Title Nicotiana sylvestrisにおける光化学系IサブユニットPSI

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Nicotiana sylvestrisにおける光化学系IサブユニットPSIDの生合成調節機構に関する研究( Dissertation_全文 )
山本, 義治
Kyoto University (京都大学)
1994-03-23
https://doi.org/10.11501/3075823
Right
Type
Textversion
Thesis or Dissertation
author
Kyoto University
i
F
14
ミ
メ l
土
;
:
，
1
'
、
〉ι
学位 11消論文
f
Nicotianasylvestrisにおける光化学系 lサ7
'ユ
ニ ット
PSI-0の
生合成調節機構に関する研究
fヘ
1
9
9
4
i
j
:
:
山本義汗?
目次
略説 ・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
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・
・
・
・
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・
・
・
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・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・2
序 宣
言
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.3
第 lf
i
'
e 尚等柄物における PSIDサ
7
'
ユ
ニ 7トの多明 ・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
.
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.
.'
6
第 2f
i
'
e N
.sy
J
v
ωσi
sにおける PSI-Dサ7'ユニけをコードする psaD
多i
f
{遺伝 f族の構成・・・・・ 12
，
ー
〆"
¥
?
f
53市
ps
a
L
芳
多重遺伝子族の組織特異的発射・・・・・・・ ・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・ ・
・
・
第 4î'~
光化学系
・
2
5
I遺伝子群の光応答 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ '31
第 5i
'
;
'
( ps
a
D
b
.
泣伝 子の転写、転写後、翻訳に与える光の彬稗・・・・・.........••••• '43
結
論
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.'59
謝辞......................................................................'60
引用文献.• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • .• • • • • • • • • •6
1
ど¥
略語
BCIP(
5
七r
omo4
c
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l
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r
o
-3
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n
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y
1
p
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p
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a
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)
・
DTSSP(
3
.
3
'd
i
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b
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m
i
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l
p
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)
EDC(
N
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出y
l・3
[
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d
i
m
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出y
l
a
r
凶n
o
)p
r
o
p
y
l
]c
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切d
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FNR(
f
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x
i
n
:
N
A
DP
+o
x
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s
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)
IAA(
3・i
n
d
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l
c
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c
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I~
MU(4
・m
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h
yl
u
m
b
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l
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f
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o
n
)
NAA(
1
・n
a
p
h
t
y
l
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c
c
t
i
ca
c
i
d
)
NBT(
凶げか b
l
u
et
e
t
r
位 o
l
i山 n
)
P
S
I(
p
h
o
t
o
s
y
s
t
e
m1
)
ヘ
{
2
-
序章
高等植物の光化学系 1(
P
S
I
)は葉緑体行 3イド映に存在し、光エネルギ.を利川して p
l
a
s
t
o
c
y
a
n
i
n
から f
e
r
r
e
d
o
x
i
n
へ屯 fを伝述する色素/タンハ.ク質似合体である (Go
l
b
c
c
k，1
9
9
2
)
. 尚等植物にお
いてはPSI
は少なくとも 1
3
極のサプユニ yトタン)¥'ク質から出来ており、それらは葉緑体ゲノムにコ.
ドされているもの (
P
S
I
A，PSI-B，
PSIC，
P
S
I
I，PSI
J
)と核コー
ドのもの (
P
SI
D，
PSI-E，
PSI-F，
PSI-G，
PSI-H，
PSI-K，PSI-L，
PSI
N
) とがある (
B
r
y
a
n
t
，1
9
9
2
;Kn∞t
z
c
lC
la
，
.
l1
9
9
3
)
. 光化学反
応を行うP7
00
反応1
'1心とー辿の電子受容体のAo，AI
，Fx，FA/F
BはP
SI
A，PSI
-B，
PSI-C
が保持
e'
している.これら光化学反応中心を構築するのに必要な遺伝子群は浜総体ゲノム上に lコピ.
づつ存在しているのに対し、 PSI
複合体の周辺部分を構成するサ7'ユニけの PSI-D，PSI-E，
PSI-F，
PSI-G，
PSI
羽 は そ れ ぞ れ2・3コヒ.の小さな車桜遺伝子として核ゲノム上にコ.ト.され、
イソ型タンハ.ク質を持っている (
Herrmanne
ta
，
.
l1
9
9
1
;Yamamotoe
ta.
l，1
9
9
3
;O
b
o
k
a
t
ac
ta
，
.
l1
9
9
4
;
，1
9
9
4
)
. これらの周辺部分のサプユニ 7卜の多型は結果として他物{同体r:
1
1
NakamuraandObokata
に分子種構成の異なる不均一な PSI
複合体群を生じさせることになるが、この PSI
の多 型
現 象 が ど の よ う な 生 理 的 意 義 を持っているのかは明らかではない.原核生物のうンソウ
Syn
∞hocyslissp.PCC6803や Synechoco∞ussp.で、は PSI-D，PSI-E，PSI-Fの泣伝子psa
D
， ps
a
E
，
n
ps
aF
はすべてゲ ノ
ムr
l
'にl
コピ.づつしか見出されておらず (
R
e
i
l
l
yc
ta
，
.
l1
9
8
8
;C
h
i
t
n
i
s
c
ta
，
.
l1
9
8
9
;
，
.
l1
9
9
1
;M
u
l
e
n
h
o
f
fe
ta
，
.
l 1993)、先に述べたようなサプユこけの多型は高等値物に
C
h
i
t
n
i
se
ta
独自の現象であると忠われる(高等植物の持つ PSI-G，
PSI-Hの巡伝 fは t記の 7
ンソウのゲ/ム
には存在しないと考えられている (
B
r
y
a
n
t
，1
9
9
2
;M心l
e
巾o
f
fe
ta
，
.
l 1993))
.
の周辺サプユニけのうち その機能が明らかになっているものは少ないが、 PS
I-D，PSI-E，
PSI
PSI-Fについてはいく つかの報告がある ，PSI
-D
サプユニ y卜
(
s
u
b
u
n
i
tI
I，
PsaD)は川町側に表山し
ており (
O
h
o
k
ac
ta.
l，1
9
8
9
;An
d
e
r
s
e
nc
la
，
.
l1
9
9
2
;LagoutωandV
a
l
l
o
n
，1
9
9
2
;Z
i
l
b
e
randMaU
くi
n，
1992)、架橋剤 (EDC)で
‘ PSI-Dがf
e
r
r
e
d
o
x
i
nと架橋されること (
'
2
0・kDap
o
l
y
p
e
p
t
i
d
e
'，
Z
a
n
e
l
t
iand
1
9
8
7
;'
2
2kDsubuni
L
'
，Z
i
l
b
e
randMalkin，1
9
8
8
;Iwa
s
a
k
ie
ta
，
.
l1
9
9
1
;An
d
c
r
s
c
ne
la
，
.
l 1992
)
M
c
r
a
t
i，
から、このり 1こ川は f
c
汀吋0氾nとの結合部位であると考えられている. P
S
I
E
(
s
u
b
u
n
i
l
I
V，
3
-
Ps
a
E
)も 川 町 側 に 表 出 し て い る (
'
1
4
k
D
ap
o
l
y
p
e
p
t
i
d
c
'，Oh-okae
ta
，
.
l 1
9
8
9
;Z
i
l
b
e
ra
n
dM
a
l
k
i
n
，
1
9
9
2
;An
d
e
r
s
e
ne
ta
，
.
l1
9
9
2
)
. うンソウの p
s
aE
(PSI
-E
遺伝子)欠失変異体で、は、 f
e
r
r
c
d
o
x
i
nの還元速
度が野性型より遅く (
R
o
u
s
s
e
a
ue
ta
，
.
l1
9
9
3
)、 循 環 的 電 子 伝 達 が 起 こ ら な く な る (Yue
ta
，
.
l
1
9
9
3
)ことが報告されており、 PSI-EはPSIからの電子伝達 に関 与していることが示されて
い る . PS
I
-Eは 架 橋 剤 (DTSS
町で f
e
r
r
e
d
o
x
i
n
:
N
A
D
P
+o
x
i
d
o
r
e
d
u
c
t
a
s
e(FNR) と 架 橋 さ れ る
r
(An
de
r
s
e
ne
ta
，
.
l1
9
9
2
)ので、 PSI-E
サ にけが FNRとの結合 に関わっている可能性も考えら
れる. PS
I
F
(
P
s
a
F
)は EDC
で
、p
l
a
s
t
∞yaninと架橋され ('19・kDasubunit"WynnandMalkin，1988;
Hi
p
p
l
e
re
ta
，
.
l1
9
8
9
)、 PSI-F
のト
ラ
ン
シ 7ヘ
卜 7チドは行コイ
ド 内腔へ輸送されるタンハ・ク質 と共通す
る特徴を持つ(
S
t
e
p
p
u
h
ne
ta
，
.
l 1
9
8
8
;F
r
a
n
z
e
ne
ta
，
.
l 1
9
8
9
)こ と か ら 、
このサプユニけは
p
l
a
s
t
o
c
y
a
n
i
nとの結合部位であると考えられている.その他の周辺サプユニけの機能について
は現在のところほとんど知られていない.
戸l
e
c
h
o
c
y
s
出s
p.PCC6803のp
s
aD(
P
S
I
-D遺伝子)欠失変異体の PSI
襟 品 に はPSI-E
サ7
う
ン
ソ
ウS
ユニけが欠失しており、またいくつかの低分 子量サプ ユ
ニ けが減少している (
C
h
i
t
n
i
se
ta
，
.
l1
9
8
9
).また PS
I
複合体中でPSI
-Cが安定して存在するためには PSI
-Dを必要とする (
Z
h
a
oe
ta.
1，
1
9
9
0
;L
ie
ta
，
.
l1
9
9
1
)
. 以上のことから PS
I
D切 に け がPSIの分子構築に必須の役割を果たし
r
ていることがわかるが、これはPS
I
-E
やP
S
I
F、 PSI
-L
がなくても他のサ ユニけの 7
セ
ン
プ リには
影響しない (
C
h
i
t
n
i
se
ta
，
.
l1
9
8
9
;C
h
i
t
n
i
se
ta
，
.
l1
9
9
1
;C
h
i
t
n
i
se
ta
，
.
l1
9
9
3
)ことと対照的である.
r
I
の7
セ
ン
プ リに 重 要 な 役 割 を 果 た すPSI-D
サ
本 研 究 で は 、 機 能 が 知 ら れ て お り 、 か つ PS
1ニけに焦点をあて、まず前半の章 (
1，
2，
3章)では PSI-D
サ7以外の分子種構成をタンハ.ク質レヘ J
レ
で明らかにし、次いで個々のPS
I
DイリンJ
¥.ク質をコードする p
s
aD
遺伝子群を分子レヘ.ルで解析し
た.さらに個々のp
s
a
瓜宣伝子の発現の組織特異性についても検討した.
被子植物の黄化芽生 えには光合成を行う能力は無く、光を受けると次第に光合成を行う
装置が構築されていく.このとき葉緑体タンハ.ク質 をコードする 1
9
種類の核遺伝子 群が光誘導
t
e
，1
9
9
1
)
. この光による核遺伝子の活性
を受けることが報告されている (ThompsonandW hi
化には、多くの場合転写誘導が関与している (Thompsona
n
dWhite，1
9
9
1
)
. ただしエン ド
ウの
4
-
f
e
r
r
c
d
o
x
i
n
i
l
l
伝 子 fcdAの場合は光照射により mRNAが !
J
_
:il::化されることがぷ￨凌されており
(
G
a
l
l
o
・
Mcaghcre
ta
，
.
l 1
9
9
2
)、 制a
r
a
n
出の r
bcS
の場合は光による翻訳i
誘 導を受ける (
B
c
町 c
t
，
.
l1
9
9
0
)
. これらの伝写後の光制御は上 Uの植物種や迫伝 fに限られた現象なのか、ある
a
いは光制御を受ける i
l
l
伝子一般に広く行われているのかは現在のところ明らかではな
し
.
:
1
光による転写の活性化の刈ニス.ムはエンドウの r
比S
3
A
で・訟も約 )
J的に研究されている.活性
型7ィトクロムはこの遺伝子発現を誘導する (
F
l
u
h
randChua，1
9
8
6
)
. またトうンスシ.エニリタハ.コをJl1い
た解析から rbcS・3Aの7' ロそ-~ -に存在する GT
・
1
結合配列 (
b
o
x11)が暗所での転'与を抑制してい
K
u
h
l
c
m
c
i
e
rc
ta
，
.
l1
9
8
7
;La
m andChua，
て、光!照射後その抑制を解除することが示された (
1
9
9
0
).タンハ.ク質性の DNA結合因子である GT-1 の cDNA は~ /¥'コから単離されているが (
P
c
r
i
s
i
c
9
9
2
;Gi
lm
a
r
t
i
nC
la
，
.
l1
9
9
2
)、GT
・
1
がどのようにして光に依存した転写調節を行う
andLam，1
山a
u
sらは c
a
b
のp
h
y
t
∞hromeに依存した発現には、三虫体G
のかは明らかでは無い.最近 Ne
タ
ン
ハ
.
ク'
f
1とcalmod叫加が関わっていることを示唆する結米-を報告している (Nc凶 ause
la
，
.
l
1
9
9
3
).彼らはさらに、 phytochromeに依仔した発現を行う核法伝子にはc
a
l
m
o
d
u
l
i
nが関わっ
Rb
c
S
， LHCII，OEE1，ATPs
y
n出a
s
eys
u
b
u
n
i
t
の逃伝子)と関わっていないもの
ているもの (
(PsaD，PsaF，R
i
e
s
k
eFeS，f
c
r
r
c
d
o
x
i
n
，p
l
a
s
t
o
c
y
a
n
i
n
の遺伝子)の 2つのク ・
ル7 があることを示唆し
ている.しかし後者については光応答を担う以配列が同与とされていないばかりか、ごく
最近まで迫伝子の単離さえなされていなかった.本研究の後半(
4，
5草)では、後者のグル-7'
咳遺伝 f
-~洋の光応答機構について psaDを巾心にして解析を行った.
に 属 す る PSI
N. sylvl回trisの PSI核遺伝 f~伴の中で最も泌早い光応答を示した psaDb.泣 ú_;;
fを
、 PSI-D
サ
プ
ユこけの遺伝子としては以核生物から初めてクローニングし、その構造を明らかにした.環境変
化に対する遺伝子発現の素早い応答は転写後のレヘ.ルで行われている場合があるので
(
Th
ompsonandWhilC，1
9
9
1
;Grecn，1
9
9
3
)、p
s
a
D
l
J
(
J
)光 応 符 が1
I
岳写レヘルで行われているのかあ
るいは 1伝写後のレヘ.ルで行われているのかを旬以シ.エニリタハ
Jを 用 い て 検 討 し た . そ の 結 果
p
s
aD
bの光応答は転写レヘ.ルで行われていることが明らかになり、また p
s
a
D
b
(
l
)5
'非 翻 訳 領 域
には翻訳を促進するシス配列j
があることを示唆する結果が得られた.
5
-
第
1章 高等植物における PSI-Dサプユニけの多型
要旨
タ
ハ
.
コ(
N
i
∞
， t
i
a
natabacum)の母系祖先種である N
.s
y
J
v
ωt
r
i
sから光化学系I
複合体を精製し、
LDS-PAGEにより構成タンハ
.ク質を分離し、それぞれの タンハク質を 7
ミ/椴シーケンサーにかけ N-末端
7
ミ/椴配列を決定した.その結果、N.syJvestrisには分
fl ， t の y~ なる 2椅頬のPSI-Dサプユニ外が
存在することがわかったので、高分子側のPSI-DをPSJ-D1、低分 f側のものを PSI-D2と名
付けた.両有のアミノ酸配列は異なり、それぞれ別の泣伝 fにコードされている .いずれの
アミノ酸配列もか.コの葉緑体ゲノムにはコードされておらず、 PSJ-Dサプユニけは核支配であること
が示された. 免疫 7ロ7ト法による解析の結果から、 ト
マ
ト
、 シロイヌナス.ナ、トウモロコシには電気泳動
の移動度の異なる 2種類のPSI-Dがあることがわかった .このことは、一般に高等植物に
おいては、 PSJ-Dサ
7
'lニけは 2種類のり型から成り立っていることを示唆している.
序
PSI
桜合体にはPSI-A，PSI-B，PSI-Cの3つのホ
.
リ
ヘ
.7
'f
ドが合まれ、これらは葉緑体ゲノムにコ
.ドされている (
G
o
l
b
e
c
k，1
9
8
7
)
. PSIに含まれるタンハク質はこれ以外に 卜数椅類あるが、 1988
年から 1993年にかけて、それらのタンハ.ク質の N-末 端 7
ミ/峨配列が決定され、またそれぞれ
に対する抗体が作成された .そしてそれらを基にして、 PSIサ
プ
ユ
ニ1
'~をエドする葉緑体遺伝
子や核遺伝 fに由来する c
DNA
が単離され、 PSI
サ7'にけの分 fレヘ.ルでの伺定が行われてき
L
a
g
o
u
t
t
c
，1
9
8
8
;Ho
仔m加 e
ta
，
.
11
9
8
8
;M出 c
he
t
a
，
.
