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【課題】 前立腺癌マーカポリペプチド
JP 2005-80524 A 2005.3.31 (57) 【 要 約 】 （ 修 正 有 ） 【課題】 前立腺癌マーカポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及び該ポリペプ チドを利用した前立腺癌の診断方法を提供する。 【解決手段】 前立腺由来の特定なアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド、 該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体、及び前立腺由来の特定なアミノ酸配列を含 む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、前立腺 癌の診断方法である。 【選択図】 なし (2) JP 2005-80524 A 2005.3.31 【特許請求の範囲】 【請求項１】 配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチド。 【請求項２】 配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１以上の置換、欠失、 付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１∼３５のいず れか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導する 変異ポリペプチド。 【請求項３】 下 記 (1)又 は (2)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 で あ っ て 、 か つ 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ 10 ノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチド 断片： (1) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド ； (2)配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 ア ミ ノ 酸 残 基 １ 以 上 の 置 換 、 欠 失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１∼３５の いずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導 するポリペプチド。 【請求項４】 少なくとも１５アミノ酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド断片。 20 【請求項５】 少なくとも２０アミノ酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド断片。 【請求項６】 少なくとも２５アミノ酸残基を含む、請求項３記載のポリペプチド断片。 【請求項７】 配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少 なくとも１種を検出することを特徴とする、前立腺癌の診断方法。 【請求項８】 被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させる工程 を有する、請求項７記載の診断方法。 30 【請求項９】 配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの 少なくとも１種を検出することを特徴とする、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断方法 。 【請求項１０】 被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体とを接触させる工程 を有する、請求項９記載の診断方法。 【請求項１１】 下 記 (a)、 (b)又 は (c)を 含 む 、 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ に 記 載 さ れ た ア ミ ノ 酸 配 列 を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対し、特異性を有する抗体製造用組成物： 40 (a) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ に 記 載 さ れ た ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む ポ リ ペ プ チ ド ； (b) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 ア ミ ノ 酸 残 基 １ 以 上 の 置 換 、 欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１∼３５ のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘 導するポリペプチド；又は (c) (a)又 は (b)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 で あ っ て 、 か つ 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチ ド断片。 【請求項１２】 (c)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 が 、 少 な く と も １ ５ ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 む 、 請 求 項 １ １ 記 載 の 抗 体 50 (3) JP 2005-80524 A 2005.3.31 製造用組成物。 【請求項１３】 (c)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 が 、 少 な く と も ２ ０ ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 む 、 請 求 項 １ １ 記 載 の 抗 体 製造用組成物。 【請求項１４】 (c)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 が 、 少 な く と も ２ ５ ア ミ ノ 酸 残 基 を 含 む 、 請 求 項 １ １ 記 載 の 抗 体 製造用組成物。 【請求項１５】 配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに特 異性を有する抗体。 10 【請求項１６】 モノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。 【請求項１７】 請求項１１記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、配列番号１∼３５のいずれか １のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を製造する方 法。 【請求項１８】 配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異 性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌治療用医薬組成物。 【請求項１９】 20 配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特 異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌治療用医 薬組成物。 【請求項２０】 配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特 異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌形成阻害 用医薬組成物。 【請求項２１】 配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異 性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌診断用キット。 30 【請求項２２】 配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特 異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用キ ット。 【請求項２３】 下 記 (i)、 (ii)又 は (iii)を 含 む 、 前 立 腺 癌 診 断 用 核 酸 プ ロ ー ブ ： (i) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列を有するポリヌクレオチド； (ii) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は 40 (iii) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 含 む ポ リ ヌ ク レ オ チ ド と 、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド 断片。 【請求項２４】 配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なく とも１種を検出することを含む、前立腺癌の診断方法。 【請求項２５】 被験者から得た検体と、請求項２３記載の前立腺癌診断用核酸プローブを接触させること を含む、請求項２４記載の診断方法。 【請求項２６】 50 (4) JP 2005-80524 A 2005.3.31 被 験 者 か ら 得 た 検 体 に 含 ま れ る ポ リ ヌ ク レ オ チ ド を ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 （ Ｐ Ｃ Ｒ )で 増 幅することを含む、請求項２４記載の診断方法。 【請求項２７】 配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片 からなる前立腺癌診断用プライマー。 【請求項２８】 配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部 分配列を含むヌクレオチド断片からなる、前立腺癌診断用プライマー。 【請求項２９】 請求項２３記載の前立腺癌診断用核酸プローブを含む、前立腺癌診断用キット。 10 【請求項３０】 さらに請求項２７及び２８記載の前立腺癌診断用プライマーを含む、請求項２９記載の前 立腺癌診断用キット。 【請求項３１】 下 記 (iv)、 (v)又 は (vi)を 含 む 、 ア ン ド ロ ゲ ン 非 依 存 性 前 立 腺 癌 診 断 用 核 酸 プ ロ ー ブ ： (iv) 配 列 番 号 ５ ３ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列を有するポリヌクレオチド； (v) 配 列 番 号 ５ ３ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は (vi) 配 列 番 号 ５ ３ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 含 む ポ リ ヌ ク レ オ チ ド と 、 20 ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断 片。 【請求項３２】 配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なく とも１種を検出することを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断方法。 【請求項３３】 被験者から得た検体と、請求項３１記載の核酸プローブを接触させることを含む、請求項 ３２記載の診断方法。 【請求項３４】 被験者から得た検体に含まれるポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増 30 幅することを含む、請求項３２記載の診断方法。 【請求項３５】 配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片 からなるアンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマー。 【請求項３６】 配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部 分配列を含むヌクレオチド断片からなる、アンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマ ー。 【請求項３７】 請求項３１記載の前立腺癌診断用核酸プローブを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌診 40 断用キット。 【請求項３８】 さらに請求項３５及び３６記載のアンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマーを含む 、請求項３７記載の前立腺癌診断用キット。 【発明の詳細な説明】 【技術分野】 【０００１】 本発明は、前立腺癌マーカポリペプチド、該ポリペプチドに対する抗体、及び該ポリペ プチドを利用した前立腺癌の診断方法に関するものである。さらに詳細に述べると、アン ドロゲン依存性前立腺癌、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌それぞれに特異的なマーカ 50 (5) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ポリペプチド、それらに対する抗体、及び該マーカポリペプチド及び抗体を利用した前立 腺癌の診断方法、及び治療用医薬組成物に関するものである。 【背景技術】 【０００２】 近年、前立腺癌は、米国において男性の罹患率第１位、かつ死亡率第２位の癌で、日本 でも高齢化と生活の欧米化の影響でその患者数が急激に増加しているが、前立腺癌は初期 症状がないため、転移を伴う進行癌の状態で発見されることが多い。 ま た 現 在 、 前 立 腺 癌 の 腫 瘍 マ ー カ と し て 前 立 腺 特 異 抗 原 (Prostatic pecific Antigen ; PSA)が 広 く 使 わ れ て い る が 、 PSAを 用 い た 診 断 で は 、 偽 陽 性 が 多 く 、 良 性 と 悪 性 と の 境 界領域が広い等の問題があり（非特許文献１）、新たな腫瘍マーカが検討されてきた。例 10 え ば 、 前 立 腺 癌 特 異 性 の ア ン ド ロ ゲ ン で 調 節 さ れ た 細 胞 表 面 セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ で あ る 20 PlF12/TMPRS2に 由 来 す る 腫 瘍 マ ー カ （ 特 許 文 献 １ ） 、 ヒ ト 前 立 腺 癌 に お い て 発 現 さ れ る Ｃ 型レクチン膜貫通抗原（特許文献２）、その他、多くの前立腺癌特異的タンパク質の発見 に伴う腫瘍マーカ（特許文献３）などである。しかし、これまで確度が高い診断を可能に する前立腺癌マーカは発見、又は実用化されていなかった。 【０００３】 さらに、初期の前立腺癌は増殖するために男性ホルモン（アンドロゲン）が必要であり 、そのため、アンドロゲン遮断療法が行われる。一方、該前立腺癌はアンドロゲン非依存 性を獲得して再増殖を始めるため、通常、該遮断療法の効果は２年以内に失われる。その ため前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得すると多くの患者は１年以内に死亡するので 20 、前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得しているか否かを判断することは重要であるに も係わらず、アンドロゲン非依存性の獲得を示す前立腺癌マーカは存在せず、アンドロゲ ン非依存性前立腺癌に対し、ホルモン療法以外の治療法を早期から実施することができな かった。 【特許文献１】特表２００２−５１７１８５号公報 【特許文献２】特表２００３−５０７０４２号公報 【特許文献３】特表２００２−５２００５４号公報 【 非 特 許 文 献 １ 】 Chan DW, Sokoll LJ. Prostate-specific antigen: update 1997. J In tFed Clin Chem 1997; 9: 120-5 【発明の開示】 30 【発明が解決しようとする課題】 【０００４】 本発明は、アンドロゲン依存性前立腺癌マーカポリペプチド、及びアンドロゲン非依存 性前立腺癌マーカポリペプチド、該マーカポリペプチドに特異的な抗体、及び該マーカポ リペプチド及び抗体を利用した前立腺癌の診断方法、及び治療用医薬組成物を提供するこ とを目的とする。 【課題を解決するための手段】 【０００５】 本発明者らは、前立腺癌組織からタンパク質を取り出し、アガロース２ＤＥ法と液体ク ロマトグラフィー又はタンデム質量分析を組み合わせ、プロテオーム解析により発現タン 40 パ ク 質 の 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 Gene Bank デ ー タ ベ ー ス に 登 録 さ れ た タ ン パ ク 質 の 中から新たにアンドロゲン依存性前立腺癌、及びアンドロゲン非依存性前立腺癌のマーカ となるポリペプチドを見出すことができた。本発明は、かかる研究成果に基づきなされた ものである。 【０００６】 したがって、本発明は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺 癌マーカポリペプチドを提供する。 また、本発明は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列から、アミノ酸残基１ 以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列 番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する 50 (6) JP 2005-80524 A 2005.3.31 抗体産生を誘導する変異ポリペプチドを提供する。 【０００７】 さ ら に 、 本 発 明 は 、 下 記 (1)又 は (2)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 で あ っ て 、 か つ 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を 誘導するポリペプチド断片を提供する。 (1) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド ；及び (2)配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 ア ミ ノ 酸 残 基 １ 以 上 の 置 換 、 欠 失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１∼３５の いずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導 10 するポリペプチドである。 