(57)【要約】 新規な腫瘍壊死因子レセプター (TNFR) ポリペプチド、前記

JP 2008-500804 A 2008.1.17
(57)【 要 約 】
新 規 な 腫 瘍 壊 死 因 子 レ セ プ タ ー (TNFR) ポ リ ペ プ チ ド 、 前 記 ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る
ポリヌクレオチド、抗体および関係する組成物および方法が開示される。ポリペプチドは
リガンド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを検出するために使用することがで
きる。また、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、腫瘍の増殖、転移および免
疫性をモジュレートする方法、例えば、刺激された免疫細胞から休止細胞を分離する方法
において使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項２】
ポ リ ペ プ チ ド が 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ Xを 含 ん で な り 、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 、
請 求 項 1に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項３】
ポ リ ペ プ チ ド が 残 基 1∼ 108を 含 ん で な る 、 請 求 項 1に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項４】
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 131を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
10
【請求項５】
ポ リ ペ プ チ ド が 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 131を 含 ん で な る 、 請 求 項 4に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ
ペプチド。
【請求項６】
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 198を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項７】
ポ リ ペ プ チ ド が 残 基 1∼ 198を 含 ん で な る 、 請 求 項 6に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項８】
ポ リ ペ プ チ ド が 下 記 の ポ リ ペ プ チ ド か ら 成 る 群 か ら 選 択 さ れ る 、 請 求 項 1に 記 載 の 単 離
されたポリペプチド:
20
a) 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
b) 配 列 番 号 30の 残 基 1∼ 308を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; お よ び
c) 配 列 番 号 32の 残 基 1∼ 185を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項９】
請 求 項 1に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【請求項１０】
請 求 項 4に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【請求項１１】
請 求 項 6に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【請求項１２】
30
下記の作用可能に連鎖された要素を含んでなる発現ベクター:
a) 転 写 プ ロ モ ー タ ー ;
b) DNAセ グ メ ン ト 、 こ こ で DNAセ グ メ ン ト は 請 求 項 1に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド 分 子 を コ ー
ドするポリヌクレオチド分子である; および
c) 転 写 タ ー ミ ネ ー タ ー 。
【請求項１３】
DNAセ グ メ ン ト が ア フ ィ ニ テ ィ ー タ グ を 含 有 す る 、 請 求 項 12に 記 載 の 発 現 ベ ク タ ー 。
【請求項１４】
請 求 項 12に 記 載 の 発 現 ベ ク タ ー が 導 入 さ れ て お り 、 DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ れ る
ポリペプチドを発現する培養された細胞。
40
【請求項１５】
請 求 項 14に 記 載 の 細 胞 を 培 養 し 、 こ こ で 前 記 細 胞 は DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ れ る
ポリペプチドを発現し; そして前記ポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチ
ドを製造する方法。
【請求項１６】
請 求 項 15に 記 載 の 方 法 に よ り 製 造 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項１７】
下記の残基またはポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドに特異的に結合
する抗体:
a) 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ X、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る ;
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b) 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ；
c) 配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ；
d) 配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ； お よ び
e) 配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項１８】
下記の工程を含んでなる、患者における遺伝的異常性を検出する方法:
患者から遺伝学的試料を採取し、
前 記 遺 伝 学 的 試 料 を 配 列 番 号 1の 少 な く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド ま た は 配 列 番 号 1
の相補体を含んでなるポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオ
チド配列に対してハイブリダイゼーションする条件下に、インキュベートすることによっ
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て 第 1反 応 生 成 物 を 生 成 し 、
第 1反 応 生 成 物 を 可 視 化 し 、 そ し て
前 記 第 1反 応 生 成 物 を 野 生 型 患 者 か ら の 対 照 反 応 生 成 物 と 比 較 し 、 こ こ で 第 1反 応 生 成 物
と対照反応生成物との間の差は患者における遺伝的異常性を示す。
【請求項１９】
下記の工程を含んでなる患者における癌を検出する方法:
患者から組織または生物学的試料を採取し、
前 記 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 を 請 求 項 17に 記 載 の 抗 体 と 前 記 抗 体 が 前 記 組 織 ま た は 生 物
学的試料中のその相補的ポリペプチドに結合する条件下にインキュベートし、
前記組織または生物学的試料中の結合した抗体を可視化し、そして
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前記患者からの組織または生物学的試料中の結合した抗体のレベルを正常の対照組織ま
たは生物学的試料と比較し、
ここで正常の対照組織または生物学的試料に関する患者の組織または生物学的試料に結
合した抗体のレベルの増加または減少は患者における癌を示す。
【請求項２０】
下記の工程を含んでなる患者における癌を検出する方法:
患者から組織または生物学的試料を採取し、
配 列 番 号 1の 少 な く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド ま た は 配 列 番 号 1の 相 補 体 を 含 ん で な
るポリヌクレオチドを標識化し、
前記ポリヌクレオチドが相補的ポリペプチド配列にハイブリダイゼーションする条件下
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に、前記組織または生物学的試料を前記ポリヌクレオチドとインキュベートし、
前記組織または生物学的試料中の標識化ポリヌクレオチドを可視化し、そして
前記患者からの組織または生物学的試料中の標識化ポリヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションレベルを正常の対照組織または生物学的試料と比較し、
ここで正常の対照組織または生物学的試料に関する患者の組織または生物学的試料に対
する標識化ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの増加または減少は患者における
癌を示す。
【請求項２１】
下記の工程を含んでなる癌細胞を殺す方法：
患 者 か ら 癌 細 胞 を 含 有 す る ex vivo 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 を 採 取 し 、 ま た は 癌 細 胞 を
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in vivo 同 定 し 、
請 求 項 15に 記 載 の 方 法 に よ り ポ リ ペ プ チ ド を 製 造 し 、
ポリペプチドを薬学上許容されるベヒクル中で配合し、そして
患者に投与するか、あるいは癌細胞を前記ポリペプチドに暴露させ、
ここで前記ポリペプチドは癌細胞を殺す。
【請求項２２】
ポ リ ペ プ チ ド が さ ら に ト キ シ ン に 複 合 体 さ れ て い る 、 請 求 項 21に 記 載 の 癌 細 胞 を 殺 す 方
法。
【請求項２３】
下記の工程を含んでなる刺激された免疫細胞から休止細胞を分離する方法:
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免疫細胞の試料を採取し、
前 記 試 料 の 一 部 分 上 に お け る 配 列 番 号 2ま た は そ の ス プ ラ イ ス 変 異 型 に よ り コ ー ド さ れ
る配列の転写、翻訳またはタンパク質発現のレベルを測定して、転写、翻訳またはタンパ
ク質発現の対照レベルを獲得し、
残りの試料を刺激因子とインキュベートし、
前 記 試 料 中 の 配 列 番 号 2ま た は そ の ス プ ラ イ ス 変 異 型 に よ り コ ー ド さ れ る 配 列 の 転 写 、
翻訳またはタンパク質発現のレベルを測定し、そして
対照レベルよりも多い転写、翻訳またはタンパク質発現のレベルを有するか、あるいは
前記対照レベルでまたはそれより低いレベルでタンパク質を発現する細胞を分離して、刺
激された状態の免疫細胞の集団を獲得する。
10
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
腫 瘍 壊 死 因 子 レ セ プ タ ー (TNFR) フ ァ ミ リ ー は 多 数 の 内 在 性 膜 糖 タ ン パ ク 質 レ セ プ タ ー
から成り、それらの多くはそれらのそれぞれのリガンドと共同して異なる造血細胞系統間
の 相 互 作 用 を 調 節 す る と 考 え ら れ る (Smith 他 、 The TNF Receptor Superfamily of Cell
ular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death 76: 959-62、 1994; C
osman、 Stem Cells 12: 440-55、 1994) 。 し か し な が ら 、 こ の フ ァ ミ リ ー に お け る い く つ
かのメンバーの全身的発現は、これらのレセプターが生物の発育、恒常性、腫瘍発生、移
20
植拒絶反応、敗血症性ショック、ウイルス複製および骨吸収においていっそう大きい役割
を 演 ず る こ と も で き る こ と を 示 唆 す る (Aggarwal、 Nat. Rev. Immunol. 3: 745-56、 2003
) 。
【０００２】
TNFレ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー は 、 特 に 細 胞 外 ド メ イ ン に お け る シ ス テ イ ン に 富 ん だ 反 復 に
関 し て 、 配 列 の 相 同 性 を 示 す I型 内 在 性 膜 糖 タ ン パ ク 質 か ら 主 と し て 構 成 さ れ て い る 。 TNF
レ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー は 29を 超 え る メ ン バ ー を 含 む (概 観 : Bodmer 他 、 TRENDS in Bioch
em. Sci. 27: 19-26、 2002) 。 特 に 構 造 的 類 似 性 を 有 す る メ ン バ ー を 有 す る こ の フ ァ ミ リ
ー の サ ブ グ ル ー プ は 下 記 を 包 含 す る : BAFF-R (Thomson 他 、 Science 293: 2108-2111、 20
01) 、 BCMA (Gross 他 、 Nature 404: 995-9、 2000) 、 TWEAKR (Wiley 他 、 Immunity 15:
30
837-46、 2001) 、 EDAR (Monreal 他 、 Nat. Gen. 22: 315-6、 1999) 、 XEDAR (Yan 他 、 29
0: 523-7) 、 TACI (Bulowお よ び Bram、 Science 278: 138-141、 1997) お よ び MK61 (Theil
l 他 、 WO 0220762、 12 March 2002) 。 TNFRの こ の グ ル ー プ は 、 普 通 に 見 ら れ る よ り も 変
動 性 の シ ス テ イ ン に 富 ん だ パ タ ー ン と 一 緒 に 2ま た は そ れ よ り 少 な い シ ス テ イ ン に 富 ん だ
ドメインを有するすることによって区別される。
【０００３】
一 般 に 、 TNFレ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー は 、 細 胞 外 領 域 、 ト ラ ン ス メ ン ブ ラ ン ド
メイン、細胞外領域結合性領域とトランスメンブランドメインとの間のリンカー領域およ
び細胞質ドメインを含んでなる多ドメイン構造により特徴づけられる。このファミリーの
い く つ か の メ ン バ ー (TNFR 1、 Fas、 DR3、 DR4、 DR5、 DR6、 NGFRお よ び EDAR) に お い て 、
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こ の 細 胞 質 ド メ イ ン は ア ポ ト ー シ ス に 関 連 す る 死 ん だ ド メ イ ン を 含 有 す る 。 TNFRフ ァ ミ リ
ー の メ ン バ ー 、 な ら び に 死 ん だ ド メ イ ン を 含 ま な い 他 の メ ン バ ー 、 例 え ば 、 TACIお よ び BC
MAは 6つ の 腫 瘍 壊 死 因 子 レ セ プ タ ー 関 連 因 子 (TRFA1∼ 6) の 1ま た は 2以 上 に 結 合 す る こ と
が示された。これらの因子は短いコンセンサス配列においてレセプターの細胞内ドメイン
に結合し、そして内部の細胞シグナリング経路にレセプターを結合させる作用をする。
【０００４】
細 胞 外 リ ガ ン ド 結 合 性 領 域 は 各 々 が 約 6シ ス テ イ ン お よ び ほ ぼ 40ア ミ ノ 酸 を 含 有 す る 1∼
6の シ ス テ イ ン に 富 ん だ モ チ ー フ に よ り 特 徴 づ け ら れ る が 、 こ れ ら の モ チ ー フ の 大 き さ お
よび数の変動はこのファミリーの間で起こる。システインに富んだ領域は、リガンドにお
い て 共 有 さ れ た 構 造 に 結 合 す る モ チ ー フ を 提 供 す る 。 TNFRフ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー 間 に お け
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る 最 高 度 の 相 同 性 は 、 こ の 細 胞 外 の シ ス テ イ ン に 富 ん だ 領 域 内 に 存 在 す る 。 ヒ ト TNFR間 に
お い て 、 平 均 の 相 同 性 は 25%∼ 30%で あ る 。 最 後 の シ ス テ イ ン に 富 ん だ 反 復 と ト ラ ン ス メ ン
ブ ラ ン ド メ イ ン と の 間 に 、 8∼ 70ア ミ ノ 酸 残 基 の 小 さ い ス ペ ー サ ー 領 域 が 存 在 す る 。 細 胞
表 面 の TNFレ セ プ タ ー は 、 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 残 基 の 配 列 に よ り 特 徴 づ け ら れ る ト ラ ン ス メ ン
ブランドメインにより細胞膜中に定着される。
【０００５】
細胞外リガンド結合性領域からのかつトランスメンブランドメインによりそれから分離
さ れ て い る タ ン パ ク 質 の 反 対 の 末 端 上 に 、 細 胞 質 ド メ イ ン が 存 在 す る 。 TNFRフ ァ ミ リ ー の
メ ン バ ー の 細 胞 質 ド メ イ ン は 小 さ い 46∼ 221ア ミ ノ 酸 残 基 で あ り 、 こ れ は フ ァ ミ リ ー メ ン
バ ー 間 の シ グ ナ リ ン グ メ カ ニ ズ ム の 起 こ り う る 差 を 示 唆 す る 。 例 え ば 、 TNFレ セ プ タ ー に
10
お い て 、 活 性 化 は 3レ セ プ タ ー の 細 胞 質 ド メ イ ン の 凝 集 に よ り 誘 発 さ れ 、 こ の と き そ れ ら
の対応する細胞外ドメインは三量体リガンドに結合し、これはレセプターファミリーに共
通の活性化法であることがある。
【０００６】
TNFレ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー の 1メ ン バ ー で あ る オ ス テ オ プ ロ テ ゲ リ ン (Simonet 他 、 前 掲
) は 、 分 泌 さ れ た タ ン パ ク 質 で あ る こ と に お い て 独 特 で あ る 。 他 の TNFレ セ プ タ ー の 可 溶
性 形 態 は 、 TNFR-I、 TNFR-II、 低 親 和 性 NGFR、 FAS、 CD27、 CD30、 CD40お よ び 4-1BBに つ い
て記載されたが、これらは細胞膜からの切断により発生するか、あるいは選択的にスプラ
イ ス さ れ た mRNAに よ り 分 泌 さ れ る 。 OPGは 溶 骨 細 胞 の 成 熟 を 阻 害 し 、 そ し て そ れ は 造 血 前
駆体からの溶骨細胞の分化をモジュレートすることによって骨密度を調節する働きをする
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と 考 え ら れ る 。 OPGは 正 常 の 骨 細 胞 リ モ デ リ ン グ お よ び 卵 巣 摘 出 関 連 骨 喪 失 か ら の 保 護 を
提供した。
【０００７】
ヒ ト TNF (Jones 他 、 Nature 338: 225-28、 1989) 、 LT-a (Eck 他 、 J. Biol. Chem. 26
7: 2119-122、 1992) お よ び LT-a/TNFR複 合 体 (Banner 他 、 Cell 73: 431-45、 1993) に つ
い て X線 結 晶 学 的 構 造 が 解 明 さ れ た 。 こ の 複 合 体 は 1つ の LT-a三 量 体 に 対 称 的 に 結 合 し た 3
レセプター分子を特徴とする。シグナルトランスダクション経路を開始するために、レセ
プ タ ー の オ リ ゴ マ ー 化 に よ る 三 量 体 リ ガ ン ド の 結 合 モ デ ル が 提 案 さ れ た 。 い く つ か の TNF
メンバーの生物学的活性の同定は、対応するレセプターに対して特異的なモノクローナル
抗体を使用することによって促進された。
30
【０００８】
これらのモノクローナル抗体は、固定化されたとき、刺激性である傾向があり、可溶性
形態で拮抗性である。さらに、これはレセプターの架橋がこのレセプターファミリーにお
けるシグナルトランスダクションのための必要条件であることの証拠である。重要なこと
に は 、 レ セ プ タ ー 特 異 的 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 ま た は マ ル チ マ ー Ig融 合 タ ン パ ク 質 の 形 態 の
可 溶 性 レ セ プ タ ー の 使 用 は 、 い く つ か の フ ァ ミ リ ー メ ン バ ー に つ い て in vitro お よ び in
vivo の 生 物 学 的 機 能 の 決 定 に お い て 有 効 で あ っ た 。 可 溶 性 レ セ プ タ ー -Ig融 合 タ ン パ ク
質 は 、 CD40、 CD30、 CD27、 4-1BBお よ び Fasレ セ プ タ ー に 対 応 す る 細 胞 表 面 の リ ガ ン ド の ク
ローニングにおいて首尾よく使用されてきている。
【０００９】
40
こ れ ら の レ セ プ タ ー の リ ガ ン ド は 同 定 さ れ て き て お り 、 1つ (NGF) を 除 外 し て 、 TNFリ
ガ ン ド フ ァ ミ リ ー に 属 す る 。 TNFリ ガ ン ド フ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー は 細 胞 外 リ ガ ン ド 結 合 性
領 域 に お い て ほ ぼ 20%の 配 列 同 一 性 を 有 し 、 主 と し て II型 膜 糖 タ ン パ ク 質 と し て 存 在 し 、
三量体またはマルチマーの複合体として生物学的に活性である。大部分のリガンドは膜結
合タンパク質として合成されるが、可溶性形態は制限されたタンパク質分解法により発生
させることができる。いくつかのレセプターについて、可溶化は活性化に必要であるが、
他のものについて、それらの活性は切断のときに阻害される。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
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1つ の 面 に お い て 、 本 発 明 は 、 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ
プ チ ド を 提 供 す る 。 他 の 態 様 に お い て 、 本 発 明 は 、 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 108を 含 ん で な る
単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド を 提 供 す る 。 本 発 明 の 他 の 面 は 、 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 131を 含 ん
で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 、 な ら び に 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 131を 含 ん で な る 単 離 さ れ
た ポ リ ペ プ チ ド で あ る 。 本 発 明 の そ れ 以 上 の 面 は 、 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 198を 含 ん で な る
単離されたポリペプチドである。
【００１１】
他 の 面 に お い て 、 本 発 明 は 、 a) 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 、 b)
配 列 番 号 30の 残 基 1∼ 308を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド お よ び c) 配 列 番 号 32の 残 基 1∼ 185を
含んでなるポリペプチドから成る群から選択される単離されたポリペプチドを提供する。
10
他 の 面 に お い て 、 本 発 明 は 、 残 基 18∼ Xを 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド を 提 供 し
、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 。
【００１２】
他の面において、本発明は、下記の作用可能に連鎖された要素を含んでなる発現ベクタ
ー を 提 供 す る : a) 転 写 プ ロ モ ー タ ー ; b) DNAセ グ メ ン ト 、 こ こ で DNAセ グ メ ン ト は 配 列 番
号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 分 子 を コ ー ド す る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 分 子 で あ
る ; お よ び c) 転 写 タ ー ミ ネ ー タ ー 。 あ る 態 様 に お い て 、 DNAセ グ メ ン ト は ア フ ィ ニ テ ィ ー
タ グ を 含 有 す る 。 他 の 態 様 に お い て 、 本 発 明 は 、 発 現 ベ ク タ ー が 導 入 さ れ て お り 、 DNAセ
グメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞を提供する。他の態
様 に お い て 、 本 発 明 は 、 細 胞 を 培 養 し 、 こ こ で 前 記 細 胞 は DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ
20
れるポリペプチドを発現し; そして前記ポリペプチドを回収することを含んでなるポリペ
プチドを製造する方法を提供する。他の態様において、細胞により産生されたポリペプチ
ドが提供される。
【００１３】
また、本発明は、下記の工程を含んでなる、患者における遺伝的異常性を検出するする
方 法 を 提 供 す る : 患 者 か ら 遺 伝 学 的 試 料 を 採 取 し 、 前 記 遺 伝 学 的 試 料 を 配 列 番 号 1の 少 な
く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド ま た は 配 列 番 号 1の 相 補 体 を 含 ん で な る ポ リ ヌ ク レ オ チ
ドと、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーシ
ョ ン す る 条 件 下 に 、 イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と に よ っ て 第 1反 応 生 成 物 を 生 成 し 、 第 1反 応 生
成 物 を 可 視 化 し 、 そ し て 前 記 第 1反 応 生 成 物 を 野 生 型 患 者 か ら の 対 照 反 応 生 成 物 と 比 較 し
30
、 こ こ で 第 1反 応 生 成 物 と 対 照 反 応 生 成 物 と の 間 の 差 は 患 者 に お け る 遺 伝 的 異 常 性 を 示 す
。
【００１４】
本発明のそれ以上の方法は、下記の工程を含んでなる患者における癌を検出する方法で
ある: 患者から組織または生物学的試料を採取し、前記組織または生物学的試料を請求項
18に 記 載 の 抗 体 と 前 記 抗 体 が 前 記 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 中 の そ の 相 補 的 ポ リ ペ プ チ ド に
結合する条件下にインキュベートし、前記組織または生物学的試料中の結合した抗体を可
視化し、そして前記患者からの組織または生物学的試料中の結合した抗体のレベルを正常
の対照組織または生物学的試料と比較し、ここで正常の対照組織または生物学的試料に関
する患者の組織または生物学的試料に結合した抗体のレベルの増加または減少は患者にお
40
ける癌を示す。
【００１５】
ま た 、 下 記 の 工 程 を 含 ん で な る 患 者 に お け る 癌 を 検 出 す る 第 2の 方 法 が 提 供 さ れ る : 患
者 か ら 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 を 採 取 し 、 配 列 番 号 1の 少 な く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ
チ ド ま た は 配 列 番 号 1の 相 補 体 を 含 ん で な る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド を 標 識 化 し 、 前 記 組 織 ま た
は生物学的試料を前記ポリヌクレオチドと前記ポリヌクレオチドが相補的ポリペプチド配
列にハイブリダイゼーションする条件下にインキュベートし、前記組織または生物学的試
料中の標識化ポリヌクレオチドを可視化し、そして前記患者からの組織または生物学的試
料中の標識化ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションレベルを正常の対照組織または
生物学的試料と比較し、ここで正常の対照組織または生物学的試料に関する患者の組織ま
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たは生物学的試料に対する標識化ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの増加また
は減少は患者における癌を示す。
【００１６】
本発明のそれ以上の面は、下記の工程を含んでなる癌細胞を殺す方法である: 患者から
癌 細 胞 を 含 有 す る ex vivo 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 を 採 取 し 、 ま た は 癌 細 胞 を in vivo 同
定し、組換え手段によりポリペプチドを製造し、ポリペプチドを薬学上許容されるベヒク
ル中で配合し、そして患者に投与するか、あるいは癌細胞を前記ポリペプチドに暴露させ
、ここで前記ポリペプチドは癌細胞を殺す。また、この方法はポリペプチドがトキシンに
複合体されている場合に実施することができる。
【００１７】
10
他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる神経芽細胞腫、黒色腫またはリン
パ 腫 、 特 に T細 胞 リ ン パ 腫 を 検 出 す る 方 法 を 提 供 す る : 前 記 神 経 芽 細 胞 腫 、 黒 色 腫 ま た は
リ ン パ 腫 を 配 列 番 号 1、 3、 29ま た は 31に 示 す ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 接 触 さ せ 、 こ こ で 前
記 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は 神 経 芽 細 胞 腫 、 黒 色 腫 ま た は リ ン パ 腫 中 の mRNAに 対 し て ハ イ ブ リ ダ
イゼーションする。ある態様において、ポリヌクレオチドは下記のものから成る群から選
択される:
【００１８】
配 列 番 号 1に 示 す 少 な く と も 16の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 1に 示 す 17∼ 25の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 1に 示 す 40の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
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配 列 番 号 1に 示 す 60の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 29に 示 す 少 な く と も 16の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 29に 示 す 17∼ 25の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 29に 示 す 40の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 29に 示 す 60の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 31に 示 す 少 な く と も 16の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 31に 示 す 17∼ 25の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 31に 示 す 40の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ;
配 列 番 号 31に 示 す 60の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド か ら 成 る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【００１９】
30
他の態様において、癌細胞、特に神経芽細胞腫、黒色腫またはリンパ腫をポリペプチド
が 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ Xを 含 ん で な り 、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 、 ポ リ ペ プ チ ド に
対する抗体と接触させることを含んでなる、癌細胞、特に神経芽細胞腫、黒色腫またはリ
ンパ腫を検出する方法が提供される。ある態様において、抗体は下記のポリペプチドから
成る群から選択されるポリペプチドに対して発生させる:
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; お よ び
配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 。
【００２０】
40
本 発 明 の 他 の 面 に お い て 、 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ Xを 含 ん で な り 、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整
数である、単離されたポリペプチドを細胞に投与することを含んでなる、下記のポリペプ
チドから成る群から選択されるポリペプチドを発現する肺癌、乳癌、黒色腫、骨肉腫また
はリンパ腫の量を抑制する方法が提供される:
配 列 番 号 2に 示 す 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 29に 示 す 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド ; お よ び
配 列 番 号 3に 示 す 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【００２１】
本発明の他の面は、休止状態である細胞から活性化された免疫細胞を検出する方法、お
よ び さ ら に 、 分 離 す る 方 法 で あ る 。 こ れ ら の 方 法 は 、 RNAま た は タ ン パ ク 質 レ ベ ル の ztnfr
50
(8)
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14発 現 を 検 出 し 、 次 い で 高 い レ ベ ル を 発 現 す る 細 胞 を 低 い レ ベ ル を 発 現 す る 細 胞 か ら 分 離
することを包含する。このような分離は、活性化された細胞に富んだ免疫細胞集団を生ず
る 。 こ の 方 法 に 好 ま し い 態 様 で あ る 免 疫 細 胞 は 、 B細 胞 、 NK細 胞 お よ び あ る 種 の 型 の T細 胞
を包含する。
【００２２】
他の面において、本発明は、下記の作用可能に連鎖された要素を含んでなる発現ベクタ
ー を 提 供 す る : 転 写 プ ロ モ ー タ ー ; DNAセ グ メ ン ト 、 こ こ で DNAセ グ メ ン ト は 請 求 項 1に 記
載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子である; および転写ターミネーター
。ある態様において、発現ベクターはアフィニティータグを含有する。他の態様において
、本発明による発現ベクターが導入された培養された細胞が提供され、そしてこの細胞は
10
DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プ チ ド を 発 現 す る 。 そ れ 以 上 の 態 様 に お い て 、
本 発 明 は 、 細 胞 を 培 養 し 、 こ れ に よ り 細 胞 は DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プ
チドを発現し、そしてポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチドを製造する
方法を提供する。
【００２３】
他の面において、本発明は、下記の工程を順番に含んでなる抗体を製造する方法を提供
する:
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; ま た は
20
配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
から成るポリペプチド分子から成る群から選択されるポリペプチドを動物に接種し、こ
こでポリペプチドは動物において免疫応答を誘発して抗体を産生し、そして動物から抗体
を 単 離 す る 。 あ る 態 様 に お い て 、 こ の 方 法 に よ り 製 造 さ れ た 抗 体 は 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 26
9に 結 合 す る 。 あ る 態 様 に お い て 、 請 求 項 14に 記 載 の 抗 体 が 提 供 さ れ 、 こ こ で 抗 体 は モ ノ
クローナル抗体である。ある態様において、この抗体はポリペプチドに特異的結合する。
【００２４】
他の面において、本発明は、下記の工程を順番に含んでなる抗体を製造する方法を提供
する:
ポリペプチドのエピトープ支持部分を動物に接種し、ここでエピトープ支持部分は配列
30
番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; ま た は
配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
【００２５】
から成るポリペプチド分子から成る群から選択され、ここでポリペプチドは動物におい
て免疫応答を誘発して抗体を産生し、そして動物から抗体を単離する。ある態様において
、 こ の 方 法 に よ り 製 造 さ れ た 抗 体 は 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 269に 結 合 す る 。 あ る 態 様 に お い
て、抗体はモノクローナル抗体である。ある態様において、この抗体はポリペプチドに特
異的結合する。
40
【００２６】
他 の 面 に お い て 、 本 発 明 は 、 下 記 の 工 程 を 含 ん で な る 可 逆 的 ペ プ チ ド -レ セ プ タ ー 複 合
体 を 形 成 す る 方 法 を 提 供 す る : レ セ プ タ ー を 準 備 し 、 こ こ で レ セ プ タ ー は 配 列 番 号 2の 残
基 18∼ 108を 含 ん で な り 、 そ し て ペ プ チ ド を レ セ プ タ ー と 接 触 さ せ 、 こ こ で レ セ プ タ ー は
ペプチドに結合する。
【００２７】
他の面において、本発明は、下記のポリペプチドから成る群から選択される単離された
ポリペプチドを提供する:
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
配 列 番 号 29の 残 基 18∼ 308を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; お よ び
50
(9)
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配 列 番 号 31の 残 基 1∼ 185を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 。 あ る 態 様 に お い て 、 本 発 明 は 、 単
離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
他の面において、本発明は、神経組織、皮膚組織または造血系列の細胞中の癌腫を配列
番 号 2に 示 す ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る 抗 体 と 接 触 さ せ る こ と を 含 ん で な る 、 前 記 癌 腫 を 検 出
す る 方 法 を 提 供 す る 。 あ る 態 様 に お い て 、 抗 体 を 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ
リ ペ プ チ ド ; 配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; 配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80
を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; ま た は 配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド
から成る群から選択されるポリペプチドに対して発生させる。
【００２９】
10
他の面において、本発明は、細胞に単離されたポリペプチドを投与することを含んでな
る細胞におけるレセプターの活性化をモジュレートする方法を提供し、ここで単離された
ポ リ ペ プ チ ド は 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ Xを 含 ん で な り 、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 。 あ
る 態 様 に お い て 、 細 胞 は 配 列 番 号 1の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 配 列 を 発 現
す る 。 他 の 態 様 に お い て 、 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド は 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ Xを 含 ん で な り
、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 。
【００３０】
本発明の他の面において、細胞に単離されたポリペプチドを投与することを含んでなる
癌細胞の増殖をモジュレートする方法が提供され、ここで単離されたポリペプチドは配列
番 号 2の 残 基 18∼ Xに 示 す ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 ん で な り 、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 。 あ
20
る態様において、癌細胞は神経芽細胞腫、黒色腫またはリンパ腫の細胞である。
本発明のこれらの面および他の面は、本発明の下記の詳細な説明および添付図面を参照
すると、明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することは本発明の理解の助けとなる
であろう：
用 語 「 親 和 標 識 」 は 、 本 明 細 書 に お い て 、 第 2ポ リ ペ プ チ ド の 精 製 ま た は 検 出 を 提 供
す る か 、 あ る い は 基 質 へ の 第 2ポ リ ペ プ チ ド の 結 合 部 位 を 提 供 す る た め に 、 第 2ペ プ チ ド に
30
結合させることができるポリペプチドのセグメントを表すために使用される。原理的には
、抗体または他の特異的結合因子が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質を親和標
識として使用できる。
【００３２】
親 和 標 識 は 下 記 の も の を 包 含 す る : ポ リ ヒ ス チ ジ ン ト ラ ク ト 、 プ ロ テ イ ン A (Nilsson他
、 EMBO J. 4: 1075、 1985; Nilsson他 、 Methods Enzymol. 198: 3、 1991) 、 グ ル タ チ オ
ン Sト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (Smithお よ び Johnson、 Gene 67: 31、 1988) 、 Glu-Glu親 和 標 識
(Grussenmeyer他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4、 1985) (配 列 番 号 7) 、 サ
ブ ス タ ン ス P、 Flag
T M
ペ プ チ ド (Hopp他 、 Biotechnology 6: 1204-1210、 1988) 、 ス ト レ
プ ト ア ビ ジ ン 結 合 性 ペ プ チ ド 、 マ ル ト ー ス 結 合 性 タ ン パ ク 質 (Guan他 、 Gene 67: 21-30、
40
1987) 、 セ ル ロ ー ス 結 合 性 タ ン パ ク 質 、 チ オ レ ド キ シ 、 ユ ビ ク イ チ ン 、 T7ポ リ メ ラ ー ゼ 、
または他の抗原エピトープまたは結合ドメイン。
【００３３】
一 般 に 、 Ford他 、 Protein Expression and Purification 2: 95-107、 1991、 参 照 。 親
和 標 識 を コ ー ド す る DNAお よ び 他 の 試 薬 は 、 商 業 的 供 給 会 社 か ら 入 手 可 能 で あ る (例 え ば
、 Pharmacia Biotech、 ニ ュ ー ジ ャ ー ジ イ 州 ピ ス カ タ ウ ェ イ ; Eastman Kodak、 コ ネ チ カ
ット州ニューヘブン) 。
【００３４】
用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリペプチド
内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語は近接性または相
50
(10)
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対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を参照して使用される。例え
ば、ポリペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある種の配列は参照
配列のカルボキシル末端に対して近接して位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシ
ル末端に必ずしも存在しない。
【００３５】
用語「ポリヌクレオチド分子の補体」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配列に比較し
て 逆 の 向 き を 有 す る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 分 子 で あ る 。 例 え ば 、 配 列 5' ATGCACGGG 3'は 5' CC
CGTGCAT 3'に 対 し て 相 補 的 で あ る 。
用語「に対応する」は、配列中のアミノ酸残基の位置に適用するとき、配列を最適に整
列させたとき、複数の配列中の対応する位置を意味する。
10
【００３６】
用 語 「 縮 重 ヌ ク レ オ チ ド 配 列 」 は 、 1ま た は そ れ 以 上 の 縮 重 コ ド ン を 含 む ヌ ク レ オ チ ド
配 列 (ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 参 照 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 分 子 に 比 較 し て ） を 表 す 。 縮 重 コ
ドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一アミノ酸残基をコードする
(す な わ ち 、 GAUお よ び GACの ト リ プ レ ッ ト の 各 々 は Aspを コ ー ド す る ） 。
【００３７】
用語「発現ベクター」は、問題のポリペプチドの転写を提供する追加のセグメントに作
用可能に連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントを含んでなる線状また
は 円 形 の DNA分 子 を 表 す た め に 使 用 さ れ る 。 こ の よ う な 追 加 の セ グ メ ン ト は 、 プ ロ モ ー タ
ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー の 配 列 を 包 含 し 、 そ し て 、 ま た 、 1ま た は そ れ 以 上 の 複 製 起 点 、 1
20
またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、および
そ の 他 を 包 む こ と が で き る 。 一 般 に 、 発 現 ベ ク タ ー は プ ラ ス ミ ド ま た は ウ イ ル ス DNAに 由
来するか、あるいは双方の要素を含有することができる。
【００３８】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチドがその
自然の遺伝的環境から取出され、こうして他の余分のまたは望ましくないコーディング配
列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で使用するために適当な形態
であることを表す。このような単離された分子はそれらの自然の環境から分離されたもの
で あ り 、 そ し て cDNAお よ び ゲ ノ ム の ク ロ ー ン を 包 含 す る 。 本 発 明 の 単 離 さ れ た DNA分 子 は
、 そ れ ら が 通 常 ア ソ シ エ ー ト す る 他 の 遺 伝 子 を 含 ま な い が 、 天 然 に 存 在 す る 5'お よ び 3'の
30
非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーターを包むことができる。アソシエ
ー ト さ れ た 領 域 の 同 定 は 当 業 者 に と っ て 明 ら か で あ ろ う (例 え ば 、 Dynanお よ び Tijan、 Na
ture 316: 774-78、 1985参 照 ) 。
【００３９】
「単離された」 ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境、例えば、血液およ
び動物の組織以外の状況において見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ま
しい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチド、特に動物由来の他のポ
リ ペ プ チ ド を 実 質 的 に 含 ま な い 。 高 度 に 精 製 さ れ た 形 態 、 す な わ ち 、 95％ よ り 大 き い 純 度
、 よ り 好 ま し く は 99％ よ り 大 き い 純 度 の ポ リ ペ プ チ ド を 提 供 す る こ と が 好 ま し い 。 こ の 関
係において使用するとき、用語 「単離された」 は別の物理的形態、例えば、二量体、あ
40
るいは選択的にグリコシル化または誘導化された形態の同一ポリペプチドの存在を排除し
ない。
【００４０】
用 語 「 作 用 可 能 に 連 鎖 さ れ た 」 は 、 2ま た は そ れ 以 上 の 実 在 物 が そ れ ら の 意 図 す る 目 的
の た め に 協 力 し て 機 能 す る よ う に 一 緒 に 結 合 さ れ て い る こ と を 意 味 す る 。 DNAセ グ メ ン ト
について言及するとき、この句は、例えば、コーディング配列が正しいリーディングフレ
ー ム で 結 合 さ れ 、 そ し て 転 写 が プ ロ モ ー タ ー に お い て 開 始 し 、 1ま た は そ れ 以 上 の コ ー デ
ィングセグメントを通してターミネーターに進行することを示す。ポリペプチドについて
言 及 す る お き 、 「 作 用 可 能 に 連 鎖 さ れ た 」 は 共 有 結 合 (例 え ば 、 ジ サ ル フ ァ イ ド 結 合 に
よ り ) お よ び 非 共 有 結 合 (例 え ば 、 水 素 結 合 、 疎 水 性 相 互 作 用 、 ま た は 塩 架 橋 相 互 作 用 に
50
(11)
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よ る ) の 結 合 さ れ た 両 方 の 配 列 を 包 含 し 、 こ こ で 配 列 の 1ま た は そ れ 以 上 の 所 望 の 機 能 は
保持される。
【００４１】
用語「オーソログ」または「種の相同体」は、異なる種からのポリペプチドまたはタン
パ ク 質 の 機 能 的 対 応 物 で あ る 1つ の 種 か ら 得 ら れ た ポ リ ペ プ チ ド ま た は タ ン パ ク 質 を 表 す
。オーソログ間の配列の差は種形成の結果である。
【００４２】
「 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 」 は 、 5'→ 3'末 端 の 方 向 に 読 ん だ 、 デ オ キ シ リ ボ ヌ ク レ オ チ ド ま た
は リ ボ ヌ ク レ オ チ ド 塩 基 の 一 本 鎖 ま た は 二 本 鎖 の ポ リ マ ー で あ る 。 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は RN
Aお よ び DNAを 包 含 し 、 天 然 源 か ら 単 離 さ れ 、 in vitroで 合 成 さ れ る か 、 あ る い は 天 然 分 子
10
と合成分子との組合わせから製造することができる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基
対 (略 号 「 bp」 ) 、 ヌ ク レ オ チ ド ( 「 nt」 ) 、 ま た は キ ロ 塩 基 ( 「 kb」 ) と し て 表
