海産生鮮魚介類を対象とした赤痢菌検査法の検討

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海産生鮮魚介類を対象 とした赤痢菌検査法の検討
九州大学 医療技術短期大学部
霜
鳥
翔
一
小
島
夫美 子
厚生省博多検疫所
東
島
弘
明
九州大学医学部細菌学教室
天
Key words :
児
和
(平成2年3月5日
受付)
(平成2年4月3日
受理)
Sihgella, Enrichment
要
Mehlmanら
の 考 案 に よ るShigella
暢
brothの
medium,
旨
改 良 法 お よ び そ の 培 養 法 を 用 い て ,人 為 的 に 赤 痢 菌 で 汚 染
した 生 ウ ニ 等 の生 鮮 魚 介 類 か ら菌 の 検 出 実 験 を 行 な っ た.用
少 数 生 菌 を 接 種 した ウ ニ か ら,こ
Seafoods
い た43株 の 赤 痢 菌 保 存 株 は,い
の 増 菌 法 に よ り容 易 に 検 出 で きた.す
な わ ち,24株(56%)は
10個 以 下 の 生 菌 を 接 種 した ウ ニか ら検 出 で き,ま た 他 の19株 も10∼1,000個
た.な
お,こ
の 増 菌 法 に よ る 魚 介 類 か ら の赤 痢 菌 の 検 出 は,そ
て,と
くに 影 響 さ れ る こ とは な か っ た.
この 増 菌 法 の 信 頼 性 を 確 か め る た め に,さ
ず れ もそ の
わず か
の接 種菌 を確実 に検 出 で き
れ ら材 料 中 の 一 般 細 菌 数(SPC値)に
らに 多 くの 魚 介 類(生 ウ ニ24例 ,生
カ キ11例,エ
様 の 実 験 を 行 な っ た .そ の 結 果,SPC値
よっ
ビ他5例)
に つ い て,S.flexneri
B 株 を 接 種 菌 に 用 い て,同
を 示 した 生 カ キ の1例
を 除 い て,大 半 が10個 以 下 の 接 種 菌 を 検 出 で き,ま た1,000個 ま で の 接 種 菌 数 で は
が と くに 高 値
す べ て の 試 料 が 赤 痢 菌 陽 性 とな っ た.
食 品 の 加 熱,冷
凍 等 の 処 理 に 起 因 す る 汚 染 赤 痢 菌 の 細 胞 損 傷 と そ れ に伴 う代 謝 機 能 の 低 下 が 十 分 予 測
さ れ る こ とか ら,本 実 験 で は そ の よ うな 損 傷 赤 痢 菌 の 検 出 に つ い て も 同 様 に 調 べ た .損 傷 菌 に お け る カ
タ ラ ー ゼ 活 性 の 明 ら か な低 下 が 見 られ た が,こ
のShigella
broth増
菌 法 は そ の よ うな 損 傷 菌 の 魚 介 類 か
ら の 検 出 に と くに 支 障 は な く,非 損 傷 菌 に お け る と 同様 に鋭 敏 に 検 出 す る こ とが で き た .
序
文
Method
赤 痢 患 者 の 発 生 に 際 して 実 施 され る原 因食 検 索
は,そ
の後 の 適 切 な 防 疫 活 動 の展 開 に きわ め て 有
第16版1)お
よ び Bacteriological
cal Manual第5版2)に
Analyti-
記 載 さ れ た 方 法 で あ る.し
か し なが ら これ ら の方 法 は い ず れ も増 菌 す る こ と
用 な指 針 を提 供 す る.し か し な が ら,食 品 を含 め
な く,食
て い ず れ の 赤 痢 菌 汚 染 材 料 の 場 合 も,そ の増 菌 法
培 地 に 塗 抹 培 養 す る 方 法 で あ る.こ
の た め,被
が確 立 さ れ て い る とは 云 い 難 く,十 分 信 頼 の で き
食 品1g当
上 の汚染菌数
る赤 痢 菌 検 査 法 は 現 在 ま で の と ころ知 られ て い な
に お い て よ うや く検 出 可 能 に な る と い わ れ て い
い.現 在 広 く採 用 され て い る食 品 の赤 痢 菌 検 査 法
る3).
