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市
首
xJ.¥f(n
出芽酵母における糖鎖付加機構の遺伝生化学的研究
東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命工学専攻
平成 7年度博士課程進学
橋本仁志
指 導 教 官
依田幸司
目次
序論
第 l章
3
VIG9
:
遺伝子の単向Itと機能の解析
1
1
j
字
1
2
結来
1
0
i
g
9
変
異
:
t
'
,
j
c
の
形
質
1
2
1 v
II
1
・2
2 VI
G9
遺伝子のクローニング
1
3
ト2
3
Vi
g
9蛋白質の機能の解析
21
考察
2
7
1
3
第 2章
VIG
4遺伝子の単離と機能の解析
2
1
序
2
2
結果
3
0
2
2
-1 v
i
g
4
変興株の形質
31
2
2
2 VI
G4
遺伝子のクローニング
3
3
22
・3 V
i
g
4
]
長自質の局夜
3
7
2
3
考察
4
2
第 3章
Mnn9蛋 白 質 複 合 体 の 単 離 と 機 能 の 解 析
3
-1
.
1
1
-
3
2.
結果
4
5
3
2
1 変異株の形質と蛋白質の構造
4
7
3
2
2 蛋白質の局在
4
9
3
2
3 蛋白質複合体の単離
5
6
3
2
4
~長自質複合体の安定性
6
0
考察
6
2
3
3
総括
6
7
実験材料と方法
72
参考文献
8
1
謝辞
8
9
序弘
日s
n
事占鎖研究の芳、義
真核生物においては、多くの蛋白質が糖飢の修飾を受ける。糖鎖は、蛋白 f
fの種釘i
によって異なるが、安定性、フオ-)レディング、局在性、蜜 l
当質問士の相互作)刊など
蛋白質の構造と機能の而で大きく寄与している 。 また、糖 j
}
1は非常に被雑且つ多織な
構造をしており、これがk:I
I
J
胞の特異性を認識するためにも機能していることが知られ
ている。一方、進化的に糖鎖の構造と機能の重姿性と中市街さは I
盟
加l
しているが、糖 j
}
i
の生合成および蛋白質への付加l
の過程は生物極│悶で基本的に保存されている 。
酵母研究の有用性
i
品芽酵母 S
a
c
c
J
W
rD
m
y
c
e
sc
e
r
e
v
i
s
i
i
l
eにおいても、大部分の糖鎖は小 l
泡体からゴルジ体を
経る過程で付加され、蛋白質のフォールデイングおよび安定化のために、また細胞~
の孟要な稿成成分のーっとして機能している [Kukuruzi
ns
k
ae
t1J
1
.
, 1
98
7
;Her
scovI
csa
n
d
Or
Je
an,
1
9
93
J
o 酵母 S
.c
e
r
e
v
i
si
a
eは真核生物のモデル生物としてよく
mいられてい る。
,
これは酵母 S
.c
e
r
e
v
i
s
i
ae
tこおいては荷主"ベクタ一系古河{
i
i
立しており、遺伝子操作を中心
とする分子生物学的解析が強力であることが理由である 。つまり条件致死をはじめと
する変異株の取得、また特定の泣伝子を標的とする造伝子破壊株の作製、さらには多
コピーサプレッサーや合成致死変異株などのスクリーニングを通じて遺伝学上関連し
ている遺伝子の取得、などが可能であるという点である。また酵母 S.
c
e
r
e
v
i
s
i
ae
は一倍
体と二倍体の二つの生活環を持つため劣性の形質を観察することができ、既によくまH
られているプロモーターを用いることによって、遺伝子の発現のスイッチの ono
[
[
が
容易であることもその理由の一つである。更には全ゲノム配列がついに明かとなった
ことから、これを利用することで膨大な情報を得ることができるようになった。そこ
で糠鎖の付加l
過程についても、このような利点を生かして、他の真核生物システムを
3
-
川いた系では得ることの難しかった情報が酵母から特られるようになってきている 。
酵母における;結鎖
.c
e
r
宮 内'
s
i
a
eにおいて分 J
必に伴 って起こる精鋭修がI
1には、 1
)アスパラギン残必へ
酵母 s
のN-結合型、 2
) セリンまたはスレオニン残基への0紡合辺、 3
) カルボキシル末端へ
I) アンカ-lli!iJをある (
F
i
g
.
O
・1
) 。た
のグリコシルホスファチジルイノシトール (OP
n
だし高等真核生物において糠鎖を構成している梢は非常に多様であるが、再 まs
c
e
r
e
V
J
S
1a
eにおいてはほとんどマンノースが主体である。似の供与イ本として働くのは
UDP-Nアセチルグルコサミン、 ODP-マンノース、 UDP-グルコースである 。小Jl包体の
隆仰)
1で付加│されるマンノースおよびグルコースは、ドリコールリン酸とそれ ぞれ
内j
ODP-マンノー スまたは UDP
グルコースから生成されるドリコールリン酸マンノース
A
b
e
i
j
o
nandH
i
r
s
c
hber
g,1
9
9
2
;
またはドリコールリン酸グルコースから供給される [
レジ体では ODP-マンノースを )
J
失上に存在するト
Her
s
c
ov
i
c
sandO
r
l
e
a
n,1993
)。一方、ゴl
ランスポーターを
mいて内 l
陸側に輸送し、
1
錯転移酵素の 1
品質とする。
N 結合型紙鎖の構造と生合成
N-結合型粧鎖は Ma
n
8Gl
cNAc2をコアとしてその後成熟し、 Man
9
1
3
0I
cNAC2といった
構造(カルボキシペプチダーゼ y(CPY))またはコアに 200残基程度までのマンノースが
様々な大きさで付加される構造(分?必蛋白質や細胞壁のマンナン蛋白質の多く)をし
び
、
g
.
0
-1
) 。後者の僻造をとるような場合はまず αぺ.
6
結合による主鎖がや 11
ている (Fi
,
2および αー1
,
3結合による側鎖がイl
q長していく。またリン酸ジエステ
それに続けて αー1
鎖に付加されることもある [
K
u
k
u
r
u
z
in
s
k
ae
la
l.
,
ル結合によるマンノースがコアや外相E
泡体およびコ'ルジ体で段階的に行わ
1
98
7
;Her
s
c
ov
i
c
sandO
r
l
e
a
n,1
9
9
3
)。その生合成は小j
、
れる。まずノjj
泡体の細胞質 i
H
I
j
で Man50lcNAc2という機造がドリコールに付加された形
控側に移行して Ol
c3Man90lcNAc2という構造になり、
で合成され、その後小胞休の内 l
l
i
g
o
s
a
c
c
h
a
r
yl
t
r
a
n
s
f
e間巴複合体により移され [
S
i
1
b
e
1
"
St
巴i
na
n
d
ドリコールから蛋白質に O
4
-
Gilmore,1
9
9
6
;t
eHe
e
s
en elal
.
,1
993
1
.
、グリコシダーゼにより Man8GI
cNAc2という情造に
E
sr
non elal
.
,1
9
8
4
;Camirand e
lal
.
,1
991
]。ゴルジ体に愉送されてから、
刈り込まれる [
Oc
h
lにより最初J
の αt,
6
-マンノースが付加され、 Mn
l
l!
Kr
e2および Mnnlといった精転
移酵素を用いて外秘鎖カ勺診成される [
Ha
u
sl
ere
la/
.
,1
9
9
2
;N
a
k
a
y
a
r
n
ae
l1/
.
,1
9
9
2
;Graham
e
t1
1
1
.,j9
9
2
]0 リン酸織は Mnn4お よ び Mnn
6を灯Iいて付加│される。 [Oda
nie
l/
1.
,1
9
9
6
;
Wa
ngela.
l,1
997]
ひ結合型糖鎖の構造と生合成
0-結合型糖鎖はセリンまたはスレオニンに直接マンノースが 1 ~ 5個分|岐な く H 加し
たような構造である [
K
u
k
u
r
u
z
i
ns
k
ae
l
<
l
/
.
,1987;Herscovi
c
sa
n
c
lOr
Iean,1
993](
F
ig
.0
1) 。
その生合成は小胞体の内股及ぴゴルジ体で行われる。一つめのマンノースはドリコー
ルリン酸マンノースから Pmtl ~ Pm t7蛋白質によって付加される [Strahl - Bo l s 川 ge r e
ta
l
.
,
1
9
9
2
;Gent
z
s
cha
n
dTanner
,1
9
9
6
;Gentzs
cha
ndTanne
r
,1
9
9
7
]。二つめ、三つめの αー1
,
2ー
マ
抱休およびゴルジ体で 9根からな
ンノースはその詳しい機構などは不明であるが、小j
るMntl/Kre2i'長白質ファミリーによって付加され.
[
H
a
us
l
ere
l/1.
1,1
9
9
2
;L
u
s
s
i
e
re
ta1
.
,1997]、
,
3結合で付加される [
G
r
a
ha
m el
四つめ、五つめのマンノースは Mnnl蛋白質により αー1
a
l.
,1
9
9
2
]。
GPIアンカーの構造と生合成
GPIアンカーについてはまだよく分かっていないが併造は他の真校生物のものとよ
〈似ており、巴t
h
a
nol
a
mine
-P6
Man-α 1,
2Man-α-l,
6Man-α-l,
4GlcN-αー 1
,
6
-i
no
st
iol
F
e
r
gus
on,1
991
](
F
i
g
.
O
I) 0 GPlアンカーの付加される 蛋
phos
phol
i
p
i
dという形である [
際
世I
!
白質はシグナル配列である N末端以外に C末端にも疎水性領域を持ち、小胞体内 j
でこの C末端領域が切断されその代わりに GPIアンカーが付加される [Ger
b
ere
t<
1.
1,
1
992
]
。脂質の部分は 小胞体以前の過程ではジアシ jレグリセロールで、その後の過程で
elma
n
n
セラミドに移されることもあるが、これは蛋白質によって違うようである [Conz
5
-
eu
l
i.
,1
9
9
2
)0細 胞膜外に愉送された後、蛋白質がGPIから細胞I¥'Kのグルカンへトラン
スグリコシレーションされるものもあるがその詳細な機構については不明である (
K
l
i
s,
1
994)
0
既知の糖鎖不全変異株
上記のような酵母 S.cerevis Íile における糖鎖付加l 過程の j~~ 析は主に変 災株を m い て行
われてきた 。 その取得方法は様々で、細胞に i
r
Jv
ivo
で'
.
eH)
マンノースを取り込ませ精
鋭不全により械タンパク質の糖飢部分への eH]
マンノースの取り込み茸が野生 保より
刊マンノース自殺法を川いて
減少し放射線による損傷を免れた株を波織するという[31
l
g変異干
[l
u
f
f
a
kera
n
c
lRobbins
,1
983)
、 oc
hl変異 [
Na
g
a
sue
l
al
.
,1
992]
等が取得され、
ー述の a
また 細 胞表層のマンナン蛋白質の糖鎖不全に起因した抗原性の変 化 を指標に mnn ~ 児
株は 収 得された [Ras
chkee
l
a
l
.,1
9
7
3
;B
a
l
lou,1
9
9
0
]
0 その他糖鎖不全となることが確認
g変異株[
Balou
されている変異株として、バナジン酸耐性を帰椋として取得された vr
e
t
al
.
,1
991
]、キラ ー毒素耐性を 指標として取得された 1=
2変ー
臭事k[
H
il e
la
/.
,1
9
9
2
]、
Ca2+ー
ATPas
eの変興で、ある pmrl
変臭事1<[
R
u
c
l
o
l
p
he
la
l
.,1
989
)
、小胞体に局在する蛋白質
d
l変異株 [
H
a
r
c
lwi
c
ke
tal
.
,1
990
]、カルコフラーホワイト高感'豆
の残留機構が欠損した er
8
1.
,1
9
9
4
]などいくつか報告されている 。 これらの変異株の
性となる cwh変異株 [Ram eI
中で、対応する 遺伝子が同定されその機能及ぴ糖鋲不全となる分子機構についてもよ
く分かっているものはまだ少ない。
本研究にいたるまでの経緯
以上のような前提にたって、当研究室の榊原らは精鋭不全となる変異株を取得し解
析を行うことにより、tl¥芥醇母の外松鎖付加過程に関 与す る因子を同定し、それら因
子の活性市 u
御機構やゴルジ体に局在化する糖転移酵素の局在化機術、さらにはゴル ジ
l
Jo
uらの報告
体 そ の も の の 機 能 解 析 を 目 的 と し て 、 研 究 を 開 始 し た 。 変 異 株 は sa
6-
[
B
a
l
l
ou e
l
a
l
.
,1991]を
t
.
!
i
に
、 5mMパナジン般に対して耐性となる山然突然変異名K
を取得
3の札I
.
Minに分類した 。 これらの株について分泌、
純潔 I
L
lnであるインベルターゼ
し
、 1
立を野生株と比般したところ、そのうち
の電気泳動を行い、活性染色によりその移動 l
の4
1日補群については野生株との差は見られず、他の 9相補1
作では野生株よりも移動 J
立
が大きかった (Fi
g
.0-2A) 。このことより前者の変興を v
mg (~I1 adate r
e
s
i
st
a
n
c
ea
n
d
~atllre gl
y
c
o
s
yl
a
t
ion) 変異 、後者を v
i
g(
Y
d
J
la
d
at
er
e
si
s
t
a
n
c
e川 d_
immat
u
r
egl
y
c
o
s
yl
a
t
i
o
n
)変
奥と名付けた。 vig変異株のうち vig2 、 3 、 5 、 8 、 9変異株の糖 ~n は lîlt 熱型と小!泡体型の
中間程度の分子量を示し、 v
i
gl
、4、6、7
変異例ミは小胞体型に近い分子量を示した。そ
こで前者をクラス l
、後者をクラス 2とした 。また 、0j
:
)
.
1
j
釘i
の分子主t
を調べる R的で、
キチナーゼを精製し泳動皮を比較した。その結果、 vig4、 5、 8、 9変異物、では 0-税~ $
1
1も
短くなっていることが確認された (Fi
g
.0
-2B) 。これら v
i
g
変異の中には当然既知の遺
も含まれていると考えられるが、相 1
i1i性テストや遺伝子組み込みといっ
伝子の変興事K
た逃伝学的手法により、
i
gl
=ViJnl
=oc!
J
3 [K加i
k-E
n
n
u
la
ra
n
d Nefr
,1
9
9
0
]、
¥
l
v
i
g3=an
p
l[M
巴I
n
icka
ndSh
巴r
r
na
n,1
9
9
3
;Chapmana
n
dMunr
o,1
9
9
4
]、 v
i
g6
ごm
nn
9[
Ba
lo
le
l
a
.
l,1991;Yipelal
.
,1
9
9
4
]、v
i
g7=oc
!
J1[
Nakayama e
la
l
.
,1
9
9
2
1、v
i
g
8
=
s
e
c
5
3
=a
J
g
4
[
B
e
r
n
s
t
e
r
i
n
e
t
a
l
.
,1
985
;K巴pe
sa
n
dSchekman,1
98
8]であることが、また p
mi40、e
r
d
l、k
r
e
2、pmrJ
変
異は v
i
g
変異の中には含まれていないことが確認された。
本研究においてはこれら V
l
g変異のうちごっの相補群に属する変具については相補す
宣伝子をクローン化して解析 を行い、機能未知であった三群の V
T
G
.