さ れ る 。 こ の 関 係 が 許 す 場 合 、 後 者 の 2つ の 用 語 は 一 本 鎖 ま た は 二 本 鎖 で あ る ポ リ ヌ ク レ
オチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、それは全体の
長さを表すために使用され、そして用語 「塩基対」 に等しいと理解されるであろう。当
業 者 は 認 識 す る よ う に 、 二 本 鎖 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド の 2つ の 鎖 は わ ず か に 長 さ が 異 な る こ と
があり、そして酵素切断の結果その末端は食い違うことがある; こうして、二本鎖ポリヌ
クレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは対合していなことがある。このような不対末
端 は 一 般 に 20ヌ ク レ オ チ ド 長 さ を 越 え な い 。
【００４３】
20
「ポリペプチド」は、自然にまたは合成的に生産されたかどうかにかかわらず、ペプチ
ド 結 合 に よ り 結 合 さ れ た ア ミ ノ 酸 残 基 の ポ リ マ ー で あ る 。 約 10ア ミ ノ 酸 残 基 よ り 小 さ い ポ
リペプチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。
「 ペ プ チ ド -レ セ プ タ ー 複 合 体 」 は 、 ペ プ チ ド ま た は リ ガ ン ド が レ セ プ タ ー に 結 合 し て
レセプターの性質を変化させるとき生ずる。この変化は、細胞機能の変化に導く反応順序
を開始させ、またはレセプターが追加のペプチドに結合できないようにさせることができ
る 。 ペ プ チ ド -レ セ プ タ ー 複 合 体 は 可 逆 的 で あ る 。
【００４４】
用 語 「 プ ロ モ ー タ ー 」 は 、 本 明 細 書 に お い て 、 RNAポ リ メ ラ ー ゼ を 結 合 さ せ か つ 転 写 を
開 始 さ せ る DNA配 列 を 含 有 す る 遺 伝 子 の 部 分 を 表 す 、 こ の 分 野 に お い て 認 識 さ れ て い る 意
30
味 に お い て 使 用 さ れ る 。 プ ロ モ ー タ ー 配 列 は 普 通 に 、 し か し 常 に で は な い が 、 遺 伝 子 の 5'
非コーディング領域の中に見出される。
【００４５】
「 タ ン パ ク 質 」 は 、 1ま た は そ れ 以 上 の ポ リ ペ プ チ ド 鎖 を 含 ん で な る 高 分 子 で あ る 。 ま
た、タンパク質は非ペプチド成分、例えば、炭水化物基を含んでなることができる。炭水
化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によりタンパク質に付
加されることがあり、そして細胞のタイプとともに変化するであろう。タンパク質は、本
明細書において、アミノ酸バックボーン構造により定義される; 置換基、例えば、炭水化
物基は一般に特定されないが、それにもかかわらず、存在することができる。
【００４６】
40
用 語 「 レ セ プ タ ー 」 は 、 生 物 活 性 分 子 (す な わ ち 、 リ ガ ン ド ) に 結 合 し 、 細 胞 上 の リ ガ
ンドの作用を伝達する、細胞関連タンパク質を表す。膜に結合したレセプターは、細胞外
リガンド結合性ドメインと、典型的にはシグナルトランスダクションに関係する細胞内エ
フェクタードメインとからなる、多ドメイン構造または多ペプチド構造により特徴づけら
れ る 。 レ セ プ タ ー へ の リ ガ ン ド の 結 合 は 、 エ フ ェ ク タ ー ド メ イ ン と 細 胞 中 の 1ま た は そ れ
以上の他の分子との間の相互作用を引き起こす、レセプターにおけるコンフォメーション
の変化を生ずる。
【００４７】
こ の 相 互 作 用 は 、 引 き 続 い て 、 細 胞 の 代 謝 の 変 更 に 導 く 。 レ セ プ タ ー -リ ガ ン ド の 相 互
作 用 に 関 係 す る 代 謝 事 象 は 、 遺 伝 子 の 転 写 、 リ ン 酸 化 、 脱 リ ン 酸 化 、 サ イ ク ル 的 AMP産 生
50
(12)
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の増加、細胞のカルシウムの移動化、膜脂質の移動化、細胞の接着、イノシトール脂質の
加水分解およびリン脂質の加水分解を包含する。一般に、レセプターは、膜結合、細胞質
ゾ ル ま た は 核 レ セ プ タ ー ; モ ノ マ ー の レ セ プ タ ー (例 え ば 、 甲 状 腺 刺 激 ホ ル モ ン の レ セ プ
タ ー 、 ベ ー タ -ア ド レ ナ リ ン 作 動 性 レ セ プ タ ー ) ま た は マ ル チ マ ー の レ セ プ タ ー (例 え ば
、 PDGFレ セ プ タ ー 、 成 長 ホ ル モ ン レ セ プ タ ー 、 IL-3レ セ プ タ ー 、 GM-CSFレ セ プ タ ー 、 G-CS
Fレ セ プ タ ー 、 エ リ ト ロ ポ イ エ チ ン レ セ プ タ ー お よ び IL-6レ セ プ タ ー ) で あ る こ と が で き
る。
【００４８】
用 語 「 分 泌 シ グ ナ ル 配 列 」 は 、 ポ リ ペ プ チ ド ( 「 分 泌 ペ プ チ ド 」 ) を コ ー ド す る DNA
配 列 を 表 し 、 そ れ は 、 よ り 大 き い ポ リ ペ プ チ ド の 1成 分 と し て 、 よ り 大 き い ポ リ ペ プ チ ド
10
が合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。通常、より大きいポリ
ペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌ペプチドを除去する。
【００４９】
「 セ グ メ ン ト 」 は 、 特 定 し た 属 性 を 有 す る よ り 大 き い 分 子 (例 え ば 、 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド
ま た は ポ リ ペ プ チ ド ) の 一 部 分 で あ る 。 例 え ば 、 特 定 し た ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る DNA
セ グ メ ン ト は 、 5'→ 3'方 向 に 読 ん だ と き 、 特 定 し た ポ リ ペ プ チ ド の ア ミ ノ 酸 配 列 を コ ー ド
す る 、 よ り 大 き い DNA分 子 の 部 分 、 例 え ば 、 プ ラ ス ミ ド ま た は プ ラ ス ミ ド フ ラ グ メ ン ト で
ある。
【００５０】
「可溶性レセプター」は、細胞膜に結合しないレセプターポリペプチドである。可溶性
20
レセプターは、最も普通には、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを欠如
するリガンド結合性レセプターポリペプチドである。可溶性レセプターは、追加のアミノ
酸残基、例えば、ポリペプチドを精製するか、あるいは基質へのポリペプチドの結合部位
を提供するアフィニティータグを含んでなることができる。多数の細胞表面レセプターは
、 タ ン パ ク 質 分 解 的 に 産 生 さ れ 、 ま た は 選 択 的 に ス プ ラ イ ス さ れ た mRNAか ら 翻 訳 さ れ る 、
天然に存在する可溶性成分を有する。レセプターポリペプチドは、それぞれ、膜の定着ま
たはシグナルトランスダクションを提供するために十分な、トランスメンブランおよび細
胞内のポリペプチドセグメントの部分を欠如するとき、これらのセグメントを実質的に含
有しないと言われる。
【００５１】
30
用 語 「 ス プ ラ イ ス 変 異 型 」 は 、 本 明 細 書 に お い て 、 遺 伝 子 か ら 転 写 さ れ た RNAの 別 の 形
態 を 表 す た め に 使 用 さ れ る 。 ス プ ラ イ ス 変 異 は 転 写 さ れ た RNA分 子 内 の 、 あ る い は そ れ 程
普 通 で は な い が 別 々 に 転 写 さ れ た RNA分 子 の 間 の 、 オ ー ル タ ネ イ ト ス プ ラ イ ス 部 位 の 使 用
に よ り 自 然 に 発 生 し 、 そ し て 同 一 遺 伝 子 か ら 転 写 さ れ た い く つ か の mRNAを 生 ず る こ と が あ
る。スプライス変異型は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするこ
とができる。また、スプライス変異型という用語は、本明細書において、ある遺伝子から
転 写 さ れ た mRNAの ス プ ラ イ ス 変 異 型 に よ り コ ー ド さ れ る タ ン パ ク 質 を 表 す た め に 使 用 さ れ
る。
【００５２】
不 正 確 な 分 析 法 (例 え ば 、 ゲ ル 電 気 泳 動 ) に よ り 決 定 さ れ た ポ リ マ ー の 分 子 量 お よ び 長
40
さ は 、 近 似 値 で あ る こ と が 理 解 さ れ る で あ ろ う 。 こ の よ う な 値 を 「 約 」 Xま た は 「 ほ ぼ
」 Xと し て 表 す と き 、 Xの 記 載 す る 値 は ± 10％ の 正 確 さ で あ る こ と が 理 解 さ れ る で あ ろ う
。
本明細書において引用するすべての参考文献は、それらの全体において引用することに
よって本明細書の一部とされる。
【００５３】
本 発 明 は 、 新 規 な DNA配 列 (配 列 番 号 1) と 腫 瘍 壊 死 因 子 レ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー の メ ン バ
ー に 対 し て 相 同 性 を 有 す る 対 応 す る ポ リ ペ プ チ ド 配 列 (配 列 番 号 2) と の 発 見 に 基 づ く 。
本発明の新規なレセプターエンコーディングポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ト
ラ ン ス メ ン ブ ラ ン ド メ イ ン お よ び 非 EGF (表 皮 増 殖 因 子 ) シ ス テ イ ン に 富 ん だ 細 胞 外 ド メ
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イ ン を 有 す る 、 非 注 釈 タ ン パ ク 質 配 列 の 発 見 に よ っ て 同 定 さ れ た 。 他 の TNFRを 有 す る こ の
システインに富んだドメインは、腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーに対する
ztnfr14の 相 同 性 を 明 ら か に し た 。 BAFF-R (ztnfr12) 、 BCMA、 TWEAKR、 EDAR、 XEDAR、 TAC
Iお よ び MK61の マ ウ ス お よ び ヒ ト 配 列 と の ztnfr14の ア ラ イ ン メ ン ト は 図 1A∼ 図 1Dに 含 め ら
れている。
【００５４】
構 造 的 に 、 TNFレ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー は 、 歴 史 的 に 「 シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 」 と
呼ばれるいくつかの分子から構成された細胞外部分により特徴づけられる。プロトタイプ
の フ ァ ミ リ ー メ ン バ ー は 4つ の こ れ ら の 擬 反 復 を 有 し 、 各 々 は 約 29∼ 43残 基 長 さ で あ り 、 1
つ は 他 の 直 後 に 存 在 す る が 、 フ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー は 1程 度 に す く な い 反 復 を も つ こ と が
10
見 出 さ れ た 。 典 型 的 な 擬 反 復 は 6シ ス テ イ ン 残 基 を 有 す る 。 そ れ ら は 擬 反 復 と 呼 ば れ る 。
なぜなら、それらは共通の祖先分子に由来するように思われるが、正確に反復することが
で き な い か ら で あ る 。 TNFレ セ プ タ ー の 結 晶 構 造 は 、 各 擬 反 復 が 普 通 に 1つ の フ ォ ー ル デ ィ
ングドメインに対応すること、および一般に、擬反復の多数のコピーが同一三次元構造に
折りたたまれ、ジサルファイド結合により内部的に一緒に保持されることを明らかにした
。
【００５５】
Ztnfr14の 推 定 さ れ た ア ミ ノ 酸 配 列 の 配 列 分 析 は 、 1つ の 細 胞 外 の シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬
反 復 の 存 在 を 示 す (一 般 に 配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80か ら な る が 、 こ の 配 列 の 上 流 に 存 在 す
る シ ス テ イ ン は 生 物 学 的 機 能 に 関 係 づ け ら れ る ) 。 こ の 型 の 擬 反 復 構 造 は TNFレ セ プ タ ー
20
の TACI/BCMA/BAFF-R/TWEAKRサ ブ グ ル ー プ に 最 も 密 接 に 関 係 づ け ら れ る 。 図 2は 、 こ の グ ル
ープのレセプターのシステインに富んだドメインのアラインメントである。この図面に図
解 さ れ て い る よ う に 、 ztnfr14の シ ス テ イ ン に 富 ん だ ド メ イ ン は 、 TNFRの シ ス テ イ ン に 富
ん だ ド メ イ ン に 典 型 的 に 見 ら れ る 6シ ス テ イ ン の う ち の 4つ (す な わ ち 、 Cys51、 Cys63、 Cy
s66お よ び Cys79) を 保 存 す る 。
【００５６】
さ ら に 、 最 近 ztnfr14の Asp58は 活 性 の た め に 必 要 で あ る こ と が 示 さ れ た BAFF-Rの Asp26
を 保 存 す る (Cordon 他 、 Biochemistry 42: 5977-5983、 2003) 。 「 シ ス テ イ ン 1-2」 対
間 に 典 型 的 に は 12残 基 が 存 在 す る が 、 XEDARお よ び ztnfr14の 両 方 に お い て 11が 存 在 す る 。
ま た 、 こ の ド メ イ ン の 一 般 的 近 傍 に お け る 追 加 の 他 の シ ス テ イ ン (Cys30、 Cys31お よ び Cy
30
s41) は 、 生 物 学 的 機 能 に 必 要 な ztnfr14の 細 胞 外 ド メ イ ン の タ ン パ ク 質 構 造 に 重 要 な ジ サ
ル フ ァ イ ド 結 合 、 す な わ ち 、 ztnfr14リ ガ ン ド の 結 合 に 関 係 づ け る こ と が で き る 。
【００５７】
シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 は 、 TNFリ ガ ン ド の 既 知 の リ ガ ン ド 結 合 部 位 で あ る 。 こ う し
て 、 リ ガ ン ド の 結 合 に 最 も 関 係 が あ る と 思 わ れ る ztnfr14の ア ミ ノ 酸 配 列 は 配 列 番 号 2の 残
基 18∼ 80内 に 存 在 す る 。
さ ら に 、 タ ン パ ク 質 は 配 列 番 号 2の ほ ぼ 残 基 1∼ 18に 位 置 す る シ グ ナ ル 配 列 を 含 ん で な る
。 成 熟 タ ン パ ク 質 の 切 断 は 、 ヒ ト 配 列 に つ い て ア ミ ノ 酸 Lys-Ser-Metお よ び マ ウ ス に つ い
て Lys-Ser-Thrで あ る と 考 え ら れ る (配 列 番 号 2お よ び 配 列 番 号 4の 残 基 19∼ 21) 。
【００５８】
40
ま た 、 タ ン パ ク 質 は 、 ト ラ ン ス メ ン ブ ラ ン ド メ イ ン (配 列 番 号 2の ほ ぼ 残 基 108∼ 131)
お よ び 細 胞 質 ま た は シ グ ナ リ ン グ ド メ イ ン (配 列 番 号 2の ほ ぼ 残 基 131∼ 198) を 含 ん で な
る 。 成 熟 膜 結 合 ztnfr14タ ン パ ク 質 は 、 配 列 番 号 2の ア ミ ノ 酸 残 基 18∼ 198を 含 ん で な る 。
当業者は認識するように、これらのドメインの境界は近似であり、そして既知のタンパク
質とのアラインメントおよびタンパク質フォールディングの予測に基づく。これらの特徴
は 、 配 列 番 号 1の DNA配 列 に よ り コ ー ド さ れ る レ セ プ タ ー が TNFレ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー の メ
ンバーであることを示す。
【００５９】
Ztnfr14の リ ン カ ー 領 域 (配 列 番 号 2の 残 基 108∼ 131) は 、 リ ガ ン ド に 対 す る 残 基 の 結 合
のために不必要であることがある。こうして、その一部分は可溶性レセプターの構築物か
50
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ら 欠 失 さ せ る こ と が で き る 。 し た が っ て 、 可 溶 性 レ セ プ タ ー の 構 築 物 は 、 配 列 番 号 2の 残
基 18∼ 108間 の 範 囲 か ら 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 131程 度 の 長 さ ま で あ る こ と を 予 測 す る こ と が
で き る が 、 ま た 、 必 要 な 生 物 学 的 活 性 、 す な わ ち 、 ztnfr14の リ ガ ン ド の 結 合 性 を 示 す よ
り短い分子が考えられる。
【００６０】
本 発 明 の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は 多 数 の 組 織 に 由 来 す る ESTラ イ ブ ラ リ ー に お い て 見 ら れ た
が 、 そ れ ら は 胃 、 子 宮 お よ び 癌 性 組 織 の ESTラ イ ブ ラ リ ー に お け る よ り も 優 勢 を 占 め る 。
特に、腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、黒色腫およびリンパ腫における発現が過度に表示さ
れる。腫瘍細胞における発現は、生長調節、分化および腫瘍発生に関連することが見出さ
れ た TNFRフ ァ ミ リ ー の 他 の メ ン バ ー と 一 致 す る 。
10
【００６１】
ヒ ト 染 色 体 1上 の ゲ ノ ム ク ロ ー ン AL390719に 対 す る ヒ ト ztnfr14の 染 色 体 の 局 在 化 は 決 定
さ れ 、 1q36.3に 位 置 決 定 さ れ た 。 150 kb内 に 2つ の 他 の TNFR遺 伝 子 : OX40 (TNRSF4) お よ
び GITR (TNRSF18) が 存 在 し 、 そ し て 4つ の 他 の 遺 伝 子 (DR3、 TNFR2、 CD30お よ び 4-1BB)
が こ の ゲ ノ ム 位 置 内 に 存 在 す る 。 同 様 に 、 マ ウ ス ztnfr14は 染 色 体 4 (E領 域 ) 上 の シ ン テ
ニ ッ ク 領 域 中 に 位 置 す る 。 ヒ ト ゲ ノ ム に お け る よ う に 、 マ ウ ス TNFR遺 伝 子 の 同 一 組 は こ の
位置に見出される。
【００６２】
本 発 明 は 、 本 明 細 書 に 開 示 す る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 、 DNAお よ び RNA分 子
を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は容易に認識するように、遺伝暗
20
号のデジェネラシーにかんがみて、これらのポリヌクレオチド分子の間でかなりの配列の
変 動 が 可 能 で あ る 。 配 列 番 号 33は 、 配 列 番 号 2の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る す べ て
の DNAを 包 含 す る 縮 重 DNA配 列 で あ る 。 当 業 者 は 認 識 す る よ う に 、 配 列 番 号 33の 縮 重 配 列 は
、 ま た 、 Uを Tで 置 換 す る こ と に よ っ て 配 列 番 号 2を コ ー ド す る す べ て の RNA配 列 を 提 供 す る
。
【００６３】
こ う し て 、 配 列 番 号 1の ヌ ク レ オ チ ド 1∼ ヌ ク レ オ チ ド 1853を 含 ん で な る ztnfr14ポ リ ペ
プ チ ド を コ ー ド す る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 、 お よ び そ れ ら の RNA同 等 物 は 本 発 明 に 包 含 さ れ る
。 縮 重 ヌ ク レ オ チ ド 位 置 を 表 す た め に 配 列 番 号 33内 で 使 用 し た 1文 字 コ ー ド を 表 1に 記 載 す
る 。 「 解 」 は コ ー ド 文 字 に よ り 表 さ れ る ヌ ク レ オ チ ド で あ る 。 「 相 補 体 」 は 1ま た は そ れ
以 上 の 相 補 的 ヌ ク レ オ チ ド の コ ー ド を 示 す 。 例 え ば 、 コ ー ド Yは Cま た は Tを 表 し 、 そ し て
そ の 相 補 体 Rは Aま た は Gを 表 し 、 Aは Tに 対 し て 相 補 的 で あ り 、 そ し て Gは Cに 対 し て 相 補 的
である。
【００６４】
30
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【表１】
10
20
【００６５】
所 定 の ア ミ ノ 酸 に つ い て す べ て の 可 能 な コ ド ン を 包 含 す る 、 配 列 番 号 33に お い て 使 用 す
る 縮 重 コ ド ン を 表 2に 記 載 す る 。
【００６６】
30
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【表２】
10
20
30
40
【００６７】
当業者は認識するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代表する縮
重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セリンの縮重コドン (
WSN)は 、 あ る 環 境 に お い て 、 ア ル ギ ニ ン (AGR)を コ ー ド す る こ と が で き 、 そ し て ア ル ギ ニ
50
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ン の 縮 重 コ ド ン (MGN)は 、 あ る 環 境 に お い て 、 セ リ ン (AGY)を コ ー ド す る こ と が で き る 。
同様な関係がフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在する。した
がって、縮重配列に包含される、いくつかのポリヌクレオチドは変異型アミノ酸配列をコ
ー ド す る こ と が で き る が 、 当 業 者 は 、 配 列 番 号 2、 4、 30ま た は 32の ア ミ ノ 酸 配 列 を 参 照 す
ることによって、このような変異型配列を容易に同定することができる。変異型配列は、
本明細書において記載するように、機能性について容易に試験することができる。
【００６８】
本 発 明 は 、 ztnfr14タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 、 DNAお よ び RNAを 包 含 す る 、 ポ リ ヌ ク レ オ
チドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、センス鎖; および二本鎖としてそれぞれ
の 水 素 結 合 に よ り 一 緒 に ア ニ ー ル し た セ ン ス 鎖 お よ び ア ン チ セ ン ス 鎖 の 両 方 を 有 す る DNA
10
を 包 含 す る 。 ztnfr14タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 代 表 的 DNA配 列 は 、 配 列 番 号 1、 3、 29お よ び
31に 記 載 さ れ る 。 当 業 者 は 、 他 の ztnfr14タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る DNA配 列 を 遺 伝 暗 号 に 基
づいて容易に発生させることができる。
【００６９】
また、当業者は認識するように、異なる種は 「優先的コドン使用頻度」 を示すことが
できる。特定種の優先的コドンを、この分野において知られている種々の技術により、本
発 明 の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド の 中 に 導 入 す る こ と が で き る 。 組 換 え DNAの 中 へ の 優 先 的 コ ド ン
の導入は、例えば、特定の細胞のタイプまたは種内のタンパク質の翻訳を効率よくするこ
と に よ っ て 、 タ ン パ ク 質 の 産 生 を 増 強 す る こ と が で き る 。 し た が っ て 、 配 列 番 号 33に 開 示
されている縮重コドンの配列は、この分野において普通に使用されかつ本明細書において
20
開示する、種々の細胞のタイプおよび種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するた
めの鋳型として働く。優先的コドンを含有する配列を、本明細書において開示するように
、種々の種における発現について試験し、発現のために最適化し、そして機能性について
試験することができる。
【００７０】
本 発 明 の 好 ま し い 態 様 に お い て 、 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は 配 列 番 号 1、 3、 29、 31
の同様なサイズの領域、またはそれらに対して相補的である配列に対してストリンジェン
ト条件下にハイブリダイゼーションするであろう。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼー
ションは、この分野においてよく知られており、そして多数の用途に広く使用されている
、 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Sambrook他 、 Molecular Cloning: A Laboratory Ma
30
nual、 第 2版 、 Cold Spring Harbor、 NY、 1989; Ausubel他 、 編 、 Current Protocols in M
olecular Biology、 John Wiley and Sons, Inc.、 NY、 1987; Bergerお よ び Kimmel、 編 、
Guide to Molecular Cloning Techniques、 Methods in Enzymology、 Vol. 152、 1987お よ
び Wetmur、 Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227-59、 1990。 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド の ハ
イブリダイゼーションは、二重らせんハイブリッドを形成する単一の標準相補的配列の能
力 を 利 用 す る 。 こ の よ う な ハ イ ブ リ ッ ド は 、 DNA-DNA、 RNA-RNAお よ び DNA-RNAを 包 含 す る
。
【００７１】
例 示 と し て 、 変 異 型 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 核 酸 分 子 を 、 配 列 番 号 1、 3、 29
ま た は 31の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 (ま た は そ れ ら の 相 補 体 )を 有 す る 核 酸 分 子 と 65℃ に お い て E
xpressHyb
T M
40
ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 溶 液 (CLONTECH Laboratories, Inc.、 カ リ フ ォ ル ニ
ア州パルアルト) 中で一夜ハイブリダイゼーションさせることができる。当業者はこれら
のハイブリダイゼーション条件の変更を案出することができる。
【００７２】
ハイブリダイゼーション後、核酸分子をストリンジェント条件下に、または高度にスト
リンジェントな条件下に洗浄して非ハイブリダイゼーション核酸分子を除去する。典型的
な ス ト リ ン ジ ェ ン ト 洗 浄 条 件 は 、 0.5× ∼ 2× SSCお よ び 0.1％ の ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム (
SDS)の 溶 液 中 の 55∼ 65℃ に お け る 洗 浄 を 包 含 す る 。 す な わ ち 、 変 異 型 ztnfr14ポ リ ペ プ チ
ド を コ ー ド す る 核 酸 分 子 は 配 列 番 号 1、 3、 29ま た は 31の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 (ま た は そ れ ら
の 補 体 )を 有 す る 核 酸 分 子 と ス ト リ ン ジ ェ ン ト 洗 浄 条 件 下 に ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ
50
(18)
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、 こ こ で 洗 浄 ス ト リ ン ジ ェ ン ト は 55∼ 65℃ に お け る 0.1× ∼ 2× SSCお よ び 0.1％ の SDSに 等
し く 、 55℃ に お け る 0.1× SSCお よ び 0.1％ の SDS、 ま た は 65℃ に お け る 2× SSCお よ び 0.1％
の SDSを 包 含 す る 。 当 業 者 は 、 例 え ば 、 洗 浄 溶 液 中 の SSCを SSPEと 置 換 す る こ と に よ っ て 、
同等条件を容易に案出することができる。
【００７３】
ま た 、 本 発 明 は 、 2つ の 基 準 を 使 用 し て 同 定 で き る 、 ztnfr14の 変 異 型 核 酸 分 子 を 包 含 す
る : 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32の ア ミ ノ 酸 配 列 を も つ コ ー ド さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 間 の 類 似
性 の 決 定 (後 述 す る ) 、 お よ び 前 述 し た よ う な ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン ア ッ セ イ 。 こ の よ
う な ztnfr14変 異 型 は 下 記 の 核 酸 分 子 を 包 含 す る : (1) ス ト リ ン ジ ェ ン ト 洗 浄 条 件 下 に 配
列 番 号 1、 3、 29ま た は 31の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 (ま た は そ れ ら の 補 体 )を 有 す る 核 酸 分 子 と
10
ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン す る 核 酸 分 子 、 こ こ で 洗 浄 ス ト リ ン ジ ェ ン シ イ は 55∼ 65℃ に お け
る 0.1× ∼ 2× SSC、 0.1％ の SDSに 等 し い 、 お よ び (2) 配 列 番 号 2、 4、 30ま た は 32の ア ミ ノ
酸 配 列 に 対 し て 少 な く と も 80％ 、 好 ま し い 少 な く と も 90％ 、 よ り 好 ま し く は 少 な く と も 95
％ の ま た は 95％ よ り 大 き い 配 列 の 同 一 性 を 有 す る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 核 酸 分 子 。
【００７４】
選 択 的 に 、 ztnfr14変 異 型 は 、 (1) 高 度 に ス ト リ ン ジ ェ ン ト の 洗 浄 条 件 下 に 配 列 番 号 1
、 3、 29ま た は 31の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 (ま た は そ れ ら の 補 体 )を 有 す る 核 酸 分 子 と ハ イ ブ リ
ダ イ ゼ ー シ ョ ン す る 核 酸 分 子 、 こ こ で 洗 浄 ス ト リ ン ジ ェ ン シ イ は 50∼ 65℃ に お け る 0.1×
∼ 0.2× SSC、 0.1％ の SDSに 等 し い 、 お よ び (2) 配 列 番 号 2、 4、 30ま た は 32の ア ミ ノ 酸 配
列 に 対 し て 少 な く と も 80％ 、 好 ま し く は 少 な く と も 90％ 、 よ り 好 ま し く は 少 な く と も 95％
20
の ま た は 95％ よ り 大 き い 配 列 の 同 一 性 を 有 す る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 核 酸 分 子 と し て
特徴づけることができる。
【００７５】
新 し い フ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー を 同 定 す る ツ ー ル と し て 、 ztnfr14の シ ス テ イ ン に 富 ん だ
擬反復ドメイン中の高度に保存されたアミノ酸を使用することができる。例えば、逆転写
-ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 (RT-PCR)を 使 用 し て 、 種 々 の 組 織 源 ま た は 細 胞 系 統 か ら 得 ら れ た
RNAか ら の 保 存 さ れ た シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 ド メ イ ン を コ ー ド す る 配 列 を 増 幅 す る こ
と が で き る 。 特 に 、 ztnfr14配 列 か ら 設 計 さ れ た 高 度 に 縮 重 の プ ラ イ マ ー は こ の 目 的 に 有
用である。
【００７６】
30
前 述 し た よ う に 、 本 発 明 の 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は DNAお よ び RNAを 包 含 す る 。 DN
Aお よ び RNAを 調 製 す る 方 法 は こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て い る 。 一 般 に 、 RNAは 大 量 の ztnfr
14 RNAを 産 生 す る 組 織 ま た は 細 胞 か ら 単 離 さ れ る 。 こ の よ う な 組 織 お よ び 細 胞 は ノ ザ ン ブ
ロ ッ テ ィ ン グ (Thomas、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201、 1980) お よ び in situハ
イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り 同 定 さ れ る 。 全 RNAは グ ア ニ ジ ン イ ソ チ オ シ ア ネ ー ト 抽 出 を
使 用 し 、 次 い で CsCl勾 配 中 の 遠 心 に よ り 単 離 す る こ と に よ っ て 調 製 す る こ と が で き る (Ch
irgwin他 、 Biochemistry 18: 52-94、 1979) 。 ポ リ (A)
+
RNAは 全 RNAか ら Avivお よ び Lede
r (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12、 1972) の 方 法 を 使 用 し て 調 製 さ れ る 。 相
+
補 的 DNA (cDNA)は ポ リ (A) RNAか ら 既 知 の 方 法 を 使 用 し て 調 製 さ れ る 。 別 法 に お い て 、 ゲ
ノ ム DNAを 単 離 す る こ と が で き る 。 次 い で ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る ポ リ ヌ ク レ オ
40
チ ド を 、 例 え ば ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン ま た は PCRに よ り 、 同 定 し 、 単 離 す る 。
【００７７】
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 全 長 の ク ロ ー ン は 慣 用 ク ロ ー ニ ン グ 手 順 に よ り 得 る
こ と が で き る 。 相 補 的 DNA (cDNA) ク ロ ー ン は 好 ま し い が 、 あ る 用 途 (例 え ば ト ラ ン ス ジ
ェニック動物における発現) のためにゲノムクローンを使用するか、あるいは少なくとも
1つ の ゲ ノ ム イ ン ト ロ ン を 含 む よ う に cDNAク ロ ー ン を 修 飾 す る こ と が 好 ま し い こ と が あ る
。 cDNAお よ び ゲ ノ ム ク ロ ー ン を 調 製 す る 方 法 は こ の 分 野 に お い て よ く 知 ら れ て お り 、 当 業
者のレベルの範囲内であり、そしてライブラリーのプロービングまたはプライミングのた
めに本明細書に記載する配列、またはその一部分を使用することを包含する。発現ライブ
ラ リ ー を ztnfr14に 対 す る 抗 体 ま た は 他 の 特 異 的 結 合 相 手 で プ ロ ー ビ ン グ す る こ と が で き
50
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る。
【００７８】
ま た 、 本 発 明 は 、 単 離 さ れ 、 精 製 さ れ た ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ を 提 供 す る
。 こ の よ う な ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ は RNAま た は DNAで あ る こ と が で き る 。 DNAは cDNA
ま た は ゲ ノ ム DNAで あ る こ と が で き る 。 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ は 一 本 鎖 ま た は 二 本 鎖
の DNAま た は RNA、 一 般 に 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド で あ る が 、 ク ロ ー ニ ン グ さ れ た cDNAま た
は ゲ ノ ム 配 列 か ら 発 生 さ せ る こ と が で き 、 一 般 に 少 な く と も 16ヌ ク レ オ チ ド 、 よ り し ば し
ば 17ヌ ク レ オ チ ド ∼ 25ま た は そ れ 以 上 の ヌ ク レ オ チ ド 、 と き ど き 40∼ 60ヌ ク レ オ チ ド 、 お
よ び あ る 場 合 に お い て 、 実 質 的 な 部 分 、 ド メ イ ン ま た は さ ら に 全 ztnfr14遺 伝 子 ま た は cDN
Aを 含 ん で な る で あ ろ う 。
10
【００７９】
本 発 明 の 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド は 、 代 表 的 な ztnfr14 DNA配 列 (配 列 番 号 1、 3、 29ま
た は 31) ま た は そ れ ら の 補 体 に 対 し て 少 な く と も 80%の 同 一 性 を 有 す る 。 ま た 、 本 発 明 は
、 配 列 番 号 1、 3、 29ま た は 31の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ま た は 配 列 番 号 1、 3、 29ま た は 31に 対 し
て 相 補 的 な 配 列 の 少 な く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド を 含 ん で な る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド
のプローブまたはプライマーを提供する。
【００８０】
プ ロ ー ブ を 構 成 す る た め に 好 ま し い 領 域 は 、 5’ お よ び /ま た は 3’ コ ー デ ィ ン グ 配 列 、
リガンド結合領域、およびシグナル配列およびその他を包含する。ポリヌクレオチドプロ
ーブを発生させる技術およびハイブリダイゼーション技術は、この分野において知られて
20
お り 、 そ し て 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と ： Ausubel 他 、 Current Protocols in Mol
ecular Biology、 John Wiley and Sons, Inc.、 NY、 1991。 プ ロ ー ブ と し て 使 用 す る た め
に、分子を、例えば、酵素、ビオチン、放射性核種、発蛍光団、化学発光性粒子およびそ
の 他 (こ れ ら は 多 数 の 源 、 例 え ば 、 Molecular Probes, Inc.、 Eugene、 ORお よ び Amersham
Cop.、 イ リ ノ イ 州 ア ー リ ン ト ン ハ イ ツ か ら 商 業 的 に 入 手 可 能 で あ る ) で こ の 分 野 に お い
てよく知られている技術に従い標識化して検出可能なシグナルを発生させる。
【００８１】
ま た 、 こ の よ う な プ ロ ー ブ を ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に お い て 使 用 し て 試 料 中 の ztnfr1
4遺 伝 子 ま た は mRNA転 写 物 の 存 在 を 検 出 し 、 ま た は そ の 量 を 定 量 化 す る こ と が で き る 。 フ
ル オ レ セ ン ト in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン (FISH) ま た は 免 疫 組 織 化 学 の よ う な 技 術
30
に 従 い 、 診 断 の 目 的 で ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ を 使 用 し て DNAま た は RNAタ ー ゲ
ッ ト に ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ る こ と が で き る 。 Ztnfr14様 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る
遺伝子を同定するために、ポリヌクレオチドプローブを使用することができる。例えば、
ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド を PCR反 応 に お い て 使 用 し て 、 TNFRフ ァ ミ リ ー の 新 規 な メ ン バ ー
を同定することができる。また、このようなプローブを使用して、新規な腫瘍壊死因子レ
セプターをコードする関係する配列をスクリーニングすることができる。
【００８２】
このようなスクリーニングは、実質的に相同的であるが、プローブ配列に対して完全な
相同性を必要としない配列の同定を可能とする、低いストリンジェンシイ条件下に実施さ
れるであろう。このような方法および条件はこの分野においてよく知られており、そして
40
例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Sambrook 他 、 Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual、 第 2版 、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 コ ー ル ド ス プ リ ン グ ハ ー バ ー 、 1989。 こ の よ う な 低 い ス ト リ
ン ジ ェ ン シ イ の 条 件 は 、 42℃ よ り 低 い ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 温 度 、 50%よ り 低 い ホ ル ム
アミド濃度および中程度∼低い塩濃度を包含することができるであろう。
【００８３】
ラ イ ブ ラ リ ー を ゲ ノ ム DNAま た は cDNAか ら 作 る こ と が で き る 。 ま た 、 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド
プローブは、サザン、ノザンまたはスロットブトット、コロニーおよびプラークハイブリ
ダ イ ゼ ー シ ョ ン お よ び in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に お い て 有 効 で あ る 。 異 な る ztnf
r14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ の 混 合 物 を 調 製 す る こ と が で き 、 こ れ ら は ス ク リ ー ニ ン グ
系における低いコピー数のターゲットの感度および検出を増加させるであろう。
50
(20)
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【００８４】
さらに、ポリヌクレオチドプローブを使用して、個々の染色体上の対応配列に対してハ
イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ る こ と が で き る 。 染 色 体 の 同 定 お よ び /ま た は ztnfr14遺 伝 子 の
マッピングは、遺伝子の機能および疾患の関連に関する情報を提供できるであろう。多数
の マ ッ ピ ン グ 技 術 、 例 え ば 、 体 細 胞 ハ イ ブ リ ッ ド の マ ッ ピ ン グ 、 お よ び 蛍 光 in situ ハ イ
ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン (FISH) を 当 業 者 は 利 用 す る こ と が で き る 。 好 ま し い 方 法 は 放 射 線 ハ
イブリッドマッピングである。放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳動物染色体の高い
分 解 能 の 隣 接 す る マ ッ プ を 構 築 す る た め に 開 発 さ れ た 、 体 細 胞 遺 伝 技 術 で あ る (Cox 他 、
Science 250: 245-50、 1990) 。 遺 伝 子 配 列 の 部 分 的 ま た は 完 全 な 知 識 は 、 染 色 体 放 射 線
ハ イ ブ リ ッ ド マ ッ ピ ン グ パ ネ ル と と も に 使 用 す る た め に 適 当 な PCRプ ラ イ マ ー の 設 計 を 可
10
能とする。ヒトゲノム全体をカバーする商業的に入手可能な放射線ハイブリッドマッピン
グ パ ネ ル 、 例 え ば 、 Stanford G3 PH Panelお よ び GeneBridge 4 RH Panel (Research Gene
tics, Inc.、 ア ラ バ マ 州 ハ ン ツ ヴ ィ レ ) は 利 用 可 能 で あ る 。
【００８５】
こ の パ ネ ル は 、 問 題 の 領 域 内 の 遺 伝 子 、 配 列 ス タ ッ ガ ー ド 部 位 (STS) お よ び 他 の 非 多
形 性 お よ び 多 形 性 マ ー カ ー の 急 速 な PCRに 基 づ く 染 色 体 の 位 置 決 定 お よ び 排 列 を 可 能 と す
る。これは、新しく発見された問題の遺伝子と以前にマッピングされたマーカーとの間の
直接的比例的物理的距離を含む。遺伝子位置の正確な知識は、下記を包含する多数の方法
に お い て 有 効 で あ る : 1) 配 列 が 現 存 す る コ ン テ ィ グ の 一 部 分 で あ る か ど う か の 決 定 お よ
び 種 々 の 形 態 、 例 え ば 、 YAC、 BACま た は cDNAク ロ ー ン の 追 加 の 取 り 囲 む 遺 伝 子 配 列 を 得 る
20
方 法 、 2) 同 一 染 色 体 領 域 に 対 す る 連 鎖 を 示 す 遺 伝 性 疾 患 の 可 能 な 候 補 遺 伝 子 を 提 供 す る
方 法 、 お よ び 3) モ デ ル 生 物 、 例 え ば 、 特 定 の 遺 伝 子 が ど ん な 機 能 を 有 す る こ と が で き る
かの決定を促進するとき有益であるマウスを相互参照する方法。
【００８６】
ま た 、 本 明 細 書 に 開 示 す る ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を プ ロ ー ブ ま た は プ ラ イ マ ー
と し て 使 用 し て 、 ztnfr14遺 伝 子 の 5' 非 コ ー デ ィ ン グ 領 域 を ク ロ ー ニ ン グ す る こ と が で き
る 。 特 に 、 上 流 領 域 は AP-1結 合 部 位 を 含 む 。 転 写 因 子 (TF) の 結 合 特 異 性 が 低 い た め に 、
個々の結合部位の予測は高い率の誤った陽性を有する。したがって、単離における結合部
位 の 予 測 は 、 in vivo に お け る 機 能 的 役 割 を 有 す る 結 合 部 位 の 同 定 の た め に 実 際 的 用 途 を
ほとんど、あるいはまったくもたない。しかしながら、配列特異的機能を有すると推定さ
30
れる予測された結合部位は、保存に基づくフィルターにより選択することができる: 調節
領域が他の非コーディング領域よりも種間でしばしばいっそう強く保存されるという生物
学的観察を定量化して、系統発生的フットプリントと呼ばれてきている保存パターンを明
ら か に す る こ と が で き る (Fickettお よ び Wasserman、 Curr. Opin. Biotechnol. 11: 19-2
4、 2000) 。 特 に 、 ヒ ト -齧 歯 類 の 比 較 は 、 機 能 的 調 節 因 子 の 同 定 の た め の 価 値 の あ る リ ソ
ー ス を 証 明 し た (Wasserman 他 、 Nat. Genet. 26: 225-228、 2000) 。
【００８７】
TRANSFACデ ー タ ベ ー ス (バ ー ジ ョ ン 3.0、 Wingender 他 、 Nucleic Acids Res. 28: 316319、 2000) か ら 抜 き 出 し た 標 準 的 位 置 ウ ェ ー ト マ ト リ ッ ク ス (Fickett、 Mol. Cell. Bio
l. 16: 437-441、 1996) な ら び に 発 表 さ れ た TF結 合 部 位 を 使 用 し て ハ ウ ス 内 で 組 立 て た い
40
く つ か の マ ト リ ッ ク ス を 使 用 し て 、 個 々 の 転 写 因 子 結 合 部 位 を 検 索 し た 。 TFの 他 の 組 を 含
む発表された研究に基づいて、マウスおよびヒトの間で十分に保存された大部分の天然結
合 部 位 は 使 用 し た ス コ ア 範 囲 に お い て 検 出 さ れ る こ と を 期 待 で き る (Fickett、 Mol. Cell
. Biol. 16: 437-441、 1996; Wasserman 他 、 J. Mol. Biol. 278: 167-181、 1998) 。
34 TFの 組 の 結 合 部 位 の 検 索 は 、 転 写 開 始 部 位 に 関 し て 下 記 の 位 置 に お け る NF-ATお よ び
AP-2に つ い て の 推 定 部 位 の 同 定 に 導 い た :
【００８８】
ヒト マウス
NF-AT -191 -157
AP-2 -107 -82
50
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【００８９】
転 写 因 子 AP-2は 分 化 お よ び 形 質 転 換 に 関 係 付 け ら れ る 。 推 定 上 の 結 合 部 位 は 、 TNFRフ ァ
ミ リ ー の メ ン バ ー の プ ロ モ ー タ ー 中 に 見 出 さ れ た (Yoo 他 、 DNA Cell Biol. 15: 377-385
、 1996) 。 最 近 発 表 さ れ た 発 見 は 、 AP-2が 細 胞 周 期 の 停 止 お よ び ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る
こ と に よ っ て 細 胞 の 増 殖 を 阻 害 す る こ と 、 お よ び AP-2ア ル フ ァ の 使 用 が 療 法 的 戦 略 単 独 ま
た は 化 学 療 法 と の 組 合 わ せ で 探 求 さ れ る べ き で あ る こ と を 示 唆 す る (Wajapeyee 他 、 J. B
iol. Chem. epub Oct 9、 2003) 。 AP-2に よ り 収 集 さ れ た 遺 伝 子 は 癌 細 胞 に お い て 過 剰 に
発現されることがある。
【００９０】
NF-ATは T細 胞 の 活 性 化 お よ び 分 化 の コ ン ト ロ ー ル に お い て 重 要 な 役 割 を 演 じ 、 そ し て ま
10
た 、 Tリ ン パ 球 の 細 胞 周 期 お よ び ア ポ ト ー シ ス の コ ン ト ロ ー ル に お い て 重 要 な 役 割 を 演 ず
る と 推 定 さ れ る (Serfling 他 、 Biochim. Biophys. Acta 1498: 1-18、 2000) 。
【００９１】
この遺伝子領域は胃、子宮、および種々の癌、例えば、神経芽細胞腫、黒色腫およびリ
ン パ 腫 の 組 織 に お い て 特 異 的 発 現 を 提 供 す る こ と が 期 待 さ れ る の で 、 NF-APお よ び AP-2結
合 部 位 を 含 む ztnfr14遺 伝 子 か ら の プ ロ モ ー タ ー 要 素 を 使 用 し て 、 例 え ば 、 ト ラ ン ス ジ ェ
ニック動物および遺伝子治療で治療される患者において組織特異的発現を指令することが
で き る で あ ろ う 。 ま た 、 5' フ ラ ン キ ン グ 配 列 の ク ロ ー ニ ン グ は 、 米 国 特 許 第 5,641,670号
に 開 示 さ れ て い る よ う に 、 「 遺 伝 子 活 性 化 」 に よ り ztnfr14タ ン パ ク 質 の 産 生 を 促 進 す
る。
20
【００９２】
簡単に述べると、少なくともターゲット配列、調節配列、エクソンおよび不対スプライ
ス ド ナ ー 部 位 を 含 ん で な る DNA構 築 物 を ztnfr14遺 伝 子 座 の 中 に 導 入 す る こ と に よ っ て 、 細
胞 に お け る 内 因 的 ztnfr14遺 伝 子 の 発 現 は 変 更 さ れ る 。 タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ 配 列 は ztnfr14の
5' 非 コ ー デ ィ ン グ 配 列 で あ り 、 こ れ は 構 築 物 と 内 因 的 ztnfr14遺 伝 子 座 と の 相 同 的 組 換 え
を 可 能 と し 、 こ れ に よ り 構 築 物 内 の 配 列 は 内 因 的 ztnfr14コ ー デ ィ ン グ 領 域 と 作 用 可 能 に