は,American
別刷 請 求 先:
Public
(〒812)福
Health
岡市 東 区馬 出3-
九 州 大学 医療 技 術短 期 大 学
平成2年10月20日
Association
た り少 な く と も105∼106以
,わ れ わ れ は,最
近Mehlmanら3)に
考 案 さ れ た 赤 痢 菌 の 増 菌 培 養 法 に 着 目 し,こ
1-1
霜鳥
一方
品 の洗 浄 液 の遠 心 沈 澱 濃縮 液 を 直 接 分 離
翔一
若 干 の 改 良 を 加 え た 方 法 を,主
検
よって
れ に
と して ウ ニな ど の
霜鳥
1338
翔一 他
海 産 生 鮮 魚 介 類 の 赤 痢 菌 検 査 に 適 用 し た と こ ろ,
5mgを
き わ め て 良 好 な 実 験 結 果 が 得 ら れ た.ま
biocinが 用 い られ て い る が,こ
た,一
般
添 加 した.な お,原 法 で は0.5mgのNovoの濃 度 で は 良好
に食 品の汚染細菌 は損傷細胞 の状態で存在 す るこ
な 結 果 が 得 られ な か った の で,予 備 実 験 に よ りそ
と が 多 い こ と か ら4),そ
の10倍 量 を 適 切 濃 度 と し て 本 実 験 に 用 い た.培
の よ うな 損 傷 赤 痢 菌 の 検
出 法 に 関 し て も検 討 を 行 な い,若
干 の知 見 を 得 た
た.魚
材 料 と方 法
エ ビ,ア
ニ,カ
キの他 クルマ
カ ガ イ 等 の 海 産 生 鮮 魚 介 類 を 用 い た.ウ
ニ に つ い て は 輸 入 直 後 の も の を,ま
い て は 市 販 の も の を,そ
し,い
で 保 存 し た.こ
(Standard
plat
plate method5)に
に は,試
料59に
5m1を
モ ジ ネ ー ト(試 料5gを5mlのPBSで
均 質化 した
全 量)を 加 え,こ れ に100∼108CFUの
範 囲 で10倍
段 階 濃 度 で 赤 痢 菌 を 接 種 した.後 述 の 損 傷 赤 痢 菌
れ ぞ れ 入 手 後4℃
に保 存
に 対 す るShigella broth増 菌 法 の有 用 性 を調 べ る
の他
実 験 で は,shigella属 お よ びSalmonella属
用 まで
に 用 い られ るGN
れ ら試 料 の一 般 細 菌 数
地 と して 用 い た.
count,以
はPour
介 類 か らの赤 痢 菌 検 出実 験 に は,こ れ らの
キにつ
ず れ も 輸 入 食 品 で あ り,使
の 間-20℃
下SPCと
略)の
よ り行 な っ た.こ
リ ン 酸 緩 衝 液(PBS;
測定
の検 査
のホモ ジネ ー
(2) 培 養 法; Shigella brothを 用 い た 場 合 に は,
ほ ぼMehlmanら3)の
示 す 方 法 に従 い,42±0.2℃
brothで 増 菌 を 行 な う対 照 実 験 で は,こ
気 的 条 件)で
(2) 赤 痢 菌 株 お よ び 接 種 用 菌 液 の 調 整
当 研 究 室 保 存 の 赤 痢 菌18株,お
よ び最 近 福 岡 市
broth(ま
broth)の 培 養 液 は,SS寒
の 分 離 株25株(福
お よ び非 選 択 分 離 培 地 と してBTB乳
flexneri5株,
岡 市 衛 生 試 験 所 よ り 分 与;S
S. sonnei20株)の
用 い ら れ た.こ
計43株
が実験 に
れ ら の 菌 株 は い ず れ も,普
培 地(pH7.2)の
通寒天
半 流 動 高 層 に 穿 刺 培 養 し,ゴ
栓 で 密 封 し て 室 温 で 保 存 し た.実
ム
験 に 使 用 す る際
れ らの保 存株 を普 通寒 天 平板 に塗 抹 し
養 後,菌
を か き 取 っ てPBSに
た.こ の 菌 浮 遊 液 はOD660=40の
浮遊 し
濃 度 に 調 整 し,さ
用 い て 適 当 濃 度(10倍
段 階)に
まで 希
報 告 さ れ たShigella
にMehlmanら3)に
broth,お
成 は 次 の 通 りで あ る.Tryptone
5g,
: 2g, KH2PO4:
Tween
121℃,加
80:
brothの
(Difco):
20g,ブ
1.5ml,蒸
圧 滅 菌,冷
よって
よ び そ の 培 養 法 を,
若 干 の 改 良 を 加 え て 用 い た.Shigella
HPO4
天 培 地,
糖 寒天培 地
類を 用 いて分 離培 養 を行
な っ た.こ れ ら の培 地 に37℃ 24hr培 養 後,生 じた
赤 痢 菌 の 定 型 的 集 落 に つ い て,診 断 用 血 清(デ
カ生 研)用
して はSIM,
ン
い て ス ラ イ ド凝 集 を 行 な い,必 要 に際
Kliglerお よ びSimmonsク
エ ン酸
塩 培 地 を 用 い て,生 物 学 的 性 状 を調 べ て 同定 を 行
な った.