11
9
8
8
;O
k
k
c
l
sc
t
a
，
.
l1
9
8
8
;Steppuhneta
，
.
1
た(
1
9
8
8
;O
k
k
c
l
sc
t
a
，
.
l1
9
8
9
;S
c
h
e
U
e
r
e
t
a.
1，1
9
8
9
;
S
t
e
p
p
叶m c
ta
，
.
l1
9
8
9
;I
w
a
s
a
k
ie
ta
，
.
11
9
9
0
;O
k
k
e
l
se
t
a
，
.
l1
9
9
1
;Yam
釘n
oωcta
，
.
11
9
9
1
;H
a
y
a
s
h
i
d
ae
ta
，
.
l1
9
9
2
;O
k
k
c
l
sc
ta
，
.
11
9
9
2
;F
l
i
e
g
e
re
ta
，
.
11
9
9
3
;
K
j制 l
f
fandO
k
k
e
l
s
.，1
9
9
3
;Kjaru
肝 e
ta
，
.
11
9
9
3
;Kn∞t
z
c
le
ta
，
.
11
9
9
3
;O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
11
9
9
3
)
.そ
'
N
i
∞
， t
i
a
n
atabacum
から精製した PSI
標品には N・点端 7
ミ
/椴配列のよく似たタンハ.ク質が
の過程で;
O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
11
9
9
0
)
. N
.labacumはN
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
sと
含まれていることが明らかになった (
6
-
N
.t
o
m
c
n
t
o
s
i
r
o
r
r
n
i
s
のゲノムを合わせ持つ被 ーて倍 体であり (Kungc
ta
，
.
1 1982)、その結果
N
.
U
l
bacumにおいては異質倍数性に由来する PSI
サ
プ
ユ
ニ yト
の多引が生じている (Obokatae
ta
，
.
1
1
9
9
0
).尚等~.w!物の半数体ゲノム当たりいくつのPSI~ ンハク質があるのかを調べるには、半数
体か純系の 2イ汚体を用いると解析が容易である.そ こで本研究ではその点を考慮して
N.U
l
bacum
の母系祖先極で、ある N
.s
y
l
v
白
， σ
i
s
を材料として J
I
Jいて、 PSI桜合体に 含まれるタンハ-
7
'
f
1の椅類を詳細に調べた.その結果、
PSI-D
切 に け に は 7ミ/椴配列の異なる 2種類のイソ型
が存在することが明らかになった.従ってここでみられた多明は多重遺伝 f族に 由来す
ると J
5
・えられる. また免疫プロット解析を行いこの PSI-Dサプユこけの多刑の一般性についても
検討した.
材料及び方法
純物の育成
Ni
∞
，t
i
a
n
as
y
J
v
c
s
t
的
、
ト
マ
ト (Lyc
，o戸 'rsicon ωcuJcntum，VFNTLA l
i
n
c1
2
2
1
)、 7ス
.
キ (Vigna
，c
v
.C
h
a
g
a
r
a
w
a
s
e
)、
a
n
g
u
J
a
r
i
s
ト
ウ
モ
ロ
コ
シ(
Z
e
amays
，Ho9)は淑宝 (
250C
)で育成した .シ
ロ
イ
ヌ
ナ
ス
.
ナ(
A
r
a
b
i
d
o
p
s
i
s的a
l
i
a
n
a，e
c
o
りr
p
eCOlumbia) は植物情益保 r
l
lで
、 220C、蛍光灯の連続照明
下で育てた.
わ1
にけの N-末端アミノ酸配列の決定
光化学系 I被合体サr
Obokataらの }j法(
O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
11
9
9
3
)に従って、 N
.s
y
J
v
C
S
l
r
i
s
の必より柴緑体を 単離し、シ 3
事
i
!
密度勾配趨遠心法により PSIを精製した. LDSPAGEにより PSI?ンハ.ク質を分離し (
O
b
o
k
a
t
a
，
.
1 1
9
9
3
)、 PVOF
膜に
e
ta
r'J'lテイングし、
それぞれのハ
・
ン
ドをJ
'
'
Jテ
インシークエンサー(Ap
p
l
i
吋
B
i
o
s
y
s
t
cms，
477
N120A)にかけた (Obokatae
ta
，
.
1 1990
).
必緑体股両分の調製
全ての傑作は 40Cで与行った .N.syJv
ωσ
'
i
s
、ト
マ
ト
、 シ
ロ
イ
ヌ
ナ
ス
.t
，7
ス
1、 トウモロコシの葉を単離メ
，
7
-
テ
ィ
ウ
ム(
0.
35Ms
o
r
b
i
t
o
l，2mMEDTA
，25
m MHEPES-NaOH(pH7
.
6
)、 2mMsodiumi
s
o
a
s
c
o
r
b
a
t
c
)
中でホ.リトロンにより破砕し、 8層のカ.fで減過した.浦、液を 4，
000
中 m、5
分間述心し、生じ
た沈殿を再び単雌メデ ィウムに懸濁し、50% シ3粕裕被に重層したのち、 10，
000
中 mで:
'
3
0分間述
心した.緑色のハ.ンドをすべて匝収し、 5mMT
r
i
s(pH7.5)に懸湖し来総体を破砕した.サン7'
ルを14，
000
中 m，1
0
分r
/lJ述心し、生じた沈殿を 5mM(
T
r
i
sp
H
7
.
5
)で、数凶洗ったのち、 5mMT
r
i
s
(
p
H
7
.
5
)に懸濁し、これを葉緑体膜画分として・ 800Cに保存した。股 I
l
f
i
;分に含まれるタンハ '
9
'
f
1泌度はBCA法 (Smi出 Cla，
.
l1
9
8
5
)により定川した.
イ
ン
ク
.
免娃7'01テ
ホ
ウ
レ
ン
ソ
ウの PSIに対するウサギ抗血清 (Oh・
okac
ta
，
.
11
9
8
9
)から、 K
e
l
l
yらの方法 (
K
e
l
l
ye
ta
，
.
l
1
9
8
6
)により抗 PSI-D抗体を 7
7ィニティー精製した.
峨々な植物より得た必緑体映画分を、 LDSPAGEにかけ PVDFl
岐に 7口7テイングし (
Obokata
，
.
l1
9
9
0
)、ウサキ.抗 PSI-D抗体、ピオチン標識されたりハ.の抗ウサキ.免泌グロ 7
・)
1ン抗体(んn
c
r
s
h
a
c
ta
l
k
a
l
i
n
ep
h
o
s
p
h
a
t
a
s
e
結 合s
t
r
e
p
t
a
v
i
d
i
n(Amcrsham)と順次反応させ、 NB
T/BCIP
の発色反応
m)、a
により PSI-Dを検出した。
、
「
結果
タ
ハ Jの母系祖先積である N
.s
y
J
v
l
出 t
r
i
s
から得た PSI様品を LDS-PAGEにより解析すると、
20kDa
以下の低分子側の領域に約20本のハ.ンドが検出された(図ト1).このうち 19kDaと
17.5kDa
のハ
.ンドを PVOFn
誌に 7町テインク.し、7'ロ
テ
ン
シ
.
ク
エ
ン
サ
.を用いて N-末 端 7
ミ/酸配列を決定
した .得られた配列はいずれもか.コの必総体ゲノムにはコ.ドされておらず、トマトの核泣伝 f
p
s
a
I
X
J
)産物で、ある P
SI
Dと相向性があった(図 1
・
1
).従って、 19kDaと17.5kDa
のタンハ.ク質は
いずれも PSI-Dサ7ユニけであることがわかった.その他のハ.ントのタン/¥'ク質は PSI-Dと相 向性
は無かった.
次に、 PSI-Dサプユニけの多型が、タハ J属に￨授られた現象なのか、あるいは高等植物一般に
8
-
広く見いだされることなのかを調べるために、純系のトマト、 シ
ロ
イ
ヌ
ナ
ス
十
、 7
，
スf
，そして近交
系の ト
ウ
モ
ロ
コ
シか ら 、 葉 緑 体 膜タンハク質 を調製し、抗 PSID抗 体を Jf]いて免疫 r
0([1ン
グ を行
い
、 PSIDを検 出した.図 1
・2
はその結果を 示しており、 トマトでは 1
8kDaと1
7.
3kDa
、河イヌナ
ス.ナでは 1
8
.
2kDaと1
7
.
5kDa、7
ス.キでは 18，
2kDa
、 トウ初コシで 1
6
.
9kDaと 1
6.
6kDa
の/
，
'
ン
ド が検
出された，
Tfキを除く全ての植物で 2本のJ
'.ントが検山されたので、これらの植物では2
種
煩の PSI-Dイソ
型
タ
ン
/
，
'
ク質を持つことが明らかとなった.
(¥
考察
D切 に け の 多 型 が 知 ら れ て い る が
N
.tabacumに お い て は 異 質 倍 数 性 に 由 来 す る PSI(
O
b
o
k
a
t
ac
ta
，
.
l1
9
9
0
)、 N
.labacumの純系祖先種である N
.sylvl
白 凶s
においても、 PSI-D
サr
ユニけ
には7
ミ
/酸配列の異なる
2つの種類があることがわかった.後f
守の多型 は、多重遺伝子 族
i
J1 ト 解析の結果 (肉 1 ・2) から 、この PSI-Dサr~ニ ハ
に由来するものと考えられる.また免疫r
の多型は f
高等純物に一般的に存在するものと思われる.
2
極頬の PSI-Dが二 者択一的に PSI
複合体に取り込まれると、結-*的に 2
積類の PSI
複合 体
複合体には わ汁の大きさが見なる 2純知の型がありそれぞれグ
が生じることになる， PSI
汁.チうコイドとストロマ.行コイトとに局在している (
A
n
d
r
c
a
s
s
o
nC
la.
1，1
9
8
8
)ということは報告 されて
組合体自体の多型についてはこれまで知られていなかった， PSIDサプユニ外
いるが、コ 7
(
S
u
b
u
n
i
tI
I
)
はf
c
r
r
c
d
o
x
i
nとの結合部位であると与えられているので:
'
(
Z
a
n
e
l
t
i加 dM
e
r
a
t
i，1
9
8
7
;
9
8
8
)、 PSI-D
サプユこけのり型 によって fcrrωo
泊 nとの親和性に違いが生 じ
Z
i
J
b
c
randMalkin，1
るのかも知れない.興味深いことに f
e
r
r
e
d
o
泊nにも り型があり、光合成器官に複数種の
7エレドキシンが仔在する (
T
a
k
油a
s
h
ie
ta1
.
.1983・Hascc
ta
，
.
l 199 1)ので、 PSI-Dサr~ニ y トの多型 との
関係に興味が持たれる.原核生物のうン藻においてはPSJ
心遺伝子はゲノム中 に1
J
ピーしか存在
しないと巧えられる (
Muhl
enho
仔e
t
a
，
.
l1
9
9
3
;Re
i
l
l
y
c
t
a
，
.
l1
9
8
8
)ので、この現象は高等植物に
特有な光合成反応の制御機構を研究していく 上で 1
つの手掛かりとなることが期待され
る.
9
-
、
f
.
.
V-
hF
A-A
・
E-E
kn
・局
-
m
.
.
.
.
・
・
・
A -"
町民
PE
to P51-0
A
M
'
・
・
t0
E-E
"
・
・
-
/一
g
z
‘.eE
I・
-・肉・・・
︻
，
。
.
a
v
﹄
・・・・
“
・
AEfA-PAAlEf-'PA
•
似1
1・1
.N
.s
y
J
v
ω
， 凶s
に含まれる P
S
I
D
t
t]
，
ユ
ニ yト
のr
l
I
J
定
約製した P
S
I
彼合体の LDS-PAGE
の銀染色像(左)と凶にぶした ハ.ンドに対応するタンハ.ク質の
N米端1
7ミ
/
椴配列を示す. 19kDa
のP
S
I
D
1と1
7
.
5
k
D
a
のP
S
I
心2
の N-末端 7ミ/酸配列は、いず
S
I
D
(
H
o
f
f
m
a
nC
la
，
.
l1
9
8
8
)と向い村 1
1
す性をぷしている.
れもトマトの P
1
0
-
、
f
NS
LE
AT
¥'A
ZM
21
.5 kOa
一
・).L3 kOa-
図1
2.高等航物における PSI
Df
1rユニバの多型
N
.s
y
l
v
出 町必 (
NS)、 ト
マ
ト (LE)、シ
ロ
イ
ヌ
ナ
ス.
ナ(AT)、 7
ス
.
キ (VA)、 ト
ウ
モ
ロ
コ
シ (ZM)の葉緑 体脱 阿
/
¥
.ク貿ずつ (
7
ス.キはみg)電 気 泳 動 し 、 抗 PSI
-D
抗体を用いて免疫
分 を そ れ ぞ れ 20μdン
ロ ïT~ ングを行った .
1
1
-
r
第 2章
N
.
s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
における PSI-Dサプユニットをトドする
p
s
aD
多重遺伝子族の構成
要旨
N
.s
y
l
v
l
白 t
r
i
s
の PSI-D2のN・末端 7ミ/酸配列をもとに、オリコ DNAを合成し、 PCRを用いて
cDNA
うイプうリから、 PSI-D2をコードする戸aD
acDNAを単離した.そして p
s
aD
acDNAを7'トプ
としてゲ J~ 'ï行イ7' 7 リから PSI-D1 をコードする psaDb遺伝子を単離した .
"
T
口i
' インク.の結果と、得られたケパリクローンの制限酵素地図とから、
p
s
a
I
X
J
)
'
/J
ミリサザン 7
N
.s
y
l
v
ωt
r
i
sにおいては
PSI-D
遺伝子は p
s
aD
a
とp
s
aD
bの 2つよりなることが明らかとなった. PSI-D1とPSI-D2の
ホモロシ.ーをコード領域の塩基配列、そこから演縛される前駆体タンハ.ク質のアミノ酸配列、 につい
て調べたところ、 DNA レヘ I~で83% 、アミノ酸レヘ)レで 94%のホモロシ.ーがあった.
序
光合成に関わる葉緑体タンハ.ク質は葉緑体ゲノムか核ゲノムのいずれかに J-ト.されている.光
化学系 I
I
複合体のサプユニット群や光化学系 I
のPSI-A/
B
， PS
I
-Cなどは葉緑体ゲ/ムにコ.ドされてお
n
り、一つのサプユニけに対して 1種類の遺伝子が存在する.核ゲノムにコ.ドされている迫伝子
としてはか汁成分である LHCI
/
I
I(
c
a
b
，Lha
/
b
)が遺伝子構成に関してよく調べられている.
cabは
トマトで・は 1
9の遺伝子が同定されており (
G
r
e
e
ne
ta
，
.
l1
9
9
1
)、またシロイヌナス.ナでは少なくと
も12の遺伝子があると見積もられている (McGrathe
la
，
.
l1
9
9
2
)
. しかし、光化学系コアを構築し
ているタンハ.ク質の核迫伝子の構成についてはほとんど知られていない.
第1
ii!において、 N
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
sには 2種類の PSI-Dが検出されたが、それぞれの PSI-Dの性質
や遺伝子の発現機構を解明するには、まずそれぞれをエドする遺伝子を単離し、次いでゲ
ノム中での PSI-D遺伝子の構成を知ることが不可欠である.そこで、この章では、 PSI-Dを
コ
ー
ドする cDNAや遺伝子を単離し、 N
.s
y
l
v
e
s
σ
i
s
のゲノムにおける PSI-Dの遺伝子構成を明らかに
1
2
-
した.
材料及び方法
。
'
s
aDcDNAのク
ロ
ー
ニ
ン
グ
切
N
.t
a
b
a
c
u
mPSI-DのN-末端7ミ/酸配列 (
Obokatac
ta
，
.
11
9
9
0
)をもとにして p
s
a
I
J
1
守異的7'うイマー
(
5にGA
A
l
GGCICCIG
TIGGITTIACICCICCICAIT
/C
TIGA
T/CCCIAA
T/CAC-3¥ た だ し Iはイ
/
シン)を合成し、 λgt107
'
う
イ
マ
ー(
5
'
AGCAAGTTCAGCCTGGTI
AAG-3') と組み合せて、 PCR
法
により N.s
y
l
v
白
， 出s
の λgt10cDNAうりうりから ps
aDcDNAを増幅した (
E
r
l
i
c
h
，
1
9
8
9
)
. PCRの温
f
へ
0
0
度条件としては(
9
4
C
/
1
m
i
n
.，550C/2min.，
72
C
/
4
m
i
n
.
)を3
0
サイクル行っ た. PCR
産物をη.0;
'
1
'
ル電気泳動 し
、 0.6kbpのDNA断片 をゲルから精製した.そして 一部を
アルカリ変性 させた後、
p
s
al)
侍異的7'うイマーを用いて dideoxy法により 部分塩基配列を決定した (Samb
r
ooke
ta
，
.
1 198
残りの精製済の PCR
産物をうンダム 7 うイマー法により 3
2
pで 標識し、 c
DNA71
'
7
'
う
り
か
9
)
. 次いで‘
ら
、 7
'7ークハイプリダイセ.ーシ 3ン法に より ホ.シ.ティプシグナjレをあた える ロ
クーンを単離した (
S
a
mbr
ooke
t
a
，
.