連 鎖 す る よ う に な る 。 こ の よ う に し て 、 内 因 的 ztnfr14プ ロ モ ー タ ー を 他 の 調 節 配 列 と 置
換するか、あるいはそれらで補充して、増強された、組織特異的、またはそうでなければ
調節された配列を提供することができる。
【００９３】
30
ま た 、 本 発 明 の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は DNA合 成 法 を 使 用 し て 合 成 す る こ と が で き る 。 現 在
選 択 さ れ る 方 法 は ホ ス ホ ル ア ミ ダ イ ト 法 で あ る 。 化 学 的 に 合 成 さ れ た 二 本 鎖 DNAが 用 途 、
例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントの合成に必要とされる場合、各相補的鎖は別々
に つ く ら れ る 。 短 い 遺 伝 子 (60∼ 80 bp) の 製 造 は 技 術 的 に 簡 単 で あ り 、 相 補 的 鎖 を 合 成
し、次いでそれらをアニーリングすることによって達成することができる。しかしながら
、 よ り 大 き い 遺 伝 子 (>300 bp) の 製 造 に つ い て 、 化 学 的 DNA合 成 間 の 各 サ イ ク ル の カ ッ プ
リ ン グ 効 率 は め っ た に 100％ と な ら な い の で 、 特 別 の 戦 略 を 開 発 し な く て は な ら な い 。
【００９４】
こ の 問 題 を 克 服 す る た め に 、 合 成 遺 伝 子 (二 本 鎖 ) を 20∼ 100ヌ ク レ オ チ ド 長 さ の 一 本
鎖 フ ラ グ メ ン ト か ら モ ジ ュ ー ル 形 態 で 組 立 て る 。 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Glickお よ び P
40
asternak、 Molecular Biology， Principles and Applications of Recombinant DNA、 (A
SM Press、 ワ シ ン ト ン D． C． 1994) ; Itakura他 、 Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356 (198
4) お よ び Climie他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-7、 1990。
【００９５】
本 発 明 は 、 さ ら に 、 他 の 種 か ら の 対 応 物 の ポ リ ペ プ チ ド お よ び ポ リ ヌ ク レ オ チ ド (オ ー
ソログ) を提供する。これらの種は下記のものを包含するが、これらに限定されない: 哺
乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊椎動物および無脊椎動物。特に
興味あるものは、他の哺乳動物種、例えば、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、
ウ マ 、 お よ び 他 の 霊 長 類 の ポ リ ペ プ チ ド か ら の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド で あ る 。 ヒ ト ztnfr14
のオーソログは、本発明により提供される情報および組成物を慣用のクローニング技術と
50
(22)
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組み合わせて使用して、クローニングすることができる。例えば、本明細書において開示
す る よ う に 、 ztnfr14を 発 現 す る 組 織 お よ び 細 胞 タ イ プ か ら 得 ら れ る mRNAを 使 用 し て 、 cDN
Aを ク ロ ー ニ ン グ す る こ と が で き る 。
【００９６】
このような組織は、例えば、胃、子宮、神経芽細胞腫、黒色腫およびリンパ腫を包含す
るであろう。本明細書において開示する配列から設計されたプローブでノザンブロットを
プ ロ ー ビ ン グ す る こ と に よ っ て 、 mRNAの 適 当 な 源 を 同 定 す る こ と が で き る 。 次 い で 、 陽 性
の 組 織 ま た は 細 胞 系 統 の mRNAか ら ラ イ ブ ラ リ ー を 調 製 す る こ と が で き る 。 次 い で 、 種 々 の
方 法 、 例 え ば 、 完 全 な ま た は 部 分 的 ヒ ト cDNAで 、 ま た は 開 示 し た 配 列 を ベ ー ス と す る 1ま
た は そ れ 以 上 の 組 の 縮 重 プ ロ ー ブ で プ ロ ー ビ ン グ す る こ と に よ っ て 、 ztnfr14を コ ー ド す
10
る cDNAを 単 離 す る こ と が で き る 。
【００９７】
ま た 、 本 明 細 書 に 開 示 す る 代 表 的 ヒ ト ztnfr14配 列 か ら 設 計 し た プ ラ イ マ ー を 使 用 す る
ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 、 ま た は PCR (Mullis、 米 国 特 許 第 4,683,202号 )に よ り 、 cDNAを ク
ロ ー ニ ン グ す る こ と が で き る 。 追 加 の 方 法 に お い て 、 cDNAラ イ ブ ラ リ ー を 使 用 し て 宿 主 細
胞 を 形 質 転 換 ま た は ト ラ ン ス フ ェ ク ト す る こ と が で き 、 そ し て ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対
す る 抗 体 で 問 題 の cDNAの 発 現 を 検 出 す る こ と が で き る 。 ま た 、 ゲ ノ ム の ク ロ ー ン の 単 離 に
同様な技術を適用することができる。
【００９８】
当 業 者 は 認 識 す る よ う に 、 配 列 番 号 1に 開 示 す る 配 列 は ヒ ト ztnfr14の 単 一 の ア レ レ を 表
20
し、そしてアレレ変異型および選択的スプライシングが起こることが期待される。配列番
号 1に 開 示 さ れ て い る 遺 伝 子 の エ ク ソ ン 位 置 は 、 ヌ ク レ オ チ ド 位 置 1-32、 33-145、 146-239
、 240-315、 316-411、 412-477、 478-612、 613-638、 639-669お よ び 670-1834で あ る 。 特 に
、 2つ の ス プ ラ イ ス 変 異 型 が 発 見 さ れ た : ztnfr14× 2が 同 定 さ れ 、 こ れ を 配 列 番 号 29お よ
び 30に 開 示 し 、 そ し て ztnfr14× 3が 同 定 さ れ 、 こ れ を 配 列 番 号 31お よ び 32に 開 示 す る 。 こ
れ ら の 変 異 型 は 基 礎 の ztnfr14配 列 と 異 な り 、 ztnfr14× 2は エ ク ソ ン 9Bを 付 加 す る が 、 ztn
fr14× 3は エ ク ソ ン 7Bを 付 加 し 、 こ れ は 停 止 コ ド ン を 含 有 す る 。 こ れ ら の 配 列 の す べ て の 3
つ の ア レ レ 変 異 型 は 、 標 準 手 順 に 従 い 、 異 な る 個 体 か ら の cDNAま た は ゲ ノ ム の ラ イ ブ ラ リ
ーをプロービングすることによって、クローニングすることができる。
【００９９】
30
配 列 番 号 1に 示 す ヌ ク レ オ チ ド 配 列 の ア レ レ 変 異 型 は 、 サ イ レ ン ト 突 然 変 異 体 含 有 す る
も の お よ び 突 然 変 異 が ア ミ ノ 酸 配 列 を 変 化 さ せ る も の を 包 含 し 、 配 列 番 号 2の ア レ レ 変 異
型 で あ る タ ン パ ク 質 と 同 様 に 、 本 発 明 の 範 囲 内 に 入 る 。 交 互 に ス プ ラ イ ス さ れ た mRNAか ら
発 生 し た cDNAは 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 性 質 を 保 持 し 、 こ の よ う な cDNAお よ び mRNAに よ
りコードされるポリペプチドと同様に、本発明の範囲内に入る。これらの配列のアレレ変
異型およびスプライス変異型は、この分野において知られている標準手順に従い、異なる
個 体 ま た は 組 織 か ら の cDNAま た は ゲ ノ ム の ラ イ ブ ラ リ ー を プ ロ ー ビ ン グ す る こ と に よ っ て
、クローニングすることができる。
【０１００】
本 発 明 は 、 ま た 、 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32の ポ リ ペ プ チ ド お よ び そ れ ら の オ ー ソ ロ グ
40
に 実 質 的 に 類 似 す る 単 離 さ れ た ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 提 供 す る 。 こ の よ う な ポ リ ペ プ チ
ド は 、 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32の ポ リ ペ プ チ ド お よ び そ れ ら の オ ー ソ ロ グ に 対 し て 好 ま
し く は 少 な く と も 90％ の 同 一 性 、 よ り 好 ま し く は 95％ ま た は そ れ 以 上 の 同 一 性 を 有 す る で
あろう。配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参照の
こ と : Altschul他 、 Bull. Math. Bio. 48: 603-16、 1986お よ び Henikoffお よ び Henikoff
、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-9、 1992。 簡 単 に 述 べ る と 、 表 3 (ア ミ ノ 酸 は
標 準 1文 字 コ ー ド に よ り 示 さ れ て い る ) に 示 す よ う に Henikoffお よ び Henikoff (前 掲 ) の 1
0の ギ ャ ッ プ オ ー プ ニ ン グ ペ ナ ル テ ィ ー 、 1の ギ ャ ッ プ エ ク ス テ ン シ ョ ン ペ ナ ル テ ィ ー 、 お
よ び 「 ブ ロ サ ム (blosum) 62」 ス コ ア リ ン グ マ ト リ ッ ク ス を 使 用 し て 、 2つ の ア ミ ノ 酸
配列を整列させて整列スコアを最適化する。次いで同一性百分率を次のように計算する:
50
(23)
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【０１０１】
【数１】
【０１０２】
10
【表３】
20
30
40
【０１０３】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、前述した比を使用する同様な方法により決定さ
れる。
当 業 者 は 認 識 す る よ う に 、 2つ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 整 列 さ せ る た め に 有 効 な 多 数 の 確 立 さ
れ た ア ル ゴ リ ズ ム が 存 在 す る 。 Pearsonお よ び Lipmanの 「 FASTA」 類 似 性 の 検 索 ア ル ゴ リ
ズ ム は 、 本 明 細 書 に 開 示 す る ア ミ ノ 酸 配 列 お よ び 推 定 上 の 変 異 型 ztnfr14の ア ミ ノ 酸 配 列
が 共 有 す る 同 一 性 の レ ベ ル を 検 査 す る 、 適 当 な タ ン パ ク 質 整 列 法 で あ る 。 FASTAア ル ゴ リ
50
(24)
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ズ ム は 下 記 の 文 献 に 記 載 さ れ て い る : Pearsonお よ び Lipman、 Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 85: 2444 (1988) お よ び Pearson、 Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) 。
【０１０４】
簡単に述べると、まず、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を考慮しないで、問
題 の 配 列 (例 え ば 、 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32) 、 お よ び 同 一 性 の 最 高 密 度 (ktup変 数 が
1で あ る 場 合 ) ま た は 同 一 性 の 対 (ktup＝ 2で あ る 場 合 ) を 有 す る 試 験 配 列 が 共 有 す る 領 域
を 同 定 す る こ と に よ っ て 、 FASTAは 配 列 の 類 似 性 を 特 性 決 定 す る 。 次 い で 、 ア ミ ノ 酸 置 換
マトリックスを使用してすべての対合アミノ酸の類似性を比較することによって、同一性
の 最 高 密 度 を も つ 10領 域 を 再 ス コ ア リ ン グ し 、 そ し て 最 高 ス コ ア に 寄 与 す る 残 基 の み を 含
む よ う に 、 領 域 の 末 端 を 「 ト リ ミ ン グ 」 す る 。 「 カ ッ ト オ フ 」 値 (配 列 の 長 さ お よ び
10
ktup値 に 基 づ い て 前 も っ て 決 定 し た 式 に よ り 計 算 さ れ る ) よ り 大 き い ス コ ア を も つ 、 い く
つかの領域が存在する場合、トリミングした最初の領域を検査して、領域を結合してギャ
ップをもつ近似整列を形成できるかどうかを決定する。
【０１０５】
最 後 に 、 ア ミ ノ 酸 配 列 の 挿 入 ま た は 欠 失 を 可 能 と す る 、 Needleman-Wunsch-Sellersア ル
ゴ リ ズ ム の 変 法 (Needlemanお よ び Wunsch、 J. Mol. Biol. 48: 444 (1970) ; Sellers、 S
IAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)) を 使 用 し て 、 2つ の ア ミ ノ 酸 配 列 の 最 高 の ス コ ア リ
ン グ 領 域 を 整 列 さ せ る 。 FASTA分 析 の た め の 例 示 的 パ ラ メ ー タ ー は 次 の 通 り で あ る : ktup=
1， ギ ャ ッ プ オ ー プ ニ ン グ ペ ナ ル テ ィ ー =10、 ギ ャ ッ プ エ ク ス テ ン シ ョ ン ペ ナ ル テ ィ ー =1、
お よ び 置 換 マ ト リ ッ ク ス =BLOSUM62。 Pearson、 Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) の 付 録 2
20
に 説 明 さ れ て い る よ う に 、 ス コ ア リ ン グ マ ト リ ッ ク ス フ ァ イ ル ( 「 SMATRIX」 ) を 変 更
す る こ と に よ っ て 、 こ れ ら の パ ラ メ ー タ ー を FASTAプ ロ グ ラ ム の 中 に 導 入 す る こ と が で き
る。
【０１０６】
ま た 、 上 に 開 示 し た 比 を 使 用 し て 核 酸 分 子 の 配 列 の 同 一 性 を 決 定 す る た め に 、 FASTAを
使 用 す る こ と が で き る 。 ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 比 較 す る た め に 、 ktup値 は 1∼ 6、 好 ま し く は
4∼ 6の 範 囲 で あ る こ と が で き る 。
【０１０７】
本 発 明 は 、 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32の ア ミ ノ 酸 配 列 と 比 較 し て 、 1ま た は そ れ 以 上 の
保 存 的 ア ミ ノ 酸 変 化 を 有 す る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 核 酸 分 子 を 包 含 す る 。 BLOSUM62表
30
は 、 関 係 す る タ ン パ ク 質 の 500よ り 多 い グ ル ー プ の 高 度 に 保 存 さ れ た 領 域 を 表 す 、 タ ン パ
ク 質 配 列 セ グ メ ン ト の 約 2,000の 局 所 的 多 重 整 列 か ら 誘 導 さ れ た ア ミ ノ 酸 置 換 マ ト リ ッ ク
ス で あ る (Henikoffお よ び Henikoff、 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992))
。
【０１０８】
したがって、本発明のアミノ酸配列の中に導入することができる保存的アミノ酸置換を
定 め る た め に 、 BLOSUM62置 換 頻 度 を 使 用 す る こ と が で き る 。 本 明 細 書 に お い て 使 用 す る と
き 、 言 語 「 保 存 的 ア ミ ノ 酸 置 換 」 は -1よ り 大 き い BLOSUM62値 に よ り 表 さ れ る 置 換 を 意 味
す る 。 例 え ば 、 置 換 が 0、 1、 2ま た は 3の BLOSUM62値 に よ り 特 徴 づ け ら れ る 場 合 、 ア ミ ノ 酸
置 換 は 保 存 的 で あ る 。 好 ま し い 保 存 的 ア ミ ノ 酸 置 換 は 少 な く と も 1 (例 え ば 、 1、 2ま た は 3
40
) の BLOSUM62値 に よ り 特 徴 づ け ら れ る が 、 よ り 好 ま し い 保 存 的 ア ミ ノ 酸 置 換 は 少 な く と も
2 (例 え ば 、 2ま た は 3) の BLOSUM62値 に よ り 特 徴 づ け ら れ る 。
【０１０９】
配 列 番 号 1、 3、 29お よ び 31に 記 載 す る ヌ ク レ オ チ ド を ヌ ク レ オ チ ド で 置 換 す る こ と に よ
っ て 、 ztnfr14遺 伝 子 に お け る 保 存 的 ア ミ ノ 酸 変 化 を 導 入 す る こ と が で き る 。 こ の よ う な
「保存的アミノ酸」 の変異型は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、リ
ン カ ー -走 査 突 然 変 異 誘 発 、 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 を 使 用 す る 突 然 変 異 誘 発 、 お よ び そ の
他 に よ り 得 る こ と が で き る (下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Ausubel (1995)pp. 8-10∼ 8-22;
お よ び McPherson (編 者 ) 、 Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1
991)) 。 細 胞 -細 胞 の 相 互 作 用 を 促 進 す る こ の よ う な 変 異 型 の 能 力 は 、 標 準 方 法 、 例 え ば
50
(25)
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、 本 明 細 書 に 記 載 す る ア ッ セ イ を 使 用 し て 決 定 す る こ と が で き る 。 選 択 的 に 、 抗 ztnfr14
抗 体 に 特 異 的 に 結 合 す る 能 力 に よ り 、 変 異 型 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 同 定 す る こ と が で き
る。
【０１１０】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野において知られている手順、
例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することが
で き る (Cunninghamお よ び Wells、 Science 244: 1081-5、 1989; Bass他 、 Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 88: 4498-502、 1991) 。 後 者 の 技 術 に お い て 、 単 一 の ア ラ ニ ン の 突 然 変 異
を分子中のすべての残基において導入し、そして、後述するように、生ずる突然変異体分
子を生物学的活性について試験して、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同
10
定 す る 。 ま た 、 Hilton他 、 J. Biol. Chem. 271: 4699-708、 1996参 照 。
【０１１１】
ま た 、 レ セ プ タ ー -リ ガ ン ド の 相 互 作 用 は 、 構 造 の 物 理 的 分 析 に よ り 決 定 す る こ と が で
き、例えば、核磁気共鳴、結晶学、電子回折またはフォトアフィニティー標識化のような
技術と、推定上の接触部位のアミノ酸の突然変異との組み合わせにより決定することがで
き る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : de Vos他 、 Science 255: 306-12、 1992; Smith
他 、 J. Mol. Biol. 224: 899-904、 1992; Wlodaver他 、 FEBS Lett. 309: 59-64、 1992。
ま た 、 必 須 ア ミ ノ 酸 の 同 定 は 、 関 係 す る TNFR様 分 子 と の 相 同 性 か ら 推 定 す る こ と が で き る
。
【０１１２】
20
既知突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載されている
方 法 を 使 用 し て 、 多 重 ア ミ ノ 酸 置 換 を 行 い 、 試 験 す る こ と が で き る : Reidhaar-Olsonお よ
び Sauer、 Science 241: 53-7、 1988ま た は Bowieお よ び Sauer、 Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 86: 2152-6、 1989。 簡 単 に 述 べ る と 、 こ れ ら の 著 者 ら は ポ リ ペ プ チ ド 中 の 2ま た は そ れ
以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異
化ポリペプチドを配列決定して、各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する
方法を開示している。使用できる他の方法は下記の方法を包含する: ファージディスプレ
イ (例 え ば 、 Lowman他 、 Biochem. 30: 10832-7、 1991; Ladner他 、 米 国 特 許 第 5,223,409
号 ; Huse、 WIPO公 開 WO 92/06204) お よ び 領 域 特 異 的 突 然 変 異 誘 発 (Derbyshire他 、 Gene
46: 145、 1986; Ner他 、 DNA 7: 127、 1988) 。
30
【０１１３】
開 示 し た ztnfr14 DNAお よ び ポ リ ペ プ チ ド 配 列 の 変 異 型 を 、 下 記 の 文 献 に 開 示 さ れ て い
る よ う に 、 DNAシ ャ フ リ ン グ に よ り 発 生 さ せ る こ と が で き る : Stemmer、 Nature 370: 38991、 1994; Stemmer、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51、 1994お よ び WIPO公 開 WO
97/20078。 簡 単 に 述 べ る と 、 親 DNAを ラ ン ダ ム フ ラ グ メ ン ト 化 し 、 次 い で PCRに よ り リ ア
セ ン ブ リ ー し て 、 ラ ン ダ ム に 導 入 さ れ た 点 突 然 変 異 を 生 じ さ せ る こ と に よ っ て 、 in vitro
相 同 的 組 換 え に よ り 変 異 型 DNAを 発 生 さ せ る 。 親 DNAの フ ァ ミ リ ー 、 例 え ば 、 ア レ レ 変 異 型
ま た は 異 な る 種 か ら の DNA分 子 を 使 用 し て 、 追 加 の 可 変 性 を プ ロ セ ス の 中 に 導 入 す る こ と
によって、この技術を変更することができる。所望の活性について選択またはスクリーニ
ングし、次いで突然変異誘発およびアッセイをさらに反復して、所望の突然変異を選択す
40
ると同時に有害な変化に対して選択することによって、配列を急速に 「進化」 させる。
【０１１４】
本明細書に開示する突然変異誘発法を大きい処理量の自動化スクリーニング法と組合わ
せて、宿主細胞においてクローニングされ、突然変異化されたポリペプチドの活性を検出
す る こ と が で き る 。 活 性 ポ リ ペ プ チ ド (例 え ば 、 リ ガ ン ド 結 合 活 性 ） を コ ー ド す る 突 然 変
異 化 DNA分 子 を 宿 主 細 胞 か ら 回 収 し 、 現 代 的 装 置 を 使 用 し て 急 速 に 配 列 決 定 す る こ と が で
きる。これらの方法は、問題のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速
な決定を可能とし、未知構造のポリペプチドに適用することができる。
【０１１５】
変 異 型 ztnfr14遺 伝 子 の 特 定 の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 無 視 し て 、 こ の 遺 伝 子 は そ の 細 胞 -細
50
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胞 の 相 互 作 用 活 性 (ztnfr14リ ガ ン ド 結 合 、 腫 瘍 発 生 、 細 胞 増 殖 を 包 含 す る が 、 こ れ ら に
限 定 さ れ な い ) に よ り 、 ま た は 抗 ztnfr14抗 体 に 特 異 的 に 結 合 す る 能 力 に よ り 特 徴 づ け ら
れ る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 。 さ ら に 詳 し く は 、 変 異 型 ztnfr14遺 伝 子 は 、 本 明 細 書 に
記 載 す る ヒ ト ztnfr14遺 伝 子 に よ り コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プ チ ド の 活 性 の 少 な く と も 50％ の
、 好 ま し く は 70、 80ま た は 90％ よ り 大 き い 活 性 を 示 す ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 。
【０１１６】
変 異 型 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は 実 質 的 に 相 同 性 の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 、 1ま た は
それ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化
は小さい特質を有する、すなわち、ポリペプチドのフォールディングまたは活性に有意に
影 響 を 与 え な い 保 存 的 ア ミ ノ 酸 置 換 お よ び 他 の 置 換 ; 典 型 的 に は 1∼ 約 30ア ミ ノ 酸 の 、 小
10
さい欠失; およびアミノ末端またはカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミ
ノ 末 端 の メ チ オ ニ ン 残 基 、 約 20∼ 25残 基 ま で の 小 さ い リ ン カ ー ペ プ チ ド 、 ま た は 親 和 標 識
である。
【０１１７】
こ う し て 、 本 発 明 は 、 配 列 番 号 2、 4、 30ま た は 32の 対 応 す る 領 域 に 対 し て 少 な く と も 85
％ 、 好 ま し く は 少 な く と も 90％ 、 よ り 好 ま し く は 95％ ま た は そ れ 以 上 同 一 で あ る 配 列 を 含
ん で な る 、 40∼ 2000ア ミ ノ 酸 残 基 の ポ リ ペ プ チ ド を 包 含 す る 。 親 和 標 識 を 含 ん で な る ポ リ
ペ プ チ ド は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド と 親 和 標 識 と の 間 に タ ン パ ク 質 分 解 的 切 断 部 位 を さ ら
に 含 む こ と が で き る 。 好 ま し い こ の よ う な 部 位 は 、 ト ロ ン ビ ン 切 断 部 位 お よ び 因 子 Xa切 断
部位を包含する。
20
【０１１８】
変 異 型 お よ び 融 合 タ ン パ ク 質 を 包 含 す る 、 任 意 の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に つ い て 、 当 業
者 は 上 記 表 1お よ び 2に 記 載 さ れ る 情 報 を 使 用 し て 、 そ の 変 異 型 を コ ー ド す る 、 完 全 に 縮 重
のポリヌクレオチド配列を容易に発生させることができる。その上、当業者は標準ソフト
ウェアを使用して、本明細書に記載するヌクレオチドおよびアミノ酸配列をベースとする
ztnfr14変 異 型 を 案 出 す る こ と が で き る 。 し た が っ て 、 本 発 明 は 、 下 記 の 配 列 の 少 な く と
も 1つ を 提 供 す る デ ー タ 構 造 で コ ー ド さ れ た コ ン ピ ュ ー タ ー で 読 取 り 可 能 な 媒 体 を 包 含 す
る : 配 列 番 号 1、 2、 3、 4、 29、 30、 31ま た は 32。
【０１１９】
コンピューターで読取り可能な媒体の適当な形態は、磁気媒体および光学的に読取り可
30
能な媒体を包含する。磁気媒体の例は、ハードまたは固定ドライブ、ランダムアクセスメ
モ リ ー (RAM) チ ッ プ 、 フ ロ ッ ピ ー （ 登 録 商 標 ） デ ィ ス ク 、 デ ィ ジ タ ル 線 状 テ ー プ (DLT)
、 デ ィ ス ク カ シ ェ お よ び ZIPデ ィ ス ク を 包 含 す る 。 光 学 的 に 読 取 り 可 能 な 媒 体 は 、 コ ン パ
ク ト デ ィ ス ク (例 え ば 、 CD-読 出 し 専 用 メ モ リ ー (ROM) 、 CD-再 書 込 み 可 能 な (RW) 、 お
よ び CD-再 記 録 可 能 な ) 、 お よ び デ ィ ジ タ ル 多 角 的 /ビ デ オ デ ィ ス ク (DVD) (例 え ば 、 DVDROM、 DVD-RAM、 お よ び DVD＋ RW) に よ り 例 示 さ れ る 。
【０１２０】
さ ら に 、 本 発 明 は 、 種 々 の 他 の ポ リ ペ プ チ ド 融 合 物 お よ び 1ま た は そ れ 以 上 の ポ リ ペ プ
チド融合物を含んでなる関係するマルチマータンパク質を提供する。例えば、システイン
に 富 ん だ 擬 反 復 ま た は 細 胞 質 ポ リ ペ プ チ ド ド メ イ ン は 、 米 国 特 許 第 5,155,027号 お よ び 米
40
国 特 許 第 5,567,584号 に 開 示 さ れ て い る よ う に 、 二 量 化 タ ン パ ク 質 に 対 す る 融 合 物 と し て
調製することができる。これに関して好ましい二量化タンパク質は、他のシステインに富
ん だ 擬 反 復 ま た は 細 胞 質 ポ リ ペ プ チ ド ド メ イ ン 、 ま た は タ ン パ ク 質 の TNFレ セ プ タ ー フ ァ
ミ リ ー の メ ン バ ー 、 例 え ば 、 APO4、 TNFR-I、 TNFR-IIお よ び TNFR-IIIを 含 ん で な る ポ リ ペ
プチドを包含する。さらに、サイトカインレセプターの細胞外部分を使用して、キメラを
調 製 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 エ リ ト ロ ポ イ エ チ ン の 細 胞 外 ド メ イ ン を ztnfr14ポ リ ペ
プチドのリンカー、トランスメンブランおよび細胞質ドメインに融合させて、二量化を生
成することができる。これらのポリペプチドドメインを遺伝子操作された細胞において発
現 さ せ て 、 種 々 の マ ル チ マ ー TNFR様 ア ナ ロ ー グ を 生 成 す る こ と が で き る 。
【０１２１】
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融合タンパク質はこの分野において知られている方法により融合タンパク質の各成分を
調製し、それらを化学的に結合することによって調製することができる。選択的に、融合
タンパク質の両方の成分を適切なリーディングフレームでコードするポリヌクレオチドを
既知技術により発生させ、本明細書に記載する方法により発現させることができる。例え
ば 、 生 物 学 的 機 能 を 提 供 す る 1ま た は そ れ 以 上 の ド メ イ ン の 一 部 分 ま た は す べ て を 、 他 の
フ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー 、 例 え ば 、 APO4、 TNFR-I、 TNFR-IIお よ び TNFR-IIIか ら の 1ま た は そ
れ 以 上 の 機 能 的 同 等 な ド メ イ ン と 、 本 発 明 の ztnfr14間 で 交 換 す る こ と が で き る 。
【０１２２】
このようなドメイン下記のものを包含するが、これらに限定されない: 保存されたモチ
ーフ、例えば、システインに富んだ擬反復、トランスメンブランおよび細胞質ドメイン。
10
このような融合タンパク質は、構築された融合物に依存して、本発明のポリペプチドまた
は 他 の TNFRフ ァ ミ リ ー の タ ン パ ク 質 (例 え ば 、 APO4、 TNFR-I、 TNFR-IIお よ び TNFR-III)
と同一であるか、あるいはそれらに類似する、生物学的プロファイルを有することが期待
される。その上、このような融合タンパク質は本明細書に開示するように他の性質を示す
ことができる。
【０１２３】
そ の 上 、 こ の 分 野 に お い て 記 載 さ れ て い る 方 法 に 従 い 、 本 発 明 の ztnfr14の 領 域 ま た は
ド メ イ ン を 他 の TNFR分 子 (例 え ば 、 APO4、 TNFR-I、 TNFR-IIお よ び TNFR-III) ま た は 異 種
タ ン パ ク 質 と 組 合 わ せ て 使 用 し て 、 ポ リ ペ プ チ ド 融 合 物 ま た は ハ イ ブ リ ッ ド ztnfr14タ ン
パ ク 質 を 構 築 す る (Sambrook他 、 前 掲 、 Altschul 他 、 前 掲 、 Picard、 Cur. Opin. Biolog
20
y 5: 511-5、 1994、 お よ び そ の 中 の 参 考 文 献 ) 。 こ れ ら の 方 法 は 問 題 の ポ リ ペ プ チ ド 中 の
より大きいドメインまたは問題のポリペプチドの生物学的重要性の決定を可能とする。こ
のようなハイブリッドは反応速度、結合を変更し、基質特異性を拘束または拡張するか、
あるいはポリペプチドの組織および細胞の局在化を変更し、そして未知構造のポリペプチ
ドに適用することができる。
【０１２４】
補 助 ド メ イ ン を ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 融 合 し て 、 そ れ ら を 特 定 細 胞 、 組 織 ま た は 高 分
子 (例 え ば 、 胃 、 子 宮 、 神 経 芽 細 胞 腫 、 黒 色 腫 お よ び リ ン パ 腫 ) に タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ す る
ことができる。例えば、プロテアーゼドメインを、システインに富んだ擬反復ドメイン (
す な わ ち 、 配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 108ま た は ztnfr14リ ガ ン ド に 結 合 す る こ と が 示 さ れ た そ
30
れらの一部分) に融合することによって、前もって決定した細胞のタイプにターゲッティ
ングすることができるであろう。このようにして、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ントおよびタンパク質を療法的または診断的目的でターゲッティングすることができる。
こ の よ う な シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 ド メ イ ン ま た は そ れ ら の 一 部 分 は 、 2ま た は そ れ 以
上の部分、例えば、精製のための親和標識およびターゲッティングドメインに融合させる
こ と が で き る 。 ま た 、 ポ リ ペ プ チ ド 融 合 物 は 、 特 に ド メ イ ン 間 に 、 1ま た は そ れ 以 上 の 切
断 部 位 を 含 む こ と が で き る 。 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Tuan他 、 Connective Tissue Rese
arch 34: 1-9、 1996。
【０１２５】
本 発 明 の ポ リ ペ プ チ ド 融 合 物 は 一 般 に 約 1,500以 下 の ア ミ ノ 酸 残 基 、 好 ま し く は 約 1,200
40
以 下 の 残 基 、 よ り 好 ま し く は 約 1,000以 下 の 残 基 を 含 有 し 、 多 く の 場 合 に お い て か な り 小
さ い で あ ろ う 。 例 え ば 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 残 基 を 大 腸 菌 (E. coli) β -ガ ラ ク ト シ
ダ ー ゼ (1,021残 基 ; Casadaban他 、 J. Bacteriol. 143: 971-980、 1980参 照 ) 、 10残 基 の
ス ペ ー サ ー 、 お よ び 4残 基 の 因 子 Xa切 断 部 位 に 対 し て 融 合 さ せ る こ と が で き る 。 第 2例 に お
い て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 残 基 を マ ル ト ー ス 結 合 性 タ ン パ ク 質 (ほ ぼ 370残 基 ) ま た は
4残 基 の 切 断 部 位 に 対 し て 融 合 さ せ る こ と が で き る 。
【０１２６】
ま た 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト を 化 学 的 合 成 に よ り 製 造 す る
こ と が で き る 。 Ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は モ ノ マ ー ま た は マ ル チ マ ー で あ り 、 グ ル コ シ ル 化
または非グルコシル化されていることができ、そして最初のメチオニンアミノ酸残基をも
50
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つか、あるいはもたないことができる。
【０１２７】
ま た 、 本 発 明 は 、 ヒ ト Igを も つ 融 合 タ ン パ ク 質 ま た は キ メ ラ タ ン パ ク 質 、 例 え ば 、 GluGluタ ッ グ ド タ ン パ ク 質 ま た は FLAG
T M
タッグドタンパク質を形成するために使用する、可
溶 性 ztnfr14レ セ プ タ ー を 提 供 す る 。 1つ の こ の よ う な 構 築 物 は ヒ ト Igに 融 合 し た 配 列 番 号
2の 残 基 30∼ 108を 含 ん で な り 、 他 の 構 築 物 は ヒ ト Igに 融 合 し た 配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 108を
含 ん で な る 。 ztnfr14ま た は ztnfr14-Igキ メ ラ タ ン パ ク 質 を 使 用 し て 、 例 え ば 、 リ ガ ン ド
に 対 す る ztnfr14の 結 合 を 確 認 し 、 な ら び に リ ガ ン ド 結 合 の ア ゴ ニ ス ト お よ び ア ン タ ゴ ニ
ス ト を 試 験 す る 。 標 識 化 さ れ た 可 溶 性 ztnfr14を 使 用 し て 、 ztnfr14リ ガ ン ド を 発 現 す る 細
胞を蛍光免疫サイトメトリーまたは免疫組織化学により同定することができる。可溶性融
10
合 タ ン パ ク 質 ま た は 可 溶 性 Ig融 合 タ ン パ ク 質 は 、 組 織 中 の ztnfr14リ ガ ン ド の 分 布 ま た は
特 異 的 細 胞 系 統 を 研 究 し 、 そ し て レ セ プ タ ー /リ ガ ン ド 生 物 学 を 洞 察 す る た め に 有 効 で あ
る。
【０１２８】
選 択 的 ア プ ロ ー チ に お い て 、 可 溶 性 ztnfr14レ セ プ タ ー 細 胞 外 リ ガ ン ド -結 合 領 域 を 免 疫
グ ロ ブ リ ン 重 鎖 定 常 領 域 、 典 型 的 に は Fcフ ラ グ メ ン ト と の キ メ ラ と し て 発 現 さ せ る こ と が
で き 、 こ こ で キ メ ラ は 2つ の 定 常 領 域 の ド メ イ ン お よ び ヒ ン ジ 範 囲 を 含 有 す る が 、 可 変 領
域を欠如する。典型的には、このような融合物はマルチマー分子として分泌され、ここで
Fc部 分 は 互 い に ジ サ ル フ ァ イ ド 結 合 で 結 合 し て お り 、 そ し て 2つ の レ セ プ タ ー ポ リ ペ プ チ
ド は 互 い に 対 し て 密 接 に 近 接 し て 配 列 さ れ て い る 。 こ の タ イ プ の 融 合 物 を in vivo ア ッ セ
20
イツールとして使用して、溶液からコグネイトリガンドをアフィニティー精製し、リガン
ド を 特 異 的 に 滴 定 除 去 す る こ と に よ っ て シ グ ナ ル を in vitro ブ ロ ッ ク し 、 そ し て ア ン タ
ゴ ニ ス ト と し て in vivo に お い て そ れ ら を 投 与 す る こ と に よ っ て リ ガ ン ド の 刺 激 を ブ ロ ッ
クすることができる。
【０１２９】
リ ガ ン ド を 精 製 す る た め に 、 ztnfr14-Ig融 合 タ ン パ ク 質 (キ メ ラ ) を レ セ プ タ ー -リ ガ
ン ド の 結 合 を 促 進 す る 条 件 (典 型 的 に は ほ ぼ 生 理 学 的 な 温 度 、 pHお よ び イ オ ン 強 度 ) 下 に
試 料 に 添 加 す る 。 次 い で 、 プ ロ テ イ ン Aを 使 用 す る 混 合 物 に よ り キ メ ラ -リ ガ ン ド 複 合 体 を
分 離 す る 。 こ こ で プ ロ テ イ ン Aは 固 体 状 支 持 体 (例 え ば 、 不 溶 性 樹 脂 ビ ー ズ ) に 固 定 化 さ
れ て い る 。 次 い で 慣 用 の 化 学 的 技 術 、 例 え ば 、 塩 ま た は pHの 勾 配 を 使 用 し て 、 リ ガ ン ド を
30
溶離する。別法において、キメラそれ自体は、前述したように、結合および溶離を実施す
ることによって、固体状支持体に結合させることができる。アッセイにおいて使用するた
め に 、 キ メ ラ を 支 持 体 に Fc領 域 を 介 し て 結 合 さ せ 、 ELISAフ ォ ー マ ッ ト に お い て 使 用 す る
。
【０１３０】
宿 主 細 胞 か ら の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 輸 出 を 指 令 す る た め に 、 そ れ 自 身 の ペ プ チ ド 以
外 の 配 列 、 例 え ば 、 t-PA二 次 ペ プ チ ド を コ ー ド す る 第 2 DNAセ グ メ ン ト に ztnfr14 DNAを 連
鎖 さ せ る こ と が で き る 。 分 泌 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド の 精 製 を 促 進 す る た め に 、 C末 端 の エ ク
ス テ ン シ ョ ン 、 例 え ば 、 サ ブ ス タ ン ス P、 Flagペ プ チ ド (Hopp他 、 Bio/Technology 6: 120
4-1210、 1988; Eastman Kodak Company、 コ ネ チ カ ッ ト 州 ニ ュ ー ヘ ブ ン か ら 入 手 可 能 で あ
40
る) 、マルトース結合性タンパク質、または抗体または他の特異的結合性因子が入手可能
で あ る 他 の ポ リ ペ プ チ ド ま た は タ ン パ ク 質 を 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 し て 融 合 さ せ る
ことができる。
【０１３１】
ま た 、 本 発 明 は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 「 機 能 的 フ ラ グ メ ン ト 」 お よ び こ の よ う な
機能的フラグメントをコードする核酸分子を包含する。核酸分子の日常的欠失分析を実施
し て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 核 酸 分 子 の 機 能 的 フ ラ グ メ ン ト を 得 る こ と が で
き る 。 例 示 と し て 、 配 列 番 号 1お よ び 3の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 有 す る DNA分 子 を Bal31ヌ ク レ
ア ー ゼ で 消 化 し て 、 1系 列 の ネ ス テ ッ ド 欠 失 を 得 る こ と が で き る 。 次 い で フ ラ グ メ ン ト を
発現ベクターの中に適切なリーディングフレームで挿入し、発現されたポリペプチドを単
50
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離 し 、 細 胞 -細 胞 の 相 互 作 用 に つ い て 、 ま た は ztnfr14リ ガ ン ド に 結 合 す る 能 力 、 既 知 の リ
ガ ン ド 活 性 を 減 少 さ せ る 能 力 、 ま た は 抗 ztnfr14抗 体 に 結 合 す る 能 力 に つ い て 試 験 す る 。
エ ク ソ ヌ ク レ ア ー ゼ 消 化 に 対 す る 1つ の 別 法 は 、 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド 特 異 的 突 然 変 異 誘 発
を使用して欠失または停止コドンを導入して、必要なフラグメントの産生を特定すること
で あ る 。 選 択 的 に 、 ztnfr14遺 伝 子 の 特 定 の フ ラ グ メ ン ト を ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 に よ り
合成することができる。
【０１３２】
機能的ドメインを同定する標準的方法は、この分野においてよく知られている。例えば
、インターフェロンの一方または双方の末端におけるトランケーションについての研究は
、 Horisbergerお よ び Di Marco、 Pharmac. Ther. 66: 507 (1995) に お い て 要 約 さ れ て い
10
る。その上、タンパク質機能を分析する標準技術は、例えば、下記の文献に記載されてい
る : Treuter他 、 Mol. Gen. Genet. 240: 113 (1993) 、 Content他 、 “ Expression and pr
eliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human inter
feron” 、 Biological Interferon Systems、 Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Inter
feron Systems、 Cantell (編 者 ) 、 pp. 65-72 (Nijhoff 1987) 、 Herschman、 “ The EGF
Receptor” 、 Control of Animal Cell Proliferation、 Vol. 1、 Boynton他 、 (編 者 ) 、 p
p. 169-199 (Academic Press 1985) 、 Coumailleau他 、 J. Biol. Chem. 270: 29270 (199
5) ; Fukunaga他 、 J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995) ; Yamaguchi他 、 Biochem. Pharma
col. 50: 1295 (1995) 、 お よ び Meisel他 、 Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996) 。
【０１３３】
20
本 発 明 は 、 ま た 、 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32の ア ミ ノ 酸 配 列 と 比 較 し て 、 ア ミ ノ 酸 変 化
を 有 す る ztnfr14遺 伝 子 の 機 能 的 フ ラ グ メ ン ト を 包 含 す る 。 変 異 型 ztnfr14遺 伝 子 は 、 前 述
し た よ う に 、 配 列 番 号 1、 2、 3、 4、 29、 30、 31お よ び 32の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 お よ び ア ミ ノ
酸配列との同一性のレベルを決定することによって、構造に基づいて同定することができ
る 。 構 造 に 基 づ い て 変 異 型 を 同 定 す る 別 の ア プ ロ ー チ は 、 潜 在 的 変 異 型 ztnfr14遺 伝 子 を
コ ー ド す る 核 酸 分 子 が 、 前 述 し た よ う に 、 配 列 番 号 1の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 有 す る 核 酸 分
子にハイブリダイゼーションすることができるかどうかを決定することである。
【０１３４】
本 明 細 書 に お い て 論 ず る 方 法 を 使 用 し て 、 野 生 型 ztnfr14タ ン パ ク 質 の リ ガ ン ド 結 合 性
ま た は 細 胞 内 シ グ ナ リ ン グ 活 性 を 保 持 す る 配 列 番 号 2の 種 々 の ポ リ ペ プ チ ド フ ラ グ メ ン ト
30
ま た は 変 異 型 を 、 当 業 者 は 同 定 お よ び /ま た は 調 製 す る こ と が で き る 。 こ の よ う な ポ リ ペ
プチドは、例えば、下記を包含することができる: システインに富んだ擬反復、リンカー
ド メ イ ン 、 ト ラ ン ス メ ン ブ ラ ン ド メ イ ン お よ び 細 胞 質 ド メ イ ン か ら の 追 加 の ア ミ ノ 酸 (細
胞内シグナリングの原因となるアミノ酸を包含する) ; 融合ドメイン; アフィニティー標
識 ; お よ び そ の 他 。 同 様 に 、 シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 (す な わ ち 、 配 列 番 号 2の 残 基 30
∼ 80、 配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80お よ び /ま た は 配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 108) を 、 他 の TNFRフ ァ
ミリーのメンバーからのシステインに富んだ擬反復で置換して、リガンド結合性または特
異性を増加または減少させることができる。
【０１３５】
配 列 番 号 2に 示 す タ ン パ ク 質 の エ ピ ト ー プ 支 持 部 分 を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド は 、 本 発
40
明のポリペプチドの範囲に入る。 「エピトープ」 は、抗体が結合できるタンパク質の領
域 で あ る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Geysen 他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81: 3998-4002、 1984。 エ ピ ト ー プ は 線 形 ま た は コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン 的 で あ り 、 後 者 は タ
ンパク質のフォールディング時にエピトープを形成するタンパク質の不連続的領域から構
成 さ れ て い る 。 線 形 エ ピ ト ー プ は 一 般 に 少 な く と も 6ア ミ ノ 酸 残 基 の 長 さ で あ る 。
【０１３６】
タンパク質配列の一部分を模倣する比較的短い合成ペプチドは、部分的に模倣されたタ
ン パ ク 質 と 反 応 す る 抗 血 清 を 日 常 的 に 誘 導 す る こ と が で き る 。 Sutcliffe 他 、 Science 21
9: 660-666、 1983。 短 い 線 形 エ ピ ト ー プ を 認 識 す る 抗 体 は 、 変 性 タ ン パ ク 質 を 使 用 す る 分
析 お よ び 診 断 用 途 、 例 え ば 、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ (Tobin、 Proc. Natl. Acad. Sci
50
(30)
JP 2008-500804 A 2008.1.17
. USA 76: 4350-4356、 1979) ま た は 固 定 し た 細 胞 ま た は 組 織 の 試 料 の 分 析 に お い て 特 に
有 効 で あ る 。 ま た 、 線 形 エ ピ ト ー プ に 対 す る 抗 体 は 、 ztnfr14の フ ラ グ メ ン ト 、 例 え ば 、
体液または細胞培地中に存在することがあるフラグメントの検出に有効である。
【０１３７】
本 発 明 の 抗 原 性 エ ピ ト ー プ 支 持 ポ リ ペ プ チ ド は 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 包 含 し 、 ztnfr1
4タ ン パ ク 質 に 特 異 的 に 結 合 す る 抗 体 を 発 生 さ せ る た め に 有 効 で あ る 。 抗 原 性 エ ピ ト ー プ
支 持 ポ リ ペ プ チ ド は 、 ztnfr14タ ン パ ク 質 (例 え ば 、 配 列 番 号 2) の 少 な く と も 6、 好 ま し
く は 少 な く と も 9、 最 も 好 ま し く は 15∼ 30の 隣 接 す る ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 有 す る 。 ztnfr14タ
ン パ ク 質 の よ り 大 き い 部 分 、 す な わ ち 、 30∼ 50残 基 か ら 全 配 列 ま で を 含 ん で な る ポ リ ペ プ