(4) 増 菌法 の評 価 基 準
囲 の10倍 段 階 濃 度 勾
配 で,順 次 人 為 的 に接 種 し汚 染 させ た 一 連 の試 料
(3) 培 地 類 お よ び 培 養 法
(1) 増 菌 培 地,1985年
(い ず れ も栄 研)の3種
た はGN
天 培 地,DHL寒
赤 痢 菌 を100∼108 CFU範
釈 し て 魚 介 類 へ の 接 種 用 と し た.
間,好
行 な った.
(3) 分 離 培 地;Shigella
内 で 児童 を 中 心 に散 発 的 に流 行 した 赤 痢 患 者 か ら
ら にPBSを
の培地 に
お い て 推 奨 さ れ て い る培 養 法7)(37℃,6時
トを 用 い た.
37℃20hr培
の増菌
broth6)を 比 較 の た め の 対 照 培
で15∼18時 間 嫌 気 的 条 件 下 で培 養 した.ま た,GN
pH 7.2)の
加 え て 十 分 均 質 化 した 後,そ
に は,こ
以 内に使用 し
た,カ
ず れ も 一 週 間 以 内 に 実 験 に 用 い た.そ
の 魚 介 類 は,い
つ
Shigella brothの 入 った 各 フ ラ ス コに,試 料 の ホ
試 供 魚 介 類 お よ び一 般 細 菌 数 の 測 定
本 実 験 の 被 検 食 品 に は,ウ
量 の 滅 菌 三 角 フ ラ ス コ に50mlず
分 注 して4℃ の 冷 室 に 保 存 し,3日
の で そ の 成 績 に つ い て も 併 せ て 述 べ る.
(1)
地 は200m1容
組
20g, K2
ド ウ 糖:1g,食
塩:
brothに
よ る増 菌 とそ の後 の
分 離 培 養 に よ っ て 『検 出 で きた 最 少 接 種 菌 数 』を,
増 菌 法 を 評 価 す る上 で の 基 準 値 と し て表 示 した.
(5) 損 傷 赤 痢 菌 の 増 菌 お よび 検 出実 験
前 述 の よ うに,食 品 の汚 染 細 菌 は多 くの 場 合,
食 品 の 加 工 や 保 存 の 過 程 で細 胞 に損 傷 を 受 け て い
留 水:1,000ml.
却 後Novobiocin
に お い て,Shigella
(Sigma)
る と さ れ て い る4).こ の よ うな 損 傷 細 菌 は 正 常 細
感 染 症学 雑 誌
第64巻
第10号
海産生鮮魚介類の赤痢菌検査法
菌 に 比 し て,様
々 な外 的 条 件 に対 して きわ め て 高
い 感 受 性 を 示 し,ま
た,増
1%濃
殖 能 に お い て も著 しい
1339
度 に加 え て 十 分 混 和 後,そ の20mlを
シ ャー
レに 分 注 し た.ま た,カ タ ラ ー ゼ に つ い て はMar.
低 下 が 見 ら れ る こ と が 指 摘 さ れ て い る8)9).わ れ わ
tinら15)が 同 じ く加 熱 損 傷 ブ ドウ球 菌 に つ い て 行
れ は,こ
な っ た方 法 を適 用 した.し
の よ うな 損 傷 赤 痢 菌 に よ る 食 品 汚 染 を 想
定 し て,そ
のShigella
brothに
よ る増 菌 お よ び検
い た カ タ ラ ー ゼ濃 度(0.02%)で
出 に 関 し て の 実 験 を 次 の 方 法 で 行 な っ た.