泣伝子に
る野生型i
ついてはそのコード、する蛋白質の生化学的解析を行った。
N
l
i
n
k
e
d
庁7nn4
一
一
一
mnn6
Asn-NH
X
ベ~
Ser
f
T
hr
c
o
r
eo
l
i
g
o
s
a
c
c
h
a
r
i
d
e
mn
円1
・
川@
0l
i
n
k
e
d
mnn1
GPIanchor
ムr
p
d巴
J
m
,
@
@EDn-1.6-GlcN <
i
i
l
l
@問 IcNAc ⑪
⑮
s
-l.
4-Man
⑫
怯1,2.Man ⑪
P~ーNH-f -pmtem
。
I
nosi
t
o
l
。伽
… @ 仕Man
no
l
仕1.3-M剖 ⑪
αl,
4-Man
F
i
g.O
l出芽酵母における糖蛋白質と糠脂質の糖鎖構造
8-
@D α哨
.
Man
A
ν
ma
V
f
g
v
l
g
一
一
・
'
",
・
.
.
.
:
:
.
.
:
:
.
.:
・
:
:
:
:
・
'
",
・
"
-
c
l
a
s
sI
c
l
a
s
s1
!""~円守
町 町 町 町 ト 町 内 同 司 町 ト -- 守 也 k
E
:E
:E
:E:正
‘
.!:1> .!'?> .~ .~ .!'?>ぎ .!,?> .~ .!,?> .!,?>
‘
:
:
.
.
2 2
2
.",.
B
、
、
﹀
﹄
︻
町R a
E
N町
E註
町
v
円
h
w
R
E
寸 Nhz
崎町一宮
町
e
h
町E
l一 円
間 一
h
h
古
YS﹀
A
地 h a﹀
﹁同
雪
c一
寸
川
引
一
S一
山一
h
一k
s、
hRCE
。
、
官
ド﹀﹀
・
=
ヒ
且
h
130kD.
.
F
ig.02v
i
g
,vmg変異株におけるインベルターゼ (
A)とキテナーゼ (
B)
9
-
第 l章
VJG9遺伝子の 単向!~と機能の解析
1
1 序
v
i
g
9
変異株は vi
g変異のうちのクラス lに属し、 N-,
O-結鎖ともにコアと成熟型の巾間
g3,v
i
g
5
,v
i
g8がある。 VI
G3は
程度の大きさを示す。クラス lの変臭事長として他に vi
ANPlと同 ーであり 3章で解析した。 VJG5は MNNIと同 一 で こ の 遺 伝 子 産 物 は α
ー 1 , 3 ・ Mannosy ltransferaseであり、 N 型機în の lU1J 鎖を付加する結 tJfi 移防~i去であるため変異
名1<では糖蛋白質の大きさがコアと成熟型の r
l
"間程度ー
になる [
G
r
a
hame
la
l
.,1
992]
0 Vf08
はSEC53/AL04と同一でこの遺伝子産物はホス 7 ;jマンノムターゼである[Bems
t
er
inel
aJ
.,1
9
8
5
;Kep
esandSchekman,1
9
8
8
)。これはマンノースー 6
Pをマンノ ースー トPへと 変換
する酵素で、糖の供与体である GDP-マンノースの前駆休の合成を行う。そこで変異例日
では GDP-マンノースの供給量が低下することにより糖鎖不全となる。以上を踏まえ
v
i
g9
変異を相補する遺伝子のクローニングを試みた 。
1
-2 結果
1
2
1
yig
9
:
変異株の形質
v
i
g
9変異株 は円i
g変異のうちのクラス lに属する変異株で、 A1
3
-l
8を主1;¥株として二つの
アリ ール (
Y
i
g
9
-1、 v
i
g
9
2
) が待られた。これらの生 3
1
1
zは 2
5'Cおよび 37'Cでもまた
YEPD
培地お よびSD
培地でも、野生株と変わらなかった。出!日胞からペリプラズム間分
SDSPAGE)
を調製し、 SDSのはいったポリアク リルアミドゲルで電気泳動を行った (
後、活性染色を行って、分泌糖蛋白質であるインベルターゼの分子量を野生株および
既知 | の糠 ~l~ 不全変異株である mnn9変異株 [B alloll e
ta
J
,. 1
991
;Y
i
pe
t"
,
,. 1
99
4
1と比鮫し
i
g9変異株における Nー
結合型糖鎖は野生株と mnn
9変異株のじ"
1l
I
l
J程度の
た。その結果、 y
Fig.ト1A
)。またこのインペ J
レターゼの分子量が精鋭
分子量であることが分かった (
の大きさのみを反映しているかどうかを調べるため に
、 それぞれのインベルターゼを
エンドグリコシダーゼHで処遇!す ることによ り糖鎖を除いたインベルターゼを免疫沈
降に よ り回収 し大きさを 比 較した (
F
ig
.l
1
B) 。その結果、インベ ルターゼの蛋白質
部分の大きさは等しいことから 、 vig9変異株では外椴 ~l'l の付加 に欠損があることが佐
かめられた。
また 、細胞培養液中に分泌されてきたキチナーゼをキチンと共沈させることにより
PAGEした後クマシープリリアントブルー (
CBB) で染色を行っ
精製し 、 これを SDSi
g
9
1
変興株における 0結合
て、キチブーゼの分子量を野生株と比較した。その結果、 v
三株より少し小 さいことが分かった (
F
i
g
.1
-IC)。
型精鋭は野正l
'
l
l
の構造異常により細胞表層のマンナン蛋白質の性質か変 化 し、そ
次に変奥株は糖j
i
g9変異株の薬剤感受性について調べた
の結果物質の透過性も変化 していると考え、 v
(
T
a
b
l
e1
-1
)0 v
i
g
9
変異株はジェネティシン (
G41
8
)に
士
、J
して感受性の上昇・が観察さ
i
g9
変異株では細胞同士の凝集性の上昇が観察された (
S
a
k
a
k
i
b
a
l
・
a
,1
99
3]
。
れた。その他
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C
.
I
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D
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v
i
g
9
変異株におけるインベ jレターゼ (
A
)(B)とキチナーゼ (
C
)の大きさ 。
(mM)
W.
T.
.
0'
v
i
g9
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ぶ
ぶ
;
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亙$
J
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九
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.
_
W.
T.
巴ト 1I
J
j
j生株と v
i
g9
変異株における薬剤l
感 受 性。数字は最大生長非阻害薬剤l
濃度
Tab1
を示す。
1
2
-
ー
ト2
-2 VIG9
遺 伝 子の ク ロ ー ニ ン グ
v
i
g9
変異株ではジェネテ ィシンに対する感受性が上昇していることを利用して v
i
g
9
家
具を相補する野生型遺伝子のクローニングを試みた 。 H1
7-6C (
MAT
i
l、 νi
g
9
1l
e
u
2
3i
r
p
J) にGI
6酵母ゲノミックライブラリー (
I
owcopy、 TRPI) を形質転換し、レ プ
山富
リカ法でジェネティシンに対する ~ljH生を野生株程度まで獲仰ー したことが確認された形
質転換体を選択した 。 さらに、インベルターゼの活性染色によって粉鎖が賢生株程度ー
a'しているものから、独立した 3積郊のクローンを回 4
反した (
pSV901、 902、
まで回 1
903) (
F
ig
.1
2) 。インベ Jレターゼの分子査を 指標としてサプクローニングを 行い、
v
i
g
9
変異を相補するために必要な領域を pSV903のHindm-Sau3AIIBamH
12.5kt
ヲに限定
した 。
F
ig
.I
3
) 、この中に 361
アミノ酸をコードするオー
この全領域の塩基配列を決定し (
プンリーデイングフレーム (
ORF
) を見いだした。配列から予怨されるこの蛋白質の
分子量は 39,
565でpHi5
.
9
3であった。上流域には TATAボックスであろうと思われる配
F
i
g
.1
3アンダーライン) 。 また下流域には 3カ所のポリ A付加シ
列 が3カ所見られた (
グナルが見られた (
F
i
g.1- 3 点線)。この領域が vig~変興株で変異の起こっている j1!伝
子 で あ る こ と を 示 す た め 、 H17W (MATa
i
!
α、 v
i
g
9
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v
i
g
9
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a
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こpSV921をHp
l
II
で切断した後形質転換し、 LEU2+となった形質転
換体を胞子形成させ、四分子解析を行った結果、 VIG
g
+とLEU2村立連鎖していること
が権認された。このことからこの領域にコードされている活伝子が VIG9
遺伝子である
と結論した。また pSV914に乗っている領域以外の他のクローンの塩基配列を部分的に
決定したところ、 5
'仰l
の下流域には転 2
5因子をコードする MBPI遺伝子が[Koch e
ta
l
.
,
1
9
93]
存在することが分かった。 MBPIは染色体四番に存在していることが報告されて
いることから [Koch e
tal
.
,1
9
9
3
]、 VIG9
泣伝子も染色体四存に乗って いることがわかっ
。
ヲ -
~Æ
H
号
a
Complementatlon
。v;g9
I
f
++++
pSV901
pSV9
担
pSI
l
9
0
3
pSV905
pSV907
pSV908
pSV914
+
"b
F
i
g
.1
2VIG9
遺伝子の制限酵素地図。図で示した領域が v
i
g
.
勿変異を相補するかどうか
をプラスミドの名前の右に相続する場合は+でしない場合は司で示す。
ATGCTGCACC CG
i
'
;
τC
CTI'CT TACC
叩 C
G
τロ CTGGG
叩l;AA AGCAAGACTA
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1
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CτI3CA1¥CTCTG
CCTI
l;AA
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TTTCTATCATτI3CCT
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l;AAl;AAA1¥ A
1¥
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3
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TrITTCご A
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G
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1
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主
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G
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I
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-601
-541
481
-421
-361
-301
-241
-181
-121
-61
-1
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
840
900
960
工020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1976
F
i
gト 3VJ
G9
遺伝子の塩基配列及びコー ドされる蛋白質のアミノ隊配列。アンダー
)A付
ラインで示した箇所がT ATAボ ックスと考えられる配列、 J.'!.紛{で示した箇所がポ 1
加l
シグナル。
1
2
3 VI
G必宣伝子の解析
VI09遺伝子が酵母 の生育にとって必須であるかどうかを調べるため、二 fl~i{本の株を
用いて 一方の V
J
09
泣伝子か市I
峻された株を作製した。遺伝子破壊川 に Vf
0
9
J
宣伝子の
H
p
a
lSi
u
f問に L
E
U
2
i
f
i
伝子を Hp
a
J
S
I
II
lで切り出してつなぎ、このプラスミドを Vl
0
9
i
f
i
伝子の両端で切断して直線状にして、 W303株に導入した。 このプラスミドがゲノム
上に組み込まれていることを、 VJ0
9
泣伝子の両端に対応するプライマー lと2を川い て
PCRを行い M
・
認した。胞子を形成させた後31個の四分子解析を行った結来、四つの j
泡
子のうち生育可能なものは各々二つで (
Fi
g・ト4) これらの表現形はすべて l
e
u
2であっ
9遺伝子は酔母の生育にとって必須な 遺伝子であることが示さ
た。 このことから、 VI0
れた 。
eとD∞l
i
t
t
l巴の方法 [Kyt
ea
ndDooi
lt
ue
;1
982]
に従って
次に Vig9iIX白質の疎水性皮を Kyt
プロットした (
F
ig ト5)。 この図より V
ig
9蛋白質は全長にわたり親水性であり、シグ
良i
ITi領域として機能するような配列は見 られなか った。 よって V
ig9蛋門
ナル配列や 1英一
質は細胞質で機能するものと考えられる 。
#るため、 FASTAプログラム [
P
c
ar
s
ona
n
d
次に Vig9蛋白質の機能に関する手がかりを f
988]
を用いてデータベースを検索したところ、この蛋白質は新規の i
l
1
:内質 で
Lipman,1
あるが、いくつかの細菌の薮白質とのホモロジーが高いことが分かつた (
Fi
g.ト6) 。
a
l
mo
n
e
l
h
lt
y
p!
Ji
m
u
r
i
u
J
J
J
のRtbF蛋白質 [
J
ia
n
ge
l
a
l
.
,1
9
9
3
]とはお lアミノ酸にわたっ
その中でS
て 32.7 % のアミノ般が一致し ており、 この蛋白質は O.抗原の~合成過 稜においてグル
コース ー
ト リン酸と CTPから CDP.グルコースを形成す るような 酵 素である。 Ye
r
s
川l
a
の RtbF蛋白質 [Ke
s
sl
ere
!a
.
l,1
9
93
]とは 257ア ミノ厳にわた って 31
.1
%
ps
eu
d
owb
e
r
c
u
l
o
s
i
s
のアミノ蔽が一致していた。 Yer
s
i
n
i
le
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r
r
o
c
o
l
i
l
i
c
a
のRtbA?
l
J
:
白
質 [Zhange
t
a
1
.
,1
9
9
3
]とは
254アミノ│般にわた って27.
6%のアミノ i
骸が一致しており 、この蛋白質は dTDPレラム
ノースを形成する酵素である。 Sc
r
e
p
lo
my
c
e
sg
r
i
s
eu
s
のStrD蛋白質 [
D
is
t
e
re
la
l
.
,1
98
7
]
とは
3
3
9アミノ般にわたって 23.3%のアミノ酸が 一致しており、この蛋 r
'
l質iidTDP-L-スト
レプトースを形成する隣家である 。これらホモロジーの高い蛋 仁I
r
tには共通した特徴
がある。つまりこれらの酵素はすべて糊リン阪とヌクレオチド三リン円安から糖ヌクレ
オチドを合成する反応を触媒するのである。そこで4邸ll'í不全となる綾な変異例えの JI~1!t 、
蛋白質が親水性であること、そして上記のホモロジーの紡烈:より、 Vig9i
'
l
'
f
白i
f
1はマ ン
から GDP
ーマンノースの生合成を行う GDP
ーマンノースピロ ホス
ノースートリン敵と GTP;
フォリラーゼであると予想された。
千→←モゴ包(>
5
0
0
b
p
c
B
I
I
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,
c
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ヘ-~".
ふ ぷ2
4
.
0
k
b惨
2
.
3
k
b.
.
.
Fig.1
4 VIO
必宣伝子破壊株の作製。 (
A
JVJG
!
i
j
宣伝子を LEU2i
宣伝子によって破壊する
B)遺伝子破壊のサザンプロッテイングによる確認。
ための DNAフラグメントの機築。 (
野生型の染色体は 1
.8kb、破壊された染色体は 3.
5kbのバンドを生じる。 (
C)VIG9
遺
. 伝子
の一方を破壊された二倍体の四分子分離。
3.
0
司
H
也
E
司
£
E
O
色
2
L 0
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0
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τ
3
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3.