チドが包含される。水性溶媒中の実質的な溶解性を提供するように、エピトープ支持ポリ
10
ペプチドのアミノ酸配列を選択することが好ましい、すなわち、このような配列は比較的
親水性の残基を含む配列であり、そして疎水性残基は実質的に回避される。好ましいこの
ような配列は、システインに富んだ擬反復、リンカードメイン、トランスメンブランドメ
イ ン ま た は 細 胞 質 ド メ イ ン の ztnfr14お よ び そ の フ ラ グ メ ン ト で あ る 。
【０１３８】
ま た 、 本 発 明 は 、 本 明 細 書 に 記 載 す る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の エ ピ ト ー プ 支 持 部 分 を 含
んでなるポリペプチドのフラグメントまたはペプチドを提供する。このようなフラグメン
トまたはペプチドは 「免疫原性エピトープ」 を含んでなることができる。免疫原性エピ
トープは、全タンパク質を免疫原として使用するとき、抗体の応答を誘発するタンパク質
の部分である。免疫原性エピトープを支持するペプチドは標準方法により同定することが
20
で き る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Geysen他 、 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81
: 3998 (1983)) 。
【０１３９】
対照的に、ポリペプチドのフラグメントまたはペプチドは、抗体が特異的に結合するタ
ンパク質分子の領域である 「抗原性エピトープ」 を含むことができる。ある種のエピト
ープはアミノ酸の線状または隣接ストレッチから成り、そしてこのようなエピトープの抗
原性は変性因子により崩壊されない。タンパク質のエピトープを模擬できる、比較的短い
合成ペプチドを使用して、タンパク質に対する抗体の産生を刺激できることはこの分野に
お い て 知 ら れ て い る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Sutcliffe他 、 Science 219: 66
0 (1983)) 。 し た が っ て 、 本 発 明 の 抗 原 性 エ ピ ト ー プ を 支 持 す る ペ プ チ ド お よ び ポ リ ペ プ
30
チドは、本明細書に記載するポリペプチドに結合する抗体を発生させるために有効である
。
【０１４０】
エ ピ ト ー プ を 支 持 す る ペ プ チ ド お よ び ポ リ ペ プ チ ド は 、 配 列 番 号 2、 4、 30お よ び 32の 少
な く と も 4∼ 10ア ミ ノ 酸 、 好 ま し く は 少 な く と も 10∼ 15ア ミ ノ 酸 、 よ り 好 ま し く は 15∼ 30
アミノ酸を含有する。このようなエピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、
本 明 細 書 に 記 載 す る よ う に 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を フ ラ グ メ ン ト 化 す る か 、 あ る い は 化
学的ペプチド合成により製造することができる。その上、エピトープはランダムペプチド
ラ イ ブ ラ リ ー の フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ に よ り 選 択 で き る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ
と : Laneお よ び Stephen、 Curr. Opin. Immunol. 5: 268 (1993) 、 お よ び Cortese他 、 Cur
40
r. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)) 。
【０１４１】
エピトープを同定し、そしてエピトープを含んでなる小さいペプチドから抗体を産生す
る 標 準 方 法 は 、 例 え ば 、 下 記 の 文 献 に 記 載 さ れ て い る : Mole、 “ Epitope Mapping” 、 Met
hods in Molecular Biology、 Vol. 10、 Manson (編 ) 、 pp. 105-116 (The Humana Press,
Inc. 1992) 、 Price、 “ Production and Characterization of Synthetic Peptide-Deri
ved Antibodies” 、 Monoclonal Antibodies: Production， Engineering， and Clinical A
pplication、 Ritterお よ び Ladyman (編 者 ) 、 pp. 60-84 (Cambridge University Press 1
995) 、 お よ び Coligan他 (編 者 ) 、 Current Protocols in Immunology、 pp. 9.3.1-9.3.5
お よ び pp. 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997) 。
50
(31)
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【０１４２】
ま た 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 、 ztnfr14の エ ピ ト ー プ 、 ペ プ チ ド ま た は ポ リ ペ プ チ ド に
結 合 す る 抗 体 の 製 造 に 使 用 す る こ と が で き る 。 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は そ の フ ラ グ メ
ン ト は 、 動 物 に 接 種 し 、 免 疫 応 答 を 誘 発 す る た め の 抗 原 (免 疫 原 )と し て 働 く 。 当 業 者 は
認 識 す る よ う に 、 抗 原 性 エ ピ ト ー プ 支 持 ポ リ ペ プ チ ド は ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 少 な く と
も 6、 好 ま し く は 少 な く と も 9、 よ り 好 ま し く は 少 な く と も 15∼ 約 30の 隣 接 ア ミ ノ 酸 残 基 の
配 列 を 含 有 す る 。 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の よ り 大 き い 部 分 、 す な わ ち 、 30∼ 10残 基 か ら ア
ミノ酸配列の全長までを含んでなるポリペプチドが包含される。また、本明細書において
記載するように、抗原または免疫原性エピトープは、結合させた標識、アジュバントおよ
び 担 体 を 含 む こ と が で き る 。 適 当 な 抗 原 の 例 は 下 記 を 包 含 す る : 配 列 番 号 2の ア ミ ノ 酸 番
10
号 1∼ ア ミ ノ 酸 番 号 198に よ り コ ー ド さ れ る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ; 配 列 番 号 30の ア ミ ノ 酸
番 号 1∼ ア ミ ノ 酸 番 号 308に よ り コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プ チ ド ; 配 列 番 号 32の ア ミ ノ 酸 番 号 1
∼ ア ミ ノ 酸 番 号 185に よ り コ ー ド さ れ る ポ リ ペ プ チ ド 。
【０１４３】
例 示 と し て 、 ztnfr14中 の 潜 在 的 抗 原 部 位 は 、 Jameson-Wolf法 、 Jamesonお よ び Wolf、 CA
BIOS 4: 181 (1988) を 使 用 し て 、 LASERGENE (DNASTAR; ウ ィ ス コ ン シ ン 州 マ デ ィ ソ ン )
の PROTEANプ ロ グ ラ ム (バ ー ジ ョ ン 3.14) に よ り 実 行 し て 、 同 定 す る こ と が で き る 。 こ の
解析において、デフォルトパラメーターを使用した。
【０１４４】
動物にこれらの抗原を接種して発生させた免疫応答からの抗体を、本明細書に記載する
20
ように、単離し、精製することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
を製造し、単離する方法はこの分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参
照 の こ と : Current Protocols in Immunology、 Cooligan 他 (編 者 ) 、 National Institu
te of Health、 John Wiley & Sons, Inc. 1995; Sambrook 他 、 Molecular Cloning: A La
boratory Manual、 第 2版 、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 コ ー ル ド ス プ リ ン グ ハ ー バ ー ; お よ び Hurrell
J. G. 編 者 、 Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications、 CRC Pr
ess, Inc.、 フ ロ リ ダ 州 ボ カ レ イ ト ン 、 1982。
【０１４５】
当業者にとって明らかなように、種々の温血動物、例えば、ウマ、雌牛、ヤギ、ヒツジ
、 イ ヌ 、 ニ ワ ト リ 、 ウ サ ギ 、 マ ウ ス お よ び ラ ッ ト に ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は そ の フ ラ
30
グメントを接種することによって、ポリクローナル抗体を発生させることができる。アジ
ュ バ ン ト 、 例 え ば 、 明 礬 (水 酸 化 ア ル ミ ニ ウ ム ) ま た は フ ロ イ ン ド 完 全 ア ジ ュ バ ン ト ま た
は フ ロ イ ン ド 不 完 全 ア ジ ュ バ ン ト を 使 用 し て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 免 疫 原 性 を 増 加 さ
せることができる。また、免疫化に有効なポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えば、
ztnfr14ま た は そ の 一 部 分 と 免 疫 グ ロ ブ リ ン ポ リ ペ プ チ ド ま た は マ ル ト ー ス 結 合 性 タ ン パ
ク質との融合物を包含する。ポリペプチドの免疫原は全長の分子またはその一部分である
ことができる。ポリペプチドの一部分が 「ハプテン様」 である場合、このような一部分
は 好 都 合 に は 免 疫 化 の た め に 高 分 子 の 担 体 (例 え ば 、 キ ー ホ ー ル リ ン ペ ッ ト ヘ モ シ ア ニ ン
(KLH) 、 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン (BSA)ま た は 破 傷 風 ト キ ソ イ ド ) に 接 続 ま た は 結 合 さ せ る
ことができる。
40
【０１４６】
本明細書において使用するとき、用語 「抗体」 はポリクローナル抗体、アフィニティ
ー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結合性フラグメント
、 例 え ば 、 F (ab')2 お よ び Fabタ ン パ ク 質 分 解 性 フ ラ グ メ ン ト を 包 含 す る 。 遺 伝 子 操 作 さ
れ た 無 傷 の 抗 体 ま た は フ ラ グ メ ン ト 、 例 え ば 、 キ メ ラ 抗 体 、 Fvフ ラ グ メ ン ト 、 一 本 鎖 抗 体
およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプチドおよびポリペプチドもまた包含される。
非 ヒ ト CDRを ヒ ト フ レ ー ム ワ ー ク お よ び 定 常 領 域 上 に グ ラ フ ト 化 す る か 、 あ る い は 全 体 の
非 ヒ ト 可 変 ド メ イ ン を 組 込 む (必 要 に 応 じ て 暴 露 し た 残 基 を 置 換 す る こ と に よ っ て 、 前 記
ド メ イ ン を ヒ ト 様 表 面 で 「 ク ロ ー キ ン グ (cloaking)」 す る 、 こ こ で 「 ベ ニ ヤ 化 さ れ た
」 抗体が生ずる) ことによって、非ヒト抗体をヒト化することができる。いくつかの例
50
(32)
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において、ヒト化抗体はヒト可変領域のフレームワーク内に非ヒト残基を保持して、適切
な結合特性を増強することができる。抗体をヒト化することによって、生物学的半減期を
増加させることができ、そしてヒトへ投与するときの悪い免疫反応の可能性は減少する。
【０１４７】
本 発 明 に お い て 有 効 な 抗 体 を 発 生 さ せ ま た は 選 択 す る 別 の 技 術 は 、 ztnfr14タ ン パ ク 質
ま た は ペ プ チ ド に 対 す る リ ン パ 球 の in vitro暴 露 、 お よ び フ ァ ー ジ ま た は 同 様 な ベ ク タ ー
中 の 抗 体 展 示 ラ イ ブ ラ リ ー の 選 択 (例 え ば 、 固 定 化 ま た は 標 識 化 さ れ た ztnfr14タ ン パ ク
質 ま た は ペ プ チ ド の 使 用 に よ る ) を 包 含 す る 。 潜 在 的 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 結 合 性 ド メ イ
ン を 有 す る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 遺 伝 子 は 、 フ ァ ー ジ (フ ァ ー ジ デ ィ ス プ レ イ ) ま た
は 細 菌 、 例 え ば 、 大 腸 菌 (E. coli) 上 に 展 示 さ れ た ラ ン ダ ム ペ プ チ ド ラ イ ブ ラ リ ー を ス
10
クリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列は、多数の方法、例えば、ランダム突然変異誘発およびランダムヌクレオチド合成
により得ることができる。
【０１４８】
タンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学的または
合成高分子、または有機または無機の物質であることができる既知のターゲットと相互作
用するペプチドについてスクリーニングするために、これらのランダムペプチドディスプ
レイライブラリーを使用することができる。使用可能なランダムペプチドディスプレイラ
イ ブ ラ リ ー を つ く り か つ ス ク リ ー ニ ン グ す る 技 術 は こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て お り (Ladn
er他 、 米 国 特 許 第 5,223,409号 ; Ladner他 、 米 国 特 許 第 4,946,778号 ; Ladner他 、 米 国 特 許
20
第 5,403,484号 お よ び Ladner他 、 米 国 特 許 第 5,571,698号 ) そ し て ラ ン ダ ム ペ プ チ ド デ ィ ス
プレイライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは
、 例 え ば 、 CLONTECH Laboratories, Inc. (カ リ フ ォ ル ニ ア 州 パ ロ ア ル ト ) 、 Invitrogen
Inc. (カ リ フ ォ ル ニ ア 州 サ ン デ ィ エ ゴ ) 、 New England Biolabs， Inc. (マ サ チ ュ セ ッ ツ
州 ベ バ ー リ イ ) お よ び Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (ニ ュ ー ジ ャ ー ジ イ 州 ピ ス カ タ
ウェイ) から商業的に入手可能である。
【０１４９】
本明細書に開示する配列を使用してランダムペプチドディスプレイライブラリーをスク
リ ー ニ ン グ し て 、 ztnfr14に 結 合 す る タ ン パ ク 質 を 同 定 す る こ と が で き る 。 ztnfr14ポ リ ペ
プチドと相互作用する、これらの 「結合性ポリペプチド」 は、細胞を標識化するために
30
; アフィニティー精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用することができる
; それらは薬剤、トキシン、放射性核種およびその他に直接的または間接的に複合化させ
ることができる。また、これらの結合性タンパク質は、分析方法、例えば、発現ライブラ
リーをスクリーニングしそして活性を中和するために使用することができる。
【０１５０】
また、結合性タンパク質は、本明細書に開示するポリペプチドの循環レベルを測定し;
根元的病理学または疾患のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出または定量する診断
ア ッ セ イ に 使 用 す る こ と が で き る 。 こ れ ら の 結 合 性 タ ン パ ク 質 は 、 in vitroお よ び in viv
oに お け る ztnfr14の 結 合 お よ び シ グ ナ ル ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン を ブ ロ ッ ク す る ztnfr14 「 ア
ン タ ゴ ニ ス ト 」 と し て 作 用 す る こ と が で き る 。 一 般 に 、 こ れ ら の 抗 ztnfr14結 合 性 タ ン パ
40
ク 質 は 、 例 え ば 、 ア ポ ト ー シ ス 、 筋 発 生 、 免 疫 学 的 認 識 、 腫 瘍 形 成 、 お よ び 細 胞 -細 胞 の
相互作用をモジュレートするために有効であろう。
【０１５１】
本明細書において使用するとき、用語 「結合性タンパク質」 はさらに下記を包含す
る : ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る 抗 体 、 ztnfr14の コ グ ネ イ ト リ ガ ン ド 、 ztnfr14ポ リ ペ
プ チ ド の 精 製 に 有 効 な タ ン パ ク 質 お よ び 細 胞 質 ド メ イ ン (配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198) に
関連するタンパク質。また、このような細胞質ドメイン関連タンパク質は細胞質メディエ
イ タ ー と 呼 ば れ 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 細 胞 内 シ グ ナ リ ン グ に お い て 機 能 す る 。 下 記 の
文 献 を 参 照 の こ と : Bazzoni F. 他 、 J. of Inflammation 45: 221-238、 1995。 こ れ ら の
細 胞 質 メ デ ィ エ イ タ ー は 下 記 の も の を 包 含 す る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い ： TRAP-1、 TRAD
50
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D、 RIP、 TRAF-1-6、 LAP-1、 FADD/MORT-1お よ び CAP-1。
【０１５２】
抗 体 が 対 照 (非 ztnfr14) ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る 結 合 ア フ ィ ニ テ ィ ー よ り も 少 な く と も 1
0倍 大 き い 結 合 活 性 (ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 ペ プ チ ド ま た は エ ピ ト ー プ に 対 し て ) の 限 界
レベルを示す場合、抗体は特異的に結合性であると決定される。抗体の結合アフィニティ
ー は 、 当 業 者 に よ り 、 例 え ば 、 ス キ ャ ッ チ ャ ー ド 分 析 (Scatchard、 G.、 Ann. NY Acad. S
ci. 51: 660-672、 1949) に よ り 容 易 に 測 定 す る こ と が で き る 。
【０１５３】
こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て い る 種 々 の ア ッ セ イ を 利 用 し て 、 ztnfr14タ ン パ ク 質 ま た は
ペ プ チ ド に 特 異 的 に 結 合 す る 抗 体 を 検 出 す る こ と が で き る 。 典 型 的 な ア ッ セ イ は 、 Antibo
10
dies: A Laboratory Manual、 Harlowお よ び Lane (編 ) 、 Cold Spring Harbor Laboratory
Press、 1988に 詳 細 に 記 載 さ れ て い る 。 こ の よ う な ア ッ セ イ の 代 表 的 な 例 は 下 記 の も の を
包含する: 並流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、酵素結合イムノ
ア ッ セ イ (ELISA) 、 ド ッ ト ブ ロ ッ ト ま た は ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト ア ッ セ イ 、 阻 害 ま た は 競
合 ア ッ セ イ お よ び サ ン ド イ ッ チ ア ッ セ イ 。 さ ら に 、 抗 体 を 野 生 型 /突 然 変 異 の ztnfr14タ ン
パク質またはポリペプチドに対する結合についてスクリーニングすることができる。
【０１５４】
ztnfr14を 発 現 す る 細 胞 の 免 疫 組 織 化 学 的 標 識 化 ; ア フ ィ ニ テ ィ ー 精 製 に よ る ztnfr14の
単 離 ; ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 循 環 レ ベ ル を 測 定 す る 診 断 ア ッ セ イ ; 根 元 的 な 病 理 学 ま た
は 疾 患 の マ ー カ ー と し て の 可 溶 性 ztnfr14タ ン パ ク 質 の 検 出 ま た は 定 量 ; FACSを 使 用 す る
20
分析法; 発現ライブラリーのスクリーニング; 抗イディオタイプ抗体の発生; のために、
そ し て 中 和 性 抗 体 ; ま た は in vitroお よ び in vivoに お い て ztnfr14を ブ ロ ッ ク す る ア ン タ
ゴ ニ ス ト ; と し て 、 ztnfr14に 対 す る 抗 体 を 使 用 す る こ と が で き る 。
【０１５５】
適当な直接的タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビタ
ー、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する; 間接的タグま
た は 標 識 は 、 ビ オ チ ン -ア ビ ジ ン ま た は 他 の 補 体 /抗 補 体 の 対 を 中 間 体 と し て 使 用 す る こ と
を特徴とする。また、本発明における抗体は、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他
と 直 接 的 ま た は 間 接 的 に 複 合 化 す る こ と が で き 、 そ し て こ れ ら の 複 合 体 は in vivoの 診 断
ま た は 療 法 の 用 途 に お い て 使 用 す る こ と が で き る 。 そ の 上 、 ztnfr14ま た は そ の フ ラ グ メ
30
ントに対する抗体をアッセイ、例えば、ウェスタンブロットまたはこの分野において知ら
れている他のアッセイにおいて使用することができる。
【０１５６】
可 溶 性 ztnfr14は 組 織 お よ び 特 異 的 細 胞 系 統 上 の 分 布 の 研 究 に お い て 、 そ し て レ セ プ タ
ー /リ ガ ン ド の 生 物 学 の 洞 察 を 提 供 す る た め に 有 効 で あ る 。 標 識 化 ztnfr14を 使 用 す る こ と
によって、リガンドを発現する細胞を蛍光免疫サイトメトリーまたは免疫サイトメトリー
に よ り 同 定 す る 。 ま た 、 TNFレ セ プ タ ー の そ れ ら の リ ガ ン ド に 対 す る 特 異 性 を 使 用 す る こ
とができる。
【０１５７】
FLAG
T M
標 識 化 さ れ た 可 溶 性 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る 抗 体 を 作 る こ と が で き る 。 選
択 的 に 、 こ の よ う な ポ リ ペ プ チ ド は ヒ ト Igと 融 合 タ ン パ ク 質 を 形 成 す る 。 特 に 、 FLAG
T M
40
標
識 化 可 溶 性 ztnfr14に 対 す る ポ リ ペ プ チ ド 抗 体 を 含 有 す る 抗 血 清 は 、 免 疫 組 織 化 学 に よ り
ヒ ト ま た は 霊 長 類 の 組 織 上 に お け る ztnfr14の 組 織 分 布 を 分 析 す る た め に 使 用 す る こ と が
で き る 。 ま た 、 こ れ ら の 可 溶 性 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 使 用 し て 、 マ ウ ス 免 疫 化 し て 可 溶
性 ヒ ト ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 産 生 す る こ と が で き る 。 ま た
、 可 溶 性 ヒ ト ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 使 用 し て リ ガ ン ド /レ セ
プ タ ー の カ ッ プ リ ン グ を 模 倣 し て 、 リ ガ ン ド /レ セ プ タ ー の 対 を 活 性 化 ま た は 不 活 性 化 す
ることができる。
【０１５８】
例 え ば 、 架 橋 性 抗 可 溶 性 CD40モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は 、 抗 IgMま た は LPSで 次 善 的 に 活 性 化
50
(34)
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さ れ た B細 胞 に 対 し て 刺 激 シ グ ナ ル を 提 供 し 、 増 殖 お よ び 免 疫 グ ロ ブ リ ン の 産 生 を 生 ず る
ことが証明された。これらの同一モノクローナル抗体は、溶液中でレセプターの活性化を
ブ ロ ッ ク す る こ と に よ っ て 使 用 す る と き 、 ア ン タ ゴ ニ ス ト と し て 作 用 す る 。 ztnfr14に 対
するモノクローナル抗体を使用して、組織分布研究により同定された特異的細胞系統上の
ztnfr14/ztnfr14-リ ガ ン ド 対 の 分 布 、 調 節 お よ び 生 物 学 的 相 互 作 用 を 決 定 す る こ と が で き
る。
【０１５９】
また、可溶性レセプターまたはレセプターに対する抗体は、薬剤、トキシン、放射性核
種およびその他と直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体は
in vivoの 診 断 ま た は 療 法 の 用 途 に お い て 使 用 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 本 発 明 の ポ リ
10
ペ プ チ ド ま た は 抗 体 を 使 用 し て 、 対 応 す る 抗 相 補 的 分 子 (例 え ば 、 そ れ ぞ れ レ セ プ タ ー ま
たは抗原) を発現する組織または器官を同定または治療することができる。さらに詳しく
は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は 抗 ztnfr14抗 体 、 ま た は そ れ ら の 生 物 活 性 フ ラ グ メ ン ト ま
たは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリングさせ、そして抗相補的分子を
発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達すことができる。
【０１６０】
適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させるこ
とができ、そしてこのような分子は放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビタ
ー、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含する。適当な細胞障
害分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そして
20
こ の よ う な 分 子 は 細 菌 ま た は 植 物 の ト キ シ ン (例 え ば 、 ジ フ テ リ ア ト キ シ ン 、 シ ュ ー ド モ
ナ ス (Pseudomonas) エ キ ソ ト キ シ ン 、 リ シ ン 、 ア ブ リ ン お よ び そ の 他 ) 、 な ら び に 治 療 用
放 射 性 核 種 、 例 え ば 、 ヨ ウ 素 -131、 レ ニ ウ ム -188ま た は イ ッ ト リ ウ ム -90 (ポ リ ペ プ チ ド
または抗体に直接的に結合されているか、または例えばキレート化部分の手段により間接
的に結合されている) を包含する。
【０１６１】
また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシンに結合さ
せることができる。検出可能なまたは細胞障害性分子の間接的結合のために、検出可能な
ま た は 細 胞 障 害 性 分 子 を 補 体 /抗 補 体 の 対 の 1メ ン バ ー に 結 合 す る こ と が で き 、 こ こ で 他 方
のメンバーをポリペプチドまたは抗体の部分に結合させる。これらの目的に対して、ビオ
30
チ ン /ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン は 典 型 的 な 補 体 /抗 補 体 の 対 で あ る 。
【０１６２】
他 の 態 様 に お い て 、 ポ リ ペ プ チ ド -ト キ シ ン 融 合 タ ン パ ク 質 ま た は 抗 体 -ト キ シ ン 融 合 タ
ン パ ク 質 を 、 タ ー ゲ ッ テ ッ ド 細 胞 ま た は 組 織 の 阻 害 ま た は 切 除 の た め に (例 え ば 、 癌 細 胞
または炎症細胞または組織を処置するために) 使用することができる。選択的に、システ
インに富んだ擬反復のみを含む融合タンパク質は、検出可能な分子、細胞障害性分子また
は 相 補 的 分 子 を 問 題 の 細 胞 ま た は 組 織 の タ イ プ に 向 け る た め に 適 当 で あ る 。 同 様 に 、 ztnf
r14に 対 応 す る リ ガ ン ド を 検 出 可 能 な ま た は 細 胞 障 害 性 分 子 に 複 合 化 さ せ 、 一 般 的 な 抗 相
補 的 -検 出 可 能 な /細 胞 障 害 性 分 子 の 複 合 体 の 細 胞 /組 織 特 異 的 送 達 の た め の 一 般 的 な タ ー
ゲッティングベヒクルを提供することができる。
40
【０１６３】
当業者にとって明らかなように、ある種の分子のマーカーは疾患の存在および予後の同
定 を 促 進 す る こ と が で き る 。 こ の よ う な マ ー カ ー は 、 例 え ば 、 p25、 C-Ki-ras、 お よ び c-e
rbB-2を 包 含 す る 。 一 般 に 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Schneider P. 他 、 Br. J. Cancer
83 (4) : 473-479、 2000; お よ び Watani M. 他 、 Surg. Today 30 (6) : 516-522、 2000。
また、当業者は知るように、このような分子のマーカーは単独でまたは他の剤を使用する
治療、例えば、化学療法と組合わせて治療するターゲットとして使用することもできる。
膜 結 合 レ セ プ タ ー に 対 す る 治 療 ア プ ロ ー チ の 1例 は 、 癌 組 織 が HER2を 過 剰 に 発 現 す る 乳 癌
を 治 療 す る ト ラ ス ツ ズ マ ブ (trastuzumab) の 使 用 で あ る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の
こ と : Baselga J. 他 、 Semin. Oncol. 26 (4 Supl 12) : 78-83、 1999; Ravdin P.、 Semi
50
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n. Oncol. 26 (4 Supl 12) : 117-23、 1999; Shak S.、 Semin. Oncol. 26 (4 Supl 12) :
71-7、 1999; お よ び Stebbing J. 他 、 Cancer Treat. Rev. 26 (4) : 287-290、 2000。
【０１６４】
いくつかの腫瘍細胞、例えば、神経芽細胞腫、黒色腫およびリンパ腫においてアップレ
ギュレーションを示すタンパク質として、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
、 そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト 、 お よ び そ れ ら に 対 す る 結 合 性 タ ン パ ク 質 (抗 体 お よ び リ ガ ン ド
を 包 含 す る ) は 多 数 の 方 法 で こ の よ う な 疾 患 を 検 出 お よ び /ま た は 診 断 す る た め に 使 用 で
き る 。 例 え ば 、 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ (DNA、 RNA、 お よ び ペ プ チ ド -核 酸 を 包 含 す る )
は、このような疾患の組織が存在するかどうかを決定するために、診断マーカーとして
使用することができる。ハイブリダイゼーション技術はこの出願のどこかで教示されてお
10
り、そして当業者によく知られている。
【０１６５】
また、この出願のどこかで教示されているように、このようなポリヌクレオチド、それ
らのフラグメントおよびそれらに対する融合物を使用して、適切なポリヌクレオチド配列
を適切な遺伝子を欠如する組織、細胞系統または生物に組込むことができる。また、この
よ う な 疾 患 を 治 療 す る 手 段 と し て 、 DNAが 細 胞 膜 を 横 切 る よ う に さ せ 、 適 当 な 結 合 相 手 と
ともに治療剤に対する細胞離解のタグとして作用させる因子の存在下に、前記ポリヌクレ
オチド、それらのフラグメントおよびそれらに対する融合物を投与することができる。こ
の 方 法 に お い て 、 ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド を 含 有 す る 細 胞 を 阻 害 ま た は 破 壊 す る こ と が
できる。
20
【０１６６】
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト お よ び そ れ ら に 対 す る 融 合 物 は 診 断 お よ
び 治 療 の 両 方 に お い て 使 用 す る こ と が で き る 。 こ の よ う な ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 、 可 溶
性ポリペプチドを包含し、腫瘍細胞、例えば、黒色腫、肺癌、乳癌、骨肉腫およびリンパ
腫を同定するためのマーカーとして使用することができる。可溶性ポリペプチドとして、
こ の 診 断 は 体 液 中 の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト お よ び そ れ ら に 対 す る
融合物を測定することによって決定することができる。体液は、血液、血漿、唾液、尿、
洗浄流体および生検流体を包含するが、これらに限定されない。
【０１６７】
膜 結 合 ポ リ ペ プ チ ド と し て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト お よ び そ れ
30
ら に 対 す る 融 合 物 は 、 組 織 生 検 (す な わ ち 、 身 体 か ら 切 除 さ れ た ) に お い て な ら び に 局 所
的 に (す な わ ち 、 上 皮 表 面 ) 映 像 法 お よ び /ま た は 可 視 化 法 を 使 用 し て 測 定 す る こ と が で
きる。このような疾患組織のターゲッティングは、治療のオプションにおいて助けとなる
であろう。例えば、疾患の広がりが制限される場合、このような可視化は疾患組織の切除
に お い て 外 科 医 を 助 け る で あ ろ う 。 同 様 に 、 膜 結 合 ztnfr14の 存 在 は 、 阻 害 因 子 ま た は 離
解 因 子 に 融 合 ま た は 複 合 化 し た ztnfr14結 合 性 タ ン パ ク 質 (そ の リ ガ ン ド ま た は 抗 体 を 包
含する) に対するターゲットとして使用することができる。
【０１６８】
他 の 態 様 に お い て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は 抗 ztnfr14抗 体 が こ れ ら の 器 官 か ら の 超
増 殖 性 組 織 を タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ す る 場 合 、 ztnfr14-サ イ ト カ イ ン 融 合 タ ン パ ク 質 ま た は 抗
40
体 -サ イ ト カ イ ン 融 合 タ ン パ ク 質 は タ ー ゲ ッ ト 組 織 (例 え ば 、 胃 、 子 宮 、 な ら び に 神 経 芽
細 胞 腫 、 黒 色 腫 お よ び リ ン パ 腫 ) の in vivo死 滅 を 増 強 す る た め に 使 用 す る こ と が で き る
。 (一 般 に 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Hornick他 、 Blood 89: 4437-47、 1977) 。 彼 ら が
記載する融合タンパク質は、サイトカインを必要な作用部位にターゲッティングし、これ
に よ り サ イ ト カ イ ン の 局 所 濃 度 を 増 加 さ せ る こ と が で き る 。 適 当 な ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド
ま た は 抗 ztnfr14抗 体 は 望 ま し く な い 細 胞 ま た は 組 織 (す な わ ち 、 腫 瘍 ま た は 白 血 病 ) を
ターゲッティングし、そして融合サイトカインはエフェクター細胞によるターゲット細胞
の改良された溶解を仲介する。この目的に適当なサイトカインは、例えば、インターロイ
キ ン 2お よ び 顆 粒 球 -マ ク ロ フ ァ ー ジ の コ ロ ニ ー 刺 激 因 子 (GM-CSF) を 包 含 す る 。
【０１６９】
50
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Ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド お よ び /ま た は ポ リ ペ プ チ ド は 、 TNF支 持 細 胞 、 例 え ば 、 T細 胞
、 B細 胞 、 リ ン パ 球 、 抹 消 血 単 核 細 胞 、 多 形 核 白 血 球 、 線 維 芽 細 胞 お よ び 造 血 細 胞 の 成 熟
化 の 調 節 に お い て 有 効 で あ る こ と が あ る 。 ま た 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 、 in vivo 代 謝
的または生理的プロセスを仲介するために使用されるであろう。増殖および分化に対する
化 合 物 の 作 用 は 、 培 養 し た 細 胞 を 使 用 し て in vitro測 定 す る こ と が で き る 。 バ イ オ ア ッ セ
イ お よ び ELISA、 特 に 細 胞 の 応 答 の 測 度 と し て サ イ ト カ イ ン 産 生 の 変 化 を 測 定 す る ELISAは
、 ztnfr14に 対 す る 細 胞 の 応 答 を 測 定 す る た め に 利 用 可 能 で あ る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を
参 照 の こ と : Current Protocols in Immunology John E. Coligan 他 (編 者 ) 、 NIH、 199
6) 。 抗 体 ア イ ソ タ イ プ 、 NK細 胞 の 形 成 、 細 胞 機 能 を 提 示 す る 抗 原 、 ア ポ ト ー シ ス を 包 含
する他の細胞の応答を測定するアッセイはこの分野において知られている。
10
【０１７０】
全長のポリペプチド、生物学的に活性なフラグメントおよび融合タンパク質を包含する
本 発 明 の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 、 慣 用 の 技 術 に 従 い 、 遺 伝 子 操 作 さ れ た 宿 主 細 胞 に お い
て 産 生 さ せ る こ と が で き る 。 適 当 な 宿 主 細 胞 は 、 外 因 的 DNAで 形 質 転 換 ま た は ト ラ ン ス フ
ェクトすることができ、培養により増殖させることができる細胞のタイプであり、そして
細菌、真菌細胞および培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の
培 養 さ れ た 細 胞 は 好 ま し い 。 ク ロ ー ニ ン グ さ れ た DNA分 子 を 操 作 し 、 外 因 的 DNAを 種 々 の 宿
主 細 胞 の 中 に 導 入 す る 技 術 は 、 下 記 の 文 献 に 記 載 さ れ て い る : Sambrook他 、 Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual、 第 2版 、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 ニ ュ ー ヨ
ー ク 州 コ ー ル ド ス プ リ ン グ ハ ー バ ー 、 1989、 お よ び Ausubel他 編 、 Current Protocols in
20
Molecular Biology、 John Wiley and Sons， Inc.、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 、 1987。
【０１７１】
一 般 に 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る DNA配 列 は 、 発 現 ベ ク タ ー 内 に お い て 、 そ の
発現のための必要な他の遺伝因子に作用可能に連鎖されており、このような因子は一般に
転 写 プ ロ モ ー タ ー お よ び タ ー ミ ネ ー タ ー を 包 含 す る 。 ま た 、 ベ ク タ ー は 1ま た は そ れ 以 上
の 選 択 可 能 な マ ー カ ー お よ び 1ま た は そ れ 以 上 の 複 製 起 点 を 普 通 に 含 有 す る が 、 当 業 者 は
認識するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々のベクター上に提供し、そし
て 宿 主 細 胞 の ゲ ノ ム 中 の 組 込 み に よ り 外 因 的 DNAを 複 製 さ せ る こ と が で き る 。 プ ロ モ ー タ
ー、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の因子の選択は、当業者の
レベル内の日常的設計事項である。多数のこのような因子は文献に記載されており、そし
30
て商業的供給会社から入手可能である。
【０１７２】
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 宿 主 細 胞 の 分 泌 経 路 の 中 に 向 け る た め に 、 分 泌 シ グ ナ ル 配 列 (
また、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列として知られている) を発現ベクター
の 中 に 準 備 す る 。 分 泌 シ グ ナ ル 配 列 は 天 然 の ztnfr14の そ れ で あ る こ と が で き る か 、 あ る
い は 他 の 分 泌 さ れ た タ ン パ ク 質 (例 え ば 、 APO4ま た は t-PA) か ら 誘 導 す る か 、 あ る い は 新
規 に 合 成 す る こ と が で き る 。 分 泌 シ グ ナ ル 配 列 を ztnfr14 DNA配 列 に 作 用 可 能 に 連 鎖 し て
、 す な わ ち 、 2つ の 配 列 を 正 し い リ ー デ ィ ン グ フ レ ー ム で 結 合 し て 、 新 し く 合 成 さ れ た ポ
リペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるように位置させる。分泌シグナル配列は問
題 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る DNA配 列 に 対 し て 5' に 普 通 に 配 置 さ れ る が 、 あ る 種 の 分 泌
40
シ グ ナ ル 配 列 は 問 題 の DNA配 列 の 中 の ど こ か に 位 置 決 定 す る こ と が で き る (例 え ば 、 Welch
他 、 米 国 特 許 第 5,037,743号 ; Holland他 、 米 国 特 許 第 5,143,830号 、 参 照 ) 。
【０１７３】
ztnfr14の 細 胞 質 ド メ イ ン を 異 種 配 列 で 置 換 し て 異 な る 細 胞 質 ド メ イ ン を 提 供 す る こ と
が で き る 。 こ の 場 合 に お い て 、 融 合 タ ン パ ク 質 を 分 泌 さ せ 、 ztnfr14の シ ス テ イ ン に 富 ん
だ擬反復ドメインは新しい細胞質ドメインを前述の特異的組織に向けることができる。こ
の 置 換 さ れ た 細 胞 質 ド メ イ ン を TNFRタ ン パ ク 質 フ ァ ミ リ ー に よ り 表 さ れ る 細 胞 質 ド メ イ ン
か ら 選 択 す る こ と が で き る 。 同 様 に 、 ztnfr14タ ン パ ク 質 の シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 ド
メインを異種配列で置換して、異なるシステインに富んだ擬反復ドメインを提供すること
ができる。再び、融合タンパク質を分泌させ、置換されたシステインに富んだ擬反復ドメ
50
(37)
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イ ン は ztnfr14の 細 胞 質 ド メ イ ン を 特 異 的 組 織 に タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ す る こ と が で き る 。 置
換 さ れ た シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 ド メ イ ン は 、 TNFRタ ン パ ク 質 フ ァ ミ リ ー の シ ス テ イ ン
に富んだ擬反復ドメインから選択することができる。これらの場合において、融合生成物
は可溶性であるか、あるいは膜結合タンパク質であることができる。
【０１７４】
培 養 さ れ た 哺 乳 動 物 細 胞 は 、 本 発 明 に お い て 適 当 な 宿 主 で あ る 。 外 因 的 DNAを 哺 乳 動 物
の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する: リン酸カルシウム仲介トランス
フ ェ ク シ ョ ン (Wigler他 、 Cell 14: 725、 1978; Corsaroお よ び Pearson、 Somatic Cell G
enetics 7: 603、 1981; Grahamお よ び Van der Eb、 Virology 52: 456、 1973) 、 エ レ ク ト
ロ ポ レ ー シ ョ ン (Neumann他 、 EMBO J. 1: 841-5、 1982) 、 DEAE-デ キ ス ト リ ン 仲 介 ト ラ ン
10
ス フ ェ ク シ ョ ン (Ausubel他 、 前 掲 ) 、 お よ び リ ポ ソ ー ム 仲 介 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン (Haw
ley-Nelson他 、 Focus 15: 73、 1993; Ciccarone他 、 Focus 15: 80、 1993) お よ び ウ イ ル
ス ベ ク タ ー (Millerお よ び Rosman、 BioTechniques 7: 980-90、 1989; Wangお よ び Finer、
Nature Med. 2: 714-6、 1996) 。
【０１７５】
培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記の特許文
献 に 記 載 さ れ て い る : Levinson他 、 米 国 特 許 第 4,713,339号 ; Hagen他 、 米 国 特 許 第 4,784,
950号 ; Palmiter他 、 米 国 特 許 第 4,579,821号 ; お よ び Ringold、 米 国 特 許 第 4,656,134号 。
適 当 な 培 養 さ れ た 哺 乳 動 物 細 胞 は 下 記 の も の を 包 含 す る : COS-1 (ATCC No. CRL 1650) 、
COS-7 (ATCC No. CRL 1651) 、 BHK (ATCC No. CRL 1632) 、 BHK570 (ATCC No. CRL 10314
20
) 、 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham他 、 J. Gen. Virol. 36: 59-72、 1977) お よ び チ ャ
イ ニ ー ズ ハ ム ス タ ー 卵 巣 (例 え ば 、 CHO-K1; ATCC No. CRL 61) 細 胞 系 統 。
【０１７６】
追加の適当な細胞系統はこの分野において知られており、そして公の寄託機関、例えば
、 ア メ リ カ ン ・ タ イ プ ・ カ ル チ ャ ー ・ コ レ ク シ ョ ン (American Type Culture Collection
) (マ リ イ ラ ン ド 州 ロ ッ ク ビ レ ) か ら 入 手 可 能 で あ る 。 一 般 に 、 強 い 転 写 プ ロ モ ー タ ー 、
例 え ば 、 SV-40ま た は サ イ ト メ ガ ロ ウ イ ル ス か ら の プ ロ モ ー タ ー は 好 ま し い 。 例 え ば 、 米
国 特 許 第 4,956,288号 参 照 。 他 の 適 当 な プ ロ モ ー タ ー は 、 メ タ ロ チ オ ネ イ ン 遺 伝 子 か ら プ
ロ モ ー タ ー (米 国 特 許 第 4,579,821号 お よ び 米 国 特 許 第 4,601,978号 ) お よ び ア デ ノ ウ イ ル
スの主要な後期プロモーターを包含する。
30
【０１７７】
薬 剤 選 択 を 一 般 に 使 用 し て 、 外 来 DNAが 挿 入 さ れ た 、 培 養 さ れ た 哺 乳 動 物 細 胞 に つ い て
選択する。このような細胞は普通に 「トランスフェクタント」 と呼ばれる。選択因子の
存在下に培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に移行させることができる細胞は、 「
安定なトランスフェクタント」 と呼ばれる。好ましい選択可能なマーカーは、抗生物質
のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択はネオマイシン型薬剤、例
え ば 、 G-418ま た は そ の 他 の 存 在 下 に 実 施 さ れ る 。 ま た 、 選 択 系 を 使 用 し て 、 問 題 の 遺 伝
子の発現レベルを増加させることができる、 「増幅」 と呼ぶ方法。低いレベルの選択因
子の存在下にトランスフェクタントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入され
た遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞について選択することによって、増幅は実施
40
される。
【０１７８】
好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与する
、 ジ ヒ ド ロ フ ォ レ ー ト リ ダ ク タ ー ゼ で あ る 。 他 の 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 (例 え ば 、 ヒ グ ロ マ イ シ
ン耐性、多薬剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ) を使用することもでき
る 。 FACSソ ー テ ィ ン グ ま た は 磁 気 ビ ー ズ 分 離 技 術 の よ う な 手 段 に よ り 、 変 更 さ れ た 表 現 型
を導入するオールタネイティブマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表面
の タ ン パ ク 質 、 例 え ば 、 CD4、 CD8、 ク ラ ス Iの MHC、 胎 盤 ア ル カ リ 性 ホ ス フ ァ タ ー ゼ を 使 用
して、非トランスフェクト細胞からトランスフェクトされた細胞を選別することができる
。
50
(38)
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【０１７９】
また、植物細胞、昆虫細胞およびトリ細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細胞と
して使用できる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクターとしてアグロバクテリ
ウ ム ・ リ ゾ ゲ ネ ス (Agrobacterium rhizogenes) を 使 用 す る こ と は 、 Sinkar他 、 J. Biosc
i. (Bangalore) 11: 47-58、 1987に お い て 概 観 さ れ て い る 。 昆 虫 細 胞 の 形 質 転 換 お よ び そ
の 中 の 外 来 ポ リ ペ プ チ ド の 産 生 は 、 Guarino他 、 米 国 特 許 第 5,162,222号 お よ び WIPO公 開 WO
94/06463に 記 載 さ れ て い る 。 オ ー ト グ ラ フ ァ ・ カ リ フ ォ ル ニ カ (Autographa californic
a) 核 多 角 体 病 ウ イ ル ス (AcNPV) か ら 普 通 に 誘 導 さ れ る 組 換 え バ キ ュ ロ ウ イ ル ス で 、 昆 虫
細 胞 を 感 染 さ せ る こ と が で き る 。 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : King L. A. お よ び Possee R.
