熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System

熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title
胃癌腹膜播腫モデルに対するアデノウイルスを用いた
Oncolytic suicide gene therapy の有用性
Author(s)
今村, 裕
Citation
Issue date
2010-03-25
Type
Thesis or Dissertation
URL
http://hdl.handle.net/2298/16829
Right
学位論文
Doctoral Thesis
胃癌腹膜播腫モデルに対するアデノウイルスを用いた
Oncolytic suicide gene therapy の有用性
(The usefulness of adenoviral oncolytic suicide gene therapy for a peritoneal
dissemination model of gastric cancer in mice)
今村
裕
Yu Imamura
熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻消化器外科学
指導教員
馬場
秀夫教授
熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻消化器外科学
2010 年 3 月
1
学
位
論
文
Doctoral Thesis
論文題名：
胃癌腹膜播腫モデルに対するアデノウイルスを用いた Oncolytic suicide
gene therapy の有用性
(The usefulness o f adenoviral oncolytic suicide gene therapy for a
peritoneal dissemination model of gastric cancer in mice)
著者名：
今村
裕
Yu Imamura
指導教員名：
熊本大学大学院医学教育部博士課程医学専攻消化器外科学
馬場秀夫
教授
審査委員名：
消化器内科学
担当教授
佐々木
分子遺伝学
担当教授
尾池
雄一
病態情報解析学
担当教授
安東
由喜雄
微生物学
担当教授
赤池
孝章
2010 年 3 月
2
裕
目次
1. 要旨
4
2. 発表論文リスト
6
3. 謝辞
9
4. 略語一覧
10
5. 研究の背景と目的
11
5-1) 胃癌と腹膜播腫
11
5-2) 遺伝子治療の現状と問題点
15
5-3) 遺伝子治療におけるアデノウイルスベクターの特徴
21
5-4) 癌に対する遺伝子治療
23
5-5) 本研究の遺伝子治療システム
24
5-6) 本研究の目的
28
6. 実験方法
30
6-1) 細胞株および細胞培養
30
6-2) MKN45-GFP の作製
31
6-3) 組換えアデノウイルスの作製と精製
31
6-4)アデノウイルスの正常細胞および腫瘍細胞に対する影響・効果
34
6-5) 至適ウイルス量の比率に関する検討
34
6-6) 至適 5-FC 量の検討
35
6-7) 腫瘍細胞における CEA-mRNA 発現状況の確認
36
6-8) Oncolytic suicide gene therapy の治療効果と安全性(in vitro)
37
6-9) Oncolytic suicide gene therapy の治療効果と安全性 (in vivo)
39
7. 実験結果
41
7-1) 至適アデノウイルス投与量の決定(in vitro)
41
7-2) 制限増殖型アデノウイルス Ad/CEA-E1 単独の抗腫瘍効果 (in vitro)
42
7-3) 至適ウイルス比率の決定 (in vitro)
43
7-4) 至適 5-FC 量の決定 (in vitro)
45
7-5) RT-PCR による各種細胞の CEA-mRNA 発現状況
46
7-6) Oncolytic suicide gene therapy の抗腫瘍効果 (in vitro)
46
7-7) Oncolytic suicide gene therapy と Suicide gene therapy の比較 (in vivo)
49
8. 考察
55
9. 結論
60
10. 参考文献
61
3
1. 要旨
【背景・目的】胃癌において腹膜播腫は再発形式として最も多く難治性の病態
である。アデノウイルスを用いた遺伝子治療は、この病態に対する有用な治療
法の一つになりうる可能性がある。しかし、アデノウイルスベクターには臨床
応用するにあたり、いくつかの問題点が存在する。その 1 つとして、アデノウ
イルスベクターの容量依存的毒性が挙げられる。それを克服するために、我々
は従来の Suicide gene therapy と Oncolytic gene therapy を組み合わせた Oncolytic
suicide gene therapy という新しい遺伝子治療システムを考案した。このシステム
では CEA 産生細胞選択的にこれら 2 つの従来法の相乗効果が発揮できるように
設計されている。我々は、このシステムを用いて抗腫瘍効果を保ちながらウイ
ルスベクター総投与量の減量が可能かどうかを、胃癌腹膜播腫モデルマウスを
用いて検討した。
【方法】従来の Cre/loxP システムを利用した Suicide gene therapy として ①
Ad/CEA-Cre, ②Ad/lox-CD::UPRT を、Oncolytic gene therapy として制限増殖型ア
デノウイルスである③Ad/CEA-E1 の 3 種類のウイルスを作製した。in vitro の実
験では、CEA 高産生細胞株であるヒト胃癌細胞株 MKN45 に対して Oncolytic
suicide gene therapy (①+②+③10MOI ) と等ウイルス量の Suicide gene therapy (①
+② 10MOI )による治療を行い、その抗腫瘍効果を比較した。さらに、in vivo の
実験では、腫瘍可視化のため GFP 遺伝子を導入した MKN45-GFP 細胞を用いた
胃癌腹膜播腫モデルマウスに対して Oncolytic suicide gene therapy (1×108
pfu/mouse)とその 10 倍のウイルス量の Suicide gene therapy(1×109 pfu/mouse)によ
る治療を行い、その抗腫瘍効果と副作用について検討した。
【結果】in vitro における Oncolytic suicide gene therapy の MKN45 に対する抗腫瘍
効果は、同ウイルス量の Suicide gene therapy よりも優れていた。また、in vivo
における Oncolytic suicide gene therapy の抗腫瘍効果は、そのウイルス 10 倍量の
Suicide gene therapy に匹敵し、副作用は軽微であった。
【結論】Oncolytic suicide gene therapy を用いることで、抗腫瘍効果を保ちながら
ウイルス量を減量させることが可能になる。Oncolytic suicide gene therapy はアデ
ノウイルスベクターの臨床応用へむけた改善策の一つになる可能性がある。
4
SUMMARY
Background: The peritoneal dissemination of gastric cancer is often refractory to
systemic therapies. Although adenoviral gene therapy has been reported to be a
potentially useful therapeutic modality, the adenovirus itself has a dose-limiting toxicity.
In this study, a novel system was constructed using adenoviral oncolytic suicide gene
therapy targeting carcinoembryonic antigen (CEA), and assessed the therapeutic effect
and possibility to reduce the total viral dose while still preserving the antitumor effect in
peritoneal dissemination models of gastric cancer in mice.
Methods: Three types of adenoviruses were prepared for this novel system, including
① Ad/CEA-Cre, ② Ad/lox-CD::UPRT for a Cre/loxP system, ③ Ad/CEA-E1 for
conditionally replicating adenovirus. The antitumor effect of the oncolytic suicide gene
therapy (①+②+③, 10MOI) was then compared with the suicide gene therapy (①+②,
10MOI) in vitro . Mice bearing the peritoneal dissemination of human gastric cancer
were treated with either this system (1×108 pfu/mouse) or a 10-fold viral dose of suicide
gene therapy (1×109 pfu/mouse). The adverse effects were then evaluated.
Results: The current system demonstrated a significantly better cytotoxic effect for
CEA producing cell lines than suicide gene therapy at the same viral dose in vitro. The
effect of oncolytic suicide gene therapy was almost equal to that of the 10- fold viral
dose of suicide gene therapy in vivo. The adverse effects of both treated groups were
tolerable.
Conclusion: It was possible to reduce the total adenoviral dose while still preserving
the antitumor effect by using oncolytic suicide gene therapy. This strategy may help
adenoviral gene therapy to be applied for clinical uses safely.
5
2. 発表論文リスト
1.
Imamura Y, Ishikawa S, Sato N, Karashima R, Hiyoshi Y, Nagai Y, Koga Y,
Hayashi N, Watanabe M, Yamada G, Baba H. Adenoviral oncolytic suicide gene
therapy for a peritoneal dissemination model of gastric cancer in mice. Ann Surg
Oncol. (in press)
2.
Imamura Y, Hirota M, Ida S, Hayashi N, Watanabe M, Takamori H, Awai K, Baba
H. Significance of Renal Rim Grade on Computed Tomography in Severity
Evaluation of Acute Pancreatitis. Pancreas. (in press)
3.
Imamura Y, Baba Y, Ishikawa S, Hiyoshi Y, Nagai Y, Nakamura T, Hayashi N,
Miyanari N, Iyama K, Baba H. Heterogeneous prognoses of patients with tumors
invaded within muscularis propria according to tumor depth in the layers of the
muscularis propria. Gastric Cancer. 2008; 11: 219-25
4.
Nakamura T, Ishikawa S, Koga Y, Nagai Y, Imamura Y, Ikeda K, Mori T, Nomori
H, Baba H. Mutation analysis of Rad18 in human cancer cell lines and non small
cell lung cancer tissues. J Exp Clin Cancer Res. 2009; 28: 106
5.
Ishikawa S, Nagai, Y, Masuda T, Koga Y, Nakamura T, Imamura Y, Takamori H,
Hirota M, Funakosi A, Fukushima M, Baba. The role of Oxysterol binding protein
related protein 5 in pancreatic cancer. Cancer Science. (in press)
6.
Hiyoshi Y, Watanabe M, Hirashima K, Karashima R, Sato N, Imamura Y, Nagai Y,
Yoshida N, Toyama E, Hayashi N, Baba H. p12CDK2-AP1 is associated with
tumor progression and a poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma.
Oncol Rep. 2009; 22 :35-9
6
7.
Hiyoshi Y, Kamohara H, Karashima R, Sato N, Imamura Y, Nagai Y, Yoshida N,
Toyama E, Hayashi N, Watanabe M, Baba H. MicroRNA-21 regulates the
proliferation and invasion in esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res.
2009; 15: 1915-22
8.
Hiyoshi Y, Watanabe M, Imamura Y, Nagai Y, Baba Y, Yoshida N, Toyama E,
Hayashi N, Baba H. The relationship between the glucose transporter type 1
expression and F-fluorodeoxyglucose uptake in esophageal squamous cell
carcinoma. Oncology. 2009; 76: 286-92
9.
Ida S, Fujimura Y, Hirota M, Imamura Y, Ozaki N, Suyama K, Hashimoto D,
Ohmuraya M, Tanaka H, Takamori H, Baba H. Significance of endothelial
molecular markers in the evaluation of the severity of acute pancreatitis. Surg
Today. 2009; 39: 314-9
10. Baba Y, Haga Y, Hiyoshi Y, Imamura Y, Nagai Y, Yoshida N, Hayashi N, Toyama E
Miyanari N, Baba H. Estimation of physiologic ability and surgical stress(E-PASS)
in patients with esophageal squamous cell carcinoma undergoing resection.