(1) 損 傷 赤 痢 菌 の 増 菌;実
B株(九
用 い た.菌
濃 度 をOD660=40に
を,加
熱(50℃
処 理 し て,そ
20min)ま
に は,shigella
brothを
と対 比 す る た めGN
brothは
備 実 験 の 結 果 か ら この500倍 を 適 切 な濃 度 と して
大 医 学 部 細 菌 学 教 室 保 存 株)を
用 い た.PBSに
DHL寒
調 整 した 菌 浮 遊 液
た は 凍 結(-20℃
れ ぞ れ 損 傷 赤 痢 菌 と し た.こ
24hr)
同 時 に 用 い た.
溶 解 し た カ タ ラー ゼ の0.1mlを
天 培 地 上 に滴 下 し コ ン ラージ棒 で広 げ
て,乾 燥 後 直 ち に 使 用 した.こ れ らの物 質 を 含 ん
の実 験
だDHL寒
用 いた 場 合 の 増 菌 の 成 績
brothを
天 培 地 上 に前 記 の 損 傷 赤 痢 菌 ま た は対
照 と して 非 損 傷 菌 を 塗 抹 培 養 して,生
GN
む な ど,食
じた 集 落 数
を そ れ らを 含 ま な い培 地 上 の 集 落 数 と比 較 した.
損 傷 細 菌 に 有 害 な デ オ キ シ コ ール 酸 ナ ト
リ ウ ム が 含 有 さ れ て お り8),さ
は損傷赤痢 菌 に
お い て ほ とん ど効 果 が 認 め られ な か った の で,予
験 に は 標 準 株 と して
Sflemeri
か し なが ら,彼 らが 用
実験 成 績
ら に糖 類 を 多 量 含
(1) shigella broth増 菌 法 に よ る保 存 赤 痢 菌 株
品 材 料 の 赤 痢 菌 検 査 に は 必 ず し も適 切
の 生 ウ ニ か らの 検 出
で な い こ と が 予 想 さ れ る10)∼13).これ ら の 損 傷 赤 痢
当 研 究 室 保 存 のS. dysenteriae 9株,
S. flexneri
菌 の 検 出 に お け る両 増 菌 培 地 の適 用 性 を 比 較 す る
15株 お よ びS.
実 験 は,前
Shigella broth増 菌 法 に よ る生 ウ ニ か ら の検 出 実
述 の
「培 地 類 お よ び 培 養 法 」 で 述 べ た
方 法 に よ り実 施 し た.
験 を行 な った.そ の 成 績 はTable
(2) 損 傷 赤 痢 菌 の 集 落 形 成 に お け るH202除
剤 の 効 果;
H2O2-degrading
compoundと
ピ ル ビ ン 酸 ナ ト リ ウ ム(Nakarai
Ltd., Kyoto,
Japan)お
sonnei 19株 の 計43株 に つ い て,
去
うに,43株
し て,
Chemicals
1に 示 され る よ
中24株 に お い て10個 以 下 の接 種 菌 を 増
菌 後 検 出 で きた.ま た 接 種 菌 数 を100個 ま で の レベ
ル に 増 や す こ と に よ り,さ らに15株 が検 出 で きた .
,
よ び カ タ ラ ー ゼ(Sigma
接 種 菌 数 を1,000個 に す る こ とに よ っ て,用 い た す
不 安 定 な性質 を有 す るため 次 の方 法 で用 い られ
べ て の 菌 株 に お い て 検 出 可 能 とな った .な お,こ
の濃 度 で 検 出 で きた4株 は い ず れ も分 離 後10年 以
た.ピ
上 を経 過 した 古 い 保 存 菌 で あ った.こ れ に対 して,
3,400units/mg)を
用 い た.こ
れ ら は い ず れ も熱 に
ル ビ ン 酸 ナ ト リ ウ ム に つ い て は,Collin-
Thompsonら14)が
加 熱 損 傷 ブ ドウ 球 菌 に つ い て
行 な っ た 方 法 を 本 実 験 に 適 用 し た.加
DHL寒
天 培 地 を50℃
Table
に 冷 や し た あ と,こ
1
Recovery
broth-enrichment
a, Bacterial
平成2年10月20日
cells
分 離 後2年
温 溶 解 した
以 下 の接 種 菌 量 を検 出 す る こ とが で き た.