【０００８】 さらに本発明は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マー カポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、前立腺癌の診断方法を提 供する。 さらに、本発明は、配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌 マーカポリペプチドの少なくとも１種を検出することを特徴とする、アンドロゲン非依存 性前立腺癌の診断方法を提供する。 さ ら に 、 本 発 明 は 、 下 記 (a)、 (b)又 は (c)を 含 む 、 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ に 記 載されたアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに対し特異性を有する抗体製造 20 用組成物を提供する。 (a) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ に 記 載 さ れ た ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む ポ リ ペ プ チ ド ； (b) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 ア ミ ノ 酸 残 基 １ 以 上 の 置 換 、 欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１∼３５ のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘 導するポリペプチド；及び (c) (a)又 は (b)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 で あ っ て 、 か つ 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペプチ ド断片である。 【０００９】 30 さらに本発明は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マー カポリペプチドに特異性を有する抗体を提供する。 さらに本発明は、前記抗体製造用組成物を哺乳動物に投与することを含む、配列番号１ ∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する 抗体を製造する方法を提供する。 さらに本発明は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカ ポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌治療用医薬組 成物を提供する。 さらに本発明は、配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マー カポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存 40 性前立腺癌治療用医薬組成物、又はアンドロゲン非依存性前立腺癌形成阻害用医薬組成物 を提供する。 【００１０】 さらに本発明は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカ ポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、前立腺癌診断用キット を提供する。 さらに本発明は、配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マ プ チドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種含有する、アンドロゲン非依存性前立腺癌 診断用キットを提供する。 さ ら に 本 発 明 は 、 下 記 (i)、 (iii)を 含 む 、 前 立 腺 癌 診 断 用 核 酸 プ ロ ー ブ を 提 供 す る 。 50 (7) JP 2005-80524 A 2005.3.31 (i) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列を有するポリヌクレオチド； (ii) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は (iii) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 含 む ポ リ ヌ ク レ オ チ ド と 、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド 断片である。 【００１１】 さらに、本発明は、配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリ ヌクレオチドの少なくとも１種を検出することを含む、前立腺癌の診断方法を提供する。 10 さらに本発明は、配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含 むヌクレオチド断片からなる前立腺癌診断用プライマー（フォワードプライマー）、及び 配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部 分配列を含むヌクレオチド断片からなる、前立腺癌診断用プライマー（リバースプライマ ー）を提供する。 【００１２】 さらに本発明は、前記前立腺癌診断用核酸プローブを含む、前立腺癌診断用キットを提 供する。 さ ら に 本 発 明 は 、 下 記 (iv)、 (v)又 は (vi)を 含 む 、 ア ン ド ロ ゲ ン 非 依 存 性 前 立 腺 癌 診 断 用核酸プローブを提供する。 20 (iv) 配 列 番 号 ５ ３ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列を有するポリヌクレオチド； (v) 配 列 番 号 ５ ３ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は (vi) 配 列 番 号 ５ ３ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 含 む ポ リ ヌ ク レ オ チ ド と 、 ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド断 片である。 【００１３】 さらに本発明は、配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌ クレオチドの少なくとも１種を検出することを含む、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診 30 断方法を提供する。 さらに本発明は、配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含 むヌクレオチド断片からなるアンドロゲン非依存性前立腺癌診断用プライマー（フォワー ドプライマー）、及び配列番号５４∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列と、相補的な ヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド断片からなる、アンドロゲン非依存性前 立腺癌診断用プライマー（リバースプライマー）を提供する。 【００１４】 さらに本発明は、前記前立腺癌診断用核酸プローブを含む、アンドロゲン非依存性前立 腺癌診断用キットを提供する。 （定義） 40 本明細書で用いる用語「前立腺癌マーカポリペプチド」とは、ヒト前立腺癌細胞抽出液 から抽出され、アガロース二次元電気泳動によりゲル上に展開して得られた、ヒト前立腺 癌細胞に特異的なスポットから分離されたポリペプチドをいう。なお、該前立腺癌マーカ ポリペプチドは、前立腺癌細胞から一般的に発現するポリペプチドであるが、アンドロゲ ン非依存性を獲得した前立腺癌細胞において特徴的に発現量が変化するものがある。なお 、当該前立腺癌マーカポリペプチドは、癌細胞から分離、又は単離された形態のポリペプ チドを含むものである。 【００１５】 また、本明細書中で用いる用語「血清中抗体」とは、血清中に存在し、配列番号１∼３ ５ に い ず れ か １ を 含 む ポ リ ペ プ チ ド と 結 合 す る 抗 体 IgGを 意 味 す る 。 ま た 、 本 明 細 書 中 で 50 (8) JP 2005-80524 A 2005.3.31 用いる用語「抗体」、及び「標式化抗体」とは、配列番号１∼３５にいずれか１を含むポ リペプチド、その変異ポリペプチド、及びこれらのポリペプチド断片を免疫原として作成 されたポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を意味する。 【発明の効果】 【００１６】 本発明により、新規な、かつ優れた前立腺癌マーカポリペプチド、アンドロゲン非依存 性前立腺癌マーカポリペプチド、これら前立腺癌マーカポリペプチドに特異的な抗体、及 び該マーカポリペプチド及び抗体を利用した前立腺癌の診断方法、及び治療用医薬組成物 を得ることができる。 【発明を実施するための最良の形態】 10 【００１７】 （前立腺癌マーカポリペプチドの検索に用いた前立腺癌組織） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチド検索に用いる、アンドロゲン依存性前立腺癌細胞 とアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞は、従来知られている方法で作成することができる （ 1） 。 例 え ば 、 ア ン ド ロ ゲ ン 依 存 性 ヒ ト 前 立 腺 癌 細 胞 と し て 、 市 販 さ れ て い る LNCaP細 胞 株 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA)を 用 い る こ と が で き る 。 該 LNCaP細 胞 株 を 、 ウ シ 胎 仔 血 清 10％ を 含 有 す る 培 養 培 地 （ 例 え ば 、 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium） 中 で 維 持 、 培 養 し た 後 、 該 培 養 LNCaP 7 細 胞 1x10 個 を 0.1 ml マ ト リ ゲ ル (Matrigel, Becton Dickinson Labware, NJ, US A) に 混 入 し て 、 雄 ヌ ー ド マ ウ ス (BALB/c strain) の 皮 下 に 接 種 し 、 腫 瘍 が 100か ら 2 20 3 00 mm に な っ た と こ ろ で 、 精 巣 を 摘 除 す る 。 該 腫 瘍 は 一 次 的 に 縮 小 す る が 、 ま も な く 再 増殖を始める。このときの精巣摘除前の腫瘍をアンドロゲン依存性前立腺癌、精巣摘除後 に再増殖した腫瘍をアンドロゲン非依存性前立腺癌として用いることができる。 【００１８】 （ヒト正常前立腺組織とヒト前立腺癌組織の採取） 本発明で用いたヒト正常前立腺組織と前立腺癌組織は、手術を施した患者の摘除検体か ら採取した。主として、神奈川県相模原市にある北里大学病院泌尿器科で手術を受けた患 者から同意を得て採取されたものである。該正常前立腺組織は、例えば、膀胱癌治療のた めに膀胱全摘除術が行われたときに同時に合併切除される前立腺から採取されたものであ る。また、前立腺肥大症により前立腺切除術が実施されたときに非癌前立腺組織も採取し 30 た。さらにヒト前立腺組織は、前立腺癌治療のために前立腺全摘除術もしくは前立腺切除 術が行われたときに摘除される前立腺、或いは、前立腺癌診断の際に実施される前立腺生 検術のときに採取されたものである。このとき、事前に男性ホルモン遮断療法が施されて いて、前立腺癌が再増殖を始めた症例の前立腺癌をアンドロゲン非依存性前立腺癌とした 。 【００１９】 （前立腺癌マーカポリペプチドの検索） 前記検索用の前立腺癌組織から得た細胞抽出物に含まれるポリペプチドを、常法である ア ガ ロ ー ス 二 次 元 電 気 泳 動 法 に よ り ゲ ル 上 に 展 開 し た (2)。 す な わ ち 、 タ ン パ ク 質 の 混 合 液をまず各タンパク質が保有する電荷（等電点）で分離し（一次元目）、続いて分子量で 40 分離する（二次元目）手法である。最も一般的な方法は固定化ｐＨ勾配二次元電気泳動法 （イモビライン２ＤＥ）であり、例えば、アマシャムバイオサイエンス（株）から販売さ れているキットを用いて実施することができる。 【００２０】 この方法は、あらかじめｐＨ勾配が固定化されたポリアクリルアミドゲルを一次元目に 用い、続いてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分子量によってタンパク質を分離する手法 であるが、一次元目にアクリルアミドゲルを用いるため、高分子量タンパク質が分離でき な い と い う 欠 点 が あ る （ 3)。 【００２１】 本発明者らが用いたアガロース二次元電気泳動法は、一次元目にアガロースゲルを用い 50 (9) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ることでこの欠点を克服したものである。典型的な該アガロース二次元電気泳動法の手法 を 説 明 す る 。 ま ず 、 ア ガ ロ ー ス １ ％ 、 D− ソ ル ビ ト ー ル １ ２ ％ 、 ５ Ｍ 尿 素 、 １ Ｍ チ オ 尿 素 、及び両性担体（例えば、ファルマライト、アマシャムバイオサイエンス（株））を混合 し 、 直 径 3.4 mm、 長 さ 180 mmの ガ ラ ス 管 に 注 入 し て 1次 元 目 の ゲ ル を 作 成 す る 。 こ の 一 端にタンパク質混合液、細胞抽出液、組織抽出液、又は血清などのサンプルを注入し、５ ００∼１０００ボルトの電圧をかけることにより電気勾配を作り、等電点電気泳動を行な う。二次元目は５∼２０％の濃度に調製したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを作成し、 電気泳動をかける（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。所 望の時間、電気泳動した後、二次元電気泳動ゲルをクーマジー染色、銀染色、シプロルビ ー染色などで染色して可視化する。このようにして、サンプルに含まれるポリペプチドを 10 ゲル上のスポットとして得ることができる。 【００２２】 （ゲル上のポリペプチド（タンパク質）の同定） 該ポリペプチドの同定は、プロテオーム解析により行なうことができる。すなわち、ア ガロース二次元電気泳動法に、自動ライン化された液体クロマトグラム−タンデム質量分 析 法 (LC/MS/MS) を 組 み 合 わ せ た 公 知 の 方 法 で 実 施 で き る (4)。 す な わ ち 、 ま ず 、 ゲ ル のタンパク質スポットをトリプシンなどでゲル内消化することでペプチドに分解する。様 々 な 部 位 で 切 断 さ れ た 、 色 々 な 長 さ の 各 ペ プ チ ド 断 片 を LC/MS/MSで 測 定 す る と 、 ペ プ チ ド の正確な質量が質量プロダクトイオン、又はマスタグとして得ることができる。このマス タグの質量スペクトルのデータを使って、ゲノム解析で作製されたデータベースを検索し 20 、ポリペプチドを同定することができる。本発明者らは、該ペプチド断片の質量スペクト ル デ ー タ を 、 解 析 ソ フ ト ウ エ ア (SEQUEST)を 用 い て 解 析 し 、 米 国 NCBIの デ ー タ ベ ー ス を 用 いて同定した。 【００２３】 （二次元電気泳動ゲルの定量的スポット解析） 二次元電気泳動ゲルの乾燥後、該ゲルの像を画像ファイルとしてコンピュータに取り込 み 、 画 像 解 析 ソ フ ト ウ エ ア （ 例 え ば 、 Phoretix 2D Advanced Version 5.01 (Nonlin ear Dynamics Ltd, UK)な ど ） を 用 い て 、 各 タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト 毎 に 定 量 し た 。 ま た 、 同様の画像解析ソフトウエアによって、各ゲルのタンパク質スポットの適合、解析ができ るので、ここからＴ検定などの統計学的手法を用いて、対照群別の比較検討を行った。 30 【００２４】 （前立腺癌マーカポリペプチド） このような二次元電気泳動ゲルと、プロテオーム解析により、本発明では、配列番号１ ∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドを得ることがで きた。これらのポリペプチドは、それぞれ特定の機能、又は発現する臓器などが知られて いたが、本発明者らが見出すまで、前立腺癌との関係は全く知られていなかった。したが って、本発明者らは、これらのポリペプチドが前立腺癌マーカとして利用できることを初 めて見出したのである。 【００２５】 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドを、従来知られていた名称などで列記する。なお 40 、それぞれのマーカポリペプチドに付された番号は、本明細書に添付された配列表のアミ ノ酸配列番号と一致している。なお、該前立腺癌マーカの具体的な同定手順は、本明細書 の実施例１∼３に具体的に記載されている。 【００２６】 １ ． KIAA0336 遺 伝 子 産 物 （ KIAA0336 gene product） ２ ． TAR RNA-相 互 作 用 タ ン パ ク 質 （ TRIP TAR RNA-interacting protein, TRIP） ３ ． RAD50 ホ モ ロ グ （ RAD50 homolog） ４ ． 仮 想 タ ン パ ク 質 FLJ10839 （ Hypothetical protein FLJ10839） ５ ． 富 ロ イ シ ン PPR-モ チ ー フ 包 含 （ Leucine-rich PPR-motif containing） ６ ． RNA ヘ リ カ ー ゼ KIAA0801 （ RNA helicase KIAA0801） 50 (10) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ７ ． ユ ビ キ チ ン 特 異 性 プ ロ テ ア ー ゼ 7 （ Ubiquitin specific protease 7） ８ ． カ ル シ ウ ム (ca2+)恒 常 性 内 部 原 形 質 網 状 質 タ ン パ ク 質 （ Calcium (ca2+) homeostasis endoplasmic reticulum protein） 【００２７】 ９ ． 関 連 ヌ ク レ オ ポ リ ン 133kDa、 又 は MGC21133タ ン パ ク 質 （ Nucleoporin 133kDa, Protein for MGC21133） １ ０ ． RNA ヘ リ カ ー ゼ 関 連 タ ン パ ク 質 （ RNA helicase-related protein） １ １ ． MOP-4（ MOP-4） １ ２ ． イ ン ス リ ン 減 成 酵 素 （ Insulin-degrading enzyme） １３．ＭＣＭ５ ミニクロモソーム維持欠陥５，細胞分画サイクル４６ 10 （ MCM5 minichromosome maintenance deficient 5, cell division cy cle 46 (S. cerevisiae)) １ ４ ． 