polyclonal antibody bound to protein G-Sepharose or A-Sepharose beads at 4°C for 75
min. The beads were washed five times with a washing buffer (50mM Tris･HCl, pH 7.5
／ 150mM NaCl ／ 1mM MgCl2 ／ 0.5% Nonidet P-40 ／ 1mM Na3VO4) and finally
resuspended in 20 μ l of 2 × SDS sample buffer. The precipitated proteins were
separated by SDS/PAGE and then immunoblotted.
免疫沈降法 … 細胞溶解液は 4℃の条件下で 75 分間，G セファロースまたは A セファロー
スタンパク質の小球（ビーズ）上のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体によっ
て免疫沈降させる．これらビーズを，50mM Tris･HCl（トリス塩酸），130mM NaCl（塩
化ナトリウム），1mM MgCl2（塩化マグネシウム），0.5% Nonidet P-40（界面活性剤ノ
ニデット P-40），1mM Na3VO4（オルトバナジウム酸ナトリウム）を含む洗浄液で 5 回洗
って，最後に 20μl の 2 倍 SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液中で再懸濁した．沈殿
エスディーエスページ
したタンパク質はドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）を用
いて分別した後，免疫ブロットにかけた．
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium Bromide (MTT) Assay. Cells (4×
103) were seeded in 98-well plates. MTT assay was performed by assessing the
reduction of MTT to formazan based on the absorbance at 590 nm using an ELISA
reader Immuno Mini NJ-2300 (System Instruments, Tokyo).
MTT2アッセイ3 … 4×103 個の細胞を 98 穴ウェルプレートに撒いた．MTT 分析は MTT
のフォルマザンに変化したことによる減少量を波長 590nm の光の吸収量により測定するこ
とでなされる．測定には System Instruments 社（東京）製の ELISA reader Immuno Mini
NJ-2300 を用いた．
In Vitro Invasion Assay. Invasion assays with a Boyden chamber were performed as
described in Yoshida, S. et al. (2001) Cancer Res. 61, 4244–4252. In brief, Matrigel
(Becton Dickinson) was diluted with ice-cold PBS (100μg/ml), and 0.6 ml was added to
each Falcon 3093 filter (polyethylene terephthalate membrane, 8-mm pore size,
23.1-mm diameter) and left to be polymerized overnight. The membrane was
reconstituted with serum-free medium. The lower chamber (6-well plate, Falcon 3502)
2 訳注・テトラゾリウム塩の一種である 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazolium Bromide，すなわち MTT は細胞内に取り込
まれるとミトコンドリアにある脱水素酵素でホルマザン(Formazan)に変化する．波長 590nm の光を吸収する性質を持つこのホルマザンの産生量
を測定することでミトコンドリアの酵素活性＝細胞の生存能力を測ることができる．
3 訳注・assay は「分析・測定」の意であるが，そのまま「アッセイ」と訳すのがほぼ定訳となっているので，ここでもそれに従った．
7
was filled with the culture medium with or without serum. Cells (1–8×105 per well)
were added to serum-free medium in the upper chamber and incubated for 24 h, and
then the cells on the surface of the filter were stained with Giemsa and counted under
microscopy.
インビトロ浸潤アッセイ（体外での浸潤能の測定） … Boyden chamber を用いた浸潤能の
測定は Yoshida, S. et al. (2001) Cancer Res. 61, 4244–4252.にあるように行った．簡潔に
言うと，Becton Dickinson 社製のマトリゲル（訳注・浸潤性細胞の培養に用いられるゲル
状基質）を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で 100μg/ml まで希釈し，Falcon 3093 フィル
ター（直径 23.1mm のポリエチレンテレフタレート製の膜で，細孔の大きさは 8mm）の各々
に 6ml ずつ加え一晩放置して重合させた．この操作により膜は無血清培地として再構成さ
れる．lower chamber（訳注・直訳すれば「下方容器」だがそのまま lower chamber と呼
ぶことが多い）として，血清を含む培地または含まない培地で満たされた 6 穴プレート
Falcon3502 を置く．1 穴当たり 1∼8×105 個の細胞を upper chamber（上方容器）中の上
述の無血清培地に加え，24 時間培養した後，フィルター表面付近の細胞をギムザ（Giemsa）
染色し，顕微鏡下でその数を数えた．
BrdUrd Assay. Cells grown on a 60-well plate were incubated in the presence of BrdUrd
for 14 h with a cell proliferation kit (Amersham Pharmacia Biosciences) according to the
manufacturer’s instructions and then fixed with acid-ethanol for 30 min. The cells were
immunostained with anti-BrdUrd antibody and Alexa Fluor 546- conjugated secondary
antibody (Molecular Probes). The BrdUrdpositive cells were observed by laser
microscopy, and the percentage of BrdUrd-positive cells was calculated.
ブロモデオキシウリジン（BrdUrd）4アッセイ … 60 穴プレート中で増殖させた細胞を
Amersham Pharmacia Biosciences 社製の細胞増殖キットをその使用説明書に従って用い
て BrdUrd 存在下で 14 時間培養した．その後，エタノール酸に 30 分間浸けて固定した．
細胞は抗 BrdUrd 抗体と Molecular Probes 社製 Alexa Fluor 546 標識5二次抗体により免
疫染色した．BrdUrd を取り込んだ細胞をレーザー顕微鏡で観察し，その割合を計算した．
Inhibition of p130Cas and Paxillin Expression by Small Interfering RNA (siRNA).
Human melanoma cells were plated at 70–80% confluency in 3.5-cm or 6-cm cell culture
4 訳注・S 期の細胞に取り込まれ，そのままでは細胞殺傷能力を示さないが，正常な細胞にはほとんど影響のない近紫外部紫外線を当てた場合に，
BrdUrd を取り込んだ細胞はその殺傷能力が発揮されて死んでしまう．これにより S 期細胞を標識し細胞周期などが確定できるようになる．
5 訳注・conjugated は直訳すれば「共役の」であり，一緒に反応してより識別を容易にしてくれるという意味であるから，conjugated antibody
には「標識抗体」という訳語を充てている．
8
dishes and were cultured overnight. They were transiently transfected in Optimem I
medium (Invitrogen) with Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) with control
(fluorescein-labeled luciferase GL2 duplex, Dharmacon Research, Lafayette, CO),
anti-p130Cas siRNAs, or paxillin siRNAs (100 nM) following the manufacturer’s
instructions. Four hours later, the Optimem I medium was replaced by regular culture
medium. Effects of down-regulation on p130Cas or paxillin were assessed at 48 h after
the transfection with IB. For invasion assay, cells were collected after 2 days of the
transfection and replated.
低分子干渉 RNA（siRNA）による p130Cas 及び paxillin 発現の抑制 … ヒトメラノーマ
細胞を 70-80％の細胞密集度で 3.5cm または 6cm の細胞培養皿に塗り付け，
一晩培養した．
遺伝子導入試薬リポフェクタミン 2000 を含む Optimem I 培地（ともに Invitrogen 社製）
中の細胞に，抗 p130Cas siRNA，抗 paxillin siRNA，対照として Dharmacon Research
社（コロラド州ラファイエット）製のフルオレセイン蛍光色素で標識したルシフェラーゼ
GL2 二本鎖（いずれも 100nM）を加えたところ，細胞は一時的に形質転換を起こした．4
時間後，Optimem I 培地を通常の培地に入れ替えた．p130Cas や paxillin の下向き調節（発
現の低下）の影響の評価はトランスフェクション（訳注・核酸を細胞内に取り込ませ増殖
させること）の 48 時間後に免疫ブロット法により行った．浸潤能の測定のために遺伝子導
入操作から 2 日後に細胞を選び出し移し替える作業を行った．
Statistical Analysis. Statistical significance of data was determined by using Student’s t
test.
