IntelliGene® HS Human Expression CHIPを用いた転写因子導入培養

i nnovation
IntelliGene HS Human Expression CHIP
®
を用いた転写因子導入培養細胞の
遺伝子発現解析
防衛医科大学校 生化学第 2 講座 近藤
信夫 新井 仁明
すでに遺伝子発現の網羅的解析技術はいくつも紹介されて
除き、ハイブリダイゼーションの再現性を確認する目的で、
いるが、特にヒトにおいては遺伝子データベースの充実に
Cy5、Cy3 ラベリングをサンプル間で取り換えた 2 回の実験
伴い、オリゴ DNA あるいは cDNAマイクロアレイを用いた
を行った。
方法が主流となりつつある。それに伴い、既成のマイクロア
レイも多数市販されているが、コスト面や解析可能な遺伝子
総数、さらには再現性などの製品間の特性をめぐる問題で多
くの研究者が少なからず悩んだ経験を持つのではないかと
思われる。我々は転写因子の機能を調べる目的で、様々な
培養細胞に活性化転写因子を導入し、支配下の遺伝子群を
検索しているが、本稿では、タカラバイオの IntelliGene® HS
【スキャニング】
DNA チップ上の水滴をエアーで吹き飛ばして乾燥した後、
スキャナー（PerkinElmer、ScanArray Express）にセットして
蛍光シグナルを読み取り、各スポットの蛍光の中央値を基準
にデータ解析を行った。標識ターゲットの比活性は、各マイ
クロアレイチップにおけるシグナルの中間蛍光値を基準に補
正した。
Human Expression CHIP（Code X121A/B）を用いて発
現解析を試みた例を紹介する。
■ IntelliGene® HS Human Expression CHIP を
用いた転写因子導入細胞の遺伝子発現の比較
■材料および方法
【材料】
fli-1 導入、非導入 MCF-7 細胞由来の RNA サンプルを Cy3、
Cy5 でラベルした後、IntelliGene® HS Human Expression
活性化 fli-1 遺伝子導入および非導入ヒト乳癌細胞株（MCF-
CHIP にハイブリダイズさせ、スキャナーを用いて各蛍光シグ
7）
、ATF6 遺伝子導入および非導入肝癌細胞株（HLF）
、およ
ナルをスキャニングした。各蛍光を重ねあわせた画像を図 1
び肝癌組織、非癌部肝組織を材料として用いた。
に示す。まず、スポット強度に比してバックグラウンドが一
【細胞からの RNA 抽出】
細胞株および組織より、ISOGEN（ニッポンジーン）を用いて
所定の方法でRNAを抽出した。RNA 抽出の最後にエタノール
沈殿を繰り返し、残留するフェノール類の除去を確実に行っ
た。さらに、抽出した total RNA のintactivity をアガロースゲ
ル電気泳動とエチジウムブロマイド染色により確認した。
【蛍光標識 antisense RNAターゲットの作製】
Total RNA（各 4 µg）から、RNA Transcript SureLABELTM Core
様かつ充分に低いことが視認された。
ScanArray Express によるデータの読み取りに際しては、最
高輝度のスポットが頭打ちにならない範囲で励起レーザー出
力を設定し、200,000 カウント以上の輝度を示す、おおむね
視認可能なスポットのみを比較の対象として用いた。
Cy3、Cy5 ラベルをサンプル間で交換して2 回の実験を行い、
得られた Cy5 染色のみ（それぞれ fli-1 導入細胞および非導入
細胞由来の RNA）の蛍光スポットをヒストグラムに描くと、
Cy5 チャンネルからの生のスポット 16,629 個のうち 200,000
Kit（Code TX815）を用いてCy3、Cy5 標識ターゲットRNAを
カウントを超えるものは共に 2,900 程度（17.3 %）存在した。
作製した。260、550、650 nm の吸光度を測定して所定の方
そのシグナル強度は fli-1 導入、非導入細胞間でほぼ同様に
法によりラベリング効率を計算し、容量当たりの蛍光強度を
分布し、ハイブリダイゼーションまでの過程で細胞サンプル
そろえてハイブリダイゼーションに供した。
間に大きな偏りは見られなかった（図 2）
。
【ハイブリダイゼーション】
各実験におけるスポットごとのfli-1/MCF-7 発現比（Cy3/Cy5
プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションはTaKaRa
または Cy5/Cy3）
を横軸、縦軸に取ってスキャッタープロット
Spaced Cover Glass XLとTaKaRa Hybridization Chamberを
を描くと
（図 3A、B）
、変動幅が2 分の1 から2 倍以内に収まる
用いて所定の方法に従って恒温水槽（70℃ 12∼16 時間）内で
もの（灰色スポット）のほかに、明らかに 2 倍以上または 2 分
行った。洗浄は、マイクロアレイチップをスライド染色かごに
の 1 以下の発現変動を有意に示すもの（赤色スポット）が存
立て、65℃の洗浄液中で激しくゆすりながら行った。Cy3 と