電 圧 依 存 性 ア ニ オ ン 選 択 チ ャ ン ネ ル タ ン パ ク 質 1、 又 は Ｖ Ｄ Ａ Ｃ １ （ Voltage-dependent anion-selective channel protein 1 (VDAC-1)） 【００２８】 １ ５ ． プ ロ ヒ ビ チ ン （ Prohibitin） １ ６ ． NipSnap1タ ン パ ク 質 （ NipSnap1 protein） １ ７ ． ペ ロ キ シ レ ド キ シ ン 4 （ Peroxiredoxin 4） １ ８ ． ス プ ラ イ シ ン グ コ ア ク チ ベ ー タ サ ブ ユ ニ ッ ト SRm300 （ Splicing coactivator subunit SRm300） 20 １ ９ ． ロ ン プ ロ テ ア ー ゼ ホ モ ロ グ （ Lon protease homolog） ２０．ピュロマイシン感受性アミノペプチダーゼ （ Puromycin-sensitive aminopeptidase） 【００２９】 ２ １ ． EBNA-2 コ ア ク チ ベ ー タ (100kD) （ EBNA-2 co-activator (100kD)） ２ ２ ． JKTBP1 ２ ３ ． GTP-結 合 性 タ ン パ ク 質 ベ ー タ 鎖 ホ モ ロ グ （ GTP-binding protein beta chain homolog） ２４．核・塩素イオンチャンネルタンパク質 （ Nuclear chloride ion channel protein） 30 ２５．ウィリアム−ベウレン症候群染色体領域１ホモログ （ William-Beuren syndrome chromosome region 1 homolog） ２ ６ ． 抗 酸 化 性 タ ン パ ク 質 2 （ Antioxidant protein 2 ） 【００３０】 ２ ７ ． ペ ル オ キ シ レ ド ク シ ン 1 （ Peroxiredoxin 1） ２ ８ ． コ フ ィ リ ン 1 （ Cofilin 1） ２ ９ ． ク ル ッ ペ ル タ イ プ 亜 鉛 フ ィ ン ガ ー タ ン パ ク 質 、 も し く は 、 PEG3 （ Kruppel-type zinc finger protein, PEG3） ３ ０ ． ス カ フ フ ォ ル ド ア ッ タ ッ チ メ ン ト 因 子 B、 又 は HSP27 ERE-TATA-結 合 性 タ ン パ ク 質 （ Scaffold attachment factor B, HSP27 ERE-TATA-binding protein） 40 ３ １ ． ス プ ラ イ ソ ゾ ー ム 関 連 タ ン パ ク 質 130（ Spliceosome-associated protein 130） ３ ２ ． T 細 胞 に よ り 認 識 さ れ る 扁 平 上 皮 癌 抗 原 ３ 、 又 は SART3 （ Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cells 3, SA RT3） ３ ３ ． ユ ビ キ チ ン 活 性 化 酵 素 E1 （ Ubiquitin-activating enzyme E1） ３ ４ ． カ リ オ フ ェ リ ン (イ ン ポ ル チ ン )ベ ー タ １ （ Karyopherin (importin) beta 1） 【００３１】 ３ ５ ． ha1225 遺 伝 子 産 物 （ The ha1225 gene product） これら前立腺癌マーカポリペプチドを、アンドロゲン依存性前立腺癌の群とアンドロゲ ン 非 依 存 性 前 立 腺 癌 の 群 と で 発 現 を 統 計 学 的 に 比 較 検 討 し た と こ ろ 、 p＜ 0.1に お い て 非 依 50 (11) JP 2005-80524 A 2005.3.31 存 群 で 増 加 し た マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド が 12個 、 減 少 し た マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド が 6個 認 め ら れ た。すなわち、前記前立腺癌マーカポリペプチドのうち、特にアンドロゲン非依存性前立 腺癌に特異的なマーカが見出された。該アンドロゲン非依存性前立腺癌のマーカポリペプ チドは次のとおりである。 【００３２】 （アンドロゲン非依存性を獲得した後、発現量が増加するマーカポリペプチド） １ ８ ． ス プ ラ イ シ ン グ コ ア ク チ ベ ー タ サ ブ ユ ニ ッ ト SRm300 １９．ロンプロテアーゼホモログ ２０．ピュロマイシン感受性アミノペプチダーゼ ２ １ ． EBNA-2 コ ア ク チ ベ ー タ (100kD) 10 ２ ２ ． JKTBP1 ２ ３ ． GTP-結 合 性 タ ン パ ク 質 ベ ー タ 鎖 ホ モ ロ グ ２４．核・塩素イオンチャンネルタンパク質 ２５．ウィリアム−ベウレン症候群染色体領域１ホモログ ２６．抗酸化性タンパク質 2 ２７．ペルオキシレドクシン 1 ２８．コフィリン 1 （アンドロゲン非依存性を獲得した後、発現量が減少するマーカポリペプチド） 【００３３】 ２９．クルッペルタイプ亜鉛フィンガータンパク質 20 ３ ０ ． ス カ フ フ ォ ル ド ア ッ タ ッ チ メ ン ト 因 子 B、 又 は HSP27 ERE-TATA-結 合 性 タ ン パ ク 質 ３ １ ． ス プ ラ イ ソ ゾ ー ム 関 連 タ ン パ ク 質 130 ３ ２ ． T 細 胞 に よ り 認 識 さ れ る 扁 平 上 皮 癌 抗 原 ３ ３ ３ ． ユ ビ キ チ ン 活 性 化 酵 素 E1 ３ ４ ． カ リ オ フ ェ リ ン (イ ン ポ ル チ ン )ベ ー タ １ ３ ５ ． ha1225 遺 伝 子 産 物 【００３４】 したがって、抗体などを用いた検査により、被検者の血液中などに、前記１∼３５の前 立腺癌マーカポリペプチドが見出された場合、該被験者を前立腺癌患者、又は前立腺癌ハ イリスク者と判定することができる。また、被験者に、前記１８∼２８の前立腺癌マーカ 30 ポリペプチドの少なくとも１種の増加、及び／又は２９∼３５の前立腺癌マーカポリペプ チドの少なくとも１種の減少が観察される場合、該被験者はアンドロゲン非依存性前立腺 癌を有するか、又はそのハイリスク者と判定することができる。 【００３５】 したがって、被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポリペプチドを検出することに より、前立腺癌を診断することができる。さらに、被験者から得た検体から、配列番号１ ８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドの少なくとも １種を検出することにより、アンドロゲン非依存性前立腺癌の診断を行なうことができる 。該前立腺癌マーカポリペプチドの検出は、被験者から得た検体と、該前立腺癌マーカポ リペプチドに対する抗体とを接触させることにより行なうことができる。 40 【００３６】 本発明で用いる抗体は、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺 癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体である。該抗体は、ポリクローナル抗体、又 はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。 本 発 明 の 抗 体 を 用 い る 免 疫 検 定 (測 定 )法 を 挙 げ る と 、 酵 素 免 疫 測 定 法 (EIA)、 酵 素 イ ム ノ メ ト リ ッ ク ア ッ セ イ 法 (ELISA)、 蛍 光 免 疫 測 定 法 (FIA)、 放 射 線 免 疫 測 定 法 (RIA)、 発 光 免疫測定法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、免疫染色法などがある。 ウエスタンブロット法は、生体試料中に存在する当該タンパク質の分子量を知るために 有効である。この方法は、例えば、臓器組織由来の粗抽出液などの生体試料液をアクリル アミドゲル電気泳動させた後、メンブランに転写し、当該タンパク質、又は当該ペプチド 50 (12) JP 2005-80524 A 2005.3.31 を認識する抗体と反応させ、生成する免疫複合体を標識第二抗体を用いて検出するもので ある。この方法では、該免疫複合体と結合する標識第二抗体の標識量を測定する。 【００３７】 免疫染色法は、組織、及び細胞における対象ポリペプチドの発現部位を解析するために 有効である。この方法は、例えば、スライドガラス上に固定された組織切片、細胞などを 、本発明の抗体と反応させ、生成する免疫複合体を標識第二抗体を用いて検出することに より実施する。この方法では、該免疫複合体と結合した標識第二抗体の標識量を測定する 。 【００３８】 前記前立腺癌マーカポリペプチドを認識する抗体を用いる免疫検定の好ましい例として 10 、 ELISA法 を 挙 げ る こ と が で き る 。 こ の ELISA法 は 、 一 般 的 な 競 合 法 、 サ ン ド イ ッ チ 法 な ど の手法に従って実施でき、更に液相系でも、固相系でも実施できる。 ELISA法 の 好 ま し い 実 施 態 様 は 次 の と お り で あ る 。 ま ず 、 標 準 抗 原 (例 え ば 、 精 製 し た 当 該 ペ プ チ ド )を 適 当 な 担 体 に 固 定 化 し 、 ブ ロ ッ キ ン グ す る 。 次 い で 、 検 出 が 望 ま れ る マ ー カペプチドを含有するサンプル、及び当該抗体を、上記固定化標識抗原と接触させて、抗 体 -免 疫 複 合 体 、 及 び 抗 体 -標 準 抗 原 免 疫 複 合 体 を 競 合 的 に 生 成 さ せ る 。 生 成 し た 抗 体 -免 疫複合体の量を測定し、予め作製した検量線からサンプル中の、又は当該ポリペプチドの 質量を決定することができる。 【００３９】 本発明の抗体と標準抗原との反応性が予め判っており、検量線などが作成できる場合に 20 は、前記固定化標準抗原の代わりに、当該ポリペプチドを含有するサンプルを固定化して 用いることもできる。 上 記 ELISA法 の 実 施 態 様 に お い て は 、 当 該 抗 体 を 第 一 抗 体 と し て 用 い 、 こ の 第 一 抗 体 に 対 す る 第 二 抗 体 を 標 識 し て 用 い る こ と も で き る 。 こ の 場 合 は 抗 体 -免 疫 複 合 体 の 量 は 、 こ れに結合した標識第二抗体の標識量を測定することにより容易に求めることができる。上 記方法の変法として、標識した第二抗体を用いることなく、第一抗体を、例えば酵素で標 識して利用することもできる。更に、第一抗体をビオチンで標識し、第二抗体の代わりに アビシン、又はストレプトアビシンに酵素を結合させたものを用いてもよい。 【００４０】 （本発明の抗体の調製） 30 本発明で用いる抗体は、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドを認識し、抗原抗体反応 するものであれば、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体の何れであってもよい 。本発明の抗体の製造に用いる抗原となる、ポリペプチド、ペプチド又はその断片には下 記のものがある： (1) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド； (2) 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ の ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 、 ア ミ ノ 酸 残 基 １ 以 上 の 置 換 、 欠失、付加及び／又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１∼３５ のいずれか１のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘 導する変異ポリペプチド；及び 40 (3) 前 記 (1)又 は (2)の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 で あ っ て 、 か つ 配 列 番 号 １ ∼ ３ ５ の い ず れ か １ のアミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導するポリペ プチド断片である。 【００４１】 なお、該ポリペプチド断片は、前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導す ることができれば、特にその長さに制限はないが、通常、少なくとも１５アミノ酸残基、 好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、特に好ましくは、少なくとも２５アミノ酸残 基 を 含 む も の で あ る 。 な お 、 こ れ ら の (1)又 は (2)の ポ リ ペ プ チ ド 、 又 は (3)そ の ペ プ チ ド 断片を、抗体誘導に好ましい成分と組み合わせて、抗体製造用組成物として用いることが できる。本発明で用いる抗体を下記の方法で調製することができる。 50 (13) JP 2005-80524 A 2005.3.31 【００４２】 （モノクローナル抗体の調製） まず、モノクローナル抗体産生細胞を次のように作成することができる。本発明の前記 (1)又 は (2)の ポ リ ペ プ チ ド 、 又 は (3)そ の ペ プ チ ド 断 片 を 、 単 独 で 、 又 は 担 体 、 希 釈 剤 な どと組み合わせて温血動物に投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロ イントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。該投与は通常２ ∼６週毎に１回ずつ、計２∼１０回程度行なう。投与する温血動物の例を挙げると、サル 、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあり、特 にマウス、及びラットが好ましい。 【００４３】 10 モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマ ウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２∼５日後に脾臓、又はリンパ節 を採取する。そして、採取された組織に含まれる抗体産生細胞を同種、又は異種動物の骨 髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製するこ とができる。 【００４４】 抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後述する標識化タンパク質と抗血清とを反応させ たのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操 作 は 既 知 の 方 法 、 例 え ば 、 ケ ー ラ ー と ミ ル ス タ イ ン の 方 法 〔 ネ イ チ ャ ー （ Nature） 、 256 、 495 (1975)〕 に 従 い 実 施 す る こ と が で き る 。 融 合 促 進 剤 の 例 を 挙 げ る と 、 ポ リ エ チ レ 20 ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあり、特にＰＥＧが好ましい。 【００４５】 該骨髄腫細胞の例を挙げると、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血 動物の骨髄腫細胞があり、特にＰ３Ｕ１が好ましい。 融合時における抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１： １∼２０：１程度である。細胞融合は、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ１０００∼ＰＥＧ６０ ００を１０∼８０％程度の濃度で添加し、２０∼４０℃、好ましくは３０∼３７℃で１∼ １０分間インキュベートすることにより効率良く実施できる。 【００４６】 得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは種々の方法で行な 30 うことができる。例えば、前立腺癌マーカポリペプチドの抗原を直接、又は担体とともに 吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）に、ハイブリドーマ培養上清を添加し、次 に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いた細胞がマウ スの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる。）、又はプロテインＡを加え、固 相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体、又はプロテイ ンＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識 したマーカポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法など が挙げられる。 【００４７】 モノクローナル抗体の選別は、常法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポ 40 キサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができ る。また、選別、及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどの ような培地を用いても良い。例えば、牛胎児血清１∼２０％、好ましくは１０∼２０％含 む RPMI 1640培 地 、 牛 胎 児 血 清 １ ∼ １ ０ ％ を 含 む Ｇ Ｉ Ｔ 培 地 （ 和 光 純 薬 工 業 （ 株 ） ） 、 又 は ハ イ ブ リ ド ー マ 培 養 用 無 血 清 培 地 （ SFM-101、 日 水 製 薬 （ 株 ） ） な ど を 用 い る こ と が で きる。 【００４８】 培養温度は、通常２０∼４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日∼ ３週間、好ましくは１週間∼２週間である。培養は、通常、炭酸ガス５％の湿潤環境下で 行なう。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にし 50 (14) JP 2005-80524 A 2005.3.31 て測定できる。 【００４９】 モノクローナル抗体の分離、精製は、常法に従って行なうことができる。例えば、通常 、免疫グロブリンの分離、精製に利用される、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法 、 電 気 泳 動 法 、 イ オ ン 交 換 体 （ 例 、 DEAE） に よ る 吸 脱 着 法 、 超 遠 心 法 、 ゲ ル ろ 過 法 、 抗 原 結合固相による方法、並びにプロテインＡ又はプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体 のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などである。 【００５０】 （ポリクローナル抗体の調製） 本発明のポリクローナル抗体は、常法に従って製造することができる。