1 1989).
ns
aD
b
遺伝子のクトニンク.
p
s
aD
acDNA (
y
aDC1η をうンタム 7うイマ舗法によりやで標識し7'0-7
'と し て 用 い た .
N
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
の ^dashケ
n
7行イ 7 うリ(Lieta，
.
l 1991)から 7う
ー
クハ
イ
7
'I)fイ
セーション法によりホ.シ 71
プシグナルをあたえる ロ
クーンを単離した (Sambrooke
ta
，
.
11
9
8
9
)。
制限醇素地図の作成と塩基配列の決定
得 られた Aロ
クーンはM13ヘ
.
ク
タ
ー
か pBlues
c
r
i
p
tI
I
ヘ.けーにサ7'クローニングし制限酵素地図を作成し
た(
Sambrooke
ta
l.)。塩基配列の決 定は
、 cDNAク
ロ
ー
ンについてはインサート全長 を
、 yaDG20につ
.
する領域及びその周辺部分について、 dydeoxy
法を用いて行っ
いては yaDC17とハイプリダイス
た(Sambrooke
ta
，
.
11
9
8
9
).
塩基配列及 びアミノ酸配列の解析は、ハ.ーソナ)~コンヒ 1 ータ ー (NEC PC98
01RA) 上で遺伝子解析
1
3
-
，
ハ7
ケ
ー
シ
.GENETYX (SDC17トウェ7)を用いて行った。
7
.う
イ
マ4ド長法
N.sylv白crisの~から Piechulla らの方法 (Picchulla c
ta
，
.
l1
9
8
6
)に従って全 RNAを抽出した.
J
2
pで末端標識した 7 う
イ
マ
ー
を 20時 の 全 RNAとハイプリ.イス.させ、 MMLV
逆転写酵素 (
BRL
，
Super
s
c
r
i
p
t
)
をJljいてのO
Cで 9
0分間7'うイマイ中長反応を行った (
S
a
mbr
ookc
ta
，
.
l1
9
8
9
)
. 遺伝チ
特~的7'うイ 7・ (5'-GGGCGACGACACGGGGATCGGCTGTTITCGAGGTG
)はp
s
a
助 mRNAと
相補的であるが、 p
s
aD
a
とはハイプリタ.イス.しない.
('
サ
ザ
ン
7
'
ロ 7テ
イ
ン
グ
ゲ
/
ミ 7ク
N
.s
y
l
v
c
s
凶s
から J
o
f
叫ωとG
oldberg
の方法 (
J
o
f
u
k
uandGoldbcrg，1
9
8
8
)により核 DNAを精製し
.
8%7h.i
J
ー
ス
ゲ
ル
上で屯気泳動した.泳動後、 ゲルを
た.核 DNA9開を制捜酵素でお切断し、 0
0.25NHClrf1で娠とうしゲル中の色素の色が変わってからさらに 1
0
分間娠とうを続けDNA
の脱7')
1ン
化(断片化)を行った.ゲ ル
中のDNAをナイロン脱 (AmcrshamHybondNつに打ヒ '7ト7
07トし、J2
pで標識したp
s
a
助 cDNA(
YaD
C
1
η を7'ロープとしてハイ7"I
)
fイ
セ
.-13/溶液 (
6
xSSC，
5
%I
r
i
s
hc
陀 aml
i
q
c
u
c
r(
'
O
r
e
g
i
n
a
lI
r
i
s
hCream'
，R& A B
a
i
l
c
y
sC
o
.
L
t
d
.，
NaasRoadD
u
b
l
i
n1
2
)，
0
.
5
n
% SDS，20μglmlh
c
a
t
d
e
n
a
t
u
r
e
dsalmons
p
町 mDNA
，2μCi/mlJ
2
p際，識7
'0-7
")中 で
、 650Cで 一
晩
ハ
イ7
.I
)
fイ
セ
.シ
ー 3ンを行った (Sambrooke
ta
，
.
l1
9
8
9
)
. 映を 1xSSC、0
.
5% SDS
溶液中で650C
で15分間娠とうして洗浄し、オート 7シ
.
tク77ィーにかけた.
結果
。
a
D
ヨ cDNAの灼.ニング
'
S
p
s
aD
ac
DNAのクロニング には、まずPCR法を用いて p
s
aD
acDNAをcDNAう
イ
7
"7リ
から増幅し、
次にそれを7'ロ
7
'として全長の cDNA灼.ンを得ることにした .
ー
1
4
-
P
S
I
-D2
のN・末端 7ミ/椴配列をもとにして psa
L
府民的7'7
イマーを作成し、 λgt107
'7
イトと組
み合せて、 PCR
法により N
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
の λgt10cDNAう
イ
7
'7リを鋭唱として PCRを行った.そ
m
1
1
の結果 0
.
6
k
b
pの 幅産物が生じた.この 0
.
6
k
b
pのDNAを1
1
収し、 psa
r
:
A
守異的7'7
イマ.を用い
てほ接指法配タJ
Iを決定したところ、トマトのpsaDと尚い相 I
I
I
;
J性があることがわかったので(テ
:
;
3ン7'ロ・7'として N
.sylvcsrrisの cDNA7イプ刊をスク リ
ーニングし
.-~は省略)、 これをハイプリグイゼ 次スクリーニングの結果 1
0
0，
0
0
0
灼.ンの cDNA7
イ7'うりに対して 7
5例のホ.シ，10'シグナルが得られ
た
， 1
0
伺のシグナルを選び、7'レ.卜のシグナルを与えた j好から 7
7
-1'を極き取り(この中
た. このうち 5
には数トクロJの 7
7
-1'を含む)、一部を先に述べたのと 1
1
]
iじ条件で I
I
JびPCRにかけると、 5
0
r
目
中s
された DNA断
J
l
唱
をA
l
u
l
で消化後、
個のうち 1
2
例が0
.
6
k
b
pの増幅産物を生じた，
PAGE
を 行い、異なる切断ハタ.ンを生じた 8個についてさらに解析を進めた(デ-~は省略)， 2
次
ス
クリ
ー
ニングを行いそれぞれの灼.ンを単離し、 M13mp18ヘ.ク~-にサプクロ.ニングし、その埴基配列を決
定した(デ-~は行略) ，その結果 8
クユンのうち 1
灼.ンについては EMBLf-~ヘ -Ã を検索しても
ホそロダ.のあるものは得られなかったが、残りの7灼.ンは共通の配列を持ち、 ト
マ
ト
の psaD
(
H
o
f
f
m
a
ne
ta
，
.
l1
9
8
8)と相向性があった.そこで7つの灼 Jのうち故も長い挿入断片を持つ
灼.ンを選んで全温基配列 を決定した(凶 2
・
1
)，これらの cDNAは互いに tハ
.7J7'
灼Jともう 1
しており、
r
n
Jじ遺伝子に由来すると思われるのでこの泣伝 fをpsaDaと名付けた ， psaDa
cDNAは 2
0
4
7ミ
/
i
喰 か ら な る ホ リ ヘ 7チドをコ.ドしており、
P
S
I
D
2
の N-末 端 配 列
AEEAA
TKEAEAPVGFfを含んでいた(国2-1) ， 従って、 psaDaはPSI-D2~ ンJ\ 'ク質をコードしてい
ることがわかった .psaD
acDNAの塩基配列から演料される P
S
I
D2
成熟知ハ・ク質の分子量は
1
7.
4
kDa
で、あり、 LDS-PAGEによって算出された分 f1Jt
1
7
.
5
k
D
aとよく一致している.この
N
.sylv
出
， ぴI
'
sのps
aD
aはトマトの ps
a
.
D
(
Hoffmane
ta
，
.
l1
9
8
8
)と、 DNAレ
ヘ
.ルで 82%、 7ミ/酸レヘ.ルで9
0
%のホモョシ-があった (
テ
.-~は省略) ，
o
，
s
aD
b遺伝子の灼二ング
ぬ cDNAを7'ロ-7'として、 N
.sylvωL
r
I
S
のゲ/ミ yク
う
イ
7
'7リ、約 3
x
1
06灼.ンを
次に、得られた psa
つのホシ 1
スクリ.ニングし、 1
17'シグナルを与えるクローン、 yaDG20を得た.このク D
iの制限酵素地図
1
5
-
ー
を凶 2・
2に示す .p
s
a
ぬ cDNAとハイ7'リダイス.した領域を pBS
ヘ.妙.にサプク 3・ニングし、 その梅基
配列を決定した(似1
2
・
3
)
. yaDG20には 2147ミ
/般を コ
.
ド する ORF
がイ
ン
ト
ロ
ン による分断を受けず
/椴配列 (AVEKAQSATKEAEPA)を
に存在しており、このアミノ
酸配列には PSI-D1のN・末端 7ミ
含み、 PSI-D2 と全長に渡って高い杭コ シ. ーがあった ([~J2・3.2・4) .結局このク
ロ
ー
ン はPSI-DlをJ-
r
ドしていることがわかったので、この遺伝 fをp
s
aD
bと ，
付けた.
。's aDbíl~'IJ. im物のマ y ピング
ps
aD
bの転写開始点を決定するために、 ps
aD
b特民的 7イ
う1
-を}I]いて7'うイマー仲長法を行つ
n
た(位:
1
2
・
5
)
. その結果、 p
s
aD
bmRNAの5
'末端は、翻訳開始の ATGコドンの 23bp
上流のAであ
'末端としての弱いシ
グ
ナ
ル
ることがわかった.ただし、 ATGから 15bp上流の Cについても 5
r
i
j綴の結果が得られた
が検出された .N.sylvestrisの別の組織より得た悶A似品をJlJいても f
bmRN
Aの5
'
上流域の 7ンチセンス鎖を 7
'0-7
'として RNase7
'Jテクション法を行っ
(
テ
.-~は省略). psaD
たが、 7
'7
イ
マ
・伸長法で得られた結果と矛盾しなかった(デイは行略).また、 p
s
aD
bの
コ
ー ド領
域全長の 7ンチセンス鎖を7'D-7'とし てRNase7'ロテクション法を行ったところ、コ.ド領域のほぼ全長
が保護されたので、 psaD
bにはねトロンが無いことが俗認された(デイは行略).
N
.s
v
J
v
也 l
r
i
sにおける l}sa
I
2の 3ピ.数
，
n
N
.sy
l
v
c
s
t
.
r
i
s
に お け る ps
必のコピ・数を決定するために、 ps
aD
acDNAを 7
・D
7・としてゲ
パ7クサザン7'07テインク.を行っ た(図 2-6). ど の 制 限 酵 ぷ で 消 化 し た も の で も 強 いハ.ンドと弱い
2
)を参照すると、 psa
ぬと弱く ハ
イ
7
'I
J
fイス.
ハ
.
ン
ト
.が比られる. yaDG20の制限酵素地図(図2・
するEc
oRIの 15kbpの DNA
断片と Hindillの 7.8kbpの断片は、 ps
aD
b
遺伝子に由来することが
わかる. 1.9kbpの EcoRI断 片 は 強 いハイ7'リゲイセ.1
3ンシグナルを示しているが、これはpsa
ぬ遺
伝
fのけ.ナルで あ る と 思 わ れ る . こ の 断 片 は2つ 以 仁 のpsaD
遺 伝 fを含むには小さすぎる
ので、結局、 N
.s
y
l
v
白
， 出s
のゲノム は2
Jピーのps
aD
をコ.ド していると結論された.
1
6
-
考察
本章では、 N
.s
y
J
v
l
白 t
r
i
sにおいてはp
s
a
瓜宣伝子はゲ ノム当 たり 2コピ.あること、また 2つ の
p
s
aD
乃遺伝子産物の 1次構造は非常によく似ていることが明らかになった .N
.s
y
J
v
l
白 t
r
i
s
の
ゲノム中には p
saE
はおそらく 2
Jピ
ー
、 p
s
a
Hはおそらく 3コピ.あると報告されているので
(
O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
11
9
9
4
;NakamuraandObokata
，1
9
9
4
)、これらの PSI
の周辺サプユニ 7卜はおおむね2・
3コピーの小さな多重遺伝子族を形成していると思われる.これらの遺伝子族にエドされて
いるアミノ酸配列はそれぞれよく似ている(成熟わハク質での相向性は、 p
s
aD
a
とp
s
aD
bとでは
94%、 p
s
aE
aと p
s
aE
b
で、は 89.1%、 p
saHa
，p
saHb
，p
s
aH
c
で、は 100% (0凶 k
a
t
ae
ta
，
.
1 1
9
9
3
;
NakamuraandObokata，1
9
9
3
)
)ので、これらのイソ型サ7'にけがそれぞれ機能的に異なってい
るとは考えにくい.しかしながら、予備的な実験の結果から、 p
s
a
D
l
A
守異的な 7
ン
チ
セ
ン
ス RNA
を高発現させたN
.s
y
l
v
e
s
凶s
は致死性で、あることが示唆されている(山本ら、未発表テ.-~)の
で、 N
.s
y
J
v
l
白 凶s
にとってはp
s
aD
a
，p
s
aD
b
の両方の遺 伝子産物が必須であるのかも知れな
い.今後詳しい解析が必要であると思われる.
1
7
-
{
喰心C1
2
)
I
20
40
60
TlτTTTTTTTTTTTTTTCATCCAGAAGAATAAGTCAACATAGAATGTAAACAAGCGCGCA
80
100
120
ATCAAA1TTATTTGGTATCCTTAACTACCAAAAATTGGTTAAGTGCATCTCCTT1fTATA
140
160
180
TTAGC11GAAAGTAATATTCTTTCTCAGAACTGTAATCAACACCTCTCAAAAATTGTCTT
200
220
?40
TGCTTGTGGTTTTCCAATTAATTGCCACfCAAGGTTGAArTCTAGCAGACACACCTACTG
260
280
300
CACTT1CCAT1CGAGAGTACCAATCACCGArATGTGTGTTCTCCACCATGTCTClACCAG
320
340
360
ATTTCAGGTAGCGGATGGGTCTCAAAACGCCATATACAGCAAGATCAGCCAAGTTTGGTT
380
400
420
iAGAGCCACCAAGAAAATCTCGACCClrCAGAGCtTCAACCCI¥TGTTTCTGCAGCτTCAT
440
d60
480
ACAGGGC1GCACGCτCAτCGGTAATAT1ATACTTCTTCTTCAATCTCY 1TGAAACAAAAT
500
520
540
ACATGGATGCAGCACCACCATACT1GACGG1AAATCTTTCCGTAAAGCCAATAATTCTAC
，
(
Y
<
ゆC1
7
)吋
I
560
580
600
AATGGCCATGGCAACTCAAGCTTCTCTCTTCACTCCAGCTCTCTCTGCCCCAAAArC1TC
附
A M A T Q A S L ド T P A L S A P K S S
620
(¥
640
660
AGCCCCATGGAAACAATCCCTTGCTTCCTTCTCTCCTAAGCAACTCAAATCCACTGTTTC
A P W K Q S L A S F S P K Q L K S T V S
680
700
720
CGCTCCCCGTCCCATTAGAGCCATGGCCGAAGAAGCCGCCACAAAAGAAGCAGAGGCTCC
A P R P 1 R A M A E E A A T K E A f A P
740
760
780
AGTGGGCTTTACCCCACCACAATTGGACCCAAACACACCTTCCCCAATCTTCGGIGGCAG
L 0 P N T P S P 1 F G G S
V G F T P P Q
800
820
840
CACCGG1GGGCTTCTCCGCAAGGCCCAAGTTGAGGAGTTTTACGTAATTACTTGGGAATC
T G G
L L R K A Q V E E F Y V 1 T W E S
860
880
900
ACCTAAAGAACAGATCTTTGAGATGCCAACTGGTGGTGCAGCTATTATGAGGGAAGGTGC
P K E Q
1 F E M P T G G A A 1 M R E G A
920
940
960
TAATTTGCTGAAATTGGCGAGGAAAGAGCAGTGTTTAGCACTTGGTACTAGGCTTAGGTC
N L L K L A R K E Q C L A L G T R L R S
980
、
f
1000
1020
AAAGTACAAGATTAACTACAGGTTTTACAGGGTGTTTCCTAATGGTGAGGTTCAATACTT
K Y K 1 N Y R F Y R V F P N G E V Q Y L
1040
1060
1080
GCACCCTAAGGATGGTGTGTACCCAGAAAAGGTGAACGCTGGCCGTCAAGGAGTTGGACA
H P K 0 G V Y P E K V N A G R Q G V G Q
1100
1120
1140
GAACTTCAGATCCATTGGTAAGAACAAGAGCCCAATTGAGGTCAAGTTCACTGGCAAACA
N F R S
1 G K N K S P 1 E V K F T G K Q
1160
1180
1200
AGTGTATGATTTGTAAGCTGATTATGGTTTTTTGTGCCTTTTCATGCAATGTAATGAATT
V Y 0 L
総
1220
1240
TGTGATTATTTAGTGCATCGTTTCCTGTAATTTTATTTGCCACTACAAATACCGCAT
L阿 川AXYaOC印)
Lp州
AXYaOC
1
2
)
L(Y<心C17)
関与1. PSI-D2をコ.ドす るps
aDacDNA灼
.