統計分析 … データに統計的有意性があるかどうかは t 検定6によって判定した．
Results 結果
Generation of GD3+ Clones of SK-MEL-28-N1 with Transfection of GD3 Synthase cDNA.
After
the
transfection
pMIKneo/D3T-31, two
of
GD3+
SK-MEL-28-N1
cells
with
the
expression
vector
clones (G5 and G11) were derived. Two clones transfected
with pMIKneo alone (V5 and V9) were also isolated. These GD3+ clones showed reduced
GM3 expression and low levels of GD2, whereas control cells expressed only GM3 (see
the supporting information, which is published on the PNAS web site). Using these
6 訳注・統計学的に言うと，２つの標本平均間の相違が母平均間においても相違として認められるのかについて推測する方法であるが，要するに，
得られた結果が実験誤差などの「取るに足らない差異」ではないことを統計学的にも付言するために使われる手法である．Student’s と付いてい
るのは開発者のペンネームが Student だったからという理由で特に意味はないので訳は定訳に従い「t 検定」とした．
9
clones, the effects of GD3 expression on cell proliferation and invasion were determined.
GD3 合成酵素 cDNA のトランスフェクションによる SK-MEL-28-N1 株の GD3+クローン
の生成 … 遺伝子発現ベクターpMIKneo/D3T-31 を SK-MEL-28-N1 株の細胞に導入した
後，G5 と G11 という二つの GD3+クローンが得られた．pMIKneo のみが導入された二つ
のクローン V5 と V9 も単離された．GD3+クローンは GM2 の発現が減少し，またわずかだ
が GD2 の発現が見られた．対照の細胞では GM3 のみが発現していた（GM3 については
PNAS ウェブサイトにある補遺（Supporting Information）URL：http://www.pnas.org/cgi/
content/full/0503658102/DC1 を参照のこと）．これらのクローンを用いて GD3 の発現が
細胞の増殖能と浸潤能にどのような影響を及ぼすのかを測定した．
Effects of GD3 Expression on Cell Proliferation and Invasion. The proliferation of the
GD3+ transfectant cells and the control cells were compared by using two methods. In
MTT assay, the GD3+ cells showed markedly increased cell growth. The cell numbers of
these transfectants were much higher than those of the control cells at day 9 of culture
(Fig. 1A). In BrdUrd uptake, GD3+ cells showed significantly higher growth rate than
the control cells (Fig. 1B). Invasion activity, as analyzed by the Boyden chamber, was
also markedly increased in the GD3+ cells (Fig. 2A) under both conditions examined: i.e.,
no serum (Fig. 2Ba) and serum added (Fig. 2Bb) in the lower chamber.
細胞の増殖能と浸潤能に対する GD3 発現の影響 … GD3+形質転換細胞と対照細胞の増殖
を二つの方法で比較した．MTT アッセイにより GD3+細胞の増殖は著しく増大しているこ
とがわかった．
培養 9 日目の形質転換細胞の数は対照細胞に比して著しく多かった
（図 1A）
．
BrdUrd の取り込みを基準に測っても，GD3+細胞は対照細胞に比べ有意に高い増殖率を示
した（図 1B）．Boyden chamber を用いた浸潤能の測定でも，下部容器に血清を加えなか
った場合（図 2Ba）
，加えなかった場合（図 2Bb）ともに，GD3+細胞は著しく高い浸潤能
を示した（図 2A）．
Tyrosine Phosphorylation of p130 and p68. To analyze critical proteins involved in the
increased proliferation and invasion of GD3+ cells, IB with PY20 was performed by
using lysates from cells treated with FCS or various recombinant growth factors. When
cells were treated with FCS, two bands appeared with increasing intensities from 5 min
and reached a plateau at 30 min after the stimulation. The intensity of two
tyrosine-phosphorylated proteins was much stronger in GD3+ cells than in the controls,
and their molecular masses were ∼130 kDa (Fig. 3 A and Ba) and 68 kDa (Fig. 3 A and
Bb). No bands with higher intensity in GD3+ cells were detected with any known
10
stimulatory factors examined (see the supporting information).
p130 と p68 のチロシンリン酸化 … GD3+細胞における増殖能と浸潤能の増大に中心的な
役割を果たすタンパク質を明らかにするため，ウシ胎仔血清（FCS）ないし種々の遺伝子
組換え型増殖因子を与えた細胞の溶解液を用いて，抗リン酸化チロシンモノクローナル抗
体（PY20）を用いた免疫ブロット法を試みた．FCS を与えた場合，5 分後から二つのバン
ドが強く現れ始め，FCS による刺激から 30 分でその強さは横這い状態となった．チロシン
がリン酸化された二つのタンパク質を示すバンドは GD3+細胞で対照よりもはるかに強く
表れ，それらの分子量は一つが約 130kDa（キロドルトン）（図 3A と 3Ba），一つが 68kDa
であった（図 3A と 3Bb）．これらよりも強いバンドは，GD3+細胞にその他の知られてい
る刺激因子を与えた場合でも検出することはできなかった（ウェブサイトの補遺を参照の
こと）．
Identification of p130 as p130Cas and Identification of p68 as Paxillin. The two
tyrosine-phosphorylated bands (130 and 68 kDa) were suspected to be p130Cas and
paxillin, respectively, based on their migration rates in SDS/PAGE. To clarify this point,
IP and sequential IB were performed. In the IB with PY20, both the immunoprecipitate
with PY20 and that with anti-p130Cas showed bands with similar mobility (Fig. 4Aa).
In contrast, in the IB with anti-p130Cas, p130 bands precipitated with anti-p130Cas as
well as those in the total lysate were detected at the faster-migrating site compared
with a band precipitated with PY20 (a-u and a-l in Fig. 4Aa). For the immunodepletion
of phosphotyrosine-containing proteins, the lysates were repeatedly precipitated with
PY20, and then the resultant supernatant was precipitated with anti-p130Cas. In the
IB of these immunoprecipitates, PY20 IP1 showed a band that could be detected with
similar mobility both with PY20 and with anti-p130Cas antibody. In PY20 IP3, no band
could be detected, indicating the complete immunodepletion of phosphotyrosinecontaining proteins with PY20 antibody (Fig. 4Ab Left). In contrast, a definite band of
p130Cas could be detected in p130Cas IP, as in the total lysate, at the faster-migrating
site, compared with that in PY20 IP1 with anti-p130Cas antibody (Fig. 4Ab Right).