0
5
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1
5
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ResidueNumber
F
i
g
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5予想!される V
i
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一一一E
圃置ßI橿喧盟車且咽血E盟E
悶冨担4
岨
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一E
臥
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畑~炉~~叫必岬命伽び凶Y澗咽恩l
乱 州臥咽圏
四1I (iI酢
E
蜘
μ
V将J必G引
附1 略伽口町寸
一圏 l崎岨哩喧由酎
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4也附個附蜘蜘~I咽
唖LIハISTP
慨E
1
5
6
1
羽
5
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3
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3
5
5
F i g. 1 -6 予想 される Yi g9 とホモロ ジーの高い細菌の蛋白質のアミノ酸 ~G 7jIJ の 比 較。
S.RfbFは S
al
mo
n
e
l
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y
p
h
i
mu
r
i
u
mの RfbF蛋白質、 Y.RfbFは Ye
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RfbF蛋白質、 RfbAIまY
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rDは S
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eu
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S
t
r
D蛋白質を示す。 Yi
g9と同ーのアミノ酸を反転文字で 3
交わす。
2
0
-
1
2
-4 Vi
g9蛋白質の機能解析
前記の仮説を証明するために、それぞれの酵旬.の l
笥体 J
l
l
l
t
lJ液をJl1いて GDP-マンノー
α32P]GTPとマンノースー 1
-リン
スピロホスフオリラーゼの活性のアッセイを行った。 [
L
l
J液と混ぜてインキュペートし、その後混合計主を TL
Cで展開した後 GDP
田
マ
酸を菌体制l
ンノースにあたるスポットの放射ffi1~I: を iJ1IJ jÈし GDP- マンノースピロホスフォリラーゼ
活性とした。この活性が菌休抗l
I
/
:
l
:
li
1
主の蛋白質孟との相│苅を調べたとき直級状になるこ
とを確認した後 (
F
ig
.I
7) 、野生株、 vi
g9変異株、 VT0
9
.
逃伝子を多コピーで保持し
在間経過に十'
lう
て い る 株 、 また変異株に VJ09泣 伝 子 を 低 コ ピ ー で 導 入 し た 株 で H
(
3
2P]GDP-マンノースの生成量の変化を調べた (
F
ig
.1
8
) 。その結泉、変異株では
GDP-マンノースピロホスフォリラーゼ活性が非常に低く、多コピー株では 3
4併l'
i
U
;
i
t
活性が上昇しており 、 また変異株に VJO必泣伝子を低コピーで導入した場合活性はIJ'Ì" ~I二
株程度まで回復していた。更に変異株における活性の低下が、阻害物質によるもので
ないことを {í(I;[i~するため、変異株および野生株の菌体抽出液を混合し術性を ìl!lJ ったと
ころ 、 これは野生株と変わらなかった (
F
ig.
I8)。一方、この遺伝子を多コピーで進
l
をインベルターゼおよびキチナーゼで硲認したが、特に野生林と比較
入した株の相官 H
して違いは見られなかった (
F
i
g.ト 1
)
。
,
さらに V
i
g
9がGDPマンノースピロホスフォリラーゼそのものであって、?舌↑l
Hl
j
f
j
卸因
子でないことを示すため、グ jレタチオン Sトランスフエラーゼと V
ig
9の融合蛋白質を
大腸菌を用いて発現、精製しその活性を i
J
!
J
I
定した (
F
ig
.ト9)。その結果、 GST
V
ig
9
を加えたときにコントロールの GST
のみでは見られなかった GDP
マンノースのスポッ
9遺伝子は GDP-マンノースピロホスフォリラー
トが見られた。これらのことから VIG
ゼをコードする構造遺伝子であることがわかった。
g9-1
また、野生株と変異株の細胞内の GDP-マンノース量を比較した。野生株及び vi
変異株を (
"C
]マンノースを含む培地で生育させ細胞羽1
1
出液中の GDP
マンノース ー
監を
21
-
定f
i
ーした。すると、 v
i
g
9
-1
'
O
.異株では野生株の 70.6%に侃下していることがわか った。
0
1
音量の NTPを加えることにより反応がどの;
限度 l
i
l害されるのか
次にこの反応系に 1
F
i
g
.
l
l
0)。その結来、 GDP
匂マンノースの精製品はコントロールと比蚊し
を調べた (
Pでは 1
8%、ATPでは 51
%、UTPでは 67%、CTPでは 87%であった。またマンノー
てGT
JIlえなかった場合活性はコントロールと比 t放して 7.1%で、これは
スィ リン固まを系に )
蘭体上清に少量合まれるマンノースートリン般と反応したことによって生成されたもの
と考えられる。これらの結果から、特典性が低い可能性が考えられたが、先の組み換
え蛋白質を
mいて特異性を部べた場合には、基質として GTPとマンノース
1
-リン般以
外の組み合わせではほとんど活性がなかった(阿部、私信)。
上記の結果から、 Vig9
蛋白質は GDPマンノースビロホスフォリラーゼそのものであ
マンノースの生合成の最終段階で機能していると結論した。
り
、 GDP-
4000
3000
口
.
.
.
J
(
/
)
0
.
.
2000
1000
TM10
TM1O/
pSV923
10
20
P
r
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t
e
i
n(
μ
g
)
F
ig
.1
7GDPマンノースピロホスフ ォ リラーゼ活性の測定。0が野生株、口が VIG
9
を多コピ ーで発現している野生株の細胞質函分を用いたときの活性を示す 。活性は合
成された GDP
マンノ ースの量で示す。
2
3
-
100
80
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一
一
.
一
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H17-6C
TM10/pSV923
-1骨ー
H17-6C/pSV914
ーでγー
TM10+H17-6C
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2
4
6
B
1
0
1
2
Time (
m
i
n
)
F
i
g
.1
8GDPマンノースピロホスフォリラーゼ活性の株による比較。
0は野生株、
. は VIG9を多コピーで発現している野生株、ロは vig9~ 異株、 ・ は VIG仇宣伝子を低コ
ピープラスミドにより供給されている v
i
g
9
変異株、ムは野 生株と v
i
g
9
変異株の細胞質
画分を用いたときの相対活性の経時的変化を示す。
24-
GDPMan
幽
GTP
GST
GSTVig9
Fig.)
9GST-Vig9による GDP-マンノースピロホスフォリラーゼ活性。細胞質画分の
代わりに精製した GST-Vig9を加えたときの TLCのオートラジオグラフィー。
2
5-
120
100
εa
aoo
(ポ ) 可 申 FC ﹄
O比 由 岬OEC司
80
60
40
20
。
C
o
n
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o
l
ATP
CTP
GTP
UTP
Fi
g
.
1
-1
0ヌクレオチド三リン酸による競争阻害効果。 1
0倍量のコー J
レドの NTPを系
o
n
t
r
o
lとして何も加えないときを 100%として相対
に加えたときの活性の変化を示す 。 C
活性を示す。
J
3 考察
本軍ーでは精鋭不全を示す v
i
g
9変異を相補す る澄伝子のクローン化をおこなった。塩
nn
i
g
9i
1
i
基配列を決定し、そのコードするアミノ酸配列のホモロジーの紡'*より、 V
はGDP-マンノースピロホスフォリラーゼではないかと予怨した。そこで酵母の
m体引j
I
I
l
:
¥i
夜を用いて GDP
マンノースピロホスフォリラーゼの活性のアッセイを行い、さらに
は組み換え蛋白質を大I
1
号蘭を川いて発現、精製し活性を i
l
l
J定した。これら ー辿の実験
から Vig9iU:白質は GDP-マンノースピロホスフォリラーゼそのものであると結論した 。
この目孝素は紙鎖合成の|努の基質である GDP司マンノースのとI~ 合成過設における最後の段
階を育jる解素であり、この酵素の変興がGDPマンノースの供給 j
立を減らし、その結果
マンノースの生合成過程に関与する泣伝
粘鎖不全となるものと考えられる。この GDP-
q
:
P
a
y
t
o
ne
ta
l
.,1
9
9
1
;S
m
i
U
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ta
1
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9
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2
]、 SEC5
3/ALG
4
[
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l
.
,
子 と し て PMT4
1
98
5
;Kep
巴sa
ndSC
he
k
:
ma
n,1
98
8
]遺伝子が知られている。これらの遺伝子はそれぞ、
れホ
ig ト 1
1に
スフォマンノイソメラーゼ、ホスフォマンノムターゼをコードしており、 F
示した GDP-マンノースの生合成過程の段階の一つを担っている。これらの遺伝子の変
異株は共に糖鎖不全の形質を示し 、現夜知られている変児株は温度感受性で高 i
s¥で純
*~~不全および蛋白質輸送が阻害され、また遺伝子被l鹿株は致死である。 VJG9.遺伝子の
遺伝子依壊株は致死的であるが、 v
i
g
9
1,
v
i
g
9
2変異株は 37'tにおいても野生株と同程
度の生育を示す。 一方、これとは別の細胞壁E
の剛性が低下している変異株のスクリー
J
立伝子に関する変異株が取得された (
K
a
w
a
c
l
a,1
99
7
]。この v
i
g
9
3
変奥
ニングから、 VIG9
株は浸透圧保護斉J
I
存在下でのみ生育し、高 i
民感受f
生である。またこの変異株では制1胞
9
9
7
10 これ
墜に繋留される蛋白質が細胞外へと漏出するという形質を示す [Kawada,1
ら変異株はすべてリーキ一変異株であり、致死的になるまでには GDPマンノースの合
成量が低下しないような変奥を持っていると考えられる。 GDPマンノースの合成が止
まると蛋白質に付加するべき糖鎖がコアの部分からすぺて生合成できなくなるため、
2
7
-
/J、 IJ包体内にトランスロケーシヨンされた蕊 I~I 貨のフ地ールデイングが|泊客、もしくは
安定性低下のために分解されることによって、致死(I~となると忠われる。更に GDP-マ
ンノースは G
P
I
-アンカーの生合成に
mいられる。細胞慌を構成しているマンナン蛋白
アンカー化されたのち刻1I1J包墜へと移行することがわかっている。そ
質はいったん GPl
こで GP
Iの生合目立を阻害すると細胞獲の合成の低下という形質を示すと考えられる 。
一方、ゴルジ体において付加される外秘鎖の付加に関守寸ー
る 泣伝子の倣峡株は致死 (
I
(
J
とはならず、 v
i
g
9
3
変異株 '
1
'でもコア糖 J
J
'
[はやJ
J
J
I
Iされていることから、 GDP-マン ノー
スの生合成に関与する逃伝子 l
政域株が致死的となるのはコア糖鎖の合成が不可能とな
ることによると考えられる。
w芽酵母における NDP-Hexoseピロホスフォリラーゼとして、
UDPガラクトースを
トグルコースを と
l
三合成する Ugplカ匂見在まで知られていた 打句I
m
a
生合成する Gal
7、 UD
e
fa
.
l,1
98
5
;Da
r
a
ne
l
l
l
/
.,1
9
9
5
)0 これら二つの蛋白質はそれぞれファミリーを形成して
おり、動物細胞に到るまで多くのホモログが存在していることがわかっている 。本研
究で新たに見い /
1
¥された V
ig
9には醗母ゲノム中だけでなく、真絞生物でまだそのホモ
1_
,
ログは報告されていない。 Fi
g,
J
て示したように Vi
g
91
立原核生物の NDPH
e
x
o
s
eピロホス
a
フォリラーゼと高いホモロジーを示すことから、この蛋白質は進化的に保存されてき
たNDP-H
e
lWs
eの合成貯ー素として新たなファミリーを形成していると考えられる 。酵何
f
l含ま
における糖鎖は大量のマンノースを含んでいるが、高等真核生物ではコアに -f
マンノースを大量に生合成する必要のない高等
れているだけに過ぎない。そこで GDP
g
9のホモログが有 在していない可能性がある 。 この場合、兵菌
真核生物においては Vi
4
g
9は有望であり、そのスクリーニング
に対する新たな抗生物質のターゲットとして Vi
にv
i
g
9
変異株は有用であると考えられる 。
Fructose-6-P
Pmi40
Mannose
'~ Mannose-6-P
Sec53
Mannose-1-P
GTP
Wu~ ③
GDP-Mannose
F
i
g
.1
1
1 I:U芽酵母における GDPマンノースの生合成経路。
第 2章
VIG4
遺伝子の単離 と機能の解析
2
-1 序
vig9変興株は vig変異のうちのクラス 2 に J/.正し、 N- ,O-糖 ~rl ともにコアlli!に近い大きさ
を示す。クラス 2の変異株として他に v
i
gJ
,v
i
g
6
,v
i
g
7がある 。 VIGJ.VIG6はそれ ぞれ
VANJ,
MNN9と同ーであり
3章で解析した。 VI
G7
はOCHJと同 一でこの遺伝チj
宝物は
1
長させる 際の
α1
,
6
-Mannos
yl
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
巴であり、 Nlli!糖鎖のコアからパ ックボーンを や1
,
6
-マンノースの付加を触媒する [Nak
l
l
y
a
m
ae
taJ
.
,1
9
9
2
]0 そのため 、変災株
最初の αー1
では相11'?Ji 1~1 質の大きさがコアとほとんど同校皮になる 。ただし ひ粧鎖に変化はないと
いう点で vig4 と異なっており vig4は全く 5!~ なる機併で糖鎖不全となっていると考えら
れる。以上を踏まえ v
i
g
4
変異を相布Iiする泣伝子のクローニングを試みた。
2
2 結果
221 vig4
変異株の形質
v
i
g
4
変j
建
材dまνほ変異のうちのクラス2に属する変民総で、 A5-8-1
Cを税株 として 8
株が、
A1
3
-1
8を親株として 6株が、また YP
l
l250をおL
株として l
株が符られた。これらの'1'.Ti'
は25"Cでも 37"Cでも野生株と変わらなかった。細胞からペリプラズム間分を淵製し、
SDS-PAOEした 後、免疫沈降を行って、分泌総蛋白質であるインベルターゼの分子 l
止
を野生株および既知の糖鎖不全変災株である v
i
g
9
変兵一株と比較した。その*,,'[来、 v
i
g
4
変児株における N-結合型粘 ~J'i' ま vig9変 J~~ 株よりも更に小さい ER ~日とほぼ同じ分j'-1'上で
あることが分かった (
Fig.2-IA) 。
また、細胞培養液中に分泌されてきたキチナーゼをキチンと共沈させることにより
i
i
-を貯生株お
精製し、これを SDS-PAOEした後 CBB染色を行って、キチナーゼの分子i
結合型糖釘i
は野生株よ
よびv
i
g
9
変興株と比 '
険した。その結果、 v
i
g
4変異株における 0、さい分子量を示すことが分かつた (
F
i
g.
2
-IB) 。
りも、 v
i
g
9
変興株よりも更にノl
株は糖鎖の構造異常に よ り細胞表層のマンナン蛋白伎の性質が変化し、そ
次に変異 i
の紡来物質の透過性も変化してい ると考え、 v
i
g
4変異株の楽斉I
J
感受性について調べた
(
T
a
b
l
e2
-1
)0 v
i
g
毛変異株はシクロヘキシミド、ハイグロマイシン Bやジェネティシン
(
0418) に対して感受性の上昇が観察された。その他、 v
i
g
4
変異株では細胞同上の凝
集性の上昇が観察された [
S
a
k
a
k
i
b
a
r
a,1
9
9
3
)。
守
。
﹃
﹀
・
一
戸
一
コE ﹁ト.﹀﹀
白
阿
古
.
hB
O
﹄ぢ
由﹀戸.﹀﹀
同
月
可
、
日
内・守
OHU由﹀¥.↑.
E
P
﹄
N
H
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h凶﹄﹀
h・守﹄叫三
町。 ﹀
で守町三
.
hB
B
03・
一
日
一
コE ﹁ト.﹀﹀
守
A
Fi
g
.