Esophagus. 2008; 5: 81-86
11. Watanabe M, Yoshida N, Karashima R, Sato N, Hirashima K, Imamura Y, Hiyoshi
Y, Nagai Y, Iwagami S, Toyama E, Hayashi N, Baba H. Transcervical superior
mediastinal lymph node dissection combined with transhiatal lower esophageal
dissection before transthoracic esophagectomy: a safe approach for salvage
esophagectomy. J Am Coll Surg. 2009; 208: 7-9
12. Hayashi N, Imamura Y, Hiyoshi Y, Takamori H, Beppu T, Hirota M, Baba H. Rapid
genotyping of tumor necrosis factor alpha with fluorogenic hybridization probes on
the LightCycler. Clin Exp Med. 2008; 8: 217-24
7
13. Hayashi N, Mima K, Nagai Y, Shigaki H, Sato N, Hirashima K, Imamura Y,
Hiyoshi Y, Nakamura T. Yoshida N, Miyanari N, Watanabe M, Baba H.
Submucosal tumour in a young girl. Gut. 2009; 58: 1040, 1090
14. 渡邊 雅之、辛島 龍一、佐藤 伸隆、平島 浩太郎、日吉 幸晴、今村 裕、長
井 洋平、馬場 祥史、岩上 志朗、外山 栄一郎、林 尚子、馬場 秀夫.
部
操作先行の食道癌手術における反回神経周囲リンパ節郭. 日気食会報 60:
131-132, 2009.
15. 渡邊 雅之、佐藤 伸隆、辛島 龍一、平島 浩太郎、日吉 幸晴、今村 裕、長
井 洋平、馬場 祥史、岩上 志朗、吉田 直矢、外山 栄一郎、林 尚子、馬場
秀夫.
助療法.
胃癌
大きく変ってきたスタンダード治療
コンセンサス癌治療
胃癌の化学療法（1）補
7: 204-208, 2008
16. 佐藤 伸隆、林 尚子、今村 裕、日吉 幸晴、長井 洋平、渡邊 雅之、馬場 秀
夫. 消化器系腹部領域における Oncologic Emergency. 癌と化学療法
35,
2316-2320, 2008
17. 平島 浩太郎、林 尚子、佐藤 伸隆、辛島 龍一、今村 裕、日吉 幸晴、長井
洋平、外山 栄一郎、渡邊 雅之、馬場 秀夫.
大腸癌科学療法の実際
ファ
ーストライン－どう選び、どう行うか「FORFOX」. 消化器の臨床 11, 491-498,
2008
18. 広田 昌彦、金光 敬一郎、高森 啓史、近本 亮、水流添 周、井田 智、今村 裕、
岩槻 政晃、馬場 秀夫. 急性膵炎の重症度判定方法は？ In ; 臨床に直結する
肝・胆・膵疾患治療のエビデンス. 文光堂 216-218,2007
8
3. 謝辞
本研究の遂行ならびに本論文の作成にあたり、終始ご指導、ご鞭撻を賜りま
した熊本大学大学院医学薬学研究部 消化器外科学 馬場秀夫教授に謹んで厚く
御礼申し上げます。
また、熊本大学生命資源研究・支援センター
技術開発分野
山田源教授に
はマウス腹膜播腫のイメージングに関する貴重なご意見と、機器及び施設の提
供に深く感謝いたします。
そして、本研究の研究方針ならびに実験手技、論文作成等に関し一貫して熱心
なご指導いただきました石川晋之先生（現 熊本地域医療センター外科医師）に
心より御礼申し上げます。
さらに、本研究の遂行にあたり膨大な数の動物達が貴重な生命を捧げてくれ
たことに対し、深い畏敬の念を表すとともに、彼らのご冥福をお祈り致します。
最後に、様々な面でご協力とご指導を頂きました長井洋平先生、林尚子先生、
渡邊雅之先生をはじめ消化器外科学教室員の皆様に心より感謝を述べて、私の
謝辞と代えさせていただきます。
2010 年 2 月
9
4. 略語一覧
CEA, carcinoembryonic antigen
E.coli CD, Echerichia coli cytosine deaminase
HSV-TK, simplex virus thymidine kinase
5-FC, 5-fluorocytosine
5-FU, 5-fluorouracil
GCV, ganciclovir
UPRT, uracil phosphoribosyl trasferase
CRAd, conditionally replicating adenovirus
HEK 293, human embryonic kidney cell line 293
GFP, Green Fluorescent protein
DNA-TPC, DNA-terminal protein complex
RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction
HSV-TK, herpes simplex virus-thymidine kinase
GCV, ganciclovir
T-Bil, total bilirubin
ALT, alanine aminotransferase
AST, asparate aminotrasferase
10
5. 研究の背景と目的
5-1) 胃癌と腹膜播腫
胃癌は、世界で 4 番目に頻度の高い癌であり 2 番目の癌関連死因である[1]。
中でも東アジア、東欧、中南米に有病率が高く、年間 70 万人が胃癌で死亡して
いる[2,3]。特に我が国では、従来最も頻度の高い癌とされてきた。年齢調整死亡
率は 1985 年の人口分布を標準人口として年齢階級別死亡率から推定した人口 10
万人あたりの死亡率であるが、肺癌、肝癌、大腸癌、膵癌が 2000 年まで増加傾
向にあったのに対して、胃癌は 1970 年代初頭より男女共に着実に低下している
（図 1）。これは、近年の消化管内視鏡検査に代表される診断学の進歩、および
外科治療をはじめ内視鏡治療や化学療法などの治療学の進歩によるものと推測
される。しかし、胃癌の総死亡者数自体は低下しておらず、依然として頻度の
高い悪性腫瘍のひとつである（図 2）[4]。
図1
図 1. 主要な癌の年齢調整死亡率の年次的推移（H18 厚生労働省人口統計）
11
図2
図 2. 主要な癌の総死亡者数の年次的推移（H18 厚生労働省人口統計）
我が国における胃癌の治療成績を見ると、日本胃癌学会による 1991 年集積の
胃癌症例 8308 例の解析では 5 年生存率が 66.0%であり、胃切除を施行された 7935
例（95.5%）の 5 年生存率は 68.2%であった。また、胃癌取扱規約第 13 版では、
腹膜播腫は P1 として表記され Stage IV に分類されている（表 1,2）[5]。財団法
人癌研究会有明病院（癌研）胃癌データベースによる胃癌の Stage 分類別 5 年生
存率[6]をみても、StageIV 胃癌の予後は極めて不良であることが分かる。
（図 3）。
胃癌術後の主な再発形式は、腹膜播腫、肝転移、局所再発（胃、リンパ節）
、遠
隔転移の 4 つに分類される。Maehara らによる本邦からの多数例の報告[7]では、
手術症例の追跡調査がなされた 939 例のうち 207 例（22.0%）が再発を来し、腹
膜播腫（43%）、肝転移（33%）、局所再発（22%）、遠隔転移（21%）、多臓器再
発（25%）であった。さらに Yoo らによる韓国からの 508 例の胃癌術後再発症
例の報告[8]によると、腹膜播腫（40%）、肝転移（18%）、局所再発（23%）、遠
隔転移（19%）であり、腹膜播腫は胃癌における最も頻度の高い再発形式である
ことが分かる。
12
表1
表 1. 胃癌取扱い規約 13 版における 6 因子
表2
表 2. 胃癌取扱い規約 13 版における Stage 分類
13
図3
図 3. 癌研胃癌データベースによる pStage 別の予後
従って、胃癌の予後を改善させるためには、腹膜播腫に対する有効な治療法
の確立が不可欠である。これまで、腹膜播腫の治療には全身化学療法が一般的
に行われてきた。最近の腹膜播腫を含む進行胃癌に対する全身化学療法として
は、我が国から SPIRITS 試験（S-1 単剤 vs S-1+CDDP の併用療法）の結果が 2008
年に報告され、S-1+CDDP による全身化学療法が現在の標準的治療と考えられる
ようになった[9]。これまでの進行胃癌に対する様々な臨床試験の生存期間は
6-11 カ月であり [10-18]、この報告では S-1+CDDP の全身化学療法を用いること
で MST は 13 カ月と予後の延長効果を認めてはいるものの、依然として進行胃
癌の予後は不良である（図 4）。
14
図4
図 4. SPIRITS 試験の結果
胃癌腹膜播腫に対する全身化学療法以外の治療方法として、これまで外科的
腹膜切除[19,20]、全身および腹腔内化学療法[21-24]、腹腔内温熱化学療法[25-27]
などの様々な先進的試みが行われてきたが、それらの効果は比較的播腫病巣が
少ない早期の腹膜播腫症例に限られており、新たな治療方法の確立が望まれて
いる。
5-2) 遺伝子治療の現状と問題点
遺伝子治療は本来、病気の原因となる異常遺伝子そのものを修復し、その正
常な機能を回復させることで病気を治癒させようとする治療法として考案され
15
た。1989 年に世界で初めて遺伝子導入腫瘍浸潤リンパ球がメラノーマ患者に投
与され、その標識リンパ球の体内動態及が観察されたと同時に安全性が確認さ
れた[28]。この結果を受けて、1990 年 NIH において 2 名の ADA(アデノシンデ
アミナーゼ)欠損症の患者へ ADA 遺伝子導入自家リンパ球投与の臨床試験が行
われ[29]、現在までに約 1500 件以上の遺伝子治療に関する臨床研究がアメリカ
を筆頭に世界中で行われており（図 5）、現在でも年間 100 件前後の登録状況を
維持している（図 6）[30]。ただし、そのほとんどが安全性評価を主体とし一部
有効性を検討する Phase I/II study であり、効果の検討を主体とする Phase III はわ
ずかである（図 7）。これまでの遺伝子治療に関する臨床研究の中で癌領域のも
のが半分以上を占め（図 8）、ベクターとしてはアデノウイルスを用いたものが
最多の 24%を占める（図 9）[30]。我が国でも 2009 年までに 17 件の臨床試験が
登録されている（表 3）。
図5
図 5. 遺伝子治療臨床試験における国別登録割合
16
図6
図 6. 世界における遺伝子治療臨床試験の年度別登録数
図7
図 7. 遺伝子治療臨床試験の phase 別割合
17
図8
図 8. 遺伝子治療臨床試験の対象疾患別割合
図9
図 9. 遺伝子治療臨床試験における使用ベクター割合
18
表3
タイトル
No.