例えば、免疫抗 10 原自体、又はその抗原性ペプチド断片とキャリアタンパク質との複合体をつくり、前記モ ノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタ ンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造するこ とができる。 【００５１】 温血動物の免疫に用いる免疫複合体を調製する場合、キャリアタンパク質の種類、及び 該キャリアタンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアタンパク質に架橋させたハプテ ンに対して抗体が効率よく産生されれば、特に制限されない。例えば、ウシ血清アルブミ ン、ウシサイログロブリン、又はヘモシアニンをキャリアタンパク質として用いた場合、 これらを重量比でハプテン１に対し、約０．１∼２０、好ましくは約１∼５の割合で架橋 20 させるのが好ましい。 【００５２】 また、ハプテンとキャリアタンパク質のカップリングには、種々の縮合剤を用いること ができる。該縮合剤の例を挙げると、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド 活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等がある。該 縮合生成物を、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体、又は担体、希釈剤 とともに投与する。 【００５３】 投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイン トアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２∼６週毎に１回ずつ、計約３∼１０ 30 回程度行なう。ポリクローナル抗体は、前記方法で免疫された温血動物の血液、腹水など から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中 の抗体価の測定と同様にして行なうことができる。また、ポリクローナル抗体の分離精製 は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離、精製法により 行なうことができる。 【００５４】 本発明のガン診断用キットは、このようにして得られたポリクローナル、又はモノクロ ーナル抗体を含むものである。該ガン診断用キットは、配列番号１∼３５のいずれか１の アミノ酸配列を含む、前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも １種利用することで、前立腺癌の診断に使用することができる。また、該ガン診断用キッ 40 トは、配列番号１８∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチ ドに特異性を有する抗体を、少なくとも１種を利用することにより、アンドロゲン非依存 性前立腺癌を診断することができる。 【００５５】 なお、該診断用キットは、必要に応じて、免疫反応用ウェル、染色剤、検出用の酵素標 識抗体、洗浄液、抗体希釈液、検体希釈液、酵素基質、酵素基質液希釈液、その他の試薬 を含むものである。 また、配列番号１∼３５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチ ドに特異性を有する抗体は、前立腺癌特異的タンパク質の発現を抑制するものであるから 、ガン化の予防、進行遅延、及び治療に使用することができる。特に、配列番号１８∼３ 50 (15) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ５のいずれか１のアミノ酸配列を含む前立腺癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体 は、前立腺癌のアンドロゲン非依存性獲得を阻害し、アンドロゲン非依存性前立腺癌の進 行遅延、及び治療に使用することができる。 【００５６】 本発明の前記前立腺癌マーカポリペプチドに対する抗体を含む医薬組成物は、経口的に 、又は非経口的に投与することができ、さらに該非経口的投与は、組織への局所的な投与 を含む。 本発明の医薬組成物を経口投与する場合、汎用されている担体などの製剤用成分、例え ば、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、分散剤 、安定化剤、コーティング剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢 10 剤及び賦形剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風 味剤、甘味剤などの添加剤を用いてもよい。 【００５７】 製薬用成分の具体的な例を挙げると、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、 デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤、水、エタ ノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロ ース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合 剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリ ウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナ トリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ステアリ 20 ン酸、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫 酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、 カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等 の滑沢剤などである。さらに必要に応じて、上記の各剤形について公知のドラッグデリバ リーシステムの技術を採用し徐放化、局所適用化（トローチ、バッカル剤、舌下錠等）、 薬物放出制御、腸溶性化、胃溶性化などを施すことができる。 【００５８】 また、本発明の医薬組成物を非経口投与する場合、点滴、静脈注射、皮下注射、筋肉注 射などの注射による投与、油脂製坐剤、水溶性坐剤、座剤による直腸投与などの形態とす ることができる。該調剤は、製薬分野における通常の担体を用い、常法により容易に行な 30 うことができる。 本発明の抗体を含む医薬組成物は、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット 、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に 対して投与することができる。該抗体の投与量は、対象の状態、投与ルートなどにより適 宜変わるが、例えば、注射剤の形態で体重６０ｋｇの成人患者に投与する場合は、一日に つ き 約 ５ ０ ∼ ５ ０ ０ mg程 度 、 好 ま し く は 約 １ ０ ０ ∼ ２ ５ ０ mg程 度 、 よ り 好 ま し く は 約 １ ２ ０ ∼ ２ ０ ０ mg程 度 を 静 脈 か ら 投 与 す る の が 好 ま し い 。 【００５９】 また、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、すなわち 、配列番号３６∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少な 40 くとも１種を検出することにより、被験者が前立腺癌を有するか、又はそのそのハイリス ク者であるか否かを判定することができる。特に、配列番号５３∼７０のいずれか１のヌ クレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの少なくとも１種を検出することにより、被験 者がアンドロゲン非依存性前立腺癌を有するか、又はそのハイリスク者であるか否かを判 定することができる。 【００６０】 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する、前立 腺癌の診断方法では、被験者から得た検体、例えば、血液、細胞抽出液、生検試料などに 含まれるポリヌクレオチドを検出する。 該ポリヌクレオチドの検出は、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリ 50 (16) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ヌクレオチドを、その部分配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖 反 応 法 （ PCR） に よ っ て 増 幅 す る か 、 又 は 適 当 な ベ ク タ ー に 組 み 込 ん だ ポ リ ヌ ク レ オ チ ド を、本発明のポリペプチドの一部、又は全領域をコードするポリヌクレオチド、又は合成 ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって行なうことができる。 該 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 方 法 は 、 例 え ば 、 モ レ キ ュ ラ ー ・ ク ロ ー ニ ン グ (5)に 記 載 の 方法などで行なうことができる。該ハイブリダイゼーションは、ハイストリンジェントな 条件、例えば、ナトリウム濃度が約１９∼４０ｍＭ、特に約１９∼２０ｍＭで、温度が約 ５０∼７０℃、特に約６０∼６５℃の条件で行なうのが好ましい。また、ナトリウム濃度 が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。 【００６１】 10 本 発 明 で は 、 下 記 (i)、 (ii)又 は (iii)を 含 む 、 前 立 腺 癌 診 断 用 核 酸 プ ロ ー ブ を 用 い る こ とができる。 (i) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列を有するポリヌクレオチド； (ii) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 と 、 相 補 的 な ヌ ク レ オ チ ド 配 列の部分配列を含むヌクレオチド断片；又は (iii) 配 列 番 号 ３ ６ ∼ ７ ０ の い ず れ か １ の ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 含 む ポ リ ヌ ク レ オ チ ド と 、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド 断片である。 【００６２】 20 特に、配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配 列を有するポリヌクレオチドは、アンドロゲン非依存性癌診断用核酸プローブとして用い ることができる。 また、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＰＣＲ 法によって検出する場合、常法で行なうことができる。 該ＰＣＲ法では、配列番号３６∼７０のいずれか１種のヌクレオチド配列に対するセン ス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとし て用いる。 特に、配列番号５３∼７０のいずれか１のヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオ チド断片からなるプライマー（フォワードプライマー）、及び配列番号５３∼７０のいず 30 れか１のヌクレオチド配列と、相補的なヌクレオチド配列の部分配列を含むヌクレオチド 断片からなるプライマー（リバースプライマー）を用いることにより、アンドロゲン非依 存性前立腺癌の診断を行なうことができる。 【００６３】 なお、該フォワードプライマーの長さは、特に制限する必要はないが、通常１４∼６０ bpで あ り 、 か つ リ バ ー ス プ ラ イ マ ー の 長 さ も 特 に 制 限 す る 必 要 は な い が 、 通 常 １ ４ ∼ ６ ０ pbと す る の が 好 ま し い 。 本発明の前立腺癌診断用キットは、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをハイブリダ イゼーションによって検出する場合、配列番号３６∼７０のいずれか１のポリペプチド配 列の一部、又は全領域をコードするポリヌクレオチド、又は合成ＤＮＡを用いて標識した 40 ものを、前立腺癌診断用核酸プローブとして含む。 【００６４】 また、該前立腺癌診断用キットが、アンドロゲン非依存性前立腺癌の検出を目的とし、 該前立腺癌マーカポリペプチドをハイブリダイゼーションによって検出する場合、配列番 号５３∼７０のいずれか１のポリペプチド配列の一部、又は全領域をコードするポリヌク レオチド、又は合成ＤＮＡを用いて標識したものを、前立腺癌診断用核酸プローブとして 含む。 【００６５】 本発明の前立腺癌診断用キットは、本発明の前立腺癌マーカポリペプチドをＰＣＲ法に よって検出する場合、配列番号３６∼７０のいずれか１種のヌクレオチド配列に対するセ 50 (17) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ンス鎖断片をフォワードプライマーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーと して含む。また、本発明の前立腺癌診断用キットが、アンドロゲン非依存性前立腺癌の検 出を目的とし、前立腺癌マーカポリペプチドをＰＣＲ法によって検出する場合、配列番号 ５３∼７０のいずれか１種のヌクレオチド配列に対するセンス鎖断片をフォワードプライ マーとして、アンチセンス鎖断片をリバースプライマーとして含むものである。 【００６６】 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドは、そのコードされているポリヌクレオチドであ る、配列番号３６∼７０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを、適当な発現ベ クターに組み込み、かつ該発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、該宿主を増殖させる ことにより製造することができる。 10 【００６７】 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドの発現ベクターは、該ポリペプチドをコードする ポリヌクレオチドから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当なベクター 中のプロモーターの下流に連結することで製造することができる。 ここで用いるベクターには、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２ ５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５ ，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなど のバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの 動物ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ｎｅｏなどがある。 20 【００６８】 本発明で用いるプロモーターは、使用する宿主に対応した適切なプロモーターであれば いかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモータ ー 、 Ｓ Ｖ ４ ０ プ ロ モ ー タ ー 、 Ｌ Ｔ Ｒ プ ロ モ ー タ ー 、 Ｃ Ｍ Ｖ プ ロ モ ー タ ー 、 Ｈ Ｓ Ｖ -Ｔ Ｋ プ ロモーターなどがある。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、 ｌ ａ ｃ プ ロ モ ー タ ー 、 ｒ ｅ ｃ Ａ プ ロ モ ー タ ー 、 λ Ｐ Lプ ロ モ ー タ ー 、 ｌ ｐ ｐ プ ロ モ ー タ ー 、Ｔ７プロモーターなどがあり、該宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモー ター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、該宿主が酵母である場合は、 ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター などがあり、さらに該宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０ 30 プロモーターなどである。 【００６９】 本発明の発現ベクターには、さらに所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル 、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含むものを用いるこ とができる。該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシ リン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがある。また、必要に応じて、宿主に適し たシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。該宿主がエシェリヒア 属 菌 で あ る 場 合 は 、 PhoＡ シ グ ナ ル 配 列 、 OmpＡ シ グ ナ ル 配 列 な ど が 、 該 宿 主 が バ チ ル ス 属 菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、該宿 主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、該宿主が 40 動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配 列、抗体分子シグナル配列などを利用できる。このように構築した本発明のポリペプチド をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。 【００７０】 本発明で用いる宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞 、昆虫、及び動物細胞などがある。該バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキ ュ ラ ー ・ ア ン ド ・ ジ ェ ネ ラ ル ・ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク ス （ Molecular ＆ General Genetics） ， １ ６ ８ 巻 ， １ １ １ (１ ９ ７ ９ )な ど に 記 載 の 方 法 が あ る 。 