2
-11
野生株と v
i
g
4
変異株にお ける イン ベ l
レターゼ (
A
)とキチナーゼ (
B
)の大きさ
1
V
a
n
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d
a
陪
Cy
c
l
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x
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e S
F
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SD
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>364
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ー ーートーーーーーーーーー ーーー ー
ー
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G
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山 n
g
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ー ーー ーーーーーーーー ーーーー一一---一一ーーーーーー・ーー ーーーーーーー ーーーーーー・
200-300
16
182
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Tabl
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-1野生株と v
i
g
4
変異株における薬剤感受性。数字は最大生長非阻害楽拘!被皮
を示す。
3
2
-
2-2-2
VIG4
遺伝子のクローニング
v
i
g4変異株ではジェネティシンに対する感受性が上好していることを利用して v
i
g
4
'
$
:
.
3~ を 中日中iIlす る野生型巡伝子のクローニングを試みた。 K2- IC (
MATα、 v
i
g
4
2J
eu2
肝心 J
y
s
Jl
ys2h
i
s
3
) にCI
O
酵母ゲノミ 7 クライプラリー
(
I
owcopy 、 LEU2) を形 ~/t 転換
し、レプリカ法でジェネテイシンに対する耐性を野生株程度まで狼得したことが概認
された j
形質転換体を選択した。さらに、インベ l
レターゼの活性染色によって制鎖が日!f"
t
虫類のクローンを回収した (pSV401) (
F
ig
.
生株程度まで回復しているものから、 I
2・2
) 。インベ J
レターゼの全〉子量を
m相としてサブクローニングを行い、
v
i
g
4
変
wを布│
布1するために必要な領域を pSV401
の HindJU-H
i
n
d
I
I
I3
.1
kb に限定した。この会瓜JJ;~~
列を決定したところ (Fi
g
.
2
3)、この巾に 3
37ア ミノ酸をコードするオープンリーデイ
ORF) が含まれることがわかった。配列から予:思されるこの蛋白質の
ングフレーム (
うド子量は 37,
018でがは9.
6
1であった。
Vig4
蛋白 1
qの疎水性度を KyteとD∞Iit
l
l巴の方法 [Kyt
ea
n
dD
o
o
l
i
t
u
e,1
9
8
2
]に従ってプロ ッ
F
i
g
.
2
4
) 。 この図より Vi
g
4iU白質は会長にわたり疎水性であり、何回も l
換を
トした (
見通していると予怨された。
Complementat
1on
+・+・+
~
百
z
a切1111
王 E 伺mill-pSV401
μJJ
pSV402
pSV403
pSV4
加
pS
V405
pSV406
lkb
F
i
g
.2
2VIG4
遺伝子の制限酵素地図。図で示した領域が v
i
g
4
変異を相補するかどうか
をプラスミドの名前の右に相補する場合は+でしない場合はー
で示す。
AAGCτ可ロ
τIXCAA
'
I
G
τ1
:
1 CGCCATATAT ATAτロCGGCT CCCTTA
'IGA
G TAGAAGAAAA
G1
ロGTACAAA GτIXCA'IGGT GGTATATAGA 'IGTAGGλ且.
CA CCAτ'ITG
λGT
GATTAAATTT CCCTTTTTA
工主主主GAAτTAG CCGCCC
.
l
I
.
TAA CACGA
且AAAT
I
G
AA
引:
GCA A1
主主主CGAAA
ACGAAAGAAG ACACGτ~GCC TAAACGCGTA A'
GT'I明'TCAGA ATC~τTAC CCAGCCTTGG ATAATAGTTT 'IlXCCGAAAA
AAAG
且AAAA
且 且.TTGAAATTT CGCGATCCGA ACAAACAAτ1
:
1 AACAGAAAAA
主TAACGCTGC CAAGCCTATT TCT'II:JT'IロCC G
A
τ寸'
A
A
T'IG
TτI
:
1ACATCCTC
AAAGAGCCTA AGAAAACAλA CACACTAACC ACACAGTATC T目~GCCCGA
'
I
G
AAAACAGGτ'CA'
I
G
C A = CATAACCCTT GGGCTTCAGTτロ
CCAATTCC
KTG HAG HNPW ASV ANS
CTA'ττTI'Aτ~ C
TACτロ
τI:JGT τ'CC
τ'
C
TT
>
ττT T
A
A
τI
:
1
ACGGT GACTAACAAG
工 LS YCG SS 工 L MTV TNK
ATTTGAAGGA Tr'配AACA
'
I
ち AA
CTT'IG
τ'CA也CTTTTCGT GCAAτ'CTT'IG
LKD FNM NFVM LFV QSL
TAACC
T'IG
AT TATCCTACGT ATACτ=Aτ'GCGAAGTT CCGτ'l'CATTA
工 L G Y A K F R S L
T L 工工 L R
ACGCCAAGAA =TTCCCT T
>
τせせ℃σTr'IT TACτIXτ℃宜T G
.
l
I
.
'
I
G
A
TCTAC
AKN WFP 工 SFL LVL M 工 Y
CT'IGGCT G
'
τ可'CCAATTT AC
且CCA
T
'
I
τT CAAGAA
TT'IG
AGGCTTTACA ATA
ALQ YLA VP 工 Y
T 工 F
K N L
:
1
AT
'
I
ロCTTAτIXτ'GA
GGTT CTCT
了I
τ切沼田'GGCTC'IGT CACCτ'CCA
'
I
G
τI
工 AY GEV LFFG GSV TSM
CA
TTT'I可'GT'I GA'IIXτ~CTTτ℃ττ℃τI:1TCG T'IGCAA
C
τ
τロ GGGτ'GACC
且G
FLL MVL SSVV ATW GDQ
c
τロCCAAGGCτ'GCτ可'CAT'IG G
C
τI
:
1
AAGGAG CAGCCGGτロcτI:1TTGCCτ~C
AKA ASL AEGA AGA V 且 S
:
1 G且τ
ロTTCACC AACτロTAτ'CA C'ITCτ'GCATT ATTCGT'I'<ごTT
GTTATTTCτI
YFW MFT NC 工 T
SAL FVL
AGAGAA'τTAA GTTAACTAAC T'I'<:AAGGATTτ'
C
GAC
且CTAT G
τ
τ可.
TACAAC
LTN FKDF DTM FYN
R 工 K
=ACCTAT 引ごTAT'IロC'IG ~G'τロτIXAAGA TTGGTCT
工'CA
LPI LLL FSFC VED WSS
CCAATAACTT 'IT(アrAACGATτ'
C
GCTAA
C
'
I
ロ CTAτロATCAT CAGτIXτI
:
1
TT
N N F S N D S L T A M 工工
S G V
T
'
I
可= AC'IG
TTCCGGT 叩 G
τI
:
1
'
I
G
TTC G'
I
G
TTACτせ'C G
τ'CT
ACTACA
GTA
工 S Y C S G W C V R V T S S T T
TAGGGGCτTI' GAACAAGCτむ CCAAττ'GCCTτGIX
ヨロG
τ可T GA
Tr'I可℃τ
可守
GAL NKL PIAL SGL 工 F F
且CTTCTr A
τ'CT
Arn:TC τ'CCA
'
τせτ可TA TTGG
T
r
'
I
X
:
CT A
'
τ'CAGGTATT
GλA
S 工 F 工
G F L
S G 工
N F L
S 工 L
τ
τI
:
1
CCAAACA AAAGAAGCAA CAAGCCCAAC CTTr
ACGTAA A
'
τ'GAGAACTT
A K Q
K K Q
Q A Q P
L R K
Ter
I
"
I11111
'
1
'
IG GTTTA
T
r
'
l
'
r
A Tr'l'r
ATAGAG GCATCTAA
'
I
沼
C
A
A
τ可寸'ATTT '
恒ATATACAAT TATAC
Tr
AAA A
'
τ
τ'GATATAC CτTAGA
且CAG G
τむほ}ACACA
士
1
:
1 ACAATAGCGC CTTCτロ
G
τI
:
1
T TTGCCCCAAA
ACTCCAATA
TA
τ℃且CTAA
CTTCATTCτ~ A
ACTAAAτロ
A AT,且CA'IGTTTτ~A'II)CCCAA 1世 田 ,TACCT
T
>
τ'CT
ATA AAATAAGCAT TCTCGTAτ'CT τ'GCCAACCCG
τT'I可'CCCACT GTC
'IlXCTTTr'IX: A
AAτロCTTrA ACAτロτIX
Tr τ'GCAGACCAG CGTAτ℃τロτ℃
CACAATA
'
I
G
TC
A
A
τ'
C
CATCA A
A
.
'
J
l
l
M
τ'CCG CTATACCCAA CAA'
詑τ
'
C
AGG
C
G
'
τ1XTr'l'Tr ATAAGCG
T'IG G
τI
:
1
AAAAGCC AC且ATTTA'τ~AAτ'CTTTCCC
GTATAT CAGGTTTCAA GATAτ。r'IGT
Aτ℃τ~CAG CATATTCCτTAAτロ
A
'
τ
τ'
C
C
A
G
τロ CGTTC
且C
τ立
てr GτIXAACAτT
A
A
τ'CATCCAC AAGCCGGTTA T
τ寸AτロGCAAGτ~CATA= T
'IG
TAGTAAG AGTTA'τせ~ AAC
G
'
I
ロAGCA
ATAGTTTCAA G
τロτロTr'lGA AAGAACCτ'CA GTATAGA
T'Iロ'IT(}CA
TAAGA
-481
-421
-361
-301
-241
-181
-121
-61
-1
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1750
1
F
i
g
.
2-3VJ0
4泣伝子の底基配列及びコードされる蛋白質のアミノ殿内C
9
J
。アンダー
ラインで示した箇所がTATAボックスと考えられる配列、点、j
i
S
lで示した筒所がポリ A付
加シグナル。
。
向
︾
3
.
0
0
z
'
。
1
:
. 0.00
H
偲
c
.
O
3
』
〉
z
3.
0
0
100
200
ResidueNumber
F
i
g
.
2
4予想される Vig4のH
y
d
r
o
p
a
t
h
yP
r
o
f
i
j
e
o
300
2
2
3 V
ig4蛋白質の局在
Vig4が
車
l
l
IJ
抱内でどこに存在し 、主のような機能を担っているのかを捌べるために、
V
i
g
4にmycのタグをつけて細胞内 で発現させ、タグに対する抗体を J
T
Jいて免疫 '
1
:(i'~lfJ!I.
析を行った。この細胞からオールガネラの)]英を保った状態でライセートを作製し、遠心
ig4は 1
0,
000g及び 1
0
0,
000gの沈殿回分に存イEしたことか ら何ら
分闘を行ったところ、 V
f
j
g
.2-5A) 。これを確かめるため l
淡を O.8M
かのI
1
英に存在していると予位、された (
NaCI
、1
.6MUrea、 O.IMNU2C03、 1
% TritonX-IOOで処迎して迷心したとこ ろ
、 T
r
i
l
o
n
X- I OO で処J!1lしたときのみ可溶性画分に移行したことから、 Vig4は JJ英且~ i
l型の蛋 r
ir
!
f
であることが示された (
F
i
g.2-5B) 。そこで細胞内のどのJ
I
英に存在するのかを調べる
去により 1
艇を分画した (Fi
g.2-5C) 。これから Vig4はゴル
ためにショ秘密度勾配遠心 j
T
Iいて Vi
g
4
ジ体朕に存在していると考えられた。更に、細胞を間接蛍先抗体染色法を J
の局在を調べたところ (Fi
g
.
2
6
) 、ド y ト状のパターンを示し、ゴルジ体に存在する
と考えられた。
g
4
-my
cは自身のプロモーターを
これまでの系では Vi
mいて発現させていたが、一方
在
、
でGAPDHプロモーターをもちいてコピー数を上げた場合について調べた。この H
V
i
g
4は遠心分画を行うと 1
0,
000gの沈殿画分にほとんどが存布し (Fi
g.2-5A) 、ショ糠
おくなっていた (
F
i
g
.
衝皮勾配遠心分画を行うと低コピーの場合より比重がわずかに 7
2
5
C
) 。そこで間接蛍光抗体染色を行ったところ、 Vi
g4はドット状の染色像を示すが
F
i
g
.
2
6
)。
低コピー状態の場合と比較して、 ドットは大きく厚みのある徽迭であった (
煤蛋白質を大量に発現したことによって初めて見られた特殊なl
I
史僻造体であ
この像は l
ると考えられた。そこで、この細胞を電子顕微鏡を用いて詳しく観察することとした。
急速凍結置換法により固定した野生株及び多コピ一発現株を電子顕微鏡下で観察する
I
牙生事r-では通常見られない幾つもの j
院が重なった傍造が見られたほか、小胞体と
と
、 I
自大していた (Fi
g
.
2
7
) 。糖染色を行うと、この層状の!院はよく染まる
思われる膜がi
ことからゴJ
レジ休由来であると考えられる。このとき Vig4は実際にどの j
院に存千Eする
かを免疫電子顕微鏡により観察した D この H寺、蛋白質の }~j{i位i丘を示すイ~コロイド怯
子はスタックした)j英上及び小胞体J史上に存在した (
Fi
g
.
2
7
)。
A
T
o
t
a
l
P10
P100
5100
L-Vig4
M-Vig4
B
c
n
t
r
o
l
P
5
NaCI
P
5
Urea
P
5
Na2
C03 TX100
P
5
P
5
L-Vig4
・
ー
C
Bottom
Top
L-Vig4
M-Vig4
F
i
g
.2
5Yig4の遠心による分画。(
A
),(
B),(
C
)
L
V
i
g
4は低コピーで、 MYig4は多コピー
でVig4とmycの融合蛋白質を発現させた場合。(
A
)はライセートの遠心による分回、 (
B)
は薬剤処理後の遠心による分画、(c)はショ糖密度勾配遠心による分画。
F
i
g.2
6間接蛍光抗体染色法による Vi
g4の局在。 (
A)
はコントロールプラスミド可(B)
C)
は多コピープラスミドで Vig4とmycの融合蛋白質を発現さ
は低コピープラスミド, (
せた。
F
i
g
.2
7Vig4を多 コピーで発現させた細胞の電子顕微鏡像。 (
C)は(
B)
の凶った領域の
拡大。写真内にあるスケールパーは 200nm。
2
3 考察
本章では粉鎖不全を示す vig4 変異を相約する泣伝子のクローン化をおこな っ た 。 J:l!~
ir両日列を決定したところ、 337 アミノ酸からなる I1英蛋 I'I~ と予想される配列をコード
していた。タグをつけた蛋白質の分画および細胞の染色から、実際に Yig4はJ
I
失l
l
i[
'
1~'t
でありゴルジ休に存在していることを示した。
e
i
!