1
Gene Therapy in Patients with HIV Infection (withdrawn)
Peripheral T-lymphocyte-directed gene transfer for a patient with severe combined
2
immune deficiency caused by adenosine deaminase deficiency
(Blood. 1998 Jan 1;91(1):30-6)
3
4
5
6
7
Gene Therapy in patients with glioblastoma and astrocytoma
(Hum Gene Ther. 2004 Jan;15(1):77-86)
Gene therapy in Patients with stage IV renal cancer (closed)
HSV-TK/GCV gene therapy in the treatment of recurrent glioblastoma multiforme
(open)
A phase I trial of adenoviral p53 gene therapy for non-small cell lung cancer
(Nippon Geka Gakkai Zasshi. 1999 Nov;100(11):749-55)
Phase I/II Adenoviral p53 Gene Therapy for Chemo-radiation-resistant Locally
Advanced Esophageal Squamous Cell Carcinoma (closed)
8
Gene therapy in patients with breast cancers (open)
9
Gene therapy in patients with prostate cancer (open)
10
Japan Trial to treat peripheral arterial disease by therapeutic angiogenesis using
hepatocyte growth factor gene transferHypertension. (2004 Aug;44(2):203-9)
11
Gene therapy in patients with melanoma (closed)
12
Clinical gene therapy for ADA deficiency targeting haematopoietic stem cell (open)
13
14
15
16
Japan Trial to treat peripheral arterial disease by therapeutic angiogenesis using
hepatocyte growth factor gene transfer (TREAT-HGF II) (open)
Phase I/II clinical trial of gene therapy for hormone refractory metastatic prostate cancer
(open)
Gene and Cell Therapy for Relapsed Leukemia after Allogeneic Stem Cells
Transplantation (open)
Gene therapy for Critical limb ischemia (CLI) due to arteriosclerosis obliterans or
thromboangitis obliterans (Buerger's disease) (open)
A novel approach to therapeutic angiogenesis for patients with critical limb ischemia by
17
sustained release of basic fibroblast growth factor using biodegradable gelatin hydrogel
(open)
表 3. 本邦でこれまでに登録された遺伝子治療臨床試験の一覧
19
遺伝子治療における遺伝子導入技術の重要性は、遺伝子治療開始前から指摘
され、遺伝子治療成功の鍵である。そのため、遺伝子導入ベクターの開発は今
も盛んに行われている。しかし導入ベクター、中でもウイルスベクターの安全
性の懸念は当初から指摘されており、1999 年ペンシルベニア大学において最高
量のアデノウイルスを肝動脈内に投与された 19 歳の男性が SIRS を発症し 4 日
後に死亡した事件[31]以来、安全性における懸念が拡がった。1999 年にフランス
で行われた SCID-X1( severe combined immunodeficiency-X1 )遺伝子治療では患者
から取り出した骨髄幹細胞にレトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行
い、症状の長期に及ぶ改善が 11 例中 9 例に見られていたが、2002 年 9 月から
12 月の間に 2 例の患者が白血病様の症状を呈したという報告があり、原因を調
査した結果、ベクター遺伝子の染色体ゲノム中への挿入により、第 11 番染色体
上にある protooncogene LMO2 を活性化し、癌化を誘発した事が明らかになった
[32]。また、アデノ随伴ウイルスベクターについても高齢マウスでの発癌性が指
摘されている[33]。それでは、非ウイルスベクターはどうかというと、安全性に
ついての懸念ははるかに低いが、効率の低さが欠点として挙げられる。血管新
生因子による閉塞性動脈硬化症の遺伝子治療はベクターを用いずに naked DNA
を直接骨格筋内に注入する方法で効果を認めているが、これは治療効果の発現
に高い遺伝子導入効率を必要としなかったためと考えられる。したがって、現
在ベクター開発の最重要課題は高効率・低侵襲ベクターおよび治療法の開発で
あり、実は矛盾するこれらの要求をいかに実現するかが重要な課題であるとい
える。
20
5-3) 遺伝子治療におけるアデノウイルスベクターの特徴
アデノウイルス粒子は 65-80nm の正十二面体でエンベロープを持たない DNA
ウイルスである。ウイルスの中心部には 36Kbp の 2 本鎖線状 DNA を持ち、これ
にコア蛋白が結合してコアを形成し、その外側をカプシド蛋白が取り囲んでい
る。カプシドは各頂点に位置する 12 個のペントン（ペントンベースとファイバ
ーからなる）と 240 個のヘキソンから構成されている（図 10）。
図 10
図 10. アデノウイルスの構造と電子顕微鏡写真
このアデノウイルスは培養細胞系でよく増殖し、ゲノム DNA はウイルス粒子か
ら容易に精製されるため、アデノウイルス 2 型及び 5 型を中心に遺伝子治療の
ベクターとしてのウイルス構造の解析が進んできた。遺伝子治療におけるアデ
21
ノウイルスの特徴としては、以下の長所が挙げられる [34]。
(1) 遺伝子導入・発現効率が高い
(2) 増殖・静止期のいずれの細胞に対しても感染可能である
(3) 感染域が広くあらゆる細胞に感染可能である
(4) 遺伝子解析が進んでおり遺伝子操作が容易である
(5) ワクチン接種目的に使用された経緯やすでに多数の臨床応用で安全
性が比較的高いことが確認されている
(6) ウイルスゲノムが宿主細胞のゲノムに組み込まれない
(7) 高濃度のウイルス液の調整が容易である
しかし一方で、アデノウイルスベクターには以下の問題点が挙げられる[35]。
(8) 遺伝子導入が標的細胞のアデノウイルス受容体 ( Coxsackie and
adenovirus receptor ; CAR )の発現レベルに依存し、CAR を発現しない
細胞への適応が困難である
(9) 組織特異性を示さない
(10) 投与に伴い免疫反応を来す
現在、これらの問題を克服し、機能面で優れたアデノウイルスベクターの開
発が世界で盛んに行われている。
本研究では、新たな高効率・低侵襲の遺伝子治療法の開発として、特にその遺
伝子発現効率が高いという点でアデノウイルスベクターを選択し、その侵襲性
の低減に努めることにした。アデノウイルス自体、上記(2),(3),(9)の特徴ために
標的細胞以外の細胞に感染が生じ、そこで遺伝子発現を来すことで細胞傷害を
22
来す可能性がある。これまでのアデノウイルスベクターによる有害事象は、容
量依存的に毒性を発揮することが指摘されている[36,37]。例えば in vitro では
Hela などのヒト由来細胞株へウイルスを感染させると、多重感染度（multiplicity
of infection ; MOI, pfu/cell ）が 10 MOI 程では問題にならないが、50 MOI 以上に
なると、数時間以内に細胞の形態が丸くなり、細胞機能（DNA, RNA, 蛋白合成）
が低下あるいは停止する。同様に、動物個体への投与でも過剰投与は数時間以
内の局所細胞機能停止を来たし、また静脈注入時の肝障害などの有害事象が起
こる[39]。このようなアデノウイルスベクター自体の容量依存的毒性から考える
と、主作用を保ちながら投与ウイルス量を最小限にするというアプローチは新
たな高効率・低侵襲の遺伝子治療法につながると考えられる。
5-4) 癌に対する遺伝子治療
これまで用いられてきた主な遺伝子治療システムは大まかに以下のように分
類される。
(a) Mutation compensation
p53 や BRCA1 などの癌抑制遺伝子の変異や ErbB2 などの癌遺伝子の過剰発現
が原因と考えられる癌において、これらの遺伝子異常を正常化することで抗腫
瘍効果をもたらすシステム。例えば p53 遺伝子導入によりアポトーシスの誘導
を試みるとともに、抗癌剤や放射線を併用することで DNA 損傷から p53 蛋白レ
ベルの上昇してアポトーシスを誘導する。
(b) Suicide gene therapy (Molecular chemotherapy)
23
細胞毒性のないプロドラッグを細胞毒性物質に変換させることのできる蛋白
をコードした suicide gene ( 自殺遺伝子 ) を標的細胞に導入・発現させ、プロド
ラッグ投与を行い遺伝子導入された細胞に対して選択的に細胞傷害性を発揮す
るシステム。例えば、cytosine deaminase ( CD ) 遺伝子/5-FC システムは、癌細胞
内で 5-FC が 5-FU に変換され抗腫瘍効果を発揮する。
(c) Genetic immunopotentiation
腫瘍細胞にサイトカイン遺伝子（IL-12 や GM-CSF）を導入することでリンパ球
や強力な抗原提示細胞である樹状細胞などを賦活化し抗腫瘍免疫を高めること
で癌細胞を排除するシステム。
(d) Oncolytic agents
癌細胞特異的にウイルスが増殖することにより腫瘍融解を来すことで抗腫瘍
効果を発揮するシステム。この制限増殖型アデノウイルスとして初めて報告さ
れた ONYX-015 は p53 変異細胞でのみ増殖することで腫瘍融解を招く。
5-5) 本研究の遺伝子治療システム
今回、われわれはこれらの遺伝子治療システムを組み合わせることで、抗腫
瘍効果を保ちながら投与するアデノウイルス量が減量できるのではないかと考
えた。本研究では(b) Suicide gene therapy (Molecular chemotherapy) と(d)
Oncolytic agents を組み合わせた Oncolytic suicide gene therapy というシステムを
考案した。このシステムの作用機序について以下に説明する。
まず、今回利用した Suicide gene therapy のシェーマを以下に示す（図 11）。
24
図 11
図 11. 本研究に利用した Suicide gene therapy のシェーマ
これは Cre/lox-p システムを利用したシステムである。まず、Ad/CEA-Cre は CEA
産生細胞でのみ Cre recombinase を発現する。次いで Cre の存在下で
Ad/lox-CD::UPRT のコードしている遺伝子の loxP サイトで囲まれた stuffer 領域
がループアウトされる。それによって、CEA 産生細胞で強力な CAG プロモータ
ー下に CD::UPRT 蛋白が発現する。
25
図 12
図 12. CD::UPRT 蛋白の働き
さらにプロドラッグである 5-FC が投与されることで、CEA 産生細胞内で発現し
ている CD::UPRT 蛋白が 5-FC から 5-FU さらには 5-FdUMP への変換を行い抗腫
瘍効果が期待される[38]（図 12）。
次に、今回利用した Oncolytic gene therapy のシェーマを以下に示す（図 13）。
26
図 13
図 13. 本研究に利用した Oncolytic gene therapy のシェーマ
Ad/CEA-E1 は、CEA プロモーターの下流に IRES 配列で連結させたアデノウイ
ルスの増殖に必要な E1A, E1B 遺伝子がコードされているため、CEA 産生細胞で
のみ E1A, E1B 遺伝子を発現するように設計された制限増殖型アデノウイルスで
ある。このウイルスは CEA 産生細胞内で無数に増殖し、細胞融解が導かれるこ
とで抗腫瘍効果が期待される。
最後に、本研究の Oncolytic suicide gene therapy のシェーマを以下に示す（図
14）。
27
図 14
図 14. Oncolytic suicide gene therapy のシェーマ
Oncolytic suicide gene therapy は上記の様に、従来の遺伝子治療の相乗効果により
より強力な抗腫瘍効果が期待できる。
5-6) 本研究の目的
これまで、腹膜播腫に対する遺伝子治療の有用性が基礎実験レベルで多数報
告されている[40-46]。本研究では高効率かつ低侵襲なアデノウイルスベクター
を用いた癌遺伝子治療の実現化のための一つの手段として、Suicide gene therapy
と Oncolytic gene therapy を組み合わせた Oncolytic suicide gene therapy という新し