れ を
of Shigella
余 の新 鮮 分 離 株19株 で は いず れ も10個
(2) Shigella broth増 菌 法 に よ る魚 介 類 の種 類
species
from
a sea urchin
by the
method.
were
inoculated
into
5 g of a sea urchin
specimen
.
Shigella
霜鳥
1340
Table
2
Shigella
Recovery
strain
the Shigella
of the
to seafood
artificially
after
inoculated
enrichment
with
broth.
翔一 他
の 実 験 に 用 いた.Table2に
示 さ れ る よ うに,輸 入
冷 凍 ウ ニ の24試 料 の そ れ ぞ れ にS. flemeri
を接 種 し,こ れ らをShigellabrothで
そ の 結 果,す
B株
増 菌 した.
べ て の汚 染 試 料 に お い て 少 数 接 種 菌
を 検 出 で きた.す
なわ ち,10個
検 出 で きた 試 料 は15例 で,ウ
あ った.ま た,100個
以 下 の接 種 菌 数 で
ニ試 料 全 体 の63%で
ま で の 接 種 菌 数 で は,用 い た
試 料 の す べ て か ら赤 痢 菌 が検 出 で きた.な
お,い
ず れ の 場 合 も,分 離 培 地 上 の 集 落 は ほ とん ど純 培
養 の 状 態 で検 出 され た.こ
の実験 に用 いた生 ウニ
試 料 に お け る1g当 た り のSPC値
は4.9×104
∼1 .0×106の 範 囲 に あ った が,こ のSPC値
と赤 痢
菌 検 出 成 績 との 間 に と くに相 関 は認 め られ な か っ
た.次 に生 カ キ試 料 に つ い て,同 様 の 実 験 を 行 な っ
た 結 果,11試
料 の うち,4例
に お い て10個 以 下 の
接 種 菌 を検 出 で きた.ま た100個 ま で の 接 種 菌 数 で
は さ らに2例 が,1,000個 ま で の 接 種 菌 数 で は4例
が そ れ ぞ れ 追 加 検 出 さ れ た.し
9.6×106の 高 濃 度 汚 染 の1例
か し,SPC値
が
の み は,3,200個
の接
種 菌 数 で も培 養 後 検 出 で きな か った.な
料 か ら は,Aeromonas属
お この 試
が きわ め て 優 勢 に検 出 さ
れ た.冷 凍 エ ビお よび そ の 他 の 貝 類 につ い て は,
エ ビの1例 を 除 い て,SPC値
は い ず れ も106/g以
上 の 高値 で あ っ た に もか かわ らず,低 濃 度 の接 種
赤 痢 菌(<10∼1,000個)をShigella
broth増 菌 培
養 に よ りほ とん ど純 培 養 の 状 態 で検 出 で き た.
(3) 加 熱 お よ び冷 凍 損 傷 赤 痢 菌 の 検 出 に お け る
増 菌法 適 用 の 検 討
本 実 験 で はShigella 属 お よ びSalmonella属
増 菌 に 用 い られ て い るGN
て用 い た.Table
の
brothを 対 照 培 地 と し
3に 示 され る よ うに,50℃20min
の 加 熱 損 傷 菌 で ウ ニ試 料 を 人 為 的 に 汚 染 させ,そ
れ を 被 検 材 料 に した2回
の 実 験(Exp.1,
2),お
冷 凍損傷 菌 で同様 に汚
よ び-20℃24hrの
染 させ,そ
a , Standard
plate count.
b , A viable cells of S. flexneri strain B were inoculated
into 5 g of each specimen.
3, Exp.
4, Exp.
の実 験(Exp
5)は いず れ も実 験 ご とに 異 な る
ロ ッ トの ウニ試 料 を 用 い た の で,成 績 は 実 験 別 に
示 した.加
熱 損 傷 菌 を 用 い たExp.
1, Exp.
2で
は,Shigella broth増 菌 法 を 適 用 した場 合,わ ず か
別 赤 痢 菌 検 出成 績
先 の 実 験 に お い て10個 以 下 の 接 種 菌 量 で 検 出 で
きた 菌 株 の 中 か ら,S.