写/
J
ma
n
i
ad01JOV81Ji
のしpg2と相向性カポ5
いことがわかった [Mae
l
ホモロジー検索から L
a
.
l
,J997]
0 Lpg21
まゴ J
レジイ本において GDP-マンノースを細胞質 1
H
1
1
から│勾股へと輸送する
ae
la
.
l
,1997]。酵母の相同分子である
トランスポークーであることが示されていた[M
Yi
g4はその変異株の形質を考え 合わせ、ゴ J
レジ体における GDPManトランスポーター
であると考えられた。一方で、本研究の進行中 1996年になって、 Y
ig4が我#とほぼ同
l
時J
9
Jに発見されていた酵母の Yrg4/Van2と問ーの分子であることがわかった伊ost
era
n
d
D刷 n;1
9
9
6
]。実 │
僚
に Vig4
/Vr
g
4が GDP
守
マ ンノースのトランスポーターであることは、
De
anらのグループにより最近示された [
D
ea
ne
ta
.
l
,1997]。、小!泡体内 j
控で糖蛋白質に
マンノース残基カ守付加される場合には、 Vig9蛋白質によって合成された GDP-マンノー
スが、細胞質 1
t
!
1
J
でGDP-マンノースからドリコールリン酸に波され、それがフリップフ
I
空側をむき、
ロ γ プによって内 J
ドリコールリン酸マンノースから合 J
!
l
:'
1
'の;fj,lf鎖へと受
良される [Abei
jona
n
dHir
s
c
h
b
e
r
g,
199
幻。しかし、コ・ルシ1
本の内腔では、結の供与体
けi
マンノースであり、細胞質にある GDPマンノースを内舷側へトランスポーター
はGDPl
!
命送しなければならない [
H
i
rs
c
h
l
泥沼, 1
98
7]
。この輸送は GMPとのアンチポー
を用いて j
トで、マンノースを付加した後の GDPをGMPへ と 変 換 し な け れ ば な ら ず 、 こ の
GDPas
eをコードする GDAJ
遺伝子の変異はやはり糖鎖不全となることがわかっている 。
[Abei
jone
ta
/
.,1
9
9
3
]0 Yig4はこのトランスポータ一本体であり、
v
i
g
4変 異 株 で は
GDP
Manをゴ J
レジ体内1
空へ輸送できないために、払当iI'i不全の]彰質を示すと考えられる。
Vi
g4を非常に強力な GAPDHプロモーターの下流で発現させた場合、細胞内に特異な
l
阿部迭を蓄積することを見い出した。この肢はその構造じの特徴および祖f
I染色の結果
からゴJレジ体由来のものであると考えられる。分泌変 j'~・株を JTJ いてJ
J
則的迭を諮綴させ
た場合以外で、/1¥芽酵母においてゴルジ体がスタックしている状態がはっきり
微鏡
i
t子顕
Fで観察されたのは初めての例である 。 これはゴ Jレジ体に局私するべき l
以i
l
i
l
i伎
が大量にJ
I
英に作られた結来、その局在する坊であるゴルジ体の量がi
村えたと考えられ
I
英蛋白質を大量に発現させた場合その局干I
ーは液胞であった
る。こ れまでに、ゴル ジ体J
[
R
o
b
e
r
t
se
tal
.
,1
9
9
2
]0 またゴルジイ判長局任決定領域に変異が入った場合も液l
泡へと ミ
スソー トされてし まう。すなわち小l
泡体 を/l',た後の朕蛋白質のデフォルトの統路は液
l
胞で、これまでに知られていた脱蛋白質の)J英局在機椛が飽和性のものであることを示
している。一方で、 V
ig
4の場合は恐らく蛋白質そのものにゴ J
レジ体局在機構を備えて
レジ体j
燥を明やす方向に車I
おり、量が増えた場合にもデフォルトの経路には乗らずゴ J
1
抱は対応するのであろう。出芳三勝母においてコワレジ体は発達した 1
1
失構造としては観察
i
s
,med
i
a
l,r
r
a
lS
といったサプコンパートメントが笑際に存任
されていなかったため、 c
しているかどうかも定かではなかった。 Vig4を大壁に発現した株を
mいた結果から、
レジ体の構造は高等真核生物と同等の精進及び観性を保ってい
出芽酵母においてもゴ J
ることがわかった。この株を利用す ることにより 出芽酵旬。におけるゴルジ休の生化学
的解析が容易となると忠われる。
GDPase
i
GDP
Lumen
。感
∞
川
川
∞
山
蜘"-1-P
E
E
E
E
E
E
E
!
M
m
z
n
e
c
r
圏∞
d
F
i
g
.2
8V
i
g
4の作用モデル。
4
4
-
Cytoplasm
第 3章
Mnn
9
蛋白質複合体の単離と機能の解析
3
1 序
mnn9
変異名j(は刻I
l
l
f
包表昭の抗原性の変化を指糠として何られた代表的な外機鎖不全変
異抹のひとつであり、 N紙鎖の構造がコア型に非常に近い構造である[Baloletal
.
,
1
991
;Yipet
a
l
.,1
994)
0 出芽酵母の蛋白質の中で Mnn9とおい相同性を示すものとして
Vanl及 びAn
p
lが知られている [
K
a
n
i
k-En
nul
atandNeff
,1
9
9
0
;Mel
n
ickandShcn
lan,1
99
3
;
Ch
a
p
l
l
l
a
nandMunro,
1
9
9
4
)0 v
i
ml変興株は最初パナジン般に対する耐性変異株として取
得され、蛋白質のリン酸化に関与していると指摘されている [Kani
l
←EnnuJatandN巴'
I
r
,
1
9
9
0
J0 ANPIは 染 色 体 V番 に コ ー ド さ れ て い る 巡 一 伝 子 の う ち で 欠 失 に よ り
aminon
i
t
r
ophe
n
o
lp
r
o
pa
n
d
iol
及び高浸透圧に対して感受性になるものとして知られてい
Mel
ni
c
ka
nd
た。また、変異株ではゴルジ体))英蛋白質の局在機構に欠債を生じる [
Sherman,
1
99
3
;C
h
a
p
l
l
l
a
nandMunro,
1
9
9
4
)。
一方 、我々 の変異株の相ネiIlテストによる解析から VJGI,VIG3,VJG6はそれぞれ
V刈 V
l,
ANPl.MNN9と同一であることが明らかとなった。これらの逃伝子によってコー
ドされる蛋白質の一次構造は、どれも N末端側に牒貫通領域を一つもち、お互いにホ
モロジーの高い領域をそれより C末端 1
l
!
1
J
にもっというものである(Fi
g
.
3
-J)。ところがこ
れらの蛋白質の機能についてはほとんどわかっておらず、興味がもたれたため解析を
行った。
i
g
6
46.0kDa
F
r胎隠
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
、
Nig3
直S
A
'
~
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
65%
,
,
巴,
,
,
,
,
一
5
7.
3kDa
日
口
…
HomologyD
F
i
g
.3
-1Mnn9ファミリー蛋白質の一次構造。 アンダーラインは抗体作製の!努に抗原
として用いた領域。
46
-
3・2 結果
3
2
1 変異株の形質と蛋白質の構造
ま ず そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 の 破j
袋株を作製した。破峡株は致死ではないが、 .
1a
np1
,
.
1mnn
9
株では特に生長が遅い。 また、その糖お1
を調べるためにインベルターゼ及びキ
チナーゼの分子量を比較した (
F
i
g.
3-2A)。 すると、 N糖 鎖を付加されるインペルターゼ
は.1v
an
l及 び.
1mnn
9妹ではコアに近い大きさを、 .
1a
n
p
l林ーでは野生型とコア砲の 1
1
'
l
m限
度 の 分 子 量 を 示 し た 。 イ ン ベ jレターゼをエンドグリコシダーゼHで処迎して分子立を
比較するとすべて同じ大きさを示すことから、分子量の変化は蛋白質でなく紙による
ことがわかった (
F
ig3-2
A)
。 一 方 で0糖;i
t
!を付加されるキチナーゼの分子主は野生株と
目
ほぼ変化がなかった (
F
i
g.
3
2
B
)
o.
1m
n
l
l
9
株では迎!山はわからないが分解されてし まい検
出できなかった。ただし、 mnn9変 .5'iH'~とでは検出でき、野生株と差異はなかった (Fig.
0
2
)。
A
W.T. ,
1v
an1 ,
1anp1 ,
1mnn9
EndoH
+
+
+
+
r一
一一ー一一一ーー一一ーー一一一一ーーー一一
165ー
B
W
.
T
.i
¥v
a
n
1Aa
n
p
1Amnn9L
lh
o
c
1L
lm
n
t
1
130ー
F
ig
.3
2Mnn977ミリー遺伝子破壊株におけるインベルターゼ (
A)
とキチナーゼ (
B)
。
E
n
d
oH+はEndoHを}
J
l
lえてインキュベートした後、免疫沈降を行った。
3
-2
-2 蛋白質の局在
次に、夜白質の!市在及び生化学的 j
抑制?を行うj;
l
的で抗体の作製を行った。抗原とし
ては、 Hi sX 6 との融合蛋白質を大 JJ詰 l:fïtl' で発現させ大比中)'i 1'i~したものを m いたが、大
J
J
&
1
省内で融合蛋白質がj
腹立通領域と思われるisIi水性官l
域を含む場合は発現しなか・コた
ため、 JI英民通領域より C 末端 1H1J の |付舵側の ;I~ リペプチドを !日いた (Fi g.3- 1 )0 H
isX
isX6V
a
n
Iではウサギを免疫し I
li
sX6
-A
n
p
lではマウスを免疫したが、 A
n
p
l
6
-Mnn9,H
に対する抗体は酵母内のネイテイフ・な A
n
p
lを認識することができなかった。そこで、
蛋白質の C末端 1
H
1
J
I
こc
m
y
cX6
抗原ペプチドを融合して発現させ、 my
cに対する抗体を
m
いるこ ととした。
いて蛋白質の局在を制べた。まず、遠心 による分間をおこなった。
以上の 抗体を灯l
オルガネラの l
換を保った状 態でライセートを作製し、 I
O,
OOOg及び I
O
O,
OOOgで沈殿 σ)
と上消 (
S)
に分けた。するとこれらの蛋白質は P
IO、PIOOに存在したことから朕に存 (
E
していると予想された (
F
i
g
.33
) 。これを確かめるため映を O.
8M Na
C
I、 1
.
6M Ur
c
a、
O.
IMNa
2
C03
、1
%T
r
i
t
o
nX-IOOで処 理して遠心したところ、 T
r
i
[
o
nXI
O
Oで処即したと
J
史民i
l型の蛋白 1
qであることが示された。9f
きのみ可溶 性画分に移行したことから、 J
にJ
J
英に対 する配向性を 決定するために 、J
J
民の外1
l
!
1
J
からプロテアーゼを }
J
I
lえ分子訟の変
化 を見た。すると 、界面 活性剤を 1
mえないときは Vanlで -6ゅ の減少、 Mnn9,Anplで
はほとんど大きさの変化が見られなかったことから、これらの蛋由貿は C末端側の大
l
舷 側 に配向する ロ型のI
J
莫蛋白質である ことがわかった (
F
ig.
35)。そこ
部分を朕の │
人
で細胞内のどのJ
J
失に存在するのかを調べるためにショ糖密度勾配迷心法により脱を分
F
ig.3
-6)。 この結果から、これらの蛋白質は Oc
h
lと一部1J!:ーなる両分に移動し、
爾した (
コ・ルジ体に存在すると考えられた。更に、細胞を 問篠蛍光抗体染色 r
l
ミで染色したとこ
P
ig.
3
-7)、低コピ ーのプラスミドにのせ白身のプロモーターを
ろ (
mいて発現させた
場合、どれもドット状のパターンを示しゴルジ体に存在すると考えられた。ただし、
49-
ベクターを多コピーのもので発現させた場合、 Mnn9は小1JiJ.体に必航していた (
Fi
g
1
1いてコピー数を的やした場合、Vl
¥n
lの一部
3
7)。さらに GAPDHのプロモーターを 1
p
lも小胞休 に蓄積するようになった (
F
ig.3-7 ) 。また、このlI !fì(~ )泡へと愉送さ
やAn
れてしま っているものがある か どうかを調べるため、液 J
J
i!lのプロテアーゼをコードす
n
lでは強〈液胞が染まることがわかった
るPEP4の依 境事長を用い て染めたところ 、Va
(
F
i
g.3
7) 。
T
o
t
a
l
P10
P100
5100
一寸
」
F
ig
.3
3遠心による分画。
51
-
'_Van1
Control
P
S
NaCI
P
S
Urea
P
S
Na2
C0
3 TX100
P
S
P
S
j
.
.叩 叩
圃
・
F
ig
.
3
4薬剤l
処理による蛋白質の挙動。
5
2
-
T
r
i
l
o
nX100
Protease
+ ・ +
+
+
.
.
.
.
.
V
a
n
1
4ト
Mnn9
~Anp1 ・ myc
F
i
g.3
5プロテアーゼ処理による 1
)
英上の配向性の決定。
Top
8
o
t
t
o
m
.-Van1
,
.---
-ーー
ー
ー
ー
一
..-Mnn9
.-Och1
‘
4
圃 圃 ー ・園田園F
F
ig
.
3
-6ショ純密度勾配遠心による分画。
-Kar2
Fi
g
.3
-7問桜蛍光抗体染色法による局在。 Vanトmy
c(
C
.O
.E,F)
‘Anpl
my
c(
0
.H.
[
,
凡 Mn
n9my
c(
K,L,
M,
N)を2μ プラスミド (
C,0,K)
,CENプラスミドで自身の
プロモーター (0,H,L)
,
2!
lプラスミド上で GAPOHプロモーター (
E,F,
1
,J
,M.N)
下で野'
生 株(
C
.0,E.O.
H,[
,K.
L,M)または pe
p4
変異株 (
F.J
.N)中で発現させたと
きに mycに対するモノクローナル抗体9EI
Oを いて細胞を染色した a (
A)
はプ
B)
はゴルジ体のマーカーである MntlI
l
1Y
cで
耳
と
ラスミドのないコントロール 、(
めたもの 。
m
323 蛋白質複合体の単離
F
ig.3
4においてこれ削除蛋白質は Tr
i
t
o
nX
-IOOによっても 一部しか可滑化きれない 。
而1
丹t
l
:
拘l
を)
J
l
I
これは大きな蛋白質;
複合体を形成していることが原因であると考え、あL
x
える際にt1を共存させて可溶性を比較した 。す ると騒が250mM以上存イ王するときこれ
l'jIト屯的相互作用による蛋白質複令体を形
らJ失蛋白質は完全に可溶化されたことから、 t
F
ig
.
3
8
) 。そこで 、この複合体を l
i
出
.
lI
1すべ〈、界間活
成していることが示唆された (
mいて免疫沈降を行った
性斉I
J
で可溶 化 したライセー トを
(
F
ig
.
3
9A)。そのバンドの
F
ig
.
3
9
A
)。
パタ ーンが一部似ていたので、さらにウエスタンプロッテイングを行った (
Vanlmycおよび、
Anplmy
c
の免疫沈降物中には Mnn9が含まれていたが、 An
p
1my
cの免
は含まれていなかった。一方、 Mnn9mycにも Y
a
n
lは合まれていた 。
疫沈降物中 にVanl
羽いて Y
a
n
lおよびMnn9を
更に Anpl-mycを発現させた細胞からポリクローナル抗体を j
p
l
my
cが倹出された。以上のが;
J
共か
免疫沈降したところ Mnn9の免疫沈降物にのみんl
複合体と Anpl-Mnn9複合体が存征していることが予怨され
ら、細胞内 には Vanl-Mnn9
た
。 更 にこれらの複合体に含ま れる蛋白 質 を同定するためにプロテインシークエンス
n
p
lmy
c免疫沈 降物から Anpl
my
c
.
