P 2

~
第 V掌
P2 特 異 性 の 改 変
目的
a
q
u
a
l
y
s
i
n[の S 2部 位 は Ala
残 基1
1
普好性であり、非分岐型アミノ酸
A
l
a
.
N
l
eに対して高い反応性を示した。分岐型アミノ酸 V
a
l
.Leu残基に対す
1
1
位の Ala残 基
る反応性は、 k 値では Ala残基の数分の lであり、 S2音
C31
1
1
島好性は、 S3音
1
1
位の P
h
e残 基 l
噂好性に比較すると、あまり高 くはなかっ
f
こ
。
そこで、 S2部位の Ala残基1
1
告好性を更に高くする、または、 Ala残 基
よりも小さな G
ly残基に対する 1
1
長好性を高くすることを目的とし、 P2特
異性の改変を行った。
S2部位の検索とモデリング
S
u
b
t
i
l
i
s
i
nの S 1音1
1
位と同様に、 S2音
1
1
位は「ポケット j を形成してい
る
。 S2音1
1
位は Asp"，Thr33，Asn6'，H
i
s64，Le
u96，GI/∞(
s
u
b
t
i
l
i
s
i
nC
a
r
l
s
b
e
r
gの
残基)等の残基により形成されており、活性中心の Asp"，H
i
s64 の 2残基も
Ap
'
)と「壁 j (
H
i
s刊に当たる部分を形成している。 Thr33，
それぞれ「底 j (
S3
Leu96，GlylOOは H
i
s
.4 とは反対側の「壁 Jを形成し、
「天井 Jに当たる部分
には Asn6'が位置している。 S2部位は s
u
b
t
i
l
i
s
i
nの S 1音1
1
位とは異なり、
i
J
l
j が浅く、かつ「天井 Jの低いポケットを形づくっていて、体積の大
きな P 2残基はポケットからはみ出した形で存在し、基質の P2残基 1
1
i
J~Jí
とS2音1
1
位との親和性は、
P2残基に対して s
u
b
t
i
l
i
s
i
nBPN'の S 1音1
1
位と
P 1残基ほどには寄与しそうにない。むしろ、 S2部位内に活性中心の残
S
P
3
2があることから、反応速度定数 k叫値に寄与すると期待
基H
i
s64 と A
できる。
F
i
gVl図A、図 Bに s
位を示した 。酵素主
u
b
t
i
l
i
s
i
nC
a
r
l
s
b
e
r
gの S2音1
1
鎖(青色)と S 2 部位(緑と白)に基質として egli 口 c の P2' ~P 5 部位(桃色)
を加えて示した。ただし、図は e
gl
i
ncの P2部位を G
l
y、 P3部{立を Phe
に置換したものを示しているため、 S2音1
伎に P2残基の側鎖は登場して
いない。
)に対して、残基
この S2音1
位を椛成する残基 (
1
T
h
r3，Asn6'，Leu96，GlylOo
置換のシミュレーションを行い、導入した似J
I鎖の向きと P2アミノ酸残基
鎖との相互作用を制べたところ 、 S2音1
r
t
1
位の「ポケット Jのイ本積・}惨状
1
J
1
l
y
'
O
Oの 2残基
を変え、 P2特異性を改変するのに寄与したのは Asn6' と G
であった (
H
i
s刷の置換も S2部伎の形状・体積を変更できるが、この残基
ー
は活性中心の一部であるため、対象から外した)。
S 2音1位を拡大し、 F
i
'g
Y2に示した。 2つのア ミノ 酸残基 As
n62と
G
l
ylOO
とを白で、他の S2音1位の残基を育で、基質 e
g
l
i
nc(P2 ・ ~ P5 部位)を
桃色で示した。
S2部位のアミノ酸の lつである G
l
y
'∞をシミ ュ レーションにより、他
l
a，Yal
，
L
e
uに置換した場合の側鎖の位置を F
i
g
Y
3に示し
のアミノ酸残基 A
た
。
l
a残基に置換したもの (
1
1
l
J
鎖を赤で示した)、図 Bは Y
a
l残
図 Aは A
e
u残基に置換したものを表す o G
l
ylOO部位へ導入された側鎖、
基、図 Cは L
が
、 S2部位の「ポケット Jの内 側へと伸びてゆき、 P2残基の側鎖が入
r
るはずの S2 ポケット Jの杢間を埋めて行く。
2部位の残基のうちか ら G
l
y
lO(
a
q
u
a
l
y
s
i
n1では G
l
ylOlI
こ当
そこで、 S
たる)を選んで変異導入の対象とし、 P24
守兵性を Gl
y残基 l
幣好型に改変す
ることにした o A
q
u
a
l
ys
i
n1の S2古川立カ{s
u
b
t
i
l
i
s
i
nと同じならば:'， P2寺
f
!
異性は側鎖の小さい Al
aや Gl
y残基に対する晴好性を上昇させ、より「エ
ラスターゼJ的特異性を獲得することが期待できる。
また、残基置換のもう lつの候補である Asn62 については、 S2音1位
に存在する電荷を持 っ た残基であるので、その側鎖の電荷を 41!~ くして S 2
部位の環境を変え、その役割について調べることにした。
F
i
g
.
V
-1
.52s
i
teo
fs
u
b
t
i
l
is
i
nC
a
r
l
s
b
e
r
g(
g
r
e
e
n
)，
ands
u
b
st
r
a
tee
g
l
i
n
c(
P2'P5;P2:
G
l
y
.P3:Ph巴
)
F
i
g
-V2
.5
u
b
s
t
r
a
t
巴
(
巴g
l川 c;P2'P5)and5
2
-s
it
e(s
u
b
t
i
l
i
s
i
nC
a
r
l
s
b
e
r
g)
r
ep
a
i
n
t
e
di
nw
h
i
t
e)
(Asn62andGlyl
∞
附
A
)G
l
yl
O
O→A
l
a
B)G
l
y
l
O
O→V
a
l
e
u
C
)G
l
y
l
O
O→L
F
i
g
-V
3
.S
i
m
u
la
t
i
o
no
fa
m
i
n
oa
c
i
dr
e
p
l
a
c
e
m
e
n
to
fG
l
y1
0
0t
oA
l
a，Va.
lL
e
u
材料と方法
変異型酵素
S 2音¥
1
位を構成している残基のうちの 2残基を選び、 G
l
y
l
O
lを Ala，V
a
l，
Leu残基に(ただし、 V
a
lは G
lyl
O
l_
S
e
r102 → V
a
lH
i
sの 2重変異の形で導入
した)、 Asn68をAsn残基と同じ体積で疎水性の残基である Valに置換した、
計 4種の変異型酵素を調製した。
4種 の 変 異 型 酵 素 の 名 称 ( 略 号 ) を 、 次 の よ う に 定 め た 。
略号
変異
AQN(N68V)
Asn68 → V
a
l
AQN(GI0IA)
G
l
y
l
O
l-+ Ala
AQN(GI0IL)
GlylOl→ Leu
AQN(GI0lV:SI02H)
Gl
ylOl→ Val
，S
e
r102 → H
i
s
ig
-V
-4 に示した)
1
. 変異の導入と発現ベクターの調製(手順を F
Aqualysin1の全椛成遺伝子を含むプラスミド pAQN より変異導入の対
Xbal断 片 を 切 り 出 し て フ ァ ー ジ D N A
象 と な る 部 分 を 含 む BamHI-
(M13mp19 RFDNA)に 組 み 込 ん で 剥 製 し た U-ssDNA を鋳型とし、
T
a
b
l
e・V-l に示す変異導入プライマーを用いて変異を導入した(方法は
B
i
oRadのマニュアルにしたがった)。変異導入の有無は DNA シークエンシ
ングにより直接確認した 。 変異導入が確認されたファージ D N Aより切り
Table-V
l
.O
l
igon
u
c
l巴ot
id巴 s
e
quen
c
e
so
fmutage
ni
cprim
巴r
s
M
u
t
a
t
ion
Re
s
.
enz
.
O
l
igon
u
c
leot
i
d
es
e
que
nc
e
s
N68Wi
l
d
AAC GGC CAG GAC 叩 C AAC GGC CAC GGT ACC CAT
N68V
AAC GGC CAG GACτロC QTT GGC CAC GGT ACC CAT
GIOlWild
GIOlA
GIOlL
GlOl
V:SI02H
GTC C
τロ GAC τ
ロC AAC GGT TCC GGC TCC ACC TCT
Mll
Il
GTC C叩
GAC TGC AAC G~ TCC GGC TCC ACC TCT
GTC C
τ'G GACτロC AAC CTG TCC GGC TCC ACC TCT
GTC CTG GACτ'GC AAC GIaACT GGC TCC ACC TCT
XbaI~
0
3
・
l
P3
ob
v
l
AC
n
ρ
m
q
u
I
HU
ρν
d
ρ
I
V
I
P
v
ρ
L
V
I
I
AU
I
-
，
，
P3
illit--
Acc
I
K
s
p
I
A
cc
I
、
d
.C
m
u
t
a
t
e
dpAQII
F
i
g
-V4.
S
t
r
a
t
e
g
yf
o
rc
o
n
s
t
r
u
c
t
i
o
n
o
fm
u
l
a
n
la
q
u
a
l
y
s
i
n1
.
pAQNoC
Np
r
o
pEXP8oC
m
u
t
a
n
ta
q
u
a
l
y
s
i
n1
F
i
g・V
4
.
出 し た BamHI-AccI断片をベクター pAQNム C に 組 み 込 み 、 更 に 、
a
q
l
l
a
l
y
s
i
n1全遺伝子配列を含む Ec
o
RI
H
i
n
d
l
l
l断片を ベクター pAQNム C か
ら 切 り 出 し て 、 高 発 現 ベ ク タ ー pEXP8に 組 み 込 ん だ 。 こ の ベ ク タ pEXP8に組み込んで得られたプラスミドを変異型酵素の発現用プラスミド
とした。
2
. 変異型酵素の生産 ・発現
E
.
c
o
l
iM V1l84)を宿主として、全ての発現ベクターを形質転換
大腸菌 (
した。菌は 37'c、アンピシリン存在下 (100μg/ml)において L B培 地
(
B
a
c
t
o
t
r
y
p
t
o
n
e 1%.Yeaste
x
t
r
a
c
t0.
5%.NaCl 0.5%.G
l
l
l
c
o
s
e0.2%)でー l
挽培
養 (1%椴菌)してタンパク質合成をおこなわせた後、遠心 (
5 k rpm.10
min)により集菌した。
3
. 変異型酵素の精製
10 mM.NaCl1%.
得られた培養菌休を熱処理溶液 (EPPS50 mM.CaCl
2
pH8
.
