「細胞モデリング技術の開発」（公開）

資料5-4
プロジェクトの詳細説明資料（公開）
細胞モデリング技術の開発
「細胞モデリング技術の開発」
サブプロジェクトリーダー
冨田 勝
1
「細胞モデリング技術開発」の研究開発テーマ
研究開発テーマ
開発対象とした技術
位置付け
細胞モデリング技術の開発
（担当：慶應義塾大学）
様々な変異株や培養条件の大腸菌の
メタボローム・プロテオーム・フラックス
を網羅的に測定する
それらのデータをもとにE-CELLシス
テムを使ってモデリング・シミュレー
ションを行った
定量的なデータ収集、
およびそれらに基づい
たモデリング手法の開
発
大腸菌細胞のモデル化に向けた
基盤構築
（担当：奈良先端科学技術大学院
大学）
世界で最も正確な大腸菌の塩基配列
を有する大腸菌単一遺伝子クローン
ライブラリー、単一遺伝子欠失株ライ
ブラリーを作成
定量的なデータ収集の
ためのリソース作り
大腸菌主要エネルギー代謝の遺
伝子発現・代謝ネットワークモデル
の作成
（担当：九州工業大学）
代謝・遺伝子制御ネットワークを詳細
細胞モデル化を効率化
に記述するソフトウエア（CADLIVE）を する汎用ソフトウエアの
開発
開発した
生産プロセスにおける酵母代謝経
路モデリング
（担当：大阪大学）
バイオインフォマティクスデータ統合に
よる酵母代謝経路モデリングによる育
種法の確立とストレス耐性、特に浸透
圧耐性株の育種
真核細胞（酵母菌）にお
いても各種データを統
合した
2
1
大腸菌細胞モデリングの研究開発内容
達成目標
研究の意義
遺伝子発現制御を含んだ主要エネル
ギー代謝系の動的シミュレーションモ
デルの構築
代謝の動的な振舞いを理解し予測す
ることができる
細胞代謝全体の静的モデル（代謝流
束モデル）の構築
測定の難しい速度パラメータを用いず
に，化学反応量論式から数学モデル
を構築して，野生株や変異株の代謝
流束を予測する
動的・静的モデルを統合した細胞シ
ミュレーション用ソフトウェアの開発
代謝の動的モデル構築に用いる酵素
反応速度式を削減でき、パラメータ測
定にかかる時間と費用を大幅に低減
することができる
代謝経路の最適化とプロセス効率の
予測（宿主細胞設計に資する）
より効率的に宿主細胞設計を行うこと
ができる
3
成
果
• 大腸菌代謝全体の定性的モデリング
– ゲノム配列／酵素ＤＢからのモデル自動生成
• 「GEMシステム」を完成した。
– CE/MSによる代謝物質の網羅的解析
• 技術を確立し、協和発酵分室の
宿主細胞
MGF株を測定した。
– バイオインフォマティクスによる代謝解析 Ｇとの
連携
• WTとの比較から協和発酵分室
MGF株の代謝特性を推定した。
4
2
成
果
• 主要エネルギー代謝系動的シミュレーション
モデリング
– マルチオミックスデータの収集
• WTと単一遺伝子欠損株２４株について収集
完了
– これらに基づいてシミュレーションモデルを構築
• E-Cellシステムを用いてプロトタイプ完成
• 大規模シミュレーションにむけての技術開発
– ハイブリッド法、MASK法を開発
5
マルチオミックスデータの網羅的収集
研究項目
目 標
成 果
目標
達成度
成果の
意義
論文数
（件）
メタボローム測
定技術の開発
CE-MS, CETOFMSによ
る代謝物質の
一斉定量法を
開発する
代謝物質の測
定法、推定法、
酵素の機能同
定法を確立し
た
◎
モデリングに必
要な代謝物質濃
度データの収集
に有用
9
プロテオーム測
定技術の開発
LC-MSを用い
たタンパク質
の一斉定量法
を開発する
タンパク質の絶
対量を一斉・迅
速に測定する
手法を開発し
た
○
モデリングに必
要なタンパク質
濃度データの収
集に有用
2
大腸菌マルチオ 定量的手法、
ミクスデータの
定性的手法を
収集
併用し、様々
な状態の大腸
菌のマルチオ
ミクスデータを
得る
24欠損株, 5比
増殖速度（野
生株）のデータ
を収集した。
○
代謝経路の変化
に関する定性
データやシミュ
レーションに必要
な定量データが
揃い、今後のモ
デリングに有用
0
6
3
メタボローム
• CE-MS（イオン性物質の測定）
– 代謝物質の
高速一斉定量法
CE
MS
Soga, T. et al. (2002) Anal Chem. 74, 2233-2239
7
CE-MS標準データベース
z合計859種類
（陽イオン性452, 陰イオン269, ヌクレオチド類 86）
Compound
Glyoxylate
Propionate
Glycolate
Crotonate
Butyrate
Isobutyrate
Pyruvate
Oxamate
Lactate
Chloroacetate
Tiglate
Isovalerate
Valerate
b-Hydroxybutyrate
a-Hydroxybutyrate
2-Hydroxyisobutyrate
Malonate