れ を被 検 材 料 に した3回
Exp.
flemeri B株 を選 ん で 以 下
10個 以下 の 接 種 菌 を検 出 で きた.こ れ に対 して,
GN
brothで 増 菌 した 場 合 に は,同 一 の ウ ニ試 料
感 染症 学 雑 誌
第64巻
第10号
海産生鮮魚介類の赤痢菌検査法
を 用 い た に もか か わ らず,そ
れ ぞ れ15,000個 お よ
1341
塗 抹 培 養 す る こ とに よ っ て,そ れ を含 ま な い 対 照
び250個 以 上 の 接 種 菌 数 で 検 出 可 能 とな った .一
培 地 の 集 落 数 の3.4倍 に 増 加 した.同 様 に カ タ ラ ー
方,冷
ゼ を含 む 分 離 培 地 で も,そ れ ぞ れ4 .0,4.9倍
凍 損 傷 菌 の 汚 染 ウ ニ で はExp.
3の み が 両
に増
増 菌 培 地 で,同 数 の2,300個 以 上 の 接 種 菌』
数で検 出
加 し た.な お,非 損 傷 菌 で は そ れ ら の 除 去 剤 に よ
で き た け れ ど も,Exp.
る集 落 形 成 の 影 響 は全 く見 られ な か った.
4, Exp.
5で は,Shigella
broth増 菌 を適 用 した 場 合 の 『検 出 で きた 最 少 接
種 菌 数 』 は そ れ ぞ れ2.5個 お よ び23個 で,こ
GN
brothに
よ る増 菌 法 よ りい ず れ も100倍 高 い
検 出 感 度 で あ った.
(4) 損 傷 赤 痢 菌 の 集 落 形 成 に お け るH202除
去
,他 材 料 の
検 査 に 比 し て 菌 の 検 出 が 困 難 な 場 合 が 少 な くな
い.そ
剤 の効果
Table
考
察
一 般 に食 品 を 対 象 と した 細 菌検 査 は
れは
の原 因 に つ い て は,と
くに ブ ドウ球 菌 で 詳
細 な 検 討 が な され て い る4)16)。
す なわ ち食 品の保
存,加 工 に伴 う冷 凍,冷 蔵,乾 燥,不 完 全 な加 熱,
4に 見 ら れ る よ うに 本 実 験 に 用 い たS.
flemeri B株 は,加 熱 処 理 に よ って,DHL寒
地 上 の 集 落 形 成 は 約10%に
で は約1%に
塩 漬,材
料 中 に 含 まれ る リゾチ ー ム の作 用,そ
の
天培
他 添 加 物 な ど の物 理 化 学 的 お よ び生 物 学 的 影 響 に
減 少 し,ま た冷 凍 処 理
よ っ て細 菌 細 胞 が損 傷 を 受 け る結 果,代 謝 機 能 の
減 少 した.一 方,両
損 傷 菌 は,
ビル ビ ン酸 ナ ト リウ ム を 含 むDHL寒
1%
天 培地上 に
低 下 を 招 来 し細 胞 自体 はviableで
あ って も正 常
に は 増 殖 で き な くな る た め と考 え られ て い る.と
くに 損傷 細 胞 に お け る カ タ ラ ー ゼ 活 性 の低 下 に 関
Table 3 Comparison of enrichment medium for
the recovery of heat-or freeze-injured cells of
Shigella flexneri strain B.
して ブ ドウ球 菌 で よ く調 べ られ て い る15).わ れ わ
れ も加 熱 お よび 冷 凍 損 傷 赤 痢 菌 に つ い て 同様 の こ
とを観 察 した.す
強 力 なH2O2除
なわ ち,こ れ らの損 傷 赤 痢 菌 を
去 剤 と して の ピル ビ ン酸 ナ ト リ ウ
ムや カ タ ラ ー ゼ を 含 むDHL寒
天培地 上 に定量的
に塗 抹 培 養 した と こ ろ生 じた 集 落 数 は,そ れ らを
含 ま な い 分 離 培 地 上 の 集 落 数 よ り3.4∼4.9倍 多
か った.こ
の 他,損 傷 細 胞 は,分 離 用 培 地 に 含 ま
れ て い る 各 種 選 択 剤 に 対 し て感 受 性 に な る こ と も
指 摘 され て い る8).食 品 や 臨 床 材 料 の 赤 痢 菌 検 査
に お い て,そ の 増 菌 法 が 今 尚確 立 され て い な い 理
由 は,上
a, Different
samples
of sea
urchin
were
used
in each
に述 べ た 細 胞 の 損 傷 に起 因 す る こ との 他
に,材 料 中 の 共存 細 菌 が培 養 液 中 に 産 生 す る揮 発
性 の 各 種 有 機 酸 に 対 して赤 痢 菌 が きわ め て 弱 抵 抗
experiment.