5
)に懸濁して超音波破砕したのち、プロテアーゼ活性が現れるまで 70
℃で熱処理 (10~50 時間)をした。ブロテアーゼ活性が現れた浴液は、遠心
により菌体由来の不溶性画分を取り除き、更に、 il~ 過(フィルター 0 . 45μm
径)したのち 、硫酸アンモニウム(最終濃度 25%) を加えて、予め 25%硫 酸
ア ン モ ニ ウ ム 浴 液 ((NH，
)
2S0 25%.Naphosphate20 mM.CaCl，
1 m M.pH
喝
6
.
0
)で 平 衡 化 し て お い た Bl
It
yl
t
o
y
o
p
e
a
rl650 カ ラ ム に 吸 着 さ せ た 。
Bl
It
y
l
t
o
y
o
p
e
a
r
lカラムからの溶出は、 10%硫酸アンモニウム溶液、 0%硫
酸アンモニウム溶液、イソプロパノール溶液 (lsopropanol20%.NaCl2
.
5
M) の}~買に行い、これらの画分のうちプロテアーゼ活性をもっ画分を選んで
透析した。透析した画分は、予めリン般緩衝液 (Nap
h
o
s
p
h
a
t
e 10mM，pH
h
a
r
m
a
c
i
a
)に吸着さ
6
.
0
)で平衡化しておいた monoSカラム(FPLCsystem:P
画分のうち、プ
せ
、 NaClで塩濃度勾配をかけて浴出させた。得られた浴日 i
PAGEで分子量と純
ロテアーゼ活性の高いものを選んで、精製襟品とし、 SDS-
度を確認した後、 B C Aキット (
P
i
e
r
c
e社)を用いてタンパク濃度を定量し
た
。
反応速度定数の測定
精 製 し た 4種 の 変 異 型 酵 素
AQN(N68V， GIOIA， GIOl
L
、
GIOlV:SI02H)の反応性を、トリペプチド基質を用いて P2特異性を測定
し、あわせて標準基質としてのテトラペプチド基質を用いて測定した。 一
部の変異型酵素 AQN(N68V)に対しては、構造をもっ基質であるプロテア
ーゼ・インヒピタ- SSI を用いて阻害定数を測定し、導入した変異の影響
を調べた。また、 S2音1
5
1
立に導入した変異が P3特異性に対して及ぼす影
いて、
響を調べるために、合成トリペプチド基質を斤l
2程の変典型酵素
AQN(N68V，GI01A)の P3特異性を調べた。
1， P2特 異 性 の 測 定 (1)
P 2 部 伎 の 異 な る 4砲 の 基 質 s
u
cPhe-X-AlapNA(
X =Ala，N
l
e，V
a
l，
L
e
u
)(
B
o
cー
アミノ般から液相法で合成したもの)を用いて、 40'
C
、 pH7
.
5
(HEPES100m M.CaCI2 1mM)における反応速度定数を求めた。反応はすべ
てミカエリス・メンテン型に従 っており、反応速度定数は観測された反応
速度 vと 基 質 濃 度 [S
] をもとに、 V叩と
K
"とを変数として、非線形の
去を用いて計算した(第 I章参!照)。
最小自釆 1
2. P 2特異性の測定 (2)
l
y
.Al
aにおい
S 2部位に導入された変異が側鎖の吏に小さなアミノ酸 G
て及ぼす P 2特異性の影響を調べるため、 2種 の 基 質 suc-XXPhepNA
(X=Ala.Gly) (NovaBiochem社より購入)を用いて、
3種 の 変 異 型 酵 素
AQN(G101A.G101L.G101V:S102H)の反応速度定数を求め、野生型酵素
と比較した。
3. テトラペプチド基質に対する反応迷度定数の測定
ペプチド基質の P 2特異性以外の反応性を調べるため、テトラペプチド
Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(Sigma社より購入)を用いて 測定し た (
40'
C
.
基質 sucpH7
_
5
)。反応様式は上記と同じくミカエ リス ・メンテン型に従っていた。
4.プロテアーゼ ・インヒピタ-SSIの阻害定数の測定
C
、 pH 7_5 における野生
変巽型酵素の一つ AQN(N68V)を用いて、 40'
Ib
t
il
is
i
ni
n
h
i
b
i
to
r
)の岨筈定数を測定により求めた。野
型 SSI(Streptomycessl
生型の a
q
l
l
al
ys
i
n 1の場合問機、 S
S
I の阻害定数が十分小さな値をとってい
たため、通常の競争阻害様式としてではなく、ペプチド基質
s
u
c
-AlaAlaProPhepNA を基質として S
S
I 濃度に対する残存活性を測定
して阻害定数値を求めた(第1Il章参照)。
5
. P3特異性の測定
P3部位の異なる 2つの基質 s
u
cPheA
l
a
A
l
apNA(
B
o
cアミノ酸か ら液
相法で合成したもの)と s
u
cA
l
a
A
l
aAlapNA (
S
i
g
m
a社より購入)を用い
て
、
2種 の 変 異 型 酵 素 AQN(N68V.GIOIA)に対して、 40'
C
. pH 7
.
5
(HEPES100mM.CaCl，
1mM)における反応速度定数を求めた。
結果と考察
変異型酵素 AQN(N68V)
l
. テトラペプチド基質と SSIに対する反応性
変異型酵素
AQN(N68V)の テ ト ラ ペ プ チ ド 基 質
suc-Al
a-Al
aP
r
o
-Phe-pNA に対する反応速度定数と野生型 SSIの阻害定数を
‘
TableV2 に示した (pH7
.
5，40'
C
)
。
テトラペプチド基質に対する反応性は、野生型酵素に比べると、 k'"値
、 K"値で約 2
1
音となり (k"
，
/K"値は約 1/4倍)、この基
で約 1/2倍
質に対する反応性は少し低下した。このテトラペプチド基質を用いて求め
た!野生型 SSIの阻害定数は、野生型 aqualysin1とほぼ同じであり、 この変
異は酵素・基質問の結合にはほとんど影響を及ぼしていなか った。また、
データには示していないが、変異型酵素 AQN(N68V) と SSI との反応にお
い て は 、 平 衡 に 達 す る の が 遅 く 、 約 1I
時間を費 や し て お り (
t
l
牙生型
aqualysin1の場合は 5分程度で十分である)、この変異が反応迷度(つまり
k，
，
，
) に影響を及ぼすことを示した。
2， P2特異性
基 質 の P 2音1
1
1
立 を 系 統 的 に 変 え た 4種 の ト リ ペ プ チ ド 基 質
suc-Phe-X.Ala'pNA (X= Ala，N
le，V
a
l
.Leu) に対する 40'
C.pH7.5 におけ
T
a
b
l
e
V
2
.K
i
n
e
t
i
cp
白 a
m
e
t
e
r
sf
o
rt
h
eh
y
d
r
o
l
ys
i
so
fs
u
c
A
l
a
A
l
a
P
r
oPhe-pNA
b
yw
i
l
d
/
m
u
t
a
n
ta
q
u
a
l
y
s
i
nI
's
，a
n
di
n
h
i
b
i
t
i
o
nc
o
n
st
a
n
to
fS
S
It
o
w
a
r
dt
h
e
s
eenzymes
s
u
c
A
l
a
A
l
a
P
r
o
P
h
e
p
N
A
Enzyme
W
i
l
d
[
s
e
c'
l
KM
{
m
M
l
kc
n
l
.
KM
(
s
e
c
"mM"1
3
3
1
.
2
2
8
k
C
a
I
SSI
Kl
[M)
3
.
0x
1
0"O
-・ーーーーーーーーーー-ーーーーーーーーー一一一ーーーーーー一一一ーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーーー一一一一一ーーーーーーーーーーーー-ーーーーーーーーーーーーーー
N68V
1
5
2.
4
6
.
2
1
.
3 x1
0・1
0
A
s
s
a
y
sw
e
r
ep
e
r
f
o
r
m
e
da
t
4
0C，pH7.5(HEPES1
0
0n
ホ札 C
aCI21m M，
E410=8
6
8
0Mー'
c
m
-1
)
0
る反応速度定数を TableY3に、反応速度の飽和 I
l
l線を F
i
gY-5に示した。
野生型商事素に比べると全体的に基質の K" 値は大きくなった(その影
響で k
叩
/K"値は小さくなっていた)が、 k
，
>
<1
直は Ala残基において野
生型酵素とほぼ同じ、 N
l
e残基で約 1/2、Y
a
l残基で約 1/3、 Leu残基で
約 1/4儲となり、 Ala残基以外での k削値が低下した。飽和曲線で比較す
ると、反応速度は器質濃度に関係なく Al
a
>N
l
e
> Yal> Leuの順に大きく、
l
eを好み、分岐アミノ酸 Y
a
l，
野生型酵素と同じく、非分岐アミノ酸 Ala，N
Leuをあまり好まなかった。
全 体的には、 P2特異性は野生型酵素と同じであ ったが、 Al
a残基の反
応性を保持したまま、 他 3種 の残基の反応性を低下させていたため、 P 2
特異性において、 l
l
i
}生型酵素よりも A
la1
1普好性が高くな った。
3
. P3特異性
P 3 部 位 の 異 な る 2種 の ト リ ペ プ チ ド 基 質 su
c-X-Al
aAl
a-pNA
(X=Ala，
Ph巴)に対する 40'
C
， pH7.5における反応速度定数を TableY4に
、
反応速度の飽和 山線を F
ig
Y
6に示した。
P2特異性の;
場合と同様に、 全体に K
" 値は大きくな った。 Phe残基に
対する反応では k削値は野生型酵素とほぼ同じであ ったが、 Ala残基に対す
る k叫値は!1'J生型静素よりも低くなった(約
1/4倍)。この変異型酵素
の S3部位は Phe1
1
普好性で、野生型酵素と同じ P3特異性を示したが、野
生型酵素よりも Phe1普好性が高くなった。
0
.
0
3
9 1
2
0
I
J
5肘 EPES1
0
0mM， CaCl21m M，E4
6
8
0M-1cm.I
)
.
A
s
s
ay
sw
e
r
eperformωat40oC，pH7.
10=8
4
.
7
0
.
0
4
4 250
8.
8
0
.
0
3
6 2
5
0
0.
0
7
1 46
3
.