ン
、 yaDC12，yaDC17，yaDC60の出法配列
これらの灼.
ンはt
・
ハ7
'
7
7 してお り、各クコ.ンのぷ端を!叫に示した ，yaDC60については3
'末端
か ら約200bpsの領域につい て の み 出~~t'1ê9IJ を決定し、 3'末端のみを I~I にノJミし た. 塩基配
ダIJ から 演縛 され る 7 ミ/ 円安 配ダIjを F に 示した . 矢印は7'ロセシンク •
1
8
-
i
f
l
W
Lをぷす .
H
H
H
X
E
X EH E
3
k
b
p
一
ト 一→
A円
A
m
'
s
'
A
T
G
O
.
5
k
b
p
図2・2.psaD
bを含むゲ/ミリクロー
ン
y
aDG20の制限静ぷ地図
H，
X，
Eは それぞれHi
n
dI
l
I，X
bal
，Ec
o
R
l
の制限静ぷ部位を表す
日く喰りつぶした領域が
r
ps
aD
ac
DNAと
ハ
イ 7け.イス.した .矢印で示した領域の塩基配列を決定した.灰色で閉われ
た所に PSI-Dl
のがj邸宅休タンハ.ク質が J-ト.されている .
1
9
-
ー1
6
9
7
A
A
G
T
G
T
A
A
T
T
G
A
T
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C
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ー1
6
0
7
AATATAATTTπTAAACAGTATITAT
打A
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1
5
1
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4
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3
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T
品
9
7
7
、
r
G
T
C
A
G
T
T
T
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図23
.PSI
Dlをコ.ドする ps
aD
b
.
遺伝チの胤法配列
・
塩基配列から演縛される 7
ミ
/椴配列を下に示した .PSI
Dl成 熟タ
ン，'
} ク質の N-末端 7
ミ/酪配列
を波線で示し た. 黒 い三 fCJ で、示 された ~ii '
1j
開始点を+1とした.臼ヌキの三 f
{
1は7'うイマ"伸長法
(
図 24
)で ぶ れ た 弱 いハ
.
ン
ド に対応している， GT-1ホ，1
7
^(
G
r
c
c
nc
ta
，
.
l1
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)、 TGA-la
結合同じ
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K
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iandChua，1
9
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)、 GATA
ポ リス (
CaS
L
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s
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n
ac
ta
，
.
l1
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)、 GrobとS
t
u
b
c
rによる LRE
(
1
9
8
7
)をそれぞ、れa
，
b，c，dで示した， Rl，R2，R3は繰返し配列を示す .
n
2
1-
fヘ)
0
/
い ite
PSI D1
PSI-D2
巴
:山国三四国問団山
1'
l
'
55
'I
VEKAQ~ ATKEAE
IPA
IAPVGFTPPQLDF
ll
sTPSP1FGGSTGGLLRKAQ川DI
EFYV1TW
50' ト
ー -EE，AJATKEAEトI
APVGFTPPQLDl
FN
I
TPSP1FGGSTGGLLRKAQ川E
I
EFYV1TW
109' ESPKEQIFEMPTGGAAIMREG
同NLLKLARKEQCLALGTRLRSKYKINYRFYRVF
99' ESPKEQIFEMPTGGAAIMREG
凶NLLKLARKEQCLALGTRLRSKYKINYRFYRVF
同GRQGVGQNFRSIGKNKSPIEVKFTGKQVYDm
163' PNGEVQYLHPKDGVYPEKVN
153' PNGEVQYLHPKDGVYPEKVM~GRQGVGQNFRSIGKNKSPIEVKFTGKQVYD札 |
図2・4
.P
S
I
D
lとPSI-D2
のアミノ酸配列の比較
両者の聞で異なる 7U酸残基を枠で囲った. ハ
サ ミは7'ロ
セ
シ
ンク・部位を示す.
2
2
-
印
心
----﹀
﹄
﹁
に
P
・
-eh2i一
ー :ー.唖:4
J
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や1
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令
9
・
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ー
雪・
I
ATG
関25， 7
'7
1マ
・
7'うイマ.伸長反応、を行ったサン 7 ル (P) と psaDbのシークェンスリ・ -(CTAG) を、 5 ， 3~るホ. リ 7ク リル7 ミド IBM尿
2Rゲ)~の電気泳動にかけ、 t- トうシ' tク，
7
7ィ.を行った.
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s
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，
Ci
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Q~
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図2・
6
.p
s
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I
X
J
)ゲ
/ミリササ.ンプロ'lT
イ
ン
グ
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核 DNAの 化に用いた制限酵素を各レ.ンの上に示した.消化後、電気泳動を行い、ナイロン肢
r
に Ol
'
T
イ
ン
ク.
し
、 p
s
aD
a
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'・
ロ7 とハイプリタ.イス.させ、 t
;
-ト
う
シ'
t
;
グ
う7
ィ.を行った.
2
4
-
第 3章
ps
aD
多重遺伝子族の組織特異的発現
要旨
p
s
aD
a
とp
s
aD
b
のmRNAの日比を、えき J
F、必菜、成然、」点、花芽、制について RNasc7
'
ロテクション法を用いて調べたところ、 p
s
aD
a
， psaDb ともに桜には作在せず、他の~官において
はp
s
aD
bより p
s
a
ぬの fjがmRNA量が多かった .しかし、 p
s
aD
amRNAに対する p
s
aD
bmRNA
の註比は 一定 ではなく、えき芽、若葉、 J点菜と葉の成熟に fl~ ってその比は、 1/8、 1/7、 1/3
と増加していた .p
s
aD
b、p
s
aD
必伝子の産物でトある、 Ps
a
D
a
(PSI-D2
)
、PsaDb(PSI-D1)
タ
ン
/
，
'
ク
質の虫比を免疫
r1:7テイング 法により調べたところ、いずれのタンハ.ク質も桜には存在しない
こと、そして若葉から成策への成熟に伴ってPsaDb
/
P
saDa比 (
P
S
I
D
l
jPS
I
D2
比)はむしろ減
少していることがわかった.これらのことから、 p
s
aD
a
，p
s
aD
b
遺伝子の発現には RNAレ
ベル(転写速度、 RNAの安定性)とわハ.ク質レヘ.ル(翻訳速度、タンハク質質の安定性)の双んで異
u
なる指 御を受けていることが明らかになった.
序
.s
y
l
v
ωl
r
I
S
の半数体ゲノム当たり 2コピ.の遺
第2草において明らかになったように、 PSI-DはN
伝子によってコードされており、 2種類のり型タンハ.ク 質を生じる.この PSJ-D~ ンハ. ク質の多型は
単細胞性のうン藻では見い出されておらず (
R
c
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l
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ye
ta
，
.
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8
8
;Muhe叶10ffCla
，
.
l1
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)、多細胞
生物である高等植物独
n
の現象であると巧えられる. 2
相知の PSI-Dが:将択一的に PSI桜
合体に取り込まれると、結果的に 2
積類の PSI複合体が生じることになるが、 PSIの多引の
出現は他物の多細胞体制と関連があるのだろうか?第 3市では、この 2純郊のり型PSJ桜合
体の植物イ1~1 体内における分布を見るために、いろいろな組織で‘のpsaDP7Æ物の蓄積砧を遺
伝子ごとに調べた.その結果p
s
a
ぬと p
s
a
D
b
(
!
)発現は異なる機併によって制御されているこ
とがわかった .
2
5
-
材料及び方法
RNAと7
'7Mド股タンハ.ク慣の約製
0
温室 (
2
5
C
)で育てた N
.sylv
ω
，σi
s
のえき;1
ミ
.
(
0・3cm)、符葉 (
5・10cm)、j
点*(20・30cm)、茎、イヒ
芽、根、を晴れた日の民過ぎに収穫し、 P
i
∞hul
1
aらの方法 (
P
i
e
c
h
叫1
ac
tal
.
.1
9
8
6
)により全
RNAを抽出した.また、7"7
スチト膜画分については第 1章と同様の }j法で約製した.
RNase7
'ロ
テ
ク
シ
ョ
ン
法
p
s
a
ぬについては ATG開始コド ンから下流の 18・279bpの領域を、 p
s
aD
b
については 18・263bp
n
の領域を p
B
1
u
e
s
c
r
i
p
t
ヘ・クトにサ 7
・灼ーニングし、
白
α
l_
l
2
p]UTP
の存在下で T7RNApo1ymerascによる
v
i
t
r
o
の転写反応、を行い (A凶 u
b
e
1e
tal
.
.1
9
8
7
)、それぞれの mRNAに相補的な町ぜA7
'u-]'を
作成した.
RNase7
'
ロ
テ
クシ
ョ
ン7
'
7セ付ま RPAII
わ
ト (AmbionInc，
.Tcxas.USA) を月jいて説明 l
'
fに従って行
，
った， RNaseA
!
f
l
で消化したわ7'ルを 6%ホ
.リ
7
ク
リ
ル7
ミ
ド IBM
尿素ゲ ルの氾気 7
k動にかけ、
t
-1
-7
シ
'
t
グ7
7ィーを行った。それぞれのハ・ンドの政射活性は、 AMBISRadioana
J
y
t
i
cIm
a
g
i
n
g
System(
K&M.
T
o
r
r
a
n
c
c
.
CA.USA)あるいは、 F吋
以 BAS2000(
F
u
j
iPh
oωFi1m.
Tokyo)により
解析した ， psaDa と psaDbに対する即~A7' ロープは、 1 分子当たりそれぞれ61 と 55個の [α_ l2 Pl
UTPを含んでいる.従って p
s
aD
amRNAに対する p
s
aD
bm町~Aの比は次の式に従って算出
した.
Db
/Da
=
(
6
1
/
5
5
)
x
(
c
p
mo
fDb-b
a
c
k
g
r
o
u
n
d
)
/
(
c
p
mo
fDa-b
a
c
k
g
r
o
u
n
d
)
免疫7'Dl
'1
イ
ン
グ
7
'7
J
.
fド膜標品のタンハク f
l濃度を BCA法(Smithc
tal
.
.1
9
8
5
)により定はした.各組織より得
た7'7
'
J.，fド膜標品を、タンハク質量を合わせて LDS・PAGEにかけ、第 1f
t
1
.
とl
r
i
J
.
t
'f<の方法で免疫
7
'
ロ 7テインク.を行い、 PSI-Dタンハ.ク質を検出した.
ー2
6
-
結果
p
s
a
ぬと p
s
a
D
b
(
l
)
発現に組織特異性があるのかどうかを，澗べるために、 N
.
s
y
J
v
何回s
のえき
芽(
03cm)、符策 (
510cm)、成葉 (
2
030cm)、菜、花茅、掛から全 RNAを 1
1
1
1/
1
¥
し
、 p
s
aD
a
、
・
・
・
p
s
aD
bに特異的な RNA7ロ7 を用いて RNa
s
c
7ロ
テ
ク
シ
ョ
ン7
1f.イを行い、各々の組織中での 1伝'
I
J
産 物 の 苔 般 を み た (r
;
>
(
1
3・1
) ，p
s
a
助
、 p
s
aD
bともに根では発現しておらず、，JIj者の転写産
物は緑色組織でのみ検出された， mRNAが検出された全ての組織では、 p
s
aD
amRNA
の)
j
がp
s
aD
bmRNAより i
止が多く、どの光合成組織においても PSID2を合む光化学系 Iが巨な
n
州7'であることが示唆された .各々のハ
・
ン
ド を定量的に解析した結果、 p
s
aD
am
肘叫に対
する p
s
aD
bmRNAの世比は、茎と花ぷとではほぼ 同じ仙(それぞれ 0.18と0.
17
)を示した
が、集では成長に伴って 0
.
12から 0
.
3
6へと明加していた.
図3・1
で見られた mRNA:W:の変化がタン}
¥
'ク賀世にどのような影響を与えているのかを調べ
ω
るために、ホウレンソウの抗 PSI抗体を 用 いて免疫 7附インク.を行った(図 3・2
}.p
s
励、 p
s
aD
翻訳産物である PsaDa(
PSI
D
2
)、PsaDb(
PS
I
Dl
)はいずれも桜からは検山されず、その他の
組織では両方のタンハ
.
ク質が蔀積していた，
5菜から成必への成熟に伴って PSI-D1は減少
し、同Il寺に PSI-D2 は増加していた.従ってこのとき PsaDa~ ンハ.ク 質 (PSI-D2) に対する PsaDb
p
ンハ.ク質 (
P
S
I
D1)
の量比は減少しており、 RNAレヘ.ルとは逆の傾向が見られた.
考察
y
J
v
ωt
.
r
i
s
のゲノム中に 2コヒ.のp
s
a
助 吋f
{
Eすることが明らかになり、コピ r
l
I
Jでの機能、発
N
.s
現様式に差異があるのかどうか、という疑問が生じる.本市ではそれぞれの遺伝子コピ.で
の発射線式について調べたところ、民、~、花芽のどの光合成組織においてもどちらか
一方の 3ピ.のみが排他的に発現しているということはないことがわかった.しかし、民の
成熟に伴って psaDamRNA に対する psaDbm悶以の昆比はiMJJIlし、また Irij 時に PsaDa~ ì/\' ク
質 (PSI-D2) に対する PsaDb~ ン/\'ク質 (PSI-Dl) のほ比は減少してい る.以上のことから 2つの
2
7
-
コピ.の発現制御機構はRNAI
t
へ
.
ルと
タン
ハ.ク質 レ
ヘ
.
ルの￨
山
j
I
jj
で、
異なっていると巧えられる(以下参
!
照
)，
*の成熟の過程で、 psaDa のrnRNAht は n~でM も多く、その翻訳版物は成熟葉で訟も
多量になる.この /
H
梢隊式は、 p
s
a
仇のタンハク '
f
1
産物はいったん PSI
似合体に組み込まれる
と策の成長の過程を通じて安定に保持されると巧えれば簡単に説明することが出来る.
しかし、 p
s
aD
bのmRNAとわ/
，' 煩 の 都 % 以 は も う 少 し 桜 雑 で あ る ， p
s
aD
brnRN
Aのh
lは
f
t
n
若葉でも成業でも '
1
，
5
'いレヘ }
レに保たれているのに対して、タンハ.ク'
f
1 物 (PSI-D1) の相体h
l
は若葉から成*へと人-きく減少している.この原因として与えられるのは、葉の成長に
n
伴って、 psaDb mRNAの翻訳活性が抑えられるか、あるいは PsaDb~ ン/，' ク質 (PSI-D1) の安定
性が低下するということである.翻訳制御や翻訳後の制御は環境の刺激に対してよりぷ
，1
9
9
1
)、p
s
aD
bは何らかの環境からの刺激に対し
早い応答を行えるが(ThompsonandWhite
て迅速に誘導されるのかも知れない ， p
s
aD
多前遺伝子族の発現解析を進めることで、光
Q
H
与される.
合成装置の多機性の*たす役割について新たな知見が得られることがJ
2
8
-
hpdp
f
六
~-
_(J-
_(
J
-
.
0-
h
s'
.0- 1
)
-
:
7 、
: ti
0
(
)
E可 針 ( ¥ . 、
:
' ~
，、‘-~b
、
、
、、、、¥.! .
'
"
2、2
1、1、2
、
、2
、3
、句
~-
・
ー
ー
・
・
~・
Da
Db
。0.5
~ 0.4
。
0.
3
a
。0.2
帽
0.1
0.
0
関与1.峨々な器Hで
‘
の psaD
aとps
aD
b
の
メJ
fン
シ
.
ヘRNAの占有i
図に示された組織から抽出した全RNA22μgに対して RNasc7
'0
7
7
1
3ン
7
/セイ;を行った .7
'07
・
にはpsaD
a
または ps
aD
b特児的な相補鎖 RNAをJfJいた. 3
[
1
1
)の実験を行い、 psaD
amRNA~こ
対する psaD
b
の比の平均{iI'(と際幣制ぷを
n出した(下のハ・ネル)
2
9
-
n
~ s
'
_
c
J均
_~()
s
'も
()
-
I
，
、
‘
，
、
‘
'
込 3
4J
ミー
.
t
一
三
‘
'
'
j
b
と と と 言 語F25 J
手
術
f
b
fbdf s seJ
4
き ぞ 要 。f
苛
苛
01
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・・
語
圏
ー
ー
-
02
凶3
2
.
様々なおむでの P
S
I心 1
(
p
s
aD
b
産物)と PSI-D2(ps
aD
a
産物)の l
Hb
'
1
l
割に示された組織から得た7"7
ス
チ
ト
.~~ンハ・ク質 (PSI-Dl の検出には 225ng、
用いた)を、抗ホウレンソウP
S
I
抗体に対して免桜
PSI-D2 には 45ng を
rD7テイング を行った.約製した PSI原品を同時に
免疫プロッテイングし、作イソ出を同定した (
P
S
Iのいン).