28
いアデノウイルスベクターを用いた癌遺伝子治療システムを考案した。さらに
難治性癌である胃癌腹膜播腫モデルマウスにおいて、このシステムと従来の
Suicide gene therapy との治療効果および副作用発現の比較を行い、本ストラテジ
ーが抗腫瘍効果を保ちながらウイルス投与量の減量を実現させることが可能か
どうかを検討することにした。
29
6. 実験方法
6-1) 細胞株および細胞培養
本研究にはヒト胃癌細胞株 AGS, MKN1, MKN45、ヒト膵癌細胞株 Capan-2,
Hs700T, AsPC-1、ヒト繊維芽細胞株 Hs68、そしてヒト胎児性腎細胞株 HEK293
を用いた。細胞培養にはいずれも RPMI-1640 ( Invitrogen, California, USA )、もし
くは DMEM ( Invitrogen )に 10%Fetal Bovine Serum ( Invitrogen )を添加したものを
用い、37℃, 5%二酸化炭素濃度の条件下で培養を行い、3 日ごとの継代を行った。
以下にそれぞれの細胞の供与先および使用した medium を示す（表 4）。
表4
細胞株
供与元
Medium
AGS
ATCC
RPMI-1640
MKN1
JCRB 細胞バンク
RPMI-1640
MKN45
JCRB 細胞バンク
RPMI-1640
Capan-2
ATCC
DMEM
Hs700T
JCRB 細胞バンク
RPMI-1640
AsPC-1
ATCC
RPMI-1640
Hs68
ATCC
RPMI-1640
HEK293
JCRB 細胞バンク
RPMI-1640
ATCC, American type culture collection;
biosources
30
JCRB, Japanese collection of research
6-2) MKN45-GFP の作製
in vitro および in vivo における抗腫瘍効果の肉眼的評価のために、GFP を発現
する MKN45-GFP 細胞を作製し可視化できるようにした。GFP 遺伝子は phrGFP
( Strategene, California, USA ) から、制限酵素を用いて HindIII-KpnI サイトをダ
イジェストし、pcDNA3.1 ( Invitrogen ) の HindIII/KpnI サイトにインサートを行
った。このプラスミド pcDNA3.1-GFP を、6-well に 40-60%コンフルエント状態
に増殖した MKN45 細胞に、
DreamFect ( Oz Biosciences, Parc scientifique de Luminy,
Marseille CEDEX 9, France )を用いてトランスフェクトを行った。その 24 時間後、
プラスミド pcDNA3.1-GFP を細胞内に維持させるために Geneticin sulfate ( G418;
Sigma-Aldrich, Missouri, USA )を 800 µg/ml 添加した RPMI-1640 を用いて medium
交換を行った。以後この MKN45-GFP 細胞の培養にはこの G418 800 µg/ml 添加
RPMI-1640 を用いた。
6-3) 組換えアデノウイルスの作製と精製
本研究では 3 種類のアデノウイルスを作製した。2 種類は Cre/loxP システムを
用いた Suicide gene therapy に用いるウイルスとして①Ad/CEA-Cre と ②
Ad/lox-CD::UPRT を、もう 1 種類は Oncolyticgene therap としての制限増殖型アデ
ノウイルスとして③Ad/CEA-E1 を作製した。これら 3 種類のアデノウイルス作
製には Adenovirus Expression Vector Kit ( Takara, Shiga, Japan ) および Adenovirus
Cre/loxP Kit ( Takara )を用いた。
まず①Ad/CEA-Cre に必要な CEA-Cre の遺伝子配列作成に関しては、
pDRIVE-hCEA ( InvivoGen, San Diego, USA ) から CEA プロモーター領域を、制
限酵素を用いて SpeI-NcoI サイトでダイジェストした。それを Cre リコンビナー
31
ゼ遺伝子を有する pSH47 ( Yeast Resource Center, University of Washington, Seattle,
USA ) の SpeI/NcoI サイトにインサートし、CEA プロモーターのもとで Cre リ
コンビナーゼが発現する設計にした。さらに、この CEA-Cre を制限酵素を用い
て SpeI-KpnI サイトでダイジェストし両端を blunting した後に、コスミド pAxcw
( Takara )の SwaI サイトにライゲーションし、コスミド pAxcw/CEA-Cre が完成し
た。次に、②Ad/lox-CD::UPRT に必要な CD::UPRT 遺伝子を、pORF-CD::UPRT
( InvivoGen )から制限酵素を用いて NcoI-HindIII サイトでダイジェストした。そ
れを、コスミド pAxCALNLw の CAG プロモーター‐loxP サイトの下流の SwaI
サイトにライゲーションし、コスミド pAxCALNLw/lox-CD::UPRT が完成した。
③Ad/CEA-E1 に必要な CEA-E1B-IRES-E1A ( CEA-E1 ) の遺伝子配列に関しては、
まず、E1A および E1B を HEK293 細胞の cDNA ライブラリーより PCR を用いて
それぞれ増幅させ、プラスミド IRES-NEO-neu ( 熊本大学大学院先導機構 大村
谷昌樹先生より提供 ) の IRES 配列の両端にそれぞれインサートし
E1B-IRES-E1A ( E1 ) の配列を得た。さらにこの E1 サイトを EcoRI-XhoI サイト
でダイジェストし、前述のプラスミド pSH47/CEA-Cre の EcoRI /XhoI サイトに
インサートすることで CEA-E1B-IRES-E1A ( CEA-E1 ) の配列を得た。この
CEA-E1 サイトを EagI-SpeI サイトでダイジェストし両端を blunting した後、コ
スミド pAxcw (Takara)の SwaI サイトにライゲーションし、コスミド
pAxcw/CEA-E1 が完成した。これら全ての目的遺伝子配列は、数種類の制限酵素
を用いた確認およびシークエンスによる確認を行った。
これら 3 種類のコスミドはそれぞれ Gigapack III Gold Packaging Extract
(Strategene)を用いてλパッケージングした後、competent E.coli ( Invitrogen )にト
ランスフォーメーションし 10cm ディッシュのアンピシリン添加 LB 寒天培地上
で培養した。目的インサート部分の遺伝子配列を Bright Star BioDitection Kit
32
II( Ambion, Texas, USA )で標識させ、コロニーハイブリダイゼーション法を用い
て目的のコスミドの入ったコロニーのみを拾い上げ、アンピシリン添加 LB Agar
液体培地を用いたコスミドの大量調整後 Plasmid Plus Midi Kit( Qiagen, Hilden,
Germany )を用いてコスミドの精製を行った。これらのコスミドはアデノウイル
スゲノム DNA-terminal protein complex (DNA-TPC)と共にリン酸カルシウム法を
用いて HEK293 にトランスフェクションすることでアデノウイルスを作製した。
細胞変性効果( Cytopathic effect; CPE ) を認め次第、それらを単離し凍結融解を 3
回繰り返したあと Adeno-X Purification Kit ( Takara ) を用いてウイルスのみを精
製し、これを一次ウイルスとした。この一次ウイルスを再度 HEK293 細胞に再
感染させ同様の手順で、二次ウイルスを精製した。この二次ウイルスを再々度
HEK293 細胞に感染させ 3 回の凍結融解を行った後、超遠心分離機を用いた塩化
セシウム法で精製した。すべてのアデノウイルス力価は plaque-forming unit (PFU)
assay で測定し、ウイルスの保存はサッカロースバッファー(10 mM Tris Buffer
ph7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 and 3% sucrose) を用い使用直前まで-80 度保
存を行うことでウイルスの安定化に努めた。実験に用いた三次ウイルス力価を
以下に示す。
①Ad/CEA-Cre
1.0×107 pfu/µl
②Ad/lox-CD::UPRT
1.0×107 pfu/µl
③Ad/CEA-E1
4.0×107 pfu/µl
33
6-4)アデノウイルスの正常細胞および腫瘍細胞に対する影響・効果
アデノウイルス自体による正常細胞に対する毒性を調べるため、ヒト繊維芽
細胞 Hs68 に対する制限増殖型アデノウイルス Ad/CEA-E1 の効果を検討した。
12-well プレートに 1105/well の Hs68 を播き、その 24 時間後の day0 に
Ad/CEA-E1 を 0,1,10,25 MOI の量で加え、day7 まで連日生存細胞の数をカウント
した。生存細胞は Tripan-Blue 染色を用いて判別し、血球計算版を用いてカウン
トした。実験は全て 3 回行った。
また、腫瘍細胞に対する Ad/CEA-E1 の抗腫瘍効果を測定するために、同様の
実験を MKN45 細胞で行った。
6-5） 至適ウイルス量の比率に関する検討
3 種類のウイルスを同時に用いる本治療において、標的細胞に対する最も効果
の高いウイルス量の比率を決定するために以下の検討を行った。12-well プレー
トに 1105/well となるようにヒト胃癌細胞株 MKN45 を播き、24 時間培養後に 3
種類のウイルスを下記のような様々な比率で感染させた。Oncolytic suicide gene
therapy が最大限の抗腫瘍効果を発揮するためには、CD::UPRT 蛋白の発現が最
大でなければならない。この蛋白の発現状況を視覚的に評価するために
CD::UPRT 遺伝子の代わりに GFP 遺伝子を導入した Ad/lox-GFP を新たに作製し
た。Ad/lox-CD::UPRT の代わりに Ad/lox-GFP と他の 2 種類のウイルスを加えた
3 種類の組み換えアデノウイルスを下記の様々な比率で感染させ、標的細胞
MKN45 での GFP 発現が最も高くなるウイルス比率を評価した。なお、総投与ウ
イルス量は 6-4)の結果に基づいた。
34
Ad/CEA-Cre : Ad/lox-GFP : Ad/CEA-E1 =
1)
1:
1 :
8
2)
1:
3 :
6
3)
1 : 4.5
4)
1:
6 :
3
5)
1:
8 :
1
6)
3:
1
6
7)
3 : 3.5
8)
3:
6 :
1
9)
5:
1 :
4
10)
5 : 2.5
11)
5:
12)
7 : 1.5
: 4.5
:
: 3.5
: 2.5
4 :
1
: 1.5
6-6) 至適 5-FC 量の検討
本実験に用いるプロドラッグ 5-FC の至適投与量を決定するために、以下の検
討を行った。12-well プレートに 1105/well となるようにヒト胃癌細胞株 MKN45
を播き、24 時間培養後に 6-4),6-5)で決定した総ウイルス量およびウイルス比率
で感染させた。5-FC を継続投与する際、400μM 以上の投与は正常細胞に影響を
及ぼすという報告 [47] から、5-FC 濃度をそれぞれ 0, 100, 200, 300, 400µM で添
加した medium (RPMI-1650) を作製し、それらを用いた Oncolytic suicide gene
therapy の抗腫瘍効果を検討した。
5-FC 添加 medium の交換は 24 時間毎に行った。
35
前述と同様に、Tripan-Blue 染色および血球計算版を用いて、day7 まで連日生存
細胞の数を用いてカウントし、実験は全て 3 回行った。
6-7) 腫瘍細胞における CEA-mRNA 発現状況の確認
本研究に用いる遺伝子治療 Oncolytic suicide gene therapy は CEA プロモーター
を用いることにより CEA 産生細胞株のみを標的とする治療である。そのため、
本研究で用いるすべての細胞株における CEA-mRNA 発現状況を RT-PCR 法を
用いて確認した。上記細胞を 6-well プレートにコンフルエント状態になるまで
増殖させ、セルスクレイパーを用いて回収した後、Fast Pure RNA Kit ( Takara )
を用いて total RNA を抽出した。そのうち 5µg の total RNA を用い oligo-dT primer,
SuperScript III ( Invitrogen )、および下記 primer を用いて CEA 遺伝子の 251bp の
領域の逆転写反応を行った。
(Forward)
5’-,GAC,GCA,AGA,GCC,TAT,GTA TG
(Reverse)
5’-,GGC,ATA,GGT,CCC,GTT,ATT,A
PCR 反応については、GoTaq (Promega, Madison, WI, USA)
を用いて、3 分間,94
度の initial denaturing に引き続き 25 回の増幅反応（94 度 30 秒、55 度 30 秒、72
度 30 秒）を行った。エチジウムブロマイドを加えた 1.2%アガロースゲルを用い
た電気泳動を行い、増幅産物を確認した。なお、同じサンプルにおける
GAPDH-mRNA についても以下のプライマーを用いた同様の RT-PCR 反応および
電気泳動を行い評価した。
36
(Forward)
5’-TGA, CCA, CAG, TCC, ATG, CCA, TC
(Reverse)
5’-CCA, CCC, TGT, TGC, TGT, AGC, C.