These results indicated that the band at 130 kDa detected with PY20 was p130Cas, and
only a small portion of p130Cas was tyrosine-phosphorylated. As for paxillin, the
identification of the 68-kDa band as paxillin was achieved just as p130Cas (Fig. 4B),
showing that only a small portion of paxillin was tyrosinephosphorylated.
p130 が p130Cas であること，並びに p68 が Paxillin であることの同定 … 130kDa 及び
68kDa のリン酸化チロシンのバンドは SDS/PAGE 中での移動率からそれぞれ p130Cas と
11
paxillin であろうと推測された．この点を明確にするために，免疫沈降法とシーケンシャル
免疫ブロット法で検証した．抗リン酸化チロシンモノクローナル抗体（PY20）を用いた免
疫ブロット法では，PY20 による免疫沈降物と抗 p130Cas 抗体による免疫沈降物とは同じ
移動度を示した（図 4Aa）．これと対照的に，抗 p130Cas 抗体を用いた免疫ブロット法で
は，抗 p130Cas 抗体によって沈降した p130 のバンドは細胞溶解液から得られたその他の
バンドと同じく PY20 による免疫沈降物に比してより高い移動度を示す位置に検出された
（図 4Aa の a-u と a-l）．リン酸化チロシンを含むタンパク質を免疫除去（訳注・抗体を用
いてタンパク質を取り除くこと）するために，細胞溶解液を PY20 によって繰り返し沈降さ
せ，得られた上澄みを今度は抗 p130Cas 抗体で免疫沈降させた．これら免疫沈降物を免疫
ブロット法にかけたところ，PY20 による 1 回目の免疫沈降物では PY20 や抗 p130Cas 抗
体の場合と同じ移動度の位置にバンドが検出された．PY20 による 3 回目の免疫沈降物では
バンドは検出されず，このことは PY20 抗体によってリン酸化チロシンを含むタンパク質が
完全に除去されたことを示している（図 4Ab 左）
．これと対照的に，抗 p130Cas 抗体によ
る免疫沈降物からは，当初の細胞溶解液から得られるのと同様の p130Cas の明瞭なバンド
を，PY20 による 1 回目の免疫沈降物を抗 p130Cas 抗体で免疫ブロットした場合よりも移
動度が高い位置に検出することができた（図 4Ab 右）．これらの結果は，PY20 によって検
出された 130kDa のバンドが p130Cas であり，そのごく一部がチロシンリン酸化を受けて
いることを示している．この p130Cas を同定したのと同じやり方で 68kDa のバンドが
paxillin であること，またそのごく一部がチロシンリン酸化を受けていることも同定できた
（図 4B）
．
Selection of siRNA for Specific Knock-Down of p130Cas and Paxillin. To analyze the
involvement of p130Cas and paxillin in cell proliferation and invasion, we used a
siRNA-based approach. We first tested the ability of siRNAs to down-regulate p130Cas
and paxillin proteins in SK-MEL-28-N1 with IB. Transfection efficiency of siRNAs as
analyzed with fluorescein-labeled luciferase was >90-95% constantly. Among effective
siRNAs, highly effective siRNAs (Cas4, Cas3, Pax5, and Pax4) were selected for the
following experiments (Fig. 5 A and B). The transfection with control siRNA had no
effect on p130Cas or paxillin levels. Specific knock-down of p130Cas and paxillin with
individual siRNAs was confirmed with IB. As shown in Fig. 5C, Cas4 suppressed the
protein level of p130Cas but not that of paxillin. Pax5 suppressed the protein level of
paxillin but not that of p130Cas. Tyrosine-phosphorylated proteins also underwent
specific effects with the siRNAs.
p130Cas と Paxillin を特異的にノックダウンするための低分子干渉 RNA（siRNA）の選別
… 細胞の増殖と浸潤に p130Cas と paxillin がどう関わっているかを調べるために，siRNA
12
による手法を用いた．最初に，免疫ブロット法により siRNA が SK-MEL-28-N1 株で
p130Cas 及び paxillin タンパク質をどの程度下向き調節（発現抑制）するかを調べた．フ
ルオレセイン蛍光色素で標識したルシフェラーゼを用いて調べたところ siRNA の細胞への
導入率は常に 90∼95％を上回った．以下の実験により，効果的な siRNA の中でも特に効
果の高かった siRNA として Cas4，Cas3，Pax5，Pax4 の 4 つを選び出した（図 5A と B）．
対照 siRNA の導入は p130Cas や paxillin の発現レベルに影響を与えなかった．個々の
siRNA により p130Cas や paxillin が特異的にノックダウンされたことは免疫ブロット法に
より確認した．図 5C が示す通り，Cas4 は p130Cas タンパク質の量を抑制したが，paxillin
タンパク質の量は変わらなかった．
Pax5 は paxillin タンパク質の量を抑制したが，p130Cas
タンパク質の量は変わらなかった．リン酸化チロシンを含むタンパク質の量も siRNA の特
異的（抑制）効果を受けた．
Effects of Knock-Down of p130Cas and Paxillin on BrdUrd Uptake. To analyze the
effects of transient knock-down of p130Cas and paxillin with siRNA on BrdUrd uptake,
siRNA Cas4 and Pax5 were transfected into the GD3+ cells and the vector controls, and
then the ratio of BrdUrd-positive cells was counted. The GD3+ cells showed a
significantly higher ratio of BrdUrd uptake than the controls (Fig. 1B). Both the GD3+
cells and the controls showed no definite differences in the ratio of BrdUrd-positive cells
between siRNAs for luciferase and Pax5 (Fig. 6A). In contrast, both the GD3+ cells and
the control cells transfected with siRNA Cas4 showed a lower ratio of BrdUrd uptake
than those transfected with luciferases. The GD3+ cells with siRNA Cas4 showed a
much decreased ratio of BrdUrd uptake compared with the control cells, suggesting that
p130Cas plays a key role in cell proliferation but paxillin does not. These results were
further confirmed by using siRNAs for other sites (Cas3 and Pax4) with similar effects
(Fig. 6B). Because the knock-down of paxillin was not enough, repeated treatments of
cells with Pax5 or combined use of Pax5 and Pax4 were examined, resulting in better
suppression of paxillin protein (see the supporting information). However, BrdUrd
uptake was not affected even in these conditions.
ブロモデオキシウリジン（BrdUrd）の取り込みの上での p130Cas と Paxillin のノックダ
ウンの影響 … BrdUrd の取り込みの上での p130Cas と Paxillin のノックダウンの影響を
調べるために siRNA Cas4 と Pax5 を GD3+細胞と対照細胞（訳注・ここでは GD3 の遺伝
子を載せずに pMIKneo ベクターのみを取り込ませた細胞）とに導入し，BrdUrd を取り込
んだ細胞を数えてその割合を計算した．GD3+細胞では BrdUrd を取り込んでいる細胞の割
合が対照に比して有意に高かった（図 1B）．これら細胞にルシフェラーゼや Pax5 の siRNA
を作用させてもいずれの細胞でも BrdUrd を取り込んだ細胞の割合に明確な変化は見られ
13
なかった（図 6A）．これに対し，siRNA Cas4 を導入すると GD3+細胞と対照細胞でとも
にルシフェラーゼに対する siRNA を導入した時に比して BrdUrd を取り込んだ細胞の割合
が下がった．siRNA Cas4 を導入された GD3+細胞で BrdUrd を取り込んだ細胞の割合が対
照細胞で見られるよりも大きく低下したことは，p130Cas が細胞増殖において重要な役割
を果たしていることを示唆している．一方，変化の見られなかった paxillin は細胞増殖に
重要な役割を果たしていないらしいこともわかる．これらの結果は siRNA Cas3 と Pax4
を用いた場合にも同じ効果が見られたことにより再確認された．これらの結果が paxillin
のノックダウンが不十分であったためである場合に備えて，paxillin をさらに十分に抑制す
るため，細胞を Pax5 で繰り返し処理したり，Pax5 と Pax4 を組み合わせて処理したりす
ることを試みたが（ウェブサイトの補遺を参照のこと），これらの場合でも BrdUrd の取
り込みに変化は見られなかった．
Involvement of p130Cas and Paxillin in Invasion. After the transfection of
SK-MEL-28-N1 transfectant cells with siRNAs, invasion assays were performed with
the Boyden chamber method. The invasion activity was markedly reduced by the
knock-down of p130Cas and paxillin in GD3+ cells, although the invasion activity
showed no change in GD3− controls (Fig. 7). Using the lower chamber filled with
serum-free medium, the relative invasion activities were 0.68 and 1.38 for
p130Cas-suppressed GD3− cells and 0.14 and 0.12 for p130Cas-suppressed GD3+ cells
(Fig. 7Ba). When the lower chamber was filled with serum-containing medium, the
relative invasion activities were 1.04, 1.04, 0.26, and 0.29 in V5, V9, G5, and G11,
respectively (Fig. 7Bb). Similar effects were also observed with Cas3 in V9 and G5 (Fig.