酵 母 を 形 質 転 換 す る に は 、 例 え ば 、 メ ソ ッ ズ ・ イ ン ・ エ ン ザ イ モ ロ ジ ー （ Methods in Enzymology） ， １ ９ ４ 巻 ， １ ８ ２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ 50 (18) JP 2005-80524 A 2005.3.31 ・ サ イ エ ン シ イ ズ ・ オ ブ ・ ザ ・ ユ ー エ ス エ ー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA） ， ７ ５ 巻 ， １ ９ ２ ９ (１ ９ ７ ８ )な ど の 方 法 が あ る 。 昆 虫 細 胞 又 は 昆 虫 を 形 質 転 換 す る に は 、 例 え ば 、 バ イ オ ／ テ ク ノ ロ ジ ー （ Bio/Technology） ,6, 47-55(1988） な ど に 記 載 の 方 法 が あ る。また、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロト コ ー ル ． ２ ６ ３ − ２ ６ ７ （ １ ９ ９ ５ ） （ 秀 潤 社 発 行 ） 、 ヴ ィ ロ ロ ジ ー （ Virology） ， ５ ２ 巻 ， ４ ５ ６ (１ ９ ７ ３ )に 記 載 の 方 法 が あ る 。 こ の よ う に し て 、 本 発 明 の ポ リ ペ プ チ ド を コ ードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を作製することがで きる。 【００７１】 該宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用 10 される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素 源、窒素源、無機物その他が含くまれている。ここで炭素源としては、例えば、グルコー ス、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩 類、硝酸塩類、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ ショ抽出液など、また無機栄養分としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナト リウム、塩化マグネシウムなどある。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など を添加してもよい。培地のｐＨは約５∼８が望ましい。 【００７２】 エシェリヒア属菌を培養する培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ ９ 培 地 〔 ミ ラ ー （ Miller） ， ジ ャ ー ナ ル ・ オ ブ ・ エ ク ス ペ リ メ ン ツ ・ イ ン ・ モ レ キ ュ ラ ー 20 ・ ジ ェ ネ テ ィ ッ ク ス （ Journal of Experiments in Molecular Genetics） ， ４ ３ １ − ４ ３ ３ ， Cold Spring Harbor Laboratory, New York１ ９ ７ ２ 〕 が 好 ま し い 。 また、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸 のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５ ∼４３℃で約３∼２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主 がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０∼４０℃で約６∼２４時間行ない、必要により 通気や撹拌を加えることもできる。 【００７３】 宿 主 が 酵 母 で あ る 形 質 転 換 体 を 培 養 す る 培 地 と し て は 、 例 え ば 、 バ ー ク ホ ー ル ダ ー （ Bu rkholder） 最 小 培 地 〔 Bostian, K. L. ら 、 プ ロ シ ー ジ ン グ ズ ・ オ ブ ・ ザ ・ ナ シ ョ ナ ル 30 ・ ア カ デ ミ ー ・ オ ブ ・ サ イ エ ン シ イ ズ ・ オ ブ ・ ザ ・ ユ ー エ ス エ ー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA） ， ７ ７ 巻 ， ４ ５ ０ ５ (１ ９ ８ ０ )〕 や ０ .５ ％ カ ザ ミ ノ 酸 を 含 有 す る Ｓ Ｄ 培 地 〔 Bitter, G. A. ら 、 プ ロ シ ー ジ ン グ ズ ・ オ ブ ・ ザ ・ ナ シ ョ ナ ル ・ ア カ デ ミ ー ・ オ ブ ・ サ イ エ ン シ イ ズ ・ オ ブ ・ ザ ・ ユ ー エ ス エ ー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA） ， ８ １ 巻，５３３０（１９８４）〕がある。該培地のｐＨは約５∼８に調整するのが好ましい。 培養は通常約２０℃∼３５℃で約２４∼７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え る。 【００７４】 宿 主 が 昆 虫 細 胞 で あ る 形 質 転 換 体 を 培 養 す る 場 合 、 グ レ イ ス イ ン セ ク ト 培 地 (Grace's Insect Medium: Grace, T.C.C.,Nature,195,788(1962)） に 非 動 化 し た １ ０ ％ ウ シ 血 清 40 等の添加物を加えた倍地などを用いる。該培地のｐＨは約６．２∼６．４に調整するのが 好ましい。培養は通常約２７℃で約３∼５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える 。 【００７５】 また、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合、培地としては、例えば、約５ ∼ ２ ０ ％ の 胎 児 牛 血 清 を 含 む Ｍ Ｅ Ｍ 培 地 〔 サ イ エ ン ス （ Science） ， １ ２ ２ 巻 ， ５ ０ １ (１ ９ ５ ２ )〕 ， Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培 地 〔 ヴ ィ ロ ロ ジ ー （ Virology） ， ８ 巻 ， ３ ９ ６ (１ ９ ５ ９ )〕 ， Ｒ ＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーシ ョ ン （ The Journal of the American Medical Association） １ ９ ９ 巻 ， ５ １ ９ (１ ９ ６ ７ )〕 ， １ ９ ９ 培 地 〔 プ ロ シ ー ジ ン グ ・ オ ブ ・ ザ ・ ソ サ イ エ テ ィ ・ フ ォ ー ・ ザ ・ バ イ 50 (19) JP 2005-80524 A 2005.3.31 オ ロ ジ カ ル ・ メ デ ィ ス ン （ Proceeding of the Society for the Biological Medi cine） ， ７ ３ 巻 ， １ (１ ９ ５ ０ )〕 な ど を 用 い る 。 ｐ Ｈ は 約 ６ ∼ ８ で あ る の が 好 ま し い 。 培 養は通常約３０℃∼４０℃で約１５∼６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える 。このようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明のポリペプチドを産 生させることができる。 【００７６】 上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、常法に従う。例えば、本発 明のポリペプチドを培養菌体、細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体又 は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解な どによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽 10 出液を得る方法などである。該緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤や、トリ ト ン Ｘ − １ ０ ０ TMな ど の 界 面 活 性 剤 が 含 ま れ て い て も よ い 。 培 養 液 中 に ポ リ ペ プ チ ド が 分 泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体又は細胞と上清とを分離し、上清を集 める。このようにして得られた培養上清、又は抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は 、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なう。これらの公知の分離・精製法としては 、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及 びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法 、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマ トグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなど の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが 20 ある。 【００７７】 該ポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法よって塩に変換することがで き、逆に塩で得られた場合には公知の方法により、遊離体または他の塩に変換することが できる。なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前又は精製後に適当なタンパク 修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去 することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、 アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどがある。この ようにして生成した本発明のポリペプチドは、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセ イやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。 30 【実施例１】 【００７８】 前立腺癌細胞株からのポリペプチド試料の抽出 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)か ら 入 手 し た 、 ヒ ト 前 立 腺 癌 細 胞 株 LNCaPを 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を 検 索 す る サ ン プ リ ン グ と し て 使 用 し た 。 LNCaP細 胞 を 、 ウ シ 胎 仔 血 清 10％ を 含 有 す る RPMI倍 地 (Roswell Park Memor ial Institute medium: RPMI)中 で 、 CO2 ５ %湿 潤 環 境 下 、 ３ ７ ℃ で 培 養 し た 。 ま た 、 本 実 施 例 で は 、 LNCaP細 胞 を 日 本 SLC（ 静 岡 、 日 本 ） か ら 購 入 し た オ ス ヌ ー ド マ ウ ス (BALB/ c strain)に 移 植 し た 。 【００７９】 40 7 ま ず 、 LNCaP細 胞 1x10 個 を マ ト リ ゲ ル 0.1 ml (Matrigel: Becton Dickinson Labw are, NJ, USA) に 混 入 し 、 該 混 合 物 を 雄 ヌ ー ド マ ウ ス の 背 部 皮 下 に 移 植 し た 。 癌 組 織 3 が 100か ら 200 mm に な っ た と こ ろ で 、 精 巣 を 摘 除 し た 。 癌 組 織 は 一 次 的 に 縮 小 し た が 、 3 ま も な く 再 増 殖 を 始 め た 。 該 癌 が 200か ら 400 mm に 達 し た と こ ろ で 摘 出 し た 。 精 巣 摘 除 前 に 採 取 し た 癌 を ア ン ド ロ ゲ ン 依 存 性 (Androgen Dependent; AD)、 精 巣 摘 除 後 に 再 増 殖 し た 癌 を ア ン ド ロ ゲ ン 非 依 存 性 (Androgen Independent; AI) と し た 。 【実施例２】 【００８０】 癌マーカポリペプチド分布マップの作製 実施例１で得た癌細胞を２０倍重量のタンパク抽出液でホモジュナイズし、超遠心した 50 (20) JP 2005-80524 A 2005.3.31 後、得られた上清をプロテオーム解析に使用した。本発明者らは、該プロテオーム解析を ア ガ ロ ー ス 二 次 元 電 気 泳 動 法 に タ ン デ ム 質 量 分 析 法 (MS/MS)を 組 み 合 わ せ て 実 施 し た 。 【００８１】 アガロース二次元電気泳動法は、一次元目の等電点電気泳動にアガロースを適用した公 知 の 方 法 に よ っ て 行 っ た (2)。 す な わ ち 、 前 記 抽 出 液 100μ l（ タ ン パ ク 質 １ mgに 相 当 ） を 直 径 3.4 mm、 長 さ 180 mmの ア ガ ロ ー ス ゲ ル 上 端 に 置 き 、 700 vの 電 荷 を 20時 間 か け た 。 そ の 後 、 こ の ゲ ル を 195× 120 mmの SDS-PAGEゲ ル (12%均 一 ゲ ル と 6-10%濃 度 勾 配 ゲ ル )の 上 に 置 き 、 SDSサ ン プ ル バ ッ フ ァ ー (SDS2%、 グ リ セ ロ ー ル 10%、 2-メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 5%、 ブ ロ モ フ ェ ニ ル ブ ル ー 0.02%、 0.05Mト リ ス -HCl, pH 6.5) を 上 部 か ら 流 し て 、 60 mAで 泳 動 し た 。 泳 動 終 了 後 、 ゲ ル を ク ー マ ジ ー ブ リ リ ア ン ト ブ ル ー R-350 (Coomasie 10 Brilliant Blue R-350)で 染 色 し た 。 【００８２】 前 立 腺 癌 の ア ガ ロ ー ス 二 次 元 電 気 泳 動 ゲ ル 上 の 合 計 324個 の タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト の 同 定 を 進 め 、 ゲ ル 間 で 重 複 し て い る ス ポ ッ ト を 除 い て 303個 の ス ポ ッ ト に 番 号 を つ け て 二 次 元 電 気 泳 動 ゲ ル マ ッ プ を 作 成 し た 。 高 分 子 タ ン パ ク 質 領 域 に 重 点 を お い た 6-10%濃 度 勾 配 ゲ ル か ら 108個 （ 図 １ ） 、 中 低 分 子 タ ン パ ク 質 領 域 に 重 点 を 置 い た 12%均 一 ゲ ル か ら 195個 （ 図 ２ ） の ス ポ ッ ト に 番 号 を 付 し た 。 そ の 後 、 こ れ ら ス ポ ッ ト か ら 、 合 計 233個 の タ ン パ ク 質を同定することができた。 【００８３】 なお、図１及び２は、実施例１のアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞に由来する、癌マ 20 ーカポリペプチドの分布を示すマップである。また、得られた二次元電気泳動ゲルは乾燥 後 、 画 像 フ ァ イ ル と し て コ ン ピ ュ ー タ に 取 り 込 み 、 画 像 解 析 ソ フ ト ウ エ ア (Phoretix 2D Advanced Version 5.01 : Nonlinear Dynamics Ltd, UK)を 用 い て タ ン パ ク 質 ス ポットの定量解析を行った。 【実施例３】 【００８４】 実施例２で得られた二次元電気泳動ゲルのスポットを、公知の液体クロマトグラム−タ ン デ ム 質 量 分 析 法 (LC-MS/MS)に よ っ て 同 定 し た 。 す な わ ち 、 ゲ ル 上 の ス ポ ッ ト を 切 り 出 し 、 タ ン パ ク 質 を ト リ プ シ ン で ゲ ル 内 消 化 し た の ち に 約 １ ５ pmolに 相 当 す る 量 を LC-MS/MSに か け た 。 こ こ か ら 得 ら れ た ペ プ チ ド 断 片 の 質 量 情 報 を 解 析 ソ フ ト ウ エ ア (SEQUEST)を 用 い 30 て 解 析 し 、 米 国 NCBIの デ ー タ ベ ー ス に よ り 前 記 ゲ ル 上 の ス ポ ッ ト に 含 ま れ る タ ン パ ク 質 を 同 定 し た 。 タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 と 塩 基 配 列 も NCBIデ ー タ ベ ー ス に よ っ た 。 な お 、 ２ ０ ０ ３ 年 ９ 月 １ 日 現 在 、 下 記 Ｕ Ｒ Ｌ で プ ロ テ オ ー ム 解 析 ソ フ ト ウ エ ア (SEQUEST)を 入 手 す ることができる。 【００８５】 URL: http://fields.scripps.edu/sequest/index.html ま た NCBIデ ー タ ベ ー ス の URLは 次 の と お り で あ る 。 URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi/ 前 記 NCBIデ ー タ ベ ー ス で 同 定 し た 全 タ ン パ ク 質 233個 を MedLineを 用 い て 検 索 し た と こ ろ 、 こ れ ま で 前 立 腺 癌 と の 関 連 性 が 報 告 さ れ て い な い タ ン パ ク 質 35個 が 含 ま れ て お り 、 す な 40 わち、新たな前立腺癌マーカポリペプチドが見出された。 【００８６】 ここで同定されたタンパク質は、本明細書の実施の態様の項に列挙されている。それぞ れのタンパク質に付された番号は、本明細書に添付された配列表のアミノ酸配列番号と一 致している。 【実施例４】 【００８７】 アンドロゲン非依存性前立腺癌マーカポリペプチドの選別 二次元電気泳動ゲルは乾燥後に画像ファイルとしてコンピュータに取り込み、画像解析 ソ フ ト ウ エ ア Phoretix 2D Advanced Version 5.01 (Nonlinear Dynamics Ltd, U 50 (21) JP 2005-80524 A 2005.3.31 K)を 用 い て タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト の 定 量 解 析 を 行 っ た 。 ア ン ド ロ ゲ ン 依 存 群 ５ 検 体 と 非 依 存 群 5検 体 の 二 次 元 電 気 泳 動 ゲ ル の タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト を 個 別 に Phoretix 2D Advanced V ersion 5.01で 定 量 比 較 し 、 ２ 群 間 に お け る 各 ス ポ ッ ト の 発 現 量 を Ｔ 検 定 に よ っ て 統 計 学 的に検定した。 