Glycerate
Carbon
2
3
2
4
2
4
3
3
3
2
5
5
5
4
4
4
1
3
m/z
73
73
75
85
87
87
87
88
89
93
99
101
101
103
103
103
103
105
MT MT/MT(IS) Area Area/Area(IS) S/N
13.834
0.745
19156
0.026
4.515
14.868
0.773
37112
0.033
9.297
10.099
0.784
59370
0.067
30.675
15.709
0.817
52279
0.046
19.357
16.625
0.849
58502
0.072
23.046
17.668
0.853
98571
0.092
33.499
11.632
0.736
97905
0.089
10.317
13.326
0.718
56725
0.025
47.119
14.976
0.796
157643
0.177
71.197
10.198
0.792
17615
0.020
27.051
20.897
0.844
148596
0.102
28.467
14.715
0.932
291806
0.230
25.713
16.847
0.907
166577
0.200
14.756
20.683
0.863
247710
0.170
74.924
11.647
0.904
164987
0.161
114.899
16.565
0.846
345230
0.390
260.227
11.008
0.531
18123
0.014
7.250
15.332
0.815
315357
0.284
176.393
Height
3906
7397
15631
9868
7469
14884
9837
13951
31706
4739
20205
52298
22547
24253
36482
69004
2338
49048
8
4
LC-MS標準データベース
•中性物質815種類のデータ
ベース作成
9
その他未知物質の特定
①CE-TOFMS法の開発
データ処理ソフトウェアの開発：全質量物質の一斉
表示・比較が可能
②CE-MS/MS法で在られたMS/MSスペクトルから構
造式を推定
③ニューラルネットワークによるCE-MS測定時間の
予測
これらの方法を組み合わせて物質を特定
10
5
プロテオーム
• ショットガンプロテオミクス（SGP）
– 67酵素
• ウェスタンブロット （WB）
– 26酵素
• 二次元ディファレンスゲル電気泳動 （2D-DIGE）
11
フラックソーム
• 13Cでラベルしたグルコースを使用
• 菌体を加水分解、GC-MSおよびNMRで
アミノ酸の同位体分布を測定
• CE-MSで遊離の代謝物質の同位体分布を
測定
12
6
トランスクリプトーム
• Real time RT-PCR
–中央代謝系遺伝子
85
–rRNA
2
（絶対値のコントロールとして用いる)
–中央代謝系のレギュレーター
8
• DNAマイクロアレイ
13
試験条件・測定項目
• Escherichia coli
BW25113
• 野生株 (WT)
or Keio コレクション
• 炭素源 : グルコース
• 連続培養
• 希釈率 ： 0.2 [hr-1]
– 2倍時間 = 3.5 [hr]
に相当
• 温度：37℃
• pH：7.0
• メタボローム
– CE-TOFMS
à
578化合物
• プロテオーム
– ショットガンプロテオミクス
à 67酵素
– ウェスタンブロット
à 26酵素
– 2D-DIGE
• フラックソーム
– GC-MS, NMR
– CE-MS
• トランスクリプトーム
– Real time RT-PCR
à 95遺伝子
– DNAマイクロアレイ
14
7
E. coli K-12 中央代謝経路
15
大腸菌モデリング向けデータ取得対象
• 野生株 希釈率変更
– 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 0.7 [hr-1]
• 一遺伝子欠損株（Keio コレクション）※
（希釈率＝0.2 [hr-1]）
– 解糖系
à galM,glk,pgi,pfkA,pfkB,fbp,fbaB,gapC,gpmA,gpmB,
pykA,pykF,ppsA,pgm
– ペントースリン酸経路
à zwf,pgl,gnd,rpe,rpiA,rpiB,tktA,tktB,talA,talB
※奈良先端大（森）の大腸菌単一遺伝子欠失/単一遺伝子クロー
ンライブラリーに係る知見を利用。
16
8
メタボローム
100
Metabolite conc. (Mutant) [mM]
10
1
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
100
0.1
0.01
0.001
galM
glk
pgi
pfkA
pfkB