7 Ac and Bc). When paxillin was suppressed with Pax5, the relative invasion activities
were 0.57, 0.98, 0.34, and 0.19 in V5, V9, G5, and G11, respectively, using the lower
chamber without serum (Fig. 7Da). Using the lower chamber with serum, the relative
invasion activities were 0.95, 1.19, 0.32, and 0.59 in V5, V9, G5, and G11, respectively
(Fig. 7Db). Similar effects were also observed with Pax4 in V9 and G5 (Fig. 7 Cc and Dc).
These results indicated that p130Cas and paxillin were involved in the invasion activity
only in GD3+ cells and suggested the possibility that GD3 expression caused the
enhancement of invasion activity by means of the activation of p130Cas and paxillin.
p130Cas や Paxillin が細胞の浸潤において果たす役割 … SK-MEL-28-N1 形質転換細胞に
siRNA を導入した後，Boyden chamber を用いる方法で細胞の浸潤能を調べた．対照であ
る GD3−細胞では特に変化が見られなかったが，GD3+細胞では p130Cas や paxillin がノ
ックダウンされると浸潤活性は著しく落ちた（図 7）．下部容器を無血清培地で満たした場
合，浸潤活性を示す相対的な値は p130Cas が抑制された GD3−細胞で 0.68 と 1.38，同じ
14
く p130Cas が抑制された GD3+細胞で 0.14 と 0.12 であった（図 7Ba）．下部容器を血清を
含む培地で満たすと，V5，V9，G5，G11 がそれぞれ 1.04，1.04，0.26，0.29 であった（図
7Bb）．同様の効果は Cas3 を加えた場合の V9 と G5 でも観察できた（図 7Ac と Bc）．Pax5
により paxillin を抑制した場合には，V5，V9，G5，G11 の浸潤能を示す値は無血清培地
を用いた場合でそれぞれ 0.57，0.98，0.34，0.19（図 7Da）
，血清を含む培地を用いた場合
でそれぞれ 0.95，1.19，0.32，0.59 であった（図 7Db）．同様の効果は Pax4 を加えた場合
の V9 と G5 でも観察できた（図 7Cc と Dc）
．これらの結果は，p130Cas と paxillin が GD3+
細胞においてのみ浸潤活性に関わっていることを示しており，GD3 の発現が p130Cas と
paxillin の活性化を通して浸潤能を増大させている可能性を示唆している．
Discussion 検討
GD3 is a melanoma-associated antigen and has been used as a target for the immune
therapy of melanomas. The facts that GD3 is highly expressed in melanomas in
comparison with melanocytes, is exclusively expressed in the early developmental stage
of the fetal brain, and is highly expressed in activated T lymphocytes and in T cell
malignant tumor cells suggest that GD3 is involved in tumor phenotypes, such as
enhanced proliferation and frequent metastasis. There have been a number of reports
indicating that GD3 is associated with cell adhesion to the extracellular matrix,
increased cell growth, and invasion activity. In fact, anti-GD3 antibodies appeared to
suppress cultured melanoma growth, and GD3-lacking mutants of SK-MEL-28 showed
markedly reduced cell proliferation, supporting its role in cell growth. Suppression of
GD3 expression with antisense GD3 synthase cDNA also resulted in the reduction of
tumor cell phenotypes such as growth, migration, metastasis, and angiogenesis in F11
cells. However, molecular mechanisms for the enhancement of malignant properties by
GD3 have never been demonstrated.
GD3 はメラノーマ関連抗原であり，メラノーマに対する免疫療法のターゲットとして使
われている．メラノーマにおいて GD3 がメラノサイト（メラニン産生細胞）に比して高度
に発現していること，胎児脳で発生初期段階においてのみ発現すること，活性化した T 細
胞や T 細胞性悪性リンパ腫細胞で高度に発現していることは GD3 が活発な細胞増殖や転移
といった腫瘍細胞の特質に関係していることを示唆している．GD3 が細胞外マトリクスへ
の細胞接着や細胞増殖能の増大，浸潤活性に関わっているという報告も数多くある．事実，
抗 GD3 抗体は培養メラノーマ細胞の増殖を抑えるし，SK-MEL-28 株の GD3 を持たない変
異体では細胞増殖がかなり減少することは，GD3 が細胞増殖の上で何らかの機能を果たし
15
ていることを支持している．GD3 合成酵素のアンチセンス cDNA7により F11 細胞で GD3
の発現を抑制すると，増殖，遊走，転移，血管新生といった腫瘍細胞の特質がある程度抑
えられることもわかっている．しかし，GD3 によって悪性形質が増大する分子メカニズム
についてはこれまで示されたことがない．
In this study, we established a set of melanoma cell lines with or without GD3
expression by using a GD3-deficient mutant of SK-MEL-28 that was generated by the
treatment of the parent cell with anti-GD3 mAb and complement. Reexpression of GD3
with GD3 synthase cDNA provided cell lines that enabled us to identify the phenotypic
changes due to GD3 expression in the transfectant cells and also to investigate the
molecular mechanisms for the enhanced malignant properties correlated with GD3
expression. Because only low GD2 expression appeared and lowGM3 expression
disappeared in the transfectants, these cells seemed to be useful to analyze the roles of
GD3. As expected, cell growth and invasion activity were markedly enhanced after the
induction of GD3 expression. Moreover, two proteins (p130Cas and paxillin) were
identified as the candidates for the effectors through which GD3 brings about the
biological features of melanoma cells. Suppression of these two molecules with siRNA
clearly demonstrated their roles in the increased cell growth and/or invasion in GD3+
cells: i.e., p130Cas is involved in both the cell growth and invasion, and paxillin is
involved in invasion in these cells. The fact that siRNAs of either p130Cas or paxillin
sufficiently suppressed the increased levels of growth and/or invasion in GD3+ cells
suggested that the increased cell growth and/or invasion in GD3+ cells was dependent
mainly on these two molecules. In contrast, GD3− cells were scarcely affected by these
treatments. These clear differential effects of siRNA encourage us to expect that these
agents could have therapeutic application for melanoma patients. Analysis of the
phosphorylation levels of p130Cas and paxillin in other melanoma cell lines and
melanocytes also revealed much higher intensities of these molecules in tumor lines
(see the supporting information).