3
0
-
「
第 4章
光化学系 I遺伝子群の光応答
要旨
N
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
のグ リ
ニング時での PSI-AIPSI-B，PSI-C，PSI-D，PSI-E，PSI-H，PSILのタン1
¥'ク
質量
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
の黄化芽生えからはこれらの
の変化を抗 PSI抗体を用いて調べた.その結果、 N
PSI
サプにけ群は検出されなかったが、白色光を連続照射すると照射開始後 6時間から72時
間まで各サ iユ
ニ
ッ トは協調的に噌加していった.このときの mRNA虫の変動を紘遺伝子で‘あ
るp
s
a
D
a
，p
s
a
D
b
，p
s
a
E
a
，p
s
a
E
b
，p
s
a
H
a，psaHb
，p
s
a
H
cに特異的な7'ロゴ を 用 い て RNasei
ロ
テ
ク
シ 3ン法により解析した.質化芽生えにおいては調べた全ての mRNAはある程度蓄積して
いるにもかかわらずそれらのタンハ.ク質産物は検出されなかったので、これらの遺伝子発現
s
aD
b
を除
には、翻訳あるいは翻訳後の段階で光を要求することがわかった.光照射後、 p
s
aD
bのみ照射開始後
いて光照射開始後 1時間まで、は mRNA量に変化は見られなかったが、 p
1時間で、すでトに mRNA
量が増加しており、素早い光応答性を示した.調べたすべての遺伝
子において照射開始後 1時間から 6時間までほぼ直線的に mRNA虫が増加し、その後 mR
l
'
マA
量は複雑に増減していった.
・
2カ月の幼植物を暗所に 5日間置き暗順化させた後、白色光を連続照射し、
矯 種 後1
mRNA
量の変動を RNaseiロテクション法を用いて調べた .p
s
aE
bは光応答を示さなかったが、
p
s
aD
a
，p
s
aD
b
，p
s
a
E
a
，p
s
aH
a
，p
s
aH
b
，p
s
aH
dとついてはグリ・ニング H
寺と同じ特徴を持つ変動曲線
J
慎化させた緑植物とで同綴の光制
が得られたので、これらの遺伝子群は黄化芽生えと階I
御を受けていることが示唆された.
序
被子植物の黄化芽生えには光合成を行う能力りないが、光の下に I
嘆されると PSI活性、
S
I
I
活性が現れ、その後明反応の電子伝達鎖が完成し (
W
e
l
l
b
u
r
nandHampp，1
9
7
9
;
そして P
，
.
l1
9
8
9
)、次第に光合成能を発達させる.このグ り
ーニングの過程で7'7M
ドに含まれ
O
h
a
s
h
ie
ta
3
1
-
ぺ
へ
るタンハ.ク質の組成は大きく変化するが、光合成に関わるタンハ.ク質としては質化芽生えにす
でに存在するものと、光照射後に出現してくるものとがある (
H
e
r
r
m
a
n
nc
ta
，
.
l1
9
9
1
)
.
葉緑体ゲノムにコ.ドされた P7007ホ.~ンハ.ク質である PSI-AjBは、オオムキ.の黄化芽生えには存在
せ ず 、 光 照 射 に よ り そ の 翻 訳 が 活 性 化 さ れPSI-AAが苔秘していく (
V
i
e
r
l
i
n
ga
n
dA
l
b
e
r
t
e
，
1
9
8
3
;Kreuze
ta
，
.
l1
9
8
6
;K
l
e
i
na
n
dM
u
l
l
e
t
，
1
9
8
6
)
. しかし、双チ長植物においてはインゲンマメと
ホウレンソウの質化芽生えにはすでに相等量のPSI-NBが存在するという N
c
c
h
u
s
h
t
a
iとN
c
l
s
o
nの報
告(
N
e
c
h
u
s
h
t
a
iandNelson，1
9
8
5
)がある一方で、黄化芽生えからはPSI-AAは検出されないと
，
.
l1
9
8
6
)、ホウレンソウ (He
汀 m加 ne
ta
，
.
l1
9
9
1
)を材料に用いてなされ
いう報告がエンドウ (
T
a
k
a
b
ee
ta
ている.これらの報 告は一見矛盾しておりグリ.ニング時における光化学系 Iの挙動を理解す
る上で混乱を生じている.こうした混乱が解決出来ない原因のーっとして挙げられるの
は、それぞれの実験系でのタンハ.ク質の検出感度が示されていないために、これらの報告が矛
盾しているかどうかが実際には明らかではないということである.従ってグリ.ニング時にお
ける PSI-NBのタンハ.ク質量の変動を定量的に解析することが必要であると思われる.
核にコードされたPSI
サiユニ外の量がグリ.ニングの過程を通じてどう変動するかはPSI-Dを代表
としてよく調べられている.このサプユニ 7トは黄化芽生 えには存在せず、光照射後初めて現
れる (
N
e
c
h
u
s
h
t
a
iandN
e
l
s
o
n，1
9
8
5
;Takabee
ta
，
.
l1
9
8
6
;I
w
a
s
紘i
e
ta
，
.
l1
9
9
1
;Herrmanne
ta
，
.
l1
9
9
1
，
.
l1
9
9
2
)
. このとき核遺伝子である p
s
a
D
，p
s
a
E
，p
s
a
F
， psaG
，
ps
aH
の転写産物が光
;
P
a
u
n
c
ze
ta
，
.
l
照射後大きく増加することが/ーザン法による解析の結果明らかにされている (
B
r
u
n
n
c
rc
ta
1
9
9
1
;F
l
i
e
g
e
rc
ta
，
.
l1
9
9
3
)
. これらの遺伝子は高等植物においては一般に小さな多重遺伝子
族を作っている (Heηmanneta
，
.
l1
9
9
1
; Obokataeta
，
.
l1
9
9
2
;Obokatactal
..
1
9
9
3
)が
、 B
r
u
n
n
e
rら
とF1i
e
g
e
rらの研究ではその点は考慮されていない. しかしそれぞれの多量辺伝子族を構成
する各遺伝子コピーのうちどのコピ.がク 1ーニング時に光誘導を受けるのかを調べることは、
PSI
生合成の分子レヘルでの調節機構を解明するためには不可欠である.そこでこの章では
グリ.ニング時における PS
I
遺 伝子群の発現をそれぞれの遺伝子コピーごとに定量的に解析し
た.
3
2
-
材料及び方法
盤飽盆主主
0
植物の育成，光/陪処理は 25
Cで‘行った .N
.sylv
ω凶 の 柏
fをぷ面滅菌し、
1
/
2
xM
S培 地
(0.8%寒天)を含む r 刀打リシャーレ』こ燭種し、発注促進のために蛍光灯の白色光 (70μElm 2 •
s
)を4
8時 I
I
I
J
J
照射して、その後完全暗黒下に 5円聞置いた .
1
l
tじた此化芳生えに蛍光灯の白
5
0
μE
l
m2・
s
) を 連 続 照 射 し 、 光 照 射 後 の 隙 々 な1
与11)に収機し、前ちに
色光 (
rうスチド脱画
分をf111
製した(以下参照) .RNA
抽出のためには、 シャーレにlI
t
'桜液体型ぷを注ぎ、込み凍結し
ぺ
た牙生えを収穫し、 -800C~こ保存後 RNA を抽出した .
N
.
s
y
l
v
<
ωt
r
i
sは発見Zのために光の前照
射が必要であり、 2
4時 間 の 前 照 射 で は 50% 以 下 の 発 牙 本 し か 得 ら れ な い . 緑 菜 で の 光 応
培地上で、 L16ρ8
の明日百周 J
U
Jで 12カ 凡 程 育 成 し ， 暗 所 で5日間
答を比るためには、 1/2xMS
・
暗j
眠化させた後，黄化芽生えに与えたのと同級にして光処Jl]!を行った.
免疫
rD}テインク.
r7
]
.チド朕両分の精製は第1章 と同 様 の 方 法で
ト行 っ た . r
7Mト.濃度を血球計算板を用い
て 算 出 し 、 同 数 の 7以 外 よ り 得 た 膜 様 品 に 対 し て LDS-PAGEを行い、ニトロセルロ.ス朕
(Amcrsham，
HybondECL)に
n
r01トし、オオムギの PSIに対するウサキ.抗体、
h
o
r
s
c
r
a
d
i
s
hp
e
r
o
泊d
a
s
e
際 議proωinAとj
順 次 結 合 さ せ た . そ し て 化 学 発 光 に よ り (Amcrsham，ECLW
e
s
t
e
r
nb
l
o
t
t
i
n
g
k
i
t
)X線 引 川 を 感 光 さ せ PSI
サプユニ川 を 検出 し た . X
線 7ィルムへの偏光は 15
秒から一夜の間行
った.科ハ・ンドの強度を積分子ンシトメ小 (
M
o
l
c
c
u
l
a
rDynamic
s
，Modcl300S
XE
)
を用いて測定し
た.希釈系から検白線を作成し、光照射を 72
時間行ったよ手作うえでのそれぞれのタンハ
.
ク質 量
を 100%として相対量を算出した.
RNAの1
1
1
1山
~紡組織2・3gを Mikro心ismembrator I
I(
B.BraunJapanI
n
c
.，Tokyo)を用いて破砕し、 AGPC
法(
C
h
o
m
c
z
y
n
s
k
iandS
a
c
c
h
i，1987) により全肘~A を抽出した後、 7 エ J-ル/クロロホ)1;)"拍出を 3 回繰返
3
3
-
し、さらに リ
チ
ウ
ム沈 澱 を 行 い 全 RNAを精製した.通常、 2
3
g
の組織から 1
0
05
0
0
μg
の RNAが
得られた.
RNAase7
'
ロ
テ
ク
シ
ョ
ン7
7
'
イ
セ
町ぜA7'ロー7'作成のための鋳型DNAは以下の様に作成した ， p
s
aD
切，
p
s
aD
bについては第3
章
にすでに記載した ，p
s
a
E
a
，p
s
aE
bc
DNA(
O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
l1
9
9
4
)のATG開 始コドンの +20から +265
bp，+18から +335の 領 域 を そ れ ぞ れpBl
u
e
s
c
r
i
p
t
I
I
へ.げ.に挿入した.またp
s
aH
a
，p
s
aH
b
，p
s
aH
c
ヘ
f
に つ い て は +1052
か ら +1261，+2117か ら +2321，+
1251か ら +1376の 領 域 (Nakamuraand
9
9
4
)を そ れ ぞ れpBl
u
e
s
c
r
i
p
t
I
I
ヘ
'H“に挿入した.これらの鋳 型 DNA7
'7
ス
ミ
ド を適 当
Ob
o
k
a
t
a，1
α-32P]U
TPの 存在 下 で T7または T3RNAp
o
l
y
m
e
r
a
s
cを用
な制限酵素を 用 いて切断した後、 [
nv
.
i
仰の転写反応を行い、それぞれの遺伝子 に特異 的なりチセ
ン
ス RNA7
'u
-7
'を作成した
いて i
(Aωubele
ta
，
.
l1
9
8
7
)， 芽 生 え よ り 得 た 全 RNA10
開と 1
x105cpm
の7'07をハイプリ.イ
ス
.さ せ
・
RN
a
s
eA庁 Iで消化後、 8
M尿 素 / 6%
ホ
.リ
7
リ
クl
げミドゲ ル中 で 電気 泳 動 し た (A
凶 u
b
e
le
ta
，
.
11
98
η
. 泳動後ゲ ルをふ トラシ・オグう 7イーにかけ、各ハ.ンドの放射活性を F吋ixBAS2000
(F吋jP
h
o
t
o
Film，
Tokyo) を用いて解析した.
結果
PS
I
サ
7
'
ユ
ニット群のグ リ
.ニング時における光誘導
黄 化 芽生 えに 白色光を連続照射し、 PSI
サプユニ yトの蓄積量の変化を免疫7'0'
7
ト
法を用 いて
)，用 い た 抗 体 は PSI
-AIB，PSI-C，PS
I
D，PSI
-E，PSI-H，PS
I
-Lと反応するもので
調べた(図41
・
ある， PS
I
D，PSI-E，PSI-Hの り 型 は電気泳動の移動度の差 から区別した， PS
I
L
サプユこけ に
は PSI
L1とPSI
L2の 2種 類 のり 型が あ る が (
O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
l1
9
9
3
)、 こ の 時 の電 気 泳 動の 条 件
で は 区 別 出 来 な い . ま た PS
I-H1タ
ンJ
¥
'ク
質 はPS
I
H2タ
ンJ
¥
'ク
質の前駆体であると考えられてい
る が(
Nakamuraa
n
dObokata，1
9
9
4
)、 微量 にしか存在しないために検出 されなかった.
3
4
-
図4・1
(
A)では抗体の力価によって6
2
4時間光照射の標品から PSI
ザプユニけが検出され始め
ているが、 X線7イ
川への露光時間を 長 くとることによって、 6・12時間光照射の標品から も
全てのサプユニ 7トが検出された.その結果を図4・
1
(
B
)に定量的に表した.黄化芽生えからは
どのPSI
サプユニ 7トも検出されなかった.このとき PSI-NBについては72時間光照射した標品
の3.6%のタンハ.ク質があれば十分検出されており、1.2%のレヘ
}
レで検出不能 になった.従って
このときの検出限界は 2% 程度であると考えられる. 同様 に他のサプユニ外 についても検出
限界は72時間光照射した標品の2-7%の間であったので、員。化芽生えにおいては多くても
、
f
l
それ以下の量であることが明らかになった.
調べたすべてのPSI~ ン}\'ク質は光照射後大きく増加していき、 PSI-DやPSI-Eサプユニ 7 トのな
かで光の影響を受けないようなイソ型タンハ.ク質はなかった.しかし、光照射後6時間ではPSI
D2を含めてほとんどのタンハク質 はまだ72
時間光照射した標品の 8
%以下 であったのに対し
て
、 PSI-D1だけは14%にまで増加しており 早い光応答を 示し た(図4・
1
(
B))，
こ の と き の 転 写 産 物量 の 変 化 を 核 遺 伝 子 の p
s
aD
a
，p
s
aD
b，p
s
a
E
a
，p
s
aE
b
，p
s
aH
a
，p
s
aH
b
，
p
s
aH
dこついて調べた(図4・2
)，なお p
s
aD
a
，
p
s
aD
b
のわJ
¥'ク質産物はそれぞれP
SI-D2，
PSI-Dlで
ある (
2
寧参照)，またp
s
a
E
aにエトされた前駆体タンハク質 には 2カ所の 7 ロ
セ
シ
ンク.部位 があるた
めに、この遺伝 子p
s
a
E
a
から N-末端部分が 1
ミ
ア ノ酸ずれた 2種類のタンハ・ク質P
S
I
E
1とPSI-E2
が
生じると考えられている (Obokatae
ta
，
.
l1
9
9
4
)，同様に不均一 な7'ロセシンク
.の結果p
s
aE
bから
{
ヘ
P
S
I
E
3とP
S
I
E4とが 生 じると考えられている (
O
b
o
k
a
t
ae
ta
，
.
l1
9
9
4
)，p
s
aH
a
，p
s
aH
b，p
s
aH
c
の
成熟知ハ.ク質のアミノ酸配列は同一であり、これらの遺伝子のタンハ.ク質産物 はPSI-H2
であるこ
とが強く示唆されている (NakamuraandObokata，1
9
9
4
)
.
調べた7つの遺伝子全てについて黄化芽生えにはすでにある程度の mR
1
'
ぜAが蓄積してい
た(図 4-2(A))，またすべての転写産物は光照射後増加しており、 p
s
a
D
， p
s
a
E
，p
s
aH
の多重 遺
伝子族の中で光応答を 示 さない遺伝 子 はなかった.増加の傾向はp
s
aD
bを除いてよく似て
いた.すなわち、照射後 1 時間まで、出n肘~A量 に変動は無いが、 1 時間後から 6時間後にか
けてほぼ直線的に増加していった.その後12時間 後にやや減少した後 再び増加し、 72
時
間後にはまた減少した ， p
s
aD
bについては 1時間後にすでに転写産物 が2
.
3倍に増加してお
3
5
-
り、京早い光応答をぶした.
グリーニング時のタンハ.ク 1
1
11!
とmRNA量の変化を科サプユニ 7トごとにまとめた結果を凶 4・3に示し
D
， psa
E
， psaff
のI
'
¥
d'
1
1
-産物は光照射後 1
1
1
，
y
l
l
¥Jから増加し始め、 W
I
J
J
I
Iは6
1
1
寺
山j後まで続
た.psa
き、その飴nRNAレヘ.ルは彼雑に増減する(1ヌ1
4・3
R
)
. タンハ.ク質レヘ.ルでは PSI-D，PSI-E，PSI-Hを
含む 6つの PSI
サプユニけはすべて 6時間後から顕著に崎加し始め、サ 7ユ
ニ 7ト
[
/
l
j
で・協調して 72時
間後までほぼ直線的に増加している(図 4
3
A
)
. mRNAレ
ヘ
.
ル
、
タ
ン
ハ
.
ク1
1レヘ.ルともにサrユ
ニ 7ト
間
でよく調和のとれた光局導を受けており、反応がとりわけ素 早しオ?にけや遅い ものは見
出されなかった.