fbp
fbaB
gapC
gpmA
gpmB
pykA
pykF
ppsA
pgm
zwf
pgl
gnd
rpe
rpiA
rpiB
tktA
tktB
talA
talB
0.0001
Metabolite conc. (WT) [mM]
欠損株と野生株の比較
17
プロテオーム
(Shotgun Proteomics)
100.00
Protein conc. (Mutant) [mg/g-dry cell]
10.00
0.01
0.10
1.00
1.00
10.00
0.10
0.01
100.00
galM
glk
pgi
pfkA
pfkB
fbp
fbaB
gapC
gpmA
gpmB
pykA
pykF
ppsA
pgm
zwf
pgl
gnd
rpe
rpiA
rpiB
tktA
tktB
talA
talB
0.00
Protein conc. (WT) [mg/g-dry cell]
欠損株と野生株の比較
18
9
フラックソーム
200
Flux (Mutant) [%-substrate uptake]
150
100
50
0
0
50
100
150
200
galM
glk
pgi
pfkA
pfkB
fbp
fbaB
gapC
gpmA
gpmB
pykA
pykF
ppsA
pgm
zwf
pgl
gnd
rpe
rpiA
rpiB
tktA
tktB
talA
talB
-50
Flux (WT) [%-substrate uptake]
欠損株と野生株の比較
19
トランスクリプトーム
(定量PCR)
1.E+12
mRNA conc. (Mutant) [copy number/μg-total RNA]
1.E+11
1.E+10
rpiAの欠損でrpiBが上昇
1.E+09
1.E+08
1.E+07
1.E+06
1.E+05
1.E+04
1.E+03
1.E+02
galM
glk
pgi
pfkA
pfkB
fbp
fbaB
gapC
gpmA
gpmB
pykA
pykF
ppsA
pgm
zwf
gnd
rpe
rpiA
rpiB
tktA
tktB
talA
talB
1.E+01
1.E+00
1.E+00 1.E+01 1.E+02 1.E+03 1.E+04 1.E+05 1.E+06 1.E+07 1.E+08 1.E+09 1.E+10 1.E+11 1.E+12
mRNA conc. (WT) [copy number/μg-total RNA]
欠損株と野生株の比較
20
10
大腸菌中央代謝系の基本モデル作成
研究項目
目 標
成 果
定常状態にお
ける代謝物質 パラメータ
濃度実験デー チューニング
マルチオミクス
に用いなかっ
データを用いたダ タを再現する
た代謝物質
イナミックモデル
データをある
の作成
動的な挙動が 程度表現でき
ある程度実測 た
値に一致する
目標
達成度
成果の
意義
論文数
（件）
○
マルチオミクス
データを用い
てダイナミック
モデルを作成
する基本的な
プロトコルを確
立した
投稿中 １
21
モデル構築のストラテジー
（酵素反応速度式のチューニング）
チューニング対象（代数的に計算）
フラックソーム
（Flux解析）
プロテオーム
（ショットガンプロテオミクス
or ウェスタンブロット）
⎛
P ⎞⎟
kcat Et ⎜ S −
⎜
K eq ⎟⎠
⎝
v=
⎛
P ⎞⎟
⎜
K m , S ⎜1 +
⎟+S
K
m, P ⎠
⎝
（一基質、一生成物の
可逆Michaelis-Menten式の例）
メタボローム
（CE/MS）
in vitro測定値 or 文献値
22
11
モデルの検証
• E-Cell 3を使用
• 希釈率0.1, 0.2, 0.5 [hr-1]のマルチオミクス
データでモデル構築
• 希釈率0.4[hr-1]のタンパク質濃度データを与
えてシミュレーション、定常時の代謝物質計
算値を実測値と比較
• 矛盾を見つけることによって代謝を考察する。
23
遺伝子欠損のシミュレーション（zwf）
（左のグラフの結果をマッピング）
ペントースリン酸経路の酵素反応速度
Zwf (G6PDH) = 0
1.20E+04
Reaction rate [molecules/sec]
1.00E+04
8.00E+03
G6PDH
PGDH
Rpe
Rpi
Tkt (1)
Tkt (2)
TA
6.00E+03
4.00E+03
2.00E+03
流束＝0となる経路
通常と逆行する経路
0.00E+00
0
10
20
30
40
50
60
-2.00E+03
反応速度＜0
-4.00E+03
Time [sec]
菌体合成に必要なR5Pを確保するため、
ペントースリン酸経路の逆行が起きる。
実際の欠損株のフラックス解析結果
通常と逆行する経路
24
12
遺伝子欠損のシミュレーション（pgi）
定常時の代謝物質のWTに対する比 （②/①）
減少
Case 1
Case 2