3
ー
噌
戸
事
_
・
・
・
ー
ー
ー
ー
ー
ー
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変典型酵素 AQN(N68V)のまとめ
変典型酵素 AQN(N68V)は、野生型酵素と同じ P 2
・ P 3特異性を 示
し
瞥好性が高く、
た。しかし、野生型酵素に比べると、 S 2部位はより AlaI
S 3部位はより PheI
鳴好性が高くな った。反応性そのものは、野生型酵素
と同等であったことから、この Asn68 残基は活性中心とはほとんど相互作
用していないと推定される。この変異型酵素における変異の導入は、 S2
音1
¥
1
立の体積を変えていないと考えられるので、変異の導入による S2音¥
1
伎
の政水環境の変化が、特異性の変化をもたらしたとJffi定できる。
変 異 型 酵 素 AQN(GIOIA). AQN(GI01L)，AQN(G101V:SI02H)
1
. テトラペプチド基質に対する反応性
P 2 音)
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7に示した。
直は野生型酵素と同等かそれ以下の値をと って
この基質に対する K"1
おり、導入した変異はミカエリス複合体形成の妨げにな っていないことが
示 唆 さ れ た 。 変 異 導 入 に よ る 主 な 変 化 は k叫 値 の 低 下 で あ り 、
AQN(G101A，
G101V:SI02H)の 2酵素では約 1/ 3 6、AQN(GIOIL)では
約 1/2400倍の低下がみられた。
2_P2特 異 性 (1)
変異型酵素
AQN(GIOIA)の、 P 2 部 位 の 異 な る 4 種 の 基 質
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l
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i
gV8に示した。
変異型酵素 AQN(G101L)は、これらの基質に対する反応性が低く、い
ずれの反応速度定数も決定できなかったため、データには載せていない。
)は
、 S2 ・ S3部位の 2重変異型酵素であるた
また、 AQN(G101V:SI02H
h
e残基を有するこれらの基質に対する反応性が低くなっ
め
、 P3部位に P
ていて、 k同 値 と
K，，1
直が決定できず (
k叫/ K"1
直は求め られた) 、デー
タからはずした。 4稜の基質全体を通じて K"値は大かった。反応性の大き
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残基の反応性が大きく低下した 。
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X.
X.
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) を用いて測定した、反応速度定数を Table.Y.
7 に、反応速度
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の飽和曲線を Fig.Y.9に示した。
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pNAに 対 す る 反 応 性 は 、
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S102H)の 2酵素において変化はなく、野生型酵素とほぼ同じであ
y残基 はアミノ酸の主鎖と同じなので、これ らの変異 は基質のペプ
った。 Gl
チ ド 主 鎖 に 対 し て 影 響 を 及 ぼ し て い な い こ と が わ か っ た 。 一 方、
sucAlaAla.
PhepNA に対する反応性は、主に k叩値の低下を引き起こし、 A
AQN(GJ01A)では約 1/10、AQN(Gl01Y:Sl02H)では約 1/
30倍にな って お
り 、 導 入 し た 側 鎖 が 大 き い ほ ど k叫値 は 低 下 し た ( 変 異 型 酵 素
AQN(G101Y:S102H)は 2重変異型両手素で あるので、 P2特異性の対照とし
て AQN(S102H)を用いて問機の測定を行い、変異 S102Hがこの基質の反
応性をほとんど変化させていないことを確認した。従 って、これ らの基質
に対する反応速度定数の傾向は、変異~ G10lY によるものであると考えら
れる)。また 、AQN(G101L)では、両方の基質において反応性は大きく低下
f
l
i
J鎖が基質主鎖とも相 互作用してい
しており、この変異により導入された 1
たことを示唆した。
2つの変異 型酵素 AQN(G101A，G101Y:SI02H)において、 Gly残 基 l
噌
好性は上昇した。変異の導入による Gly残基￨噂好性の変化を、 k"
l/ K，，1
直
を用いて、 FigY-10に示した。
Table-V・7
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1
位の異なる 2種の基質 s
u
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X'
Ala'
Ala'
pNA(
X= Ala.P
h
e
)に対する
反応速度定数を Table'Y'
8に、反応速度の飽和 ￨曲線を F
ig'
Y'
l
lに示した。
瞥好型となり P3特異性は変化し
変典型酵素 AQN(GIOIA)では、 A
l
a1
噌好型で野生型酵素と同
た。変異型酵素 AQN(GIOlY:SI02H)では、 Pher
じであったが、反応性は野生型酵素に比べて低下した。変異型酵素
AQN(GIOIL)では、テトラペプチド基質の場合と同機に反応性の低下が大
きく、基質 s
l
l
c.
P
h
e
.
A
l
a
φ
A
l
a'
pNAでは基質の分解は検出されなか った
。
G
I
y山の残基置換のまとめ
これらのことから、 Gl
y山 に導入した側鎖は S2部位を組める方向に伸
び
、 P2側鎖と相互作用していたことが批定できる。 S
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is
i
nをモデルと
したシミュレーションによると、 Gl
y→ A
laの置換、および Gl
y→ Yalの置
I主
演を付 lばして空間を埋め、 P 2音1
1
位の Ala残基などのア
換は S3部位に似J
ミノ酸の側鎖、と重なる 。Gl
y→ Leuの置換では、 Leu側鎖は基質 主鎖とも重
なり、全ての基質に対する反応を阻害することを示した。
このシミュレーションの結果と測定の結果とはよく 一致しており、 Gly
残基から A
l
a
.Y
a
l残基への世換は、 S2部位の空間を狭くすることにより
G
l
y1
1
訓子性を上昇させた。 G
l
y→ L
e
l
l残基への置換は S2音I
1
位の空間を組め
て P2残基側鎖を排斥するだけでなく、基質主鎖の結合をも阻害すること
により、すべての基質の反応性を低下させた。
変典型酵素 AQN(GIOIA)では、似I
J鎖の導入により、 P 2特異性だけで
なく、 P3特異性までもが変化した。
Table-V・8
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S102H)
第 V章 の ま と め
S 2部 位 を 構 成 す る 残 基 の う ち の 2残 基 Asn68 と Gly山 は 残 基 置 換 に
より P 2特異性を改変することがわかった。
68
Asn 残恭は活性中心残基とは相互作用せず、
S2部 位 の 疎 水 環 境 に 影
響を与えていると推定された。この残基を伺L積が同じで、疎水性の Val残 基 に
置 換 し た 変 典 型 酵 素 AQN(N68V)では、
S2部 位 の Ala残 基 l
啓好性は更に
1
1
位の Phe残基 l
啓好性は更に高くなった。
高くなり、 S3音
G
l
y
l
O
l残 基 は 、 側 鎖 (
A
l
a，V
a
l
) を導入することにより P 2特 異J性 を 変 化
させ、 Ala残 基 H
普好性を低下させることにより、
S3部 位 の
Gly1
1き好性を
高く改変した。また 、変異型醇 素の lつ AQN(G101A)では、 P 2特 異 性 だ
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nCarlsbergと類似し
けでなく、 P 3特異性も変化し、類縁商事素の s
た P 2 ・ P 3特異性を示した。
1
1
位の構造
シミュレーションと測定値の 一致から、 aqualysin[の S 2音
は、仙の s
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n型酵素とほぼ同 一 であると推定できる。
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1976)J.BioJ.Chem.，251，
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1972)Biochemistry，1
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第 3部
タンパク質工学 一一 一 新 た な 試 み へ の 序 章
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n1の 立 体 構 造 は 活 性 中 心 及 び
第 l部 、 第 2部を通じて、 a
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n型酵素たちと極めてよく似て
基質結合部位において、類縁の sl
いることが迎解された。
そこで、類縁酵素の立制"fJli造を利用して、活性中心と基質結合部位に対
して、タンパク質工学を試みた。
第 VI章
メタル・スイッチの導入
アクアライシン Iは単量体酵素である。通常条件下において活性を可
逆的に制御する「リカ'ンド」や「エフエクター J等の制御l
因子は存在しな
い。前.~巨体からひとたび成熟体へ転じてしまえば、分解により桁ち果てて
ゆくその瞬間まで、ずっと「活性型 Jとして存在してゆく。
しかし、それではあまりに「芸 j がない。
そこで、この酵素に活性のオン・オフを切り替える「スイッチ j を導
入することを企画した。
モデリング
野生型酵素には「スイッチ」になるようなものは存在しない。
従っ
て、新たに導入する必要がある。モデルを単純化するため、導入する「ス
イッチ」として、以下に示す 3つを条件とした。
は用いない
1.化学修飾i
2
. 酵素はモノマーのままで機能する
3
. ありふれた試薬の投与により「スイッチ」のオン・オフが切り替
えられる
以上を満たす「スイッチJとして、金属イオンとキレーターの組合せを
利用することを考えた。すなわち、金属イオンを「リガンド Jとして作用
させ、それと配位結合するアミノ酸残基を酵素分子表面のいずれかの部位
に導入することにより、金属イオン結合時には活性の「オフ」、非結合 1寺
には「オン j となるように機能させるのである。金属イオンと配位結合し
i
s残基があるが、金属イオンとして Cuイオンを
やすいアミノ酸残基に H
i
s残基と Cu イオンとが適当な配置にあるならば、
選んだ場合、 2つの H
-H
i
s・
・
・ Cu・
.
.H
i
s一
の形で配位結合を形成することがj
切符できる 。 2つの H
is残基と配位結合
Hi
s残基のイミダゾール環よりもはるかに結
している Cuイオンは EDTA (
合定数が大きい金属キレーター)等の試薬の投与・によって容易に酵素表面
uの結合は"可逆的"であり、
からひき剥せるため、酵素分子にとって C
「
ス
イッチ」として t~能することカサ倒待できる。
動物由来のセリン・プロテアーゼである c
h
y
m
o
t
r
y
p
s
i
nを材料として、
金属イオ ンと H
is残 基 と の 配 位 結合 を利用した情性 の制 御 に 成 功 し た 笑 例
H
iga
k
ieta
l.1990)。 この例では、活性中心の His残基と ア
が lつある (
ミノ酸残基置換により導入した His残基とを利用して、 Cu イオンの投与に
より配位結合を形成させて、活性中心の His残 基 の 側 鎖 の 向 き を 変 え 、 活
性中心の
3残基の連携を破壊することによ って 活 性 を 消 失 さ せ る ( 消 失 し
た活性は金属キレーターの投与により回復する)。
この例か ら、 2つの His残基は適当な距離 ・角度に存在していれば、容
易に Cu等の金属イオンと配位結合を形成することが期待でき、
「スイ ッ
チ j として用いるのによい候補となる。
セリン・プロテアーゼのような球状分子では椛造変化を巻き込んでのス
イッチングを期待することは難しいため、この「メタル・スイッチ Jは 活
性中心か、恭質結合音1
1
1
立を標的とすることになる o S山 t
il
is
i
n型のセリン ・
フロテアーゼでは上述した trypsin型の酵素の場合とは異なり、活性中心の
His残 基 は 基 質 結 合 音1
1
位 の S 2音
1
1位 に 面 し て 存 在 し て い る た め 、
c hym otryp sin と同じ手法はとれなし、。そこで、本章では、~質が酵素分子
へ結合する段階での 制御を 考え、基質結合音1
1
1
立を楳的とした。
すなわち、基質結合音;
1
伎の淋の両官 i
l
Jに 2つの H
i
s残基を導入することに
より、 Cu イオンの j
界
再t
I.結合で I
A
I
l
?