D.、 The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide、 London、 Chapman & Ha
10
ll; O'Reilly D. R.他 、 Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual、 New Y
ork、 Oxford University Press、 1994; お よ び Richardson C. D. 編 、 Baculovirus Expre
ssion Protocols、 Methods in Molecular Biology、 Totowa、 NJ、 Humana Press、 1995。
【０１８０】
組 換 え ztnfr14バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を 作 る 第 2の 方 法 は 、 Luckowが 記 載 す る ト ラ ン ス ポ ゾ ン
を ベ ー ス と す る 系 を 利 用 す る (Luckow V. A.、 他 、 J. Virol. 67: 4566-79、 1993) 。 こ
の 系 は 、 転 移 ベ ク タ ー を 利 用 し 、 Bac-to-Bacキ ッ ト (Life Technologies、 マ リ イ ラ ン ド
州 ロ ッ ク ビ レ ) で 販 売 さ れ て い る 。 こ の 系 は 転 移 ベ ク タ ー 、 pFastBac1
gies) を 利 用 し 、 こ こ で pFastBac1
T M
T M
(Life Technolo
は 「 バ ク ミ ド (bacmid) 」 と 呼 ば れ る 大 き い プ ラ
ス ミ ド と し て 大 腸 菌 (E. coli) の 中 に 維 持 さ れ た バ キ ュ ロ ウ イ ル ス の ゲ ノ ム の 中 に ztnfr
20
14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る DNAを 動 か す た め に 、 Tn7ト ラ ン ス ポ ゾ ン を 含 有 す る 。 pFastB
ac1
T M
転 移 ベ ク タ ー は 、 AcNPVポ リ ヘ ド リ ン プ ロ モ ー タ ー を 利 用 し て 、 問 題 の 遺 伝 子 、 こ の
場 合 に お い て ztnfr14、 の 発 現 を 推 進 す る 。
【０１８１】
し か し な が ら 、 pFastBac1
T M
はかなりな程度に修飾可能である。ポリヘドリンプロモー
タ ー を 除 去 し 、 バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を ベ ー ス と す る タ ン パ ク 質 プ ロ モ ー タ ー (ま た 、 Pcor、
p6.9ま た は MPプ ロ モ ー タ ー と し て 知 ら れ て い る ) で 置 換 し 、 こ こ で こ の プ ロ モ ー タ ー は 以
前にバキュロウイルスの感染において発現され、そして分泌されたタンパク質の発現に好
都 合 で あ る こ と が 示 さ れ て い る 。 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Hill-Perkins M. S. お よ び P
ossee R. D.、 J. Gen. Virol. 71: 971-6、 1990; Bonning B. C.、 他 、 J. Gen. Virol. 7
30
5: 1551-6、 1994; お よ び 、 Chazenbalk G. D.、 お よ び Rapoport B.、 J. Biol. Chem. 270
: 1543-9、 1995。
【０１８２】
このような転移ベクター構築物において、基本的タンパク質プロモーターの短いまたは
長 い バ ー ジ ョ ン を 使 用 す る こ と が で き る 。 そ の 上 、 自 然 ztnfr14分 泌 シ グ ナ ル 配 列 を 昆 虫
タンパク質から誘導された分泌シグナル配列で置換する、転移ベクターを構築することが
で き る 。 例 え ば 、 エ ク ジ ス テ ロ イ ド グ ル コ シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (EGT) 、 蜜 蜂 メ リ チ
ン (Invitrogen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 カ ー ル ス バ ッ ド ) 、 ま た は バ キ ュ ロ ウ イ ル ス gp67 (Ph
arMingen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 サ ン デ ィ エ ゴ ) か ら の 分 泌 シ グ ナ ル 配 列 を 構 築 物 に お い て 使
用 し て 、 自 然 ztnfr14分 泌 シ グ ナ ル 配 列 を 置 換 す る こ と が で き る 。
40
【０１８３】
さ ら に 、 転 移 ベ ク タ ー は 、 発 現 さ れ た ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の C末 端 ま た は N末 端 に お け
る エ ピ ト ー プ 標 識 、 例 え ば 、 Glu-Gluエ ピ ト ー プ 標 識 を コ ー ド す る DNAと の イ ン フ レ ー ム 融
合 物 を 含 む こ と が で き る (Grussenmeyer T. 他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4、 1
985) 。 こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て い る 技 術 を 使 用 し て 、 ztnfr14を 含 有 す る 転 移 ベ ク タ ー
を 大 腸 菌 (E. coli) の 中 に 形 質 転 換 し 、 そ し て 組 換 え バ キ ュ ロ ウ イ ル ス を 示 す 中 断 さ れ
た lacZ遺 伝 子 を 含 有 す る バ ク ミ ド に つ い て ス ク リ ー ニ ン グ す る 。 組 換 え バ キ ュ ロ ウ イ ル ス
の ゲ ノ ム を 含 有 す る バ ク ミ ド DNAを 普 通 の 技 術 に 従 い 単 離 し 、 そ し て ス ポ ド プ テ ラ ・ フ ル
ギ ペ ル ダ (Spodoptera frugiperda) 細 胞 、 例 え ば 、 Sf9細 胞 を ト ラ ン ス フ ェ ク ト す る 。 zt
nfr14を 発 現 す る 組 換 え ベ ク タ ー を 引 き 続 い て 生 成 さ せ る 。 こ の 分 野 に お い て 普 通 に 使 用
50
(39)
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されている方法により、組換えウイルスの系統を作る。
【０１８４】
宿 主 細 胞 、 典 型 的 に は ヨ ト ウ ガ 、 ス ポ ド プ テ ラ ・ フ ル ギ ペ ル ダ (Spodoptera frugiperd
a) に 由 来 す る 細 胞 系 統 を 感 染 さ せ る た め に 、 組 換 え ウ イ ル ス を 使 用 す る 。 一 般 に 、 下 記
の 文 献 を 参 照 の こ と : Glickお よ び Pasternak、 Molecular Biotechnology: Principle and
Applications of Recombinant DNA、 ASM Press、 ワ シ ン ト ン D. C. 、 1994。 他 の 適 当 な
細 胞 系 統 は 、 ト リ コ デ ル マ ・ ニ (Trichoderma ni) か ら 誘 導 さ れ た High FiveO
T M
細胞系統
(Invitrogen) で あ る (米 国 特 許 第 5,300,435号 ) 。 商 業 的 に 入 手 可 能 な 無 血 清 培 地 を 使
用して、細胞を増殖させかつ維持する。
【０１８５】
10
適 当 な 培 地 は Sf9細 胞 に つ い て Sf900 II
T M
(Life Technologies) ま た は ESF 921
pression System) ; お よ び ト リ コ デ ル マ ・ ニ (T.ni) 細 胞 に つ い て Ex-cellO450
Bioscience、 カ ン サ ス 州 レ ネ ク サ ) ま た は Express FiveO
5
T M
T M
T M
(Ex
(JRH
(Life Technologies) で あ る
6
。 細 胞 を ほ ぼ 2∼ 5× 10 細 胞 の 接 種 密 度 か ら 1∼ 2× 10 細 胞 の 密 度 に 増 殖 さ せ 、 こ の 時 組 換
え ウ イ ル ス の 系 統 を 0.1∼ 10、 よ り 典 型 的 に は 約 3の 感 染 の 多 重 度 (MOI) で 添 加 す る 。 使
用 す る 手 順 は 一 般 に 入 手 可 能 な 実 験 室 の マ ニ ュ ア ル に 記 載 さ れ て い る (King L. A. お よ
び Possee R. D.、 前 掲 ; O'Reilly、 D. R.、 他 、 前 掲 ; Richardson、 C. D.、 前 掲 ) 。 本 明
細 書 に 記 載 す る 方 法 に 従 い 、 上 清 か ら の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 引 き 続 く 精 製 を 達 成 す る
ことができる。
【０１８６】
20
また、酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用できる。これに関して特に興
味 あ る 酵 母 種 は 、 サ ッ カ ロ ミ セ ス ・ セ レ ビ シ エ (Saccharomyces cerevisiae) 、 ピ キ ア ・
パ ス ト リ ス (Pichia pastoris) 、 お よ び ピ キ ア ・ メ タ ノ リ カ (Pichia metanolica) を 包
含 す る 。 外 因 的 DNAで サ ッ カ ロ ミ セ ス ・ セ レ ビ シ エ (S. cerevisiae)を 形 質 転 換 し 、 そ れ
から組換えポリペプチドを生産する方法は、例えば、下記の特許文献に記載されている:
Kawasaki、 米 国 特 許 第 4,599,311号 ; Kawasaki他 、 米 国 特 許 第 4,931,373号 ; Brake、 米 国
特 許 第 4,870,008号 ; Welch他 、 米 国 特 許 第 5,037,743号 ; お よ び Murry他 、 米 国 特 許 第 4,84
5,075号 。
【０１８７】
選 択 可 能 な マ ー カ ー に よ り 決 定 さ れ た 表 現 型 、 普 通 の 薬 剤 耐 性 ま た は 特 定 の 栄 養 (例 え
30
ば、ロイシン) の非存在下に増殖する能力により、形質転換された細胞を選択する。サッ
カ ロ ミ セ ス ・ セ レ ビ シ エ (Saccharomyces cerevisiae) に お い て 使 用 す る た め に 好 ま し い
ベ ク タ ー 系 は 、 Kawasaki他 (米 国 特 許 第 4,931,373号 ) に よ り 開 示 さ れ て い る POT1ベ ク タ
ー系であり、これによりグルコースを含有する培地中の増殖により形質転換細胞を選択す
ることができる。酵母において使用するために適当なプロモーターおよびターミネーター
は 、 解 糖 酵 素 遺 伝 子 (例 え ば 、 Kawasaki、 米 国 特 許 第 4,599,311号 ; Kingsman他 、 米 国 特
許 第 4,615,974号 ; お よ び Bitter、 米 国 特 許 第 4,977,092号 参 照 ) お よ び ア ル コ ー ル デ ヒ ド
ロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。
【０１８８】
ま た 、 米 国 特 許 第 4,990,446号 ; 米 国 特 許 第 5,063,154号 ; 米 国 特 許 第 5,139,936号 お よ
40
び 米 国 特 許 第 4,661,454号 参 照 。 ハ ン ゼ ヌ ラ ・ ポ リ モ ル フ ァ (Hansenula polymorpha) 、
シ ゾ サ ッ カ ラ ロ ミ セ ス ・ ポ ン ベ (Schizosaccharomyces pombe) 、 ク ル イ ベ ロ マ イ セ ス ・
ラ ク チ ス (Kluyveromyces lactis) 、 ク ル イ ベ ロ マ イ セ ス ・ フ ラ ギ リ ス (Kluyveromyces
fragilis) 、 ウ ス チ ラ ゴ ・ マ イ デ ィ ス (Ustilago maydis) 、 ピ キ ア ・ パ ス ト リ ス (Pichi
a pastoris) 、 ピ キ ア ・ メ タ ノ リ カ (Pichia metanolica) 、 ピ キ ア ・ グ イ レ ル モ ン デ ィ
イ (Pichia guillermondii) お よ び カ ン ジ ダ ・ マ ル ト サ (Candida maltosa) を 包 含 す る
、他の酵母のための形質転換系はこの分野において知られている。例えば、下記の文献を
参 照 の こ と : Gleeson他 、 J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65、 1986お よ び Cregg、 米 国 特
許 第 4,882,279号 。
【０１８９】
50
(40)
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McKnight他 、 米 国 特 許 第 4,935,349号 の 方 法 に 従 い 、 ア ス ペ ル ギ ル ス (Aspergillus) 細
胞 を 利 用 す る こ と が で き る 。 ア ク レ モ ニ ウ ム ・ ク リ ソ ゲ ヌ ム (Acremonium chrysogenum)
を 形 質 転 換 す る 方 法 は 、 Sumino他 、 米 国 特 許 第 5,162,228号 に 開 示 さ れ て い る 。 ニ ュ ー ロ
ス ポ ラ (Neurospora)を 形 質 転 換 す る 方 法 は 、 Lambowitz、 米 国 特 許 第 4,486,533号 に 開 示
さ れ て い る 。 組 換 え タ ン パ ク 質 の 生 産 の た め の 宿 主 と し て ピ キ ア ・ メ タ ノ リ カ (Pichia m
etanolica) を 使 用 す る こ と は 、 米 国 特 許 第 5,716,808号 、 米 国 特 許 第 5,736,383号 、 米 国
特 許 第 5,854,039号 お よ び 米 国 特 許 第 5,888,768号 に 開 示 さ れ て い る 。
【０１９０】
ま た 、 細 菌 大 腸 菌 (Escherichia coli) 、 バ シ ラ ス (Bacillus) お よ び 他 の 属 の 株 を 包
含する原核宿主細胞は本発明において有効である。これらの宿主を形質転換し、その中に
10
お い て ク ロ ー ニ ン グ さ れ た 外 来 DNA配 列 を 発 現 さ せ る 技 術 は こ の 分 野 に お い て よ く 知 ら れ
て い る (例 え ば 、 Sambrook他 、 前 掲 参 照 ) 。 大 腸 菌 (E. coli) の よ う な 細 菌 に お い て ztn
fr14ポ リ ペ プ チ ド を 発 現 さ せ る と き 、 ポ リ ペ プ チ ド を 典 型 的 に は 不 溶 性 粒 子 と し て 細 胞 質
の中に保持させることができるか、あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスミック空間
の中に向けることができる。前者の場合において、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば
、グアニジンイソチオシアネートまたは尿素を使用して変性する。
【０１９１】
次いで変性されたポリペプチドをリフォールディングさせ、変性物の希釈により、例え
ば、尿素の溶液および還元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンとの組合わ
せに対する透析、および引き続く緩衝化生理食塩水に対する透析により、二量体化させる
20
こ と が で き る 。 後 者 の 場 合 に お い て 、 細 胞 を 崩 壊 さ せ て (例 え ば 、 超 音 波 処 理 ま た は 浸 透
圧ショックにより) ペリプラスミック空間の内容物を解放し、これにより変性およびリフ
ォールディングの必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリプラスミック空間
から可溶性の機能的形態で回収することができる。
【０１９２】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素および選
択した宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培地中で培養する。規定された培地お
よび複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野において知られており、そして
一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよび無機質を含む。また、培地は、必
要に応じて、成長因子または血清のような成分を含有することができる。一般に、外因的
30
に 添 加 さ れ た DNAを 含 有 す る 細 胞 に つ い て 成 長 培 地 を 選 択 す る 。 こ の 選 択 は 、 例 え ば 、 薬
剤選択または必須栄養素の欠如により実施され、必須栄養素は発現ベクター上に担体され
るか、あるいは宿主細胞の中に共トランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補足
される。
【０１９３】
炭 素 、 窒 素 お よ び 微 量 栄 養 素 の 適 切 な 源 を 含 む 培 地 中 で 約 25℃ ∼ 35℃ の 温 度 に お い て 、
ピ キ ア ・ メ タ ノ リ カ (P. metanolica) 細 胞 を 培 養 す る 。 慣 用 の 手 段 、 例 え ば 、 小 さ い フ
ラスコの震盪または発酵槽のスパージにより、液体培地を十分にエアレーションする。ピ
キ ア ・ メ タ ノ リ カ (P. metanolica) の た め に 好 ま し い 培 地 は 、 YEPD (2％ の D-グ ル コ ー ス
、 2％ の Bacto
T M
ペ プ ト ン (Difco Laboratories、 ミ シ ガ ン 州 デ ト ロ イ ト ) 、 1％ の BactoTM
40
酵 母 エ キ ス (Difco Laboratories) 、 0.004％ の ア デ ニ ン お よ び 0.006％ の L-ロ イ シ ン ) で
ある。
【０１９４】
また、本発明のタンパク質は天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。天然
に 存 在 し な い ア ミ ノ 酸 は 限 定 さ れ ず に 、 下 記 の も の を 包 含 す る : ト ラ ン ス -3-メ チ ル プ ロ
リ ン 、 2,4-メ タ ノ プ ロ リ ン 、 シ ス -4-ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ ン 、 ト ラ ン ス -4-ヒ ド ロ キ シ プ ロ リ
ン 、 N-メ チ ル グ リ シ ン 、 ア ロ -ト レ オ ニ ン 、 メ チ ル ト レ オ ニ ン 、 ヒ ド ロ キ シ エ チ ル シ ス テ
イン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリ
ン 酸 、 チ ア ゾ リ ジ ン カ ル ボ ン 酸 、 デ ヒ ド ロ プ ロ リ ン 、 3-お よ び 4-メ チ ル プ ロ リ ン 、 3,3-ジ
メ チ ル プ ロ リ ン 、 tert-ロ イ シ ン 、 ノ ル バ リ ン 、 2-ア ザ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 、 3-ア ザ フ ェ ニ
50
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ル ア ラ ニ ン 、 4-ア ザ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン お よ び 4-フ ル オ ロ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 。
【０１９５】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に組込む、いくつかの方法はこの分野
に お い て 知 ら れ て い る 。 例 え ば 、 化 学 的 に ア ミ ノ ア シ ル 化 さ れ た サ プ レ ッ サ ー tRNAを 使 用
し て ナ ン セ ン ス 突 然 変 異 を 抑 制 す る 、 in vitro系 を 使 用 す る こ と が で き る 。 ア ミ ノ 酸 を 合
成 し 、 tRNAを ア ミ ノ ア シ ル 化 す る 方 法 は こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て い る 。 大 腸 菌 (E. col
i) S30抽 出 物 お よ び 商 業 的 に 入 手 可 能 な 酵 素 お よ び 他 の 試 薬 を 含 ん で な る 、 無 細 胞 系 に お
いて、ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は実施される。タンパ
ク 質 を ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 精 製 す る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Robertso
n他 、 J. Am. Chem. Soc. 113: 2722、 1991; Ellman他 、 Methods Enzymol. 202: 301、 199
10
1; Chung他 、 Science 259: 806-9、 1993; お よ び Chung他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 10145-9、 1993。
【０１９６】
第 2の 方 法 に お い て 、 突 然 変 異 さ れ た mRNAお よ び 化 学 的 に ア ミ ノ ア シ ル 化 さ れ た サ プ レ
ッ サ ー tRNAの マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン に よ り 、 キ セ ノ プ ス ・ オ オ サ イ ト (Xenopus oocy
tes) 中 で 翻 訳 を 実 施 す る (Turcatti他 、 J. Biol. Chem. 271: 19991-1、 1996) 。 第 3の
方 法 に お い て 、 置 換 す べ き 天 然 の ア ミ ノ 酸 (例 え ば 、 フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン ) の 非 存 在 下 に か
つ 必 要 な 天 然 に 存 在 し な い 1ま た は そ れ 以 上 の ア ミ ノ 酸 (例 え ば 、 2-ア ザ フ ェ ニ ル ア ラ ニ
ン 、 3-ア ザ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 、 4-ア ザ フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン ま た は 4-フ ル オ ロ フ ェ ニ ル ア ラ ニ
ン ) の 存 在 下 に 、 大 腸 菌 (E. coli） 細 胞 を 培 養 す る 。 天 然 に 存 在 し な い ア ミ ノ 酸 を そ の
20
天 然 の 対 応 物 の 代 わ り に タ ン パ ク 質 の 中 に 組 込 む 。 Koide他 、 Biochem.: 7470-6、 1994、
参 照 。 in vitro化 学 的 修 飾 に よ り 、 天 然 に 存 在 す る ア ミ ノ 酸 残 基 を 天 然 に 存 在 し な い 種 に
変換することができる。化学的修飾を部位特異的突然変異誘発と組合わせて、置換の範囲
を さ ら に 拡 張 す る こ と が で き る (Wynnお よ び Richards、 Protein Sci. 2: 395-403、 1993)
。
【０１９７】
制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、天然に存
在 し な い ア ミ ノ 酸 、 お よ び 非 天 然 の ア ミ ノ 酸 を ztnfr14ア ミ ノ 酸 残 基 と 置 換 す る こ と が で
きる。
本 発 明 の ポ リ ペ プ チ ド を 好 ま し く は ≧ 80%の 純 度 、 よ り 好 ま し く は ≧ 90%の 純 度 、 な お よ
30
り 好 ま し く は ≧ 95%の 純 度 に 精 製 し 、 そ し て 汚 染 性 高 分 子 、 特 に 他 の タ ン パ ク 質 お よ び 核
酸 に 関 し て 99.9%よ り 高 い 純 度 で あ り か つ 感 染 因 子 お よ び 発 熱 因 子 を 含 ま な い 、 薬 学 的 に
純粋な状態は特に好ましい。好ましくは、精製されたポリペプチドは他のポリペプチド、
特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。
【０１９８】
発 現 さ れ た ztnfr14タ ン パ ク 質 (キ メ ラ ポ リ ペ プ チ ド お よ び マ ル チ マ ー の タ ン パ ク 質 を
包含する) を慣用タンパク質精製法、典型的にはクロマトグラフィー技術の組合わせによ
り 精 製 す る 。 一 般 に 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Affinity Chromatography: Principles
& Methods、 Pharmacia LKB Biotechnology、 ス イ ス 国 ウ ッ プ サ ラ 、 1988; お よ び Scopes、
Protein Purification: Principles and Practice、 Springer-Verlag、 New York、 1994。
40
ポ リ ヒ ス チ ジ ン 親 和 標 識 (典 型 的 に は 約 6ヒ ス チ ジ ン 残 基 ) を ニ ッ ケ ル キ レ ー ト 樹 脂 上 の
ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 精 製 す る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Houchuli他 、 Bi
o/Technol. 6: 1321-1325、 1988。 glu-gluタ グ を 含 ん で な る タ ン パ ク 質 は 、 慣 用 手 順 に 従
い イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 精 製 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 Grus
senmeyer他 、 前 掲 参 照 。 マ ル ト ー ス 結 合 性 タ ン パ ク 質 融 合 物 を 、 こ の 分 野 に お い て 知 ら れ
ている方法に従いアミロースカラム上で精製する。
【０１９９】
本発明のポリペプチドは、下記を包含するが、これらに限定されない手順の組合わせに
より単離することができる: アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排
除クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー。他の精製法は、レクチ
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ンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコ
シ ル 化 タ ン パ ク 質 の 精 製 を 包 含 す る (Methods in Enzymol.、 Vol. 182、 “ Guide to Prot
ein Purification” 、 M. Deutscher (編 ) 、 Academic Press、 サ ン デ ィ エ ゴ 、 1990、 pp.
529-39) 。 本 発 明 の 追 加 の 態 様 の 範 囲 内 に お い て 、 問 題 の ポ リ ペ プ チ ド と 親 和 標 識 (例 え
ば、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン) との融合物を構築して、精製
を促進することができる。
【０２００】
ま た 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 、 こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て い る 方 法 、 例 え ば 、 独 占 的
固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合反応または古典的溶液合成法に従い化学的合
成 に よ り 製 造 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Merrifield、 J. Am.
10
Chem. Soc. 85: 2149、 1963; Stewart他 、 Solid Phase Peptide Synthesis (第 2版 ) 、 P
ierce Chemical Co.、 イ リ ノ イ 州 ロ ッ ク フ ォ ー ド II; Bayerお よ び Rapp、 Chem. Pept. Pro
t. 3: 3、 1986; お よ び Atherton他 、 Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Appr
oach、 IRL Press、 Oxford、 1989。 よ り 小 さ い ポ リ ペ プ チ ド の 製 造 の た め に 、 in vitro合
成は特に好都合である。
【０２０１】
こ の 分 野 に お い て 知 ら れ て い る 方 法 を 使 用 し て 、 ztnfr14タ ン パ ク 質 を モ ノ マ ー ま た は
マルチマーとして調製し; グリコシル化するか、あるいはグリコシル化せず; ペギル化す
るか、あるいはペギル化せず; そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むか、あるいは含
まないことができる。
20
Ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 活 性 は 、 例 え ば 、 細 胞 -細 胞 の 相 互 作 用 、 ztnfr14リ ガ ン ド の 結
合 、 腫 瘍 細 胞 の 増 殖 、 B細 胞 の 活 性 化 、 NK細 胞 の 活 性 化 、 T細 胞 の 活 性 化 お よ び ztnfr14リ
ガ ン ド /レ セ プ タ ー の 結 合 に 関 連 す る 他 の 生 物 学 的 機 能 を 測 定 す る 種 々 の ア ッ セ イ に よ り
測定することができる。
【０２０２】
本発明のタンパク質は、選択的にスプライスされたペプチドを包含し、単独で、または
胃、子宮、および癌状態、例えば、神経芽細胞腫、黒色腫およびリンパ腫中の他の分子 (
成長因子、サイトカインおよびその他) と組合わせて働き、腫瘍の抑制、免疫学的認識、
お よ び 増 殖 お よ び 分 化 の た め に 有 効 で あ る 。 ztnfr14の 選 択 的 ス プ ラ イ シ ン グ は 細 胞 型 特
異的であり、そして特異的組織に活性を与えることができる。
30
【０２０３】
本発明のポリヌクレオチドは、他の癌細胞系統のなかの胃、子宮、神経芽細胞腫、黒色
腫 お よ び リ ン パ 腫 の 細 胞 に お い て 同 定 さ れ た の で 、 ztnfr14の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド を 使 用 し
て 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り 、 ま た は ztnfr14結 合 性 タ ン パ ク 質 を 用 い て 、 こ れ ら
の 細 胞 型 を 検 出 す る こ と が で き る 。 同 様 に 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る 抗 体 は 、 表 面
結 合 ztnfr14レ セ プ タ ー を 発 現 す る 細 胞 を 検 出 す る こ と が で き る 。 こ の よ う な 検 出 は 、 転
移、疾患の段階または疾患の一次的診断を決定するために有効であることがある。さらに
、 例 え ば 、 ztnfr14-コ グ ネ イ ト リ ガ ン ド ま た は ztnfr14に 対 す る 抗 体 を 包 含 す る ztnfr14結
合性タンパク質と細胞を接触させることによって、これらの細胞型の増殖、分化および/
またはアポトーシスをモジュレートすることができる。
40
【０２０４】
ま た 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト に よ り 、 ztnfr14リ ガ ン ド に 対
し て 結 合 し 、 こ れ に よ り リ ガ ン ド と 膜 結 合 ztnfr14タ ン パ ク 質 と の 間 の 相 互 作 用 を 減 少 さ
せ る こ と に よ っ て 、 細 胞 シ グ ナ リ ン グ の ア ン タ ゴ ニ ス ト と し て 細 胞 の 増 殖 お よ び /ま た は
分 化 を 仲 介 す る こ と が で き る 。 増 殖 お よ び /ま た は 分 化 に 対 す る ztnfr14分 子 の モ ジ ュ レ ー
ションの効果は、例えば、これらの細胞型に対して特異的な細胞マーカーの存在または非
存在により、またはこれらの疾患の他の発現を測定することによって、測定可能である。
例 え ば 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は そ れ ら の フ ラ グ メ ン ト 、 な ら び に ztnfr14結 合 性 タ ン
パク質を神経芽細胞腫の細胞に投与し、そして癌増殖の阻害を慣用の造影技術によりモニ
ターすることができる。
50
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【０２０５】
本発明の分子の活性は、例えば、神経、皮膚または造血細胞系統の組織の新生または過
形 成 (す な わ ち 、 増 殖 ) を 測 定 す る 種 々 の ア ッ セ イ を 使 用 し て 測 定 す る こ と が で き る 。 本
発明のポリペプチドに関連すると思われる追加の活性は、直接的または間接的に他の成長
因子によるリンパ様細胞の増殖を包含する。
【０２０６】
本 発 明 の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 使 用 し て 、 胃 お よ び 子 宮 な ら び に 神 経 芽 細 胞 腫 、 黒 色
腫およびリンパ腫における増殖または分化を研究することができる。一般に、このような
本 発 明 の 方 法 は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 、 そ れ ら の ア ゴ ニ ス ト ま た
はアンタゴニストの存在および非存在下にこれらの組織に由来する細胞を培養し、そして
10
細胞の増殖または分化の変化を観察することを含んでなる。これらの組織からの細胞系統
は 、 例 え ば 、 ア メ リ カ ン ・ タ イ プ ・ カ ル チ ャ ー ・ コ レ ク シ ョ ン (American Type Culture
Collection) (バ ー ジ ニ ア 州 マ ン ナ ッ サ ス ) か ら 商 業 的 に 入 手 可 能 で あ る 。
【０２０７】
培 養 し た 尿 ま た は 胃 細 胞 を 使 用 す る か 、 あ る い は in vivoに お い て 特 許 請 求 の 範 囲 に 記
載する発明の分子を適当な動物モデルに投与することによって、増殖を測定することがで
きる。一般に、増殖作用は細胞数の増加として観測され、したがって、アポトーシス、な
らびに有糸分裂誘発の阻害を包含することができる。培養された細胞は、尿線維芽細胞、
神経芽細胞腫、黒色腫およびリンパ腫、ならびに一次培養からのものを包含する。確立さ
れた細胞系統は当業者により容易に同定され、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・
20
コ レ ク シ ョ ン (American Type Culture Collection) (バ ー ジ ニ ア 州 マ ン ナ ッ サ ス ) か ら
商業的に入手可能である。細胞増殖を測定するアッセイは、この分野においてよく知られ
ている。
【０２０８】
例えば、増殖を測定するアッセイは下記のようなアッセイを包含する: 中性赤色色素に
対 す る 化 学 感 受 性 (Cavanugh他 、 Investigational New Drug 8: 347-354、 1990) 、 放 射
能 標 識 化 ヌ ク レ オ チ ド の 組 込 み (Cook他 、 Analytical Biochem. 179: 1-7、 1989) 、 増 殖
す る 細 胞 の DNA中 の 5-ブ ロ モ -2'-デ オ キ シ ウ リ ジ ン (BrdU) の 組 込 み (Porstmann他 、 J. I
mmunol. Methods 82: 169-179、 1985) 、 お よ び テ ト ラ ゾ リ ウ ム 塩 の 使 用 (Mosmann、 J. I
mmunol. Methods 65: 55-63、 1983; Alley他 、 Cancer Res. 48: 589-601、 1988; Marshal
30
l他 、 Growth Reg. 5: 69-84、 1995; お よ び Scudiero他 、 Cancer Res. 48: 4827-4833、 19
88) 。
【０２０９】
分化は漸進的、動力学的プロセスであり、多能性幹細胞で開始し、末端的に分化した細
胞で終わる。系列に対して拘束されないで再生することができる多能性幹細胞は、細胞系
列に対する拘束がなされるとき、分化マーカーの組を発現する。前駆細胞は、細胞が成熟
に向かって細胞系列の経路を進行するとき、発現され続けるか、あるいは続けることがな
い 、 1組 の 分 化 マ ー カ ー を 発 現 す る 。 成 熟 細 胞 に よ り も っ ぱ ら 発 現 さ れ る 分 化 マ ー カ ー は
、通常機能的特性であり、例えば、細胞産物、細胞産物を産生する酵素、およびレセプタ
ー様相補的分子である。
40
【０２１０】
細胞集団の分化段階は、細胞集団の中に存在するマーカーの同定によりモニターされる
。例えば、筋細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞および網状細胞は共通の
間 葉 幹 細 胞 に 由 来 す る と 考 え ら れ る (Owen他 、 Ciba Fdn. Symp. 136: 42-46、 1988) 。 間
葉 幹 細 胞 に つ い て の マ ー カ ー は よ く 同 定 さ れ て き て い な い (Owen他 、 J. of Cell Sci. 87
: 731-738、 1987) の で 、 同 定 は 通 常 前 駆 細 胞 お よ び 成 熟 細 胞 の 段 階 に お い て な さ れ る 。
本 発 明 の 新 規 な ポ リ ペ プ チ ド は 、 in vivoお よ び ex vivoの 両 方 に お い て 、 間 葉 幹 細 胞 お よ
び尿筋細胞の前駆細胞を単離する研究のために有効であろう。
【０２１１】
末端の分化または脱分化に向かって経路を下る特異的細胞型を刺激する因子は、共通の
50
(44)
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前駆体または幹細胞に由来する全細胞集団に影響を与えることを示唆する証拠が存在する
。 こ う し て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 、 子 宮 、 胃 な ら び に 黒 色 腫 、 神 経 芽 細 胞 腫 お よ び リ
ンパ腫の内分泌細胞および外分泌細胞の阻害または増殖を刺激することができる。
本 発 明 の 分 子 は 、 子 宮 線 維 芽 細 胞 の 増 殖 ま た は 分 化 を 刺 激 す る が 、 共 通 の 前 駆 体 /幹 細
胞に対する作用のために、脂肪細胞の増殖または分化を阻害する。本発明の新規なポリペ
プチドは、神経細胞および上皮幹細胞および子宮、ならびに黒色腫、神経芽細胞腫および
リ ン パ 腫 を in vivoお よ び ex vivoの 両 方 に お い て 研 究 す る た め に 有 効 で あ る 。
【０２１２】
分化を測定するアッセイは、例えば、組織の段階特異的発現に関連する細胞マーカー、
酵 素 活 性 、 機 能 的 活 性 ま た は 形 態 学 的 変 化 を 測 定 す る こ と を 包 含 す る (Watt、 FASEB 5: 2
10
81-284、 1991; Francis、 Differentiation 57: 63-75、 1994; Raes、 Adv. Anim. Cell Bi
ol. Technol. Bioprocesses、 161-171、 1989) 。
本 発 明 の タ ン パ ク 質 は 、 選 択 的 に ス プ ラ イ ス さ れ た ペ プ チ ド を 包 含 し 、 細 胞 -細 胞 の 相
互作用、受精、発生、免疫認識、成長制御、腫瘍抑制および配偶子成熟を研究するために
有 効 で あ る 。 ztnfr14の 分 子 、 変 異 型 お よ び フ ラ グ メ ン ト は 、 単 独 で 、 ま た は 胃 お よ び 子
宮 、 な ら び に 黒 色 腫 、 神 経 芽 細 胞 腫 お よ び リ ン パ 腫 中 の 他 の 分 子 (成 長 因 子 、 サ イ ト カ イ
ンおよびその他) と組合わせて適用することができる。
【０２１３】
本発明のタンパク質は治療剤の送達に有効であり、このような治療剤はプロテアーゼ、
ラジオヌクレオチド、化学療法剤および小分子を包含するが、これらに限定されない。こ
20
れ ら の 治 療 剤 の 効 果 は in vitroに お い て 培 養 し た 細 胞 を 使 用 し て 、 ex vivoに お い て 組 織
ス ラ イ ス に つ い て ま た は in vivoに お い て 特 許 請 求 し た 発 明 の 分 子 を 適 当 な 動 物 モ デ ル に
投 与 す る こ と に よ っ て 測 定 す る こ と が で き る 。 本 発 明 の タ ン パ ク 質 を ア ッ セ イ す る 別 の in
vivoア プ ロ ー チ は 、 ウ イ ル ス 送 達 系 を 包 含 す る 。 こ の 目 的 に 典 型 的 な ウ イ ル ス は 、 ア デ
ノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ関連
ウ イ ル ス (AAV) を 包 含 す る 。
【０２１４】
ア デ ノ ウ イ ル ス は 二 本 鎖 DNAウ イ ル ス で あ り 、 現 在 異 種 核 酸 の 送 達 の た め に 最 良 に 研 究
さ れ て い る 遺 伝 子 転 移 ベ ク タ ー で あ る (概 観 に つ い て は 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : T. C
. Becker他 、 Mol. Cell. Biol. 43: 161-89、 1994; お よ び J. T. Douglasお よ び D. T. Cu
30
riel、 Science & Medicine 4: 44-53、 1997) 。 ア デ ノ ウ イ ル ス 系 は い く つ か の 利 点 を 提
供 す る : ア デ ノ ウ イ ル ス は (i)比 較 的 大 き い DNAイ ン サ ー ト を 収 容 す る こ と が で き る ; (ii
) 高 い 力 価 に 増 殖 す る こ と が で き る ; (iii) 広 い 範 囲 の 哺 乳 動 物 細 胞 型 を 感 染 す る こ と が
で き る ; そ し て (iv) 異 な る プ ロ モ ー タ ー を 含 有 す る 多 数 の 異 な る 入 手 可 能 な ベ ク タ ー と
ともに使用することができる。また、アデノウイルスは血流中で安定であるので、静脈内
注射により投与できる。
【０２１５】
ア デ ノ ウ イ ル ス ゲ ノ ム の 一 部 分 を 欠 失 さ せ る こ と に よ っ て 、 異 種 DNAの 大 き い イ ン サ ー
ト (7 kbま で ) を 収 容 す る こ と が で き る 。 直 接 的 結 合 に よ る か 、 あ る い は 共 ト ラ ン ス フ ェ
ク ト さ れ た プ ラ ス ミ ド を 使 用 す る 相 同 的 組 換 え に よ り 、 こ れ ら の イ ン サ ー ト を ウ イ ル ス DN
40
Aの 中 に 組 込 む こ と が で き る 。 典 型 的 な 系 に お い て 、 必 須 E1遺 伝 子 は ウ イ ル ス ベ ク タ ー か
ら 欠 失 さ れ て お り 、 そ し て E1遺 伝 子 が 宿 主 細 胞 (ヒ ト 293細 胞 系 統 は 典 型 で あ る ) に よ り
提供されないかぎり、ウイルスは複製しないであろう。無傷の動物に静脈内投与するとき
、 ア デ ノ ウ イ ル ス は 肝 臓 を 主 と し て タ ー ゲ ッ テ ィ ン グ す る 。 ア デ ノ ウ イ ル ス 送 達 系 が E1遺
伝子の欠失を有する場合、ウイルスは宿主細胞中で複製することができない。しかしなが
ら 、 宿 主 細 胞 の 組 織 (例 え ば 、 肝 臓 ) は 異 種 タ ン パ ク 質 を 発 現 し か つ プ ロ セ ス す る で あ ろ
う (そ し て 、 分 泌 シ グ ナ ル 配 列 が 存 在 す る 場 合 、 分 泌 す る ) 。 分 泌 さ れ た タ ン パ ク 質 は 高
度に血管化した肝臓中の循環の中に入り、感染した動物に対する作用を測定することがで
きる。
【０２１６】
50
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その上、ウイルス遺伝子の種々の欠失を含有するアデノウイルスベクターを使用して、
ベクターに対する免疫応答を減少または排除することを試みることができる。このような
ア デ ノ ウ イ ル ス は E1が 欠 失 さ れ て お り 、 さ ら に E2Aま た は E4の 欠 失 を 含 有 す る (Lusky M.
他 、 J. Virol. 72: 2022-2032、 1998; Raper S. E. 他 、 Human Gene Therapy 9: 671-679
、 1998) 。 さ ら に 、 E2bの 欠 失 は 免 疫 応 答 を 減 少 さ せ る と 報 告 さ れ て い る (Amalfitano A.
他 、 J. Virol. 72: 926-933、 1998) 。 そ の 上 、 全 体 の ア デ ノ ウ イ ル ス ゲ ノ ム を 欠 失 す る
こ と に よ っ て 、 異 種 DNAの 非 常 に 大 き い イ ン サ ー ト を 収 容 す る こ と が で き る 。 す べ て の ウ
イ ル ス 遺 伝 子 が 欠 失 さ れ て い る い わ ゆ る 「 グ ー ト レ ス (gutless)」 ア デ ノ ウ イ ル ス の 発
生 は 、 異 種 DNAの 大 き い イ ン サ ー ト の 挿 入 の た め に 特 に 好 都 合 で あ る 。 概 観 に つ い て は 、
下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Yeh P.お よ び Perricaudet M.、 FASEB J. 11: 615-623、 1997。
10
【０２１７】
ま た 、 ア デ ノ ウ イ ル ス 系 を タ ン パ ク 質 の in vitro産 生 の た め に 使 用 す る こ と が で き る 。
細 胞 が 急 速 に 分 裂 し な い 条 件 下 に ア デ ノ ウ イ ル ス 感 染 非 293細 胞 を 培 養 す る こ と に よ っ て
、 細 胞 は 延 長 し た 時 間 の 間 タ ン パ ク 質 を 産 生 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 BHK細 胞 を 細 胞
ファクトリー中でコンフルエンスに成長させ、次いで問題の分泌されたタンパク質をコー
ドするアデノウイルスベクターに対して暴露させる。次いで細胞を無血清条件下に成長さ
せ、これにより感染した細胞は有意な細胞分裂なしに数週間生き残ることができる。選択
的 に 、 ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー が 感 染 し た 293S細 胞 を 比 較 的 高 い 細 胞 密 度 に お い て 懸 濁 培
養 で 成 長 さ せ て 、 有 意 な 量 の タ ン パ ク 質 を 産 生 す る こ と が で き る (Garnier他 、 Cytotechn
ol. 15: 145-55、 1994参 照 ) 。 い ず れ の プ ロ ト コ ル を 使 用 し て も 、 発 現 さ れ 、 分 泌 さ れ た
20
異 種 タ ン パ ク 質 を 細 胞 培 養 の 上 清 か ら 反 復 し て 単 離 す る こ と が で き る 。 感 染 し た 293S細 胞
産生プロトコルにおいて、非分泌タンパク質をまた効果的に得ることができる。
【０２１８】
可 溶 性 ま た は 細 胞 表 面 の タ ン パ ク 質 と し て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は ztnfr14が 結 合
するペプチドの活性はシリコンをベースとするバイオセンサーミクロフィジオメーターに
より測定できる。このバイオセンサーミクロフィジオメーターは細胞表面タンパク質の相
互作用に関連する細胞外酸性化速度またはプロトン外分泌を測定し、引き続いて生理学的
細 胞 応 答 を 測 定 す る 。 典 型 的 な 装 置 は Cytosensor
T M
(Molecular Devices、 カ リ フ ォ ル ニ
ア州サニーヴェイル製) である。種々の細胞応答、例えば、細胞増殖、イオン輸送、エネ
ルギー産生、炎症性応答、調節およびレセプターの活性化およびその他をこの方法により
30
測 定 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : McConnell H. M. 他 、 Scienc
e 257: 1906-1912、 1992; Pitchford S. 他 、 Meth. Enzymol. 228: 84-108、 1997; Arimi
lli S. 他 、 J. Immunol. Meth. 212: 49-59、 1998; Van Liefde I. 他 、 Eur. J. Pharmac
ol. 346: 87-95、 1998。
【０２１９】
付着性または非付着性真核細胞または原核細胞をアッセイするために、ミクロフィジオ
メーターを使用することができる。細胞培地中の細胞外酸性化の変化を経時的に測定する
こ と に よ っ て 、 ミ ク ロ フ ィ ジ オ メ ー タ ー は 、 ztnfr14仲 介 経 路 に 影 響 を 与 え る タ ン パ ク 質
、アゴニストおよびアンタゴニストを包含する種々の刺激因子に対する細胞の応答を直接
測 定 す る 。 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 応 答 性 真 核 細 胞 は 、 ztnfr14の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド が そ の 中
40
に ト ラ ン ス フ ェ ク ト さ れ 、 ztnfr14に 対 し て 応 答 性 で あ る 細 胞 を つ く る 細 胞 ; ま た は ztnfr
14の 活 性 化 に 対 し て 自 然 に 応 答 性 で あ る 細 胞 を 含 ん で な る 。
【０２２０】
ztnfr14活 性 化 に 対 し て 暴 露 し な い 対 照 に 関 係 し て ztnfr14活 性 化 に 対 し て 暴 露 し た 細 胞
の 応 答 の 変 化 に よ り 測 定 し た 差 は 、 ztnfr14仲 介 細 胞 応 答 の 直 接 的 測 定 値 で あ る 。 そ の 上
、 こ の よ う な ztnfr14仲 介 細 胞 応 答 を 種 々 の 刺 激 因 子 下 に ア ッ セ イ す る こ と が で き る 。 本
発 明 は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 活 性 化 に 対 し て 応 答 性 で あ る 細 胞 を 準 備 し 、 被 検 化 合 物
の 非 存 在 下 に 細 胞 の 第 1部 分 を 培 養 し 、 被 検 化 合 物 の 存 在 下 に 細 胞 の 第 2部 分 を 培 養 し 、 そ
し て 細 胞 の 第 1部 分 に 比 較 し て 細 胞 の 第 2部 分 の 細 胞 の 応 答 の 変 化 を 検 出 す る こ と を 含 ん で
な る 、 ztnfr14タ ン パ ク 質 の ア ゴ ニ ス ト お よ び ア ン タ ゴ ニ ス ト を 同 定 す る 方 法 を 提 供 す る
50
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。
【０２２１】
細 胞 の 応 答 の 変 化 は 、 細 胞 外 酸 性 化 速 度 の 測 定 可 能 な 変 化 と し て 示 さ れ る 。 そ の 上 、 zt
nfr14ポ リ ペ プ チ ド の 存 在 下 お よ び 被 検 化 合 物 の 非 存 在 下 に 細 胞 の 第 3部 分 を 培 養 す る こ と