【００８８】 アンドロゲン依存群と非依存群とでタンパク質の発現を統計学的に比較検討したところ 、 実 施 例 ３ で 見 出 さ れ た 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド の う ち 、 p＜ 0.1に お い て 非 依 存 群 で 増 加 し た タ ン パ ク 質 が 12個 、 減 少 し た タ ン パ ク 質 が 6個 認 め ら れ た 。 同 様 に 、 p＜ 0.05で は 、 増 加 し た タ ン パ ク 質 が ７ 個 、 減 少 し た タ ン パ ク 質 が 4個 認 め ら れ た 。 【００８９】 10 図 ３ に 、 前 立 腺 癌 の ア ン ド ロ ゲ ン 非 依 存 性 獲 得 に 伴 い 統 計 学 的 有 意 差 (p＜ 0.05) を も って量的増減を示したタンパク質スポットと、その定量比較グラフを示した。図３におい て 、 ADは ア ン ド ロ ゲ ン 依 存 群 を 、 AIは ア ン ド ロ ゲ ン 非 依 存 群 を PNは 、 図 １ 及 び ２ に お け る タ ン パ ク 質 ス ポ ッ ト 特 定 番 号 （ Protein-identification number） を 示 す 。 な お 、 該 PNは 実施例で用いるタンパク質スポットの固有番号であり、本明細書の配列表の配列番号とは 一致していない。 【００９０】 また、肉眼的に各群のゲルで増減のみられたポリペプチドも含めて文献的に検討したと こ ろ 、 従 来 、 前 立 腺 癌 と の 関 連 が 報 告 さ れ て い な い も の は 1７ 個 あ っ た （ 図 ３ ） 。 こ れ ら は、配列表に記載されている配列番号１８∼３６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドで 20 ある。これらポリペプチドの電気泳動像を解析の結果、配列番号１８∼２８のアミノ酸配 列を含むポリペプチドは、前立腺癌がアンドロゲン非依存性を獲得した場合に発現量が増 加し、配列番号２９∼３６のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、発現量が減少すること が明らかになった。 【実施例５】 【００９１】 ヒト前立腺癌における前立腺癌マーカポリペプチドの発現 ヒト前立腺癌における、前記前立腺癌マーカポリペプチドの発現を、抗体を用いたウエ スタンブロットにより確認した。 （ヒト前立腺癌サンプルの調製） 30 本実施例で用いたヒトの前立腺癌組織、及び正常前立腺組織は、神奈川県相模原市にあ る北里大学病院泌尿器科で手術を受けた患者から同意を得て採取した。患者の詳細は以下 のとおりである。 【００９２】 １ ． Ｎ Ｐ １ ： 正 常 前 立 腺 組 織 ： 51歳 男 性 、 膀 胱 癌 に て 合 併 摘 除 さ れ た 前 立 腺 か ら 正 常 前 立 腺組織を採取した。 ２ ． Ｐ ８ ： 正 常 前 立 腺 組 織 ： 70歳 男 性 、 前 立 腺 癌 に て 前 立 腺 全 摘 除 術 を 施 行 さ れ た 。 非 癌 部位から正常前立腺組織を採取した。 ３．Ｐ３：正常前立腺組織：６０歳男性、膀胱癌にて合併摘除された前立腺から正常前立 腺組織を採取した。 40 ４．Ｐ５：前立腺癌組織（アンドロゲン依存性）：５０歳男性、前立腺癌にて前立腺全摘 除術を施行された。肉眼的に癌部位から前立腺癌組織を採取した。 ５．Ｐ１：前立腺癌組織（アンドロゲン非依存性）：８０歳男性、前立腺癌にてアンドロ ゲン除去療法を試行後に再発し、尿閉となったため、経尿道的前立腺切除術が施行された 。切除組織はアンドロゲン非依存性前立腺癌であり、これを採取した。 【００９３】 ６．ＣａＰ５：前立腺癌組織（アンドロゲン非依存性）：６４歳男性、前立腺癌のため、 6ヶ 月 間 の 術 前 ア ン ド ロ ゲ ン 除 去 療 法 を 施 行 後 に 前 立 腺 全 摘 除 術 を 施 行 さ れ た 。 肉 眼 的 に 癌部位から前立腺癌組織を採取した。 得 ら れ た 癌 組 織 を 20倍 重 量 の タ ン パ ク 抽 出 液 で ホ モ ジ ュ ナ イ ズ し 、 超 遠 心 後 の 上 清 を 用 50 (22) JP 2005-80524 A 2005.3.31 いて検討を行った。 ま ず 、 LNCaPマ ウ ス 接 種 モ デ ル の 癌 抽 出 液 と 前 記 ヒ ト 前 立 腺 組 織 抽 出 液 の タ ン パ ク 質 濃 度 を 公 知 の Bradford法 で 定 量 し 、 SDSサ ン プ ル バ ッ フ ァ ー (SDS2%、 グ リ セ ロ ー ル 10%、 2メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 5%、 ブ ロ モ フ ェ ニ ル ブ ル ー 0.02%、 0.05Mト リ ス -HCl、 pH 6.5)で 希 釈 し て 2 mg/mlに 調 製 し た 。 こ れ を 97℃ で 15分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し て サ ン プ ル を 調 製 し た 。 【００９４】 該 サ ン プ ル を 各 10μ lず つ 12.5% SDS-PAGEゲ ル で 電 気 泳 動 し た 。 こ の ゲ ル の タ ン パ ク 質 を PVDF膜 上 に 転 写 し た 。 こ れ を 3％ ゼ ラ チ ン 溶 液 で ブ ロ ッ キ ン グ し て 、 当 該 タ ン パ ク 質 の 一次抗体溶液で反応させ、アルカリフォスファターゼ標識の二次抗体を反応させた。 10 （前立腺癌マーカポリペプチドと抗体） 使用した一次抗体は下記のとおりである。 配 列 番 号 ３ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Rad50)： 市 販 の 抗 ヒ ト R AD50ウ サ ギ ポ リ ク ロ ー ン 性 抗 体 （ AB3754, Chemicon International, Inc., CA, USA ） 配 列 番 号 １ １ .の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Mop-4)： 市 販 の 抗 ヒ ト MOP4ウ サ ギ ポ リ ク ロ ー ン 性 抗 体 （ AB5442P, Chemicon International, Inc., CA, USA） 配 列 番 号 １ ４ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (VDAC-1)： 市 販 の 抗 ヒ ト VDAC-1ヤ ギ ポ リ ク ロ ー ン 性 抗 体 （ sc-8828, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA 20 , USA） 配 列 番 号 １ ９ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (LON protease)： 配 列番号１９のアミノ酸配列のポリペプチド断片（配列番号７１）を合成し、キャリアタン パク質と組み合わせてウサギの皮下に８回接種後、血清を採取し、該血清を一次抗体とし て使用した。 【００９５】 ポ リ ペ プ チ ド 断 片 CFDIAFPDEQAEALAVER （ 配 列 番 号 ： ７ １ ） 配 列 番 号 ２ １ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (EBNA-2 co-activato r; p100)： 配 列 番 号 ２ １ の ア ミ ノ 酸 配 列 の ポ リ ペ プ チ ド 断 片 （ 配 列 番 号 ７ ２ ） を 合 成 し 、キャリアタンパク質と組み合わせてウサギの皮下に８回接種後、血清を採取し、該血清 30 を一次抗体として使用した。 【００９６】 ポ リ ペ プ チ ド 断 片 RPASPATETVPAFSERTC （ 配 列 番 号 ： ７ ２ ） 配 列 番 号 ３ ０ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Scaffold attachmen t factor B, HSP27 ERE-TATA-binding protein)： 配 列 番 号 ３ ０ の ア ミ ノ 酸 配 列 の ポ リペプチド断片（配列番号７３）を合成し、キャリアタンパク質と組み合わせてウサギの 皮下に８回接種後、血清を採取し、該血清を一次抗体として使用した。 【００９７】 ポ リ ペ プ チ ド 断 片 CRMQAQWEREERERLEIAR （ 配 列 番 号 ： ７ ３ ） 配 列 番 号 ３ ３ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Ubiquitin-activatin 40 g enzyme E1)： 市 販 の 抗 ヒ ト Ubiquitin-activating enzyme E1マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ン 性 抗 体 (MAB3520, Chemicon International, Inc., CA, USA) 使用した二次抗体は下記とおりで、購入して使用した。 【００９８】 抗 マ ウ ス IgG（ ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 ） (115-055-003, Jackson ImmunoResea rch Laboratories, Inc., PA, USA) 抗 ウ サ ギ IgG（ ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 ） (172-1016, Bio-Rad Laboratories, CA, USA) 抗 ヤ ギ IgG（ ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 標 識 ） (AP-5000, Vector Laboratories, Inc ., CA, USA) 50 (23) JP 2005-80524 A 2005.3.31 （結果） 配 列 番 号 ３ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Rad50)の 抗 体 に よ る 検 出結果： Rad50は 正 常 前 立 腺 組 織 で 強 い 発 現 が 認 め ら れ る が 、 前 立 腺 癌 組 織 で は 発 現 が 減 少 し て いた（図４）。 【００９９】 配 列 番 号 １ １ .の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Mop-4)の 抗 体 に よ る 検出結果： Mop-4は 正 常 前 立 腺 組 織 で 強 い 発 現 が 認 め ら れ る が 、 前 立 腺 癌 組 織 で は 発 現 が 減 少 し て いた（図５）。 10 配 列 番 号 １ ４ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (VDAC-1)の 抗 体 に よ る 検出結果： VDAC-1は 正 常 前 立 腺 組 織 で 発 現 が 少 な く 、 前 立 腺 癌 組 織 で は 発 現 が 増 加 し て い た （ 図 ６ ）。 【０１００】 配 列 番 号 １ ９ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (LON protease)の 抗 体による検出結果： LON proteaseは 正 常 前 立 腺 組 織 で 発 現 が 少 な く 、 前 立 腺 癌 組 織 で は 発 現 が 増 加 し て い た。さらに、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が増加していた（図７）。 配 列 番 号 ２ １ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (EBNA-2 co-activato 20 r; p100)の 抗 体 に よ る 検 出 結 果 ： EBNA-2 co-activator; p100は 正 常 前 立 腺 組 織 で 強 い 発 現 が 認 め ら れ る が 、 前 立 腺 癌 組織では発現が減少していた。また、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が増加 していた（図８）。 【０１０１】 配 列 番 号 ３ ０ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Scaffold attachment factor B, HSP27 ERE-TATA-binding protein)の 抗 体 に よ る 検 出 結 果 ： 該マーカポリペプチドは、正常前立腺組織で発現が少なく、前立腺癌組織では発現が増 加していた。また、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が減少していた（図９） 。 30 【０１０２】 配 列 番 号 ３ ３ の ア ミ ノ 酸 配 列 を 含 む 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド (Ubiquitin-activatin g enzyme E1)の 抗 体 に よ る 検 出 結 果 ： Ubiquitin-activating enzyme E1は 正 常 前 立 腺 組 織 で 発 現 が 少 な く 、 前 立 腺 癌 組 織 で は発現が増加していた。また、アンドロゲン依存群に比べて非依存群で発現が減少してい た（図１０）。 【実施例６】 【０１０３】 逆 転 写 ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 (RT-PCR)に よ る 分 析 アンドロゲン依存性、及びアンドロゲン非依存性のヒト前立腺癌における、前立腺癌マ 40 ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る 、 配 列 番 号 ５ ３ か ら ７ ０ の mRNA発 現 レ ベ ル を 、 RT-PCを 用 いて次のように分析することができる。 ま ず 、 前 立 腺 組 織 中 の mRNAの 抽 出 を 、 ISOGEN RNA 分 離 キ ッ ト (ISOGEN RNA isolation kit, ISOGEN社 )を 用 い て 製 造 業 者 の 仕 様 書 に そ っ て 行 な う 。 RT-PCRは 、 タ カ ラ RNA LA PCR キ ッ ト Ver. 1.1(Takara RNA LA PCR kit Ver. 1.1,タ カ ラ 酒 造 、 大 津 )を 用 い て 公 知 の 方 法 に 拠 っ て 行 な う (6)。 【０１０４】 す な わ ち 、 第 １ 鎖 cDNAは 総 RNA (1.5μ g)を テ ン プ レ ー ト と し て 合 成 す る 。 ラ ン ダ ム ヘ キ サ マ ー (Random hexamer, 50 pM)を 5 mM MgCl2 , 1 x RNA PCR 緩 衝 液 , 10 mM dNTP mix, 20 U リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ 阻 害 剤 を 含 む 反 応 液 で 30℃ 10分 、 55℃ 15分 50 (24) JP 2005-80524 A 2005.3.31 、 99℃ 5分 間 、 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 蒸 留 水 で 40μ lに な る よ う 希 釈 し た 後 、 そ の う ち の 5 μ lに 2.5 U Tag ポ リ メ ラ ー ゼ (タ カ ラ 酒 造 )， 1.5 mM MgCl2 , 1 x RNA PCR 緩 衝 液 , 10 mM dNTP mix, そ し て 、 フ ォ ワ ー ド プ ラ イ マ ー 及 び リ バ ー ス プ ラ イ マ ー そ れ ぞ れ 20 pMを 加 え 、 DNA サ ー マ ル サ イ ク ラ ー (ASTEC、 福 岡 )を 用 い て 35サ イ ク ル 増 幅 す る 。 PCR産 物 を 3%ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に よ っ て 分 析 す る 。 こ の 分 析 の た め に 用 い る プ ライマー／プローブのセットの最適な配列を、コンピュータによって決定する。 【０１０５】 本明細書の配列表の配列番号は、以下に説明する配列を示す。なお、配列番号１∼３５ のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、これまで前立腺癌との関係が知られておらず、 本発明者らにより初めて前立腺癌との関係が知られたものである。また、配列番号３６∼ 10 ７０のポリヌクレオチドは、配列番号１∼３５のいずれか１のポリペプチドをコードする mRNA 又 は DNAで あ る 。 ま た 、 下 記 説 明 に お け る 略 号 「 NCBI」 は 、 デ ー タ ベ ー ス Nationa l Center for Biotechnology Information を 意 味 し 、 「 PN」 は 、 図 １ 及 び ２ の 電 気 泳動像におけるスポットの番号を意味する。 【０１０６】 （配列番号：１） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 KIAA0336遺 伝 子 産 物 の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 遺 伝 子 産 物 は 、 脳 cDNAラ イ ブ ラ リ ー に見られ、モチーフデータベースから、シグナル伝達、核酸調節、細胞骨核に関与するこ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.7662062, PN:029 （配列番号：２） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 20 は 、 TAR RNA-相 互 作 用 タ ン パ ク 質 （ TRIP TAR RNA-interacting protein, TRIP） 又 は TRIPポ リ ペ プ チ ド と 考 え ら れ て い る 遺 伝 子 産 物 の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 胎 児 心 で mRNA が 高 発 現 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 Reed (1998)に よ り 卵 巣 癌 cDNAラ イ ブ ラ リ ー か ら 分 離 さ れ 、 MSで 83kDだ が SDS-PAGEで は 160kDな の で ， ダ イ マ ー 形 成 し て い る と 考 え ら れ て い る (Wilson, 1998)。 NCBI Accession No.4758690, PN:041 （配列番号：３） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 RAD50 ホ モ ロ グ （ RAD50 homolog: S.cerevisiae） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 ホ モ ロ グ が ア デ ノ ウ イ ル ス の 腫 瘍 性 タ ン パ ク 質 (oncoprotein)と RAD50-MRE11-NBS1複 合 体 を 不活化させて発癌性を発揮することが報告されている。 