6-8) Oncolytic suicide gene therapy の治療効果と安全性(in vitro)
Oncolytic suicide gene therapy の抗腫瘍効果および安全性を評価するために、腫
瘍細胞株としてヒト胃癌細胞株 AGS, MKN1, MKN45、およびヒト膵癌細胞株
Capan2, Hs700T, AsPC1 を、正常細胞株としてヒト繊維芽細胞株 Hs68 を用いた。
MKN45 以外の細胞においては Oncolytic suicide gene therapy と No-treated group
の 2 つの比較を行い、MKN45 細胞においては Oncolytic suicide gene therapy,
Suicide gene therapy, No-treated group の 3 つの比較を行った。
全ての細胞を 12-well
プレートに 1105/well となるように播き、24 時間培養後に以下のような条件で
治療を行った。なお、遺伝子治療群の総ウイルス量は 6-4)の結果に基づき、
Oncolytic suicide gene therapy 群のウイルス比率は 6-5)に基づいた。Suicide gene
therapy 群のウイスル比率に関しては過去の文献[48, 49]より Ad/CEA-Cre :
Ad/CD::UPRT = 1 : 1 とした。ウイルス添加の 24 時間後から 6-6)に基づく至適
5-FC 添加 medium を各遺伝子治療群に加え治療を行った（図 15）。前述と同様に
5-FC 添加 medium の交換は 24 時間毎に行い、Tripan-Blue 染色および血球計算版
を用いて day7 まで連日生存細胞の数を用いてカウントし、実験は全て 3 回行っ
た。
37
図 15
図 15. in vitro における Oncolytic suicide gene therapy 加療計画
6-9) Oncolytic suicide gene therapy の治療効果と安全性 (in vivo)
従来の遺伝子治療である Suicide gene therapy と比べて Oncolytic suicide gene
therapy が抗腫瘍効果を保ちながらウイルス量を減量することが可能となるかど
うかを検討するために、Suicide gene therapy とその 10 分の 1 ウイルス量の
Oncolytic suicide gene therapy を比較した（図 14）。さらに副作用についても検討
を行うために No-treated group を含めた 3 群で比較した。総ウイルス投与量に関
してはこれまでの報告 [48,50] に基づき Suicide gene therapy を 1109 pfu/マウス
で、Oncolytic suicide gene therapy についてはその 10 分の 1 量である 1108 pfu/
マウスで行い比較することにした。ウイルス量の比率については 6-5) の結果に
基づいた。生後 6 週のヌードマウス(female, BALB/c nu/nu , CLEA, Tokyo, Japan)
を各群 4 匹ずつ用い、day0 にヌードマウスの腹腔内に MKN45-GFP 細胞 1107
38
個 /マウス注入し胃癌腹膜播腫モデルを作製した。これまでと同様の Suicide
gene therapy の報告 [48-50] に基づき、day10 にウイルスの腹腔内投与を行い
day11 から day20 にかけて連日 1 回/day 5-FC 500mg/kg/day の腹腔内投与を行った。
No-treated group についてはウイルスの代わりにウイルス保存液であるサッカロ
ースバッファーを、5-FC の代わりに PBS の投与を行った。すべての腹腔内投与
は 26G 注射針および 1ml シリンジ( Terumo, Tokyo, Japan )を用いて行った。day28
にイソフルラン麻酔下に採血を行った後、頸椎脱臼によって安楽死させ所見を
観察した（図 16）。
図 16
図 16. in vivo における Oncolytic suicide gene therapy 加療計画
39
抗腫瘍効果の判定は MKN45-GFP 発色面積の定量化と血清 CEA 値で評価を行
った。腫瘍の定量化には、まず開腹したマウスの腸管膜を展開し蛍光実体顕微
鏡を用いて撮影した。その画像を Computer-assisted image analysis (VH Analyzer,
KEYENCE CO.,Osaka, Japan) に取り込み、画像上の GFP 発色部分の割合を算出
し定量化した。副作用評価においては、day28 の血液サンプルを用いてヘモグラ
ム、肝機能 ( T-Bil, ALT, AST ) および腎機能 ( BUN, Crea)の評価を行った。肝臓
については、HE 染色による病理組織学的評価も同時に行った。
統計学的解析は Stat View ( SAS, Washington, USA )を用いて行った。2 群間の検
定には Student’s t-test を用いて解析を行い、P<0.05 を有意差ありと判定した。
40
7. 実験結果
7-1) 至適アデノウイルス投与量の決定(in vitro)
アデノウイルス自体の正常細胞への影響を評価するために、様々な濃度の
Ad/CEA-E1 をヒト繊維芽細胞株 Hs68 加えた場合の生存細胞数の結果を以下に示
す（図 17）。
図 17
図 17. Ad/CEA-E1 のヒト繊維芽細胞株 Hs68 に対する影響
上図より、0, 1, 10MOI 投与群においてはいずれも同じように day3 付近でコンフ
ルエント状況に至り、以後 day7 まで生存細胞数の減少は認められなかった。従
ってこれらのウイルス量では正常細胞に対する毒性はないものと考えられる。
41
一方、25MOI 投与群では day6-7 にかけて生存細胞数の減少傾向が見られた。こ
の結果から、遺伝子治療本来の目的である遺伝子導入による治療効果のみを判
定するために、in vitro におけるアデノウイルスの総投与量は 10MOI にすること
とした。
7-2) 制限増殖型アデノウイルス Ad/CEA-E1 単独の抗腫瘍効果 (in vitro)
ヒト胃癌細胞株 MKN45 に対する制限増殖型アデノウイルス Ad/CEA-E1 単独
での CEA 高産生株である MKN45 に対する抗腫瘍効果を下図に示す（図 18）。
図 18
図 18. Ad/CEA-E1 のヒト胃癌細胞株 MKN45 に対する抗腫瘍効果
42
Ad/CEA-E1 は 1-25MOI までウイルス量依存的に抗腫瘍効果を認めた。また、7-1)
の結果で正常細胞 Hs68 に対して毒性を示さかった 10MOI のウイルス量でも十
分な抗腫瘍効果を認めた。また、0-10MOI の濃度であれば、day4 までには
Ad/CEA-E1 の抗腫瘍効果は発現しないことも判明した。
7-3) 至適ウイルス比率の決定 (in vitro)
本研究で用いる 3 種類の遺伝子組み換えアデノウイルスの最も抗腫瘍効果を
認めウイルス比率を決定するために、上記 7-1), 7-2)の結果から総ウイルス量
10MOI とし、様々なウイルス比率で治療した結果を図 19 に示す。なお、7-2)の
結果から Ad/CEA-E1 遺伝子の抗腫瘍効果の発現は day5 以降であり、day4 まで
に CD::UPRT 遺伝子（代わりに GFP 遺伝子）が高発現している比率が Oncolytic
suicide gene therapy の治療効果を最大限に発揮できる設定と考えられる。
43
図 19
図 19. 各種ウイルス比率で行った Oncoltic suicide gene therapy における GFP 遺伝子発現の検討
CD::UPRT 遺伝子の代わりに GFP 遺伝子を導入した遺伝子組み換えアデノウイルス Ad/lox-GFP
を用いることで目的の CD::UPRT 遺伝子発現効率を評価した。
上図によると、どの投与群も経時的に GFP 蛋白が発現している。最も判定しや
すい day4 では、Ad/CEA-Cre : Ad/lox-GFP : Ad/CEA-E1 =5MOI ： 2.5MOI
:5
MOI の場合に最も GFP 蛋白を発現していることが分かる。以上より Oncolytic
suicide gene therapy は Ad/CEA-Cre : Ad/lox-CD::UPRT : Ad/CEA-E1 =5：2.5 : 5 の
ウイルス比率が最も抗腫瘍効果が期待できる条件であると考えられた。
44
7-4) 至適 5-FC 量の決定 (in vitro)
各種 5-FC 条件下 Oncolytic suicide gene therapy の MKN-45 に対する抗腫瘍効果
の結果を下図に示す（図 20）。
図 20
図 20. 各種 5-FC 量で行った Oncoltic suicide gene therapy の MKN45 に対する抗腫瘍効果
5-FC 濃度が高いほどより高い抗腫瘍効果が得られたが、特に 200µM と 300µM
の間に有意差をもって抗腫瘍効果の差異がみられ、300µM と 400µM の抗腫瘍効
果はほぼ同等であることが判明した。以上の結果より、in vitro での 5-FC 投与濃
度は 300µM とすることにした。
45
7-5) RT-PCR による各種細胞の CEA-mRNA 発現状況
本研究で用いた全ての細胞株における CEA-mRNA 発現状況を以下に示す。
図 21
図 21. 各種細胞株における CEA-mRNA 発現状況
ヒト繊維芽細胞株 Hs68、ヒト胃癌細胞株 MKN1、ヒト膵癌 AsPC-1 においては
CEA-mRNA の発現は認められず、残りのヒト胃癌細胞株 MKN45, AGS、ヒト膵
癌 AsPC-1, Hs700T はそれぞれ CEA 高産生細胞株であることが確認された。
7-6) Oncolytic suicide gene therapy の抗腫瘍効果 (in vitro)
上記実験結果により CEA をほとんど発現しない細胞株であるヒト繊維芽細胞
株 Hs68、ヒト胃癌細胞株 MKN1、ヒト膵癌細胞株 AsPC-1 における Oncolytic
suicide gene therapy の抗腫瘍効果を下図に示す（図 22）。いずれの細胞に対して
もウイルス総量 10MOI ( Ad/CEA-Cre : Ad/lox-CD::UPRT : Ad/CEA-E1 =5MOI ：
2.5MOI
: 5 MOI ) 、5-FC 400µM で治療を行った。
46
図 22
図 22. CEA 非産生細胞株における Oncolytic suicide gene therapy の効果
Hs68 の実験結果より、Oncolytic suicide gene therapy は正常細胞の増殖に影響を
及ぼさないことを確認した。また、CEA 非産生細胞株である MKN1, AsPC-1 に
おいても全く抗腫瘍効果を認めなかった。
一方、CEA 高産生株であるヒト胃癌細胞株 MKN45, AGS、ヒト膵癌細胞株
Hs700T における Oncolytic suicide gene therapy の抗腫瘍効果を下図に示す（図 23）。
47
図 23
図 23. CEA 高産生細胞株における Oncolytic suicide gene therapy の効果
CEA 高産生株である AGS, Capan-2, Hs700T, MKN45 においては高い抗腫瘍効果
を認めた。
48
以上より、本研究の Oncolytic suicide gene therapy は CEA 産生細胞特異的な治
療であることを確認した。さらにヒト胃癌細胞株 MKN45 細胞においては
Oncolytic suicide gene therapy と Suicide gene therapy を同じウイルス量および同じ
5-FC 量で比較を行い、同条件下において Oncolytic suicide gene therapy の方が従