増加
2.68
2.22
2.14
157.93
0.48
1.01
0.53
0.97 シミュレーションで
1.85
8.38
はAcetyl CoAが大
3.82
21.21
実測
Glucose 6-phosphate
Acetyl CoA
Succinyl CoA
Succinate
Ribulose 5-phosphate
Sedoheptulose-7-phosphate
0.43
2.53
0.76
1.95
3.07
0.91
量に蓄積
Case 1：WTの酵素濃度を入力し、pgiを欠損（×1/7）させたシミュレーション
Case 2：pgi欠損株の酵素濃度を入力し、pgi酵素活性を0にした時のシミュレーション
3.5
0.9
G6P
F6P
FDP
DHAP
3PG
PEP
PYR
AcCoA
CIT
ICT
AKG
SucCoA
SUC
FUM
MAL
6PG
RIB5P
RIBU5P
SED7P
E4P
0.7
②
0.5
0.4
①
0.3
0.2
0.1
G6P
F6P
FDP
DHAP
3PG
PEP
PYR
AcCoA
CIT
ICT
AKG
SUCCoA
SUC
FUM
MAL
6PG
RIB5P
RIBU5P
SED7P
E4P
2.5
2
1.5
①
1
0.5
0
0
0
200
400
600
Time [sec]
800
1000
0
1200
Case 1
KO
200
400
600
Time [sec]
800
1000
1200
Case 2
KO
25
遺伝子欠損のシミュレーション（rpe）
定常時の代謝物質のWTに対する比 （②/①）
実測
Glucose 6-phosphate
Fructose 6-phosphate
Fructose 1,6-diphosphate
3-Phosphoglycerate
Phosphoenolpyruvate
Acetyl CoA
Succinate
Fumarate
Malate
Ribulose 5-phosphate
Ribose 5-phosphate
Sedoheptulose-7-phosphate
3.97
13.71
15.04
0.27
0.15
1.09
0.92
1.33
0.98
66.82
35.07
1.45
Case 1
Case 2
0.99
0.89
0.97
1.16
0.86
0.27
0.88
0.40
0.75
1.00
1.50
3.85
0.78
0.61
0.77
0.96
0.78
1.48
1.33
3.97
1.51
2.39
0.55
0.88
減少
増加
実測では中間代謝物質
が多量に蓄積
Case 1：WTの酵素濃度を入力し、rpeを欠損させたシミュレーション
Case 2：rpe欠損株の酵素濃度を入力し、rpe酵素活性を0にした時のシミュレーション
0.25
②
0.25
g6p
f6p
fdp
dhap
_3pg
pep
pyr
accoa
cit
ict
akg
succoa
suc
fum
mal
_6pg
ribu5p
rib5p
sed7p
e4p
0.15
0.1
0.05
0.2
Concentration [mM]
②
①
0.2
Concentration [mM]
Concentration [mM]
0.6
②
3
Concentration [mM]
0.8
G6P
F6P
FDP
DHAP
3PG
PEP
PYR
AcCoA
CIT
ICT
AKG
SUCCoA
SUC
FUM
MAL
6PG
RIB5P
RIBU5P
SED7P
E4P
①
0.15
0.1
0.05
0
0
0
200
KO
400
600
Time [sec]
Case 1
800
1000
1200
0
200
KO
400
600
Time [sec]
Case 2
800
1000
1200
26
13
遺伝子改変のシミュレーション（pfkA）
• PfkA（解糖系の律速酵素と言われる）の酵素濃度、
キネティックパラメータ(Km for F6P)を変更したときの変化
0.20
0.20
PFK濃度: × 1/10
0.18
0.16
0.16
0.14
0.14
G6P
F6P
GAP
3PG
2PG
PEP
0.12
0.10
0.08
Conc. [mM]
Conc. [mM]
PFK: Km for F6P × 3
0.18
G6P
F6P
GAP
3PG
2PG
PEP
0.12
0.10
0.08
0.06
0.06
0.04
0.04
0.02
0.02
0.00
0.00
0
20
40
60
80
100
0
120
20
40
60
80
100
120
Time [sec]
Time [sec]
●キネティックパラメータの方が小さな変化で影響が大きい
→単に発現量を変えるだけでなく、酵素自体の性質を変えたほうが有効な場合も
ある
●G6P以外の物質濃度はあまり変化しない→代謝系のロバスト性
27
ダイナミックシミュレーション（１）