NCBI Accession No.19924129, PN:045 30 【０１０７】 （配列番号：４） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 仮 想 ポ リ ペ プ チ ド FLJ10839の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 SAPモ チ ー フ が あ る た め ， DNA結 合部位を有すると思われるが、これまで機能は不明であった。 NCBI Accession No.20471264, PN:049 （配列番号：５） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 富 ロ イ シ ン PPR-モ チ ー フ 包 含 （ Leucine-rich PPR-motif containing） 遺 伝 子 産 物 の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 遺 伝 子 産 物 は 、 肝 臓 芽 腫 の cDNAで 高 発 現 し 、 そ の ア ミ ノ 酸 配 列から機能推定により、細胞骨格，細胞内輸送，転写，核細胞質閉鎖に関与していると考 えられている。 40 NCBI Accession No.18959202, PN:054 【０１０８】 （配列番号：６） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 RNA ヘ リ カ ー ゼ KIAA0801 （ RNA helicase KIAA0801） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 NCBI Accession No.7662318, PN:057.2 （配列番号：７） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 ユ ビ キ チ ン 特 異 性 プ ロ テ ア ー ゼ 7 （ Ubiquitin specific protease 7） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 プ ロ テ ア ー ゼ ７ は 、 P53遺 伝 子 を 安 定 化 さ せ て p53を 介 す る 成 長 阻 害 やアポトーシスを補助する癌抑制タンパクであると報告されている。 NCBI Accession No.4507857, PN:058 50 (25) JP 2005-80524 A 2005.3.31 【０１０９】 （配列番号：８） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 カ ル シ ウ ム (ca2+)恒 常 性 内 部 原 形 質 網 状 質 タ ン パ ク 質 （ Calcium (ca2+) homeostas is endoplasmic reticulum protein） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は 、 脳 c DNAラ イ ブ ラ リ ー 、 又 は ヒ ト 赤 白 血 病 (HEL)細 胞 cDNA発 現 ラ イ ブ ラ リ ー か ら 発 現 が 確 認 さ れ 、 Ca2+の 恒 常 性 に 働 き 、 分 化 成 長 に 関 係 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.18204653, PN:061 【０１１０】 （配列番号：９） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配列 は 、 MGC21133タ ン パ ク 質 （ Nucleoporin 133kDa, Protein for MGC21133） の ア ミ ノ 酸 10 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は 、 メ ラ ノ ー マ 細 胞 で 発 現 し 、 mRNAの 核 外 輸 送 を 担 っ て い る と い う 報 告 が あ る 。 NCBI Accession No.18043079, PN:065 （配列番号：１０） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 RNA ヘ リ カ ー ゼ 関 連 タ ン パ ク 質 （ RNA helicase-related protein） 又 は そ の 関 連ポリペプチドと考えられる遺伝子産物のアミノ酸配列でもある。該遺伝子産物は、ヒト 膵 島 cDNAラ イ ブ ラ リ ー で 確 認 さ れ 、 デ ッ ド ボ ッ ク ス ポ リ ペ プ チ ド フ ァ ミ リ ー (DEAD box protein family)と 考 え ら れ て い る 。 NCBI Accession No.11267525, PN:069 【０１１１】 （配列番号：１１） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 MOP-4の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 MOP-4は 、 ヒ ト 単 球 に 発 現 し 、 ユ ビ キ チ ン − プ ロ 20 テ ア ソ ー ム 系 で の タ ン パ ク 分 解 の 第 1段 階 で ユ ビ キ チ ン と 結 合 、 カ ス ケ ー ド を 開 始 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.11990422, PN:070 （配列番号：１２） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 イ ン ス リ ン 減 成 酵 素 （ Insulin-degrading enzyme） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 酵素は、インスリン、グルカゴン、及びβアミロイドを分解する活性を有する。アルツハ イマー病では、βアミロイドの脳背髄液中への産生量に変化がないにもかかわらず、βア ミロイドが脳に沈着するので、該酵素の減少が原因といわれている。 NCBI Accession No.20548083, PN:091 【０１１２】 （配列番号：１３） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 30 列 は 、 Ｍ Ｃ Ｍ ５ ミ ニ ク ロ モ ソ ー ム 維 持 欠 陥 ５ ， 細 胞 分 画 サ イ ク ル ４ ６ （ MCM5 minichromo some maintenance deficient 5, cell division cycle 46 (S. cerevisiae))遺 伝 子 産 物 の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 遺 伝 子 産 物 は 、 Burkitリ ン パ 腫 で 発 現 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.13177775, PN:0102 （配列番号：１４） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 電 圧 依 存 性 ア ニ オ ン 選 択 チ ャ ン ネ ル タ ン パ ク 質 1 (Voltage-dependent anion-s elective channel protein 1 (VDAC-1)） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は B CL-2フ ァ ミ リ ー の ア ポ ト ー シ ス 調 節 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.130683, PN:231 【０１１３】 40 （配列番号：１５） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 プ ロ ヒ ビ チ ン （ Prohibitin） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 プ ロ ヒ ビ チ ン は 、 DNA合 成 阻 害 、 及 び PHBの 変 異 に よ り 乳 癌 発 症 に 関 与 す る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.464371, PN:244.2 （配列番号：１６） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 ニ プ ス ナ ッ プ １ タ ン パ ク 質 (NipSnap1 protein)の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は 、 C.エ レ ガ ン ス (C.elegance)染 色 体 IIIの 遺 伝 子 産 物 に 類 似 し 、 細 胞 内 顆 粒 移 動 に 関 係 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.17380144, PN:258 （配列番号：１７） 本発明の前立腺癌マーカポリペプチドのアミノ酸配列を示す。該配 列 は 、 ペ ロ キ シ レ ド キ シ ン 4 （ Peroxiredoxin 4） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン 50 (26) JP 2005-80524 A 2005.3.31 パク質は、サイトカインや免疫系の転写に関与していることが報告されている。 NCBI Accession No.3024727, PN:259 【０１１４】 （配列番号：１８） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、スプライシングコア ク チ ベ ー タ サ ブ ユ ニ ッ ト SRm300 （ Splicing coactivator subunit SRm300） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 サ ブ ユ ニ ッ ト SRm300は 、 RNA結 合 性 ポ リ ペ プ チ ド 及 び AT-富 要 素 結 合 因 子 な ど と し て 知 ら れ て い る 。 SRM160及 び 前 駆 mmrと 会 合 し て 、 核 ス ペ ッ ク ル 内 に 存 在 し 、 SRM160/SRM300デ プ リ ー ト ス プ ラ イ シ ン 反 応 の 再 構 成 に 関 与 す る こ と が 報 10 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.19923466, PN:002 （配列番号：１９） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン 非依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロ ゲン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ロンプロテアーゼ ホ モ ロ グ （ Lon protease homolog） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 ホ モ ロ グ は 、 DNA損 傷 時 に SOS遺 伝 子 群 が 誘 導 さ れ 、 そ の 修 復 に 働 く こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.12644239, PN:092.2 【０１１５】 （配列番号：２０） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ 20 ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ピュロマイシン感受 性 ア ミ ノ ペ プ チ ダ ー ゼ （ Puromycin-sensitive aminopeptidase） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る。該ペプチダーゼは神経ペプチドの活性化、細胞増殖と多様性に必要なプロテアーゼで あ り 、 胎 児 脳 の cDNAラ イ ブ ラ リ ー か ら 同 定 さ れ 、 か つ 白 血 病 細 胞 で ビ タ ミ ン Dで 刺 激 す る と 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.2499902, PN:099 （配列番号：２１） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン 非 依 存 性 を 獲 得 す る と 、 該 癌 マ ー カ の 発 現 は 上 昇 す る 。 該 配 列 は 、 EBNA-2 コ ア ク チ ベ ー タ （ EBNA-2 co-activator (100kD)） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 EBNA-2 コ ア ク チ ベ ー タ は 、 特 定 遺 伝 子 の 翻 訳 を 活 性 化 し 、 か つ EBV関 連 の B細 胞 の 転 写 に 必 須 で あ り 、 さ ら に 30 ショウジョウバエのメラニン合成に関与することが報告されている。 NCBI Accession No.7657431, PN:116, 088 【０１１６】 （配列番号：２２） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、異種核酸リボ核ポリ ペ プ チ ド Ｄ 様 ホ モ ロ グ (JKTBP)の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 ホ モ ロ グ に つ い て 、 RNAの ス プ ライシングと移動に関与することが報告されている。 NCBI Accession Nos.7446333, 4512253, PN:223 【０１１７】 40 （配列番号：２３） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン 非 依 存 性 を 獲 得 す る と 、 該 癌 マ ー カ の 発 現 は 上 昇 す る 。 該 配 列 は 、 GTP-結 合 性 タ ン パ ク 質 ベ ー タ 鎖 ホ モ ロ グ （ GTP-binding protein beta chain homolog） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 ホ モ ロ グ は 、 GTP-結 合 性 ポ リ ペ プ チ ド β 鎖 ホ モ ロ グ 、 HMC B複 合 ポ リ ペ プ チ ド 12.3な ど と し て 知 ら れ 、 リ ン パ 球 活 性 化 機 能 、 イ ン ス リ ン 様 生 育 因 子 (IGF-1)で あ る ラ ッ ト RACK1 (Rn.2568)の レ セ プ タ ー と 類 似 す る こ と な ど が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.5174447, PN:233, 237 【０１１８】 （配列番号：２４） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 50 (27) JP 2005-80524 A 2005.3.31 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、核・塩素イオンチャ ン ネ ル タ ン パ ク 質 （ Nuclear chloride ion channel protein） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 NCBI Accession No.2073569, PN:243 （配列番号：２５） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ウィリアム−ベウレ ン 症 候 群 染 色 体 領 域 １ ホ モ ロ グ （ William-Beuren syndrome chromosome region 1 h omolog） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 ホ モ ロ グ は 、 Wbscr1 代 用 ス プ ラ イ ス 産 物 、 及 び William-Beuren症 候 群 染 色 体 領 域 1ホ モ ロ グ 等 と し て 知 ら れ 、 mRNA利 用 の レ ベ ル で ポ リ 10 ペプチド合成の開始を刺激する機能が報告されている。 NCBI Accession No.18204592, PN:251 【０１１９】 （配列番号：２６） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、抗酸化性タンパク質 2 （ Antioxidant protein 2 ） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は 、 細 胞 の レドックス制御に関連し、過酸化水素を減らし、短鎖有機脂肪酸及びリン脂質過酸化物を 減らし、リン脂質の代謝制御及び酸化障害に対する防御における役割が報告されている。 NCBI Accession Nos.1718024, 4758638, PN:266 20 （配列番号：２７） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、ペルオキシレドクシ ン 1 （ Peroxiredoxin 1） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 ペ ル オ キ シ レ ド ク シ ン 1は 、 細 胞 内 の 過 酸 化 水 素 を 調 節 す る こ と で 生 育 因 子 と TNFα の シ グ ナ ル 伝 達 を コ ン ト ロ ー ル し て おり、酸化ストレス下に出現するということが報告されている。 NCBI Accession No.548453, PN:284 【０１２０】 （配列番号：２８） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ 30 ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は上昇する。該配列は、コフィリン非筋肉ア イ ソ フ ォ ー ム (Cofilin, non-muscle isoform )(18 kDa リ ン ポ リ ペ プ チ ド )１ の ア ミ ノ酸配列でもある。該アイソフォームは、アクチンと結合し、その細胞質から核への移動 を 助 け 、 LIM-キ ナ ー ゼ に よ り リ ン 酸 化 さ れ た 際 、 ア ク チ ン を 脱 重 合 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.116848, PN:297 （配列番号：２９） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、クルッペルタイプ亜 鉛 フ ィ ン ガ ー タ ン パ ク 質 （ Kruppel-type zinc finger protein, PEG3） の ア ミ ノ 酸 配 列でもある。該タンパク質は、成人脳で高発現し、グリオーマ細胞にトランスフェクショ 40 ンさせると癌原性消失するので腫瘍抑制ポリペプチドと考えられている。 