来の Suicide gene therapy よりも高い抗腫瘍効果を得られることが分かった（図
23）。
7-7) Oncolytic suicide gene therapy と Suicide gene therapy の比較 (in vivo)
本研究では、従来の遺伝子治療である Suicide gene therapy と比べて Oncolytic
suicide gene therapy が抗腫瘍効果を保ちながらウイルス量を減量することが可能
となるかどうかを検討するために、Suicide gene therapy とその 10 分の 1 ウイル
ス量の Oncolytic suicide gene therapy を in vivo で比較した。day28 におけるそれぞ
れの群の蛍光実体顕微鏡下で撮影した開腹写真を下図に示す（図 24）。
49
図 24
図 24. 各治療群マウスの day28 開腹所見
day28 のマウスを開腹し小腸腸管膜を展開し、小腸腸管膜の MKN45-GFP 腫瘍細胞結節を蛍光実
体顕微鏡を用いてを発色させて撮影を行った。黄色矢印で示した部分はウイルス治療により変性
した腫瘍細胞と思われ、同部位には GFP 発色を認めない。
day28 のマウスの開腹所見では、蛍光実体顕微鏡によって MKN45-GFP 腫瘍結節
が緑色発色結節として容易に視認できる。無治療群に比べて 2 つの遺伝子治療
群の GFP 発色を呈する viable な腫瘍結節は明らかに少ないことが確認できる。
また、図中の黄色矢印で示した部分は腸管膜上の綿花様結節であり同部位に
GFP 発色を認めなかった。このような結節は遺伝子治療群マウスの腸管膜に散
50
在性に見られ、治療によって変性した viability の無い腫瘍結節と推測される（図
24 黄色矢印）。
さらに、Computer-assisted image analysis による腫瘍部分の定量結果を下図に示
す（図 25）。
図 25
図 25. Computer-assisted image analysis による腫瘍部分の定量結果
*, 統計学的有意差あり（<.0.05)
腫瘍部分の定量結果から、2 つの遺伝子治療群は無治療群と比べて有意に腫瘍量
の減少を認めた（P<0.05）。また、Suicide gene therapy と、その 10 分の 1 ウイル
ス量の Oncolytic suicide gene therapy はほぼ同等の抗腫瘍効果を認めた。
day28 に採取した血清サンプルの血清 CEA 値を下に示す（表 5）。
51
表5
表 5. day28 における各治療群の血清 CEA 値
*, 両者間に統計学的有意差あり（<.0.05)
血清 CEA 値においても Computer-assisted image analysis 定量結果と同様に、2 つ
の遺伝子治療群は無治療群と比べて有意に抗腫瘍効果を認め（P<0.05）、Suicide
gene therapy とその 10 分の 1 ウイルス量の Oncolytic suicide gene therapy はほぼ同
等の抗腫瘍効果であった。
副作用については、day28 に採取した血液サンプルから下表の結果を得た（表
6）。
52
表7
表 7. day28 における各治療群の血液検査結果
上記に示す様に、3 群とも全ての項目において統計学的有意差を認めず、いずれ
の遺伝子治療も大きな副作用を認めなかった。肝障害の評価でも、Suicide gene
therapy に比べて Oncolytic suicide gene therapy の方がより肝障害が軽度な傾向を
認めたが、検査値のばらつきも大きく両群間に統計学的有意差は認めていない
（表 7）
。マウスにおけるアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の副作用
として肝障害が重要であり、これまでにもマウス肝の病理所見で門脈周囲の限
局性壊死が多く報告されている[36,37,50]。本研究においても同様に全てのマウ
スの肝 HE 標本を作製し、門脈周囲を注意深く観察した（図 26）。
53
図 26
図 26. 典型的な門脈周囲の壊死性変化（左;文献 36 より引用,×40)
本研究における遺伝子治療群マウス肝 HE 標本(右, ×40)
その結果、上図のように本研究における遺伝子治療群において門脈周囲の壊死
性変化は認められなかった。
54
8. 考察
本研究ではアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の臨床応用へむけて
その容量依存性の毒性の軽減に着目した。これまでの臨床試験においてアデノ
ウイルスの導入により容量依存的に風邪様症状の出現、リンパ球減少、トラン
スアミラーゼの上昇等が報告されている[51]。 最近の腫瘍選択的融解性アデノ
ウイルス dl1520/Onyx-015 を用いた CG7870 という臨床試験[52]でも、低血圧、
血小板減少、トランスアミラーゼの上昇などの有害事象がアデノウイルスベク
ターの容量に依存して出現したと報告されている。これらのアデノウイルスベ
クターによる有害事象の発生機序については未だ充分に解明されていないが、
容量依存性の毒性に関しては免疫反応の活性化との関係も指摘されている
[53-62]。これまでより安全な遺伝子治療法の開発のためにアデノウイルスベク
ターの改良が行われ、その多くは腫瘍細胞特異的な感染能力を挙げることに重
点が置かれてきた[63-65]。本研究では抗腫瘍効果を保ったままアデノウイルス
の投与量の減量を行うことに焦点を絞り、新たな 3 種類のウイルスを用いた
Oncolytic suicide gene therapy という遺伝子治療システム考案し、その有用性を確
認した。この Oncolytic suicide gene therapy の有用性は以下の工夫と特徴によって
もたらされたと考えられる。
まず第一に Suicide gene therapy システムで重要な 5-FC から 5-FU への変換酵
素として従来の CD 遺伝子の代わりに新しく CD::UPRT 遺伝子を用いたことで
ある。この遺伝子による 5-FdUMP への変換効率は CD 遺伝子単独の場合の約
100 倍に達すると報告されている[66]。これを用いることで、アデノウイルス投
与量を減量させることでロドラッグ変換酵素の量が減少したとしても 5-FC から
5-FdUMP への高い変換効率が維持できると考えられる。
55
第二点目は、これま
での Suicide gene therapy にさらに制限増殖型アデノウイルス Ad/CEA-E1 を加え
た点である。これまで用いられてきた第一世代の非増殖型アデノウイルスは、
その安全性を保つために、ウイルス増殖のために不可欠な E1A, E1B 遺伝子を欠
失している。本研究で作製した Ad/CEA-E1 は CEA 産生細胞でのみ E1A,E1B 蛋
白を発現することにより自己複製できるように設計した。これにより、
Ad/CEA-E1 が CEA 産生細胞に感染するとこのウイルスが無数に増殖し、細胞融
解を導く。さらに、この細胞に Ad/CEA-Cre と Ad/lox-CD::UPRT が感染していれ
ば、これらのアデノウイルスも Ad/CEA-E1 が作り出す E1A,E1B 蛋白を利用して
無数に増殖することが可能となり、Cre の存在下で発現する CD::UPRT 蛋白量も
増加し、CD::UPRT/5-FC システムによる抗腫瘍効果がより効率的に発揮される
こととなる。第三点目として、本システムの bystander effect（バイスタンダー効
果）が挙げられる。この効果は別の Suicide gene therapy システムである HSV-TK
遺伝子/GCV（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ/ガンシクロビル）におい
て報告されている[67-71]。そのストラテジーは、HSV-TK 遺伝子を癌細胞に導入
した後プロドラッグとして GCV を体内に投与すると、投与された GCV は
HSV-TK 遺伝子が作りだす HSV-TK によってリン酸化され細胞傷害性を発揮す
る。このシステムでは隣接細胞にコネキシンを介して HSV-TK 蛋白が輸送され、
直接 HSV-TK 遺伝子が導入されなかった細胞にも細胞傷害性を発揮できるとい
う bystander effect を有している。これに比べ本研究のシステムでは 3 種類のウイ
ルスが同時感染した細胞内では全てのウイルスが無数に増殖し、細胞融解を来
しながら隣接する癌細胞へ感染が拡大するという細胞間接着分子によらない、
より強力な bystandard effect を発揮することが推測される[72]。これらの工夫と
特徴により、Suicide gene therapy と Oncolytic gene therapy の相乗効果が発揮され、
少ないウイルス投与量でも抗腫瘍効果が得られたものと考えられる。
56
今回の研究において Oncolytic suicide gene therapy を用いることで副作用が軽
減する傾向は認められたものの、当初期待された有意な結果には至らなかった。
今回検討した全ての副作用検討項目において、No-treated group, Suicide gene
therapy, Oncolytic suicide gene therapy のどの群間にも有意な差を認めなかった。
特に肝障害は、マウスにおけるアデノウイルスベクターを用いた Suicide gene
therapy で一般的に認められやすい障害である。元来肝臓はアデノウイルスに対
する親和性が高い臓器であり、特にマウス肝はヒト肝に比べて
Coxsakie-adenovirus receptor (CAR) の発現が高いため、アデノウイルスは感染し
やすい[73]。腹腔内投与されたアデノウイルスおよびプロドラッグは経門脈的に
肝へ到達し、主に門脈周囲の肝細胞へ感染する。さらに同様の経路でこれら肝
細胞にプロドラッグが取り込まれることで Suicide gene therapy の細胞傷害性が
発揮され、肝障害の副作用が生じると考えられる。本研究では、いずれの遺伝
子治療群も CEA 特異的に CD::UPRT 遺伝子が発現するように設計した結果、ア
デノウイルスが肝細胞に感染しても CD::UPRT 蛋白が発現せず、5-FC が 5-FU に
変換されることによる肝障害を免れたため、軽微な副作用結果になったと考え
られる。さらに、今回の実験で用いたアデノウイルス量は 109, 108 pfu/mouse と
いう量であり、この程度のアデノウイルス容量では両者に明らかな差が出現し
ないということも考えられる。Lan KH らは CD/5-FC システムを用いたアデノウ
イルスベクターによる Suicide gene therapy の胃癌腹膜播腫モデルに対する遺伝
子治療を行い、その肝障害について詳細に報告している[36]。その中で、ALT 値
と肝病理組織学的評価による肝障害の検討を行った結果、109, 108 pfu/mouse とい
うアデノウイルス量では両者にさほど大きな差が実際に認められていない。ま
た、副作用に関する血液検査所見において、特に遺伝子治療群で AST 値と ALT
値にばらつきが大きい傾向が見られた。本研究での肝病理組織標本を詳細に検
57
討した結果、下図のように好中球浸潤と肥厚した胆管を認める症例を散見した
（図 27）。
図 27
図 27. 遺伝子治療群における好中球浸潤を伴う肥厚した胆管壁(×100)
マウス腹膜播腫モデルを観察すると、肝門部に腫瘍塊を形成しているものが多
く存在し、腫瘍細胞が胆管へ浸潤した結果、限局性に閉塞性胆管炎を併発した
マウスが存在したのではないかと推測される。このような胆管炎とアデノウイ
ルス感染による肝障害が相まって、特に遺伝子治療群における血清 AST, ALT 値
のばらつきが生じたのではないかと考えられる。
一般的にアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、アデノウイルスの