Chassagnole(2002)の実験との比較
FDP
FDP
F6P
F6P
G6P
G6P
1.8
2.5
4.5
2
3.5
1.6
4
1.4
1.2
3
1.5
1
0.8
2.5
2
1
0.6
1.5
0.4
1
0.5
0.2
0.5
0
-20
-10
0
0
10
20
30
40
50
-20
-10
0
0
GAP
GAP
10
20
30
40
50
-20
-10
0
PEP
PEP
2.5
3
2
2.5
10
20
30
40
50
30
40
50
PYR
PYR
2.5
2
2
1.5
1.5
1.5
1
1
1
0.5
0
-20
-10
0.5
0.5
0
0
10
20
30
40
50
-20
-10
0
0
10
20
30
40
50
-20
-10
0
10
20
PYR生合成の別経路がactivateされている
可能性を示唆
6PG
6PG
1.8
1.6
1.4
D = 0.1 [hr-1]の定常状態より、
グルコースを3倍濃度になるようパルス投与
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-20
-10
0
10
20
30
40
50
● 実測値 X軸：Time [sec]
計算値 Y軸：Normalized concentration [-]
28
14
ダイナミックシミュレーション（２）
Hoque et al. (2005) の実験と比較
G6P
F6P
FBP
2.5
4
10
2
3
8
1.5
6
2
1
0.5
1
0
0
0
100
200
300
400
4
2
0
0
100
200
300
400
6
4
2
0
100
200
300
2
200
300
400
0
0.5
0
200
300
400
200
● 実測値
計算値
1
100
100
２PG生合成の別経路がactivateさ
れている可能性を示唆
2
0
400
0
100
1.5
0.5
300
1
2.5
1
400
0.5
PYR
1.5
300
2
0
400
200
1.5
PEP
0
100
2PG
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
8
0
0
GAP
DHAP
0
100
200
300
400
X軸：Time [sec]
Y軸：Normalized concentration [-]
29
モデルの精度向上に向けて（今後の課題）
• さらに多くの条件におけるマルチオミクスデータを収
集する
• 現状のモデルで考慮していない、もしくは簡略化し
ている要素を改善する
– 酵素反応速度式
– 以下の様な要素
• Crabtree effect（好気的発酵）
• グルコース以外の細胞外物質（NH4、Pi）の能動輸送系
• PTS以外のグルコース取り込み系
• パラメータチューニング法の改善
– kcat以外のパラメータをチューニング
– データに含まれる誤差を考慮したフィッテイング法の開発
30
15
大規模シミュレーションのための技術開発
研究項目
目 標
成 果
モデル自動
生成
ゲノム塩基
パスウェイモデルの
配列からモ
自動構築を可能とし
デルを自動
た
生成すること
HDS法
代謝の動的
モデル構築
に用いる酵
素反応速度
式を削減す
る
メタボロームデータ
を用いることで、合
理的に50%以上の
反応速度式を削減
できた
MASK法
遺伝子ネット
ワークの大
規模シミュ
レーションを
実現する
DNAマイクロアレイ
情報を用いた大規
模遺伝子制御シミュ
レーションを可能と
する手法を考案した
目標
達成度
成果の
意義
論文数
（件）
○
自動構築を可能
としたことで、モデ
ル開発について、
コストと人的ミス
を低減させること
を可能とした
発表済
１
○
実験を削減する
ことで、モデル構
築にかかる時間
と費用を大幅に
低減することがで
きる
発表済
１
投稿中
１
○
理論上、規模に
限界がなく、非常
に高精度な遺伝
子シミュレーショ
ン手法を実現した
発表済
１
準備中
１
31
ゲノム配列／酵素ＤＢからのモデル自動生成
Escherichia coli K12 MG1665
Metabolites： 940
Enzymes： 1178
Reactions： 1179
Genome- based E-cell
Set of Reactions
= Metabolic Pathways
Modeling
Genome Sequence
attgaacgct
tgcttcgctg
gataactact
caccaaggcg
GEM
SYSTEM
SWISS-PROT
KEGG
The GEM system automatically builds static cell models from genomic
sequences using various databases.