を図 に示すバンドについて行っ た。その結果、 A
Mnn9そして Ho
clと呼ばれる既知の蛋白質が、 Mnn9
免疫沈 1
1
1
1
0物からは Mnn9
-my
c,
An
p
l
が同定された。 Hoc
lは最初 P
r
o
t
e
i
nk
i
na
s
eCの変異pkcJ
-371
のアリール特異的多コピー
i
m
a
net1/
.
,1
997
]
0 αー1
,
6
-糖転移酵素である Oc
h
lと
サプ レ ッサーとして取得された [
Ne
cl
は何らかの糖転移酵素をコードしていると考えられ
ホモロジ ーが高いことから 、Ho
るが、その破峻株では N-,O$
吉合型結鎖を付加される蛋白質の大きさに変化がなかっ
cタグをつけて免疫沈降を行うとそのパターンは A
n
p
lの場合とよく似て
た
。 Hoclにmy
F
i
g
.
3-1
0
)、ウエスタンプロッテイングから 1
l
o
c
lI
1
1Y
c
免疫沈降物に Y
a
n
lは含まれ
おり (
はAnplMnn9
複合体にのみ含まれていると考えられる。
ない。このことから、 日ocl
150
250
500
-
1000
NaCI(mM)
....Van1
(
8
)
4時ー
Van1
(
P
)
4ト
Mnn9
(
8
)
....Mnn9
(
P
)
骨 ー Anp1・myc
(
8
)
....Anp1・myc (
P
)
F
i
g
.
3
8界面活性斉J
IとN
aClによる Mnn9ファミリー蛋白質の可溶化。 ライセー卜に
T
r
i
t
o
nXl
0
0とNaCI
を示した濃度で J
J
nえてインキユベー卜した後 、上清 (P)と沈殿 (S)に
分けた 。
u
oz
mccE
且 EdH
Fcmw
﹀
o
b
c
o
ω
A
200
IgG
115
97
55
B
.
圃
.
・
-
Ia
n
t
imyc
l
│
…
.
.
ん
│
戸
・
.・・
│
会
Ia
n
t
i
M
n
n
9
F
ig
.3
9Mnn9ファミリーの免疫沈降物。 (
A
)はよに示したプロープを用いて免疫沈降
PAGEし、銀染色したもの。 (
B)
はSDSPAGEした後、織
したものを非還元状態で SDS-
に示した抗体でウエスタンブロッテイングを行った結果 c ゲル内に示した数字が切り
出 し て N末 端 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 し た も の 。 1
;MKYNNRKLSF (Anp1
)
,2
:
SLSL
VSYRLR (
Mnn9)
,3
;A
K.
1TKRA
SSF (Hoc1
)
‘ 4 S
LSLXSYRLR (
Mnn9)
,a
n
d 5;
唱
OCK(Anp1
)
MKYNl
一O υ
﹄M F
。
﹄
FFCCE
F
υ
o工
司
∞C C E
F
a
c
d
・
20019
17
6・
ー
66-
45-
31-
F
ig
.3
-1
0ん l
p
l複合体の構成因子にそれぞれタグをつけて免疫沈降したもの。
5
9
-
32
4 蛋白質複合体の安定性
前項において Va川 Mnn9
復作体と Anp
1l
locl
Mnn9複合体が創1I1J包内に存イEしているこ
l
]ではどのような挙動をするかを調べた。野
とを示したが、これが各種遺伝子磁波株 r
生株, ,L
1a
n
p
l,
L
1mn
n
9
,
L
1h
o
cl
破壊株 1
C
l
J
fこVunlmyc,
Anpトmy
c,
Mnn9
-I
1
1Y
c
.Hocl
my
cを低
コピープラスミドにクローン化して導入し、細胞当たりの蛋内質の i
d
:をウエスタンプ
1)
。すると、L1v
a
n1
株r
l
Jでは特に変化はなかった
ロティングによって比較した (Fig.3-1
が
、 L
1a
n
p
l,
L
l
!
Jo
c
l株 1
1
=
1
:では Anp1
-Hoc1-Mnn
9複合体の他のコンポーネントの量も減って
いた。また L
1m
nn9f
米中では他のどの蛋白質も顕著な量が減少していた。このことから
これらの複合体は複合体を形成するパートナーが欠けると安定性を失ってしまうと考
えられる。
司
。
h
uε
qcchC司
﹄戸内地巴町句
h
c悶﹀句
.
h ﹀﹀
Van1・myc6
Anp1・myc6
Mnn9・myc6
圃
・
・
・
・
田
・・
Hoc1・myc6
Fig.3-1
1倣壊掛川 lにおける他の蛋白質の安定性。上に示した株内で右に示した蛋白
質を発現させウエスタンプロッテイングを行った結果。
61
-
3
3 考察
本主主ではそれぞれ独立にクローン化された
3つの .
u
l
f
云子 V
J
G肌 IANJ
,V
I
GJ/ANPI
,
V
I
G6
爪;fNN
9
がファミリーに属し複合イ本を形成していることを示した 。こ れらの逃伝子
の変異株は糖釘i
不全の形 i
f
!を示し、 一次
m造上もホモロジーの苅い領域を含んでいる
ことから、その機能に興味がもたれた 。 3つの蛋白質に my
cのタグをつけて発現させ、
タグを 用いて免疫沈降したところこれらの蛋白質は複合体を形成していることが示唆
された。その後細胞内には Ve
mJMnn
9
複令休と An
p
ll
Io
cJ
Mnn9複合体が存ずI
ーすること
を示した。ホモロジーを見ると AnplとVanl
の/
f
]
lのホモロジーは 65%でV
a
n
lとMnn9の
0%よりかなり高い。このことからも Mnn9が複合休の
聞の46%、 AnplとMnn9の問の5
双方に含まれており微妙に Anpl,
Vanl
と機能カ古典なると考えられる。ホモロジーの F
J
i
い領域が どの ような機能を担って いるのかはまだわからない。この領域を介して複合
体 を形成しているのかもしれない。これらの桜合体が C末端 側の内腿似I
J
の領域を介し
て複合体を形成しているらしいことは、この領域を 用 いた酵母の Two
-H
y
b
r
i
dシステム
で示されている(
小 島、私信) 0 Anpl
にはホモ ロジーの高い領域よりも更に C末端側
にグ ルタ ミンが22残基述絞して並ぶ P
o
ly
-Q領域があり、これカず他の蛋白質との 4
7
1合に
機能している可能性がある。これらも合わせて、今後どの領域がどの蛋白質との相互
作用 に必要であるのかを解析して いく予定である。この複合体内の結合は強く、免疫
i
.
tl
降の際 に架橋剤等を 加 えていないばかりでなく、
2MのNa
C
I中でもほとんどF
序維し
ない (
小鳥、私信)。ただしこの複合体の構成因子の一つが欠けると複合体全体の安
定性が低下し、残りの情成因子の量が減少する (
F
i呂田3
-1
1)
。このことからこれらは複
合体を形成することで非常に強固な相互作用が生じ安定な構造体となると考えられる 。
しか し、 HOCIのj
遺伝子破壊株が紙鎖構造に顕著な変 化を示さないことは、この結条
と矛盾 しているかの よ うに見える。 .
dhocl
株では実際に Anpl
,Mnn9は減少している
(
F
ig.31
1)
。このことの説明として、 An
p
lMnn9はHocl
以外ともまた別の複合体を形
62
-
成しておりそれが権処1
俄造に関与している、とも考え られるがA
n
p
1の免疫沈降物と
Hocl
のそれを比較すると非常・によく似ていることからこれは与えにくい。恐らくは前
告の顕清な変
伯の本体がAn
p
l-Mn
n9の側にあり、これが一部でも伐っていれば側鎖情 j
化は引き起こさないのではないかと 考えられる。 Cal
c
on
uo
r¥
V
h
i
l
eやCon
g
oRe
dとい った
細胞壁の締:迭に以上のある変異株が感受性となる~郊l に丸j して Ll llOC I
株は感受性であ
ることから 、何らかの細胞盤の総造変化を起こしていることは I
IJl違いないが、その構
造についてはまだわからない。この蛋白貨が αー1
,
6
-Manno
s
yl
t
l
'a
n
s
f
el
'a
s
e
であるOch
lとホ
モロジーが高いことから何らかの品f
J
転移酵素の可能性はあるがまだわからない 。
一方 でMu
n
r
oらのグループにより我々と同様な結果が報告された [
J
u
ng
manna
n
d
9
98
]。彼等により Anpl-Ho
cl
Mnn9
複合体にはさらに Mnnll(Y
J
L
I8
3
w
)が含ま
Munro,1
型のJ
J
英蛋白質でホモロジー倹索の紡巣、
れていることが示された。 Mn
n
l
lはやはり n
Sac
c7
laromycescerevisiaeの機能未知!
な MnnlOと部分的に40%程度のホモロジーがあるこ
7i
zosac
c
l
l
i
l
r
o
m
ycespombeの αーl
,
2
g
a
l
a
ct
o
s
y
t
lr
a
ns
f
e
r
a
s
eなどを
とがわかった。 Mnn10はScl
含むファミリーの 一 員である [
D
e
ana
n
d Po
sl
e
r
,1
9
9
6
)0 Mnn1
1が 実 際 に
Anp1
Hoc1
一M
nnllMnn9
複合体のなかでどのような機能を狙っているのかはまだ I
Y
Jか
ではない。
レジ体で付加される
これら複合体の局在はゴルジ体であった 。 これはその機能がゴ J
糖鎖に関与している点からも妥当である 。 ところがそれぞれの夜白質のコピー数を併
加させると小胞体にも存在するようになる 。複合体を形成するような蛋白質の場合、
その憐成因子の一つが欠けるなどして正常なコンホメーシヨンをとれなくなると小j
胞
体に蓄積するというのはよくある現象で、イムノグロプリンの例がよく知られている
[
K
n
i
t
ll
e
ra
n
dHa
a
s,1
9
9
2
]。これは小J包体における♂1質管理機構のために異常な蛋白質は
泡体からゴルジ体へと向かう小胞から排除または粂ることができないことを示して
小l
いると考えられる。 Mn
n9
複合体の場合は、それぞれの構成因子のみでは小j
泡輸送の系
に乗ることができず、複合体を形成して初めてゴルジ体へと輸送される仕組になって
いると考えられる。
ただし、 Vanl
の場合は GAPDHプロモーターによって大 i
止に発現させた場合でも小Jl包
休への蓄積はほとんど見られなかった。で は大量に発 J
'
J
Lした Vanlはどこに応イ1::するの
か?これを確かめるために液胞のプロテアーゼである PEP4の破域株を j
日いて染色した
結果、液J包へ輸送されていることがわかった (
Fi
g子7
)。つま り
、 Vanl
は緩令休を形成
していなくても小胞休における品質管理機椛は通り抜けるが結局ゴJ
レジ14'に f
{
{まるこ
とができず n
英蛋白質デ 7;lルトの経路である液胞へと愉送されてしまうものと考えら
れる。これは加 p
lの場合は少なくとも 4つの 1
2
9子からなる複線な複合体を形成してい
るが、 V
a
n
lの場合は相互作用する相手がMnn9しか見つかっていないことと関係があ
るかもしれない。
;
m1
*
米中でも Mnn9は小 l
抱体にかな
一方でコピー数を培やした場合ばかりでなく、 L
1v
I
包体に訴航す
り残っているのが観察される。恐らくほかの椛成因子が欠けた場合も小J
ると考えられるが、他の場合はほとんど分解されてしまってよくわからなかった。
では、この複合体は笑際にどのような機能を担っているのか?以前より Mn
n9は僻 t阪
移酵素そのものではないと考えられてきた。それは、 m口n
9
変異物;における精製l
はヘテ
ロであり、もっとも有力な候補である αー1
,
6
-Ma
n
no
s
yl
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
c
活性が一部残っている
ことがわかったからである。しかし Mnn9は絞維な複合体を形成しており、またその榊
成因子のなかに糖転移酵素とホモロジーの高いものが含まれていることから、この複
el
i
mi
n
a
r
yな笑験からこれらの複合体
合体はやはり純転移酵素であると考えられる。 pr
を免疫沈降したピースに GDPマンノースから精蛋白質にマンノースを移す活性がある
ことがわかっており、今後詳細な検討を行う予定である。
Mnn9
複合体にはJ'
J
!
花までに 二種類あることがわかっているが、二つの複合体の機能
の違いはまだわからない。説明の一つは、t;!佐賀の構造が異なるということであろう。
構造としても蛋白質部分と締鎖部分がある。il( 1~1 質による糖鎖構造の迷いがあること
は、以前より知られていて、 αー1
,
6
-マンノースの パァクボーンがほとんど仰長せずマ
6
4
-
ンノース 13個程度しか付加されないカ J
レボキシペプチダーゼYの様なタイプと、パッ
クボーンが1 1 11 長し最終的にマンノースが IOO~200倒付加されるインベ Jレターゼの織な
タイプである 。 それぞ、れを Vanl
-M
nn9または Anpl-I
!
ocl
-Mn
n
l
lMnn9
複合体が認議して
糖鎖付加を行っているかもしれなし、。制鋭部分を認識している場合は 二つ の複合体は
連続的な反応を行っていると考えられる。その場合税f~J!t の大きさから考え、 Va nl r.主合
体がある反応を行った後に Anp1
複合体が次の反応を触媒すると思われる (Fi
g
.
3
1
2
)。
車IIIJJ包内の Van
lの 量 がAnplとJ
t,険して非常に少ないことから、 Vanlの行う反応より
Anpl
の行う反応のほうが量的に多いものである可能性もある。今後、上記の実験をよt
質の条件を変え行うことにより、これらの I~I'J胞を I>>J かにしていきたい。
6
5
匂
ER
,
Golgi
compartmnts
ー惨
Hoc1- Mnn9 Anp1
F
i
g.
3
1
2Mnn9ファミリーの作用モデル
6
6
-
総括
パナジン自主耐性と措 j
j
1不全
H
宵標として変異株を取得し19T斤を行った。パナジン般耐性
我々はパナジン酸耐位を J
'
1に械鎖不全家災事│ミが多く含まれる理 l
幻についてはまだよく分かっていない。
変異株の 1
しかしこれは恐らく糖鎖不全という形質による二次的な効果としてパナジン敵耐性と
いう形質が現れてくると忠われる。つまり、細胞鐙やペ')プラズムおよび細胞膜に存
在する蛋白質には糖鎖が大量に付加されており、 ~~f鎖不全変異株においてはこれらの
構造が顕著に変化するものと思われる 。その結果、物質の透過性も変化し、あ るもの
は透過しやすくあるものは透過しにくくなるのであろう。シクロヘキシミドやジェネ
ティシンに対する感受性の上昇という変異例=の形質もこれによるものと忠われる。ま
た
、 細胞の凝集性が変異株において高まっていることも、細胞懸の情造が大きく変化
しているであろう奇 l を予知さぜる。ただし逆に J踏鎖不全~~~株がすべてパナジン酸耐
性という形質を示すかについては定かではなく、 erd l 、 kre2、 pmr l 変異名~について検
定を行ったが、株のパックグラウンドによって耐性皮も兵なるようで、はっきりした
ことは分からなかった。パナジン酸の標的蛋白質と言われているものには、細胞Il英の
ATPa
s
eやホスファターゼがある。バナジン般耐性変異株の'1'にはこのような際的安 "
1
質の変異も含まれていると思われる。特に vm
g
変異株は椴鉱i
に変化はないことからこ
れら標的蛋白質またはその周辺にある蛋白質に変異が入っている可能性が高い。ただ
し、パナジン i
唆感受性細胞Il英 ATPaseをコードする PMAli
宣伝子 [
S
e
r
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,1
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8
6
]は
LEUl遺伝子の近傍にあり、一方 v
i
g、 v
mg
変興の中には l
e
u
l変異と述鎖するものがない
ことから、 PMAI遺伝子に変異のある株が含まれている可能性は低い。
膜蛋白質の局在機構
~白質には機能する場所がありそこに正確に局在することが必要である。朕蛋白質
6
7-
の場合その局在化シグナルはJ
史民通領域 (TMD)および細胞質領域にあると考えられて
抱体局夜機構は幾っか知られているが、小l
泡体を山てしまった
いる。酵母における小l
ものをもう一度小胞体に逆行輸送で返すために細胞質側の KKXXシグナルが川いられ
s
le
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4
;Gaynorc
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1.