容量依存性の副作用が存在する。抗腫瘍効果を保ちながら投与ウイルス量が減
量できるという本研究のアプローチは、アデノウイルス以外のベクターにも応
用できる可能性があり、今後の遺伝子治療の発展に有用であると考えられる。
58
このような工夫を積み重ねることで難治性である胃癌腹膜播腫に対する遺伝子
治療のより安全な臨床応用が期待されるが、本研究結果を臨床応用するために
は問題点がいくつか存在する。一つはアデノウイルスというベクターが最良の
選択であるかという点である。前述のように、導入効率、感染効率は現在使わ
れているベクターの中では最良であるが、例え使用するウイルス量を減らし、
副作用を軽減させることができたとしても、免疫を獲得した宿主に対しては 2
回目以降の治療効果は上がらないであろうことが容易に想像できる。即ち、効
果があるとしても初回投与だけにとどまるのではないかという懸念である。こ
れらにおいては、現在アデノウイルスベクター自体の更なる改良が進行中であ
り、免疫反応の制御が可能なベクターが実現化しつつある。第二に、効果のあ
る治療法であったとしても、現在行われている化学療法と同等以上の効果が期
待できるのか、また、治療の選択肢としてどの段階で使用すべきかという点で
ある。これらは臨床試験を通して解明されるべき問題であるが、ウイルス導入
という手法が長期的にどのような影響を人体に及ぼすかが不明な状況において
現段階では、従来の治療法が効かなくなった場合にのみ試みられるべき治療法
と考えられる。今後のトランスレーショナルリサーチに期待したい。
59
9. 結論
これまでのアデノウイルスベクターによる遺伝子治療システムを組み合わせ
た Oncolytic suicide gene therapy は、従来法に比べて抗腫瘍効果を保ちながらウイ
ルス量を減量させることが可能である。ウイルス投与量の減量というアプロー
チは今後の遺伝子治療の発展に有用であると考えられる。
60
10. 引用文献
1. Parkin DM, Ferlay J, Pisani P, et al. Global cancer statistics,2002. CA Cancer J Clin
2005; 74: 74-108
2. Muñoz N, Franceschi S. Epidemiology of gastric cancer and perspectives for
prevention. Salud Publica Mex. 1997; 39: 318-30
3. Kamangar F, Dores GM, Anderson WF. Patterns of cancer incidence, mortality, and
prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in
different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 2006; 24: 2137-50.
4. 厚生労働省平成 18 年人口動態統計
http://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/jinkou/geppo/nengai06/kekka3.html
5. 日本胃癌学会編：胃癌取扱規約, 第 13 版, 金原出版, 東京, 1999
6. 中島聰總, 山口俊晴. 癌研胃癌データベース 将来展望のためのデータマイ
ニング. 金原出版, 東京, 2006
7. Maehara Y, Hasuda S, Sugimachi K. et al. Postoperative outcome and sites of
recurrence in patients following curative resection of gastric cancer. Br J Surg.
2000;87:353–7
8. Yoo CH, Noh SH, Min JS, et al. Recurrence following curative resection for gastric
carcinoma. Br J Surg 2000;87:236–42
9. Koizumi W, Narahara H, Takeuchi M, et al. S-1 plus cisplatin versus S-1 alone for
first-line treatment of advanced gastric cancer (SPIRITS trial): a phase III trial.
Lancet Oncol. 2008; 9: 215-21.
10. Macdonald JS, Schein PS, Woolley PV, et al. 5-fluorouracil, doxorubicin and
mitomycin (FAM) combination chemotherapy for advanced gastric cancer. Ann
Intern Med 1980; 93: 533–36.
11. Vanhoefer U, Rougier P, Wilke H, et al. Final results of a randomized phase III trial
of sequential high-dose methotrexate, fluorouracil, and doxorubicin versus
etoposide, leucovorin, and fluorouracil versus infusional fl uorouracil and cisplatin
in advanced
12. gastric cancer: A trial of the European Organization for Research and Treatment of
Cancer Gastrointestinal Tract Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2000; 18:
2648–57.
13. Ohtsu A, Shimada Y, Shirao K, et al. Randomized phase III trial of fluorouracil
alone versus fl uorouracil plus cisplatin versus uracil and tegafur plus mitomycin in
61
patients with unresectable, advanced gastric cancer: The Japan Clinical Oncology
Group Study (JCOG9205). J Clin Oncol 2003; 21: 54–59.
14. Preusser P, Wilke H, Achterrath W, et al. Phase II study with the combination
etoposide, doxorubicin, and cisplatin in advanced measurable gastric cancer. J Clin
Oncol 1989; 7: 1310–17.
15. Wilke H, Preusser P, Fink U, et al. High dose folinic acid/etoposide/5-fl uorouracil
in advanced gastric cancer—a phase II study in elderly patients or patients with
cardiac risk. Invest New Drugs 1990; 8: 65–70.
16. Findlay M, Cunningham D, Norman A, et al. A phase II study in advanced
gastro-esophageal cancer using epirubicin and cisplatin in combination with
continuous infusion 5-fl uorouracil (ECF). Ann Oncol 1994; 5: 609–16.
17. Cutsem EV, Moiseyenko VM, Tjulandin S, et al. Phase III study of docetaxel and
cisplatin plus fl uorouracil compared with cisplatin and fl uorouracil as fi rst-line
therapy for advanced gastric cancer: a report of the V325 Study Group. J Clin Oncol
2006; 24: 4991–97.
18. Cunningham D, Starling N, Rao S, et al. Capecitabine and Oxaliplatin for Advanced
Esophagogastric Cancer. N Engl J Med 2008; 358: 36–46.
19. Yonemura Y, Bandou E, Sasaki T, et al. Quantitative prognostic indicators of
peritoneal dissemination of gastric cancer. Eur J Surg Oncol 2006; 32: 602-6.
20. Sugarbaker PH, Yonemura Y. Clinical pathway for the management of resectable
gastric cancer with peritoneal seeding. Oncology 2000; 58: 96-107
21. Yu W, Whang I, Sugarbaker PH, et al. Prospective randomized trial of early
postoperative intraperitoneal chemotherapy as an adjuvant to resectable gastric
cancer. Ann Surg 1998; 228: 347–54.
22. Nakajima T, Nishi M, Kajitani T. Improvement in treatment results of gastric cancer
with surgery and chemotherapy: experience of 9,700 cases in the Cancer Institute
Hospital, Tokyo. Semin Surg Oncol 1991; 7: 365–72.
23. Shimada K, Ajani JA. Adjuvant therapy for gastric carcinoma patients in the past 15
years: a review of western and oriental trials. Cancer 1999; 86: 1657–68.
24. Noh SH, Yoo CH, Min JS, et al. Early postoperative intraperitoneal chemotherapy
with mitomycin C, 5-fluorouracil and cisplatin for advanced gastric cancer.
Oncology. 2001; 60: 24-30.
25. Fujimura T, Yonemura Y, Shibata K, et al. Subtotal peritonectomy with
chemohyperthermic peritoneal perfusion for peritonitis carcinomatosa in
gastrointestinal cancer. Oncol Rep 2000; 7: 809–14.