パ
時適応、させた緑菜での PSIサ
プ
ユ
ニ 7ト群の光応答
次に緑葉での PSI
サプユニ 7トの咳遺伝子訴の光に対する反応、を.R.た.情純後 1
2ヵ月の幼航
物を暗所に 5日1
8
15
2いて階1
)
固化させた後、 j
l
J
び白色光を連続照射し、 psaD
a
，psaD
b，ps
a
E
a
，
ps
a
E
b
， psaffa
，psilib
，psilic
のmR
1
吋A量の笈化を RNase70テ
ク
シ 3ン法を用いて調べた(図 4・4
)
.
貨化芽生えの時の反応とは異なり、 psaEb
のI伝写産物はほとんど光の影響を受けなかった
が
、 psaEaは他の遺伝子と同様に光応答を示した.またpsaE
bを除く 6
つの泣伝子は黄化芽
生えでの場合と同じ特徴を持つ蓄積様式をポしたので、これら 6つの泣伝 fの光応答には
政化芽生えの子必とIlrT
I
J
民化させた築で共通の制御機構が働いていることが示唆される.
考察
N
.syJv
釘 t
r
i
s
の質化芳生えには PSI-Dサ7ユ
ニ 7トは検出 されず、光照射後附加していった.こ
れはホウレンソ
ウ
、 オ
ー
ト
ム
ギ
、 イ
ン
ゲ
ン
マ
メ(
N
e
c
h
u
s
h
t
a
ia
n
dNclson，1
9
8
5
)、 エ
ン
ド
ウ
、 小ぷ (Takabec
ta
，
.
l
1
9
8
6
)、わウリ(I
w
a
s
a
k
iCla
，
.
l1
9
9
0
)を材料に行った結果と一致する.このとき P
S
I
A/P
SI-B
サ7
1ニ
7ト
も PSI-Dと同じ諮前線式を示した .この 結果はTakabeら(
1
9
8
6
)やHcmnannら(
1
9
9
1
)の報
c
c
h
u
s
h
t
a
iとNelsonの報告 (
1
9
8
5
)とは矛盾している.この不一致の原
特とは一致するが、 N
i
S
h
e
i
物の武化芽生えに P
S
I
A/P
SI-Bが存在するとい
因については明らかではないが、双子 J
3
6
-
う報告は今のところ 1
つの研究室からのみ促 1
1¥されていることになる.本市での結果と考
え合わせてみても、 N
c
c
h
u
s
h
t
a
iとNelsonの紡民は再検討を要するのではないかと思われ
る.本章においてはさらにサ r~ニ 7 卜PSI-C. PSIE
.PSI-H.PSI-LもPSJ
DとI
r
;
Jじ指積様式を示
すことが明らかになった.このことから、グ リ
.
ニング時における光化学系 Iサプユニ 7ト
群の占
有i
は非常に協調的に行われていることがわかる.
Jf{化芽生えには PSI-D，PSI-E，PSI-Hの mRNAはある 程度作街している(凶 42
)のでこれら
・
のサ
rユニットの訴秘には翻訳そして/あるいは翻訳後の段階で光が必要であることがわか
る.この現象の1 つの ~rVJ としては、民化 ..*'1: えで、は PSI-A/PSI-B は作イピしないが、このと
き他の PSI
サプにけが合成され 7以外.へ巡ばれたとしても PSI
桜代体に組み込まれないの
で蓄積されずに分解されてしまうということが考えられる. 夕刊 7
1
.
ル
タ
ン
ハ
.
ク
質である PSIAJPSI-Bの蓄積には翻訳あるいは翻訳後の段附で光が必要であり、従って黄化芽生えでは
P
S
I
-A/P
SI-Bは仔花山米ない (
G
r
u
i
s
s
e
mandTonkyn，1
9
9
3
)、また P
S
I
A/P
S
I
Bが存在しない i
時
には他の PSI
サプユニ川は蓄積されずに分解されてしまう (
G
i
r
a
r
d
B
a
s
c
o
uc
ta
，
.
l1
9
8
7
;Smartc
t
，
.
l1
9
9
1
;GruissemandTonkyn
，1993
)という知見は前述の説明と矛応 しない.ただし PSI
-D，
a
a
PSI-E，PSI-Hの翻訳あるいは7
"7
スチドへの輸送に光が必要かどうかは駐在のところ明らか
ではない.
p
s
a
D
，p
s
a
E
，p
s
aH
はそれぞれ小さな多重遺伝 f族を形成しているが、光に対する応答は辿
伝子コピ.ごとに只なっていた .p
s
a
D
i
f
J
.伝子族のなかで、
はp
s
aD
b
が光j
必符が素早く(図 41
，4
・
2，4・4
) 、また p
s
a
E
i
1
1伝
・
f族の中ではp
s
a
助のみが緑葉での光応答がみられない(図4・3
).
PSI-D，PSI-E
サ7ユ
ニ yトのり型の量比の変動が P
S
I
7
吊性に対してどのような影響を 与えるのか
は現時点では明らかでは無い.しかしながら p
s
aD
.
p
s
aE
多重遺伝 f族のそれぞれの遺伝 f
コピ.は異なる挙動をしていることから、遺伝 fコヒーごとに異なる役 ;
l
i
j
￨
を引っていると忠わ
れる.
p
s
aH
遺伝 子発現の光応答性が、ホウレンソウのグ リ
ーニンク.時と mRNAの r
]
周変動とで他の PSI遺
伝子と比較して逝く、むしろ LHCI遺伝 fの応答と似ていることから、 P
S
I
-H(
S
u
b
u
n
i
tV
I
)
はPSIコ
7
複合体とわ汁との結合に関わるサプユニけではないかと Stcppuhnらは議論している
3
7
-
(
S
t
e
p
p
u
h
ne
ta
，
.
l1
9
8
9
;Golbeck，1
9
9
2
;B
r
y
a
n
t
，1
9
9
2
)， しかし一方で"
B
r
u
n
n
e
rらがホウレンソウのグリ.
ニング時の mRNA
量の増加を/・サ.ン法を用いて調べた実験では、 p
s
aH
はp
s
a
D
，p
s
a
F
，p
saGと比
べて特に光に対して遅い反応を示してはいない (
B
r
u
n
n
e
re
ta
，
.
l1
9
9
1
)
.p
s
aH
は高等植物で・は
単独コピ ーの遺伝子ではなく、ホウレンソウでは 2・
3コ
ピ
ー (He
汀 m釘 m
eta
，
.
l1
9
9
1
)、 N
.s
y
l
v
l
白 t
r
i
s
で、はお
そらく 3コ
ピ -(Nakamuraa
ndObokata，1
9
9
3
)あるので、7'ロ・
rに用いた遺伝子、用いた遺伝子
の 領 域 に よ っ て 同 じ 材 料 を 用いてもノインプ町テイングの結果が異なることは十分考えられ
る.上記の論文ではこの点について考慮されていない .N
.s
y
l
v
e
s
σ
i
s
の貨化芽生えにおいて
、
f
RNase7'ロテクション法を用いて各コピ ーごとに p
s
aH
の 発現を調べた結果(図 4・
2
)で、はp
s
aH
の光応答
がp
s
a
D
，p
s
aE
と比べて遅いということはなか った， PSI-H~ ンハ・ク質の噌1101" ターンについても同
様である(図 4・
1
).従って PSI-Hの 機 能 に つ い て の Steppuhnらの考察は再検討を必要とする
と思われる.
3
8
-
・
・
A
B
••
。 1224364872
80
HC30E国ω﹀
Z22
a
•••
一-P
S
I
A
lB
60
40
20
-4
ふ
る
争4
5子
:
;
:
;
4 36 4
8 60 72
12 2
万三
出IL2
hour
y PsトE
2
aaミPSI-
PSI
-C
100
さコOE司 副 ﹀Z22
('
ー-P
S
I
H
2
n
J
-
ー -PS卜C
nunununu
nO
作。凋件
孟
PSトA/B
100
・
一
6
ー
4 36 48 6
0 72
12 2
hour
100
P
S
ID
PSI
E
PSトし
PSI
H
80
︼
E
コO 何世﹀一戸田 一由﹄
60
40
20
一 一..
ー-PSI.
O
l
一一0
ー-PSト02
一一-0一-PSトLl/L2
0
4 36 48 6
0 72
4 36 48 60 72 0 12 2
4 36 48 6
0 720 12 2
0 12 2
hour
hour
hour
。
2
4 36 4
8 60 7
12 2
hour
S
I
タンハ.ク質の蓄積
図 41
. グリ.ニング時における P
(
A
)黄化芽生えに 0
，6
，1
2，2
4，3
6，4
8，7
2
時間光照射し、免疫プロット法により P
S
I
サプユこけを検
出した. 検出にはp
e
r
o
x
l
d
a
s
e
の化学発光法を行い、 X線 7イJ
V
.
b
へ1分間露光した. 各いンには7'
8
x
1
0
個分の膜タンJ¥'ク質を試料とした.精製した P
S
I
様品を同時に電気泳動し、移動度
う
ス
チ
ド5
の比較から各サ7ユニけを同定した (
O
b
o
k
a
t
ae
taL，1
9
9
3
)
. 星印は未同定のハ.ンドを示す .(
B
)
2回の実験を行い、 それぞれのタンハ.ク質量の平均値を算出し、 7
2
時間光照射した標品の
タンハ.ク質量を 100%として相対値を算出した. それぞれのタンハ.ク質量カi
'
8
%以上の場合のみ定
量的な解析が行えた.
3
9
-
A
・
・
a
-.B
・
岨
一
一
-E
a
・
-sa，
.
，
'
-・
<:::>~ .
.
~ザ守 4P CSS
ペ
?
r
- h U Q凶 h υ 2 u h U
・・
-
as
as
a as
aa
s
p
p ps
p ps
p
••••
D E E H H Hν
ーー・・・・・・ psaOa
円
B
2
0
1
8
一
ー・- psaOa
ー
〈
ト
ー p..Ob
・
-
psaEa
p..Eb
-<:ト
・
-
一
c
ト
- psaHa
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psaHb
psa
州c
1
6
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﹄
4zzE
14
1
2
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4
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C
2 3 4 5 60
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h
)
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a
O
b
234 5 6
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2 3 4
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h
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5 6
30
28
一宅>-
psa~a
_ . _ psaEb
。Ed﹃@﹀=・-ez
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c
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2
6
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2
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0
一~
psaHa
一
一
←一回
.Hb
ー
。
.
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1
8
1
6
14
1
2
1
0
8
6
4
2
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0
1
2 24 3
o 48 60 72 0 1
2 24 3
o 48 60 72 0 1
2 24 3
o 48 60 72
t
l
m
e(
)
1
)
tlme(
h
)
tlme(
h)
図 4・2.グリ.ニング時における p
s
a
D
，p
s
a
E
，p
s
aH遺伝子群の光誘導
(A)N.sylv
出
<r
r
i
s
の黄化芽生えに白色連続光を図に示された時間照射して全RNAを抽出
し、p
s
aD
a
，
p
s
a
Db
，p
s
a
E
a
，
p
s
a
E
b
，
p
s
a
H
a
，
psaHb
，p
s
aH
c
に対する特異的リホ.]"ロ
・]"を用いて
中 で、電気泳動を行った後のオー
ト
?
シ.オグうムを示す.
RNase7
'0
テ
ク
シ 3ン7
'
i
f
!
.イを行った. 変性ゲ ル
(8) と (C) それぞ、れの遺伝子 について Ohで、の m貯~Av'\. ルを1. 0 として相対値を算出した . 3
回の実験を行い、 平均値と原準偏差を示した. 0
・
6
hの反応を (
B
)に
、 0
・
72hの反応を (
C
)に示
した.
4
0
-
100
B
A
1
0
('
︽ZZZ﹄POMP﹄コOZ﹄M W ω﹀一戸何一也﹄
80
522aPOME
コO E伺ω﹀2 2 E
60
40
一
0
ー
20
。
。
ー寸~
ーか
一企ー
-0-
12
24
36
48
t
i
m
e(
h
)
PSトN B
PSトC
PSトO
PSトE
PSトH
PSI.L
60
6
4
+寸す
一
寸
.
一
8
2
72
。
。
12
24
36
48
psaD
P日 E
psaH
60
72
t
i
m
e(
h
)
図4
3
.グリーニング時における P
S
I
サ7ユこけ群の t
i
1f
:
l
'
1
7
''J7人以
(A) 図 41の結-*をもとにして、 それぞれのサ7ユ
ニ
ハ ごとにタ
ン
ハ
.
ク
T
li
i
1を約算した .(8)
肉42の結果をもとにして、 それぞれのサプユニ川ごとに mRNAiJ:を h~ n:した.
・
4
1
-
1
2
ロ
psaDa
psaDb
一--0一一
・
-
psaEa
psaEb
一ー官一一
psaHa
一一←-
b
psaHc
一
-
《
、
f
z
包
8
E
。
喝
回
‘
陣
.
c
コ
。
6
E
<(
ω
〉
喝
F
6
4 4
恒
ω
E
2
。
。
2
4
T
i
m
e(
h
)
60
2
4
Ti
me(
h
)
60
2
4
T
i
m
e(
h
)
6
(I
図4
4
.
r
r
f
f
順化させた幼植物における p
s
a
D
，p
s
a
E
，p
s
aH遺伝 f
A
洋の光応答
シャル巾で 1
・2
カバ育成した N
.s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
の幼植物を暗所に 5UI
I
Ui
'
tいて H
音順化させ、その後白
・6
h
照射し、図4
・2
と同様に R
Nasc7
'J
r
7
1
3ン7
Jセイを行いそれぞれの遺伝子の転写
色i1!絞光を 0
hの mRNAレへ.ルを 1とし
産物を定位した. 3 回の実験を行い平均値と傑~制定をJ1. l iIした. O
に現した .
て相対前をグう 7
4
2
-
第 5章
p
s
aD
が宣伝子の転写、転写後、翻訳レヘ.ルでの光制御について
要旨
Ni
∞
，t
i
a
n
as
y
l
v
回
，t
r
i
sの光化学系 I核遺伝子群の中で p
s
aD
bは最も迅速な光応答をタンハ・ク質
レヘ)レ並びに RNAレヘ.ルで示す。戸aD
bの遺伝子発現に関して光の作用点は転写、 mRNAの安
s
aD
b遺伝子断片
定性、翻訳のどの段階にあるのかを トランスシ.エニリタハ・コ を用いて解析した。 p
を含む3
種 の 融 合 遺 伝 子 ( rpsaDb7'同ート +GUSレ
ホ
.-~・J
rCaMV35S7
'Of.-~-+psaDb の転
写 領 域J r
CaMV35S7'町小 +
p
s
aD
bmRNAの 5
'
部 分 +GUSレ
ホ
.-~-J )を構築し、 7
グロハ.
[
)
クテりウムの系によりかコ (N
i
c
o
t
i
a
n
at
a
b
a
ω mSR1c
vPe
t
i
t
eH
a
v
a
n
a
)に導入した。そしてこれ らの
導入遺伝 子が光応答を示すかどうかを調べた。その結果 r
p
s
aD
b7
'同 小 +GUSレ
ホ
.-~・」の
みが光応答を示したので、 p
s
aD
bの光に依存した発現は転写レヘ.
ルで調節されており、
mRNAの安定性や翻訳開始頻度は光照射によって変化しないことがわかった。またp
s
aD
b
転写産物の 5
'部分には翻訳効率を十数倍高める機能があることが示された.同様の結果が
示唆されているシロイヌナスナ fedAとの構造比較から、 p
s
aD
b
の5
'
非翻訳領域に存在するそ f
7、
LM1(TCTCAA)、LM2(CAACTTT)が翻訳活性を高める以配列であることが示唆される.
ぐ「
序
グ
リー
ニ
ング時には光合成を行うための数多くのタンハク質が光に依存して合成される.葉緑
体遺伝子の多くは、転写レヘルではなく転写後のレヘ ルで光制御を受けているが，このこと
i
t
r
oでの転写活性は光による影響を受けないがi
nv
i
v
o
で、のmRNA量は増加している
は、白 v
ことから明らかになった (Denga
n
dGruissem，1
9
8
7
;K
r
u
p
i
n
s
k
aandApel，1
9
8
9
)
. 一 方いくつ
かの核遺伝 子では、転写レヘルで光誘導を受けていることが単離核での転写活性の変化か
ら示されている (Thompsona
n
dWhite
，1
9
9
1
)
. 核遺伝子の転写後の光制御を調べるために、
これまで単離核での転写活性の増加率と i
nv
i
v
o
で、の mRNA
量の増加率を比較することで検
討されてきた . しかし、 r
u
n
o
n
7'
i
セ
イ
法で-測定した単離核での転写活性は、加 v
i
v
o
で、の転写
4
3
-
活性のすべてを反映しているわけでは無いので、定母的な解析を行うことは疑問視され
ている (ThompsonandWhite，1
9
9
1
)，上記の検討法には別の問題もある.例えばmRNAの分
解速度が変化しない場合、転写活性が2倍に変化したとき mRNAの噌加速度がど、のくらい
になるかはもともとの転写活性によって異なる.またこのとき mRNA騒が何倍になるかは
転写活性の上昇の持続時間によって異なる.従ってたとえ mRNA最の安定性に変化はなく
ても、転写活性が2倍に変化したとき mRNA量 が2倍になることも 20倍になることも原理的
には有り得る.
