ラット血漿中遊離システインの定量 ー HPLC用チオール蛍光誘導体化

ラット血漿中遊離システインの定量
ー HPLC用チオール蛍光誘導体化試薬ABD-Fを用いた試み ー
大谷りら1)，小川進也2)，中澤京子1)，趙治磊1)，吉村悦郎2)，加藤久典1)，梅原俊介3)
1)東京大学総括プロジェクト機構「食と生命」，
2)東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命化学専攻, 3)プロテインケミカル株式会社
目
的
チオール化合物の定量は誘導化試薬7-fluoro-2,1,3-bensoxadiazoke-4sulfonate(SBD-F)等を用い蛍光HPLCで検出する方法が広く用いられて
いる。蛍光標識時のチオール基の交換反応を抑えるために還元剤を使用する。
そのため，酸化型のチオール基が還元されるために，血漿中の遊離の
システイン（Cys）とシスチン（Cys2）を区別して定量することは困難であった。
本研究では，標識効率の高い4-aminosulfonyl-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole
（ABD-F）を用いて，低温条件下で還元剤を使用せずに蛍光標識することで，血
漿中の遊離Cysの定量を試みた。
反 応
SBD-Fを用いた反応
Sample
条
システイン（Cys）
シスチン（Cys2）
［C3H7NO2S, MW,121.16］
［C6H12N2O4S2, MW, 240.30］
中性
アルカリ性条件下
O H
H
N
S
H
H
S
還元剤
レダクターゼ
件
H
O
H
N
H
O
O H
ABD-Fを用いた反応
Sample
0.5 mM N-Acetyl-Cysteine（内部標準)
還元剤（0.3
M トリブチルフォスフィン）
還元剤
0. 6 M 過塩素酸（除タンパク質）
遠心分離
遠心分離
上清
上清
水酸化ナトリウム（中和）
SBD-Fによる蛍光誘導化（
による蛍光誘導化（pH
℃）
による蛍光誘導化（ 9.5, 60℃
蛍光標識時にチオール基や
チオエステル基の交換反応を抑える
ために，還元剤が必要
還元剤が必要
ABD-Fによる蛍光誘導化（
による蛍光誘導化（pH
℃）
による蛍光誘導化（ 8.3, 4℃
低温，pH8.3で蛍光標識では，還元剤
還元剤
なしで交換反応を抑えられるかも
なし
HPLC
HPLC
Cys2からCysへの変換率
SBD-Fによる蛍光誘導化
ABD-Fによる蛍光誘導化
生理食塩水にCys2を添加
73 ± 16（%）
生理食塩水にCys2を添加 3 ± 1（%）
血漿にCys2を添加
112 ± 24（%）
血漿にCys2を添加
13 ± 3（%）
ラットへのCysおよびCys2の投与
実験動物： 雄性Wistarラット
投与量 ： 対照群 （0.08N HCl / 0.9% saline)
Cys （300 mg/kg in 0.08 N HCl / 0.9% saline)
Cys2 （300 mg/kg in 0.08 N HCl / 0.9% saline)
投与方法：経口投与
3.00
1.50
門脈血
1.50
腹部大動脈血
抗凝固剤にEDTAを使用し，
投与60分後に門脈と大動脈から採血した。
遠心分離(1000×g, 1 min) により血漿を得た。
Cysの測定はABD-Fによる蛍光誘導化を行った。
4.00
腸内容物
門脈血
1.50
1.25
1.25
3.00
p <0.01
1.00
0.75
p <0.01
p <0.01
y = 4.1961x + 0.0949
R² = 0.9685
2.00
0.50
0.50
0.50
mM
0.75
1.00
0.75
0.75
0.50
0.50
0.25
0.25
p <0.01
p <0.01
1.00
0.25
0.25
腹部大動脈血
1.25
p <0.01
p <0.01
1.00
mM
p <0.01
mM
1.50
p <0.01
1.00
1.00
mM
1.25
2.00
mM
Cys/NAC Area
2.50
1.50
p <0.01
p <0.01
N.D.
0.00
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
血漿Cys濃度（mM）
Fig.1 検量線
血漿にCysを標準添加して作成
対照群 Cys
Cys2
0.00
0.00
0.00
0.00
対照群 Cys
Fig. 2 ラットの血漿Cys濃度
対照群 Cys
Cys2
Cys2
Fig. 3 腸内容物中の
Cys濃度
ま と
0.00
対照群 Cys
Cys2
対照群 Cys
Cys2
Fig. 4 血漿中のCysとCys2の総量
め
1. SBD-Fの場合，蛍光誘導化の反応時のチオール基の交換反応やCys2への酸化を抑えるために還元剤を使用する必要がある。
そのために，試料中に含まれるCys2のほとんどはCysに還元された。
2. ABD-Fの場合，蛍光誘導化の反応は4℃，pH8.3の条件で行い還元剤を使用しなかった。そして，Cys2からCysの変換率を
低く抑えることが可能となった。
3. ABD-Fを用いた蛍光誘導化の反応により，血漿中のCysのみを測定することが可能となった。
4. ラットにCysおよびCys2を投与し，血漿Cys濃度を測定した。その結果，Cys2の投与は血漿中Cys濃度を有効に上昇させた。
このとき，血漿中のCysとCys2の総量は両投与群で同程度であった。
5. Cys濃度は門脈血に比べ腹部大動脈血で低かったことから，Cysは肝臓である程度代謝されることが推測された。