1
する「扉 Jをつけるのである (Cu非
存在下では、
「扉Jは な く な り 、 基 質 は ク レ フ ト に 進 入 で き る た め 、 酵 素
活性は「オン j に な る ) 。 こ の よ う な H
is-Cu-H
i
sの 架 橋 が 形 成 さ れ る
条件として、 2つの H
is残 基 は と も に 溶 媒 側 に 露 出 し て い る こ と 、 お よ び
2つの His1
1
Uの 距 雌 が 1nm程 度 で あ る こ と が 望 ま し い 。 基 質 結 合 ク レ フ
トを形成する 2 つの ペ プチド鎖 (Se r l"~ Gly ベ Gly iOO~ Se r 山) おいて、それ
らの条件を満たす残基を類縁酵素の s
u
b
t
i
l
i
s
i
nC
a
r
lsber
gの 立 体構造 (PDB
I
Dコード:2SEC)をもとにして、コンピューター ・グラフイクスを用いて、
アミノ酸残基置換、及び、置換導入した側鎖の M Mや M Dによるシミ ュ レ
ーションをおこない、検索したところ、
S3部 位 を 梢 成 す る
Ser
山と
Gli"が適当な候補として見つかった。
FigYIlに「メタル・スイッチ Jの機能模式図を示す。 C uイオン存
在時には、 C uイオンは構の両側の His残基と配位結合して基質結合部位
の入口を閉じ、基質と酵素との結合を阻害する。 C uイオンの非存在時に
される。
は、この「扉」は聞き、基質は酵素と結合して、活性が発拘i
F
i
gYI2に s
u
b
t
i
l
i
s
i
nCarlsbergの立体構造をもとにして SerlO2とGly'
"
lと Glyl
(
s
u
b
t
i
l
i
s
i
nでは SerlO
2
'
) とを His残基に置換した￨時の構造を示す。
(図中の His残基側鎖の位置は、シミュレーションにより得た「可能性の
高い j 位置を表す。
シミュレーションによれば、導入された 2つの His残基側鎖はともに
浴媒側に露出していて、浴媒側からの C uイオンの接近が可能である 。ま
た
、 2つの His残基附の距離は 0.55 11m 程度であり、 C uイオンと配位結
合を形成することが十分期待できる。
b
し
ρv
叶
9u
‘
・
MIlli--
Hu
LU
e
d
Q区旦
，
S
u
b
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gs
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Fig-VI・
I
.Diagramofmetal-switch
Withm
e
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a
l
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g
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fEDTA，ch
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t
e
" opens，s
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1
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P2'
-P5;gr
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r
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d)bya
minoa
c
i
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巴p
l
a
cemen
t
Fi
g-VI
・2
.
材料と方法
変典型酵素の調製
A
q
u
a
l
y
s
i
n1の構成遺伝子を含むプラスミド pAQN より変異導入予
定断片を含む BamHI-XbaI断片をファージ D N A (M13mp19RFDNA) に
組 み 込 ん で 得 た U-ssDNA を鋳型として、
2つ の 変 異 導 入 プ ラ イ マ ー
(
T
a
b
l
eVIl参照)を用いて、 2重変異を導入した (
F
i
gVI
3
) 。変異導入
はすべて B
i
o
R
a
dのマニュアルに従って行った。 2つの変異はいずれも制
限酵素 Ncolの切断配列を導入するため、得られたファージ D NA の制限
僻素 NcoI切断片長により変異導入を確認し、 D N A シークエンシングによ
り更に変異導入を確認した。変異導入が維認されたファージ D N A より切
a
q
u
al
y
s
i
n1の Cーブ
り出した BamHI-Accl断片を発現ベ ク タ - pAQNム C (
ロ領域を欠く発現ベクター)に組み込み、変典型酵素のプラスミドを得た。
発現ベクター pAQNム C ではタンパクの発現量が少ないことが予想された
ので、吏に変奥型酵素の全配列を含む EcoRI-Hindlll断片を切り出して、高
発 現 ベ ク タ -pEXP8に組み込み、この変異型酵素の発現ベクターとした。
E
c
o
l
iMV1184) を宿主として、アンピ
タンパク質の発現は、大腸菌 (
シリン存在下 (100μ g/ml
) において LB
培地 (
Y
e
a
s
tE
x
t
r
a
c
t0_
5%，B
a
c
t
o
t
r
y
p
t
o
n
cl
.O，
%N
a
C
I0
.
5，
%G
l
u
c
o
s
e0
.
2%)を用い、 37'Cでーl
免府主主して
行わせた。
菌体からの精製は、菌体の熱処理浴液 (EPPS50mM，C
a
C
l，
10mM，
NaCI 1，
% pH8
.
5
) への懸i
街、超音波破砕、 7 0'c処迎(約 501
時I
I
J)、
Table-VI・
1
.O
l
i
g
o
n
u
c
l
e
o
t
i
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i
cp
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r
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Ml
It
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n
Res.
en
z
.
S102H
GI31H
NcoI
Ncol
O
l
i
g
o
n
l
l
c
l
e
o
t
i
d
e5閃 u
e
n
c
e
s
CTG GAC 叩 C AAC GGc 8
旦 GGC TCC ACC TCT GGG
AAC ATG AGC TTA GG
♀ ♀A
TGGA GTC TCC ACT GCC
N-pro
Xbal_'
n
s
・
l
、
-
“
n
Hu
ρ
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l
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b
L
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V
l
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Pρ
V
L
A
u
e
t
pd
l
i
t
t
'
v
N-pro
Ac
c
I
pAQNL
lCMsp1
(Acceptor)
mutated
M13pAQN
BamHI-Acc
Id
i
g
es
t
i
o
n
N-pro
L
i
g
a
t
i
o
n
Ks
pl
Ac
c
l
Fig-VI・3.
St
r
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g
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rc
o
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s
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o
fm
u
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n1
pAQNd
.C
Np
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pEXP8d
.
C
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.
F
i
g
-VI・3
B
u
t
y
l
t
o
y
o
p
e
a
r
l
6
5
0カラム・クロマトグラフイー(リン酸緩衝液 201
1
1
M、
吸着させたのち、低濃度硫安で段階的に浴
硫 安 25%でタンパクをカラムに l
出させた)、 1
1
1
0
n
oSカ ラム・クロマトグラフィー(リン酸緩衝液 10mM、
Na
C
Iで塩濃度勾配をかけて溶出させた)、の 1
)
員で行 った(第 I
V章 参 照)。
テトラペプチド基質の反応性
調製した変異型酵素の活性をみるため、標準基質としてテトラペ プ
u
c
A
l
a
Al
aProPh
epNA (
S
i
g
m
aChe
m
i
c
alC
o
.
.より購入)を用い
チド基質 s
て 反 応 速 度 定 数 を 求 め 、 野 生 型 醇 素 と 比 較 し た (40'
C
， pH7
.
5，HEPES100
1
1
1
M，CaCI
，1mM、第 I章参照)。
「
メ タル・ ス イ ッチ Jの 測 定
1. 2伽 金属イオンによる阻害の 測定
変 典 型 醇 素 の 活 性 が 、 ど の 金 属 に よ り 阻 害 さ れ る か を 5種 の 金 属
CuSO" ZnCI
，
.Ni
CI
，
.CaCI
"MgCI
，を添加￨して刑べた。また、金属による活性
阻害 が 導 入 さ れ た 変 興 に よ る も の で あ る こ と を 検 証 す る た め 、 野 生 型 酵 素
に 対 し で も 同 線 の 測 定 を 行 い 比 較 し た 。 活 性 測 定 は 、 酵 素 溶 液(
4
0
μ1
)
と金
l1
)
とを混合して室温で 15分 I
l
Jお い た 後 、 基 質 溶 液 (200μ 1:
属 溶 液 (40J
s
u
c
A
l
a
Al
a-Pro'Phe-pNA.HEPES100mM.CaCI
，
1mM) を
力1
I
えて、 40'
C
において基質分解活性を追跡した。
2. 金属イオン / E D T Aによる活性制御の測定 (1)
変異型酵素の活性に対して阻害作用を示す 3磁の 2価金属 CuSO;.
ZnCI
・， NiCI，を用いて、活性制御の切り替えを調べた。
測定は、醇素溶液
(
100μ1) と金属浴液 (
100μ1:5mM) とを混合して室温で 1 5分間お
:
l00mM) を
、
いた後、 80μlずつ分取して、 一方には EDTA浴液 (20μ l
i
l
iQ 水 (20μ1) を加えて史に 15分間室 j
晶に置いた後、それぞ
他方には m
れ基質浴液 (200μ1) を加えて、 40'Cにおいて基質 分解活性を追跡した 。
コントロールとして、金属の代わりに m
i
l
i
Q水を用いて問機に測定した。
3
. 金属イオン / E D T Aによる活性市J
I
御の測定 (2)
般を形成しにくく、変異型酵素に対して大きな
HEPES緩衝液と沈 j
40
阻害作用を示す Zn を刷いて、経￨時的に鮮 素活性の 切り 替え を訓 べた (
℃
、 pH7
_
5、 HEPES50m
t
v
[
.CaCI，0
.
5m M)。測定は 、基質溶液 (200μ りに
酵素溶液 (20μ1)を加えて反応を開始させた後、 ZnCI，(5mM.20μ1) を添
加lし、あ る時間をおいた後、 EDTA(10mM.20μ1)、ZnCI
，
(
5mM.60μ1)、
EDTA(
lOm M.60μ 1
)を順に添加 し、基質 suc-Al
aAl
aPro・
PhepNAの分解
活性を追跡した。
2価 金 属 の 阻 害 活 性 の 測 定
1
. 阻害様式の検証
モデル上では、金属結合部位(導入した 2つの His残基)は基質結
合部位に位置しており、金属イオンは基質と基質結合部位をめぐ っ て競争
的に作用するはずである。そこで、阻害定数の大きさ、および、阻害様式
Ic
AlaAl
a'
Pr
o'
Phe-pNA を用いて、 Cl
ISO
，の共存
を検証するため、基質 sl
(
0
.
2mM)・非共存下において反応速度定数を求めた (40'
C
， pH7.5，HEPES
CaCI2 20μM)o
2m M，
(Cuイオンは Goodb
l
l
f
f
e
r と沈 j
殿をつくり易いた
め
、 HEPES緩衝液の濃度は低く設定しである)。
2
. 阻害定数の測定
金属による活性阻害は基質に対して競争的であると推定される。し
かも、酵素・金属の結合は基質の場合に比べて強いことが上述の i
J
!tl定から
推定される。そこで、 SS1と同機の測定方法を用いて (
第J
[
[掌参照)、
Cl
ISO
.