は 、 ztnfr14応 答 性 細 胞 の た め の 陽 性 対 照 、 お よ び 被 検 化 合 物 の ア ゴ ニ ス ト 活 性 と ztnfr14
ポリペプチドのそれとを比較するための対照を提供する。被検化合物の存在および非存在
下 に ztnfr14タ ン パ ク 質 に 対 し て 細 胞 を 暴 露 す る こ と に よ っ て ztnfr14の ア ン タ ゴ ニ ス ト を
同 定 す る こ と が で き 、 そ れ に よ り ztnfr14刺 激 活 性 の 減 少 は 被 検 化 合 物 に お け る ア ン タ ゴ
ニスト活性を示す。
【０２２２】
10
同 様 に 、 ミ ク ロ フ ィ ジ オ メ ー タ ー を 使 用 し て 、 ztnfr14刺 激 経 路 を 活 性 化 す る 細 胞 、 組
織または細胞系統を急速に同定することができる。このような組織および細胞系統を使用
し て 、 前 述 し た よ う に 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の リ ガ ン ド 、 ア ン タ ゴ ニ ス ト お よ び ア ゴ ニ
ス ト を 同 定 す る こ と が で き る 。 同 様 な 方 法 に 従 い 、 ztnfr14を 発 現 す る 細 胞 を 使 用 し て 、 z
tnfr14シ グ ナ リ ン グ 経 路 を 刺 激 ま た は ブ ロ ッ ク す る 細 胞 を 同 定 す る こ と が で き る 。
【０２２３】
免 疫 細 胞 の 活 性 化 間 に お け る ztnfr14の ア ッ プ レ ギ ュ レ ー シ ョ ン に か ん が み て 、 ztnfr14
/ztnfr14リ ガ ン ド の 結 合 に 対 す る ア ゴ ニ ス ト (天 然 の シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 お よ び 細
胞 質 ド メ イ ン を 包 含 す る ) お よ び ア ン タ ゴ ニ ス ト は in vitro お よ び in vivo の 両 方 の 用
途 に お い て 莫 大 な 可 能 性 を 有 す る 。 ztnfr14の ア ゴ ニ ス ト お よ び ア ン タ ゴ ニ ス ト と し て 同
20
定 さ れ た 化 合 物 は 、 in vitroお よ び in vivoに お け る 細 胞 -細 胞 の 相 互 作 用 、 ア ポ ト ー シ ス
、腫瘍の増殖および抑制、感染および炎症を研究するために有効である。
【０２２４】
例 え ば 、 ztnfr14お よ び ア ゴ ニ ス ト 化 合 物 は 規 定 さ れ た 細 胞 培 地 の 成 分 と し て 有 効 で あ
り、そして単独で、あるいは他のサイトカインおよびホルモンと組み合わせて使用して、
細胞培養において普通に使用される血清を置換することができる。こうして、アゴニスト
は 培 養 に お い て 骨 髄 お よ び リ ン パ 球 系 の 細 胞 の 増 殖 お よ び /ま た は 発 生 を 特 異 的 に 促 進 す
る た め に 有 効 で あ る 。 さ ら に 、 小 分 子 を 包 含 す る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド お よ び ztnfr14ア ゴ
ニストは、例えば、子宮、ならびに黒色腫、骨肉腫、乳癌およびリンパ腫の膨張、分化、
増 殖 お よ び /ま た は 細 胞 -細 胞 の 相 互 作 用 の た め の 研 究 因 子 と し て 有 効 で あ る 。 ztnfr14ポ
30
リペプチドを、これらの細胞タイプのための組織培養培地に添加する。
【０２２５】
ztnfr14ア ゴ ニ ス ト と し て 同 定 さ れ た 化 合 物 は 、 in vitro お よ び in vivo に お い て タ
ーゲット細胞の増殖および発生を変更するために有効である。例えば、アゴニスト化合物
は、規定された細胞培養培地の成分として単独でまたは他のサイトカインおよびホルモン
と 組 合 わ せ て 有 効 で あ る 。 こ う し て 、 ア ゴ ニ ス ト は 培 養 に お い て ztnfr14支 持 Tリ ン パ 球 ま
た は 他 の ztnfr14支 持 細 胞 の 増 殖 お よ び /ま た は 発 生 を 特 異 的 に 仲 介 す る た め に 有 効 で あ る
。 ま た 、 ア ゴ ニ ス ト お よ び ア ン タ ゴ ニ ス ト は 、 Tリ ン パ 球 の エ フ ェ ク タ ー 機 能 、 特 に Tリ ン
パ球の活性化および分化の研究において有効であることを証明することができる。アンタ
ゴ ニ ス ト は リ ガ ン ド -レ セ プ タ ー の 相 互 作 用 を 特 性 決 定 す る 研 究 試 薬 と し て 有 効 で あ る 。
40
【０２２６】
TNFRフ ァ ミ リ ー の 1メ ン バ ー と し て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド は 感 染 に 対 す る 免 疫 応 答 に 関
係 す る と 推 定 さ れ る 。 リ ン ホ ト キ シ ン -β レ セ プ タ ー 、 こ の レ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー の 他 の
メ ン バ ー は 、 HIV-1複 製 を 調 節 す る こ と が 示 さ れ た (Marshall W. L. 他 、 J. Immun. 162:
6016-6023、 1999) 。 さ ら に 、 リ ン ホ ト キ シ ン -β お よ び TNF-レ セ プ タ ー を 介 す る 共 シ グ
ナ リ ン グ は HIV-1複 製 の モ ジ ュ レ ー シ ョ ン お よ び 引 き 続 く 単 球 に お け る HIV-1ウ イ ル ス 負 荷
の 決 定 に 多 分 関 係 づ け ら れ る こ と が 示 さ れ た 。 Ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 ア ゴ ニ ス ト お よ び
アンタゴニストを使用して、微生物感染を治療することができる。このような感染は、細
菌、酵母およびウイルスの感染を包含する。
【０２２７】
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タンパク質の抗微生物活性は、この分野において知られている技術により評価される。
例えば、被検剤に対する微生物細胞培養物の感度を評価し、そして感染したマウスに対す
る被検剤の保護作用を評価することによって、抗微生物活性をアッセイすることができる
。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Musiek 他 、 Autimicrob. Agents Chemothr. 3: 40
、 1973。 ま た 、 抗 ウ イ ル ス 活 性 は 哺 乳 動 物 細 胞 培 養 物 の 保 護 に よ り ア ッ セ イ す る こ と が で
きる。
【０２２８】
抗 微 生 物 活 性 を 評 価 す る 既 知 の 技 術 は 、 例 え ば 、 下 記 を 包 含 す る : Bausum 他 、 Eur. Re
spir. J. 8: 709-714、 1995; Sandovsky-Losica 他 、 J. Med. Vel. Mycol. (England) 28
: 279-287、 1990; Mchentee 他 、 J. Gen. Microbiol. (England) 135: 2181-2188、 1989;
10
お よ び Segalお よ び Savage、 J. Med. Vel. Mycol. 24: 477-479、 1986。 抗 ウ イ ル ス 活 性
に対して特異的なアッセイは、例えば、下記の文献に記載されているアッセイを包含する
: Daher 他 、 J. Virol. 60: 1068-1074、 1986。 同 様 に 、 細 胞 に 負 荷 さ れ た HIV-1ウ イ ル ス
を測定するアッセイを使用することができる。
【０２２９】
感 染 の 発 現 は シ ョ ッ ク で あ る 。 研 究 に お い て 、 血 清 TNFレ ベ ル の 増 加 は 高 い 死 亡 率 に 関
係 付 け ら れ る こ と が 示 さ れ る 。 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Wage A. 他 、 Lancet 1: 355-35
7、 1987お よ び Girardin 他 、 New. Eng. J. Med. 39: 397-400、 1988。 可 溶 性 TNFレ セ プ タ
ー は 、 本 発 明 の ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 包 含 し 、 TNFの 血 清 濃 度 を 減 少 さ せ 、 セ プ シ ス の 作
用を最小化するために有効である。
20
【０２３０】
ま た 、 本 発 明 は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 結 合 す る か 、 あ る い は 選 択 的 に ztnfr14ポ リ ペ
プ チ ド が 結 合 す る リ ガ ン ド に 結 合 し 、 こ れ に よ り ztnfr14の 機 能 を 阻 害 ま た は 排 除 す る ア
ン タ ゴ ニ ス ト を 提 供 す る 。 こ の よ う な ztnfr14ア ン タ ゴ ニ ス ト は 、 抗 体 ; ztnfr14ポ リ ペ プ
チドまたはそのリガンドに結合するポリペプチド; レセプターに結合する能力を保持する
が 、 レ セ プ タ ー ま た は レ セ プ タ ー の シ グ ナ リ ン グ を 生 じ な い ztnfr14リ ガ ン ド の 天 然 お よ
び合成のアナローグを包含するであろう。
【０２３１】
このようなアナローグはペプチドまたはペプチド様化合物であることができる。また、
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 結 合 し 、 シ グ ナ リ ン グ を 防 止 す る 天 然 ま た は 合 成 の 小 さ い 分 子 は
30
ア ン タ ゴ ニ ス ト と し て 考 え ら れ る 。 ま た 、 可 溶 性 ztnfr14レ セ プ タ ー が 考 え ら れ る 。 そ れ
自 体 と し て 、 ztnfr14ア ン タ ゴ ニ ス ト は 、 ztnfr14レ セ プ タ ー ま た は リ ガ ン ド か ら の ブ ロ ッ
キングシグナルが有益であるある種の障害を治療する治療剤として有効であろう。アンタ
ゴ ニ ス ト は 、 リ ガ ン ド -レ セ プ タ ー の 相 互 作 用 を 特 性 決 定 す る 研 究 試 薬 と し て 有 効 で あ る
。
【０２３２】
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 診 断 系 に お い て 使 用 し て 、 リ ガ ン ド ポ リ ペ プ チ ド の 存 在 を 検 出
す る こ と が で き る 。 ま た 、 ztnfr14に 特 異 的 に 結 合 す る 抗 体 ま た は 他 の 因 子 を 使 用 し て 、
循環するまたは膜結合したレセプターまたはリガンドのポリペプチドの存在を検出するこ
とができる。このような検出はこの分野において知られており、そして、例えば、酵素結
40
合 免 疫 収 着 ア ッ セ イ (ELISA) お よ び ラ ジ オ イ ム ノ ア ッ セ イ を 包 含 す る 。 免 疫 組 織 化 学 的
に 標 識 化 さ れ た ztnfr14抗 体 を 使 用 し て 、 組 織 試 料 中 の ztnfr14レ セ プ タ ー お よ び /ま た は
リ ガ ン ド を 検 出 す る こ と が で き る 。 ま た 、 ztnfr14レ ベ ル は RT-PCRの よ う な 方 法 に よ り モ
ニ タ ー す る こ と が で き 、 こ こ で ztnfr14 mRNAを 検 出 し 、 定 量 化 す る こ と が で き る 。 こ の よ
う な 検 出 法 か ら 誘 導 さ れ た 情 報 は 、 種 々 の 疾 患 に お け る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 意 味 の 洞
察 を 提 供 し 、 そ し て そ れ ら 自 体 ztnfr14レ ベ ル の 変 更 が 有 意 で あ る 疾 患 の た め の 診 断 ツ ー
ル と し て 働 く で あ ろ う 。 ztnfr14レ セ プ タ ー の ポ リ ペ プ チ ド レ ベ ル の 変 更 は 、 癌 、 自 己 免
疫疾患、骨の障害、炎症および免疫不全を包含する病理学症状を示すことができる。
【０２３３】
ま た 、 ア ン タ ゴ ニ ス ト は 補 体 /抗 補 体 対 の メ ン バ ー 間 の 相 互 作 用 部 位 な ら び に 細 胞 -細 胞
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の 相 互 作 用 部 位 を 特 性 決 定 す る た め の 研 究 試 薬 と し て 有 効 で あ る 。 ztnfr14活 性 の イ ン ヒ
ビ タ ー (ztnfr14ア ン タ ゴ ニ ス ト ) は 、 抗 ztnfr14抗 体 お よ び 可 溶 性 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド
(例 え ば 、 前 述 の も の ) な ら び に 他 の ペ プ チ ド お よ び 非 ペ プ チ ド 因 子 (リ ボ ザ イ ム を 包 含
する) を包含する。
【０２３４】
ま た 、 ztnfr14は そ の 活 性 の イ ン ヒ ビ タ ー (ア ン タ ゴ ニ ス ト ) を 同 定 す る た め に 使 用 で
き る 。 被 験 化 合 物 を 本 明 細 書 に 開 示 す る ア ッ セ イ に 添 加 し て 、 ztnfr14活 性 を 阻 害 す る 化
合 物 を 同 定 す る 。 本 明 細 書 に 開 示 す る ア ッ セ イ に 加 え て 、 レ セ プ タ ー /リ ガ ン ド の 結 合 ま
た は ztnfr14依 存 的 細 胞 応 答 の 刺 激 /阻 害 を 測 定 す る よ う に 設 計 さ れ た 種 々 の ア ッ セ イ に お
い て 、 試 料 を ztnfr14活 性 の 阻 害 に つ い て 試 験 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 ztnfr14刺 激 細
10
胞 経 路 に 対 し て 応 答 性 で あ る リ ポ ー タ ー 遺 伝 子 構 築 物 で 、 ztnfr14応 答 性 細 胞 系 統 を ト ラ
ンスフェクトすることができる。
【０２３５】
このタイプのリポーター遺伝子構築物はこの分野において知られており、そしてアッセ
イ 可 能 な タ ン パ ク 質 、 例 え ば 、 ル シ フ ェ ラ ー ゼ ま た は 代 謝 物 質 、 例 え ば 、 環 状 AMPを コ ー
ド す る 遺 伝 子 に 作 用 可 能 に 連 鎖 さ れ た DNA応 答 因 子 を 一 般 に 含 ん で な る 。 DNA応 答 因 子 は 下
記 の も の を 包 含 す る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い : 環 状 AMP応 答 因 子 (CRE) 、 ホ ル モ ン 応 答
因 子 (HRE) 、 イ ン ス リ ン 応 答 因 子 (IRE) (Nasrin他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
5273-7、 1990) お よ び 血 清 応 答 因 子 (SRE) (Shaw他 、 Cell 56: 563-72、 1989) 。 環 状 AMP
応 答 因 子 は 下 記 の 文 献 に お い て 概 観 さ れ て い る : Roestler他 、 J. Biol. Chem. 263 (19)
20
: 9063-6、 1988、 お よ び Habener、 Molec. Endocrinol. 4 (8) : 1087-94、 1990。 ホ ル モ
ン 応 答 因 子 は 下 記 の 文 献 に お い て 概 観 さ れ て い る : Beato、 Cell 56: 335-44、 1989。
【０２３６】
このようなリポーター遺伝子構築物はシステインに富んだ擬反復を含有し、このシステ
イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 は 、 TNFに 結 合 す る と 、 例 え ば 、 SREリ ポ ー タ ー を 通 し て 、 細 胞 内 に シ
グナリングするであろう。候補の化合物、溶液、混合物または抽出物をターゲット細胞に
対 す る ztnfr14活 性 を 阻 害 す る 能 力 に つ い て 試 験 す る 。 こ れ は リ ポ ー タ ー 遺 伝 子 発 現 の ztn
fr14刺 激 の 減 少 に よ り 証 明 さ れ る 。 こ の タ イ プ の ア ッ セ イ は 、 細 胞 表 面 の タ ン パ ク 質 、 す
な わ ち 、 リ ガ ン ド ま た は 相 補 的 /抗 相 補 的 対 の 抗 相 補 的 メ ン バ ー に 対 す る ztnfr14の 結 合 を
直 接 ブ ロ ッ ク す る 化 合 物 、 な ら び に 相 補 体 /抗 相 補 体 の 結 合 に 引 き 続 く 細 胞 経 路 に お け る
30
プロセスをブロックする化合物を検出するであろう。
【０２３７】
別 法 に お い て 、 検 出 可 能 な 標 識 (例 え ば 、
1 2 5
I、 ビ オ チ ン 、 セ イ ヨ ウ ワ サ ビ ペ ル オ キ シ
ダ ー ゼ 、 FITCお よ び そ の 他 ) で 標 識 化 し た ztnfr14を 使 用 し て 、 リ ガ ン ド に 対 す る ztnfr14
の結合の直接的ブロッキングについて、化合物または他の試料を試験することができる。
こ の タ イ プ の ア ッ セ イ に お い て 、 TNFに 対 す る 標 識 化 ztnfr14の 結 合 を 阻 害 す る 被 験 試 料 の
能力は阻害活性を指示し、これは二次アッセイにより確証することができる。結合アッセ
イ に お い て 使 用 す る TNFは 、 細 胞 の TNF、 可 溶 性 TNFま た は 単 離 さ れ 、 固 定 化 さ れ た TNFで あ
ることができる。
【０２３８】
40
ア ゴ ニ ス ト お よ び ア ン タ ゴ ニ ス ト の 活 性 は 、 レ セ プ タ ー /リ ガ ン ド の 結 合 の 潜 在 能 を 決
定 す る 活 性 ア ッ セ イ に よ り 決 定 す る こ と が で き る 。 NfKB、 NAAT-1お よ び AP-1に 対 す る レ セ
プター遺伝子構築物を共発現する、安定にトランスフェクトされた細胞系統を作ることが
で き 、 こ れ は ztnfr14を 発 現 す る 。 ztnfr14リ ガ ン ド は 、 こ れ ら の 構 築 物 中 の リ ポ ー タ ー 遺
伝 子 に 通 し て シ グ ナ リ ン グ す る こ と を 見 出 す こ と が で き る 。 可 溶 性 ztnfr14お よ び 抗 体 を
使用して、結合を測定することができる。
【０２３９】
ま た 、 ztnfr14リ ガ ン ド 結 合 性 ポ リ ペ プ チ ド を リ ガ ン ド の 精 製 に 使 用 す る こ と が で き る
。ポリペプチドを、使用条件下に安定である固体状支持体、例えば、アガロース、架橋ア
ガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、架橋ポ
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リアクリルアミド樹脂およびその他の材料のビーズ上に固定化する。固体状支持体にポリ
ペプチドを結合する方法はこの分野において知られており、そしてアミン化学、臭化シア
ン 活 性 化 、 N-ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド 活 性 化 、 エ ポ キ シ ド 活 性 化 、 ス ル フ ヒ ド リ ル 活 性
化およびヒドラジド活性化を包含する。得られる媒質は一般にカラムの形態に形造られ、
そ し て リ ガ ン ド を 含 有 す る 流 体 を カ ラ ム に 1回 ま た は そ れ 以 上 の 回 数 通 過 さ せ て 、 リ ガ ン
ド を レ セ プ タ ー ポ リ ペ プ チ ド に 結 合 さ せ る 。 次 い で 塩 濃 度 の 変 化 、 カ オ ト ロ ー プ 剤 (グ ア
ニ ジ ン HCl) ま た は リ ガ ン ド ま た は レ セ プ タ ー の 結 合 を 崩 壊 さ せ る pHを 使 用 し て 、 リ ガ ン
ドを溶離する。
【０２４０】
リ ガ ン ド 結 合 性 レ セ プ タ ー (ま た は 抗 体 、 相 補 体 /抗 相 補 体 の 対 の 一 方 の メ ン バ ー ま た
10
は他の細胞表面結合性タンパク質) またはその結合性フラグメント、および商業的に入手
可 能 な バ イ オ セ ン サ ー 計 装 (BIAcore、 Pharmacia Biosensor、 ニ ュ ー ジ ャ ー ジ イ 州 ピ ス カ
タウェイ) を使用するアッセイシステムを好都合に用いることができる。このようなレセ
プ タ ー 、 抗 体 、 相 補 体 /抗 相 補 体 の 対 の メ ン バ ー ま た は フ ラ グ メ ン ト を レ セ プ タ ー チ ッ プ
の 表 面 上 に 固 定 化 す る 。 こ の 計 装 の 使 用 は 、 Karlsson、 J. Immunol. Methods 145: 229-4
0、 1991お よ び Cunninghamお よ び Wells、 J. Mol. Biol. 234: 554-63、 1993に 開 示 さ れ て
いる。
【０２４１】
アミンまたはスルフヒドリルの化学を使用して、レセプター、抗体、メンバーまたはフ
ラグメントをフローセル内の金薄膜に結合させたデキストラン繊維に共有結合させる。試
20
験 試 料 を セ ル に 通 過 さ せ る 。 リ ガ ン ド 、 エ ピ ト ー プ 、 ま た は 相 補 体 /抗 相 補 体 の 反 対 の メ
ンバーが試料中に存在する場合、それはそれぞれ固定化されたリガンド、抗体またはメン
バーに結合し、媒質の屈折率を変化させ、これは金薄膜表面のプラズモンの共鳴の変化と
し て 検 出 さ れ る 。 こ の シ ス テ ム は 、 オ ン お よ び オ フ の 割 合 の 測 定 (こ れ か ら 結 合 ア フ ィ ニ
ティーを計算することができる) および結合の化学量論的評価を可能とする。
【０２４２】
また、リガンド結合性ポリペプチドを、この分野において知られている他のアッセイシ
ステムにおいて使用することができる。このようなシステムは、結合アフィニティーを測
定 す る ス キ ャ ッ チ ャ ー ド 分 析 (Scatchard、 Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72、 1949参 照 )
お よ び 比 色 ア ッ セ イ (Cunningham他 、 Science 253: 545-48、 1991; Cunningham他 、 Scien
30
ce 245: 821-25、 1991) を 包 含 す る 。
【０２４３】
「可溶性タンパク質」 は細胞膜に結合しないタンパク質である。可溶性タンパク質は
、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを欠如する、最も普通にリガンド結
合性のレセプターのポリペプチドである。可溶性タンパク質は追加のアミノ酸残基、例え
ば、ポリペプチドの精製を提供するか、あるいはペプチドを基質に結合させる部位を提供
する親和標識、または免疫グロブリンの定常領域の配列を含んでなることができる。多数
の細胞表面のタンパク質は、タンパク質分解により産生されるか、あるいは選択的にスプ
ラ イ ス さ れ た mRNAか ら 翻 訳 さ れ た 、 天 然 に 存 在 す る 可 溶 性 対 応 物 を 有 す る 。 そ れ ぞ れ 膜 定
着またはシグナルトランスダクションを提供するために十分なトランスメンブランおよび
40
細胞内ポリペプチドのセグメントの部分を欠如するとき、タンパク質はこれらのセグメン
トを実質的に含まないと言われる。
【０２４４】
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 可 溶 性 形 態 は 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド に 対 す る ア ン タ ゴ ニ ス ト ま
た は ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の ア ゴ ニ ス ト と し て 作 用 す る こ と が で き 、 そ し て 胃 、 子 宮 、 な
ら び に 黒 色 腫 、 神 経 芽 細 胞 腫 お よ び リ ン パ 腫 に お け る ztnfr14の 作 用 を モ ジ ュ レ ー ト す る
た め に 有 効 で あ ろ う 。 こ う し て 、 ト ラ ン ス メ ン ブ ラ ン ド メ イ ン を 含 有 し な い ztnfr14ポ リ
ペ プ チ ド の イ ソ 型 は 可 溶 性 で あ り 、 ztnfr14活 性 の ア ゴ ニ ス ト ま た は ア ン タ ゴ ニ ス ト と し
て作用することができる。この特質を有するポリペプチドは膜に定着されないので、それ
ら が 発 現 さ れ る 組 織 か ら 離 れ た 部 位 に お い て 作 用 す る こ と が で き る 。 こ う し て 、 ztnfr14
50
(50)
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ポリペプチドの可溶性形態の活性は、その膜定着対応物よりもいっそう広く拡大すること
が で き る 。 両 方 の イ ソ 型 は in vitroお よ び in vivoに お け る 本 発 明 の 効 果 を 研 究 す る と き
有効であろう。
【０２４５】
本 発 明 の 分 子 は 、 TNFま た は 細 胞 -細 胞 の 相 互 作 用 に 関 係 す る 補 体 /抗 補 体 の 対 の メ ン バ
ーを同定し、単離するために使用することができる。例えば、本発明のタンパク質および
ペプチドをカラム上に固定化し、そして膜調製物をカラム上に展開させることができる (
Immobilized Affinity Ligand Techniques、 Hermanson他 、 編 、 Academic Press、 カ リ フ
ォ ル ニ ア 州 サ ン デ ィ エ ゴ 、 1992、 pp. 195-202) 。 ま た 、 タ ン パ ク 質 お よ び ペ プ チ ド を 放
射 線 標 識 化 す る (Methods in Enzymol.、 vol. 182、 “ Guide to Protein Purification”
10
、 M. Deutscher、 編 、 Acad. Press、 サ ン デ ィ エ ゴ 、 1990、 721-37) か 、 あ る い は フ ォ ト
ア フ ィ ニ テ ィ ー 標 識 化 し (Brunner他 、 Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514、 1993お よ び Fed
an他 、 Biochem. Pharmacol. 33: 1167-80、 1984) そ し て 特 異 的 細 胞 表 面 タ ン パ ク 質 を 同
定することができる。
【０２４６】
本発明の分子は、異常な細胞の生長、増殖および分化をモジュレートするとき有効であ
ろ う 。 本 発 明 の ポ リ ペ プ チ ド 、 核 酸 お よ び /ま た は 抗 体 は 、 感 染 、 腫 瘍 増 殖 、 免 疫 不 全 、
自己免疫および生殖能に関連する障害の治療において使用することができる。本発明の分
子は、細胞接着、細胞融合およびシグナリングをモジュレートし、または多様な組織、例
えば、胃、子宮、神経芽細胞腫、黒色腫およびリンパ腫における病理学的症状の発生を治
20
療または予防するために使用することができる。特に、ある種の疾患はこのような診断、
治療または予防が可能である。これらの疾患は黒色腫、神経芽細胞腫、自己免疫疾患およ
び免疫不全を包含するが、これらに限定されない。本発明の分子を使用して、胃および子
宮における組織、ならびに黒色腫、神経芽細胞腫およびリンパ腫の細胞の阻害および増殖
をモジュレートすることができる。
【０２４７】
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は 、 ztnfr14活 性 を 増 加 ま た は 阻 害
さ せ よ う と す る 遺 伝 子 治 療 の 用 途 に お い て 有 効 で あ る 。 哺 乳 動 物 が 突 然 変 異 し た ztnfr14
遺 伝 子 を も つ か 、 あ る い は ztnfr14遺 伝 子 を も た な い 場 合 、 ztnfr14遺 伝 子 を 哺 乳 動 物 の 細
胞 の 中 に 導 入 す る こ と が で き る 。 1つ の 態 様 に お い て 、 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る
30
遺 伝 子 を in vivoに お い て ウ イ ル ス ベ ク タ ー の 中 に 導 入 す る 。 こ の よ う な ベ ク タ ー は 、 弱
毒 化 ま た は 欠 陥 DNAウ イ ル ス 、 例 え ば 、 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス (HSV) 、 肺 炎 ウ イ ル ス 、 EB
ウ イ ル ス (EBV) 、 ア デ ノ ウ イ ル ス 、 ア デ ノ 関 連 ウ イ ル ス (AAV) お よ び そ の 他 を 包 含 す る
が、これらに限定されない。欠陥ウイルスは、ウイルス遺伝子を完全にまたはほとんど完
全に欠如し、このようなウイルスは好ましい。
【０２４８】
欠陥ウイルスは、細胞の中に導入された後、感染性ではない。欠陥ウイルスベクターを
使用すると、ベクターが他の細胞を感染することができるということを無視して、特定の
局在化区域における細胞への投与が可能となる。特定のベクターの例は下記のものを包含
す る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い : 欠 陥 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス 1 (HSV1)の ベ ク タ ー (Kaplit
40
t他 、 Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-30、 1991) ; 弱 毒 化 ア デ ノ ウ イ ル ス 、 例 え ば 、 Str
atford-Perricaudet他 、 J. Clin. Invest. 90: 626-30、 1992に 記 載 さ れ て い る ベ ク タ ー ;
お よ び 欠 陥 ア デ ノ 関 連 ウ イ ル ス の ベ ク タ ー (Samulski他 、 J. Virol. 61: 3096-101、 198
7; Samulski他 、 J. Virol. 63: 3822-8、 1989) 。
【０２４９】
他 の 態 様 に お い て 、 ztnfr14遺 伝 子 を 、 例 え ば 、 下 記 の 文 献 に 記 載 さ れ て い る よ う に 、
レ ト ロ ウ イ ル ス の ベ ク タ ー の 中 に 導 入 す る こ と が で き る : Anderson他 、 米 国 特 許 第 5,399,
346号 ; Mann他 、 Cell 33: 153、 1983; Temin他 、 米 国 特 許 第 4,650,764号 ; Temin他 、 米 国
特 許 第 4,980,289号 ; Markowitz他 、 J. Virol. 62: 1120、 1988; Temin他 、 米 国 特 許 第 5,1
24,263号 ; Dougherty他 、 国 際 特 許 公 開 No. WO 95/07358、 公 開 1995年 3月 16日 ; お よ び Kuo
50
(51)
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他 、 Blood 82: 845、 1993。 選 択 的 に 、 ベ ク タ ー は リ ポ ソ ー ム を 使 用 す る in vivoリ ポ フ ェ
クションにより導入することができる。合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコー
ド す る 遺 伝 子 の in vivoト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン の た め の リ ポ ソ ー ム を 調 製 す る こ と が で き
る (Felgner他 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7、 1987; Mackey他 、 Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 85: 8027-31、 1988) 。
【０２５０】
in vivoに お い て 特 異 的 器 官 の 中 に 外 因 的 遺 伝 子 を 導 入 す る た め に リ ポ フ ェ ク シ ョ ン を
使用することは、ある種の特定の利点を有する。リポソームを特異的細胞にターゲッティ
ン グ す る 分 子 は 、 利 益 の 1つ の 領 域 を 表 す 。 さ ら に 詳 し く は 、 特 異 的 細 胞 に ト ラ ン ス フ ェ
ク シ ョ ン を 向 け る こ と は 利 益 の 1つ の 領 域 を 表 す 。 例 え ば 、 特 定 の 細 胞 の タ イ プ に ト ラ ン
10
スフェクションを向けることは、細胞の異種性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓
および脳において特に好都合であろう。脂質をターゲッティングの目的で他の分子に化学
的 に カ ッ プ リ ン グ さ せ る こ と が で き る 。 タ ー ゲ ッ テ ッ ド ペ プ チ ド (例 え ば 、 ホ ル モ ン ま た
は神経伝達物質) 、タンパク質、例えば、抗体、または非ペプチド分子をリポソームに化
学的にカップリングさせる。
【０２５１】
同 様 に 、 ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド (配 列 番 号 1、 3、 29お よ び 31) を 使 用 し て 、 胃 お よ
び子宮における特異的組織、ならびに黒色腫、神経芽細胞腫およびリンパ腫の細胞をター
ゲ ッ テ ィ ン グ す る こ と が で き る 。 体 か ら タ ー ゲ ッ ト 細 胞 を 除 去 す る こ と ; 裸 DNAプ ラ ス ミ
ドとしてベクターを導入すること; 次いで形質転換された細胞を体の中に再移植すること
20
が可能である。この分野において知られている方法、例えば、トランスフェクション、エ
レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 、 マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン 、 ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン 、 細 胞 融 合 、 DE
AEデ キ ス ト ラ ン 、 リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 沈 澱 法 、 遺 伝 子 ガ ン の 使 用 ま た は DNAベ ク タ ー の ト ラ
ン ス ポ ー タ ー の 使 用 に よ り 、 遺 伝 子 治 療 の た め の 裸 DNAベ ク タ ー を 必 要 な 宿 主 細 胞 の 中 に
導 入 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Wu他 、 J. Biol. Chem. 267:
963-7、 1992; Wu他 、 J. Biol. Chem. 263: 14621-4、 1988。
【０２５２】
ア ン チ セ ン ス お よ び リ ボ ザ イ ム の 方 法 を 包 含 す る 、 種 々 の 技 術 を 使 用 し て 、 ztnfr14遺
伝 子 の 転 写 お よ び 翻 訳 を 阻 害 す る こ と 、 例 え ば 、 in vivoに お け る 細 胞 増 殖 を 阻 害 す る こ
と が で き る 。 ztnfr14を コ ー ド す る mRNAに 結 合 し か つ こ の よ う な mRNAの 翻 訳 を 阻 害 す る よ
30
う に 、 ztnfr14を コ ー ド す る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド の セ グ メ ン ト (例 え ば 、 配 列 番 号 1ま た は 3
に記載するようなポリヌクレオチド) に対して相補的であるポリヌクレオチドを設計する
。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを使用して、細胞培養物または被検体におけ
る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 発 現 を 阻 害 す る 。
【０２５３】
ま た 、 ztnfr14遺 伝 子 を 発 現 す る よ う に 操 作 さ れ た マ ウ ス ( 「 ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ
ス 」 と 呼 ぶ ) 、 お よ び ztnfr14遺 伝 子 機 能 の 完 全 な 非 存 在 を 示 す マ ウ ス ( 「 ノ ッ ク ア ウ
ト マ ウ ス 」 と 呼 ぶ ) を 発 生 さ せ る こ と も で き る (Snouwaert他 、 Science 257: 1083、 199
2; Lowell他 、 Nature 366: 740-42、 1993; Capecchi M. R.、 Science 244: 1288-1292、 1
989; Palmiter R. D. 他 、 Annu. Rev. Genet. 20: 465-499、 1986) 。 例 え ば 、 偏 在 的 に
40
ま た は 組 織 特 異 的 ま た は 組 織 制 限 的 プ ロ モ ー タ ー 下 に 、 ztnfr14を 過 剰 に 発 現 す る ト ラ ン
スジェニックマウスを使用して、過剰発現が表現型を引き起こすかどうか決定することが
できる。
【０２５４】
例 え ば 、 野 生 型 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド 、 そ の ペ プ チ ド フ ラ グ メ ン ト ま た は 突 然 変 異 体 の
過 剰 発 現 は 正 常 の 細 胞 プ ロ セ ス を 変 更 し 、 組 織 を 同 定 す る 表 現 型 を 生 じ 、 こ こ で ztnfr14
の 発 現 は 機 能 的 に 関 係 づ け ら れ 、 こ れ に よ り ztnfr14、 そ の ア ゴ ニ ス ト ま た は ア ン タ ゴ ニ
ストに対する療法上のターゲットを示すことができる。例えば、操作するためのトランス
ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス は 、 可 溶 性 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は 膜 結 合 レ セ プ タ ー を 過 剰 に 発 現
するものである。その上、このような過剰発現は、ヒト疾患に対して類似性を示す表現型
50
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を 生 ず る こ と が あ る 。 同 様 に 、 ノ ッ ク ア ウ ト ztnfr14マ ウ ス を 使 用 し て 、 ztnfr14が in viv
oに お い て 絶 対 的 に 必 要 で あ る か ど う か 決 定 す る こ と が で き る 。
【０２５５】
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス の 表 現 型 は 、 ztnfr14ア ン タ ゴ ニ ス ト 、 例 え ば 、 本 明 細 書 に 記 載 す
る も の が 有 す る こ と が で き る in vivo作 用 を 示 す 。 ヒ ト ztnfr14 cDNAを 使 用 し て 、 ネ ズ ミ z
tnfr14 mRNA、 cDNAお よ び ゲ ノ ム DNAを 単 離 す る こ と が で き 、 引 き 続 い て こ れ ら を 使 用 し て
ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 発 生 さ せ る 。 こ れ ら の マ ウ ス を 用 い て ztnfr14遺 伝 子 お よ び in vivo
系においてこれによりコードされるタンパク質を研究することができ、そしてこれらのマ
ウ ス は 対 応 す る ヒ ト 疾 患 の た め の in vivoモ デ ル と し て 使 用 す る こ と が で き る 。 そ の 上 、
本 明 細 書 に 記 載 す る ztnfr14に 対 し て 向 け ら れ た ztnfr14ア ン チ セ ン ス ポ リ ヌ ク レ オ チ ド ま
10
たはリボザイムを発現するトランスジェニックマウスを、前述のトランスジェニックマウ
スと同様に使用することができる。
【０２５６】
In vivo モ デ ル に つ い て の 他 の 用 途 は 、 動 物 へ の 抗 原 投 与 の 送 達 、 引 き 続 く 可 溶 性 ztnf
r14ま た は そ の リ ガ ン ド の 投 与 、 お よ び T細 胞 の 応 答 ま た は ztnfr14発 現 細 胞 の 増 殖 ま た は
低下の測定を包含する。
T細 胞 依 存 性 お よ び T細 胞 独 立 性 の 免 疫 応 答 を 下 記 の 文 献 に 記 載 さ れ て い る よ う に し て 測
定 す る こ と が で き る : Perez-Melgosa 他 、 J. Immunol. 63: 1123-7、 1999。
【０２５７】
薬 学 的 研 究 を 放 射 線 標 識 化 し た 可 溶 性 ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド ま た は 融 合 物 と 関 連 し て 使
20
用 し て 、 こ の よ う な ポ リ ペ プ チ ド の in vivo 分 布 お よ び 半 減 期 を 決 定 す る こ と が で き る 。
さ ら に 、 動 物 モ デ ル を 使 用 し て 、 in vivo に お い て 腫 瘍 に 対 す る 可 溶 性 ztnfr14の 作 用 お
よび腫瘍の発生を決定することができる。
また、黒色腫、異常な細胞増殖、特に神経芽細胞腫およびリンパ腫に関係する増殖のた
め の 代 理 マ ー カ ー と し て ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を 使 用 す る こ と が 提 供 さ れ る 。 こ の よ う な
疾 患 を 有 す る 患 者 か ら 採 血 し 、 血 液 中 の ztnfr14可 溶 性 レ セ プ タ ー お よ び そ の リ ガ ン ド を
検出することができる。
【０２５８】
欠 陥 性 ztnfr14遺 伝 子 を 有 す る ヒ ト を 同 定 す る た め の プ ロ ー ブ と し て 、 ま た は 多 数 の TNF
Rフ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー を 含 む と し て 染 色 体 1の 領 域 に 見 出 さ れ た 突 然 変 異 を 同 定 す る た め
30
の プ ロ ー ブ と し て 、 ztnfr14遺 伝 子 は 有 効 で あ る こ と が あ る 。
また、本発明のポリヌクレオチドは調節可能なプロモーターと組合わせて使用すること
ができ、こうしてタンパク質の送達量を調節することができる。
【０２５９】
そ の 上 、 腫 瘍 の 進 行 お よ び 転 移 に 対 す る ztnfr14の 活 性 お よ び 作 用 を in vivo に お い て
測定できる。腫瘍の進行に対するポリペプチド、化合物または他の治療の影響を研究する
ために、いくつかの同系マウスのモデルが開発されてきている。これらのモデルにおいて
、継代培養した腫瘍細胞を腫瘍ドナーとして同一系統のマウスに移植する。細胞はレシピ
エントマウスに同様な特性を有する腫瘍に発生し、そして転移もまたいくつかのモデルに
お い て 起 こ る で あ ろ う 。 腫 瘍 モ デ ル は 、 な か で も 、 ル イ ス ラ ッ ト の 肺 癌 (ATCC No. CRL-1
40
642) お よ び B16黒 色 腫 (ATCC No. CRL-6323) を 包 含 す る 。 こ れ ら の 両 方 は 、 in vitro で
容 易 に 培 養 お よ び 操 作 さ れ る 、 C57BL6マ ウ ス に 対 し て 同 系 で あ る 、 普 通 に 使 用 さ れ る 腫 瘍
系統である。
【０２６０】
こ れ ら の 細 胞 系 統 の い ず れ か の 移 植 か ら 生 ず る 腫 瘍 は 、 C57BL6マ ウ ス に お い て 肺 へ 転 移
することができる。最近、ルイスラットの肺癌のモデルはマウスにおいて使用されて、血
管 形 成 の イ ン ヒ ビ タ ー が 同 定 さ れ た (O’ Reilly MS 他 、 Cell 79: 315-328、 1994) 。 C57
BL6/Jマ ウ ス を 組 換 え タ ン パ ク 質 、 ア ゴ ニ ス ト ま た は ア ン タ ゴ ニ ス ト の 毎 日 の 注 射 ま た は
5
組 換 え ア デ ノ ウ イ ル ス の 1回 の 注 射 に よ り 実 験 因 子 で 治 療 す る 。 こ の 治 療 後 3日 に 、 10 ∼ 1
6
0 細胞を背側皮膚の下に移植する。選択的に、移植前に細胞それら自体を組換えアデノウ
50
(53)
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イ ル ス 、 例 え ば 、 ztnfr14を 発 現 す る ウ イ ル ス で 感 染 さ せ 、 こ う し て タ ン パ ク 質 が 全 身 的
よ り む し ろ 腫 瘍 部 位 ま た は 細 胞 内 に お い て 合 成 さ れ る よ う に す る 。 通 常 、 マ ウ ス は 5日 以
内 に 可 視 の 腫 瘍 を 発 生 さ せ る 。 腫 瘍 を 3週 ま で の 期 間 の 間 増 殖 さ せ 、 そ の 期 間 内 に 腫 瘍 は
3
対 照 治 療 群 に お い て 1500∼ 1800 mm の 大 き さ に 到 達 す る こ と が あ る 。
【０２６１】
実験を通じて、腫瘍の大きさおよび体重を注意してモニターする。犠牲の時間において
、肺および肝臓に沿って腫瘍および取出し、秤量する。肺の重量は負荷された転移性腫瘍
と十分に相関することが示された。追加の計量法として、肺表面の転移を数計測する。こ
の分野において知られておりかつ本明細書に記載する方法を使用して、組織病理学的検査
、 免 疫 組 織 化 学 お よ び in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の た め に 、 切 除 し た 腫 瘍 、 肺 お よ
10
び肝臓を調製した。こうして、血管系を補充しかつ転移を行う腫瘍の能力に対する問題の
発 現 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 、 例 え ば 、 ztnfr14の 影 響 を 評 価 す る こ と が で き る 。 さ ら に 、 ア
デ ノ ウ イ ル ス の 使 用 を 別 と し て 、 移 植 し た 細 胞 を ztnfr14で 一 時 的 に ト ラ ン ス フ ェ ク ト す
ることができる。
【０２６２】
そ の 上 、 精 製 し た ztnfr14ま た は ztnfr14コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た 培 地 を こ の マ ウ ス の モ
デ ル に 直 接 注 射 し 、 こ う し て こ の 系 に お い て 使 用 す る こ と が で き る 。 In vivo に お け る zt
nfr14の 発 現 を 活 性 化 す る た め に 安 定 な ztnfr14ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン ト な ら び に 誘 導 可 能 な
プロモーターを使用することはこの分野において知られており、そしてこの系において使
用 し て 転 移 の ztnfr14誘 導 を 評 価 す る こ と が で き る 。 一 般 的 参 考 文 献 に つ い て は 、 下 記 の
20
文 献 を 参 照 の こ と : O’ Reilly MS 他 、 Cell 79: 335-328、 1994; お よ び Rusciano D 他 、
Murine Models of Liver Metastasis、 Invasion Metastasis 14: 349-361、 1995。
【０２６３】
Ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド お よ び 抗 体 を 診 断 系 に お い て 使 用 し て 、 そ の リ ガ ン ド ポ リ ペ プ チ
ド、例えば、腫瘍壊死因子のリガンドを検出することができる。このような検出法から誘
導 さ れ る 情 報 は 、 種 々 の 疾 患 に お け る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド の 意 味 に 対 す る 洞 察 を 提 供 し
、 ztnfr14レ ベ ル の 変 更 が 有 意 で あ る 疾 患 の た め の 診 断 ツ ー ル と し て 働 く で あ ろ う 。 ztnfr
14レ ベ ル の 変 更 は 、 癌 、 自 己 免 疫 疾 患 お よ び 感 染 症 を 包 含 す る 病 理 学 的 症 状 を 示 す こ と が
ある。
【０２６４】
30
基 本 的 ア ッ セ イ に お い て 、 一 本 鎖 プ ロ ー ブ を 生 物 学 的 試 料 か ら 単 離 し た RNAと と も に 、
プ ロ ー ブ と タ ー ゲ ッ ト ztnfr14種 と の 間 の 塩 基 対 合 を 促 進 す る 温 度 お よ び イ オ ン 強 度 の 条
件下にインキュベートする。ハイブリダイゼーションした分子から非結合プローブを分離
した後、ハイブリッドの量を検出する。
【０２６５】
RNA検 出 の 十 分 に 確 立 さ れ た ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 は 、 ノ ザ ン 分 析 お よ び ド ッ ト /ス
ロ ッ ト ブ ロ ッ ト ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 包 含 す る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と :
Ausbel 前 掲 お よ び Wu 他 (編 ) “ Analysis of Gene Expression at the RNA Level” 、 Me
thods in Gene Biotechnology pp. 225-239 (CRC Press, Inc.、 1997) 。 核 酸 プ ロ ー ブ を
放射性同位体、例えば、
3 2
Pま た は
3 5
Sで 検 出 可 能 に 標 識 化 で き る 。 選 択 的 に 、 ztnfr14 RN
40
Aは 非 放 射 能 的 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 で 検 出 で き る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ
と : Issac (編 者 ) Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes、 H
uman Press, Inc.、 1993) 。 典 型 的 に は 、 非 放 射 能 的 検 出 は 発 色 性 ま た は 化 学 発 光 性 物 質
の酵素転化により達成される。例示的非放射性部分は、ビオチン、フルオレセインおよび
ジゴキシゲニンを包含する。
【０２６６】
ま た 、 ztnfr14オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ロ ー ブ は in vivo 診 断 に お い て 有 効 で あ る 。 例 示
として、
1 8
F標 識 化 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 被 検 体 に 投 与 し 、 陽 電 子 放 射 断 層 写 真 に よ り 可
視 化 す る (Tavitian 他 、 Nature Medicine 4: 467、 1998) 。
【０２６７】
50
(54)
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多 数 の 診 断 手 順 は ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 (PCR) を 利 用 し て 、 検 出 法 の 感 度 を 増 加 さ せ
る 。 PCRを 実 行 す る 標 準 的 技 術 は よ く 知 ら れ て い る (一 般 に 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : M
athew (編 者 ) Protocols in Human Molecular Genetics (Human Press, Inc.、 1991) 、 W
hite (編 者 ) PCR Protocols: Current Methods and Applications (Human Press, Inc.