転写後の光制御を調べるためのもう 1
つの 7
7'ロ.チとして形質転換植物を用いた研究が行
寸
われている， Thompsonとその共同研究者らの報告によると、光の影響を受けなし斗CaMV7'
モ
ロー
ター
の支配下にエントウの f
e
r
r
e
d
o
x
i
n
遺伝子 fedA
の転写領域をつないだ‘融合遺伝子をか.コに導
入すると、このキメう遺伝子は光照射により発現誘導される (
E
l
l
i
o
l
te
ta
，
.
11
9
8
9
;G
a
l
l
o・Meagher
，
.
l1
9
9
2
;Dickeyeta
，
.
l1
9
9
3
)，このことは fedAの光に依存した遺伝子発現には、 mRNA
の
e
t
a
光安定化が含まれることを示唆している.
第 4章で明らかになったように、 f
e
r
r
e
d
o
x
i
n
結合性サ7'ユニけをコードする ps
aD
bはN
.s
y
J
v
l
白 出S
のPSI
核遺伝子群の中で最も素早い光応答を RNAレヘ)レ並びにタンハ.ク質レヘ)レで示す.遺伝子
発現の環境変化に対する素早い反応には転写後の制御が行われている場合がある
(Thompsona
n
dWhite
，1
9
9
1
;Green，1993)，そこでこの翠ではps
aD
bの転写、 mRNAの安定
性、翻訳のどの段階で光誘導が行われるのかを円以シ.エニリタハ.コを用いて調べることにし
た.
材料及び方法
7
'7
J..ミドの構築
概略は図 5
1に示した.
p
s
aD
b::GUS
y
a
D
G
2
0
(
2
章参照)の 2
k
b
pのF
o
k
I
断片 (
2
0
8
0から +
2
4まで‘を含む)を K
l
e
n
o
w
酵素で、平滑末端に
4
4
-
し
、 pBI221(
J
e
f
f
e
r
s
o
ne
ta
，
.
11
9
8
7
)のBamHI
部位 (Klenow酵素で‘平滑末端にした)ヘ導入した.
CaMV35S7'町小領域を含む領域をEx
onu
c
1
e
a
s
e皿を用いて除去し再び連結した.得られた
クローンの部分塩基配列を決定し導入した断片の両端を確認した後、得られたキメラ GUS遺伝子
全体を含むEcoRI・H
i
n
d
I
I
I
断片を pBI
10
1のEcoRI
H
i
n
d
I
I
I
ヘ導入し、同時に pBI
10
1に含まれて
いた7'ロモーターレス GUS遺伝子を除いた.
C刷y..戸aD
b
pBI
12
1から GUSをコ-~.する SmaI-SacI断片を除き pBI1 21G を作成した . psaD
bの+1から+
861の領域を PCRにより増幅し p
B
l
u
e
s
c
r
i
p
tのXbaI
部位にサプクロ.ニングし、挿入断片の全場基
で、切断し、 psaD
bを含む断片を pB
I
121GのXbaI
部位
配列を確認した.得られたクロ.ンを XbaI
ヘ挿入した.
Cゆ 1V::GUS
pB
I
12
1に含まれているものをそのまま用いた.
Ca
MV::戸a
D
b
-GUS'
2つのオリコ.DNA(
5
'・CTAGACTTCTCTCAATCCAAC
T
T
1
寸CTATGGCCATGGCAC-3')，(
5
'
GATCGTGCCATGGCCATAGAAAGτ'
T
GGA
TTGAGAGAAGT
3
'
)を 7
ニーリングし pBI
2
2
1のX
b
a
I
-
rnH
I
部位へ挿入した.挿入した領域の塩基配列を確認した後、得られた融合遺伝子を含
Ba
o
R
I
H
i
n
d
l
l
I
断片を pBI
101のEc
o
R
I
H
i
n
d
Ill部位ヘ導入し、同時に pBI
101に含まれていた
むEc
GUS
遺伝子を除いた.
CaMV::GUS'
2つのオリコ DNA(5'-CTAGATGGCTATGGCTC-3')，(5'-GATCGAGCCA
TAGCCAT
3
'
)を用
いて Cめi
l
V
:
:
p
s
aD
かGUS'
の構築と同様にして作成した.
T
i7
'7J，ミドを用いたタハ.コへの遺伝子導入
2
0
μE/
m2s
)下で行った.無菌的に育成した
タハ.コの培養はすべて 25C、蛍光灯の連続照明 (
0
が
.
コ(
N
i
∞
， t
i
a
n
at
a
b
a
ω mSR1cvP
e
t
i
t
eH
a
v
a
n
a
)の葉を 1
・
2
c
m角の切片にし、終夜培養した 7
グ
ロ
H
o
r
s
c
he
ta
，
.
11
9
8
8
)
(ただし寒天は
ハ
.
ク
テ
リ
ウ
ム (Agrobac伝riumtumofaciensLBA4404)とMS104培地 (
4
5
-
別 AA
gar(
F
u
n
a
k
o
s
h
i，BA
・3
0
)を用いた)、 NAAの代りに 3
i
n
d
o
l
a
c
c
t
i
cacid(Wako
，O
s
a
k
a
)を用い
た)上で 2・3日間共存培養した.葉片を MS液体培地で懸濁し余分なハ.
ク
テリ
7を除いてから、
MS104
培 地(
5
0
0
μ
g
l
m
lC
l
a
f
o
r
a
n(
H
o
e
c
h
s
t
J
a
p
a
nI
n
c
.，Tokyo)を含む)へ植え継いだ. 4
5日後
、
1
0
0
μ
g
l
m
lk
a
n
a
m
y
c
i
nを含む)で懸濁した後、 MS104
培地 (
4
0
0
μ
g
l
m
l
葉 片 を MS液 体 培 地 (
C
l
a
f
o
r
a
n
、1
0
0
μダmlkanamycinを含む)へ植え継いだ. 1
2
週 間 に 一 度 MS104(300-100μglml
C
l
a
f
o
r
a
n
、1
0
0
μg
!
mlkanamycinを含む)ヘ植え継ぎ、シユー ト
を再生させた.独立に得られたシユ
ー
ト
1
0
0
μ
g
l
m
lC
l
a
f
o
r
a
n、 1
0
0
μ
g
l
m
lkanamycinを含む)に移した.シユート形成後、 正常な
をMSO培地 (
l
a
f
o
r
a
n
、 100μglmlkanamycinを含む)で植え
外観を示す個体のなかから MSO培地(100μglmlC
週間以内に発根したのをふ8
個体ずつ選びさらに解析を進めた.発根した個体
継いでから 2
2
5C)に移して開花させた.
は温室 (
0
T1世代のタ 1
¥
.コ
を 2つに分けて、それぞれを MS寒天培地 (3%~3 糖、 100μglml kanamycin、
0
100μglmlC
l
a
f
o
r
a
n
)を含む培養容器 (Sigma，
MagentaGA7)ヘ植え接ぎ、 25
C、蛍光灯の連続
2
2
0
μ町'
m
s
)下で;
'
2
3
週間育てた.その後4日間暗処理を行い、 2つに分けた内の片方か
照明 (
3
・6
cm)を緑色安全光のもとで収穫し即座に液体窒索中に投入しー8
00Cで保存した.も
ら葉 (
7
0
μF
1
m2s
)を8
時間照射し葉 (
3
6
c
m
)を収穫した. T2
世代を用いた
う一方は暗処理後白色光 (
(¥
場合は，独立に得た形質転換個体の T1世代の種子を無菌的に採集し、寒天培地 (1/2xMS
無機塩類、カナマイシン 1
0
0
μg
!
mlを含む)に播種した.発芽促進のために一夜白色光 (
7
0
μF
1
m2s
)を
7
0
μ.
F
1
m2s
)のもとに 6日間置き、生じた芽生え (
5
0
5
0
0
個
照射し、その後暗所または白色光 (
体)の上半分(寒天から露出している部分)を収穫し凍結保存した.
i
k
r
o
Di
s
m
e
m
b
r
a
t
o
r1
1(
B
.
B
r
a
u
nJ
a
p
a
nI
n
c
.，Tokyo)を用いて破砕し再び
凍結した葉組織を M
8
0Cで保存した.得られた凍結破砕標品から，可溶性タンハ.ク質及び/あるいは全RNAを抽
0
出した(以下参照). GUS活性の見られなかった個体、あるいは7'うイマー伸長法の結果形質転
換体特異的なシグナルが検出出来なかった個体を除いて統計解析を行った.
4
6
-
GUS71
イ
セ
凍 結 破 砕 傑 品 か らJ
c
f
[
c
r
s
o
nらの方法により u
J惰性タンハ.ク質をお1
1
1
1
¥しGUS71tイを行った
(
J
e
f
[
e
r
s
o
ne
La
，
.
l1
9
8
7
)，抽出した標品に合まれるタンハク質濃度を B
r
a
d
f
o
r
d
法(
B
r
a
d
f
o
r
d，1
9
7
6
)
により測定し、 GUS活性をタ ンハ.ク質浪 度当たりの航で表した.
RNAの抽出と RNAの解析
全 RNA は第 4~1 と lñJ 織の方法で抽出した， 7う
イ
村
マ
n
より得た全RNAlω0μ
均g
を
、 p
戸
'
5
a
必
D併守異的 7
'7イ
村
マ
-(
げ
5'-GGGCGACGACACGGGGATCGGCTGTI
TTCGAGGTG-3')または uidA(GUS
遺伝
f
)特民的7'ライマ-(
5
'・
GTCGAGIT
汀 TIGATTICAC
S
A
3
)
'を 1
2
pで 末端 際 識 し た も の 1
x
1
0
cpm(
約 10fmo
l)とを S1ハ
イ
7
'I)f
GGGTTGGGGTTTCT
1f-河川 1
7
7・中で 30 Cで一夜ハイプリ.イス.させた後、第 2
章と問機に7'うイマ _
{
q
l長反応、 1
立公
0
泳動を行った.泳![l
)
J後 t
-ト
う
シ'
t
グ7
7イ
-を 行 い 、 各ハント の 放 射 活 性 を FUJlXB
AS2000(Fuji
P
h
o
t
oF
i
l
m
，T
o
k
y
o
)を矧いて解析した.
結果
oaD
bキメラ遺伝子の構築
p'
5
a
D
b
(
J
)転写 、 転 写 後 の 光 制 御 を 調 べ る た め に 図 5・
1に あ る よ う な 村 7
遺伝子を構築し
た.まずp
叫 b
の転写産 物の安定性が光によって変化するかどうかをみるために、光の影
稗を受けないCaMV3
5
S
7
'D{-~-の支配下に p'5aDbの転写領域を rt いた (Cめれ1: 判aD帥.そし
て光による転写の活性化が起こるかどうかを 羽
t べるために p
'
5
a
D
b
の7
'D{-~- を含む-1728 か
ら +24 までトの領域のド流に GUSレホ -~-遺伝 f を接続した (p'5aDb::GUS) ， また翻 訳 開 始の 頻
リグ .領域か開始コドンの周辺であると持えられるので、 p
'
5
a
D
bの
度を調節するとすれば、 5'
w.
.
開始コドンを含む +1 から +35 までの領域を GUS レホ-~-遺伝チに in f
r
a
m
c
で媛続した (
C
め
psaDb-GUS')，この結果 GUS~ìハク質の N・米 端に 127 ミ/椴が付加される(この長くなった
4
7
-
GUS7ン
/
¥
'
ク
質をGUS'
で表した)，この付加に由来して GUSの比活性やか/¥'ク質の代謝 速度 が
変化する 可能性があるので、 GUS'を持つコ
ン
ト
ロー
ルも用 意 した(図5・l
B，CaMV::GUS')，これ
らの村う遺伝子をタハ
.
コ に導入し形質転換体を作成した.
D'
s
aD
民主写産物の安定性への光の影響
まずps
aD
bの転写 産物の安定性が光によって変化するかどうかを調べた.導入遺伝子の
転写産物の同定を7'7
イマー仲長法 により行った(図 5
2
)， ps
aD
b7
'うイマーを用い ると、 N.ωbacum
の非転換体(
S
R
1
)で N.s
y
l
v
e
s
t
r
i
s
の ps
aD
bmRNAと 同 じ 長 さ の 伸 長 産 物 を生 じ る .タハ
・
コ
f)
N
.t
a
b
a
c
u
mは N
.s
y
l
v
e
s
路由来のゲノムを持つので、この伸長産物は N
.s
y
l
v
白凶の ps
aD
bに相
1
当する N
.t
a
b
a
c
u
m
の遺伝子 産物のけ 妙であると思われる.この遺伝子は N
.s
y
l
v
白t
r
i
s
の場合
，
・2
，S
R1D，SRlL
)，CめれT
:
:戸 aD
b
の形 質転 換体では転換
と同様に光誘導を受けていた(図 5
体特 異的なシグナルが強く現れているが、このけ.
ナ
ルは光照射による変動は 見 られなかった
bD，C品i
f
¥
T
"戸 aD
bL)
. また ps
aD
bに対応する遺伝子の発現は、 ps
aD
bを
(
図 52，Cめれ'::戸aD
・
高発現する転換体 (
C
品
1
1
¥
'
'
戸 d油)でも非転換体 (
SRl
)と変わりなく起こっていたのでpsaD
b
の遺伝子発現に関してmRN
Aレ
ヘ j
レ
での 7
イ
ー
ド ハ.け制御は起こっていないことがわかる.
コ
ン
ト
ロ
ールのCaMV::GUSの形質転換体では転換体特異的なシグ〉ナルは光照射によって減少し
ている(図 5・2右のハ
.
ネ
ル
).7
'7 イマー伸長法による解析を 5個体づっ行い、導入遺伝子の m貯~A
(
"
¥
量 を定量 した所、 ps
aD
b
転写 産物の安定性は光による変化を受けないことが明らかになっ
3
)，
コ
ン
ト
ロ
ールとして用いた CaMV::GUS
で、は明所で、 mRNA
量が減少しているので、 GUS
た(図 5
mRNAは暗所に比べると明所では不安定なようである. 同 様の 結果 はE
U
i
o
t
tらら (
1
9
8
9
)、
Bi
c
h
l
e
rとH
e
η
m
a
n
n
(
1
9
9
0
)によっても得られている.
。
'
s
_
a
D
b7
'む
壬
与ー
の光応答
次にps
aD
b::GUSの光応答能を調べた， GUS7ンハク質は i
nv
i
v
o
で非常に安定で、あるので、
形質転換世代で、のGUS活 性 は mRNA量の変動にはなかなか一致しない(データは省略).そこ
で GUS活性 を 指 標 に 遺 伝 子 発 現 を 解析する 実験 は T2世 代の芽 生えを 用 い ることにした.
4
8
-
図5
4に示されているように、コント D
J
vのC
a
M
V
:
:
G
U
S
では光照射によってやや GUS
活性が減
少したが、これに対して p
s
aD
b::GUS
では光処理によって GUS
活性は増加した.このこと
から p
s
aD
bの
ー1
7
2
8から +
2
4までの領域に光応答領域があることがわかる.この領域には転
写される配列も含まれているが、図 5
3に示 されているようにp
s
aD
bmRNAは転写後の光誘
導は受けないので、これは転 写 及び/あるいは翻 訳レ
ヘ Jレで誘導されていることがわか
る.
、
f
Ds
aD
bの翻訳制御
翻訳レヘ J
レ
での光調節があるかどうかを C
a
M
V
:
:
p
s
a
D
，か GUS'遺伝子を用いて調べた.図 5
・5
に示されているように、 p
s
aD
bとの融合遺伝子を持つ転換体は光によって GUS
活性に変化
s
aD
b
の翻訳開始頻度は光制御を受けていないことがわかった.従って
はなかったので、 p
p
s
aD
b
:
:
G
U
S
遺伝子で、見られた光応答(図 5-4)は転写レヘ J
レで行われていることが明らかにな
っ?乙.
コントロルの C
a
M
V
:
:
G
U
S
'
遺伝子はC
a
M
V
::
p
s
aD
lrGUS遺伝 子 と同じく光応答能は無いが(図 5
-
5
)、GUS活性の絶対量は後者に比べると相当低い値であった(テ.-~は省略) .この理由とし
てp
s
aD
b由来の配列に翻訳効率を高める働きがあるか、あるいは転写活性を高める働きが
あると考えられる.そこで、定常状態における転換体でのGUS
活性と mRNA
量を比較し、
n
翻訳効率を調べることにした. T1世代のトランスシ・
工 こけか・3を培地に植え継ぎ、連続照明下
で培養し、培養容器の中で成熟した菜 (
3
・6
c
m
)から可溶性タンハ.ク質と 全 RNAを抽出し、
GUS
活性と GUSmRNA
量を測定した(図 5
6
)
. その結果、 p
s
aD
bmRNAの5
'
部分の配列を持つも
のは pBI
12
1ヘ.クターに含まれている GUS遺 伝子 (
C
a
M
V
:
:
G
U
S
)と比べると mRNAあたり 7
3
倍の
GUS活性があった.そして G
U
S
'のアミノ酸配列をエドするコントロJのGUS遺伝子 (
CaMV
:
:
G
U
S
'
)
と比べると、 p
s
aD
bmRNAの5
'
部分を持つことで、 (
C
a
M
V
:
:
p
s
aD
l
r
G
U
S
'
)翻訳効率は 1
4
倍高ま
ることカ王明らかになった.