Arakawa , K. et al (2006) BMC Bioinformatics 7, 168
32
16
動的/静的ハイブリッドシミュレーション法
• キネティクスが必要な酵素の数を減らす技術
Dynamic model
X2
X4
反応速度式
v1
物質量
Xn
X1
X3
反応速度式などで
計算される流束
v2
v3
X5
X6
流束分布解析
X12
v9
X11
v8
Stoichiometric model
流束分布解析で計算さ
れる流束
v4
X7
X10
X8
X9
v7
v5
dX5/dt = V2 + V3
dX11/dt = V8 + V9
v6
Yugi, K. et al. (2005) Theor. Biol. Med. Model. 2, 42
33
MASKによる
遺伝子発現シミュレーション
Delay 1 min
6
REB1 array
Regulated gene
x
Regulator gene
Delay 5 min
RB=Rx2
B
4
b
Kb ⋅ [ RNAP ]
∏ [ A]
⋅ Ka ⋅ Kc ⋅
1 + Kb ⋅ [ RNAP ]
∏ [ R]
l
Vsyn =
3
a
gi
i=0
m
j=0
hj
R
[ m R N A ] / [ m R N A ]0
x
Rx=2
A
RA=3Rx
2.5
REB1 simulation
ABD1 array
2
ABD1 simulation
1.5
1
0.5
0
0
60
120
180
240
300
360
time(min)
S. Cerevisiaeのマイクロアレイデータでテスト
(Spellman et al. (1998) Mol. Biol. Cell 9, 3273-3297)
Yugi , Y. et al (2005) BMC Bioinformatics 6, 299
34
17
大腸菌中央代謝系の基本モデル作成
研究項目
目 標
成 果
代謝流束予測モ
デル（ECFモデ
ル）開発
エレメンタリ
モードを用い
て，酵素活性
を考慮した代
謝流束予測モ
デル（ECF）を
開発する
複数の変異株
の流束を
MOMAや
FBAなどの他
法より正確に
予測すること
ができた
目標
達成度
成果の
意義
論文数
（件）
○
測定の難しい速
度パラメータを
用いずに、化学
反応量論式を
用いて数学モデ
ルを構築し、変
異株の代謝流
束を予測するこ
とに長所がある
投稿中
35
遺伝子発現／代謝ネットワークの
コンピュータ支援設計システムの研究開発
研究項目
目 標
成 果
生命分子ネット
ワーク設計支援
システム
CADLIVE開発
遺伝子制御・
代謝ネット
ワークを詳細
に記述する方
法やそれを実
装したソフトウ
エアを開発す
る．
完成したソフト
ウエアは
CADLIVEとし
て，フリーで公
開している．
エレメンタリモード
を用いた静的流
束予測法（ECF）
開発
変異株の流束
酵素活性を統
を，MOMAや
合して変異株
FBA等の手法
の流束を正確
より正確に予
に予測する．
測できた．
目標
達成度
成果の
意義
論文数
（件）
○
細胞の分子ネッ
トワークの記述
法を世界に先
駆けて提案し，
ソフトウエアとし
て実装した．
4
○
酵素活性の動
的変化を考慮し
た静的シミュ
レーションに世
界で初めて成
功した．
投稿中
36
18
遺伝子発現/代謝ネットワークの
コンピュータ支援設計システムの研究開発
九州工業大学
倉田博之
37
研究成果
１．CADLIVE(反応経路マップを基にした簡易シミュレー
ションモデル) の開発
→ web公開
(http://www.cadlive.jp/)
データベースからの自動レイアウト
Nucleoc acods Res. 2003
ノックアウトと経路探索による
システム解析
ポストゲノムデータの統合による
未知反応経路探索
Bioinformatics 2005
Genome informatics, 2004
38
19
２．代謝・遺伝子制御ネットワークのシミュレーション
σ32 mRNA
FF sensor
Computer σ32
RNAP
Actuator
σ32 RNAP
Heat Shock
FB
sensor
σ32 DnaK
σ32 DnaK
FtsH
制御の観点から
ネットワークのモジュール分解
PNAS, 2005
Plant
σ32
FtsH
DnaK
HSP(DnaK, FtsH, Lon) genes
代謝・タンパク質・遺伝子層からなる
大規模ネットワーク(アンモニア同化システム)
の動的シミュレーションとシステム解析
Genome Res. 2005