，
と ZnCI，
の阻害定数を測定した。社!IJ定は、 一定濃度の酵素溶液 (40μ1)
と濃度の異なる金属溶液 (40μ1) とを混合して 40'
C
で 15分間置いた後、
基質溶液 (200μl:sl
Ic
'AlaAlaProPhe'pNA，HEPES100 m M，
CaCI，1m M，
pH7
.
5a
t40'C)を加えて、その残存活性を 4 0'Cで測定し阻筈定数を求め
た
。
P3特異性の測定
きである(第 I
V章参照) 。
変異を導入した 2つの残基は S3部位の残 1
従 って、変異は P3特異性に影響を及ぼしている可能性がある。そこで、
P3部位の異なる 2種のトリペプチド基質 s
u
c
P
h
eAlaAlapNA (波相法
で合成したもの。第[[章参照)、 suc-Ala-Ala-Ala-pNA (SigmaChemical
C
O
.，より購入)を用いて反応速度定数を 40'
C
、 pH7
.
5 (HEPES100mM
CaCl，
lmM) にて測定し、 P3特異性を調べた。
粘土巣と考察
テトラペプチド基質の反応性
テトラペプチド基質
SUC'A
la'
Ala'
Pro'
Phe'
pNA
に対する反応速度定
数を Tabl
e.
VI.2 に示した (40'
C
， pH7.5，HEPES100m M，
CaCI2 1mM) 。
この変奥型~~素の反応速度定数は、野生型酵素とほぼ同じであり k 叫
及 び K"値の差は小さかった。この変奥導入が活性に与える影響は大きくな
いことカfわかった。
Table-VI・2
.K
i
n
e
t
i
cp
a
r
a
m
e
t
e
r
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o
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h
eh
y
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l
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l
cAla-AlaProPhe-pNA
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'l
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[
s
KM
[mM]
kcat/KM
]
[
s
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1Jl制ー 1
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3
1
.
2
2
8
2
5
1
.5
1
6
o
Assayswerep
e
r
f
O
J
l
1
1e
da
t40C，pH7
.
5(HEPES1
0
0m M，CaCI2Im恥1
)
「メタル・スイッチ Jの測定
1
. 2価金属イオンによる阻害の測定
5種の 2価金属 CuSO，
.Z
nCI
，
.N
i
Cl
，
・C
aCI
，
.MgCl
，の 阻害効巣 を野生型 酵
素と比較し T
a
b
l
e
-YI
3に示した。
変異型酵素の活性は、 3種の金属 C
u
.Z
n
.N
iの添加により低下した 。活
性の低下は C
u
.Z
nにおいて大きく(金属 2
.
5mM存在下で、 Cuでは 1
6%、
Z
nでは 10%に低下した)、 N
iではあまり低下しなか った (
4
51
1
1
Mで 50%
の低下)。野生型酵素の活性は、これらの金属の添加 l
によりやや低下した
ものの、その低下は 小 さく、変典型酵素における活性の低下は導入した変
異によるものであることが雌認された。
a
.Mgおよび EDTAによる活性の低下はほとんどなく、導入し
また、 C
I
位は Cu
.
Z
n等の金属と静電的結合ではなく配位結合で結合し
た金属結合音1
ていることを示唆した。
2
. 金属イオン /EDTAによる活性制御の測定 (1)
u
.Z
n.NiをJijいて、
変異型酵素に対して阻害活性を示した 3種の金属 C
金 属 キ レ ー タ 一 試 薬 EDTAの 添 加 に よ る 活 性 回 復 刻J巣 を 調 べ た
(
Tabl
e
.
Y
I
4
)。
金属 (
2.
5mM) の添加 により活性が低下した酵素に、 EDTA (
2
0mM)
を添加すると、活性は完全に回復した。
1
I
tって、金属による活七1
:1
¥
1
1筈効果は"可逆的"であり、活性回復はほぼ完
全で あ ったことから、導入した変異は「スイッチ Jとして機能することが
わか った。
Table-VI・3
.I
n
h
i
b
i
l
iona
C
l
i
v
i
l
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0
.
2
5
2
.
5
25
ZnCI2
NiCI2
CaCI2
MgCI2
EDTA
0
.
2
5
2
.
5
2
.
5
R
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0
0
28
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1
6
0
.
3
8
74
55
9
.
7
88
9
1
59
9
7
1
5
45
450
63
69
50
100
1
0
85
50
8
3
1
0
1
0
9
92
50
11
7
1
0
3
1
0
50
1
0
9
1
0
4
1
1
3
Table-VI・4
.I
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5
2.
5
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4
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1
0
5
20
20
7
.
8
1
1
2
1
3
.
2
1
3
2
42
3・金属 イ オ ン / EDTAによ る活性制御の測定 (2)
による変典型酵素活性の経 l
時変化を F
ig
-Vr4に
Zn及 び EDTAの添加l
不した o Zn添加による酵素活性の低下と
EDTA添加によ る活性の回復
濃度
が、繰り返し行われた。試薬の投与により反応溶液中の醇素 及び基質 l
は低下するため、 EDTA添加後のみかけの酵素活性は低下したが、濃度
を補正すると酵素活性はほぼ完全に回復していた。
0
.
8
0
.
6
A410
0
.
4
0
.
2
。
。。
200
400
600
t
i
m
e[
s
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c
]
Fig-VI・4
.M
e
t
a
lsw
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c
h
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c
t
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v
i
t
ywasc
h
a
s
e
da
tA410，a
t40oC，pH7
.
5(HEPES50m M，CaC120
.
5mM)
u
-a
t
巴s
o
l
u
t
i
o
n
a
f
t
e
rm
i
x
a
t
i
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no
f20μ1o
fenzymes
o
l
u
t
i
o
nand200μ1o
fs
u
bs
(
s
l
l
c
A
l
aAlaPro-Phe-pNA)，anda
d
d
i
t
i
o
no
fZnC12(
5m M，20μ1)，EDTA(
10m M，
20μ1，
)
ZnC12(
5m M，60μ1)，andEDTA(
10m M，
60μ
1)weref
o
l
l
o
w
e
d
2価 金 属 の 阻害 活性の測定
1
. 阻害様式の検証
変異導入部位は基質結合部位で、あるため、金属による活性阻害は基質に
対して競争的であるはずである。そこで、 2側金属の lつ Cu(CuSO，)を用
0mMまたは 0
.
2mM)
いて、競争阻害型の測定を行 った。あらかじめ金属 (
を混合して置いた基質を用いて、基質 s
u
cA
l
a
-AlaProPhe
-pNAの反応速度
定数を求めた (40'
C
， pH7
.
5，
HEPES2mM，
CaCl
，20J
lM
)。野生型酵素にお
いても同様の測定を行い、得られた反応速度定数を TableVI
5に示した。
野生型酵素においては Cuの存在 ・非存在に関係なく、反応速度定数は
同じ値を示した。変異型酵素においては、 Cuの存在により V 値の低下が
1Uax
起きたが、 K"値はほぼ同じであ った。見かけ上は非競争阻害であるが、金
属イオンによる阻害は基質結合部位をめぐ って基質に対して競争的に作用
すると考えられるため、 Cuによる活性阻害は SSIと同様に酵素に対して
見かけ上「不可逆的
」 に作用することがわか った
。
2.阻害定数の捌J
I定
Cuによる活性阻害効果は見かけ上、
「不可逆的」競争阻害 であった。
そこでタンパク性プロテアーゼ ・インヒピター SSIと同じ 測定方法を用
いて、 2磁の 2仙金属 Cu，Znの阻害定数を求めた(第 1
I
I掌参照)。
-Al
a
'Al
aP
r
o
-PhepNA を用 い (Tabl
e
V
I
2参 '
)
罰)、 40'
C
， pH
基質 suc
bl
e
-VI
・
6に示した。 また、 Znを用いた;
場
7
.
5 にて求めた阻害定数の値を Ta
合の阻害 1
1
]
線を F
i
gVI
5に示した。
Zn，Cuの阻害定数は 100μM程度で、
程度の結合の強さを示した 。
ト
リ ペプチ ド基質の K"値と同
Table-VI・S
.K
i
n
e
t
i
cp
a
r
al11e
t
e
r
sf
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rt
h
eh
y
d
r
o
l
y
s
i
so
fs
l
Ic
AlaAla
-P
r
oPhe-pNA
l
1
1
l
1t
a
n
ta
q
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a
l
ys
i
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t
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u
tCl
IS04
・
byw
i
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IS0
Cl
4
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。
0.
2
k
c
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KM
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l
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p
e
kcat/KM
[
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c"j [
1
1
1
M
] Isec"M"J
3
.
5
2 0
.
3
1
4
1
.
12x1
0
1
.05 0.22 4.83xl03
k
c
a
t KM
kcat/KM
[
s
e
c
'
j[
1
1
1
M
]l
s
e
c
'
M'
j
4
1
5.
8 0.
41 3
.
8
5 x1
0
1
5
.
3 0.40 3.
85 xl04
Assayswerep
e
r
f
o
rl11eda
t40oC，pH7
.
5(HEPES21
1
1
M，CaC1 20μM)
2
→
1
1.
0
〉、
1.
¥
0.8
・
】
1
1
1
〉
M
g 0.6
、
、
司
コ
て2
i
3 0.4
.~"、
a
:
・
、
・
・
.
e
0.
2
.
川・
・
・
・・ .
'
川
町
.
.
.
.
.
.・
"
。
。
0.
0
0.5
1.
0
1
.
5
2.
0
2.
5
c
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n
c
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n[mMJ
3.
0
ZnC~
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Fig-VI・S
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a
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m
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s
.
Table-VI・
6
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n
h
i
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nc
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to
fd
i
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i
o
n(Cu，Zn)towa
r
dl11u
t
a
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taqual
ys
i
n1
M巴凶
KiIM]
4
1
.1x1
05
9
.
5 x1
0-
ZnCI2
CUS04
P
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i
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a
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swerep
e
l
f
O
J
l
1
1e
da
t40oC，pH7
.
5(HEPES1
0
01
1
1
M，CaCI21mM)
(
s
u
b
s
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e:s
l
l
cAlaAlaP
r
o
P
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epNA)
Table-VI・7
.K
i
n
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i
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al11e
t
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cX-AlaAlapNA(X=Ala，Ph
巴
)
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KM
Ph巴
KM
k
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] ImM] [
s
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c1mM1
1
w
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l
H
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1
.2
1
.
1
0.43 4
.