在した。
Cy5 の蛍光輝度を比べると、低発現領域の Cy5 蛍光強度が
さらに詳細に発現の状況を検討したところ、輝度が 200,000
見かけ上強く出やすいので、2 色蛍光の差によるバイアスを
カウントを超えた 2869 遺伝子のうち 97.6%は、実験 1 と 2 で
14
●
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の発現比率差が 2 倍以内に収まっていた（図 4）
。両実験で共
に 2 倍以上の変化を示し、発現倍率に明らかな再現性を示
（A）実験1
すと考えられるものは、解析対象とした遺伝子のうち 53 種
は、定性的に見る限りきわめて良好であることが示唆された。
実験 1
実験 2
MCF-7（Cy3）
存在した。これらの事実から、独立した実験における再現性
107
106
2×105
105
105
2×105
106
107
fli-1（Cy5）
（B）実験 2
fli-1（Cy3）
107
106
2×105
105
105 2×105
106
107
MCF-7（Cy5）
図3 fli-1導入／非導入細胞の発現遺伝子のスキャッタープロット
図1 ScanArray Express に取り込んだ Cy3、Cy5 重ね合わせ画像
100000
fli-1導入MCF-7
MCF-7
Number
10000
1000
実験 2_fli-1/MCF-7（Cy3/Cy5）_ratio
10 2
10 1
10 –2
10 –1
10 1
10 2
10 –1
10 –2
100
実験 1_fli-1/MCF-7（Cy5/Cy3）_ratio
10
図4 実験 1と実験 2 で得られた発現プロファイルの比較
more
∼3000000
∼2800000
∼2600000
∼2400000
∼2200000
∼1800000
∼2000000
∼1600000
∼1400000
∼1200000
∼800000
∼1000000
∼600000
∼400000
0∼200000
1
Intensity range
輝度が 200,000 カウント以上のスポットについてプロットした。両実験で共に
2 倍以上の変化を示したものを黄色のドットで示す。
■ IntelliGene® HS Human Expression CHIP と
他社オリゴ DNA チップとの比較
肝癌組織で活性化している遺伝子群、および肝癌細胞株
図2 fli-1導入／非導入細胞サンプル間のスポット蛍光当たりの Cy5
輝度をもとに作成したヒストグラム
（HLF）
に導入したATF6（肝癌特異的に活性化する転写因子）
で発現調節される遺伝子群の発現をIntelliGene® HS Human
Expression CHIP（cDNA チップ）を用いて調べ、すでに公表
されているデータや、我々の研究室で他社オリゴDNA チップ
を用いて得た結果との比較検討を行った。
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今回我々が IntelliGene® HS Human Expression CHIP を用い
た。また、シグナル強度が高く、オリゴDNA チップを取り
て得た結果を、肝細胞癌での活性または ATF6 による調節が
扱うときに問題となっていた低発現領域における Cy 3、
すでに確認されている遺伝子の発現挙動（文献データ）と比
Cy5 の蛍光強度の歪みも気にならなかった。さらに、シグ
較したところ、16 種類の遺伝子において再現性が確認された
ナル強度が高いために、実質的に検索可能な遺伝子の数
（表 1 A、B）
。
（我々の例では 200,000カウントを超えるものは17.3%程度
一方、全く同じRNAサンプルを他社オリゴDNA チップで解析
したところ、Cy5、Cy3ラベリングを交換し2 度の実験を行っ
て再現性を示す遺伝子を選別したにもかかわらず、正答率は、
®
存在した）が増大することが期待された。
3）DNA チップには大きく分けてオリゴDNA を固定したタイ
プと IntelliGene® HS Human Expression CHIP のように
IntelliGene HS Human Expression CHIP の結果の方が有意
長い cDNA を用いたタイプとがある。一般にオリゴ DNA
に高かった。また、個々の発現倍率もおおむね後者の方が
チップの場合、特異性の高さが期待される向きがあり、
大きい傾向が見られた。以上の結果から、IntelliGene® HS
特殊なシステムを採用しているAffymetrix® 社のGeneChip®
Human Expression CHIP で得られた結果は他社オリゴDNA
のように高い特異性と信頼性を示すものもある。しかしな
チップに比しても充分信頼性の高いものであることが示唆さ
がら、我々の経験では一般のオリゴ DNA チップは、シグ
れた。
ナルの弱さがその特異性を打ち消して結果の不安定さの
要因になっていることが実感された。
■結論および考察
一方、cDNA チップは大変強いシグナルを示し、一定量の