本研究において我々は，抗 GD3 モノクローナル抗体（mAb）と補体8を用いて SK-MEL-28
株の親細胞から GD3 の働かない変異体を作り出し，この変異体から GD3 発現を伴う，あ
るいは伴わないメラノーマ細胞の株を確立した．この細胞株に GD3 合成酵素 cDNA を与え
7 訳注・あるタンパク質を合成するための mRNA の塩基配列をセンス配列と呼び，この配列に対して相補的な塩基配列を持った DNA をアンチ
センス DNA と呼ぶ．これを細胞に導入することで，mRNA を二重鎖化してその発現を妨げることができる．
8 訳注・補体とは免疫反応を媒介する血中タンパク質で，抗原と結合した抗体により活性化され，最近の細胞膜を破壊するなど免疫上の機能を果
たす．
16
ることで GD3 を再発現させることにより，形質転換細胞（訳注・cDNA が発現した細胞）
において GD3 の発現により生じた表現形質の変化を同定することが可能となった．また，
GD3 の発現に伴って悪性形質が増大することの分子メカニズムを調べることも可能となっ
た．形質転換細胞では GD2 のわずかな発現が見られるものの，GM3 のわずかな発現は見
られなくなっていたため，GD3 の機能を調べるには好都合と考えられた．予想通り，GD3
の発現を誘導すると細胞増殖と浸潤活性は有意に増大した．加えて， GD3 がメラノーマ細
胞の生物学的特徴を引き起こす際のエフェクターの候補として p130Cas と paxillin という
二つのタンパク質を同定することができた．siRNA によるこれら二つの分子の抑制により，
GD3+細胞で見られる活発な細胞増殖と浸潤，あるいはそのいずれかにおけるそれら分子の
働きが明らかになった．具体的には，p130Cas は細胞増殖と浸潤に，paxillin は浸潤に関
わっている．siRNA により p130Cas または paxillin のいずれかを抑制すると GD3+細胞で
増大していた増殖能，浸潤能が大きく抑えられる事実は，増殖能と浸潤能の増大が主にそ
れら分子によるものであることを示している．これと対照的に，では同様の処理を行って
もほとんど影響が見られなかった．siRNA の効果がこのように（GD3−細胞（正常モデル）
と GD3+細胞（がんモデル）とで）はっきり異なったことで，これらをメラノーマ患者の治
療に応用できるのではないかという我々の期待は高まった．他のメラノーマ細胞株や正常
なメラニン産生細胞での p130Cas と paxillin のリン酸化の度合いを調べた場合にも，がん
細胞株の方がこれら分子のリン酸化の度合いがはるかに高かった（ウェブサイトの補遺を
参照のこと）．
p130Cas was originally defined as a highly tyrosine-phosphorylated molecule during
transformation by p60v-src, as well as by v-Crk, forming stable complexes with these
oncoproteins, suggesting that it was a direct signal mediator of v-Crk. Then, it was
reported that the binding of melanoma growth stimulatory activity (MGSA), a CXC
chemokine to the class II IL-8 receptor (IL-8RB), enhanced the tyrosine phosphorylation
of p130Cas and a 70-kDa protein. These results suggest that some growth factor or
factors in FCS bind to IL-8RB and induce the tyrosine phosphorylation of p130Cas and
paxillin. In a preliminary experiment, MGSA (Groα) stimulation of GD3+ transfectant
cells induced tyrosine phosphorylation of the two molecules with a different time course
from that with FCS. Furthermore, GD3+ cells expressed IL-8RB at a minimal level.
Therefore, we need to consider factors other than MGSA, although it may partially
contribute as an autocrine factor to the signals triggered with FCS as reported
previously.
p130Cas は遺伝子 p60v-src や v-Crk による形質転換の際，腫瘍タンパク質と安定した複
合体を形成する高度にチロシンリン酸化されたタンパク質として既に知られていた．この
17
ことは p130Cas が v-Crk に直接連なるシグナル伝達物質であることを示唆している．
また，
メラノーマ成長促進活性物質（MGSA）である CXC ケモカインが Class II インターロイキ
ン 8 受容体（IL-8RB）に結合すると，p130Cas 並びに分子量 70kDa のタンパク質のチロ
シンリン酸化が進むことも報告されている．このことは何らかの増殖因子，あるいは FCS
（ウシ胎仔血清）中の要素が IL-8RB に結合して p130Cas と paxillin のチロシンリン酸化
を引き起こした可能性を示唆している．予備実験において，GD3+形質転換細胞に MGSA
（Groα）を与えて刺激すると二つの分子のチロシンリン酸化が進んだが，FCS を与えた場
合とは経時変化が異なっていた．加えて，GD3+細胞では IL-8RB はわずかしか発現してい
なかった．従って，既に報告されていることだが，MGSA が FCS によって引き起こされる
シグナルの自己分泌因子として一部が機能しているとしても，二つのタンパク質のチロシ
ンリン酸化を進める因子としては MGSA 以外のものを考える必要が生じた．
p130Cas is now considered to be an important adaptor moleculein a variety of
biological processes, including cell adhesion, migration, growth factor stimulation, and
cytokine receptor engagement. It is well known that p130Cas is implicated in many
different receptor signaling pathways and interacts with a wide variety of molecules.
Above all, association with focal adhesion kinase (FAK) and Src family kinases should
be important in the development of malignant phenotypes. In the null mutant mice,
p130Cas was shown to be essential in actin filament assembly as well as in the
development of heart and blood vessels. Therefore, it seems reasonable to think that
p130Cas plays an essential role in the increased growth and invasion in GD3+
transfectant cells, whatever the extrinsic stimulant is. In our IP of p130Cas, it was
shown that only a small portion of p130Cas was tyrosine-phosphorylated. This active
form might be translocated from cytoplasm to the plasma membrane, as reported.
Furthermore, the membrane fraction toward which p130Cas moved might be
glycolipid-enriched microdomains, where GD3 is also enriched in the transfectants. If so,
interaction between p130Cas and GD3 in glycolipid-enriched microdomains could be
crucial in the phenotypic changes of GD3+ cells.