、 1993) 、 Cotter (編 者 ) Molecular Diagnosis of Cancer (Human Press, Inc.、 1996)
、 Hanausekお よ び Walaszek (編 者 ) Tumor Marker Protocols (Human Press, Inc.、 1998)
、 Lo (編 者 ) Clinical Applications of PCR (Human Press, Inc.、 1998) 、 お よ び Melt
zer (編 者 ) PCR in Bioanalysis PCR (Human Press, Inc.、 1998)) 。 特 定 の ztnfr14ド メ
イ ン ま た は モ チ ー フ 、 例 え ば 、 ztnfr14シ ス テ イ ン に 富 ん だ 擬 反 復 を コ ー ド す る 配 列 を 増
幅 す る よ う に 、 PCRプ ラ イ マ ー を 設 計 す る こ と が で き る 。
10
【０２６８】
診 断 ア ッ セ イ の た め の PCRの 1つ の バ ー ジ ョ ン は 、 逆 転 写 PCR (RT‐ PCR) で あ る 。 RT-PCR
技 術 に お い て 、 RNAを 生 物 学 的 試 料 か ら 単 離 し 、 cDNAに 逆 転 写 し 、 そ し て cDNAを ztnfr14プ
ラ イ マ ー と イ ン キ ュ ベ ー ト す る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Wu 他 (編 ) “ Rapid
Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR” 、 Methods in Gene Biotechnology、 C
RC Press, Inc.、 pp. 15-28、 1997) 。 次 い で PCRを 実 行 し 、 生 成 物 を 標 準 的 技 術 に 従 い 分
析する。
【０２６９】
例 示 と し て 、 RNAを 、 例 え ば 、 前 述 の グ ア ジ ニ ウ ム -チ オ シ ア ネ ー ト 細 胞 溶 解 法 に よ り 、
生 物 学 的 試 料 か ら 単 離 す る 。 選 択 的 に 、 固 相 技 術 を 使 用 し て 、 細 胞 ラ イ ゼ イ ト か ら mRNAを
20
単 離 で き る 。 ラ ン ダ ム オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド 、 dTの 短 い ホ モ ポ リ マ ー ま た は ztnfr14ア ン チ
セ ン ス オ リ ゴ マ ー を 使 用 し て 、 単 離 さ れ た RNAで 、 逆 転 写 反 応 を 開 始 で き る 。 オ リ ゴ -dTプ
ラ イ マ ー は 、 種 々 の mRNAヌ ク レ オ チ ド を 増 幅 し て 、 対 照 タ ー ゲ ッ ト 配 列 を 得 る こ と が で き
る と い う 利 点 を 与 え る 。 典 型 的 に は 少 な く と も 5塩 基 長 さ で あ る 2つ の フ ラ ン キ ン グ オ リ ゴ
ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー を 使 用 す る ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 に よ り 、 ztnfr14配 列 を 増 幅 す
る。
【０２７０】
PCR増 幅 生 成 物 を 種 々 の ア プ ロ ー チ に よ り 検 出 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 PCR生 成 物 を
ゲル電気泳動により分画し、臭化エチジウム染色により可視化する。選択的に、分画され
た PCR生 成 物 を 膜 に 移 し 、 検 出 可 能 に 標 識 化 さ れ た ztnfr14プ ロ ー ブ と ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ
30
ョンさせ、オートラジオグラフィーにより検査できる。追加の別のアプローチは、ジゴキ
シ ゲ ニ ン 標 識 化 デ オ キ シ リ ボ 核 酸 ト リ ホ ス フ ェ ー ト を 使 用 し て 、 化 学 発 光 検 出 お よ び C-TR
AK比 色 ア ッ セ イ を 実 施 す る 。
【０２７１】
他 の ア プ ロ ー チ は 実 時 間 定 量 的 PCRで あ る (Perkin Elmer Cetus、 コ ネ チ カ ッ ト 州 ノ ー
ウォーク) 。結合したリポーター色素およびクエンチャー色素の両方を有するオリゴヌク
レオチドから成る蛍光発生プローブは、前方向プライマーと逆方向プライマーとの間で特
異 的 に ア ニ ー ル す る 。 Taq DNAポ リ メ ラ ー ゼ の 5’ エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 を 使 用 し て 、
リポーター色素をクエンチャー色素から分離し、配列特異的シグナルを発生させ、これは
増 幅 が 増 加 す る と と も の 増 加 す る 。 PCR反 応 間 に 、 蛍 光 強 度 を 連 続 的 に モ ニ タ ー し 、 定 量
40
化する。
【０２７２】
ztnfr14を 検 出 す る 他 の ア プ ロ ー チ は サ イ ク リ ン グ プ ロ ー ブ 技 術 (CPT) で あ り 、 こ こ で
一 本 鎖 DNAタ ー ゲ ッ ト は 過 剰 の DNA-RNA-DNAキ メ ラ プ ロ ー ブ と 結 合 し て 複 合 体 を 形 成 し 、 RN
A部 分 を RNaseHで 切 断 し 、 そ し て 切 断 さ れ た キ メ ラ プ ロ ー ブ の 存 在 を 検 出 す る (例 え ば 、
下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Beggs 他 、 J. Clin. Microbiol. 34: 2985、 1996お よ び Bekkao
ui 他 、 Biotechniques 20: 240、 1996) 。 Ztnfr14配 列 を 検 出 す る 別 法 に お い て 、 下 記 の
よ う な ア プ ロ ー チ を 利 用 で き る : 核 酸 配 列 に 基 づ く 増 幅 (NASBA) 、 ク ロ ス ハ イ ブ リ ダ イ
ゼ ー シ ョ ン に よ る 鋳 型 の 共 同 増 幅 (CATCH) お よ び リ ガ ー ゼ 連 鎖 反 応 (LCR) (例 え ば 、 下
記 文 献 を 参 照 の こ と ： Marshall 他 、 米 国 特 許 第 5,686,272号 (1997) 、 Dyer 他 、 J. Viro
50
(55)
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l. Methods 60: 161、 1996、 Ehrich 他 、 Eur. J. Biochem. 243: 358、 1997お よ び Chadwi
ck 他 、 J. Virol. Methods 70: 59、 1998) 。 他 の 標 準 的 方 法 は こ の 分 野 に お い て 知 ら れ
ている。
【０２７３】
ま た 、 ztnfr14プ ロ ー ブ お よ び プ ラ イ マ ー を 使 用 し て 、 組 織 試 料 に お け る ztnfr14遺 伝 子
の 発 現 を 検 出 し 、 位 置 決 定 す る こ と が で き る 。 こ の よ う な in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ
ン 法 は こ の 分 野 に お い て よ く 知 ら れ て い る (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Choo (編
者 ) In Situ Hybridization Protocols、 Human Press, Inc.、 1994; Wu 他 (編 ) “ Analy
sis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive in Situ Hybridization (R
ISH)” 、 Methods in Gene Biotechnology、 CRC Press, Inc.、 pp. 259-278、 1997お よ び W
10
u 他 (編 ) “ Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence in Situ Hyb
ridization (FISH)” 、 Methods in Gene Biotechnology、 CRC Press, Inc.、 pp. 279-289
、 1997) 。
【０２７４】
種 々 の 追 加 の 診 断 ア プ ロ ー チ は こ の 分 野 に お い て よ く 知 ら れ て い る (例 え ば 、 下 記 の 文
献 を 参 照 の こ と : Mathew (編 者 ) Protocols in Human Molecular Genetics Human Press,
Inc.、 1991; Colemanお よ び Tsongalis、 Molecular Diagnostics、 Human Press, Inc.、 1
996; お よ び Elles、 Molecular Diagnostics of Genetic Disease、 Human Press, Inc.、 1
996) 。
【０２７５】
20
さらに、このようなポリヌクレオチドプローブを使用して、個々の染色体上の対応物に
対 し て ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ る こ と が で き る で あ ろ う 。 染 色 体 の 同 定 お よ び /ま た
は ztnfr14遺 伝 子 の マ ッ ピ ン グ に よ り 、 遺 伝 子 機 能 お よ び 疾 患 の ア ソ シ エ ー シ ョ ン つ い て
の有効な情報を得ることができるであろう。多数のマッピング技術、例えば、幹細胞ハイ
ブ リ ッ ド の マ ッ ピ ン グ お よ び 蛍 光 in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン (FISH) は 当 業 者 に と
って利用可能である。好ましい方法は放射線ハイブリッドマッピングである。放射線ハイ
ブリッドマッピングは、哺乳動物染色体の高い分解能の隣接地図を構築するために開発さ
れ た 、 細 胞 遺 伝 的 技 術 で あ る (Cox 他 、 Science 250: 245-50、 1990) 。
【０２７６】
遺伝子配列の部分的または完全な知識は、染色体放射線ハイブリッドマッピングパネル
30
と と も に 使 用 す る た め に 適 当 な PCRプ ラ イ マ ー の 設 計 を 可 能 と す る 。 ヒ ト ゲ ノ ム 全 体 を カ
バ ー す る 、 商 業 的 に 入 手 可 能 な 放 射 線 ハ イ ブ リ ッ ド マ ッ ピ ン グ パ ネ ル 、 例 え ば 、 Stanford
G3 RH Panelお よ び GeneBrige 4 RH Panel (Research Genetics, Inc.、 ア ラ バ マ 州 ハ ン
ツヴィレ) が入手可能である。これらのパネルは、問題の領域内の遺伝子、配列タッグド
部 位 (STS) 、 お よ び 他 の 非 多 形 性 お よ び 多 形 性 マ ー カ ー の 急 速 な PCRに 基 づ く 染 色 体 位 置
決定および排列を可能とする。
【０２７７】
これは、新しく発見された問題の遺伝子と以前にマッピングされたマーカーとの間の比
例的物理的距離の直接的確立を包含する。遺伝子の位置に関する正確な知識は、下記を包
含 す る 多 数 の 方 法 に お い て 有 効 で あ ろ う : 1) 配 列 が 存 在 す る コ ン テ ィ グ の 一 部 分 で あ る
40
か ど う か を 決 定 し 、 種 々 の 形 態 の 追 加 の 取 り 囲 む 遺 伝 的 配 列 、 例 え ば 、 YAC-、 BAC-ま た は
cDNAク ロ ー ン を 得 る 、 2) 同 一 染 色 体 領 域 に 対 す る 連 鎖 を 示 す 遺 伝 性 疾 患 の 考 え ら れ る 遺
伝 子 を 提 供 す る 、 お よ び 3) モ デ ル 生 物 、 例 え ば 、 特 定 の 遺 伝 子 が ど ん な 機 能 を 有 す る か
を決定するのを促進するために有益であろうマウスを相互参照する。
【０２７８】
配 列 番 号 2の ztnfr14ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は 、 染 色 体 1q36.3に マ ッ ピ ン グ さ れ た 。 こ う し て
、 本 発 明 は 、 ま た 、 診 断 用 途 に お い て 使 用 さ れ る 試 薬 を 提 供 す る 。 例 え ば 、 ztnfr14遺 伝
子 、 ztnfr14 DNAま た は RNAを 含 ん で な る プ ロ ー ブ ま た は そ れ ら の サ ブ 配 列 を 使 用 し て 、 zt
nfr14遺 伝 子 が 染 色 体 1q36.3上 に 存 在 す る か ど う か 、 ま た は 突 然 変 異 が 起 こ っ た か ど う か
を 決 定 す る こ と が で き る 。 ztnfr14遺 伝 子 座 に お け る 検 出 可 能 な 染 色 体 異 常 は 下 記 の も の
50
(56)
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を 包 含 す る が 、 こ れ ら に 限 定 さ れ な い : こ の 遺 伝 子 ま た は 前 記 遺 伝 子 座 に 位 置 す る TNFRフ
ァ ミ リ ー の 他 の 6メ ン バ ー に お け る 異 数 性 、 遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 変 化 、 挿 入 、 欠 失 、 制 限 部
位の変化および再配列。これらの異常は、コーディング配列内、イントロン内、または上
流プロモーターおよび調節領域を含むフランキング配列内で発生することがあり、そして
コーディング配列内の物理的変更または遺伝子発現レベルの変化として発現されることが
ある。
【０２７９】
このような異常は、本発明のポリヌクレオチドを使用して、分子遺伝学的技術、例えば
、 制 限 フ ラ グ メ ン ト 長 さ の 多 形 性 (RFLP) 分 析 、 PCR技 術 を 使 用 す る 短 い 縦 列 反 復 (STR)
分析、およびこの分野において知られている他の遺伝学的結合分析技術に従い検出するこ
10
と が で き る (Sambrook他 、 前 掲 ; Ausubel他 、 前 掲 ; Marian、 Chest 108: 255-65、 1995)
。
【０２８０】
一 般 に 、 こ れ ら の 診 断 法 は 下 記 の 工 程 を 含 ん で な る : (a) 患 者 か ら 遺 伝 的 試 料 を 採 取 し
、 (b) ポ リ ヌ ク レ オ チ ド が 相 補 的 ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 配 列 に 対 し て ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン
する条件下に、遺伝的試料を上に開示したポリヌクレオチドのプローブまたはプライマー
と イ ン キ ュ ベ ー ト し て 第 1反 応 生 成 物 を 生 成 し 、 そ し て (c) 第 1反 応 生 成 物 を 対 照 反 応 生
成 物 と 比 較 す る 。 第 1反 応 生 成 物 と 対 照 反 応 生 成 物 と の 間 の 差 は 、 患 者 に お け る 遺 伝 的 異
常 性 を 示 す 。 本 発 明 に お い て 使 用 す る 遺 伝 的 試 料 は 、 ゲ ノ ム DNA、 cDNAお よ び RNAを 包 含 す
る。
20
【０２８１】
ポ リ ヌ ク レ オ チ ド の プ ロ ー ブ ま た は プ ラ イ マ ー は RNAま た は DNAで あ る こ と が で き 、 配 列
番 号 1ま た は 3の 一 部 分 、 配 列 番 号 1ま た は 3の 相 補 体 、 ま た は そ れ ら の RNA同 等 物 を 含 ん で
なるであろう。これに関して適当なアッセイ法は下記を包含する: この分野において知ら
れ て い る 分 子 遺 伝 学 的 技 術 、 例 え ば 、 制 限 フ ラ グ メ ン ト 長 さ 多 形 性 (RFLP) 分 析 、 PCR技
術 を 使 用 す る 短 い 縦 列 反 復 (STR) 分 析 、 連 結 連 鎖 反 応 (Barany、 PCR Methods and Appli
cations 1: 5-16、 1991) 、 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ プ ロ テ ク シ ョ ン ア ッ セ イ 、 お よ び こ の 分 野
に お い て 知 ら れ て い る そ の 他 の 遺 伝 学 的 連 鎖 分 析 技 術 (Sambrook 他 、 前 掲 ; Ausubel他 、
前 掲 ; Marian、 Chest 108: 255-65、 1995) 。
【０２８２】
30
リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ プ ロ テ ク シ ョ ン ア ッ セ イ (例 え ば 、 下 記 の 文 献 を 参 照 の こ と : Ausube
l他 、 前 掲 、 ch. 4) は 、 RNAプ ロ ー ブ を 患 者 の RNAに 対 し て ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン さ せ 、
次 い で 反 応 生 成 物 (RNA-RNAハ イ ブ リ ッ ド ) を RNア ー ゼ に 対 し て 暴 露 す る こ と を 含 ん で な
る 。 RNAの ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン し た 領 域 は 消 化 か ら 保 護 さ れ る 。 PCRア ッ セ イ に お い て
、 患 者 の 遺 伝 的 試 料 を 1対 の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー と イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 プ ラ イ マ
ー間の領域を増幅させ、回収する。回収された生成物の大きさまたは量の変化は、患者に
お け る 突 然 変 異 を 示 す 。 使 用 で き る 他 の PCRに 基 づ く 技 術 は 、 一 本 鎖 コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン
多 形 性 (SSCP) 分 析 で あ る (Hayashi、 PCR Methods and Applications 1: 34-8、 1991)
。
【０２８３】
40
ア ン チ セ ン ス 法 を 使 用 し て 、 ztnfr14遺 伝 子 の 転 写 を 阻 害 す る こ と 、 例 え ば 、 T細 胞 の 発
生 お よ び 他 の 細 胞 と の 相 互 作 用 を 阻 害 す る こ と が で き る 。 ztnfr14を コ ー ド す る ポ リ ヌ ク
レ オ チ ド (例 え ば 、 配 列 番 号 2、 27ま た は 38) の セ グ メ ン ト に 対 し て 相 補 的 で あ る ポ リ ヌ
ク レ オ チ ド を 設 計 し て 、 ztnfr14を コ ー ド す る mRNAに 結 合 さ せ 、 こ の よ う な mRNAの 翻 訳 を
阻害する。このようなアンチセンスポリヌクレオチドを使用して、細胞培養物または被検
体 に お け る ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 発 現 を 阻 害 す る 。
【０２８４】
さ ら に 、 本 発 明 の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド は X染 色 体 の た め の マ ー カ ー と し て 使 用 す る こ と が
で き る 。 1q36.3に マ ッ ピ ン グ さ れ る 疾 患 は 、 こ の 位 置 に お け る 6つ の 他 の TNFRメ ン バ ー に
関連する疾患を包含する。
50
(57)
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ztnfr14の ポ リ ペ プ チ ド は 、 神 経 芽 細 胞 腫 、 黒 色 腫 ま た は リ ン パ 腫 、 な ら び に 胃 お よ び
子宮の腫瘍の抗原性マーカーを表すことができる。こうして、これらのポリペプチドまた
はそれらのフラグメントは、これらの特異的腫瘍を治療するヒト化抗体を産生する抗原と
して有効である。さらに、これらのポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントは、癌
治療に使用するワクチンを発生させるために有効である。
【０２８５】
薬 学 的 に 使 用 す る た め に 、 本 発 明 の タ ン パ ク 質 は 、 経 口 的 、 経 直 腸 的 、 非 経 口 的 (特 に
静 脈 内 ま た は 皮 下 ) 、 槽 内 、 腹 腔 内 、 局 所 的 (圧 注 剤 、 粉 剤 、 軟 膏 、 点 滴 剤 ま た は 経 皮 的
パッチとして) 、頬に、または胸または鼻の吸入剤として投与することができる。静脈内
投 与 は 、 1∼ 数 時 間 の 典 型 的 な 時 間 に わ た る ボ ー ラ ス 注 射 ま た は 注 入 に よ る で あ ろ う 。 一
10
般 に 、 医 薬 処 方 物 は ztnfr14タ ン パ ク 質 単 独 、 ま た は そ れ と 、 薬 学 上 許 容 さ れ る ビ ヒ ク ル
、 例 え ば 、 生 理 食 塩 水 、 緩 衝 化 生 理 食 塩 水 、 水 中 の 5％ デ キ ス ト ロ ー ス ま た は そ の 他 と の
組 合 わ せ を 包 含 す る で あ ろ う 。 処 方 物 は 、 さ ら に 、 1ま た は 2以 上 の 賦 形 剤 、 保 存 剤 、 可 溶
化剤、緩衝化剤、バイアル表面上のタンパク質の損失を防止するためのアルブミンおよび
その他を含むことができる。
【０２８６】
処方法はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に開示され
て い る : Remington、 The Science and Practice of Pharmacy、 Gennaro、 編 、 Mack Publi
shing Company、 ペ ン シ ル ベ ニ ア 州 イ ー ス ト ン 、 第 19版 、 1995。 治 療 投 与 量 は 一 般 に 0.1∼
100μ g/kgの 患 者 体 重 /日 、 好 ま し く は 0.5∼ 20 mg/kg/日 の 範 囲 で あ り 、 正 確 な 投 与 量 は 、
20
承認された標準に従い、治療すべき症状の特質および重症度、患者の体質およびその他を
考慮して、臨床医により決定される。投与量の決定は当業者のレベルの範囲内である。
【０２８７】
タ ン パ ク 質 は 、 急 性 治 療 の た め に 、 1週 ま た は そ れ よ り 短 い 期 間 に わ た っ て 、 し ば し ば 1
∼ 3日 の 期 間 に わ た っ て 投 与 す る こ と が で き る か 、 あ る い は 慢 性 的 治 療 に お い て 、 数 カ 月
ま た は 数 年 間 に わ た っ て 使 用 す る こ と が で き る 。 一 般 に 、 ztnfr14の 治 療 的 に 有 効 な 量 は
、腫瘍の抑制、アポトーシス、筋形成、子宮組織における炎症および感染、肺および乳房
の癌、ならびに 黒色腫、骨肉腫およびリンパ腫の細胞において臨床的に有意な変化を産
生 す る た め に 十 分 な 量 で あ る 。 同 様 に 、 ztnfr14の 治 療 的 有 効 量 は 、 胃 、 子 宮 、 黒 色 腫 、
神経芽細胞腫およびリンパ腫の組織に関連する疾患において臨床的に有意な変化を生成す
30
るために十分である量である。
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【０２８８】
実 施 例 １ ． EST配 列 の エ ク ス テ ン シ ョ ン
最 初 に 、 部 分 的 配 列 の デ ー タ ベ ー ス を 検 索 す る こ と に よ っ て 、 本 発 明 の 新 規 な ztnfr14
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定した。部分的配列は、胃、子宮および
癌 の cDNAラ イ ブ ラ リ ー に お い て 同 定 さ れ た 。 cDNAク ロ ー ン に 対 応 す る イ ン サ ー ト の ポ リ ヌ
ク レ オ チ ド 配 列 (配 列 番 号 1) を 配 列 決 定 し た 。 イ ン サ ー ト の 推 定 さ れ た ア ミ ノ 酸 配 列 は
全 長 で あ る こ と が 決 定 さ れ 、 配 列 番 号 2に 示 す 。 追 加 の ESTの ス ク リ ー ニ ン グ に よ り 、 2つ
40
の ス プ ラ イ ス 変 異 型 の 部 分 的 配 列 が 得 ら れ た : ztnfr14× 2 (配 列 番 号 29) お よ び ztnfr14
× 3 (配 列 番 号 31) 。 こ れ ら の ポ リ ヌ ク レ オ チ ド お よ び そ れ ら を コ ー ド す る ポ リ ペ プ チ ド
は 、 腫 瘍 壊 死 因 子 レ セ プ タ ー フ ァ ミ リ ー ztnfr14の 新 規 な メ ン バ ー と し て 同 定 さ れ た 。
【０２８９】
実施例２．組織分布
ヒ ト 多 組 織 ノ ザ ン ブ ロ ッ ト (MTN I,MTN IIお よ び MTN III; ヒ ト 癌 細 胞 系 統 ; ヒ ト 免 疫
ブ ロ ッ ト ; Clontec、 イ ン -ハ ウ ス ヒ ト リ ン パ 球 サ ブ セ ッ ト ブ ロ ッ ト ; Clontec、 カ リ フ ォ
ル ニ ア 州 パ ル ア ル ト ) を プ ロ ー ビ ン グ し て 、 ヒ ト ztnfr14発 現 の 組 織 分 布 を 決 定 す る 。 プ
ローブをテンプレートとして増幅し、適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして調製
す る 。 増 幅 は 次 の よ う に 実 施 す る : 1サ イ ク ル の 94℃ に お け る 1.5分 間 、 35サ イ ク ル の 94℃
50
(58)
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に お け る 15秒 間 お よ び 60℃ に お け る 30秒 間 、 次 い で 1サ イ ク ル の 72℃ に お け る 10分 間 。 PCR
生 成 物 を ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 可 視 化 し 、 ゲ ル 抽 出 キ ッ ト (Qiagen、 カ リ フ ォ ル
ニア州チャッツワース) を製造業者のインストラクションに従い使用して精製する。
【０２９０】
MULTIPRIME DNA標 識 化 キ ッ ト (Amersham、 イ リ ノ イ 州 ア ー リ ン ト ン ハ イ ツ ) を 製 造 業 者
の イ ン ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て 、 プ ロ ー ブ を 放 射 線 標 識 化 す る 。 こ の プ ロ ー ブ を NU
CTRAPプ ッ シ ュ カ ラ ム (Stratagene) に よ り 精 製 す る 。 EXPRESSHYB (Clontech) 溶 液 を プ
レハイブリダイゼーションのために使用し、そしてノザンブロットのハイブリダイゼーシ
ョ ン 溶 液 と し て 使 用 す る 。 1× 10
6
cm/mlの 標 識 化 プ ロ ー ブ を 使 用 し て 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー
シ ョ ン を 65℃ に お い て 一 夜 実 施 す る 。 次 い で プ ロ ー ブ を 2× SSCお よ び 0.1% SDS中 で 室 温 に
10
お い て 4回 洗 浄 し 、 次 い で 0.1× SSCお よ び 0.1% SDS中 で 55℃ に お い て 2回 洗 浄 す る 。
【０２９１】
実 施 例 ３ ． ztnfr14の 染 色 体 の 帰 属 お よ び 配 置
商 業 的 に 入 手 可 能 な “ Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel” (Research Gen
etics, Inc.、 ア ラ バ マ 州 ハ ン ツ ヴ ィ レ ) の バ ー ジ ョ ン を 使 用 し て 、 ztnfr14を ヒ ト 染 色 体
1に 対 し て マ ッ ピ ン グ す る 。 “ Stanford G3 RH Mapping Panel” は 、 全 ヒ ト ゲ ノ ム に お け
る 83の 放 射 線 ハ イ ブ リ ッ ド ク ロ ー ン の 各 々 か ら の PCable DNA + 2つ の 対 照 DNA (RMド ナ ー
お よ び A3レ シ ピ エ ン ト ) を 含 有 す る 。 公 に 利 用 可 能 な WWWサ ー バ (http://shgc-www.stanf
ord.edu) は マ ー カ ー の 位 置 決 定 を 可 能 と す る 。
【０２９２】
20
“ Stanford G3 RH Mapping Panel” を 使 用 し て ztnfr14を マ ッ ピ ン グ す る た め に 、 20 μ
lの 反 応 物 を 96ウ ェ ル の マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ー ト (Stratagene、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ラ ジ
ョ ラ ) 中 で 組 立 て 、 “ RoboCycler Gradient 96” サ ー マ ル サ イ ク ラ ー (Stratagene) を
使 用 す る 。 85 の PCR反 応 物 の 各 々 は 下 記 の 成 分 か ら 成 る : 2 μ lの 10× KlenTaq PCR反 応 緩
衝 (CLONTEC Laboratories, Inc.、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 パ ル ア ル ト ) 、 1.6 μ lの dNTP混 合
物 (2.5 mMの 各 々 、 PERKIN-ELMER、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 フ ォ ス タ ー シ テ ィ ー ) 、 1 μ lの セ
ン ス プ ラ イ マ ー 、 ZC 25352 (配 列 番 号 14) 、 1 μ lの ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー ZC 25353 (
配 列 番 号 15) 、 2 μ lの “ RediLoad” (Research Genetics, Inc.、 ア ラ バ マ 州 ハ ン ツ ヴ ィ
レ ) 、 0.4 μ lの 50× ア ド バ ン テ ー ジ KlenTaq ポ リ メ ラ ー ゼ キ ッ ト (Clontech Laboratori
es, Inc.) 、 25 ngの 個 々 の ハ イ ブ リ ッ ド ク ロ ー ン ま た は 対 照 ク ロ ー ン か ら の DNAお よ び 全
30
体 積 を 20 μ lと す る x μ lの ddH2O。 反 応 物 に 等 し い 量 の 鉱 物 油 を オ ー バ ー レ イ し 、 密 閉 す
る。
【０２９３】
PCRサ イ ク ラ ー 条 件 は 次 の 通 り で あ る : 最 初 の 1サ イ ク ル の 94℃ に お け る 5分 の 変 性 、 35
サ イ ク ル の 94℃ に お け る 45秒 の 変 性 、 64℃ に お け る 45秒 の ア ニ ー リ ン グ お よ び 72℃ に お け
る 1分 15秒 の エ ク ス テ ン シ ョ ン 、 次 い で 最 後 の 1サ イ ク ル の 72℃ に お け る 7分 の エ ク ス テ ン
シ ョ ン 。 反 応 物 を 2%の ア ガ ロ ー ス ゲ ル 上 の 電 気 泳 動 に よ り 分 離 す る 。
結 果 に よ り 、 ヒ ト 染 色 体 1骨 格 マ ー カ ー に 対 す る ztnfr14の 連 鎖 が 示 さ れ る 。 取 り 囲 む 遺
伝 子 /マ ー カ ー を 使 用 す る と 、 ztnfr14は 1q36.3染 色 体 領 域 に 位 置 決 定 さ れ る 。
【０２９４】
40
実 施 例 ４ ． 哺 乳 動 物 可 溶 性 ztnfr14発 現 ベ ク タ ー : ztnfr14sR/CEEお よ び ztnfr14sR/Fc4の
構築
発 現 ベ ク タ ー を 調 製 し て 、 C末 端 の Glu-Gluタ グ (配 列 番 号 36) に 対 し て 融 合 し た 可 溶 性
ztnfr14ポ リ ペ プ チ ド (ztnfr14sR) を 発 現 さ せ る 。
【０２９５】
適 当 な オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を PCRプ ラ イ マ ー と し て 使 用 し て 、 そ れ ぞ れ 可 溶 性 ztnfr14 D
NAの 5’ お よ び 3’ 末 端 に お け る 制 限 部 位 に 付 加 し て PCR発 生 ztnfr14 DNAフ ラ グ メ ン ト を
つ く る 。 ztnfr14 cDNA (配 列 番 号 1) を 含 有 す る プ ラ ス ミ ド を テ ン プ レ ー ト と し て 使 用 す
る 。 ztnfr14フ ラ グ メ ン ト の PCR増 幅 を 次 の よ う に し て 実 行 す る : 1サ イ ク ル の 94℃ に お け
る 1分 間 ; 25サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 間 、 68℃ に お け る 90秒 間 、 次 い で 追 加 の 4分 間 の
50
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68℃ に お け る イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 、 お よ び 10℃ に お け る 保 持 。 反 応 物 を ク ロ ロ ホ ル ム /フ
ェノール抽出およびイソプロパノール沈降により精製し、選択した制限エンドヌクレアー
ゼ (Boehringer Mannheim、 イ ン ジ ア ナ 州 イ ン ジ ア ナ ポ リ ス ) で 消 化 す る 。 適 当 な 長 さ の
バ ン ド を 1%の ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 可 視 化 し 、 切 除 し 、 DNAを QiaexII
T M
精製キ
ッ ト (Qiagen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 バ レ ン シ ア ) を 製 造 業 者 の イ ン ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 使
用して精製した。
【０２９６】
約 30 ngの 制 限 消 化 し た ztnfr14sRイ ン サ ー ト お よ び 約 10 ngの 適 当 な 消 化 し た 発 現 ベ ク
タ ー を 、 室 温 に お い て 2時 間 連 結 さ せ る 。 1 μ lの 連 結 反 応 物 を DH10Bコ ン ピ テ ン ト 細 胞 (G
ibco BRL、 マ リ ー ラ ン ド 州 ロ ッ ク ビ レ ) の 中 に 製 造 業 者 の 指 示 に 従 い エ レ ク ト ロ ポ レ ー ト
10
し 、 50 mg/mlの ア ン ピ シ リ ン を 含 有 す る LBプ レ ー ト 上 に プ レ ー ト し 、 一 夜 イ ン キ ュ ベ ー ト
す る 。 個 々 の コ ロ ニ ー の 2 mlの 培 養 物 か ら 調 製 し た コ ロ ニ ー を DNAの 制 限 分 析 に よ り ス ク
リーニングする。陽性クローンのインサート配列を配列分析により確認する。こうして、
切 除 し た ztnfr14sR DNAを 適 当 な 発 現 ベ ク タ ー の 中 に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ す る 。 Qiagen
T M
Me
ga prepキ ッ ト (Qiagen) を 製 造 業 者 の イ ン ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て 、 大 規 模 プ ラ
スミド調製を実施する。
【０２９７】
同 一 プ ロ セ ス に 従 い C末 端 の Fc4タ グ (配 列 番 号 37) を 使 用 し て ztnfr14の 可 溶 性 レ セ プ
タ ー を 調 製 し 、 ztnfr14sR/Fc4を 作 っ た 。 ztnfr14sR/Fc4を 調 製 す る た め に 、 発 現 ベ ク タ ー
は Glu-Gluタ グ の 代 わ り に Fc4タ グ を 有 す る 。 Fc4は ヒ ト IgGに 由 来 す る Hc領 域 で あ り 、 こ れ
20
は Fcレ セ プ タ ー に 結 合 し な い よ う に 突 然 変 異 を 含 有 す る 。 Fc4を こ の 実 施 例 に お い て 利 用
す る が 、 当 業 者 は 認 識 す る よ う に 、 こ の プ ロ ト コ ル に 従 い 他 の Fc構 築 物 (す な わ ち 、 他 の
Ig分 子 に 由 来 す る も の ) を 使 用 し て 、 可 溶 性 ztnfr14レ セ プ タ ー を 調 製 す る こ と が で き る
。
【０２９８】
実 施 例 ５ ． ztnfr14可 溶 性 レ セ プ タ ー の ポ リ ペ プ チ ド の ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン お よ び 発 現
ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン の 前 日 に 、 BHK 570細 胞 (ATCC No. CRL-10314; ATCC、 バ ー ジ ニ ア
州 マ ン ナ ッ サ ス ) を 通 常 の BHK DMEM (Gibco/BRL High Glucose) 培 地 中 に お い て 50%の コ
ン フ ル エ ン ス の 10 cmの プ レ ー ト に 入 れ る 。 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン の 日 に 、 細 胞 を 無 血 清
(SF) DMEMで 1回 洗 浄 し 、 次 い で ztnfr14sR/Fc4ま た は ztnfr14sR/CEE発 現 プ ラ ス ミ ド で ト ラ
30
ン ス フ ェ ク ト す る 。 16 μ gの 各 DNA構 築 物 を 全 最 終 体 積 640 μ lの SF DMEMの 中 に 別 々 に 希
釈 す る 。 希 釈 し た LipofectAMINE
M
混 合 物 (605 μ lの SF培 地 中 の 35 μ lの LipofectAMINE
T
) を DNA混 合 物 に 添 加 し 、 室 温 に お い て 30分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 5 mlの SF培 地 を DNA/
LipofectAMINE
2
T M
T M
混 合 物 に 添 加 し 、 次 い で こ れ を BHK細 胞 に 添 加 す る 。 細 胞 を 37℃ /5% CO
に お い て 5時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 次 い で 10%の FBSを 含 む 6.4 mlの BHK培 地 を 添 加 す る 。
細 胞 を 37℃ /5% CO2 に お い て 一 夜 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。
【０２９９】
ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 後 ほ ぼ 24時 間 に お い て 、 1 μ Mの メ ト ト レ キ セ ー ト (MTX) を 含 む
選 択 培 地 の 中 に 、 BHK細 胞 を 分 割 す る 。 安 定 な ztnfr14sR/CEEお よ び ztnfr14sR/Fc4細 胞 系
統 が 同 定 さ れ る ま で 、 こ の 方 法 で 細 胞 を 反 復 分 割 す る 。 ztnfr14可 溶 性 レ セ プ タ ー の 融 合
40
タ ン パ ク 質 の 発 現 レ ベ ル を 検 出 す る た め に 、 BHK細 胞 を PBSで 洗 浄 し 、 SF培 地 中 で 72時 間 イ
ン キ ュ ベ ー ト す る 。 SF条 件 培 地 を 収 集 し 、 20 μ lの 試 料 を 還 元 条 件 下 に 10%の SDS-PAGEゲ
ル上で展開する。タンパク質バンドをウェスタンブロットによりニトロセルロースフィル
タ ー に 移 し 、 ztnfr14sR/Fc4融 合 物 の た め に 抗 ヒ ト IgG/HRP接 合 体 ま た は ztnfr14sR/CEE融
合 物 の た め に マ ウ ス 抗 Glu-Gluタ グ / HRP接 合 体 を 使 用 し て 、 融 合 タ ン パ ク 質 を 検 出 す る 。
Fc4タ グ ま た は CEEタ グ に 対 し て 融 合 し た 異 な る 可 溶 性 レ セ プ タ ー を 含 有 す る 発 現 ベ ク タ ー
を対照として使用する。
【０３００】
ト ラ ン ス フ ェ ク ト さ れ た BHK細 胞 を T-162フ ラ ス コ 中 に 移 す 。 い っ た ん BHK細 胞 が 約 80%の
コ ン フ ル エ ン ス に 到 達 す る と 、 そ れ ら を PBSで 洗 浄 し 、 100 mlの SF培 地 中 で 72時 間 イ ン キ
50
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ュベートし、次いで条件培地をタンパク質精製のために収集する。
【０３０１】
実 施 例 ６ ． ztnfr14sR/CEEの 精 製 お よ び 分 析
上 記 実 施 例 5に 記 載 す る よ う に ト ラ ン ス フ ェ ク ト し た BHK細 胞 か ら 、 組 換 え カ ル ボ キ シ ル
末 端 の Glu-Gluタ ッ グ ド ztnfr14sRを 製 造 す る 。 ほ ぼ 72時 間 の イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後 、 60枚
の 皿 か ら 約 6リ ッ ト ル の コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た 培 地 を 収 獲 す る 。 異 な る 製 造 会 社 か ら の
濾 過 ユ ニ ッ ト を 使 用 し て 、 培 地 の 一 部 分 を 滅 菌 濾 過 す る 。 Nalgeneの 0.2 μ mお よ び 0.45
μ mの フ ィ ル タ ー 、 お よ び Millipore Expressの 0.22 μ mの フ ィ ル タ ー を 比 較 し 、 最 良 の タ
ン パ ク 質 回 収 お よ び 流 速 を 提 供 す る フ ィ ル タ ー を 使 用 す る 。 新 し い 培 地 に お い て 約 72時 間
後 、 タ ン パ ク 質 の 発 現 レ ベ ル は 最 適 濃 度 に 到 達 す る 。 こ れ ら の 3つ の ztnfr14sR/CEE収 獲 物
10
でコンディショニングした培地を収集する。
【０３０２】
抗 Glu-Glu (抗 EE) ペ プ チ ド 抗 体 の ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー と S-100ゲ ル 排 除
クロマトグラフィーとの組合わせにより、濾過した培地からタンパク質を精製する。培地
を 20× 185 mm (ベ ッ ド 体 積 58 ml) の 抗 EE抗 体 の ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム に 約 4 ml/分 の 流 れ
で 直 接 負 荷 す る 。 10カ ラ ム 体 積 の PBSで カ ラ ム を 洗 浄 し た 後 、 結 合 し た タ ン パ ク 質 を 2カ ラ
ム 体 積 の 0.4/mlの EYMPTDペ プ チ ド (Princeton Biomolecules、 ニ ュ ー ジ ャ ー ジ ー 州 ) で 溶
離 す る 。 5 mlの 画 分 を 収 集 し た 。
【０３０３】
銀 染 色 を 使 用 す る SDS-PAGEお よ び ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 、 抗 EE抗 体 の ア フ ィ
20
ニ テ ィ ー カ ラ ム か ら の 試 料 を ztnfr14sR/CEEの 存 在 に つ い て 分 析 す る 。 ztnfr14sR/CEEタ ン
パ ク 質 を 含 有 す る 画 分 を プ ー ル し 、 Biomax-5濃 縮 装 置 (Millipore) を 使 用 し て 4 mlに 濃
縮 し 、 16× 1000 mmの Sephacryl S-100 HRゲ ル 濾 過 カ ラ ム (Amersham Pharmacia Biotch)
上 に 負 荷 す る 。 精 製 し た ztnfr14sR/CEEを 含 有 す る 画 分 を プ ー ル し 、 0.2 μ mの フ ィ ル タ ー
に 通 し て 濾 過 し 、 各 100 μ lの ア リ コ ー ト を 採 り 、 -80 ℃ に お い て 凍 結 す る 。 BCAア ッ セ イ
(Pierce) お よ び HPLC-ア ミ ノ 酸 分 析 に よ り 、 最 終 の 精 製 さ れ た タ ン パ ク 質 の 濃 度 を 測 定
する。
【０３０４】
ク ー マ ッ シ ー ブ ル ー お よ び 銀 染 色 法 (Fast Silver、 Geno Tech) を 使 用 す る SD-PAGE (N
upage 4-12%、 Novex) お よ び モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 EE抗 体 を 使 用 す る ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン
30
グ に よ り 、 組 換 え ztnfr14sR/CEEを 分 析 す る 。 Novexの XceIIミ ニ セ ル (カ リ フ ォ ル ニ ア 州
サンディゴ) を使用して、コンディショニングした培地または精製したタンパク質を電気
泳 動 さ せ 、 計 装 マ ニ ュ ア ル に 記 載 さ れ て い る 指 示 に 従 い Novexの XceIIブ ロ ッ ト モ ジ ュ ー ル
を 攪 拌 し な が ら 使 用 し て 室 温 に お い て ニ ト ロ セ ル ロ ー ス (0.2 μ ｍ ; Bio-Rad Laboratori
es、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ハ ー キ ュ レ ス ) に 移 す 。 25 mMの Tris塩 基 、 200 mMの グ リ シ ン お よ
び 20%の メ タ ノ ー ル を 含 有 す る 緩 衝 液 中 で 、 500 mAに お い て 転 移 を 1時 間 実 施 す る 。 次 い で
PBS中 の 10%の 脱 脂 粉 乳 で 室 温 に お い て フ ィ ル タ ー を 10分 間 ブ ロ ッ ク す る 。 ニ ト ロ セ ル ロ ー
ス を 急 速 に す す ぎ 、 次 い で 2.5%の 脱 脂 粉 乳 を 含 有 す る PBS中 に 一 次 抗 体 を 添 加 す る 。
【０３０５】
ブ ロ ッ ト を 室 温 に お い て 2時 間 ま た は 4℃ に お い て 一 夜 お だ や か に 震 蘯 さ せ な が ら イ ン キ
40
ュ ベ ー ト す る 。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後 、 ブ ロ ッ ト を PBS中 で 各 10分 間 3回 洗 浄 す る 。 2.5%の
脱 脂 粉 乳 を 含 有 す る PBS中 で 1:2000に 希 釈 し た 二 次 抗 体 (セ イ ヨ ウ ワ サ ビ ペ ル オ キ シ ダ ー
ゼ に 複 合 化 し た ヤ ギ 抗 マ ウ ス IgG; 入 手 先 : Rockland Inc.、 ペ ン シ ル ベ ニ ア 州 ギ ル バ ー ス
ビ レ ) を 添 加 し 、 ブ ロ ッ ト を 室 温 に お い て 2時 間 お だ や か に 震 蘯 し な が ら イ ン キ ュ ベ ー ト
す る 。 次 い で ブ ロ ッ ト を PBS中 で 各 10分 間 3回 洗 浄 し 、 次 い で H2 O中 で 急 速 に す す ぐ 。 商 業
的 に 入 手 可 能 な 化 学 発 光 基 質 試 薬 (SuperSignal
T M
ULTRA試 薬 1お よ び 2の 1:1混 合 物 ; 試 薬
の 入 手 先 : Pierce Chemical Co.) を 使 用 し て ブ ロ ッ ト を 現 像 し 、 10秒 ∼ 5分 の 範 囲 の 露 出
時 間 Lumi-Imagerの Analyst 3.0ソ フ ト ウ ェ ア (Boehringer Mannheim GmbH、 ド イ ツ 国 ) を
使用してまたは必要に応じてシグナルを捕捉する。
【０３０６】
50
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実 施 例 ７ ． ztnfr14sR/FC4の 精 製 お よ び 分 析
上 記 実 施 例 5に 記 載 す る よ う に ト ラ ン ス フ ェ ク ト し た BHK細 胞 か ら 、 組 換 え カ ル ボ キ シ ル
末 端 の Fc4タ ッ グ ド ztnfr14sRを 製 造 す る 。 約 72時 間 の イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後 、 60枚 の 皿 か
ら ほ ぼ 5リ ッ ト ル の コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し た 培 地 を 収 獲 す る 。 異 な る 製 造 会 社 か ら の 濾 過
ユ ニ ッ ト を 使 用 し て 、 培 地 の 一 部 分 を 滅 菌 濾 過 す る 。 Nalgeneの 0.2 μ mお よ び 0.45 μ mの
フ ィ ル タ ー 、 Millipore Expressの 0.22 μ mの フ ィ ル タ ー お よ び Duraporeの 0.45 μ mの フ
ィルターを比較し、最良のタンパク質回収および流速を提供するフィルターを使用する。
新 し い 培 地 に お い て 約 72時 間 後 、 タ ン パ ク 質 の 発 現 レ ベ ル は 最 適 濃 度 に 到 達 す る 。 通 常 、
培 地 の 3∼ 4の 収 獲 物 を 収 集 し た 。
【０３０７】
10
Poros 50プ ロ テ イ ン Aの ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー (PerSeptive Biosystems、
1-5559-01、 マ サ チ ュ ー セ ッ ツ 州 フ ァ ー ミ ン ガ ム ) と S-100ゲ ル 排 除 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー と
の 組 合 わ せ に よ り 、 濾 過 し た 培 地 か ら タ ン パ ク 質 を 精 製 す る 。 培 地 を 10× 80 mm (ベ ッ ド
体 積 6.2 ml) の プ ロ テ イ ン Aの ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム に 約 4 ml/分 の 流 れ で 直 接 負 荷 す る 。
10カ ラ ム 体 積 の PBSで カ ラ ム を 洗 浄 し た 後 、 結 合 し た タ ン パ ク 質 を 5カ ラ ム 体 積 の 0.1 Mの
グ リ シ ン 、 pH 3.0で 10 ml/分 に お い て 溶 離 す る 。 38 μ lの 2.0 Mの Tris、 pH 8.8を 含 有 す
る 管 の 中 に 1.5 mlの 各 画 分 を 収 集 し て 、 溶 離 さ れ た タ ン パ ク 質 を 中 和 す る 。
【０３０８】
ク ー マ ッ シ ー ブ ル ー 染 色 を 使 用 す る SDS-PAGEお よ び ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 、
ヒ ト IgG-HRPを 使 用 し て ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム か ら の 試 料 を ztnfr14sR/FC4の 存 在 に つ い て
20
分 析 す る 。 ztnfr14sR/FC4タ ン パ ク 質 を 含 有 す る 画 分 を プ ー ル し 、 Biomax-5濃 縮 装 置 (Mil
lipore) を 使 用 し て 4 mlに 濃 縮 し 、 16× 1000 mmの Sephacryl S-200 HRゲ ル 濾 過 上 に 負 荷
す る 。 精 製 し た ztnfr14sR/FC4を 含 有 す る 画 分 を プ ー ル し 、 0.2 μ mの フ ィ ル タ ー に 通 し て
濾 過 し 、 各 100、 200お よ び 500 μ lの ア リ コ ー ト を 採 り 、 -80 ℃ に お い て 凍 結 す る 。 BCAア
ッ セ イ (Pierce) お よ び HPLC-ア ミ ノ 酸 分 析 に よ り 、 最 終 の 精 製 さ れ た タ ン パ ク 質 の 濃 度
を測定する。
【０３０９】
ク ー マ ッ シ ー ブ ル ー 銀 染 色 法 を 使 用 す る SD-PAGE (Nupage 4-12%、 Novex) お よ び ヒ ト Ig
G-HRPを 使 用 す る ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 、 組 換 え ztnfr14sR/FC4を 分 析 す る 。 No
vexの XceIIミ ニ セ ル (カ リ フ ォ ル ニ ア 州 サ ン デ ィ ゴ ) を 使 用 し て 、 コ ン デ ィ シ ョ ニ ン グ し
30
た培地または精製したタンパク質を電気泳動させ、計装マニュアルに記載されている指示
に 従 い Novexの XceIIブ ロ ッ ト モ ジ ュ ー ル を 攪 拌 し な が ら 使 用 し て 室 温 に お い て ニ ト ロ セ ル
ロ ー ス (0.2 μ ｍ ; Bio-Rad Laboratories、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 ハ ー キ ュ レ ス ) に 移 す 。 25
mMの Tris塩 基 、 200 mMの グ リ シ ン お よ び 20%の メ タ ノ ー ル を 含 有 す る 緩 衝 液 中 で 、 500 mA
に お い て 転 移 を 1時 間 実 施 す る 。
【０３１０】
次 い で PBS中 の 10%の 脱 脂 粉 乳 で 室 温 に お い て フ ィ ル タ ー を 10分 間 ブ ロ ッ ク す る 。 ニ ト ロ
セ ル ロ ー ス を 急 速 に す す ぎ 、 次 い で 2.5%の 脱 脂 粉 乳 を 含 有 す る PBS中 に ヒ ト IgG-HPR抗 体 (
1:2000) を 添 加 す る 。 ブ ロ ッ ト を 室 温 に お い て 2時 間 ま た は 4℃ に お い て 一 夜 お だ や か に 震
蘯 さ せ な が ら イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン 後 、 ブ ロ ッ ト を PBS中 で 各 10分 間 3
40
回 洗 浄 し 、 次 い で H2 O中 で 急 速 に す す ぐ 。 商 業 的 に 入 手 可 能 な 化 学 発 光 基 質 試 薬 (SuperSi
gnal
T M
ULTRA試 薬 1お よ び 2の 1:1混 合 物 ; 試 薬 の 入 手 先 : Pierce Chemical Co.) を 使 用 し
て ブ ロ ッ ト を 現 像 し 、 10秒 ∼ 5分 の 範 囲 の 露 出 時 間 Lumi-Imagerの Analyst 3.0ソ フ ト ウ ェ
ア (Boehringer Mannheim GmbH、 ド イ ツ 国 ) を 使 用 し て ま た は 必 要 に 応 じ て シ グ ナ ル を 捕
捉する。
【０３１１】
実 施 例 ８ ． in situ ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 使 用 す る ztnfr14を 発 現 す る 細 胞 の 同 定
特 異 的 ヒ ト 組 織 を 単 離 し 、 in situハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に よ り ztnfr14発 現 に つ い て
ス ク リ ー ニ ン グ す る 。 調 製 し 、 切 断 し 、 in situハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン に 付 し た 種 々 の