NCBI Accession No.11494024, PN:028 【０１２１】 （配列番号：３０） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、スカフフォルドアッ タ ッ チ メ ン ト 因 子 B、 又 は HSP27 ERE-TATA-結 合 性 タ ン パ ク 質 （ Scaffold attachment f actor B, HSP27 ERE-TATA-binding protein） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は 、 HSP27プ ロ モ ー タ ー 結 合 タ ン パ ク で ， 各 種 乳 癌 の 細 胞 ラ イ ン の 核 内 で 発 現 し 、 乳 癌 の 原 因 遺 伝 子 候 補 と 考 え ら れ て い る 。 NCBI Accession No.21264343, PN:043 50 (28) JP 2005-80524 A 2005.3.31 （配列番号：３１） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、スプライソゾーム関 連 タ ン パ ク 質 130（ Spliceosome-associated protein 130） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 タ ン パ ク 質 は 、 ス プ ラ イ シ ン グ 因 子 3b,サ ブ ユ ニ ッ ト 3(130kDa)及 び ス プ ラ イ セ オ ソ ー ム 会 合 ポ リ ペ プ チ ド 130な ど と し て 知 ら れ 、 ス プ ラ イ セ オ ソ ー ム に お い て 機 能 す る 複 合 体 SF3 bの 構 成 要 素 で あ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Accession No.11034823, PN:059 【０１２２】 （配列番号：３２） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 10 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、Ｔ細胞により認識さ れ る 扁 平 上 皮 癌 抗 原 ３ （ Squamous cell carcinoma antigen recognized by T cel ls 3, SART3） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 抗 原 は 、 腫 瘍 特 異 性 T細 胞 を 誘 導 し て 腫 瘍 免 疫 に 働 き 、 ま た ， mRNAス プ ラ イ シ ン グ に も 関 与 す る こ と 、 及 び 大 腸 癌 で 発 現 ， 正 常 組 織 で は発現していないことが報告されている。 NCBI Accession No.7661952, PN:062 【０１２３】 （配列番号：３３） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ 20 ン非依存性を獲得すると、該癌マーカの発現は低下する。該配列は、ユビキチン活性化酵 素 Ｅ １ （ Ubiquitin-activating enzyme E1） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 ユ ビ キ チ ン 活 性 化 酵 素 Ｅ １ は 、 ユ ビ キ チ ン − プ ロ テ ア ソ ー ム 系 で の タ ン パ ク 分 解 の 第 1段 階 で ユ ビ キ チ ン と結合、カスケードを開始させることが報告されている。 NCBI Accession No.4507763, PN:074.2, 078 【０１２４】 （配列番号：３４） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン 非 依 存 性 を 獲 得 す る と 、 該 癌 マ ー カ の 発 現 は 低 下 す る 。 該 配 列 は 、 カ リ オ フ ェ リ ン (kar yopherin)ベ ー タ １ 、 又 は イ ン ポ ル チ ン （ importin） ベ ー タ １ の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 30 該遺伝子産物は、核内シグナルをもつタンパクと結合して、このタンパクを細胞質から核 内 へ 輸 送 し 、 RANと 結 合 す る こ と に よ り 輸 送 は 終 了 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 NCBI Acc ession No.19923142, PN:103 （配列番号：３５） 本発明のアンドロゲン依存性前立腺癌マーカ、及びアンドロゲン非 依存性前立腺癌マーカとなるポリペプチドのアミノ酸配列である。前立腺癌がアンドロゲ ン 非 依 存 性 を 獲 得 す る と 、 該 癌 マ ー カ の 発 現 は 低 下 す る 。 該 配 列 は 、 ha1225 遺 伝 子 産 物 （ The ha1225 gene product） の ア ミ ノ 酸 配 列 で も あ る 。 該 遺 伝 子 産 物 は 、 ヒ ト α グ ル コシダーゼに関連することが報告されている。 NCBI Accession No.577295, PN:118 【０１２５】 40 （ 配 列 番 号 ： ３ ６ ） 配 列 番 号 １ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ３ ７ ） 配 列 番 号 ２ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ３ ８ ） 配 列 番 号 ３ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ３ ９ ） 配 列 番 号 ４ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ０ ） 配 列 番 号 ５ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 50 (29) JP 2005-80524 A 2005.3.31 【０１２６】 （ 配 列 番 号 ： ４ １ ） 配 列 番 号 ６ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ２ ） 配 列 番 号 ７ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ３ ） 配 列 番 号 ８ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ４ ） 配 列 番 号 ９ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ５ ） 配 列 番 号 １ ０ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 10 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 【０１２７】 （ 配 列 番 号 ： ４ ６ ） 配 列 番 号 １ １ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ７ ） 配 列 番 号 １ ２ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ８ ） 配 列 番 号 １ ３ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ４ ９ ） 配 列 番 号 １ ４ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 20 （ 配 列 番 号 ： ５ ０ ） 配 列 番 号 １ ５ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ５ １ ） 配 列 番 号 １ ６ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 【０１２８】 （ 配 列 番 号 ： ５ ２ ） 配 列 番 号 １ ７ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ５ ３ ） 配 列 番 号 １ ８ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ５ ４ ） 配 列 番 号 １ ９ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 30 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ５ ５ ） 配 列 番 号 ２ ０ の 前 立 腺 癌 マ ー カ す る mRNA又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列を示す。 （ 配 列 番 号 ： ５ ６ ） 配 列 番 号 ２ １ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ５ ７ ） 配 列 番 号 ２ ２ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 【０１２９】 （ 配 列 番 号 ： ５ ８ ） 配 列 番 号 ２ ３ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 40 （ 配 列 番 号 ： ５ ９ ） 配 列 番 号 ２ ４ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ０ ） 配 列 番 号 ２ ５ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ １ ） 配 列 番 号 ２ ６ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ２ ） 配 列 番 号 ２ ７ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 【０１３０】 （ 配 列 番 号 ： ６ ３ ） 配 列 番 号 ２ ８ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 50 (30) JP 2005-80524 A 2005.3.31 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ４ ） 配 列 番 号 ２ ９ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ５ ） 配 列 番 号 ３ ０ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ６ ） 配 列 番 号 ３ １ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ７ ） 配 列 番 号 ３ ２ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mmr 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ６ ８ ） 配 列 番 号 ３ ３ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 10 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 【０１３１】 （ 配 列 番 号 ： ６ ９ ） 配 列 番 号 ３ ４ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （ 配 列 番 号 ： ７ ０ ） 配 列 番 号 ３ ５ の 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る mRNA 又 は cDNAの ヌ ク レ オ チ ド 配 列 を 示 す 。 （配列番号：７１） 配列番号１９の前立腺癌マーカポリペプチドのポリペプチド断片の アミノ酸配列を示す。 （配列番号：７２） 配列番号２１の前立腺癌マーカポリペプチドのポリペプチド断片の アミノ酸配列を示す。 20 （配列番号：７３） 配列番号３０の前立腺癌マーカポリペプチドのポリペプチド断片の アミノ酸配列を示す。 【０１３２】 （参考文献） 1. Miyake H, Hara S, Arakawa S, Kamidono S, Hara I. Optimal timing and dosage of chemotherapy as a combined treatment with androgen withd rawal in the human prostate LNCaP tumour model. Br J Cancer. 2001, 8 4:859-63. 2. Oh-Ishi M, Satoh M, Maeda T. Electrophoresis. 2000 May; 21(9): 165 3-69 30 3. Klose J, Kobalz U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the gen ome. Electrophoresis 1995, 16: 1034-59 4. Wilm M, Shevchenko A, Houthaeve T, Breit S, Schweigerer L, Fotsis T, et al. Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. Nature 1996, 379: 466-9 5. Molecular Cloning, 2nd Ed,J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor L ab. Press, 1989) 6. Uchida T, Gao JP, Wang C et al. Mol Urol. 2001 Summer;5(2):71-8 【図面の簡単な説明】 40 【０１３３】 【 図 １ 】 図 １ は 、 高 分 子 タ ン パ ク 質 領 域 に 重 点 を お い た 6-10％ 濃 度 勾 配 ゲ ル の ア ガ ロ ー ス 2次 元 電 気 泳 動 に よ り 得 ら れ た 、 前 立 腺 癌 に 含 ま れ る タ ン パ ク 質 の 分 布 マ ッ プ を 示 す 。 【 図 ２ 】 図 ２ は 、 中 低 分 子 タ ン パ ク 質 領 域 に 重 点 を お い た 12％ 濃 度 均 一 ゲ ル の ア ガ ロ ー ス 2次 元 電 気 泳 動 に よ り 得 ら れ た 、 前 立 腺 癌 に 含 ま れ る タ ン パ ク 質 の 分 布 マ ッ プ を 示 す 。 【図３】図３は、アンドロゲン依存群、及びアンドロゲン非依存群において、量的増減を 示したタンパク質スポットと、その定量比較グラフを示す。 【 図 ４ 】 図 ４ は 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド で あ る Rad50の 前 立 腺 癌 組 織 に お け る 発 現 を示す電気泳動の像である。 【 図 ５ 】 図 ５ は 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド で あ る Mop-4の 前 立 腺 癌 組 織 に お け る 発 現 50 (31) JP 2005-80524 A 2005.3.31 を示す電気泳動の像である。 【 図 ６ 】 図 ６ は 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド で あ る VDAC-1の 前 立 腺 癌 組 織 に お け る 発 現 を示す電気泳動の像である。 【 図 ７ 】 図 ７ は 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド で あ る LON proteaseの 前 立 腺 癌 組 織 に お け る発現を示す電気泳動の像である。 【 図 ８ 】 図 ８ は 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド で あ る EBNA-2 co-activator; p100の 前 立腺癌組織における発現を示す電気泳動の像である。 【 図 ９ 】 図 ９ は 、 前 立 腺 癌 マ ー カ ポ リ ペ プ チ ド で あ る Scaffold attachment factor B, HSP27 ERE-TATA-binding proteinの 前 立 腺 癌 組 織 に お け る 発 現 を 示 す 電 気 泳 動 の 像 で ある。 【 図 １ ０ 】 図 １ ０ は 、 Ubiquitin-activating enzyme E1の 前 立 腺 癌 組 織 に お け る 発 現 を 示す電気泳動の像である。 10 (32) 【図１】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (33) 【図２】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (34) 【図３】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (35) 【図４】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (36) 【図５】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (37) 【図６】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (38) 【図７】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (39) 【図８】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (40) 【図９】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (41) 【図１０】 JP 2005-80524 A 2005.3.31 (42) 【配列表】 2005080524000001.app JP 2005-80524 A 2005.3.31 (43) JP 2005-80524 A 2005.3.31 フロントページの続き 7 (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード（参考） Ｃ０７Ｋ 16/32 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 16/32 Ｃ１２Ｑ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ (72)発明者 馬場 志郎 神奈川県横浜市神奈川区片倉町１１７番６２号 Ｆターム(参考) 4B024 AA01 AA12 BA45 CA04 CA09 CA12 EA04 GA11 HA14 4B063 QA18 QA19 QQ42 QQ53 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA14 4C085 AA13 AA14 BB31 CC21 DD22 EE01 4H045 AA11 BA10 CA41 DA76 DA86 EA28 EA51 FA71 FA72