今日では p130Cas は細胞接着，移動，増殖因子刺激，サイトカイン受容体連結など様々
な生体内作用において重要なアダプター分子であると考えられている．p130Cas は多くの
異なる受容体によるシグナル伝達経路に関与し，多様な分子と相互作用していることがわ
かっている．これらのうち，焦点接着キナーゼ（FAK）や Src ファミリーキナーゼとの関
連が悪性形質の増大という点では重要である．ヌル変異体（特定の遺伝子を欠損した変異
体のこと）マウスにより，p130Cas がアクチンフィラメントの組み立てや心臓や血管の成
長に欠かせないことが示されている．従って，p130Cas がその外因性の刺激因子が何であ
18
るにせよ GD3+形質転換細胞での増殖能や浸潤能の増大において不可欠な機能を果たして
いると考えるのは妥当な推測と思われる．p130Cas を免疫沈降法にかけたところ，このう
ちほんの一部がチロシンリン酸化していることが示された．既存の報告によれば，この活
性化された p130Cas は細胞質から細胞膜へと移動するようである．その移動先となる膜領
域とは glycolipid-enriched microdomains（訳注・GEM と略され，直訳すれば「糖脂質に
富んだ膜領域」）であり，形質転換細胞ではここに GD3 も多く存在する．だとすると，
glycolipid-enriched microdomains での p130Cas と GD3 の相互作用が GD3+細胞で見られ
る形質の変化の鍵を握っている可能性がある．
Paxillin is a multidomain protein that primarily localizes to cell adhesion sites at the
extracellular matrix (ECM) called focal adhesions. Focal adhesions form a structure
link between the ECM and the actin cytoskeleton and are also important sites of signal
transduction. Focal adhesion proteins, including paxillin, serve as a point of
convergence for signals resulting from stimulation of various growth factor receptors.
Thus, it also seems reasonable that paxillin is involved in the increased invasion of
GD3+ cells. The paxillin and FAK complex plays roles in association with extracellular
signal-regulated kinase (ERK) in DNA synthesis, survival, and motility and in
morphogenesis. Correspondingly, GD3+ cells showed higher phosphorylation levels of
ERK1/2 and Akt (see the supporting information).
paxillin は複数のドメインからなるタンパク質であり，主として接着斑と呼ばれる細胞外
基質（ECM）に存在している．接着斑は細胞外基質とアクチン細胞骨格とを構造的に結び
付けており，ここはシグナルの変換場所としても重要である．paxillin を含む接着斑のタン
パク質は様々な増殖因子受容体が刺激された結果生じるシグナルの集合点として働く．従
って，GD3+細胞における浸潤能の増大に paxillin が関与していると考えるのも妥当であろ
う．paxillin と焦点接着キナーゼ（FAK）の複合体は細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）
と共同で DNA 合成や細胞の生存，運動性に関与し，また，発生時の形態形成にも働いてい
る．これと対応して，GD3+細胞は ERK1/2 と Akt9がリン酸化されている度合いが正常に比
して高かった（ホームページの補遺を参照のこと）．
The results with inhibitors of mitogen-activated protein kinase kinase or
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) suggested that only Akt activation is involved in
the process of tyrosine phosphorylation of p130Cas and paxillin, although both the
ERK1/2 and PI3-K/Akt pathways seem to be involved in the changes of GD3+ cells. An
9 訳注・Akt は PI3-K（ホスファチジルイノシトール 3 キナーゼ）の下流に位置して細胞機能の制御に関連するタンパク質リン酸化酵素の名称．
19
important
issue
to
be
investigated
is
how
these
pathways
interact
with
FAK/p130Cas/paxillin in the signal crosstalk.
マイトジェン（分裂促進因子）活性化タンパクキナーゼキナーゼ（訳注・MAP キナーゼ
キナーゼと略される），あるいはホスファチジルイノシトール 3 キナーゼ（PI3-K）を阻害
した結果から，ERK1/2 と PI3-K/Akt の両方の経路が GD3+細胞の変化に関与しているらし
いにもかかわらず，p130Cas と paxillin のチロシンリン酸化の過程には Akt の活性化のみ
が関わることが示唆された．調査されるべき重要な課題は，ではこれらの経路がシグナル
クロストーク10の中で FAK や p130Cas，paxillin とどのように相互作用しているのかであ
る．
In the immunocytostaining, colocalization of GD3 and p130Cas or GD3 and paxillin at
the leading edges of melanoma cells was observed (see the supporting information).
Here, cells seemed to be affected by signals both through unidentified growth
factor/receptor(s) and through integrins. Although focal adhesions consisting of
integrins, FAK, p130Cas, Src family kinases, and paxillin are considered to be formed
based on the interaction between integrin and the extracellular matrix, resulting in the
migration and filopodia/lamellipodia formation, growth factor/receptors are also
involved under proper coordination. Coordination of adhesion and growth factor signals
might be facilitated by the close physical proximity of key molecules in the signaling
cascades and might be regulated by the docking molecules called ‘‘platform’’, such as
FAK in the focal adhesion complex.
免疫染色により，GD3 と p130Cas．及び GD3 と paxillin がメラノーマ細胞の先端に共
に局在している様子が観察された（ウェブサイトの補遺を参照のこと）．細胞はまだ特定
されていない増殖因子並びにその受容体とインテグリンの両方を通したシグナルの影響を
受けると考えられている．インテグリン，FAK，p130Cas，Src ファミリーキナーゼ，paxillin
からなる接着斑はインテグリンと細胞外基質との相互作用によって形成され，細胞の移動
や糸状仮足・葉状仮足の形成に働くと考えられているが，増殖因子とその受容体も固有の
調整を受けて関与している．細胞接着と増殖因子シグナルの間の協調はシグナルカスケー
ド11中の鍵となる分子同士が物理的に近接することで促進され，接着斑複合体中の FAK の
ように「プラットフォーム」と呼ばれる結合した分子により調節されていると考えられる．
The remaining issue is how GD3 regulates the input of extrinsic signals on the cell
10 訳注・クロストークとは，あるシグナル伝達経路が情報を伝えるときに他の伝達経路と影響しあうことである．
11 訳注・カスケードとは，シグナルが連鎖的に伝わっていく反応，またはその経路のことである．
20
surface. One possibility is that it functions through interactions with integrins as
suggested by Cheresh et al.. Also, Hakomori proposed interactions between ganglioside
and integrin as one of patterns for signal regulation in the membrane microdomain on
the cell surface. We have also suggested the possibility that ganglioside GM2 modulates
integrin function. Simultaneously, GD3 might also interact with unidentified growth
factor receptor(s) and enhance the receptor function, as we demonstrated in the study of
a rat pheochromocytoma cell line, PC12. The elucidation of molecules associating with
GD3 in GD3+ cells is critical.
残された問題は，GD3 が細胞表面で外因性のシグナルの細胞へのインプットをどのよう
に調節しているのかである．一つの可能性としては Cheresh et al. (1986) J. Cell Biol. 102,
688–696 で Cheresh らが言ったように，インテグリンとの相互作用を通して機能している
と い う こ と が あ ろ う ． 箱 守 も Hakomori, S. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,
10231–10233.においてガングリオシドとインテグリンの相互作用が細胞表面の膜領域にお
けるシグナル調節のパターンの一つではないかと提案している．我々もガングリオシド
GM2 がインテグリンの機能を調節している可能性を指摘している．同時に，我々がラット
褐色細胞腫細胞株 PC12 に関する研究で示したように，GD3 は未特定の増殖因子受容体に
作用してその機能を高めている可能性がある．GD3+細胞において GD3 と協働している分
子は何なのかを解明することこそ核心的課題と言えよう．
As for known growth factors effective in the stimulation of the growth in
melanocytes/melanomas, basic FGF, platelet-derived growth factor, and EGF have been
demonstrated to be responsible. However, these known factors did not show increased
tyrosine phosphorylation in any proteins of GD3+ transfectant cells in our study (see Fig.