4
9
-
考察
エンドウ f
e
r
r
c
d
o
x
i
n
迫 伝 子 fcdA
の転写領域内には光応答領域があり、転写後のレヘ J
レ
で-光制御
を受けていると示唆されている (
D
i
c
k
e
yc
ta
，
.
l1
992). 高 等 植 物 の fedAは 一 般 に 転 写 領 域 内
に光応答領域を持つのか、あるいはそれはエンドウの fcdAに 限 ら れ た こ と な の か を 見 る た め
に、シロ
イ
ヌ
ナ
ス.ナの f
cdAで 転 写 後 の 光 制 御 が 行 わ れ て い る か ど う か が 調 べ ら れ て い る が
(
C
a
s
p
a
randQ
u
a
i
l，1
9
9
3
;V
o
r
s
te
ta
l，1
9
9
3
)、明確な結論は得られていない.光化学系 IのP
S
I
e
r
r
e
d
o
x
i
nと機能的に 非市に近い関係にはあるものの、 psaD
bの泣伝子 発 現 の 光
Dサプユニけは f
、
r
ぺ
応答は転写レヘ J
レで行われており、 mRNAの安定性や翻訳開始頻度は光の影響を受けないこ
とが本章 の 結 果 か ら 明 ら か に な っ た 他 の PSI
サプユこけ を 3・
トす る 核 遺 伝 チ 群 に つ い て は、
光 応 答 がpsaD
bより遅いのでやはり転写レヘ.ルでのみ光制御を受けているものと推察される.
翻訳レヘ.ルで の 遺 伝 子 発 現 調 節 は 真 核 生 物 で は 数 少 な い 例 外 を 除 い て ほ と ん ど わ か っ て い
9
9
2
)が、それに比べるとウイ l
はの RNAに関しては比較的よく調べられている.
ない (Kozak，1
'非翻訳領域には翻訳活性を高める働きがあることが、タハ.コモザイクウイルスゲ
あ る 種 のRNAの 5
ノムや、 7
J
レ
1
7
J
レ
1
7モザイクウイルス RNA4、 7ロムそサ.イクウイルス RNA3、 ホテト Xイ
ウl
以、 タハ.コエ汁ウイルスゲノム
で示されている (
G
a
l
l
i
e，1
9
9
3
)
. 宿主 である高等植物がこれらウイJ
以RNAの 5
'
非翻訳領域を認
識し翻訳活性を高めていることは明らかであるが、どのような分子機構で行われている
のかはわかっていない (
G
a
l
l
i
e，1
9
9
3
)
. 本軍の結果から、 N
.s
y
l
v
ωt
r
i
s
のps
aD
bに翻訳活性を調
6
)
. このことはウイl
以RNAだけでな
節する配列がコードされていることが明らかになった(図 5
く、高等植物のゲノムにコードされた遺伝子においても翻訳レヘ ルでの発現調節が行われている
ことを示している.翻訳レヘ.ルでの発現調節は amaran
出の r
bcSに お い て も 知 ら れ て い る
(
B
e
町 Ie
ta
，
.
l1
9
9
0
)が 、 高 等 植 物 で の 翻 訳 調 節 機 構 を 解 明 す る に は よ り 多 く の 知 見 が 必 要 で
あると思われる.
Caspar と Quail の報告 (1993) によると，シロ イヌナス.ナfedAの 7 ・ Df-~- と 5'非翻訳領域を含む領域と
l
u
c
i
f
e
r
a
s
eレ
ホ
.-~-遺伝子との融合遺伝 子は光応答能を持つ.このとき 5'非翻訳領域を欠失さ
せ た 融 合 遺 伝子 は 、 光 応 答 能 は 保 た れ て い た が 発 現量 は大きく減少した.このことから
シ
ロ
イ
ヌ
ナ
ス
.
ナ fedA
の5
'
非翻訳領域には、光に依存しないで翻訳活性を高める以配列があると考
5
0
-
えられる.そこで、 N
.s
y
l
v
l
白 t
r
i
sps
ε
Db
の5
'非翻訳領域をシロイヌナス.ナfedAのものを比較してみ
7
)
. その結果両者に共通するそチ7
(
5
'
L
c
a
d
c
rM
o
t
i
f
，LM1及び LM2)が見いだされた.
た(図 5
s
aD
bの 5
'
非 翻 訳 領 域 の 半 分 以 上 の 配 列 がfedA
のものと共通に存在
驚くべきことに、短いp
していた .p
s
aD
bは
、 f
e
r
r
e
d
o
x
i
n結合部位で、ある PSI-D
サプユニけ をコードしており (
B
r
y
a
n
t
，1
9
9
2
;
9
9
3
)、PSI-Dとf
e
汀e
d
o
x
i
nは機能的に非常に緊街な関係にある.従って両者はこれ
Golbeck，1
7を通じて、協調的な遺伝子発現制御を翻訳レヘ レで受けるのかも知れない.
)
らのそf
、
f
o
5
1
-
A
5・
Flanklng
psaDb I
n
t
actGene
5・
UTR
Codlng Reglon
「ーム
3.UTR & 3・
Flanklng
φ668φ861
-1728
CaMV:
:psaDb
+861
MV35S
PCa
psaDb::GUS
、
ロ7
隠蕊芯おW
」』
-1728
「
CaMV::GUS
GUSCωi
ngReg削
- h
下一
m m
f
TNOS
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i
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GUSCωi
ngRegi
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Tt心S
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n
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g
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∞
TNOS
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.
.
.
.
.
CaMV::psaDb.GUS'
mMV35S
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「
CaMV::GUS'
- h
日夜 一
P臼 MV3
ATG
B
CaMV::GUS
T
C
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G
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G
G
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G
G
G
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G
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CaMV:
:psa
Db.GUS'
T
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T
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CaMV:
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T
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G
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G
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G
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G
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C
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T
A
T
G
T
T
A
M A M A R S PG G Q S L M L
図51
. ~ハ J の形質転換に用いたりう遺伝子の模式図
(A)詳細は「材料及び、方法 J に記載した. (8)翻訳開始点付近の塩基配列とそこから翻
'f
ドのアミノ酸配列を示した.大文字の 7
ミ/酸配列は実際に翻訳されるが、
訳されるホ.リヘ.7
小文字の斜字で、示した配列は翻訳されない.下線で示した頃基配列はpsaD
bに由来する.
5
2
-
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p
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v
F﹄
M
a
・-
ー
-
図5・
2.形質転換タハ
コ
.で、
の mRNAのf
d
j
:
ど
レ
ー
ン
の kに示された材料の良から得た全町川と、 p
s
aD
b
特果的 7イマ
うー
ヤ，
s
aD
b
)
または G
US遺
伝子特民的7' 7 イ マ・ ( uidA) をJlJい て 7'うイマ_{rIJ 長法を行った . 変 性ゲ I~で、 の屯主(i永動後の t - ト?シ ­
t
グ
うムを示す .1つの{同体を 2つに分け、
材料及び J
J
t
t
:_
に従い光(L)または i
暗(
0)
処J1
Hし
た.
53
-
B
A
CaMV:GUS
•
..
z
巴
E
•
D
a
r
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g
h
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1
1
1
.
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.
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円
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。
.
・
・
回
c
コ
。
。
1
.
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. 1.0
命圃
司
.
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《
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ミ
r
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唱
.
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区
2
.
0
1
.
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• • •
《
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•
CaMV
::psaDb
1
1
1
1
1
1
1
1
1
11
1
1
1
1
1
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8
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.
6
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.
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.
2
、
2 3 4 5
2 3 4 5
0
.
0
t
r
a
n
s
g
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i
cl
i
n
e
s
f
CaMV
::GUS CaMV
::
p
saDb
図5
3
.p
s
aD
bm
附 仙 の安定性は光による影響を受けない
(A)図に示されたキメラ遺伝子 を導入した形質転換タハ.コのTl世代を、 4日間暗処し (D)、その
後 8時間光照射した(L).葉より全悶'
l
Aを抽出し 、7"7
イ
マー
伸長法によりキメう遺伝子の転写産
物を定量した. (
8)(
A)
の結果から各りう遺伝子の転写産物量のL/D比、標準偏差を算出し
た.
5
4
-
B
A
3
psaDb::GUS
4
3
2
。
CaMV::GUS
﹄白¥
﹂
HMW
ι
内ノ
﹄ロ¥﹂
MMW
。
。
o
12345678
1234
psaDb::GUS CaMV::GUS
t
r
a
n
s
g
e
n
i
cl
i
n
e
s
図 54
.p
s
aD
b7
'町小の光応答
(A)図に示された導入遺伝子を持つ形質転換タハ.コの種子 (T2世代)を明所 (L)または暗所 (
D)
で6日間育て、 GUS活性を測定した. (B)(A)の結果をもとに GUS活性のL/D比、標準偏差
を算出した.
5
5
-
B
A
2
ぺ
2
CaMV
:psaDb-GUS' CaMV
:GUS'
i
z
E-1
1
1~
一
一
、
f
1
2
3.
4
5一
6.
12
3一
4
5
67
。一
一
一
一
一
.
一
一
一
一
一
.
一
l
I
1
0
CaMV
:psaDb
-GUS'CaMV:GUS'
t
r
a
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s
g
e
n
i
cl
i
n
es
図5
・5
.p
s
aD
bmRNAの翻訳活性は光による影響を受けない
(A)図に示さ れた導入遺伝子を持つ形質転換タハ Jの 椅 !-(T2世代)を明所(L)または暗所 (
D)
で6日間育て、 GUS活性を測定した.
(
8
)(A)の結果をもとに GUS活性の υD
比、標準偏差
を算出した.
5
6
-
A
B
∞
10
∞
Ca
MV::GUS・
SRl
1
，・
t
:
CaMV"GUS
1
~
~
CaMV psaDT.GUS
1
1 1
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CaMV;
.
GUS
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一
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。
一. ↑
畠
一
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一.
.
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a
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念
.
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10
F
田
(
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E
B
B
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2 2 εC}bgzu帽 的 ﹁40
CaMV::psaDb-GUS'
CaMV::GUS_
.
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C
D
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コ
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一
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CaMV
::
psaDb-GUS'
CaMV
::GUS
CaMV
::GUS・
，，
234 5
，
2345
t
r
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g
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i
cl
i
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s
1
0
.
0
6
12 3 4 5
CaMV::GUS
CaMV
:
:
p
s
a
D
b
・
GUS'
Ca
MV::GUS'
図 5・6
.ps
aD
b庇写産物の 5
'
部分は翻訳効率を高める
(A)それぞれの形質転換体 (
T
l世代)を蛍光灯の述続照明 (
2
0
μF/
m2s
)下でJ
自必し、 定沼状態
3・6cm
)
での GUS
活性 (MUは4・meU
1
ylumbel
1
i
f
e
r
o
nをぷす)を測定した. (
B)7
'7マ
イ4ド
長
で‘の菜 (
法により GUSmRN
Ai
止を定虫した. (C)各個体より得た GUS
活性を GUSmRNA
虫で官iJ
0)(C)の結果をもとに
り
、 CaMV::GUS
の6
1
同体の 平均を1.0として相対値を n
l
l
lした. (
m 貯~A itl に対す る GUS活性の平均値と tR1111 偏差を n 出した .
す.
5
7
-
持グ 7
7上の数f
l
f
tは平均値を示
LM1
LM2
N.
s
y
l
v
e
s
t
r
i
spsaDb
A
C
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T
C
T
C
T
C
A
A
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T
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A
C
A
C
A
A
A
A
C
A
A
A
A
A
A
A
AA
T
G
図5
7
.N
.s
y
J
v
e
s
t
r
i
sps
aD
bとA
.的 幼i
a
n
a[cdAの5
'リ
ーダー配列の比較
ATGは翻 訳開始コドンを示す. LMl(TCTCAA)及び LM2(CAACTIT)はN
.s
y
J
v
c
s
l
r
i
s
のpsaD
bと
シ
ロ
イ
ヌ
ナ
ス
十(
A
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1
i
a
n
a
)[edA(
C
a
s
p
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dQ
u
a
i
l，1
9
9
3
)とに共通して仔在する.
5
8
-
結論
1
. ~，.
)コ
属 Ni
∞
， t
i
a
n
as
y
J
v
の光化学系 I
サプユニ 7ト
をコ.ドする核遺伝子 として
回 出s
複合体の PSI-D
1
はp
s
aD
a
，p
s
aDbO
コ
2コピーが半数体ゲノム中 に存在 し、その結果 2積類のり型タン
ハ
.
ク質を 生 じる.
これらの遺伝子 は葉の成熟に伴って異なる様式で発現制御を受ける.また、いずれも光
によって発現が活性化されるが、その反応の素 早 さは遺伝 子コピ.によって異なり、 p
s
aD
a
は他の PSI
サプユこけ遺伝子と協調して誘導されるが、 p
s
aD
bはそれに比べるとより迅速な光
n
応答を示す.またp
s
a
E
.
遺 伝子群のなかでは:， p
s
a
E
aは緑茶中で光に依存した発現の活性化を
行うカミ p
s
aEb
の発現は光の影響を受けない.これらのことは、 p
s
a
D
，p
s
a
E
.
遺伝子群に 含 ま
れるそれぞれの遺伝子コピ.は異なる発現様式をしており、光化学系 I複合体の形成にお
いてコピーごとに異 なる役割を担 っていることを示 している.しかしながら、それぞれのり
型サプユニけを含む光化学系I
が異なる機能を持つのかどうかは今のところ明らかでは無い.
2
. グリ
ーニング時に N
.
s
y
J
v
e
s
t
r
i
s
の光化学系I
サrユ
ニ け群 (PSI-AIB，PSI-C，PSI-D，PSI-E，PSI-H，
P
S
I
L
)は協調的に蓄積していく.このとき p
s
a
D
，p
s
a
E
，p
s
aH
の核遺伝子群も阿川レヘ I
レ
で調
和のとれた光誘導を受けおり共通の分子機構によって発現調節が行われていることが示
Aレ
ヘ レで
) 、
示す p
s
aD
bについ
唆される.その中で最も 早 い光応答をタンハ ク質レヘル並びに附-J
て、光によって影響を受けるのは転写、 mRNAの安定性、翻訳のどの段階なのかを形質転
換が.コを用いて調べた.その結果光制御を受けているのは転写活性だけであり、 m貯仙の
安定性や翻訳活性は光の影響を受けないことが明らかになった.また、 p
s
aD
b
転写産物 の
5
'
部分には翻訳活性を高める機能があり、 LMl(TCTCAA)、 LM2(CAAC1
寸T
)が翻訳活性を
高める以配列であることが示唆された.
5
9
-
謝辞
本研究の遂行と取りまとめに終始懇切なる御指導を賜った京都大学理学部教授辻英夫博
士に心より感謝の意を表します.また北海道大学大学院地球環境科学研究科助教授小保
方潤一博士には本研究を行う機会を与えていただき、また本論文の完成に至るまで媛か
い御指導と多大な御援助を頂きました、衷心より謝意を表します.有益な討論、御指導
を賜った京都大学理学部田中歩博士に深 く感謝の 窓を表します .研究を 行うに当たって
n
貴重な材料の分譲をして頂いた大岡宏三博士(大阪大学)、杉浦昌弘教授(名古屋大学)、杉
町 i
kVi国 S
c
h
e
l
l
e
r教授(デンマイ王立獣医良業大物、三上哲夫
田護助教授(名古屋大学)、 He
教授(北海道大学)、土岐精一博士(北海道大学)の各博士に謹んで感謝の官、を表します.本
研究には三上浩輝氏(北海道大学)、近藤由希子女史(北海道大学)、中部真之氏(北海道大
学)、林田信明博士(理化学研究所)、木村淳夫博士(北海道大学良学部)、井上和仁博士(神
奈川大物ち の御協力、御助言を頂きました、深く感謝の意を 表します .また か.コ形質転
換の 実験 は一部北海道農業試験場で行われました.快く場所の提供をして頂き、また御
指導して頂いた加藤明博士(北海道農業試験場)に謹んで謝意を表します.本研究は主に北
海道大学遺伝子実験施設で行われました.同施設の利用に際し快く受け入れて頂いた北
海道大学遺伝子実験施設長高木信夫教授並びに前施設長杉本和則教授に衷心より謝辞を
表します.本研究をまとめるに当たって、御助言、活発な御討論を頂いた京都大学理学
部植物学教室環境応答機構解析学講座の方々、並びに北海道大学大学院地球環境科学研
究科生態環境科学専攻生態遺伝学講座小保方研究室、北海道大学遺伝子実験施設、北海
道大学理学部生物学科植物学専攻細胞生物学講座の方々に深く感謝の官、を表します.
6
0
-
引用文献
AndersenB，
KochB加 dS
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h
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rH V(
19
9
2
)
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61
.
AndersenB，
S
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1
9
9
2
)
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FEBSLeu3
1
1
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6
9
]7
3
.
AndrcassonE，
SvcnssonP，
WeibullCandA
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b
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r
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s
s
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