39
代謝流束と酵素活性のElementary Modeへの統合による
大腸菌主要代謝シミュレーション法の開発
With 冨田グループ(清水和幸)
40
20
宿主細胞創製グループへのフィードバック
（連携）
研究項目
目 標
大腸菌の代
WT大腸菌W3110
謝物質数を
とMGF-01のメタボ
測定し比較
ローム測定
する
成 果
MGF-01の方
が代謝物数が
多かった
目標
達成度
成果の
意義
論文数
（件）
○
遺伝子破壊株
の方が代謝物
質数が多いこと
が判明した
これはバイパス
経路が発現して
いる可能性を示
唆しているが、
再現性、培養条
件など更なる検
討が必要
0
41
協和発酵分室MGFの
メタボローム解析
• 大腸菌 MGF株（MGF-01）と野生株
（W3110）を比較
• 慶應義塾大学（先端生命科学研究所）の代謝
スナップショット測定と同条件でサンプル調製
42
21
解析結果： バッチ培養 CE-TOFMS
MGF-01
陰イオン
陽イオン
WT (W3110)
43
W3110とMGF-01の比較
陽イオン
陰イオン
44
22
W3110及びMGF-01の検出されたピーク数
陽イオン
WT
MGF
942
1161
陰イオン
WT
MGF
579
1343
ヌクレオチド類*
WT
MGF
37
47
*; 測定した53成分（60質量数）中のピーク数
検出された全ピーク数
WT
MGF
1558
2551
検出されたピーク数・・・S/N<3, Area<1000, 中性物質を除く
45
解析結果： 連続培養 CE-MS
cAMP
AMP
ADP
ATP
NAD
NADH
NADP
NADPH
1.25/1.09 (0.88)
46.15/35.31 (0.77)
81.27/62.72 (0.77)
481.54/405.62 (0.84)
188.88/184.21 (0.98)
2.95/3.87 (1.31)
44.04/44.04 (1.00)
22.92/28.48 (1.24)
CMP-DG
PA
Glc
Glycogen
Glycerophosphate
F1,6BP
8.58/6.99 (0.81)
GA3P
DHAP
0/28.10 (∞)
CMP
PS
2,3BPG
Gly
13.23/13.53 (1.02)
Cys
0/0
0/0
GLcn6P
6.03/1.75 20.67/23.33 (1.13)
F6P
(0.29)
4.51/4.46 (0.99)
②
30.01/22.66 (0.76)
Glconate
G6P
G1P
0/0
Ser
15.40/24.36
(1.58)
X5P
Thr
5.52/9.03 (1.63)
測定不可･未測定
未検出
AcOH
AcCOA
Val 11.94/7.29 (0.61)
Citrate
3.95/6.98 (1.77)
cis-Aco
GOX
aKG
13.19/10.36 (0.79)
Leu 11.34/5.38 (0.47)
Ileとの区別が困難
なので参考データ Pro 11.31/7.84 (0.69)
0/0
IsoCit
0/0
Fumarate
MGF-01で4/3倍以上高い
MGF-01で2/3倍以下低い
Ala 16.46/11.94 (0.73)
11.92/2.89
(0.24)
Lys
Malate
Ile
29.92/19.56 29.95/15.57 (0.60)
0.53/0 (0)
(0.65)
Leuとの区別が困難なので参考データ
0/0
9.17/14.19 (1.55)
Succinate
11.10/12.44
(1.12)
SucCoA
7.34/6.63 (0.90)
①7.01/27.28 (3.89)
Glycolate
Trp 0/0
Tyr
3.25/0 (0)
Lac
Pyruvate
Asp
0/0
His
3.30/2.85 (0.86)
Phe
1.46/1.99 (1.36)
0/0
27.77/17.83
(0.64)
OAA
W3110の定量値(pM)/MGF-01の定量値(pM)
( )内の値はMGF-01÷W3110の値
SH7P
G2P
8.77/9.17 (1.05)
PRPP
F6P
E4P
53.47/38.41 (0.72)
Asn
6.08/0 (0)
Ribo5P
8.87/10.62 (1.20)
GA3P
PEP
Met
4.55/6.86
(1.51)
3.21/0.66 (0.21)
23.51/14.24 (0.61)
1,3BPG
G3P
2,3BPG
Ribu5P
Gln
22.00/21.40
(0.97)
Glu
353.92/226.41