9 and Table 1). In turn, the treatment of GD3+ transfectant cells with FCS showed
markedly increased tyrosine phosphorylation and enabled us to identify p130Cas and
paxillin as actual effectors involved in inducing some malignant features of GD3+
melanoma cells. Although these effectors were discovered with FCS treatment, results
of the following function analyses suggested that they are critical molecules in the
growth and/or invasion of GD3+ melanomas, regardless of the real stimulants. These
results strongly suggested that p130Cas and paxillin are widely involved in the
malignant properties of melanoma cell lines and melanoma tissues. Thus, expression
levels and tyrosine phosphorylation levels of these molecules in melanoma cell lines and
melanoma tissues deserve to be investigated.
メラニン産生細胞あるいは（それが悪性化した）メラノーマ細胞の増殖を促進する既知
21
の増殖因子としては，塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），
血小板由来増殖因子（PDGF），上皮細胞増殖因子（epidermal growth factor）の関与が示
されている．しかし，我々の実験ではこれら既知の増殖因子は GD3+形質転換細胞のいかな
るタンパク質についてもチロシンリン酸化の増大を示さなかった（ウェブサイトの図９と
表１を参照のこと）．これに対し，GD3+形質転換細胞にウシ胎仔血清（FCS）を与えると
p130Cas と paxillin のチロシンリン酸化が有意に増大することで，これらが GD3+メラノ
ーマ細胞の悪性形質が生じる上で実際にエフェクターとなっていることが確認できている．
これらエフェクターは FCS を与えたときにのみ見られるものであるが，それらの機能の分
析からは，真の刺激物質が何であるかに関わらずこれらエフェクターが GD3+メラノーマ細
胞において増殖と浸潤，あるいはそのいずれかに決定的な役割を果たしていることが示唆
されている．分析の結果はメラノーマ細胞株やメラノーマ組織の示す悪性形質に p130Cas
や paxillin が広く関与していることを強く支持しているのである．従って，メラノーマ細
胞株やメラノーマ組織におけるこれら分子の発現やチロシンリン酸化の度合いは調べられ
るに値する重要な指標と言える．
（本文，終わり．次ページ以降に図をまとめる．
）
22
Fig. 1. Effects of GD3 expression on
cell proliferation. (A) Cells (4 × 103)
were seeded in 98-well plates. At day
1, 3, 6, and 9 of culture, MTT assay
was performed. The experiments were
repeated three times with similar
results. (B) Cells were cultured with
BrdUrd for 14 h and stained with
BrdUrd antibody as described in
Materials and Methods. *, P < 0.05;
**,P < 0.01.
図１：細胞の増殖能に対する GD3 発現
の影響を示す図．
（A）4×103 個の細胞を 98 穴プレートに撒いた．培養 1，3，6，9 日目に MTT アッセイ
を行った．実験は 3 回行われ，いずれにおいても同じ結果を得た．
（B）細胞を BrdUrd を与えて 14 時間培養し，本文中の「材料と手法について」で記した
ようにして BrdUrd 抗体により染色した．
*は P 値 12 が 0.05 以下であることを，**は P 値が 0.01 以下であることを示す．
Fig. 2. Invasion activity of GD3 synthase gene transfectant cells. Invasion activity of the
transfectants was analyzed by using a Boyden chamber as described in Materials and
Methods. (A) Micrographs at 200× magnification of a vector control transfectant (V5)
12 訳注・統計学的に言うと，「帰無仮説（統計的な差はないという前提）の下で，実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測
される確率」のことで，乱暴な理解が許されるならば，偶然に過ぎない結果を「いや，これは偶然ではない」と誤って言ってしまっている可能性
のことと考えておけばよい．だとすればもちろん，この値が小さい場合ほどデータ間の差は科学的に意味のある差，有意差であると言える．例え
ば p 値が 0.05 以下ならば，上述の誤りが起きる可能性は 5%以下であるということである．
23
and GD3+ transfectant (G11) showing migrated cells to the lower surface of the filter. (B)
Summaries of the invasion assay. The ratios of cell number in the lower chamber_total
cell number applied (in percent) are shown. V5 and V9 are the vector controls, and G5
and G11 are the GD3 synthase gene transfectant cells. Results when the lower chamber
was filled with serum-free medium (Ba) or with FCS-containing medium (Bb) are shown.
*, P < 0.05; **, P < 0.01.
図２：GD3 合成酵素の導入による形質転換細胞の浸潤能を示す図．本文中の「材料と手法
について」に説明があるように Boyden chamber を用いて調べた．
（A）ベクターのみを導入した細胞（V5）と GD3+形質転換細胞（G11）の 200 倍での顕微
鏡像．細胞がフィルターの下面に向かって移動する様子が見られる．
（B）浸潤アッセイの結果の要点．アッセイにかけた細胞の総数に対する lower chamber
（下方容器）に移った細胞の数の比を百分率で示している．V5 と V9 はベクターのみを導
入した対照であり，G5 と G11 は GD3 合成酵素の遺伝子が導入された形質転換細胞である．
Ba は lower chamber を無血清培地で満たした場合，Bb は同じく FCS（ウシ胎仔血清）を
含む培地で満たした場合の結果を示す．
*は P 値が 0.05 以下であることを，**は P 値が 0.01 以下であることを示す．
Fig. 3. Tyrosine-phosphorylated proteins appearing after FCS treatment. (A) IB with
PY20 was performed by using lysates from cells treated with FCS after serum
starvation for 12 h. (B) Bands in A were quantitated by a scanner, and the relative
intensities of the bands were plotted. Two tyrosine-phosphorylated proteins showed
molecular masses of ∼130 (a) and 68 (b) kDa.
24
図３：FCS を与えた後にチロシンリン酸化されたタンパク質が現れた．
（A）12 時間の血清飢餓状態に置いた後 FCS を与えた細胞の溶解液を抗リン酸化チロシン
モノクローナル抗体（PY20）による免疫ブロット法にかけた結果．
（B）A のように現れたバンドをスキャナーで測定して，その相対的な強さをプロットした
図．チロシンがリン酸化された二つのタンパク質は分子量が約 130kDa（キロドルトン）
（a）
と 68kDa（b）であった．
Fig. 4. Identification of p130 as p130Cas and identification of p68 as paxillin. IP/IB was
performed to identify the two tyrosine-phosphorylated components using PY20 and
anti-p130Cas (A) and PY20 and anti-paxillin (B) antibodies. (A) Immunoprecipitates
with PY20 (PY20 IP) and those with anti-p130Cas (p130Cas IP) together with total
lysate were immunoblotted by using PY20 (a Left) or anti-p130Cas (a Right). The bands
at ∼130 kDa were designated a-u (upper) and a-l (lower). Then, immunodepletion of
phosphotyrosine- containing proteins was performed before IP/IB as follows. The lysates
were
repeatedly
immunoprecipitated
with
PY20,
and
the
individual
immunoprecipitates were designated PY20 IP1, PY20 IP2, and PY20 IP3. The resultant
supernatant
was
Immunoprecipitates
immunoprecipitated
with
PY20
and
with
those
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anti-p130Cas
with
(p130Cas
anti-paxillin
IP).
antibody
(B)
were
immunoblotted as performed for p130Cas in A to identify the 68-kDa band to be paxillin
(Ba). As was performed for p130Cas, the identification of the 68-kDa band as paxillin
was performed with sequential IP (Bb).