7
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0
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0
1
k
c
a
t KM
KM
k
c
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1
I
s
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c1
J[
I
1
1Mllsec-1
m Ml
1
1
0.
044 250
3
.
0 0.089 33
.
5(HEPES1
0
01
1
1
M，CaCI21mM)
Assayswerep
er
f
O
l
l
l
l
e
da
t40oC，pH7
P3特異性の測定
P3音¥
1
位の異なる 2種の基質 s
u
cX-AlaAlapNA(
X= A
l
a
.P
h
e
)に対す
e
-VI
7に示した。
る反応速度定数を Tabl
この変典型酵素の
S3部位は
PheI
噌好型であり、野生型酵素と同じ性質
を示した。変異の導入による P3特異性への影響は小さかった。
HIS 残基を利用した活性制御の他の実例
Trypsin型酵素の chymotrypsinにおいて活性中心の H
i
s残基を利
H
i
g
a
k
ieta
J
. 1990) 。この例
用した活性の制御が、 lつ実例としてある (
本構造を用い
では、類縁酵素の 一次配列の相向性と chymotrypsin自身の立 f
f
l
J
J
御機構は、活性中心の近傍に導入された l
てモデリングしている。活性f
つの H
i
s残基と、活性中心の H
i
s残基とを Cuイオンにより配位結合させ
i
s残基の側鎖の向きを変更させ、触媒能の低
ることにより、活性中心の H
i
s残基を導入した部伎は、立 f
ヰオ北造でのモデリ
下をもたらすことによる。 H
ングにより選定しているが、結果的には、類縁の金属結合タンパクにおけ
る「金属結合モチーフ」と閉じ 一次 檎 を と っ て い た 。 こ の 変 異 型
chymotrypsinでも、 Cu，Zn，N
i等の金属による活性の低下、 E D T Aによ
る活性の回復がみられ、金属の結合は Cu，Zn，Ni の J~買に大きい。
まとめ
基質結合部位に導入した 2つの His残基は、金属結合部位として機能し
i
t
金属と結合した。金属との結合により活性は不可逆的
て Cuや Z日等の 2侃
に阻害されたが、金属キレーター試薬 EDTAの添加によりその活性は回
復した。
このような「メタル・スイッチ Jを aqualysin1に導入することに成功
した。この「メタル・スイッチ」の特徴は、純粋に立体構造をもとにモデ
リングすることにより、もともとそのような機能のない部位へ新しい機能
を導入したことであり、類縁酵素においても、そのような金属結合部位は
存在していなかった。
b
t
i
l
i
s
i
n型のセ
今回の標的は基質結合音1位に限定したが、その理由は su
リン・プロテアーゼでは、活性中心付近に「金属結合モチーフ j がなく、
しかも、活性中心の His残基の近傍において、もう lつの His残基を導入
する適当な部位が見いだせなかったという消極的理由による。それ以上に
極的な理由は、
より積J
「可能性への挑戦」である。
第V
II掌
ss結合の欠失
と
Aqualysin 1の活性型自己分解産物 AQN#
背景
Aqualysin 1は 分 子 内 に 2対 の
ss結 合 を 有 す る
(
Cy
7
_Cy
9，
s6
s9
sl
Cy
6
3
・
Cys山間に形成されている ;KwonetaJ
.1988)。一次構造の保定して
u
b
t
il
is
i
n型酵素のうちで分子内に
いる s
s
s結合を有するのは aqualysin1
とp
r
o
t
e
i
n
a
s
eK のみである (
p
r
o
t
e
in
a
s
eKでは Cy
4_
Cys123，Cys川 一Cy
4
9
)
。
s3
s2
これら 2つの酵素は異なる位置に
s
s結合を有する。
P
r
o
t
e
i
n
a
s
eK はやや
N，C末端よりであり、(推定される)aqualysin1の位置は基 質結合部位
(
S
1、S2音1
1
位)近傍である (
F
i
gY
I
I1
)。
分子内に形成された
s
s結合はタンパク質分子を安定化させることが知
M
a
t
sumuraeta
J
. 1989)。一次構造の比較からわかる s
u
t
ヲt
i
l
i
s
i
n
られている (
型酵素における a
qu
a
l
ysi
n1の特徴は
s
s
結合の存在である。既に第 I
章で
ub
t
i
l
is
in型酵素との比較において aqual
ysi
n1は高い熱安定性
みたように、 s
を有し、加えて、
s
s結合を有するもう
lつの酵素 p
r
o
t
e
i
n
a
s
eK とともに
i
n1におけ
高い温酸グアニジン 耐性を 示した。 これらから考えて 、 aqualys
s
s
結合の安定化への寄与は、熱力学的な研究のよい対象となりうる。
t
i
l
i
s
i
nにおいては、分子内に s
s結合を導入することによ
類縁酵素の sub
る
り 、 酵 素 の 安 定 化 を 向 上 さ せ る 試 み が な さ れ て い る (Mitchinson etaJ
1989，WellsetaJ.1986，Katzeta
J
.1
986，Pantol
i
a
noetaJ
.1987) 。
また、 p
r
o
t
e
i
n
a
s
eK と比較して a
q
u
a
l
y
s
i
n1におけ る
ss
結合は、
2対
1
位の近傍に位世しているため、
の結合がそれぞれサブサイト S1、 S2音1
S
基質との相互作用 に対して影響を及ぼしている可能性がある。つまり、 S結合により桃造のゆらぎが抑えられ、酵素 ・i!.T質結合 l
時における誘導迎合
(
i
n
d
uc
e
df
i
t
)が起きにくくなる可能性である。
F
i
g
.V
I
I
.l
.Dis
u
l
f
i
d
ebondso
fp
r
o
t
e
i
n
a
s
巴 K(
y
e
l
l
o
w)
，a
n
ddeducedpos
i
t
i
o
nf
o
ra
q
u
a
l
y
s
i
n[(
1巴d)
以上の 2つの動機から、 aqualysin1において、 2対ある
ss結合をそ
れぞれ l対ずつ、または 2対とも欠失した変異型酵素を調製し、安定性と
構造のゆらぎの解析に用いることを試みた。
ー
ー
ー
ー
ー
ー
主
主
変異型酵素 AQNム SSの調製
分子内にある 4 つの Cys残基を、 S'S結合を形成する 2残基ごとの組合
せでそれぞれ別のアミノ酸に置換した(2重変異が 2っと 4重変興が iつ)
計 3種の変異型酵素を調製した。表記を簡単にするため、次のように変異
型酵素の名称を定めた。
名称
変異
AQNム SS'l
CYS67 → Asn， CYS99 → Ala
AQNム SS.2
C
y
s
l
6
3→ Ser， CyS山 → Gll
1
AQNム SS'1，2
Cys6
7 → Asn， Cys99 → Al
a
CYSI臼 → S
e
r
. Cysl
9<→ G
ll
1
これら 3磁の変異型酵素の発現ベクター (pAQN)の調製、 DNA配列上
における変異導入の確認、及び、大腸菌 (E.coJ
iMV1l8
4
)におけるタンパ
クの発現は寺田氏(日本タバコ)の協力を得て行われた後の培養菌体を出発
点として、変異型酵素の精製をおこなった。
i浴液 (Tris.HCI 50 m M，CaCI2 10 111M，pH
精製は、まず、歯科三を熱処m
9.
0)に!懸濁して超音波破砕した後、 70'
C
で 3時間保温して酵素の成熟化を
おこなわせた。
l
溶液を遠心により不浴画分を除去した後、限外
この熱処理i
i
1
M
.i
品(PCcasettesystem，200 kDaJ
r
Jmembrane使用)で大腸菌の朕画分等
，
の巨大分子を取り除いて、更に、再び ￨
浪外減過 (5 kDa用 membrane使用)
侃塩・濃縮をした。この浴液を泌過 (0.22μmmiliporef
i
l
t
e
r
) した後、リ
でj
ン酸緩衝液 (Naphosphate 10m M，
CaCI21 m M，pH 6
.
0
)で平衡化しておいた
S.SepharoseHP カラム (FPLCs
y
s
t
e
m
.P
h
a
r
0
1
a
c
i
a
) に吸着させ、 NaClで血濃
度勾配をかけて浴出させた。得られた活性画分を、 mono.Sカラム (FPLC
s
y
s
t
e
0
1
.Pharmacia) に吸着・溶出させ、更に、高純度化・濃縮を行い、精製
標品とした。
活性型自己分解産物 AQN#の検出
こうして得た 3種の
s
s結合欠失型酵素において、
4 0'
C
、 pH7.5 にお
いて基質 suc.AlaφAla.
Pro.Phe.pNA を用いて活性測定をしたところ(第 I
I掌
参照)、 3種全ての変典型酵素において、測定中に酵素活性の急激な低下が
観測された。そこで、残りの精製襟品を SDS.PAGEで再び泳動して純度を
硲認したところ、本来の 28kDaのバ ンドの他に 22kDa付近にもバンドが
出現しているのが伴認された。この 22kDaをバンドを有するタンパクの由
来を調べるため、酵素楳品に対し、 一部を DFP処理して失活させ、 一部は
活性のあるまま再びO1onoS カラムを用いて吸着・浴出させたところ、 28
kDa よりも高庖濃度側において浴出してくる、タンパク分解活性をもっタ
ンパクが、この 22kDaのバンドに対応することがわか った。また、この
22 kDaの位置にバ ンドを有する タンパクは、 28kDaの aqu
a
l
y
s
i
n1由来で
あり、 28kDa→ 22 kDaへと 一方向的・不可逆的に移行した。 28kDa→ 22
kDaの移行は、 aqual
y
s
i
n1の活性に依存していて、 DFP投与により 28
kDaを失活させることにより移行はな くなった。また 、移行の速さは、リ
0mM.CaCl，
1mM.pH6
.
0
)中、室温において、
ン酸緩衝液 (Naphosphate1
酵素濃度が数 μ Mの条件において、 1I
時間で約半分が 22kDaに移行した。
この 22kDaにバンドを有する aqualysi口 Iの自己分解産物は、 3砲の変
異型酵素に共通して安定であり、それ以上の自己分解は認められなか った
ため、 monoS カラムを用いて精製し、その性質を剰べた。
活性型自己分解産物 AQN'の性質
Aqualysin1の自己分解産物 AQN# にはタンパク分解活性があり、 DFP
により失活するセリン酔素であ った。 そこで、変典型酵素の lつ AQNム
S
S
l の 自 己 分 解 産 物 AQN'ム S
S
lを 用 い て 、 テ ト ラ ペ プ チ ド 基 質
s
u
c
-AlaAlaProPhepNA に対する反応速度定数と、!野生型 S
S
Iの阻害定数
を測定した(第1I、[[[~参照)。
求めた反応速度定数を、野生型 aqualysin1と比較して以下 に示した。
S
S
I
酵素
互」
suc-Al
aAlaProPhepNA
kt
白
KM k / K
M
同
I
x10'OMI I
s
e
c'
] ImMI I
sec"mM'1
野生型 aqual
y
s
i
n1
l
AQN'ム SS-
3
.