1）一般的にマイクロアレイを用いた実験では、Cy3/Cy5 ラ
輝度を超えるスポットでは結果が安定しているが、非常に
ベリングを替えて複数回実験を行って結果の補正を行う
稀に数十倍もの発現差がチップ上で確認されたにもかか
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が、IntelliGene HS Human Expression CHIP を用いて得
わらず、RT-PCR の結果では数倍程度にとどまる場合が
られた結果は高い再現性を示し、実質的に 1 回の実験で
あった。このような場合には、Splicing variant なども考慮
も信頼度の高い判定が可能と思われた。
しながら CHIP プローブ搭載領域とRT-PCR 増幅領域を
2）オリゴ DNA チップに比べ、cDNA チップはハイブリダイ
そろえ、プローブ塩基配列を参考に特異的な PCR プライ
ゼーションの条件検討が容易で、安定した結果が得られ
マーを設計するなどの補足的な検討が必要と思われた。
表1 肝細胞癌／非癌部肝組織（HCC/NL）
、および ATF6 導入／非導入肝癌細胞株（ATF6/HLF）で発現が変化する既知の遺伝子
（A）HCC/NL
再現性
TaKaRa
X社
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
×
⃝
ND
ND
ND
発現倍率
TaKaRa
X社
3.3
2.2
2.1
3.6
3.7
2.4
5.6
33.3
2.3
6.2
3.9
1.4
1.7
−
−
−
発現変化を示すことがすでに文献で報告されている遺伝子
Galactoside-binding, soluble, 4（Galectin 4）
（LGALS4）
Insulin-like growth factor binding protein 1（IGFBP1）
UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide B4（UGT2B4）
Vitronectin（VTN）
Ribosomal protein S8（RPS8）
Ribosomal protein L30（RPL30）
78 kDa glucose-regulated protein precursor（GRP78）
94 kDa glucose-regulated protein, GRP94）
（ gp96 homolog）
文献
1
1
1
1
3
3
4
2
（B）ATF6/HLF
再現性
TaKaRa
X社
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
⃝
×
⃝
×
×
ND
ND
×
×
発現倍率
TaKaRa
X社
3.6
1.6
3.5
2.3
4.2
3.5
0.3
0.6
1.4
1.6
0.9
0.9
−
−
0.9
0.8
発現変化を示すことがすでに文献で報告されている遺伝子
94 kDa glucose-regulated protein, GRP94）
（ gp96 homolog）
Protein disulfide isomerase-related protein（P5）
Tryptophanyl-tRNA synthetase（WARS）
Calreticulin（CALR）
3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1（soluble）
（HMGCS1）
78 kDa glucose-regulated protein precursor（GRP78）
Solute carrier family 1（neutral amino acid transporter）
, member 5（SLC1A5）
Four and a half LIM domains 2（FHL2）
文献
5
5
5
5
5
5
5
5
文献：1）Cancer Res., 59（19）
, 4990-6（1999）
. 2）Biochim Biophys Acta., 1536（1）
, 1-12（2001）
. 3）Anticancer Res., 21（4A）
, 2429-33（2001）
.
, 605-14（2003）
. 5）Biochem J., 366（Pt 2）
, 585-94（2002）
.
4）J Hepatol., 38（5）
文献的にHCC（A）やATF6 導入細胞（B）で発現が変化することが報告されている遺伝子が、IntelliGene® HS Human Expression CHIP および他社オリゴDNA チップ
を用いてどのように検出されるか調べた。発現倍率はHCC もしくはATF6 で促進されるものを1 以上、抑制されるものを1 以下で表している。すでに報告されてい
る発現様式に対して再現性のあるもの（1.5 倍以上または 0.6 以下）を○、再現性の乏しいものを×で表記した（ND：no data）
。
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