26. Glehen O, Mohamed F, Gilly FN. Peritoneal carcinomatosis from digestive tract
62
cancer: new management by cytoreductive surgery and intraperitoneal
chemohyperthermia. Lancet Oncol 2004; 5: 219–28.
27. HC Jeung, SY Rha , HC Chung, et al. Treatment of advanced gastric cancer by
palliative gastrectomy, cytoreductive therapy and postoperative intraperitoneal
chemotherapy. Br J Surg 2002; 89: 460-6.
28. Rosenberg SA, Aebersold P, Topalian SL, et al. Gene transfer into humans
immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating
lymphocytes modified by retroviral gene transduction. N Engl J Med. 1990 30; 323:
570-8.
29. Blaese RM, Culver KW, Anderson WF,et al. T lymphocyte-directed gene therapy
for ADA- SCID: initial trial results after 4 years. Science. 1995 20; 270: 475-80.
30. http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/
31. Raper SE, Chirmule N, Batshaw ML, et al. Fatal systemic inflammatory response
syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral
gene transfer. Mol Genet Metab. 2003; 80: 148-58.
32. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Cavazzana-Calvo M, et al. LMO2-associated
clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science.
2003; 302: 415-9
33. Nakai H, Montini E, Kay MA, et al. AAV serotype 2 vectors preferentially integrate
into active genes in mice. Nat Genet. 2003; 34: 297-302.
34. Zhang WW. Development and application of adenoviral vectors for gene therapy of
cancer. Cancer Gene Ther. 1999; 6: 113-38.
35. 水口裕之 アデノウイルスベクター開発の最前線. バイオテクノロジージャ
ーナル. 2007 vol.2 No,2 168-173
36. Lan KH, Kanai F, Omata M, et al. In vivo selective gene expression and therapy
mediated by adenoviral vectors for human carcinoembryonic antigen-producing
gastric carcinoma. Cancer Res 1997; 57: 4279-84.
37. Heise CC, Williams AM, Kirn DH, et al. Intravenous administration of ONYX-015,
a selectively replicating adenovirus, induces antitumoral efficacy. Cancer Res. 1999
Jun 1;59(11):2623-8.
38. Tiraby M, Cazaux C, Tiraby G, et al. Concomitant expression of E. coli cytosine
deaminase and uracil phosphoribosyltransferase improves the cytotoxicity of
5-fluorocytosine. FEMS Microbiol Lett. 1998; 167: 41-9.
39. 谷憲三朗、浅野茂隆、齊藤泉ら. 遺伝子治療の新展開-ベクター開発と臨床応
用の最前線. 羊土社. 2001
63
40. Takei Y, Saga Y, Suzuki M, et al. Overexpression of PTEN in ovarian cancer cells
suppresses i.p. dissemination and extends survival in mice. Mol Cancer Ther 2008;
7: 704-11.
41. Fu X, Tao L, Zhang X. An oncolytic virus derived from type 2 herpes simplex virus
has potent therapeutic effect against metastatic ovarian cancer. Cancer Gene Ther
2007; 14: 480-7.
42. Yu HK, Ahn JH, Kim JS, et al. Expression of human apolipoprotein(a) kringles in
colon cancer cells suppresses angiogenesis-dependent tumor growth and peritoneal
dissemination. J Gene Med 2005 ;7: 39-49.
43. Miura Y, Ohnami S, Aoki K, et al. Intraperitoneal injection of adenovirus expressing
antisense K-ras RNA suppresses peritoneal dissemination of hamster syngeneic
pancreatic cancer without systemic toxicity. Cancer Lett 2005; 218: 53-62.
44. Tanaka F, Tominaga K, Arakawa T, et al. Interleukin-10 gene transfer to peritoneal
mesothelial cells suppresses peritoneal dissemination of gastric cancer cells due to a
persistently high concentration in the peritoneal cavity. Cancer Gene Ther 2008; 15:
51-9.
45. Miyagi M, Aoyagi K, Shirouzu K, et al. The TIMP-1 gene transferred through
adenovirus mediation shows a suppressive effect on peritoneal metastases from
gastric cancer. Int J Clin Oncol. 2007; 12: 17-24.
46. Tsunemitsu Y, Kagawa S, Fujiwara T, et al. Molecular therapy for peritoneal
dissemination of xenotransplanted human MKN-45 gastric cancer cells with
adenovirus mediated Bax gene transfer. Gut. 2004; 53: 554-60.
47. Vermes A, Guchelaar HJ, Dankert J. Flucytosine: a review of its pharmacology,
clinical indications, pharmacokinetics, toxicity and drug interactions. J Antimicrob
Chemother. 2000 Aug;46(2):171-9.
48. Ueda K, Iwahashi M, Tanimura H, et al. Carcinoembryonic antigen-specific suicide
gene therapy of cytosine deaminase/5-fluorocytosine enhanced by the Cre/loxP
system in the orthotopic gastric carcinoma model. Cancer Res 2001; 61: 6158-62.
49. Kijima T, Osaki T, Kishimoto T, et al. Application of the Cre recombinase/loxP
system further enhances antitumor effects in cell type-specific gene therapy against
carcinoembryonic antigen-producing cancer. Cancer Res 1999; 59: 4906-11.
50. Goto H, Osaki T, Hayashi S, et al. Gene therapy utilizing the Cre/loxP system
selectively suppresses tumor growth of disseminated carcinoembryonic
antigen-producing cancer cells. Int J Cancer 2001; 94: 414-9
51. Reid T, Warren R, Kirn D. Intravascular adenoviral agents in cancer patients:
lessons from clinical trials. Cancer Gene Ther 2002; 9: 979-86
64
52. Small EJ, Carducci MA, Wilding G, et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a
replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the
treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther 2006; 14:
107-17.
53. Juillard V, Villefroy P, Guillet JG, et al. Long-term humoral and cellular immunity
induced by a single immunization with replication-defective adenovirus
recombinant vector. Eur J Immunol. 1995; 25: 3467-73
54. Yang Y, Li Q, Wilson JM, et al. Cellular and humoral immune responses to viral
antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant
adenoviruses. J Virol. 1995; 69: 2004-15.
55. Adesanya MR, Redman RS, O'Connell BC, et al. Immediate inflammatory
responses to adenovirus-mediated gene transfer in rat salivary glands. Hum Gene
Ther. 1996; 7: 1085-93.
56. Worgall S, Wolff G, Crystal RG, et al. Innate immune mechanisms dominate
elimination of adenoviral vectors following in vivo administration. Hum Gene Ther.
1997; 8: 37-44.
57. Jooss K, Ertl HC, Wilson JM. Cytotoxic T-lymphocyte target proteins and their
major histocompatibility complex class I restriction in response to adenovirus
vectors delivered to mouse liver. J Virol. 1998; 72: 2945-54.
58. Otake K, Ennist DL, Trapnell BC, et al. Nonspecific inflammation inhibits
adenovirus-mediated pulmonary gene transfer and expression independent of
specific acquired immune responses. Hum Gene Ther. 1998;9: 2207-22.
59. Muruve DA, Barnes MJ, Libermann TA, et al. Adenoviral gene therapy leads to
rapid induction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic
injury in vivo. Hum Gene Ther. 1999; 10: 965-76.
60. Nunes FA, Furth EE, Raper SE, et al. Gene transfer into the liver of nonhuman
primates with E1-deleted recombinant adenoviral vectors: safety of readministration.
Hum Gene Ther. 1999; 10: 2515-26.
61. Driesse MJ, Esandi MC, Sillevis Smitt PA, et al. Intra-CSF administered
recombinant adenovirus causes an immune response-mediated toxicity. Gene Ther.
2000; 7: 1401-9.
62. Thomas CE, Birkett D, Lowenstein PR, et al. Acute direct adenoviral vector
cytotoxicity and chronic, but not acute, inflammatory responses correlate with
decreased vector-mediated transgene expression in the brain. Mol Ther. 2001; 3:
36-46.
65
63. Tanaka T, Huang J, Hamada H, et al. Carcinoembryonic antigen-targeted selective
gene therapy for gastric cancer through FZ33 fiber-modified adenovirus vectors.
Clin Cancer Res 2006; 12: 3803-13.
64. Akbulut H, Zhang L, Deisseroth A, et al. Cytotoxic effect of replication-competent
adenoviral vectors carrying L-plastin promoter regulated E1A and cytosine
deaminase genes in cancers of the breast, ovary and colon. Cancer Gene Ther 2003;
10: 388-95.
65. Yamamoto M, Davydova J, Curiel DT, et al. Sectivity enhanced, cyclooxygenase-2
promoter-based conditionally replicative adenovirus for pancreatic cancer.
Gastroenterology 2003; 125: 1203-18.
66. Chung-Faye GA, Chen MJ, Kerr DJ, et al. In vivo gene therapy for colon cancer
using adenovirus-mediated, transfer of the fusion gene cytosine deaminase and
uracil phosphoribosyltransferase. Gene Ther 2001; 8: 1547-54.
67. Yamasaki H, Katoh F. Novel method for selective killing of transformed rodent cells
through intercellular communication, with possible therapeutic applications. Cancer
Res. 1988; 48: 3203-7.
68. Mesnil M, Piccoli C, Yamasaki H. A tumor suppressor gene, Cx26, also mediates the
bystander effect in HeLa cells. Cancer Res. 1997; 57: 2929-32.
69. Mesnil M, Yamasaki H. Bystander effect in herpes simplex virus-thymidine
kinase/ganciclovir cancer gene therapy: role of gap-junctional intercellular
communication. Cancer Res. 2000; 60: 3989-99.
70. Mesnil M, Piccoli C, Yamasaki H, et al. Bystander killing effect of cancer cells by
herpes simplex virus thymidine kinase gene is mediated by conneins. Proc Natl
Acad Sci USA 1996; 93: 1831-5
71. Matono S, Tanaka T, Shirouzu K, et al. Bystander effect in suicide gene therapy is
directly proportional to the degree of gap junctional intercellular communication in
esophageal cancer. Int J Oncol 2003; 23:1309-15
72. Erbs P, Regulier E, Mehtali M, et al. In vivo cancer gene therapy by
adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil
phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res 2000; 60:3813-3822
73. Tomko R, Xu R, Philipson L. HCAR and MCAR: the human and mouse cellular
receptors for subgroups C adenoviruses and subgroup B coxackieviruses. Proc Natl
Acad Sci USA 1997; 94: 3352-6.
66