0
7.9
33
3
.
7
1
.2
2
_
3
28
1
.6
テトラペプチド基質の反応速度定数を 比較す ると、 AQN#ム S
S
lの活性
は野生型に比べて低いなが らも (k倒値で 1110)保持されていた 。 また、ミ
カエリス定数や SS 1の阻害定数を比べると、野生型酵素とほとんど差は
'
l心 は ほ ぼ
なく、 この自己分解産物において基質結合部位、および、活性 ι
完全に保持されていることが推定された。
現段階では、この自己分解がどの部位で起きているかは不明であり、活
s
s結合欠失により自己分解が加速したのかを考え
る具体的な根拠 はない。しかし 、a
qua
l
y
si
n1において、 s
s結合が安定性
性低下の原因や、なぜ
に寄与しているのは確かなようである。
第V
I
I
I章
活性中心の改変
背景と目的
sub
t
i
l
i
s
i
n型
、
および t
r
y
p
s
in型のセリン・プロテアーゼは、
i
charger
e
l
a
ysystemJ 、最近では
古くは
r
c
a
t
a
l
y
t
i
ct
r
i
a
d
J と呼ばれる 3つのアミ
ノ酸残基 (Ser，His，Asp)から構成される触媒中心により活性を発揮してい
る。ペプチドの加水分解過程において直接アシル化される Ser残基だけでな
く
、 His残基や Asp残基も大きな役割を果たしている。
s
u
b
t
i
l
i
s
i
n型のプロテアーゼでは、活性中心残基のうちの 2残 基 Hisと
Asp残基は、基質結合部位の S2音1位に面していて、これらの残基が基質特
異性に影響を与えている可能性がある。
s
u
b
t
i
l
i
s
i
nBPN'を用いた実験報告では、活性中心の His残基を Ala
残基に
世換し、基質の His残基 (P2部位に位置する)を利用して、再びセリン・プ
ロテアーゼの活性を回復させることに成功しているが (Cartereta
l
.1987，
1991)、この実験結果は、基質のア ミノ酸残基を 利用した活性l
r
'
心の再構
成が可能であることの他に、活性中心の His残基が P2特異性に関与でき
る位置に存在していることを示唆している。
トリペプチド基質を用いた基質特異性の解析(第Il章参!!現)によると、
aqualysin1を含めて s
u
b
t
i
l
i
s
i
n型酵素は、大きな側鎖を有するア ミノ 酸残基
を好まないという P2特異性を示していたが、このことは S2部位の「ポ
ケット Jの杢聞の体積と対応していると考えられる。
そこで、 S2部位の空間l
を拡大し、 P2特異性を改変することを目標に
そえて、活性中心、を構成する His残基を S2部位から取り除き、他の音 1
1
1
立に
新しく活性中心を組むことを企画した。
モデリング
類縁酵素 s
u
b
t
i
l
i
s
i
nCarl
sbergおよび pr
o
t
e
i
n
a
s
eK の立{糾持造をモデルと
して用いて、活性中心の Ser残基に隣接する残基すべてに対してアミノ酸
残基置換のシミュレーションをおこない、既存の Ser残基と共に新しい活
性中心を構成する候補残基を選定した。モデルとして 2つの s
u
b
t
i
l
i
s
i
n型 酵
素を用いたが、 s
u
b
t
i
l
i
s
i
nCarlsbergとp
r
o
t
e
i
n
a
s
eK とでは、活性中心近傍の
残基の立体配置が異なっていたため、それぞれの酵素において適当と思わ
y
s
i
n1において対応する残基を置換した 。
れる残基の組合せを選び、 aqual
選定したアミノ酸残基盤換の候補を次に示した。
候補
置換
候補一 l
s
Ala'
，→ H
i
s， Ser128 → Asp
候補 - 2
s
Ser128 → H
i
s， Ala'
，→ Asp
候補一 3
128
74
Ser → H
i
s， Val → Asp
この残基置換の候補 に対して、それぞ、れ活性 l
十1心の His残基を Al
a残 基
に置換する変異を更に加えた計 6種の変典型酵素を調製することにした。
6種の変異型酵素の略号を次のように定めた。
略号
変異
AQN_cat'
l
(候補一 1)と同じ
AQN_cat'
2
(候補一 1) 十
AQN_cat'
3
(
候補 一 2)と ￨
司じ
AQN_
c
a
t
'
4
(候補一 2)
AQN_c
a
t
5
(
1
長補 - 3) と同じ
AQN_cat
6
(
候補
3)
十
+
(
H
i
s70→ Al
a
)
(
H
i
s70→ Ala)
(
H
is70→ Ala)
変異型酵素の調製
1.変異の導入と発現ベクターの調製(手順を F
i
g
-V
I
I
I1に示した)
A
q
u
a
l
y
s
i
n[の全構成遺伝 子を含むプラスミド pAQN より変異導入の対
象となる部分を含む BamHIXbaI断片を、ファージ D N A(M13 mp19RF
DNA)に組み込んで得た UssDNAを調製して鋳型とし、 T
a
b
l
eV
I
I
I1に示
i
oRadのマニ ュア
す変異導入プライマーを用いて変異を導入した(方法は B
ルにしたがった)。変異導入の有無は DNA シークエンシングにより直接権
認した。変異導入が維認されたファージ DNAより切り出した
BamHIXbaI断片を、ベクター pAQNム C (pAQNより a
q
u
a
l
y
s
i
n1の前駆休
の Cープロ領域を欠失させたもの)に組み込んで=、発現ベクターを待た。
6程の変異型酵素のうち、最終的に 4程の変異型酵素 (AQN_cat-，
l 2，4，
5
)の発現ベクターを得、タンパク質の発現に用いた。
2. 変異型酵素の生産・発現
大腸菌 (E.coJiMVl184) を宿 主として 、全ての発現ベクターを形質転
換した。 ì~ï は 37'(; 、アンピシリン存在下 (100μ g/ ml) において LB
(
B
a
c
t
otrypωnel
.0，
%Y
e
a
s
te
x
tr
a
c
t0
.
5，
%N
a
C
I0
.
5，
%G
l
u
co
s
e0
.
2%)培地
で培養し、菌体・培地の吸光度 A660が 0
.
9に達したのち、
IPTG を最
7mMになるように加えてタンパク質合成を誘導後、 3
1
1
寺間培養
終濃度 0.
してから遠心 (
5kr
p
m
.10m
i
n
)により集菌した 。
Table-V
I
I
I
-l
.O
l
i
g
o
n
u
l
e
o
t
i
d
es
e
q
l
l
e
nc
e
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fm
l
l
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a
g
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n
i
cp
l川 田 r
s
m
u
t
a
t
i
o
n
Res
.
enz
.
H70A
V74D
Sl28H
Sl28D
Al54H
Al54D
O
l
i
g
o
n
l
l
c
l巴o
t
i
des
e
q
u
e
n
c
e
s
GAC TGC AAC GGC GCT GGT ACC CAT GTG GCG
CAC GGG ACC CAT GAC GCG GGA ACG ATC
GTT GCC AAC ATG CAC TTA GGA GGC GGA
GTT GCC AAC ATG GAC TTA GGA GGC GGA
5phl
GTC TAC GCT GTG CAT GCG GGG AAC GAC
5
a
/
[
GTC TAC GCT GTC GAT GCG GGG AAC GAC
Xba!__'
3
0
l
し
w
し
、
pu
pv
ob
ρ
n
uu
t
u
A
u
m
r
e
t
pu
レ
JU
ν
ρ且
.
l
p
a
ρ
l
・
1111117
N
p
r
o
Xba!__'
m
u
t
a
t
e
dpAQNd
.C
.S
t
r
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t
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g
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l
F
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g
-V
I
I
I
-l
o
fm
u
t
a
n
ta
q
u
al
y
s
i
n1
.
3
. 変異型酵素の精製
l，
10 m M，Na
C
I1%
，
得 られた培養菌体を熱処王
日浴液 (EPPS50 m M，CaC
pH8.
5) に懸渇して超音波破砕したのち、
70'Cで熱処理 (100時間)をし
た。
粗活性の測定
-Al
aAl
aPro'
Phe'
pNA(HEPES J00 m M，
CaC
I
テトラ ペ プチド基質 suc
2
11
1
1
M，pH7
.
5a
t40'C)を用いて、熱処理溶液のプロテアーゼ情性を測定し
た。熱処理溶液は、遠心により菌体由来の不溶画分を取り除いた上 清画分
を用いた 。
熱処理時間 2，5，10，20，50，100時間に対してそれぞれ粗l
活性を求めた
が、コ ン トロール(基質の非酵素的分解速度)と同程度の活性しか検出され
ず、野生型酵素と同程度の活性を有する 変異型酵素は得 られなか った。
まとめ
aqualysin1の活性発現には、タンパク質の f
o
l
d
i
n
gが野生型酵素と同様
に進行すると仮定した場合、成熟体酵素が活性を有していることと、前駆
体として生産された酵素が成熟化することが必要である。酵素の成熟化に
L
e
ee
ta
!， 1988)、調製した 4磁の変異型酵
は、酵素活性が要求されるため (
素は結局、 foldingがうまく進行していないか、活性を有していないと推定
PAGEはおこなっていないため、タンパク質が
される(熱処理溶液の SDS-
きちんと生産されているかは未確認である)。いずれの理由にせよ、
「活性
型j の変異型酵素は得られておらず、活性中心の改変の試みは失敗に終わ
った。
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l
l
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u
l
o
s，
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i
a
n
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1
9
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i
o
c
h
e
m
i
s
r
r
y，26，2077-2082
、
謝辞
本論文の研究において、私個人のわがままを許し、学習と研究の場を与
えてさった太田￨隆久教授、並びに松沢洋助教授にこの場を借りてお礼を
申し上げます。
また、データの解析において種々の示唆を与えてくれた小出昌平博士
と
、 DNA操作技術を指導してくれた李泳春博士に、この場でお礼を申し
上げます。
論文内容要旨
応用生命工学専攻
平成 2年度博士課程進学 田 中 照 通
指準教官
太田隆久
耐熱性プロテアーゼ
アクアライシン Iの 基 質特 典 性 の 解 析 と 改 変
An
al
y
s
i
s血 l
dEngi
ne
e
r
i
ngofSu
b
sl
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a
l
eSp
e
ci
f
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i
lyofAqua
l
y
si
n1
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q
l
l
Q
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1
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lS
lab
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a
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du
c
e
db
y1
'
l
Ie/'IIIIISa
、
u
ti
ti
ls
i
nに代表される、分子量 3万程度のー鮮の鮮
微生物由来のセリンプロテアーゼの中には s
素があり、いずれも広い基質特異性を有することが知られている 。 これらの商
事素には主として動物
r
y
p
s
l
l
l型防素と問機に詳細な立体構 造の解析がなされているものが多く、触媒反応機構の
由来の l
解析を始めとして、広〈タンパク質工学の対象として級われ、多くの研究がなされている 。
h
t
r
l
l
llJs8quaL
icus¥
'
1
'lの生産する s
u
b
t
i
l
i
s
i
n型醇素アクアライシ
本研究では、高度好熱性細菌 T
ン 1(
a
qua
l
y
s
i
n1
)を材料として用いて、基質特異性の附庁とタンパク賀工学的手法による基質特異
性の改変、そして活性の制御スイッチの導入をおこなった。耐熱性の本酵素において基質特異性の
待できる 。
改変を行うことは、産業面・研究面の両方において有用なことであり、広い応用が!りj
第 l部
基 質特 異 性 の 解 析
(1 ) トリ ベ プ チ ド1
品質によ る1' 1' 1
' 2 '1
'3特 典 性 の解 析
a
q
u
a
l
y
剖 11
は、基質における切断部位より N末端側の 3残基 (
P
l-P3残基)をヨミに認識して』品
質を加水分解する 。そこで、切断部 i
立の C末端側にある1'1・部位に発色団(JJ"n
it
r
o
a
n
i
li
ne)を有する
q
u.