Table 4 The effect of H2O2-degrading compounds added to selective medium
DHL on the recovery of heat-and freeze-injured cells of Shigellaa
a, S. flexneri strain
B was used in this experiment.
b, Figures in parentheses are the rate of increase in the number of viable cells calculated
by dividing the number of viable cells by that abtained in the control.
平成2年10月20日
霜鳥
1342
翔一 他
性 で あ る こ と も大 き な 原 因 と考 え ら れ て い
総 輸 入 額 に 占め る割 合 は きわ め て 大 で あ る. そ し
る10)-13).今 回, わ れ わ れ はMehlmanら
て,そ
に よって
れ らの 多 くが赤 痢,
コ レ ラな どの感 染 下 痢
よ びそ の培 養 法 につ
症 の多 発 地 域 か ら輸 入 され て い る とい う事 実 に十
い て, 海 産 生 鮮 魚 介 類 を対 象 と した 赤 痢 菌 検 査 法
分 な監 視 が 要 求 され る. この よ うな輸 入 魚 介 類 に
へ の適 用 性 を検 討 した. そ の 結 果, 魚 介 類 に きわ
起 因す る と考 え られ る大 規 模 な 赤 痢 流 行 は,1984
め て 低 濃 度 で接 種 した 赤 痢 菌 を 鋭 敏 に 検 出す る こ
年 の オ ラ ン ダ ・ユ トレ ヒ ト市 近 郊 に お い て 発 生 し
とが で き た. これ は, 42℃ で の嫌 気 的 な培 養 条 件
た バ ン グ ラ デ シ ュか らの輸 入 冷 凍 エ ビを 原 因 とす
考 案 され たShigella
とNovobiocinに
brothお
よ る汚 染 赤 痢 菌 の 選 択 的 増 菌,
る例 が よ く知 られ て お り18)∼20),
これ に 関 して 詳 細
と し て の グ ル コー ス 含 量 を
な 報 告 が あ る. また, 最 近 の ア メ リカ合 衆 国 に お
最 少 濃 度 にす る こ と に よ っ て, 他 共 存 細 菌
け る赤 痢 発 生 の 原 因食 調 査 報 告 に よれ ば海 産 魚 介
による揮発性有機 酸の産生 をで きるだけ少な くし
類 に よ る例 が 決 して 少 な くな い21). 今 回 わ れ わ れ
て い る こ とな どの 総 合 的 な合 理 性 に基 づ くも の と
は, この よ うな状 況 を ふ ま え て,
考 え る. NakamuraとDawson17)に
よ れ ば, S.
で 摂 食 す る こ とが 多 く, ま た 生 産 一 流 通 の 過 程 で
冷 凍 損 傷 細 胞 は, カザ ア ミノ?を 含 む 栄
常 に 水 に よ る洗 浄 や 浸 漬 が不 可 欠 で あ るた め に細
さ ら に 培 地 のC源
0.1%と
sonneiの
と くに 生 の 状 態
養 豊 富 な液 体 培 地 で 培 養 す る こ とに よ って 容 易 に
菌 汚 染 の 危 険 性 が 高 い こ とが 予 想 され る生 ウ ニ,
修 復 され る こ とを 実 験 的 に証 明 して い る. この 点
生 カキ を 中 心 に そ れ らを検 査 材 料 と した 赤 痢 菌 検
で もTryptoneを2%に
査 法 につ い て の 検 討 を行 った. そ の 結 果,
含 むShigella
brothは 損
この 実
傷 赤 痢 菌 の 修 復 に 有 効 と思 わ れ る. す な わ ち,
験 に 採 用 したShigella broth増 菌 法 が きわ め て 有
Table3に
示 され る よ うに, 損 傷 赤 痢 菌 で あ っ て
用 で あ って, 今 後 の我 国 に お け る輪 入 魚 介 類 を 含
も非 損 傷 菌 と同 様, Shigella brothで 増 菌 す る こ
め た 食 品 の 衛 生 学 的 監 視 の うえ で 有 力 な検 査 手 段
とに よ り, そ の 微 量 を接 種 した ウ ニ試 料 か ら容 易
と して応 用 で き る もの と考 え る.