1,1
9
9
4
]。これには細胞質のコートマーとの総
る[Town
e
r
1とい
合が関与している。 TMDを介した逆行愉送への経路も知られており、これは R
l
介している [
S
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J。一方で小j
胞体から H
Iさな
う)j失蛋白質がや'
1
1
1
1
泡質領域が関係しているもの [
S
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l
oe
t
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9
9
6
)と
い{愛情も存在しているがそれには *
TMDが関与しているものがある [
R
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y
n
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dPelham,1
99
7
]
0 TMDはその長 さにな味があ
y
n
c
ra
l
l
d
るのではなく T MDの中でも比較的極性のある残恭の位援が関係している[Ra
Pelham,1
9
9
7
]0 また 、複合体を形成する袈白質は小J
包体内でそのア ッセンブリーが行
抱体を /
1
¥ることができない
われることが多いが、これが適礁に行われないと小l
[
B
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J
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9
92]
0 Mnn9ファミリー複合体の情成図予を多
コピーで発現させた際に小J
]
包体に蓄積する現象は、この機構によると考えられる。小
l
泡体に局在するシグナルをもっ蛋白質を大量に発現させると小!抱体肢が異常'
にi
自
力n
す
ることがあるが [Zimm巴re
ta.
l,1
9
9
7
]、これらの蛋白質がどのような機構を則いてい る
のかはまだわからない。
ゴルジイ本に局在化する機構にはやはり TM Dと細胞質領域が関与している。細胞質管i
域が関与する局在機構はゴルジ体を/.1:',て pr
e
v
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p
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m
e
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t(PV
C)またはエンドソー
レジ体へ返す経路である 。この機榊には細胞質に存在する
ムに輸送された蛋白質をゴ l
蛋白質が関与していて飽和性であるため、この機構を用いてゴルジ休に局在している
K巴x2やDPAPAを多コピーで発現させると液胞へミスソートされる。一方で、九仰を
用いてゴ Jレジイ本に局在化する機構についてはまだ明かでない。動物細胞においては細
胞質Il莫、リソソーム膜は脂質の組成がゴルジ体とは異なりステロールが多いため、
TMDの長さが重要で 21
残器以上ないとゴルジ体から出ることができない [
B
r
e
ts
h
e
ra
n
d
Munro,
1993]
。酵母においてはエンドソーム、液 j
泡脱はさほどゴルジ体と異ならない
ためデフォルトの経路として液胞へと分泌される。判仰をJl'lいる機構として、長きの
6
8
-
ほかにコソレジ体に局在する蛋白質問士が局花するべきコンパートメントにおいて、大
きな複合体を形成して次の愉送小l
泡へ来ることができないようにするものが考えられ
ている [
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が、まだ確かではない。本研究において川
J
英蛋白質のうち、 Anpl
l
Io
cl
-Mnnl
l・Mnn9複合体は小I
J
包体を 1
¥るときに
いたゴルジ体I
すでに大きな複合体を形成しているためコソレジ休の C1S領域に保持されることができる
のかもしれない。 Va
n
lは大量に発現させると小1Jiil.体を/1',ることはできるが、ゴルジ体
泡へとミスソートされてしまう。
に保持されるための Mnn9との複合体を形成できずに液j
F
ig.
3
-9Bで見られるように、 Va
nl-mycで免疫沈降しでもゲノムにコ」ドされる Van
l'
よ
共沈しないが、 Mnn9-mycでら免疫沈│
燥した場合はゲノムにコードされる Mnn9が共 i
.
t
し
ており、 Mnn9同士の結合が示唆される 。そこで、 Mnn9の複合体は複合体向上の紡令
もあってより大きな複合体を形成しゴルシイ本の CIS領域に局在できるのかもしれない。
一方、 Vig4は大量に発現させてもミスソー トされないばかりか、局在する場であるゴ
ルジ体を肥大化 させる。この様な現象は初めてであり、ll'i復的にゴルジイ本に局在化さ
ig4同士のホモオリゴマーを形成するこ
せる機備の存在を示唆している。この場合も V
ig4の綴に l
淡を何
とで大きな複合体としてゴルジ体内で存イEしている可能性もある。 V
回も貫通している蛋白質の局在についてはほとんどわかっておらず、この現象を詐し
J
f
守さ
く解析することにより新たな蛋白質局在機構を明かにすることができることがW
れる。
ゴルジ体の機能 I~判庁
ゴルシイ本の機能解析を行う上で、既知のゴルジ体局在蛋白質をJTjいることは有効な
方法の一つであると考えられるが、現在のところ分かっているものは醇母に限らず動
l、 Mntl蛋白質といっ
物細胞においても非常に少ない。酵母においては、 Mnnl、Och
た糖 jl~言移酵素 [Haus l e r a
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)や、 DPAP
蛋白質といつたべプチダ一ゼ[に
C∞
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児
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99
勾
3]の外は、前述したものと分f
必装置くらいしかまだ分かつて
6
9
-
いない。残留機備やイ l
一分け機怖を司るもののほかゴル ジ休そのものを的成する蛍白質
はもっと存住するはずであり、実|捺ゴルジイキの発達した動物細胞では生化~;(自にゴル
ジ体を単縦し、その +
l
l
f
J
髭蛋佐l
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l
l
l
lに 同 定 し て い く よ う な 試 み も 行 わ れ て い る
[
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9
9
4)
0更にゴルジ休は細胞分裂の l
訟
を
に
中U
I
分化して消 失し、分裂終了
後また構成されるというような制御が行われている小1
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C
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9
4
1が、この
1
時は通常の分?必に用いられるものとは J
Ijの/l.l非、融合機構を 川いている 。ゴルジ体1見
表層蛋白質である G MI30 のリン酸化及びこれに結合する pl lS が11l~な役割を担ってい
る[
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l
.,1
9
9
7
)
0 またゴJ
レジイ本の再構築の際の j
肢がスタ γキングするために
必要な図子として、脂質修飾された細胞質蛋白質である GRASP65がクローン化されて
B
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C
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.
,1
9
9
7
]0 酔母にもこの蛋白質のホモログが存ギi
ニすることから、 F
i
g
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7の
いる [
ようなゴルジ体l
撲のスタッキングの機械を逃伝学的に調べることができると考 えられ
る
。
他方培養細胞を用いた系から、非常に親水性であるがゴル ジ 体表而に局在し、低干f.~
j
立リポソーム
(
L
D
L
) 受容体の糖r
'
l
l
付加に深 <
1羽与している蛋白質 I
dl
C蛋白質がクロー
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0 この蛋白質は線虫でも保存されており、非常に重姿な
ン化された [
機能を担っているものと考えられるがまだよく分か っていない。 I
c
l
lC蛋白質には協同
c
l
l
B
蛋白質もあり、細胞質に存在してゴJ
レヅ体の機能を制御
して機能すると思われる I
している因子は多く存在していると考えられる。彼らの しDL
受容体の糖i
f
'
J
l
の状態を指
4
2
f
iとした CHO細胞の系からのアプローチと、我々の用いているパナジン酸耐性を指標
l
f
.
f
析を最終的に目標として
とした酵母の系からのアプローチは、共にゴルジ体の機能 I
いる点でも非常に似通っており、二つの結泉ーをあわせることにより更に深い程腕が符
られると考えられる。
将来の展望
木研究では外糠鎖の付加機構を明かにすることと共に、糖鎖付加の J
易であるゴルジ
体の機能についても明かにすることを日的としていたが、実際に v
i
g
1
変異を相補する i
l
i
伝子は糖 ~j~ 合成に関与するものばかりであった 。 しかし、外秘鎖付加l に関しては、そ
の糠供与体の合成及びゴルジ体内 l在への愉送、そして尖際に mi~j'ii寸JJII を行う 4自転移俳
素と網続的にクローン化することができた。これにより酵母ゴルジ休における椴 i
M
J
力 11 に関わる因子の大部分が同定でき、その機械もかなりの部分がI~] かにな ったと考え
られる。
本研究は今後次のように進めることでより発展するものと考えている 。 Mnn9フ ァミ
リーについてはその活性と恭賀特異性を明かにする必要ーがある。また複合体の榊成凶
子をすべて阿定し、再構成し、活性とそれぞれの因子の関わりを調べることで、俳句
細胞壁を仏成するマンナン蛋白質の合成の制御機構がよりI"
V
Jかになるであろう 。一方、
V
ig
4を大丑に発現することで現われた肥大化 したゴルジ体は大変興味深い 。その 1¥
J
)
,
!
の機構を遺伝学的に解析するとともに生化学的にゴルジ体を扱う材料として J
T
Jいるこ
とで 、当初の目的であったゴルジ体の機能と維持の機備を明らかにできると考えられ
る
。
細胞とは、個体を椛成する最小の単位であり、その中では複雑な機構が組み合わさ
r
I
り実に巧妙なドラマが絶え間なく演じられている。その局目 的な現象を解明すること
が全イ
本の解明につながるとは限らないが、仕掛けの素晴しさ、美しさに少しでも触れ
るべく今後も研究を続けていきたい。
71
-
ー
実験材料と方法
1
)使用菌株および楕 I
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) プラス ミドおよび醇母ゲノミックライブラリー
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g
i
n
a
lc
l
o
n
ei
npRS314)
pSV902
10nei
npRS314)
(
or
ig
i
n
alc
pSV903
巴i
npRS314)
(
or
ig
i
n
al
c
l
o
n
pSV907
.1
kbS
a
l
l
S
a
l
l断片)
(pRS31
4,pSV901由来の 2
pSV908
,
6kbS
a
!
!S
au3AIl
l
f
rJ
十)
(pRS314,pSV903由来 の 1
pSV914
(pRS314,pSV903由来の 2
.
7
k
bHindm-Sau3A
1断片)
.9
pSV91
(
p
Bl
ue
s
c
r
i
p
t
,下記のプライマー l
および2を いた PCR産物)
pSV923
(pYES2O,pSV903由来の 2
.
7kbHindT
I
r
S
aL
l3
A
1断片)
pSV924
3由来の 21kbHpa[
-S
I
l
l
I断片)
(pSV919,YEpl
pSV931
l
l
X
h
o
[断片)
(
pGEX-4T-3,pSV919由来の Baml
pSV401
(
o
ri
g
i
n
a
lc
l
o
n
ei
nCI
0L
i
b
r
a
r
y
)
pSV402
pSV401由来の 3
.
8
kbHindTII-Bam
I
H断片)
(pRS41
6,
pSV403
(pRS416,pSV401由来の 3.
4kbHind
I
l
l
-HindmWi片)
pSV404
(
pRS416,pSV401由来 の2.
3kbHindTII-BamH1Wi片)
pSV405
(
pRS416,
pSV401由来の 75kbSall-BamHI断片)
m
,
,
,
7
4
-
pSV406
(pRS41
6,pSV401L
l
J
来
の1
.
2kbBgl
I
I
Bg
l
l
I断)r)
pSV46J
(pBl
u
e
s
c
r
i
p
t,下記のプライマー 3および4を
月]
いた PCR産物)
pSV46
3
pSV461
山米の BamHI-X
h
o
J断片)
(pKT10-mycN,
pMAI2
(pCHI,
)
pSV124
(
pCHI,VAN/)
pSV1
2
8
(
pRS416,pSV1
24由来の BiJmHI-Xholl
析片)
pSVI30
(
pKT10・mycN,VANIGAPDHp
r
o
m
o
t
巴r
)
pSV3D5
ANPlGAPDHp
r
or
n
o
t
e
r
)
(pKTI
O-mycN,
pSV313
(pC
Hl,ANPl)
pSV314
(pRS416,pSV313由来の Bl
i
mHT-Xhol
断片)
pSV629
(pCH1,MNN
9
)
pSV631
(pRS41
6,pSV629由来の BamHf
XhoI
断片)
pSV639
(pKT10-mycN,
MNN9GAPDHpromot
er
)
pSV702
)
(pCHI,HOCl
pSV7D9
(pRS416,pSV702由来の BamHl-Xhon
折片)
pSV2Dl
(pCHI
,MNTI)
酵母グノミックライブラリー
G1
6L
i
b
r
a
r
y(
pRS314,TRPI)ゲノムの断片は約 8
-I
Okb (
0.
,
.D
.K
o
s
h
l
a
n
dより )
C1
0L
i
b
r
a
r
y(
p
3
6
6,LEU
Z
)ゲノムの断片は約9・1
2kb (
Dr
.O
.Kos
h
l
a
n
dより)
3) 合成オ リゴヌクレオチドおよび PCR
合f
iX:オリゴヌクレオチド
7
.ライマー 1
5'
-CGGGATCCATGAAAGGTITAATTTTAGTCGG-3
'
プライ マ -2
ー CGCTCGAGGGCGCAGAACAGATCATCA-3
'
5'
プライマ -3
5
'・ CGGGATCCATGTCTGAATTGAAAACAGGTCATG-3'
プラ イマー4
G1寸G-3
'
5'
-CGTCTAGAATTTACGTAAAGGTTGGGCTT
7
5
-
ー
PCR
条
刊
ー
テンプレートとして A5-8-1
Cのゲノムを剥製して
mいた。PCR反応は 94"Cを l分、
50
℃を l 分、 72 "Cを 1. 5 分というサイク Jレで羽田行った。 ~r 索はベーリンガーマンハイム
1
1のArnp
1
iT
a
qpo1
ym巴r
a
s
eを用いた。
4
) 分子生物学的技法
Sa
mbrooke
l
"
I
.,1
98
9
;G
u
t
h
r
iea
n
c
lFi
n
k,1
991
]によった。
分子生物学的手法は成者 [
5) インベルターゼ活性染色
B
a
l
l
o
l
lの方法[
Ba
l
l
o
u,1
9
9
0
]に従った。 1
0
m
1のYEP10D
培地にて OD5
5
0
=
0
.
5
-1
.
0になるま
でお ℃で土台養後、 37"Cにし、 30分培養した。菌体を遠心により集め、 37"Cに禍めた
1
0
m
1のYEPS
培地へ培地交換し 、3時間情養してインベ l
レターゼの誘導を行った。
l
l
f
f
e
r(100mMT
r
is
-HC1(pH=
7
.