a
l
y
s
i
nIの疎水位アミノ 般残基に対する基質特異J性を解析
トリベフチド基質を用いて、野生型 a
した (
'
I
O'
C
.pH7.
5)
oS
I 部位は、 P
h
eや A
l
a残基 1苦射性 を示し、 V
a
lや L
e
u残ままでは触媒効率は低かっ
た 。 S2 郎 i立は、 A l a 残}.!i P~k下型で非分岐型の Ala や N l e残基を好み、分岐型の Leu や Va l残基を好まな
か っ た 。 S3 部位は、 PheP !'i PH~ であり、制i水性の高い Pheや Ile:残基を好んだ 。 それぞれの吋プサイ
ト における特異性 は 、 ~i縁古事業の ρrOl白 nase ，
<
1s
u
b
t
i
i
ls
i
nBPN とほぼ同一であった 。
(2) Pl変 典 型 SSI(StrcpLomyccssu
b
l
i
l
isi
l
li
lhi
b
i
tor
) によ る I
'l特 製 性 の 解 析
Pl剖1
I
立をAl
a
.L
e
u
.P
h
e
.A
r
g
.Asp残基に置換した変典型 S
SI
、および野生型 (Me
l
)
S
S
Iを用いて
l
J
J
I
定した。本 能，
f
i
はs
u
b
t
i
l
i
s
i
nと同株に S
SIと強〈総合する 。 #
1
*
量隣家と!日l
織に、i'JI(水
阻¥li5E数を i
性アミノ鮫残基を1'1部{立に有する場合の特異性は 1
止く、野生I¥!ISS(と伺じ程度の阻害定数値を示
したが、
?
1
1
荷を有するアミノ般として は嵐基性アミノ 般残基 Argを好んだ。
q同 l
y
s
i
l
l(のサプサイ ト(
SI-S3部位)毎の基質特異性は類縁静素の
これらの測定の結来は、 a
s
u
b
t
i
li
s
i
n，p
r
o
t
e
in
a
s
eJ(と煩似していることを示 し、1
主質結合部i
立のサブサイ ト S
I-S
3部位とその
周辺の立{
材陣造の相同性を示唆した。
第 2部
基 質 特 典性 の 改 変
s
u
b
t
il
i
s
in型酵素 I
H
Jの立体構造の紅i
向性、及び基質特典性の類似性を背景とし、これら盟i
縁酵
素の構造が本 ðr;~ の立(*'!構造のモデルとして利用できることがわかった 。 そこで、 52 ・ 53 部位
の 2つのサプサイトを 4
果的として、1'2.1
'3特典性の改変をおこなった。
(1) 1
'3 特 典 性 の 改 変
1' 3 特典性は~水性の高い 7 ミノ般残1.\i Phel こ対して高い反応性(高いん.値と低い K " 他)を示
す Phe格好~である 。 1' 1 .P~ 特異性は Ala P 創出1 であるため、 1' 3 特呉性を Ala P 昔好型へと改変すれ
ぱ
、 a
q
u
a
l
y
s
i
nI は Pl - P3 特異性すべてにおいて AlaP~好型となって モlastase" へと改変される 。 そ
こで、 s
u
b
t
i
l
i
s
i
n等の類縁酵素の立体構造をモデルとして、残基笹換および笹換導入した側鎖と基
質との相互作用のシミュレーションを行った 。その結呆、基質結合部 i
立の 2つ の残基 S
e
r
!0
2と
yl3l1
こおいてアミノ 酸残基置換により側鎖を I
G1
I
I
換す ると、そ れぞれの部位に導入されたアミノ骸
I鎖と問機に j
在媒U!
J
Iを向き、側鎖 J
U
Jの相互作用が予測された 。 シミュレーショ
残基側鎖は P3残基加J
ンで得た予 i
l
!
J
に従い、Sel
叫を H
i
s，L
y
s，G
l
u
伐基 l
、
二 G
1
yi31
をH
is
，L
y
s，Aspにそれぞれ世換した計 6
極の変典型鮮素を調製し、 P3特典性を解析したところ、 H
i
s
残基を導入した 2極の変典型鮮素
SI
02H とGI31Hは A
J
a残基日制下型へと改変された。 L
y
s残基を導入した 2種の酵素 SI02Kと
G131Kおよび G
l
u残基を導入した S102Eの計 3種の変異型酵素においても A
l
a残1
在日創刊生は上
昇し、円特異性の改変に成功した 。
(2) P2 特 異 性 の 改 変
鎖縁酵素 の S2 部位 は底の浅い ポケ γ トを形成し、 Al aJ:主基 UIH干 ~の P2 特集性 を 示す。 この
P2特巽性を側鎖の更に小さな G
l
y残J.
V制下型に改変することを企画した 。 シミュレーションにお
いて S2部位 を形成してい るアミノ 酸残基の lつGl
y山を他のアミノ酸残基に世換す ると、 S
2釜 山1
は抜くなり、 P2特集性が G
l
y残1J;晴好型に改変されることが予測された 。 シミュレ ーションで得
l
a，V
a
l，L
e
u残基に誼換した変異型酵素を調製したところ、 G
l
y
残基
た予測に従い、この Gly残基を A
(
1
)2
)に対する反応性を保持したまま、導入残基が Gl
y-'
A
l
a→ V
a
lの I
I
!
I
i
に Al
a
残基に対する反応性が
低下し、 Gly~;苦虫干性が上昇した。
6
8
また、 S2部位にある Asn を榊迭の類似した疎水性残基 Val
に誼換して S2部 i
立の疎水性環境を
a
U
I
i
!
l
f
牲は更に高くなった。
変えたところ、 P2特異性の Al
第
3郎
「メタ J
レ・スイッチ j の導入
類縁際索との基質特異性のrI!f以、及びm縁 ð~~転をモデルとした基質特異性の改変が本語字素にお
いて成:r)}を収めたことにより、本 d
f
;
長の1J;質結合部 1
立の立イ4構造は類縁酵素と類似していることが
u
b
t
i
l
i
s
i
n型鮮素には、可 i
主的な活性の制御因子は存在していない。 そ
わかった 。本酵素を含めて s
こで、モデル鯵素の立{料棒造をもとに、本 Nf~長の活性を制御する「スイッチ J を導入することを企
画した 。 I
スイッチj のモデルとして、 Hi
sCuH
i
s/
i
j
]の配位結合形成を利用し、基質が隊索へ結合
する段階での制御を考えた。すなわち、基質結合部位の i
梓の両側に 2つの H
i
s
残基を噂入すること
により、 Cu の存在で閉じ、金属キレーターの添加で聞く「扉 j を f~ けるというもの である 。 導入
した側鎖が浴媒側に向いてfIIl
び、お互いのU!
/
IJ
J
i
が0
.
6
nll1程度の距離にくることが予測された、 2
主
質結合剖\ 1立 (S3 部 i立に存在する)の 2 残基 Ser l 0 2 と Gly !31 とを His残基に置換した 2 重変典型 N~素を調
製した 。 この変異型酵素は、 Cuイオンの添加l
により話叫性が低下し、金属キレーター EDTAのj
奈川l
によりその活性を回復した。 また 、Cuの他に Z
n，N
iにおいても活性の附答 ・回復が認め られた 。
以上のことから、好熱菌由来のセリンプロテアーゼ a
q
u
a
l
y
s
i
n1 の基質特典性 、及び.~質結合
部¥
1
立の立{辛勝造が、その由来を自主えて広< s
u
b
l
ii
ls
i
n型酵素聞において相肉的であることがわかっ
た。上述 した戦略・手法はす べて s
u
b
t
il
is
i
n型隊素に共通して適応できるものであ り
、 1
1:い応用が
W
l
1
寺さ れる 。
付録
反 応 速 度 定 数 V u' KM の 求 め 方
阻
互韮・
最小自采法による回帰計算 (
L
e
a
s
tS
Q
u
a
r
ee
r
r
o
rc
a
l
c
u
l
a
t
i
o
nbvNewtonm
e
t
h
o
d
)
亙座盤基
叫
一
ー
十
M
、
'し
だ
た
I
-t
v
l
l
ed
-pa
i
v
一
M
i
c
h
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l
i
s
M
e
n
t
e
nt
v
o
e
V，
，
，
，
.=[
E
o
l
k
叫
手)
l
f
t:
反応速度 v を 2変数 K(1.らの代わり)，V
(九割の代わり)の ￨
剥数(非線形￨児数)とし
て定義し、それを 一次のマクローリン展開により展開する 。但し、個々の反応述
度 V，と基質波皮 s
，(
IS
Iのこと )は 定数として扱う 。
すなわち、反応式を
主 主 吋(V，K)
Vj=
民
+S
i
と定義するとき、ょを最適値 K'=K+L
'
.K，V'=V+
L
'
.V に対して 1
次展開すると
五(
K
'，
V
'
)三f
i
(
K，
V)叫
K並 +L
'
.V~/;_
dK --'dV
となる 。{
旦
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TRANSLATION 工NTO 1- OR 3- LETTER AMINO ACID FORMAT )
AQ1-A.
NUC
F工1ename
Sequence Size
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Sequence Position
1 - 1934
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