文
に 菌 の 検 出 が で きた こ とは, こ の可 能 性 を 示 唆 す
る もの で あ る. し か しな が ら, 損 傷 赤 痢 菌 修 復 の
た め の 培 養 法 に関 して は さ らに実 験 例 を 多 く して
検 討 す る必 要 が あ る. 一 方, 対 照 実 験 に用 い たGN
brothに
お い て も, わ れ わ れ の 予 想 よ り比 較 的 少
数 の汚 染 赤 痢 菌 を検 出 す る こ とが で きた. しか し
な が ら, こ のGN
brothに は 損 傷 細 菌 に 有 害 な デ
オ キ シ コ ー ル酸 塩 を0.05%含
3%含
有 す る こ と, 糖 類 を
む こ とな ど,こ れ らの 条 件 は前 述 の よ うに
食 品 汚 染 赤 痢 菌 の 検 出 に 障 害 とな るは ず で あ る.
本 実 験 の結 果 で も, 赤 痢 菌 を100∼108 CFU範
囲の
10倍 段 階 の 濃 度 勾 配 で接 種 した 一 連 の ウ ニ試 料 に
お い て, 培 養 に よ り 『検 出 で きた 最 少 接 種 菌 数 』
以 上 の濃 度 で 間 欠 的 に 赤 痢 菌 陰 性 と な る こ とが し
ば し ば観 察 され た.さ
らにGN
brothの 培 養 液 か
らは 共 存 細 菌 の うち のAeromonas属
が優勢 に検
出 され る傾 向 が 見 られ る な ど, こ の増 菌 培 地 が食
品 汚 染 菌, 特 に 赤 痢 菌 の増 菌 に必 ず し も適 切 で な
い こ とが 示 され た.
エ ビを始 め と して, 我 国 に お け る海 産 魚 介類 の
献
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霜鳥
翔一 他
Evaluation of Recovery Methods of Shigella Species from Fresh Marine Fish and Shellfishes
Shoichi SHIMOTORI & Fumiko KOJIMA
Schoolof Health SciencesKyushuUniversity
Hiroaki HARUSHIMA
Hakata QuarantineOffice
Kaazunobu AMAKO
Departmentof Bacteriology,Facultyof Medicine,KyushuUniversity
Recovery experiments of Shigella strains from fresh marine fish and shellfishes, including fresh
sea urchin, which have been artificially contaminated with the strains, were performed using the
improved Shigella broth-enrichment method and the culture method reported by Mehlman et al. All of
the 43 Shigella stock cultures strains tested were recoverd easily by the enrichment method from sea
urchin individuals inoculated with a small number of viable cells of each strain. That is, a total of 24
strains (56%)were recovered from sea urchin individuals inoculated with less than 10 viable cells per
one individual, and the other 19 strains were also recovered when 10 to 1,000cells of each strain were
inoculated. Recovery of Shigella strains from fish and shellfishes by the enrichment method was
hardly affected by the number of contaminated bacteria (SPC, standard plate counts) in these
materials.
In order to confirm reliability of the enrichment method, similar experiments were performed
using S.flexneri strain B as the inoculum nad more fish and shellfishes as the samples (24 specimens of
fresh sea urchins, 11 specimens of fresh oysters and 5 other specimens including prawns). Except for
one oyster specimen which showed an especially high SPC value, the inoculum was able to be
recovered from most of the materials inoculated with less than 10 viable cells, and all of the tested
samples became Shigella positive when they were inoculated with up to 1,000 viable cells.
Because injuries of contaminated Shigella cells in food caused by heating, freezing, etc. and
subsequently reduced metabolic functions in the cells can be expected, recovery of such injured cells of
a Shigella strain was also examined. Though obvious decrease in the catalase activity was observed in
the heat- or freeze-injured cells of the strain, the Shigella broth-enrichment method was able to recover
even such an injured strain from fish and shellfishes with almost the same accuracy as in the case of
the intact strain with no significant difficulties.
感 染 症 学 雑誌
第64巻
第10号