(0.64)
CO2
Arg
12.70/8.00
(0.63)
46
23
結果の考察
多くの遺伝子を破壊したMGFの方が代謝物質は多く検出された．
この理由を以下に考察する．
・遺伝子を破壊するとその酵素の前の代謝経路に存在する代謝物が
いくつか蓄積することが知られている．MGFは多くの遺伝子を破壊
しているため,多くの代謝物質が蓄積し検出された．
・遺伝子の破壊によって,バイパスの代謝経路がいくつか発現したこと
により,多くの代謝物質が検出された可能性がある．
・実験操作上の問題でサンプリングのタイミングが合わず、
W3110は定常期に対して MGFでは対数増殖期を比較した．
（測定した細胞数は同じ）
この違いが影響した可能性がある．
前述の点を考慮して今後さらなる検討実験が必要である．
47
実用化・事業化の見通し
実用化・事業化
展
開
論文数
（件）
発酵企業と共同研究を行い特定物質
の高生産法を新規に開発した
製薬企業と共同で新規バイオマーカー
を発見した
6
プロテオーム／メタボロームの測定法
企業に特許を譲渡し、今後事業化され
や遺伝子の機能同定に関して幾つか
る見通しである
の特許を出願した
4
メタボロームのデータ解析ソフトを開
発した
2
CE-MS法によるメタボローム測定法
を開発し、この技術をヒューマン・メタ
ボローム・テクノロジーズ㈱に導出し
た
企業に開発したソフトのライセンス契
約がなされる見通しである
48
24
Human Metabolome
Technologies Inc.
Since 2003
Keio invested HMT
2003.11.27
49
2004.6.18 読売新聞
2004.1.17 日経バイオテクオンラインより
HMT社、微生物の新規代謝物探索で
ミツカンと提携
メタボローム解析を行うベンチャー企
業であるヒューマン・メタボローム・テク
ノロジーズは、１月16日、微生物の新規
代謝物の探索と同定について、ミツカン
グループ本社と共同研究を開始したこ
とを発表した。
50
25
生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発
細胞モデリング技術の開発
研究開発テーマ
生産プロセスにおける酵母代謝経路
モデリング技術の研究開発
大阪大学 大学院工学研究科
塩谷捨明
研究開発目標
バイオインフォマティクスデータ統合による酵母代謝経路モデリン
グによる育種法の確立とストレス耐性、特に浸透圧耐性株の育種
51
生産プロセスにおける酵母代謝経路モデリング技術の研究開発
バイオインフォマティクスデータを統合する代謝情報工学大阪大学・塩谷・清水グルー
グ
ル
コ
｜
ス
生理学的変化・適応
外的環境の変化
代謝物質レベル
グ
リ
セ
ロ
｜
ル
エ
タ
ノ
｜
ル
30分
25分
20分
15分
10分
5分
代謝フラックス解析
タンパク質レベル
代謝物質解析
プロテオーム解析
(kDa) 3
97
66
45
遺伝子レベル
トランスクリプトーム解析
微生物の多階層システム
pI
10
30
20
14
タンパク質発現解析
各階層における状態量データの取得と統合
評価
細胞内状態を表現するモデルの構築
Control
(Cy5)
NaCl添加
(Cy3)
重ね合わせ
(Cy5+Cy3)
情報科学技術
・クラスタリング解析
・統計解析
による有用遺伝子探索
物質生産に適した微生物育種への応用
遺伝子発現解析
52
26
研究開発成果のまとめ
1.
代謝システム解析：
環境ストレスに対して遺伝子、タンパク質、代謝のネットワークの応
答を解析する技術を整備した。
2. 代謝系モデリング技術
2-1 代謝経路モデリング：
フラックス解析を行えるグルコースからエタノール生成に到る中枢代
謝経路のモデリングを行った。
2-2 SOMとクラスタリング技術：
SOMサイズの決定に、AICを利用し、DNAアレイの実験誤差を指標に、
SOMと階層的クラスタリング法を結合した新しいクラスタリング法を
開発した。
3. ストレス耐性株の育種
3-1 浸透圧ストレスに対して、GPD1 の発現増強株
3-2 NaCl耐性：ENA1、CUP1 増強株
3-3 エタノール耐性株：TRP1、TRP5 遺伝子の発現増強株
成果物
酵母中枢代謝モデル
ストレス耐性株
53
細胞モデリング技術開発の波及効果
発酵企業と共同で特定物質の高生産法を開発することや、
製薬企業と共同で新規バイオマーカーを発見することが
今後数多く行われることが期待される。
世界的にも国際メタボローム学会の設立やシステムバイオ
ロジー国際会議などで、リーダーシップを発揮している。
54
27