ヒト組織は、正常の胃、正常の子宮、数ある癌の中でも神経芽細胞腫および黒色腫を包含
50
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す る 。 組 織 を 10%の 緩 衝 化 ホ ル マ リ ン 中 で 固 定 し 、 標 準 技 術 を 使 用 し て パ ラ フ ィ ン 中 に ブ
ロ ッ ク す る 。 組 織 を 4∼ 8ミ ク ロ ン で 切 断 す る 。
【０３１２】
組 織 を 標 準 的 プ ロ ト コ ル に 従 い 調 製 す る (“ Development of non-isotopic in situ hy
bridization” 、 http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/ish.html) 。 簡 単 に 述 べ る と 、 組 織
の 切 片 を HistoClear (National Diagnostics、 ジ ョ ー ジ ア 州 ア ト ラ ン タ ) で 脱 パ ラ フ ィ ン
し 、 次 い で エ タ ノ ー ル で 脱 水 す る 。 次 に 、 切 片 を プ ロ テ イ ナ ー ゼ K (50 μ g/ml) (Boehrin
ger Diagnostics、 イ ン ジ ア ナ 州 イ ン ジ ア ナ ポ リ ス ) で 37℃ に お い て 2∼ 20分 間 消 化 す る 。
この工程に引き続いて組織をアセチル化し、再脱水する。
【０３１３】
10
PCRに よ り 発 生 さ せ た 2つ の in situ プ ロ ー ブ を ヒ ト ztnfr14配 列 に 対 し て 設 計 す る 。 ztn
fr14 cDNAの 別 々 の 領 域 に つ い て プ ロ ー ブ を 発 生 さ せ る た め に 、 2組 の オ リ ゴ を 設 計 す る 。
ま た 、 各 組 か ら の ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ は 、 こ れ ら の PCR生 成 物 か ら の ア ン チ セ ン ス RNAプ ロ
ー ブ の 容 易 な 転 写 を 可 能 と す る た め に 、 T7 RNAポ リ メ ラ ー ゼ プ ロ モ ー タ ー の 作 用 配 列 を 含
有 す る 。 PCR反 応 条 件 は 次 の 通 り で あ る : 2サ イ ク ル の 95℃ に お け る 30秒 間 、 50℃ に お け る
1分 間 、 72℃ に お け る 1分 間 、 次 い で 33サ イ ク ル の 95℃ に お け る 30秒 間 、 72℃ に お け る 2分
間 。 in vitro 転 写 シ ス テ ム (Poemega、 ウ ィ ス コ ン シ ン 州 マ デ ィ ソ ン ) を 製 造 業 者 の イ ン
ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て 、 プ ロ ー ブ を ジ ゴ キ シ ゲ ニ ン (Boehringer) ま た は ビ オ チ
ン (Boehringer) で 順 次 に 標 識 化 す る 。
【０３１４】
20
ジ ゴ キ シ ゲ ニ ン ま た は ビ オ チ ン 標 識 化 ztnfr14プ ロ ー ブ (上 記 ) を 使 用 し て 、 in situ
ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 実 行 す る 。 プ ロ ー ブ を ス ラ イ ド ガ ラ ス に 1∼ 5 pmol/mlの 濃 度 で
60℃ に お い て 12∼ 16時 間 添 加 す る 。 引 き 続 い て ス ラ イ ド ガ ラ ス を 55℃ に お い て 2× SSCお よ
び 0.1× SSCで 洗 浄 す る 。 シ グ ナ ル を チ ラ ミ ド シ グ ナ ル 増 幅 (TSA) (TSA、 in situ 間 接 キ
ッ ト ; NEN) に よ り 増 幅 し 、 Vector Red基 質 キ ッ ト (Vector Lab) を 製 造 業 者 の イ ン ス ト
ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て 可 視 化 す る 。 次 い で ス ラ イ ド ガ ラ ス を ヘ マ ト キ シ リ ン (Vector
Laboratories、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 バ ー リ ン ガ ム ) で 対 比 染 色 す る 。
【０３１５】
実 施 例 ９ ． ヒ ト ztnfr14ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体
実 施 例 6か ら の BHKに お い て 発 現 さ れ た 精 製 組 換 え タ ン パ ク 質 ztnfr14-CEEタ ン パ ク 質 で 2
30
匹のニュージーランド白ウサギを免疫化することによって、ポリクローナル抗体を調製す
る 。 各 ウ サ ギ に 完 全 フ ロ イ ン ト ア ジ ュ バ ン ト 中 の 200 μ gの 精 製 タ ン パ ク 質 を 初 期 腹 腔 内
(ip) 注 射 し 、 次 い で 3週 毎 に 不 完 全 フ ロ イ ン ド ア ジ ュ バ ン ト 中 の 100 μ gの ペ プ チ ド を ip
ブ ー ス タ ー 投 与 す る 。 第 2ブ ー ス タ ー 注 射 (合 計 3回 の 注 射 ) の 投 与 後 7∼ 10日 に 、 動 物 か
ら 採 血 し 、 血 清 を 収 集 す る 。 次 い で 動 物 に ブ ー ス タ ー 投 与 し 、 3週 毎 に 採 血 す る 。
【０３１６】
CNBr-SEPHAROSEの 1 g当 た り 10 mgの 精 製 組 換 え ztnfr14-Fcタ ン パ ク 質 (実 施 例 6に お け
る よ う に 調 製 し た ) を 使 用 し て 調 製 し た CNBr-SEPHAROSE 4Bタ ン パ ク 質 カ ラ ム (Pharmacia
LKB) を 使 用 し て 、 hztnfr14sR特 異 的 ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を ウ サ ギ 血 清 か ら ア フ ィ ニ テ ィ
ー 精 製 し 、 次 い で PBS中 で 一 夜 20× 透 析 す る 。 抗 体 タ ー ゲ ッ ト と し て 1 μ g/mlの 特 異 的 精
40
製 組 換 え hztnfr14-CEE-BHKタ ン パ ク 質 を 使 用 し て ELISAに よ り 、 ztnfr14sR特 異 的 抗 体 を 特
性決定する。
【０３１７】
実 施 例 １ ０ ． ヒ ト ztnfr14ノ ザ ン
鋳 型 と し て 配 列 番 号 1を 含 有 す る プ ラ ス ミ ド DNAお よ び プ ラ イ マ ー と し て 適 当 な オ リ ゴ ヌ
ク レ オ チ ド を 使 用 す る PCRに よ り 、 適 当 な プ ロ ー ブ を 作 る 。 増 幅 を 次 の よ う に 実 施 す る : 1
サ イ ク ル の 94℃ に お け る 1分 間 、 35サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 間 、 55℃ に お け る 30秒 間
お よ び 72℃ に お け る 30秒 間 、 次 い で 1サ イ ク ル の 72℃ に お け る 10分 間 。 PCR生 成 物 を ア ガ ロ
ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 可 視 化 し 、 ゲ ル 抽 出 キ ッ ト (Qiagen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 チ ャ ッ ツ
ワ ー ス ) を 製 造 業 者 の イ ン ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て プ ロ ー ブ を 精 製 す る 。 REDIPRIM
50
(63)
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E DNA標 識 化 キ ッ ト (Amersham、 イ リ ノ イ 州 ア ー リ ン ト ン ハ イ ツ ) を 製 造 業 者 の イ ン ス ト
ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て 、 プ ロ ー ブ を 放 射 性 標 識 化 す る 。 NUCTRAPプ ッ シ ュ カ ラ ム (Str
atagene) を 使 用 し て 、 プ ロ ー ブ を 精 製 す る 。
【０３１８】
少なくともヒト正常胃、ヒト正常子宮およびヒト神経芽細胞腫細胞系統およびヒト黒色
腫 細 胞 系 統 、 例 え ば 、 C32、 Malme 3M、 SK-MEL-2お よ び WM-115か ら の ポ リ A
+
RNAを 含 有 す
る イ ン -ハ ウ ス ブ ロ ッ ト を 、 65℃ に お い て EXPRESSHYB (Clontech) 中 で 3時 間 プ レ ハ イ ブ リ
ダ イ ゼ ー シ ョ ン す る 。 65℃ に お い て 10
6
cpm/mlの 標 識 化 プ ロ ー ブ を 使 用 し て 、 ハ イ ブ リ ダ
イ ゼ ー シ ョ ン を 一 夜 実 施 す る 。 次 い で ブ ロ ッ ト を 室 温 に お い て 2× SSCお よ び 0.1% SDS中 で
4回 洗 浄 し 、 次 い で 50℃ に お い て 0.1× SSCお よ び 0.1% SDS中 で 2回 洗 浄 す る 。
10
【０３１９】
実 施 例 １ １ ． ヒ ト ztnfr14腫 瘍 の ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応
神 経 芽 細 胞 腫 細 胞 系 統 、 黒 色 腫 細 胞 系 統 お よ び リ ン パ 腫 細 胞 系 統 か ら の マ ラ ソ ン cDNAを
使 用 し て 、 ネ ス テ ッ ド 5’ RACE反 応 を 実 施 し た 。 50 μ lの PCR反 応 を 次 の 条 件 下 に 進 行 さ
せ る : ベ ク タ ー 配 列 に 対 応 す る 20 pmolの セ ン ス プ ラ イ マ ー お よ び 配 列 番 号 1に 示 す ポ リ ヌ
ク レ オ チ ド 配 列 に 対 応 す る 20 pmolの ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー 。 下 記 を 含 む 3工 程 2温 度 の
反 応 を 使 用 し て 実 験 を 実 施 す る : 初 期 の 94℃ に お け る 1分 、 次 い で 5サ イ ク ル の 94℃ に お け
る 30秒 お よ び 72℃ に お け る 5分 、 次 い で 5サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 お よ び 70℃ に お け る
5分 、 次 い で 25サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 お よ び 68℃ に お け る 5分 。 72℃ に お け る 10分 間
の最後のエクステンションにより、反応は完結する。
20
【０３２０】
ベ ク タ ー 配 列 に 対 応 す る 20 pmolの セ ン ス プ ラ イ マ ー お よ び 配 列 番 号 1の 第 2区 画 の 20 pm
olの ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー を 使 用 す る ネ ス テ ッ ド 5’ RACE反 応 の た め に 、 上 記 反 応 物
の 1 μ lの 1:50希 釈 物 を 使 用 す る 。 50 μ lの 反 応 を 構 成 し 、 下 記 の 条 件 下 に 実 施 す る 。 初
期 の 94℃ に お け る 1分 、 次 い で 4サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 お よ び 72℃ に お け る 5分 、 次
い で 4サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 お よ び 70℃ に お け る 5分 、 次 い で 20サ イ ク ル の 94℃ に お
け る 30秒 お よ び 68℃ に お け る 5分 。
【０３２１】
こ れ ら の PCRバ ン ド を 切 除 し 、 Qiagenゲ ル 抽 出 キ ッ ト を 使 用 し て 精 製 し 、 pCR 2.1 TOTO
ベ ク タ ー (Invitrogen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 サ ン デ ィ エ ゴ ) 中 に サ ブ ク ロ ー ニ ン グ す る 。 55
30
2 bpの バ ン ド (上 部 ) を 含 有 す る ク ロ ー ン の 生 ず る ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 配 列 番 号 33に 示 し
、 こ れ は 配 列 番 号 34に 示 す 175残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 に 対 応 す る 。 配 列 番 号 2の ポ リ ペ プ チ ド
配 列 と 配 列 番 号 34と の 複 合 体 は 、 配 列 番 号 35に 示 す 299残 基 の タ ン パ ク 質 を 生 ず る 。 こ の z
tnfr14変 異 型 は 配 列 番 号 2に 示 す ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 配 列 番 号 2の 対 応 す る 領 域 に 関
し て 、 残 基 172に お け る 2ア ミ ノ 酸 の 挿 入 (Val-Ala) お よ び 残 基 204に お け る 28残 基 の 挿 入
だけ異なる。
【０３２２】
431 bpの バ ン ド (下 側 ) を 含 有 す る ク ロ ー ン の 生 ず る ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 配 列 番 号 36に
示 し 、 こ れ は 配 列 番 号 37に 示 す 142残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 に 対 応 す る 。 配 列 番 号 2の ポ リ ペ プ
チ ド 配 列 と 配 列 番 号 37と の 複 合 体 は 、 配 列 番 号 38に 示 す 173残 基 の タ ン パ ク 質 を 生 ず る 。
40
こ の ztnfr14変 異 型 は 配 列 番 号 2に 示 す ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 翻 訳 停 止 コ ド ン が 異 な り 、
ト ラ ン ケ ー ト 可 溶 性 ztnfr14レ セ プ タ ー を 生 ず る 。
【０３２３】
実施例１２．アッセイ細胞系統の構築
ztnfr14リ ガ ン ド を ク ロ ー ニ ン グ す る た め に 、 BaF3ア ッ セ イ 細 胞 系 統 を 構 築 す る 。 ztnfr
14/TNFR1キ メ ラ を 構 築 し 、 こ こ で ztnfr14の ト ラ ン ス メ ン ブ ラ ン ド メ イ ン お よ び 細 胞 質 ド
メ イ ン は TNFα レ セ プ タ ー (TNFR1) (配 列 番 号 38) の そ れ ら で 置 換 さ れ て い る 。 KZ159/mIL
4レ セ プ タ ー 遺 伝 子 (配 列 番 号 39) を 含 有 す る BaF3細 胞 系 統 中 に 、 ztnfr14/TNFR1キ メ ラ を
ト ラ ン ス フ ェ ク ト す る 。 KZ159/mIL4は TNFα に よ る TNFR1レ セ プ タ ー の 活 性 化 に 応 答 し 、 mI
L4の 発 現 お よ び 分 泌 を ト リ ガ ー し 、 BaF3細 胞 の 増 殖 に 導 く 。
50
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【０３２４】
鋳 型 と し て ztnfr14の 全 長 cDNAを 使 用 し て 適 当 な PCRプ ラ イ マ ー で 、 ztnfr14の 細 胞 外 ド
メ イ ン を 増 幅 す る 。 PCR反 応 は 次 の 通 り で あ る : 20サ イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 間 お よ び 6
8℃ に お け る 2分 間 、 次 い で 68℃ に お い て さ ら に 4分 間 お よ び 10℃ に お け る ソ ー ク 。 鋳 型 と
し て マ ウ ス 胎 盤 マ ラ ソ ン cDNAを 使 用 し て 適 当 な PCRプ ラ イ マ ー で 、 マ ウ ス TNFR1の ト ラ ン ス
メ ン ブ ラ ン ド メ イ ン お よ び 細 胞 質 ド メ イ ン を 増 幅 す る 。 PCR反 応 は 次 の 通 り で あ る : 35サ
イ ク ル の 94℃ に お け る 30秒 間 お よ び 68℃ に お け る 2分 間 、 次 い で 68℃ に お い て さ ら に 4分 間
お よ び 10℃ に お け る ソ ー ク 。 PCR生 成 物 を 1%ア ガ ロ ー ス 上 で 分 離 し 、 ztnfr14お よ び TNFR1
の バ ン ド を 切 除 し 、 QiaexII
T M
精 製 キ ッ ト (Qiagen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 バ レ ン シ ア ) を 製
造 業 者 の イ ン ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 使 用 し て DNAを 精 製 す る 。
10
【０３２５】
pZP7Zプ ラ ス ミ ド は 、 CMVプ ロ モ ー タ ー お よ び ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン タ ー ミ ネ ー タ ー を 有 す る
発現カセットを含有する哺乳動物の発現ベクターである。また、このプラスミドは大腸菌
(E. coli) 複 製 起 点 、 SV40プ ロ モ ー タ ー 、 エ ン ハ ン サ ー お よ び 複 製 起 点 を 有 す る 哺 乳 動
物 選 択 可 能 な マ ー カ ー 発 現 単 位 、 な ら び に ゼ オ シ ン (Zeocin) 耐 性 遺 伝 子 お よ び SV40タ ー
ミ ネ ー タ ー を 有 す る 。 約 30 ngの 制 限 消 化 し た ztnfr14イ ン サ ー ト お よ び TNFR1イ ン サ ー ト
お よ び 約 10 ngの 消 化 し た ベ ク タ ー を 11℃ に お い て 一 夜 連 結 す る 。 1 μ lの 連 結 反 応 物 を DH
10Bコ ン ピ テ ン ト 細 胞 (Gibco BRL、 マ リ ー ラ ン ド 州 ロ ッ ク ビ レ ) 中 に 製 造 業 者 の イ ン ス ト
ラ ク シ ョ ン に 従 い エ レ ク ト ロ ポ レ ー ト し 、 50 μ g/mlの ア ン ピ シ リ ン を 含 有 す る LBプ レ ー
ト 上 に プ レ ー ト し 、 一 夜 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 2 mlの 個 々 の コ ロ ニ ー の 液 状 培 養 物 か ら 調
20
製 し た コ ロ ニ ー を 、 DNA制 限 分 析 に よ り ス ク リ ー ニ ン グ す る 。 陽 性 ク ロ ー ン の イ ン サ ー ト
配列を配列決定分析により確認する。
【０３２６】
6
KZ159/mIL4レ セ プ タ ー を 含 有 す る 10× 10 の BaF3細 胞 を ztnfr14/TNFR1/pZP7Zプ ラ ス ミ ド
で エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン に よ り ト ラ ン ス フ ェ ク ト し 、 ゼ オ シ ン (Zeocin) 耐 性 の 安 定 な
ト ラ ン ス フ ェ ク タ ン ト に つ い て 選 択 す る 。 mIL-3を 含 ま な い TNFα に 応 答 す る こ の 安 定 な 細
胞 系 統 の 増 殖 を ア ッ セ イ し 、 1 μ g/mlの ウ サ ギ 抗 ztnfr14抗 体 を 抗 ウ サ ギ 免 疫 グ ロ ブ リ ン G
(IgG) 抗 体 が カ ッ プ リ ン グ し た 磁 気 ビ ー ズ と イ ン キ ュ ベ ー ト す る こ と に よ っ て 調 製 し た
架 橋 抗 ztnfr14試 薬 を 使 用 し て 、 ztnfr14/TNFR1キ メ ラ の 活 性 化 を 試 験 す る 。 次 い で 陽 性 ク
ロ ー ン を ア ッ セ イ 細 胞 系 統 と し て 使 用 し て 、 ztnfr14細 胞 外 ド メ イ ン に 対 す る ztnfr14リ ガ
30
ンドの結合を確認する。
【０３２７】
実施例１３．トランスジェニックプラスミドの構築
実 施 例 5か ら の ztnfr14-Fc4可 溶 性 レ セ プ タ ー 配 列 を 含 有 す る 20 μ gの pzp9を 、 適 当 な 制
限 エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ で 消 化 し た 。 次 い で 1.2%の SeaPlaque GTG
T M
ゲル上に消化したベク
タ ー を 展 開 し 、 フ ラ グ メ ン ト を 切 除 す る こ と に よ っ て 、 ztnfr14-Fc4可 溶 性 レ セ プ タ ー の
フ ラ グ メ ン ト を 単 離 す る 。 QiaQuick
T M
(Qiagen) ゲ ル 抽 出 キ ッ ト を 使 用 し て 、 DNAを 精 製
す る 。 次 い で EcoRIお よ び XbaIの オ ー バ ー ハ ン グ を ク レ ノ ウ ポ リ メ ラ ー ゼ で 平 滑 末 端 に 転
化する。
【０３２８】
40
次 い で 適 当 な 制 限 酵 素 で 前 に 消 化 し た apoA1 C1-17ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク ベ ク タ ー 中 に 、 z
tnfr14-Fc4可 溶 性 レ セ プ タ ー の フ ラ グ メ ン ト を 連 結 す る 。 ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス に お
い て 問 題 の 遺 伝 子 を 発 現 さ せ る た め に 、 apoA1 C1-17プ ラ ス ミ ド を 設 計 す る 。 そ れ は apoA1
プ ロ モ ー タ ー 、 第 1 apoA1エ ク ソ ン お よ び 第 1イ ン ト ロ ン の 一 部 分 か ら 構 成 さ れ た 発 現 カ セ
ッ ト 、 ztnfr14-Fc4コ ー デ ィ ン グ 配 列 、 必 要 な ク ロ ー ン を 挿 入 す る た め の ポ リ リ ン カ ー お
よ び ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン ポ リ A配 列 を 含 有 す る 。
【０３２９】
約 1 μ lの 連 結 反 応 物 を DH10B ElectroMax
T M
コ ン ピ テ ン ト 細 胞 (GIBCO BRL) 中 に 製 造 業
者 の 指 示 に 従 い エ レ ク ト ロ ポ レ ー ト し 、 100 μ g/mlの ア ン ピ シ リ ン を 含 有 す る LBプ レ ー ト
上 に プ レ ー ト し 、 37℃ に お い て 一 夜 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 コ ロ ニ ー を 取 り 上 げ 、 100 μ g/
50
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mlの ア ン ピ シ リ ン を 含 有 す る LBプ レ ー ト 中 で 増 殖 さ せ る 。 取 り 上 げ た ク ロ ー ン か ら ミ ニ プ
レ プ DNAを 調 製 し 、 制 限 消 化 分 析 お よ び 引 き 続 く ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ り 正 し く 配
向 さ れ た ztnfr14-Fc4可 溶 性 レ セ プ タ ー の イ ン サ ー ト に つ い て ス ク リ ー ニ ン グ す る 。 正 し
い apoA1 C1-17 ztnfr14-Fc4可 溶 性 レ セ プ タ ー 構 築 物 の マ キ シ プ レ プ (maxipreps) を 実 行
する。
【０３３０】
発現カセットを含有する適当なフラグメントを調製し、受精したネズミ卵母細胞中への
マイクロインジェクションのために使用する。
【０３３１】
実 施 例 １ ４ ． 免 疫 細 胞 に お け る ztnfr14の 示 差 的 発 現
10
予 備 的 PCR分 析 を 使 用 し て 、 種 々 の 細 胞 系 統 に お け る ztnfr14発 現 に 関 す る 初 期 の 実 験 を
実 行 し た 。 こ の 実 験 の 結 果 は 、 ztnfr14が B細 胞 、 NK細 胞 お よ び T細 胞 系 統 と し て 特 徴 づ け
ら れ る 細 胞 を 包 含 す る 多 数 の 免 疫 細 胞 系 統 に お い て 優 先 的 に 発 現 さ れ る こ と を 示 す 。 ztnf
r14 (+) で あ る 特 異 的 細 胞 系 統 の 中 に は 、 Granta 519、 ARH-77、 Ramos、 Raji、 CCRF-CEM
、 MV-4-11お よ び HS Sultanが 存 在 す る 。 こ れ ら の 結 果 が 示 唆 す る よ う に 、 い っ そ う 定 量 的
な PCR分 析 を 使 用 し て 、 休 止 お よ び 活 性 化 さ れ た ヒ ト 細 胞 系 統 に お け る ztnfr14の 量 を 比 較
すべきである。
【０３３２】
次 の よ う に し て 、 全 mRNAを 休 止 お よ び 活 性 化 さ れ た ヒ ト 細 胞 系 統 か ら 単 離 し た 。 RNeasy
Midiprep Kit (Qiagen、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 バ レ ン シ ア ) を 製 造 業 者 の イ ン ス ト ラ ク シ ョ
20
ン に 従 い 使 用 し て 、 ペ レ ッ ト を 調 製 し た 。 後 述 す る よ う に ヒ ト zTNFR14× 1、 zTNFR14× 2お
よ び zTNFR14× 3の 発 現 レ ベ ル を 評 価 す る よ う に 設 計 さ れ た 測 定 を 使 用 し て 、 こ れ ら の ヒ ト
mRNAに つ い て 実 時 間 PCRを 実 行 し た 。
【０３３３】
定 量 的 RT-PCRの た め の プ ラ イ マ ー お よ び プ ロ ー ブ
ABI PRISM 7000配 列 検 出 シ ス テ ム (PE Applied Biosystems, Inc.、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州
フ ォ ス タ ー シ テ ィ ー ) を 使 用 す る 実 時 間 定 量 的 RT-PCRは 従 来 に 記 載 さ れ た (下 記 の 文 献 を
参 照 の こ と 、 Heid C. A. 他 、 Genome Research 6: 986-994、 1996; Gibson U. E. M. 他
、 Genome Research 6: 995-1001、 1996; Sunaresan S. 他 、 Endocrinology 139: 4756-47
64、 1998) 。 こ の 方 法 は 、 リ ポ ー タ ー 蛍 光 性 色 素 お よ び ク エ ン チ ャ ー 蛍 光 性 色 素 の 両 方 を
30
含有する遺伝子特異的プローブの使用を含む。プローブが完全であるとき、リポーター色
素の放出はクエンチャー色素が密接しているために無効にされる。追加の遺伝子特異的前
方 向 プ ラ イ マ ー お よ び 逆 方 向 プ ラ イ マ ー を 使 用 す る PCRエ ク ス テ ン シ ョ ン 間 に 、 プ ロ ー ブ
は Taqポ リ メ ラ ー ゼ の 5’ ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 に よ り 切 断 さ れ る 。 こ の 切 断 に よ り 、 リ ポ ー
ター色素はプローブから解放され、蛍光発光は測定可能に増加する。
【０３３４】
3組 の プ ラ イ マ ー お よ び プ ロ ー ブ を 実 時 間 定 量 的 RT-PCRに お い て 使 用 す る た め に 発 生 さ
せ 、 各 々 は zTNFR14× 1、 zTNFR14× 2ま た は zTNFR14× 3を 特 異 的 に 増 幅 す る よ う に 設 計 さ れ
た 。 ヒ ト zTNFR14× 1の た め の 前 方 向 プ ラ イ マ ー 、 zc49573 (配 列 番 号 40) (5’ CTGGCGAAGC
CGCTGC) を 200 nmの 濃 度 で 使 用 し 、 そ し て 逆 方 向 プ ラ イ マ ー 、 zc49579 (配 列 番 号 41) (5
40
’ GATCCGTGGCCCTGTCCAGG) を 800 nMの 濃 度 で 使 用 し て 67 bpの 生 成 物 を 合 成 し た 。 ヒ ト zT
NFR14× 2の た め の 前 方 向 プ ラ イ マ ー 、 zc49277 (配 列 番 号 42) (5’ AGAAGAAACAAAGCTCCGGC
CCTGCAGCC) お よ び 逆 方 向 プ ラ イ マ ー 、 zc49280 (配 列 番 号 43) (5’ CCCAGCACCACTGAAGCGA
TGGCT) の 両 方 を 800 nMの 濃 度 で 使 用 し て 141 bpの 生 成 物 を 合 成 し た 。
【０３３５】
ヒ ト zTNFR14× 3の た め の 前 方 向 プ ラ イ マ ー 、 zc49284 (配 列 番 号 44) (5’ CAAAGGGCCGGC
CCCCGCA) お よ び 逆 方 向 プ ラ イ マ ー 、 zc49233 (配 列 番 号 45) (5’ GAAAAGGAGAGAAAGGCAGAG
TGA) の 両 方 を 400 nMの 濃 度 で 使 用 し て 179 bpの 生 成 物 を 合 成 し た 。 zTNFR14× 1の た め の
対 応 す る TaqManプ ロ ー ブ 、 ZG49714 (配 列 番 号 46) (5’ AGTCCTCAGTACGGAAGC) を 200 nMで
使 用 し た 。 ま た 、 zTNFR14× 2の た め の 対 応 す る TaqManプ ロ ー ブ 、 ZG49360 (配 列 番 号 47) (
50
(66)
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5’ CCACCCGAGGACAGACGCAGCCG) を 200 nMで 使 用 し た 。 zTNFR14× 3の た め の 対 応 す る TaqMa
nプ ロ ー ブ 、 ZG48404 (配 列 番 号 48) (5’ CCTGGCCGCGTGTGCCTGGT) を 200 nMで 使 用 し た 。
こ れ ら の 3 つ の TaqManプ ロ ー ブ は 、 標 準 的 プ ロ ー ブ 合 成 手 順 に 従 い イ ン -ハ ウ ス で 合 成 し
た 。 プ ロ ー ブ を 5’ 末 端 に お い て リ ポ ー タ ー 蛍 光 色 素 (6-カ ル ボ キ シ フ ル オ レ セ イ ン ) (F
AM) (Glen Research、 バ ー ジ ニ ア 州 ス タ ー リ ン グ ) で 標 識 化 し 、 そ し て 3’ 末 端 に お い て
非 蛍 光 ク エ ン チ ャ ー (ECLIPSE) (Epoc Biosciences、 ワ シ ン ト ン 州 ボ セ ル ) で 標 識 化 し た
。
【０３３６】
試 験 し た RNA試 料 の 完 全 性 お よ び 品 質 を 試 験 す る た め の 対 照 と し て 、 PE Apllied Biosys
temsに 注 文 す る (rRNAキ ッ ト 、 カ タ ロ グ No. 4304483) か 、 あ る い は 標 準 的 プ ラ イ マ ー 、
10
プ ロ ー ブ プ ロ ト コ ル を 使 用 し て イ ン -ハ ウ ス で 設 計 し た (hGUS) プ ラ イ マ ー お よ び プ ロ ー
ブ の 組 を 使 用 し て 、 す べ て の RNA試 料 を rRNAお よ び ハ ウ ス キ ー ピ ン グ 遺 伝 子 グ リ コ シ ダ ー
ゼ の ヒ ト 形 態 (hGUS) に つ い て ス ク リ ー ニ ン グ し た 。 rRNAキ ッ ト は 前 方 向 プ ラ イ マ ー 、 rR
NA逆 方 向 プ ラ イ マ ー お よ び rRNA TaqMan
T M
プローブを含有する。
【０３３７】
rRNAプ ロ ー ブ を 製 造 業 者 の イ ン ス ト ラ ク シ ョ ン に 従 い 5’ 末 端 に お い て リ ポ ー タ ー 蛍 光
色 素 VIC (PE Apllied Biosystems、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 フ ォ ス タ ー シ テ ィ ー ) で 標 識 化 し 、
そ し て 5’ 末 端 に お い て ク エ ン チ ャ ー 蛍 光 色 素 TAMRA (PE Apllied Biosystems、 カ リ フ ォ
ル ニ ア 州 フ ォ ス タ ー シ テ ィ ー ) で 標 識 化 し た 。 hGUSプ ラ イ マ ー お よ び プ ロ ー ブ を 、 そ れ ぞ
れ 200 nMお よ び 100 nMで 、 各 PCR反 応 に お い て 使 用 し た 。 前 方 向 プ ラ イ マ ー は zc40574 (配
20
列 番 号 49) (5’ CTCATTTGGAATTTTGCCGATT) で あ り 、 そ し て 逆 方 向 プ ラ イ マ ー は zc40575 (
配 列 番 号 50) (5’ CCGAGTGAAGATCCCCTTTTTA) で あ る 。
【０３３８】
hGUSプ ロ ー ブ zc43228 (配 列 番 号 51) (5’ TGAACAGTCACCGACGAGAGTGCTGG) を 5’ 末 端 に
お い て リ ポ ー タ ー 蛍 光 色 素 Yakima Yellow (Epoc Biosciences、 ワ シ ン ト ン 州 ボ セ ル ) で
標 識 化 し 、 そ し て 3’ 末 端 に お い て 非 蛍 光 ク エ ン チ ャ ー 色 素 (ECLIPSE) (Epoc Bioscienc
es、 ワ シ ン ト ン 州 ボ セ ル ) で 標 識 化 し た 。 ま た 、 rRNAお よ び hGUSの 結 果 は 内 因 的 対 照 と し
て 働 き 、 そ し て 試 験 試 料 に お い て 見 ら れ た zTNFR14× 1、 zTNFR14× 2ま た は zTNFR14× 3 mRN
Aの 発 現 結 果 の 正 規 化 を 可 能 と す る 。
【０３３９】
30
実 時 間 定 量 的 RT-PCR
ヒ ト zTNFR14× 1、 zTNFR14× 2ま た は zTNFR14× 3 mRNAの 相 対 レ ベ ル を 、 RT-PCRを 使 用 す
る 全 RNA試 料 の 分 析 に よ り 決 定 し た 。 全 RNA試 料 を 三 重 反 復 実 験 に お い て 各 ヒ ト ztnfr14ス
プ ラ イ ス 変 異 型 、 ヒ ト zTNFR14× 1、 zTNFR14× 2ま た は zTNFR14× 3の 転 写 レ ベ ル お よ び 内 因
的 対 照 と し て hGUSの レ ベ ル に つ い て 分 析 し た 。 10 μ lの 全 体 積 に お い て 、 各 RNA試 料 を 下
記 の 成 分 を 含 有 す る RT-PCR反 応 に 付 し た : 1× に 希 釈 し た Absolute QPCR dUTP混 合 物 (Abg
ene、 ニ ュ ー ヨ ー ク 州 ロ チ ェ ス タ ー 、 製 品 No. AB-1140/B) (DNAポ リ メ ラ ー ゼ 、 塩 お よ び 各
dNTPの 登 録 名 混 合 物 ) 中 の 70 ngの 全 RNA; 内 部 の 標 準 色 素 、 カ ル ボ キ シ -x-ロ ー ダ ミ ン (R
OX)) ; 前 述 し た 濃 度 の 適 当 な プ ラ イ マ ー お よ び プ ロ ー ブ ; お よ び rMoMuLV逆 転 写 酵 素 (0.
25 U/μ l) (PE Apllied Biosystems、 カ リ フ ォ ル ニ ア 州 フ ォ ス タ ー シ テ ィ ー 、 製 品 No. 43
40
11235) 。 PCR熱 的 サ イ ク リ ン グ は 次 の 通 り で あ っ た : 1サ イ ク ル の 50℃ に お け る 20分 間 の
初 期 逆 転 写 (RT) 工 程 ; 次 い で 1サ イ ク ル の 95℃ に お け る 10分 間 の ポ リ メ ラ ー ゼ 活 性 化 工
程 ; 次 い で 40サ イ ク ル の 95℃ に お け る 15秒 間 お よ び 60℃ に お け る 1分 間 の 増 幅 。
【０３４０】
下 記 の 細 胞 系 統 に お い て ヒ ト zTNFR14× 1、 zTNFR14× 2ま た は zTNFR14× 3 mRNAの 発 現 を
評 価 す る た め に TaqMan RT-PCR使 用 し た : 非 刺 激 ヒ ト B細 胞 系 統 (DOHH-2、 Granta519、 REH
、 Ramos、 WSU-NHL、 CESS、 BJAB、 RPMI1788、 OMP-2、 HS Sultan、 697、 L363、 RPMI8226、 U
266、 ARH77、 Raji) 、 非 刺 激 ヒ ト T細 胞 系 統 (HUT78、 CCRF-CEM) 、 形 質 転 換 さ れ た 骨 髄 内
皮 細 胞 系 統 (TRBMEC) 、 非 刺 激 ヒ ト 単 球 系 統 (K652、 KG-1、 HEL 92.1.7、 MV4-11) 、 非 刺
激 樹 枝 状 細 胞 (DC) 、 混 合 リ ン パ 球 反 応 物 (2つ の ド ナ ー 、 1つ の 照 射 物 ) (MLR) 、 イ ン タ
50
(67)
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ー フ ェ ロ ン -γ (IFNg) を 含 む も の お よ び 含 ま な い も の の 両 方 お よ び 線 維 芽 細 胞 。
【０３４１】
ま た 、 発 現 を 休 止 お よ び 活 性 化 ヒ ト 単 球 系 (HL-60、 THP-1、 U937) に お い て 評 価 し た 。
この分野においてよく知られているように、下記を包含する種々の標準的手段により、活
性 化 を 達 成 し た : 刺 激 因 子 、 例 え ば 、 ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド (DMSO、 種 々 の 源 か ら の RNA
を 含 む 、 略 号 CGATお よ び MKMA) 、 12-ミ リ ス テ ー ト 13-ア セ テ ー ト (イ オ ノ マ イ シ ン を 含 む
か ま た は 含 ま な い PMA) 、 ビ タ ミ ン D3 、 レ チ ノ イ ン 酸 、 酪 酸 、 リ ポ 多 糖 (LPS、 IFNgを 含 む
かまたは含まない) 。
【０３４２】
こ れ ら の 結 果 は 図 4、 図 5お よ び 図 6に グ ラ フ で 表 さ れ て い る 。 こ れ ら の 結 果 が 示 す よ う
10
に 、 ヒ ト zTNFR14× 1は こ れ ら の 細 胞 型 に お い て 圧 倒 的 に 発 現 さ れ る mRNAス プ ラ イ ス 変 異 型
で あ る よ う に 思 わ れ る 。 ARH-77、 Granta519お よ び LPS-活 性 化 U937細 胞 は 、 hGUSに 関 し て
そ し て 検 査 し た 他 の 系 統 に 比 較 し て 、 zTNFR14× 1の 発 現 が 最 大 で あ る よ う に 思 わ れ る 。 一
般 に 、 単 球 細 胞 系 統 か ら の 細 胞 は 静 止 か ら 刺 激 さ れ た 状 態 に 行 く の で 、 ztnfr14は 発 現 を
増加させ、休止細胞と刺激された細胞との間の区別を可能とするように思われる。また、
こ の レ セ プ タ ー は B細 胞 、 T細 胞 、 単 球 お よ び 他 の 免 疫 細 胞 系 統 に お い て 有 意 な レ ベ ル で 転
写される。
【０３４３】
前述の説明から理解されるように、本発明の特別の態様を例示の目的で記載してきたが
、本発明の趣旨および範囲から逸脱しないで、種々の変更および変化が可能である。した
20
がって、本発明は添付された特許請求の範囲による以外限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０３４４】
【 図 １ 】 図 1は 、 TNFRフ ァ ミ リ ー の 関 係 す る メ ン バ ー を 有 す る ヒ ト お よ び マ ウ ス ztnfr14 (
そ れ ぞ れ 配 列 番 号 1お よ び 3) の ア ミ ノ 酸 配 列 の 比 較 で あ る 。 他 の 列 挙 す る 配 列 は 下 記 を 包
含 す る : ヒ ト お よ び マ ウ ス ztnfr12 (BAFF-R、 配 列 番 号 5お よ び 7) ; ヒ ト お よ び マ ウ ス BCM
A (配 列 番 号 8お よ び 10) ; ヒ ト お よ び マ ウ ス TWEAKR (配 列 番 号 11お よ び 13) ; ヒ ト お よ び
マ ウ ス EDAR (配 列 番 号 14お よ び 16) ; ヒ ト XEDAR (配 列 番 号 17) ; ヒ ト お よ び マ ウ ス TACI
(配 列 番 号 19お よ び 21) ; お よ び ヒ ト お よ び マ ウ ス MK61 (配 列 番 号 22お よ び 24) 。
【 図 ２ 】 図 2は 、 ヒ ト お よ び マ ウ ス ztnfr14 (配 列 番 号 34お よ び 35) の シ ス テ イ ン に 富 ん だ
30
ド メ イ ン の 区 画 を 下 記 の レ セ プ タ ー の 各 々 の 少 な く と も 1つ の シ ス テ イ ン に 富 ん だ ド メ イ
ン と 比 較 す る : ヒ ト ztnfr12 (BAFF-R、 配 列 番 号 6) ; ヒ ト BCMA (配 列 番 号 9) ; ヒ ト TWEAK
R (配 列 番 号 12) ; ヒ ト EDAR (配 列 番 号 15) ; ヒ ト XEDAR (配 列 番 号 18) ; ヒ ト TACI (配 列
番 号 20) ; お よ び ヒ ト MK61 (配 列 番 号 23) 。
【 図 ３ 】 図 3は 、 ヒ ト (配 列 番 号 2) 、 マ ウ ス (配 列 番 号 4) 、 ラ ッ ト (配 列 番 号 25) 、 雌
牛 (配 列 番 号 26) 、 ニ ワ ト リ (配 列 番 号 27) お よ び ア フ ル リ カ ツ メ ガ エ ル (配 列 番 号 28)
の ztnfr14配 列 の 種 比 較 で あ る 。 「 Cons」 と し て 示 す ラ イ ン は 種 間 の 保 存 さ れ た ア ミ ノ
酸を記録する。
【 図 ４ 】 図 4は 、 種 々 の 非 刺 激 B細 胞 系 統 に お け る ztnfr14× 1、 ztnfr14× 2お よ び ztnfr14
× 3の 発 現 を 評 価 す る 実 時 間 PCR分 析 結 果 を グ ラ フ で 表 示 す る 。
【 図 ５ 】 図 5は 、 種 々 の 非 刺 激 単 球 、 T細 胞 系 統 な ら び に 形 質 転 換 さ れ た 骨 髄 内 皮 細 胞 系 統
(TRBMEC) 、 (MLR) お よ び 線 維 芽 細 胞 系 統 に お け る ztnfr14× 1、 ztnfr14× 2お よ び ztnfr
14× 3の 発 現 を 評 価 す る 実 時 間 PCR分 析 結 果 を グ ラ フ で 表 示 す る 。
【 図 ６ 】 図 6は 、 種 々 の 休 止 お よ び 非 刺 激 ヒ ト 単 球 系 統 に お け る ztnfr14× 1、 ztnfr14× 2
お よ び ztnfr14× 3の 発 現 を 評 価 す る 実 時 間 PCR分 析 結 果 を グ ラ フ で 表 示 す る 。
40
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【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
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【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
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【配列表】
2008500804000001.app
【手続補正書】
【 提 出 日 】 平 成 19年 10月 17日 (2007.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項２】
ポ リ ペ プ チ ド が 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ Xを 含 ん で な り 、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る 、
請 求 項 1に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項３】
ポ リ ペ プ チ ド が 残 基 1∼ 108を 含 ん で な る 、 請 求 項 1に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項４】
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 131を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項５】
ポ リ ペ プ チ ド が 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 131を 含 ん で な る 、 請 求 項 4に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ
ペプチド。
【請求項６】
配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 198を 含 ん で な る 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項７】
ポ リ ペ プ チ ド が 残 基 1∼ 198を 含 ん で な る 、 請 求 項 6に 記 載 の 単 離 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項８】
ポ リ ペ プ チ ド が 下 記 の ポ リ ペ プ チ ド か ら 成 る 群 か ら 選 択 さ れ る 、 請 求 項 1に 記 載 の 単 離
されたポリペプチド:
a) 配 列 番 号 2の 残 基 1∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ;
b) 配 列 番 号 30の 残 基 1∼ 308を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ; お よ び
c) 配 列 番 号 32の 残 基 1∼ 185を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項９】
請 求 項 1に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【請求項１０】
請 求 項 4に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【請求項１１】
請 求 項 6に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 単 離 さ れ た ポ リ ヌ ク レ オ チ ド 。
【請求項１２】
下記の作用可能に連鎖された要素を含んでなる発現ベクター:
a) 転 写 プ ロ モ ー タ ー ;
b) DNAセ グ メ ン ト 、 こ こ で DNAセ グ メ ン ト は 請 求 項 1に 記 載 の ポ リ ペ プ チ ド 分 子 を コ ー
ドするポリヌクレオチド分子である; および
c) 転 写 タ ー ミ ネ ー タ ー 。
【請求項１３】
DNAセ グ メ ン ト が ア フ ィ ニ テ ィ ー タ グ を 含 有 す る 、 請 求 項 12に 記 載 の 発 現 ベ ク タ ー 。
【請求項１４】
請 求 項 12に 記 載 の 発 現 ベ ク タ ー が 導 入 さ れ て お り 、 DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ れ る
ポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項１５】
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請 求 項 14に 記 載 の 細 胞 を 培 養 し 、 こ こ で 前 記 細 胞 は DNAセ グ メ ン ト に よ り コ ー ド さ れ る
ポリペプチドを発現し; そして前記ポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチ
ドを製造する方法。
【請求項１６】
請 求 項 15に 記 載 の 方 法 に よ り 製 造 さ れ た ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項１７】
下記の残基またはポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドに特異的に結合
する抗体:
a) 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ X、 こ こ で Xは 80∼ 108の 整 数 で あ る ;
b) 配 列 番 号 2の 残 基 18∼ 108を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ；
c) 配 列 番 号 2の 残 基 30∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ；
d) 配 列 番 号 2の 残 基 50∼ 80を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド ； お よ び
e) 配 列 番 号 2の 残 基 131∼ 198を 含 ん で な る ポ リ ペ プ チ ド 。
【請求項１８】
配 列 番 号 1の 少 な く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド ま た は 配 列 番 号 1の 相 補 体 を 含 ん で な
るポリヌクレオチドを含んでなる、患者からの遺伝学的資料における遺伝的異常性検出剤
、ここで前記ポリヌクレオチドと前記遺伝学的資料との第１反応生成物と、前記ポリペプ
チドと野生型患者対照試料との第２反応生成物との差が患者における遺伝的異常性を示す
。
【請求項１９】
請 求 項 17に 記 載 の 抗 体 を 含 ん で 成 る 、 患 者 か ら の 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 に お け る 癌 の
検出剤、ここで正常の対照組織または生物学的試料に対する患者の組織または生物学的試
料に結合した抗体のレベルの増加または減少は患者における癌を示す。
【請求項２０】
配 列 番 号 1の 少 な く と も 14の 隣 接 す る ヌ ク レ オ チ ド ま た は 配 列 番 号 1の 相 補 体 を 含 ん で な
るポリヌクレオチド又はその相補体を含んでなる、患者から組織または生物学的試料にお
ける癌の検出剤、ここで正常の対照組織または生物学的試料に関する患者の組織または生
物学的試料に対する標識化ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの増加または減少
は患者における癌を示す。
【請求項２１】
請 求 項 15に 記 載 の 方 法 に よ り 製 造 さ れ る 殺 癌 細 胞 性 ポ リ ペ プ チ ド を 含 ん で 成 る 、 患 者 か
ら 癌 細 胞 を 含 有 す る ex vivo 組 織 ま た は 生 物 学 的 試 料 に 対 す る 殺 癌 細 胞 剤 。
【請求項２２】
ポ リ ペ プ チ ド が さ ら に ト キ シ ン に 複 合 体 さ れ て い る 、 請 求 項 21に 記 載 の 殺 癌 細 胞 剤 。
【請求項２３】
下記の工程を含んでなる刺激された免疫細胞から休止細胞を分離する方法:
免疫細胞の試料を採取し、
前 記 試 料 の 一 部 分 上 に お け る 配 列 番 号 2ま た は そ の ス プ ラ イ ス 変 異 型 に よ り コ ー ド さ れ
る配列の転写、翻訳またはタンパク質発現のレベルを測定して、転写、翻訳またはタンパ
ク質発現の対照レベルを獲得し、
残りの試料を刺激因子とインキュベートし、
前 記 試 料 中 の 配 列 番 号 2ま た は そ の ス プ ラ イ ス 変 異 型 に よ り コ ー ド さ れ る 配 列 の 転 写 、
翻訳またはタンパク質発現のレベルを測定し、そして
対照レベルよりも多い転写、翻訳またはタンパク質発現のレベルを有するか、あるいは
前記対照レベルでまたはそれより低いレベルでタンパク質を発現する細胞を分離して、刺
激された状態の免疫細胞の集団を獲得する。
(72)
【国際調査報告】
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｑ
5/10
1/68
Ｃ１２Ｎ 5/06
Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｇ０１Ｎ 33/574
Ａ６１Ｋ 38/00
Ａ６１Ｐ 35/00
Ａ６１Ｋ 47/48
テーマコード（参考）
(2006.01)
(2006.01)
Ｃ１２Ｎ
5/00
Ａ
４Ｃ０８４
Ｃ１２Ｑ
1/68
Ａ
４Ｈ０４５
(2006.01)
(2006.01)
Ｃ１２Ｎ
5/00
Ｅ
Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ
(2006.01)
(2006.01)
Ｇ０１Ｎ 33/574
Ａ
Ａ６１Ｋ 37/02
(2006.01)
(2006.01)
Ａ６１Ｐ 35/00
Ａ６１Ｋ 47/48
(81)指定国 AP(BW,GH,GM,KE,LS,MW,MZ,NA,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),
EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HU,IE,IT,LU,MC,NL,PL,PT,RO,SE,SI,SK,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,
CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,
DE,DK,DM,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
A,MD,MG,MK,MN,MW,MX,MZ,NA,NI,NO,NZ,OM,PG,PH,PL,PT,RO,RU,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SY,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG
,US,UZ,VC,VN,YU,ZA,ZM,ZW
(74)代理人 100108903
弁理士 中村 和広
(72)発明者 フォックス，ブライアン エー．
アメリカ合衆国，ワシントン ９８１０３，シアトル，ウッドローン アベニュ ノース ３９２
５
(72)発明者 ホローウェイ，ジェイムズ エル．
アメリカ合衆国，ワシントン ９８１１５，シアトル，ノースイースト エイティーナインス ス
トリート ８３５
(72)発明者 シェパード，ポール オー．
アメリカ合衆国，ワシントン ９８２５２，グラニット フォールズ，トゥエンティーハンドレッ
ツセブンティーエイス ドライブ ノースイースト １３５３２
(72)発明者 ディロン，ステイシー アール．
アメリカ合衆国，ワシントン ９８１１５，シアトル，トゥエンティーエイッス アベニュ ノー
スイースト ８０５７
Ｆターム(参考) 4B024 AA01 AA12 BA63 CA04 DA02 DA05 DA11 EA04 FA01 GA11
HA03 HA12
4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QS25 QS36
QX02
4B064 AG20 CA19 CC24 CE12 DA01 DA14
4B065 AA01X AA57X AA90X AA93Y AB01 BA01 CA24 CA44 CA46
4C076 CC27 EE41 EE59 FF68
4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA19 BA20 BA21 BA22 BA23 BA44
CA53 NA14 ZB262
4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA40 DA50 EA28 EA50 FA72 FA74