図４：p130 が p130Cas であること，並びに p68 が Paxillin であることの同定．PY20 と
抗 p130Cas 抗体（A），PY20 と抗 paxillin 抗体（B）を用いて，チロシンリン酸化を受け
ている二つの成分を同定すべく免疫ブロット法・免疫沈降法を行った．
（A）細胞溶解液全体から得られた PY20 による免疫沈降物（PY20 IP）と抗 p130Cas 抗
体による免疫沈降物（p130Cas IP）を PY20 を用いた免疫ブロット（a 左）または抗 p130Cas
抗体を用いた免疫ブロット（a 右）にかけた結果．約 130kDa の成分のバンドは a-u（上限），
a-l（下限）で指定されている．次に，リン酸化チロシンを含むタンパク質の免疫除去（訳
注・抗体を利用して成分の一部を取り除くこと）を行った．細胞溶解液を PY20 により繰り
返し免疫沈降させ，各回ごとの沈降物を PY20 IP1，PY20 IP2，PY20 IP3 と名付けた．そ
の結果残った上澄み液を抗 p130Cas 抗体で免疫沈降させた（p130Cas IP）．
（B）PY20 による免疫沈降物と抗 paxillin 抗体による免疫沈降物に対し，A で p130Cas
について行ったのと同じように，68kDa のバンドが paxillin であることを同定するため免
疫ブロット法を行った結果（Ba）．p130Cas の場合と同じく，68kDa のバンドが paxillin
であることの同定作業はシーケンシャル免疫沈降法によった（Bb）．
Fig. 5. siRNAs for the knock-down of
p130Cas
and
suppression
paxillin.
after
(A)
p130Cas
transfection
of
SK-MEL-28-N1 with siRNAs Cas1–Cas4
was examined by IB as described in
Materials and Methods. Actin served as a
control for equal loading. The percentage of
remaining p130Cas in cells transfected
with anti p130Cas-siRNAs was calculated
as a percentage of p130Cas in cells
transfected with the control siRNA. (B)
Paxillin suppression was assessed as
performed for p130Cas in A with siRNAs
Pax1–Pax5 by IB. The percentage of
remaining paxillin in cells transfected with
anti-paxillin siRNAs was calculated. (C)
Suppression of tyrosine phosphorylation in
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G5 and G11 after the transfection of siRNAs. Cell lysates after the transfection with
Cas4 or Pax5 were served for IB using PY20, anti-p130Cas, anti-paxillin, and anti-β
-actin as indicated.
図５：低分子干渉 RNA（siRNA）による p130Cas と paxillin のノックダウン．
（A）SK-MEL-28-N1 への siRNA Cas1∼Cas4 の導入による p130Cas の抑制は，本文の
「材料と手法について」にあるように免疫ブロット法により検証した．siRNA 導入自体の
影響を見るための対照としてアクチンの発現量も調べた．抗 p130Cas siRNA による形質転
換後も残っていた p130Cas の割合は，対照 siRNA（ルシフェラーゼ GL2 二本鎖）を導入
後の p130Cas の割合と比較して算出した．
（B）A で p130Cas について行ったのと同じように，siRNA Pax1∼Pax5 の導入による
paxillin の抑制を免疫ブロット法で評価した．抗 paxillin siRNA による形質転換後も残っ
ていた paxillin の割合を算出した．
（C）siRNA による形質転換後の G5 及び G11 細胞株におけるチロシンリン酸化の抑制．
Cas4 または Pax5 による形質転換後に細胞を溶解させ，
PY20，
抗 p130Cas 抗体，
抗 paxillin
抗体，抗β-アクチン抗体による免疫ブロット法にかけた結果を示す．
Fig. 6. BrdUrd assay to examine the role of p130Cas and paxillin in cell proliferation.
(A) The cells were analyzed for BrdUrd uptake after treatment with either Cas4 or Pax5
siRNAs as described in Materials and Methods, and the results were compared with
those of control siRNA (Luc). (B) Similar experiments were performed using other
siRNAs (i.e., Cas3 or Pax4), showing similar results. *, P < 0.05; **, P < 0.01.
図６：細胞増殖の上での p130Cas と paxillin の機能を調べるために行ったブロモデオキシ
ウリジン（BrdUrd）アッセイの結果．
（A）本文の「材料と手法について」にあるように siRNA Cas4 または Pax5 で処理された
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細胞の BrdUrd の取り込みを対照 siRNA（ルシフェラーゼ GL2 二本鎖）が導入された細胞
のそれと比較して分析した．
（B）同様の実験を別の siRNA（Cas3 または Pax4）を用いた場合についても行い，類似
の結果を得た．
*は P 値が 0.05 以下であることを，**は P 値が 0.01 以下であることを示す．
28
Fig. 7. Suppression of the invasion activity with siRNA in GD3 synthase gene
transfectant cells. (A) Invasion activity of each transfectant was investigated after 2
days of transfection with the control and Cas4 or Cas3 siRNA. (a) The lower chamber
was filled with serum-free medium. (b and c) The lower chamber was filled with culture
medium containing FCS. (B) Relative inhibition rate of invasion activity. Relative
inhibition rate was calculated as the ratio of the number of invaded siRNA Cas4- or
siRNA Cas3-treated cells to the control (Luc) siRNA-treated cells. (C) Invasion activity
of each transfectant was investigated after transfection with the control (Luc) and Pax5
or Pax4 siRNA. (a) The lower chamber was filled with serum-free medium. (b and c) The
lower chamber was filled with culture medium containing FCS. (D) Relative
inhibitionrate of invasion activity was shown as the ratio of the number of invaded
siRNA Pax5- or siRNA Pax4-treated cells to the control siRNA-treated cells. *, P < 0.05;
**, P < 0.01.
図７：GD3 合成酵素遺伝子による形質転換細胞の浸潤活性の siRNA による抑制．
（A）対照 siRNA（ルシフェラーゼ GL2 二本鎖）または Cas4 または Cas3 をトランスフ
ェクション（細胞への核酸の導入）した 2 日後に，それら細胞の浸潤活性を調べた．（a）
lower chamber（下方容器）を無血清培地で満たした場合と，（b と c）lower chamber を
ウシ胎仔血清（FCS）を含む培地で満たした場合．
（B）浸潤活性の相対的な抑制率．相対的な抑制率は siRNA Cas4 または Cas3 で処理され
た細胞のうち浸潤を示した 13 細胞の数と，対照 siRNA で処理された細胞のうち浸潤を示し
た細胞の数との比として算出した．
（C）対照 siRNA，Pax4，Pax5 のトランスフェクション（核酸導入）の後に測定された
（siRNA による）各形質転換細胞の浸潤活性．（a）lower chamber（下方容器）を無血清
培地で満たした場合と，（b と c）lower chamber をウシ胎仔血清（FCS）を含む培地で満
たした場合．
（D）相対的な抑制率を siRNA Pax5 または Pax4 で処理された細胞のうち浸潤を示した細
胞の数と，
対照 siRNA で処理された細胞のうち浸潤を示した細胞の数との比として示した．
*は P 値が 0.05 以下であることを，**は P 値が 0.01 以下であることを示す．
（翻訳文責：矢野 寿）
13 訳注・原論文では“invaded … cell”（侵入された細胞？）とあるが，実験の内容から考えて“invading … cell”（浸潤を示した細胞）と考
えた方が通りが良いので，そのように訳出した．
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