4
),1
.4MS
o
r
b
i
l
o
1,
誘 導 後 、 集 菌 し た 斑 体 を 300μlの Zb
0
.
1% 2
-Mer
c
a
pt
oe
t
ha
no1
,250μgI
m1Zymo1ya
s
e
-1
00T) に懸渇し、 30"
Cで20分処理し、ス
フエロプラスト化した 。これを 400g,5分遠心し、上清をペリプラズム国分とした 。こ
5量 の 80%G1ycero1,0.05% BromophenolB1ueと混ぜ、電気泳動のサンプ J
レ
の蘭分を l1
とした。電気泳動は 7
.
5% SDS-PAGEでL
a
emm
J
iの方法 [
L
a
emm1i,1
9
7
0
)に従 って行い、
活性染色は原法に従った。
6
) キチナーゼの単離
K
u
r
a
n
c
l
aとRobbins( 1991 ) の方法に従って、酵母を定常 J~J まで培養しその培養液から
キチンとの親和性を利 用して分泌されたキテナーゼを単縦した。定常J
切に逮した精義
i
夜10n
吐を - 10mgのキチン
(
Sigma) と4"
Cで4時間以上緩やかに浸透しキチナーゼをキ
チンに結合させる。その後PBSで 3回洗かし、沈殿を SDSサンプ J
レパ -;;77ー 1
00
μ
!と
C
でL
O
分熱した後 6%SDSPAGEを行う。最後にゲルを CBBで染色した。
混合し 100"
7
) 薬剤l
感受性の判定
0
0
1
帝濃度の楽剤溶液をメンブレンフィ J
レター(孔作
各種薬剤添加プレートは 1
0.
45川 )により除菌した後に最終的に記載されている青島 j
支になるように YEPD
府j
也も
しくは s
o
t
創出をオートクレープ後に添加して作製した。 SD精 j
也にパナジン般を添 )
J
I
I
する場合は、 pHの上昇を防ぐため 50rnMMes
州 aOH(
pI
lS
.
O
)を同時に添加して pHを洲節
した。薬剤感受性の判定は 2S"Cにて薬売I
J
!
n
f
i添加プレ」トで生育させた I
泊休を ;
来月I
J
i
添)
J
I
I
プレートに ï!!TI線、もしくは薬剤無添加培地で定常 I~J まで府饗した E自体を滅的水で 100
倍希釈した後、 1
0
μ
lを薬剤添 )
JfIプレートにスポ Y トして 25tにて精養した後、 J
竹
死I
の
程度により判定した。
使用薬剤
So
c
l
i
u
r
nor
t
h
o
van
a
c
la
t
e (添川型化学)
C
y
c
l
o
h
e
;
t
i
m
i
d
e,5
F
l
u
o
r
o
u
r
a
c
i
l,
HygromycinB,G
e
n
e
t
i
c
i
n(
Si
g
ma
)
8
) 遺伝子のクローニング
日1
7-6CにGI6、CIOライブラリーを J
f
y
r
l
{
!
i
日免したプレートを 100μMのジェネテイシ
ンを含んだ培地にレプリカし、生育してきた形質転換体を選択し、インペ jレターゼの
活性染色法により、総鎖が里子生株程度にまで回復している株を逃ぴプラスミドを凹収
した。このプラスミドをもう一度変異株に導入し、変 j
モーを回復させる機なプラスミド
をそれぞれの野生型遺伝子を含むクローンとした。
9
)塩基配列の決定
pRS31
4ベクターに含まれる M13由来の配列を利用してアプライドバイオシステムズ
手土の Ta
qDy
巴P
r
i
me
rCy
c
l
eS
e
q
u
e
n
c
i
n
gK
i
lのー 21
MI3Dy
eP
r
i
m
e
rとM1
3Re
v
er
s
eDyeP
r
i
med
こ
より二本鎖 DNAを鋳型として付属の説明書の通りに行なった。 DNAシークエンサーは
mした。
アプライドバイオシステムズ社の Mod
e
l373ADNASe
q
ue
n
c
erを使
1
0
) ライセートの調製
各磁細胞を OD
5
5
0
=1
.0程度にまで培長した後、築博lし0
.9MS
o
r
b
t
i
ol
で洗浄し Zs
ol
u
t
i
on
(
1
0I
1
1MHEPES(
7
.
6
),0.
9M Sor
bi
tol
,2
51
1
1
Ms
-Me
r
c
ap
t
o
巴I
1
I
a
l
10
l
,
2
5
0μg
/
1
1
l1
Zymol
y
a
s
e
)に懸
濁し 3
7'
(
;で30minインキユベートする。 4000r
pm,5mi
n遠心し集めたスフエロプラス
トをLy
s
i
sb
u
f
f
e
r(
1
0mMHEPES(
7.
6)
,0.
2M Sor
b
i
tol
,1
5
01
1
1
MNaCI
、5mMMgCI
2,11
1
1
M
PMSF,1μg
/
m
lp
r
o
t
e
a
s
ei
n1
li
b
i
to
rc
o
ck
t
a
l
i(
Lc
u
pe
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n
,Ch
ymo
st
a
t
i
n,Pe
p
s
l
<
lt
i
n,Ap
r
ol
i
n川 町
A
n
t
i
p
a
i
n(SIGMA))
(p.
.
ic
.)
)
に懸濁し 4
'
(
;で3
0m
i
nインキュペートし浴菌させ、 40
00rpm,5
1
1
1
m遠心 して未破波菌体を除いてライセートとする。
0,
OOOg,1
0m
i
n
遠心し沈殿国分を PIOとし、この
遠心 による分画はこのライセー トを1
0
0,
000g,1h
r
遠 心 し沈殿四分を PIOO
、上清を SIOOとする。沈殿画分は
上清画分を更に 1
-}
}
tLy
s
i
sb
u
f
'
f
e
r
で、洗めする。ま た 、各種楽斉I
J
による処理は 2
0ドl
の4M NaCI
,
8M Ur
c
a,
0
.
5MNa
2
C0
3
,5% T
r
i
t
o
n
XL
O
Oにライセート 8
0μlを加 えて 4
'
(
;で 3
0m
i
nインキユベ}ト
した後、 1
0
0,
000g,1h
r
遠心して沈殿と上滑に分ける。
ウエ ス タンプロッテイングの一次抗体として a
n
t
i
m
ycmAb(
9
E
I
0
)は5
0
0
0
倍
、 a
n
t
iV
a
n
l
pAb
,a
n
t
iMnn9pAbは 3
0
0
0
1
昔、 a
n
t
iOc
h1pAbは2000倍に希釈して 用い、二次抗体とし
e
r
o
x
i
d
a
s
e
l
a
b
巴l
e
da
n
t
i
M
o
l
ls
巴T
gGまたは Pe
r
o
x
i
c
l
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e
-I
a
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l
e
l
ca
n
t
iR
a
b
b
i
tI
g
G(
K
p
l)を5
0
0
0
てP
依 希 釈 して用 いた。発光基質として Sl
Ip
e
r
Si
gn
a
lSl
Ib
s
t
ra
t
e
s,We
st
e
mB
lot
t
i
ng(
Pl
E
RCE)を
h
o
t
o
nc
o
u
n
te
r
で検出した。
用い
、 X線 フィルムまたは ARGUSp
1
1) GDP-マンノースピロホスホリラーゼ活性のアッセイ
バッファー (
HEPES(pH7.6)40mM,MgC
I28
m M,Ma
n
l
P0.
2m M,C
o
l
dGTP0
.2mM,
GMJ'50mM,GDP50mM,[
o
:
.
3
2P]GTP0
.
1mCi
/
m
l(
sp
e
ci
f
ic
i
r
y3
0
0
0
Ci/mmol
) に適量細胞質
画分を 加 え、この時 間を0分 と して 2
5'
(
;でインキユベートし、反応終了後等量の反応
停止液 (
C
o
l
dGTP100mM,
EDTA100mM) と混合し、ドライアイス/エタノール中で
凍らぜ反応を止める。 その後サンプ J
レを皮 肉液 (1ML
i
C
I,JMHCOOH) を用い益事層
PElセルロース (
Me
陀 k
) で展開し 、イメージアナライザー(富士 BAS2000) を用い
7
8
-
ー
てGDP
-マンノースのスポットの欣射前性を測定した。
1
2) ショ概脅皮勾配遠心
文勾配遠心で分けるときは、 10mM
上 記 の よ う に 調 製 し た ラ イ セ ー ト を シ ョ 舵 術j
HEPES(
7.
6)
,54,50,46,42,38,34,30、2
6
.22,1
8% S
u
c
r
o
s
cを 1m
lずつのせた 10mlのス
テップグラジエントの」こに 1mlのライセー卜をのせ、 1
00,
000g,1
6h
r
迷心し、 l
蕊から l
m
lずつ分画世る。
1
3) 間接蛍光抗体染色
調J
I
胞を 1
0ml、 00
5
5
0=1.
0程度にまで培養した後、 Jml,
37% Formaldehyde
,
330~L1 2 %
Sodiuma
zi
d巴を加え、 30'
C
, 15m川崎養する。その後集 1
却し、 3
.
7% P
a
r
a
f
o
m
l
a
l
d
e
h
y
d
eの
erA (
0
.1M P
o
t
as
si
l
l
mpho
s
p
a
r
e(
7.
3
),10m MS
o
d
i
l
l
l
l
la
z
i
d
e
)に懸濁させ、 90min
溶けた Buff
室視でインキユベートし、悶定する。 Bl
If
f
e
rAで 2回
、 Bl
If
f
c
rB(
1
.2M S
o
r
bi
lo
li
nBl
If
f
e
r
A)で l回洗節した細胞に 25mMs-M
巴r
c
ap
l
o
e
t
h
a
n
o
l,
2
5
0
μg
/
m
lZymolya
s
eの熔けた Bu
f
f
erB
を加え、 37'cで 30minインキュベートする。 Bl
If
f
erBで l問洗浄した後、 0
.1%
T
r
i
t
o
n
X
l
0
0の溶けた B
u
f
f
e
rBに懸濁し 1
0min氷上でインキュベートする。 Bl
If
f
巴
,
rBで洗
yl
y
s
in
巴でコートしたスライドグラスに 塗り、 Buff
e
rC(
1 mg
/
m
lBSA.
悔した細胞を Pol
n20i
nPBS)で 30minブロッキングし、 Buff
erCで 1
00情に薄めた 一次抗体を
0
.
1 % Twee
rインキュベートする。 Bl
If
f
erCで洗i'
{
rした後、 B
u
f
f
e
rCで2
0
0
1
1
'fに務めた二次
のせ て 1h
抗;イ本をのせて 30minインキュペートし Bl
If
f
e
rCで 2回洗浄しマウントする 。
1
4
) 免疫沈降
各種細胞を 00
5
5
0=
1,0程 度 に ま で 渚 養 し た 後 、 集 菌 し 0
.
9M S
o
r
b
i
r
o
lで洗浄し 25m M
出a
n
o
l,
0
.
9M S
o
r
b
i
r
o
lに懸濁し 1
0min室温でインキュベートし、もう一度
sMe
r
c
ap
toe
0.9MS
o
r
b
i
t
o
lで洗悔した後、 sM
e
r
c
a
p
t
o
巴um
J
lo
l
を│除いた ZBuff
e
r
をh
nえ37'Cで 30minイン
キュベートする。 1
長国ーしたスフエロプラストに Ly
si
sX s
u
f
f
e
r(
10m MHEPES(
7
.
6
),1%
7
9
-
ー
T
r
i
t
o
nX-IOO,1
5
0mMNaCI,51
1
1
MMgCI2,1mMPMSF.1pg
/
ml
pi
..
c
.
)を加え 4'
C.1
5min
静置した後 1
0,
000g,1
0m
i
l
l遠心した上約をとり、 P
r
ot
e
i
nAs
e
p
h
a
r
o
s
eb
e
a
d
s5~ll を IJIlえ4
'
C
, 1h
r回!
i
i.i;させながらインキュベー卜して P
r
o
t
e
inAとの非特異的紡合物を除く。その
後0
.
5
μ
lの抗体を加えて 4"
C
, 1h
r
j
静置し、 P
r
ot
c
i
nAs
ep
ha
r
o
s
eb
e
a
d
sS ~LI を加え 4 'C, o
/
n向
転させながらインキュベートする。 TTBSで 5回洗i'
f
'した後、非泣元状態で SDSPAGE
明
し、銀染色によりゲルを染色した。
1
5
) インベ J
レターゼ免疫沈降
各種細胞を OD
5
5
0
=1
.
0程 度 に ま で 暗 養 し た 後 、 集 菌 し 0
.
9MS
o
r
bi
l
ol
で洗浄し 2
51
1
1
M
巴t
h
a
nol
,
0
.
9M Sor
b
i
l
ol
に!怒濁し 1
0m
i
n室組でインキュペートし、もう 一度
sMe
r
c
ap
to
0.
9
MS
o
r
b
i
tol
で、洗均した後、 s
M
e
r
c
a
p
t
o
e
t
h
a
n
ol
を除いた ZB
u
f
f
e
r
をJ
l
/え3
7"Cで3
0m
i
nイン
.1
キュベートする。遠心によりスフエロプラストを除いてペリプラズム画分をとり、 0
mg
/
m
lになるように Dbi
o
t
i
no
yl
E
amin
o
c
a
p
r
on
ica
c
i
dN
h
y
d
r
ox
y
su
c
ci
n
i
m
i
de巴s
t
e
r
を加え、
i
K
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謝辞
本研究を遂行するにあたり暖かいご指導、ご鞭縫を J!易りました 111~1荷民狩教僚、依 ITI
幸司教授に心より感謝し、たします。
実際に笑験の方法から姿勢まで丁寧にそして辛抱強〈ご指導いただきました榊原明
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D士に心より感謝し、たします。
抗体作製を行っていただいたエスエス製楽(株)橘公 一陣上、電子顕微鏡写真をぬっ
ていただいた分子細胞生物学研究所平日可愛子博士、プロテインシークエンスを行 って
いただいた理化学研究所千々松畠労協士に心より感謝いたします。
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Iきました北本Jj事ひこ教J
受
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十附 7
i誌助教
実際の実験に│廻しまして布設なご助言 をl
授、野田│場一助手、有同年:助手、門倉 I
W助手に心より感謝いたします 。
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hl、 mnn
9、oc
h3変興株および遺伝子を移"供与いただき且つ様々なご助言 を]耳きま
した通産省生命工学工業技術研究所
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npJ磁波
地神芳文博士に心より感謝いたします。
1
*及び逃伝子を御供与いただき且つ様々なご助 言 を頂きました醸造研究所
下飯仁博士に心より感謝いたします。
pRSベクターおよび醇母ライブラリーを術l
分与いただき且つ様々なご助言を頂きま
した L
Li本歩博士に心より感謝いたします。
本研究で用いた変異株およびプラスミドを御分与いただきました海外の研究者の皆
様に心より感謝いたします。
共同研究者であり様々なご協力を頂きました川田剛士氏、小島英敏氏、阿部将人氏
に心より感謝いたします。
最後になりましたが、公私にわたり枚々なご指導、ご協力を頂きました本線秀子、
石大賢雨博士をはじめとする微生物学研究室の皆様、術i
川到氏、高宮正也氏をはじめ
とする分子生命工学研究室の皆様、生物有機化学研究室永田晋治氏に心より感謝いた
します。
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