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ノボサーティーン静注用 2500 2.6.6 毒性試験の概要文 ノボノルディスク
1 of 57 ノボサーティーン静注用 2500 2.6.6 毒性試験の概要文 ノボ ノルディスク ファーマ株式会社 2 of 57 目次 Page 目次 .............................................................................................................................................................2 図目次 .............................................................................................................................................................3 表目次 .............................................................................................................................................................4 略語一覧 .............................................................................................................................................................6 2.6.6.1 まとめ ..................................................................................................................................................8 2.6.6.1.1 単回投与（急性）毒性 .................................................................................................................9 2.6.6.1.2 反復投与毒性 .................................................................................................................................9 2.6.6.1.3 局所刺激性...................................................................................................................................11 2.6.6.1.4 その他の毒性試験 .......................................................................................................................11 2.6.6.2 単回投与（急性）毒性 ....................................................................................................................12 2.6.6.2.1 毒性試験における動物種選択 ...................................................................................................12 2.6.6.2.2 単回投与（急性）毒性（参考資料） .......................................................................................14 2.6.6.3 反復投与毒性 ....................................................................................................................................18 2.6.6.3.1 反復投与毒性：ラット ...............................................................................................................19 2.6.6.3.2 反復投与毒性：カニクイザル ...................................................................................................23 2.6.6.4 遺伝毒性 ............................................................................................................................................34 2.6.6.4.1 遺伝毒性 - in vitro ........................................................................................................................34 2.6.6.4.2 遺伝毒性 - in vivo.........................................................................................................................34 2.6.6.5 がん原性 ............................................................................................................................................34 2.6.6.6 生殖発生毒性試験 ............................................................................................................................34 2.6.6.7 幼若動物を用いた毒性試験 ............................................................................................................35 2.6.6.8 局所刺激性 ........................................................................................................................................35 2.6.6.9 その他の毒性 ....................................................................................................................................37 2.6.6.9.1 抗原性...........................................................................................................................................37 2.6.6.9.2 メカニズム検討 ...........................................................................................................................37 2.6.6.9.3 試験物質関連不純物 ...................................................................................................................37 2.6.6.9.4 その他...........................................................................................................................................37 2.6.6.10 考察及び結論 ....................................................................................................................................43 各種検査パラメータの一覧 ..................................................................................................................................49 参考文献 ...........................................................................................................................................................56 3 of 57 図目次 Page 図 2.6.6-1 プロトロンビン時間（PT、秒）、 活性化部分トロンビン時間（aPTT、秒）及びト ロンビン時間（TT、秒）に関する非臨床試験で使用される動物種とヒトとの相違 .....12 図 2.6.6-2 FVII、FVIII 及び FXIII の基礎レベルに関する非臨床で使用される動物種とヒトと の比較..........................................................................................................................................13 図 2.6.6-3 線溶系（プラスミノーゲン及び2-プラスミンインヒビター）に関する非臨床で使 用される動物種とヒトとの比較 ..............................................................................................13 4 of 57 表目次 Page 表 2.6.6-1 毒性試験一覧 ................................................................................................................................8 表 2.6.6-2 単回投与毒性試験の概要と結果 ..............................................................................................14 表 2.6.6-3 反復投与毒性試験の概要と結果 ..............................................................................................18 表 2.6.6-4 毒性及びトキシコキネティクスを検討した DRF 試験（試験番号 NN209517）にお ける投与群、用量及び動物数 ..................................................................................................19 表 2.6.6-5 ラット 4 週間反復投与毒性試験（試験番号 NN209502）における試験群、用量及び 動物数..........................................................................................................................................21 表 2.6.6-6 カニクイザル試験（試験番号 SBi-1249-175）における試験群、動物数／性、実際 の投与用量及び動物の生死 ......................................................................................................23 表 2.6.6-7 カニクイザルにおける 14 日間反復投与毒性試験（試験番号 SBi-1394-175）の試験 群、動物数／性、用量、投与容量、投与液濃度及び試験ごとの動物数 ..........................26 表 2.6.6-8 サルの試験（試験番号 SBi-1266-175）における試験群、動物数／性、用量、投与 容量、投与液濃度及び試験ごとの動物数 ..............................................................................28 表 2.6.6-9 カニクイザルにおける反復投与毒性試験（試験番号 NN205255）の試験群、用量、 投与容量、投与期間、試験ごとの動物数 ..............................................................................31 表 2.6.6-10 カニクイザル反復投与毒性試験の 2 試験〔Module 2.6.7.7.C（試験番号 SBi-1394175）及び Module 2.6.7.7.E（試験番号 NN205255）〕における雌雄動物の性成熟 .........35 表 2.6.6-11 初期の酵母菌株（ZM146）で製造した rFXIII を用いたラット及びイヌの反復投与 毒性試験ならびにカニクイザルの単回投与毒性試験の要約 ..............................................38 表 2.6.6-12 初期の酵母菌株（ZM146）から製造されたバッチのラット又はイヌにおける用量 に対応する rFXIIIa°含有量及び試験結果の要約 ...................................................................39 表 2.6.6-13 rFXIII の 30～35 mg/kg 投与によるラットの試験（KHS92005）における rFXIIIa*含 有量増加に対応する死亡発現時間 ..........................................................................................41 表 2.6.6-14 トランスグルタミナーゼ前駆体（rFXIII）存在下又は非存在下での rFXIIIa による 毒性比較 a ....................................................................................................................................42 表 2.6.6-15 初期の酵母菌株製造 rFXIII 及び現行の酵母菌株製造 rFXIII の毒性試験における無 毒性量、致死量及び rFXIIIa°含有量の比較 ...........................................................................48 表 2.6.6-16 反復投与毒性試験における一般状態の観察及び検査項目 ..................................................49 表 2.6.6-17 反復投与毒性試験におけるトキシコキネティクス及び抗体産生の評価 ..........................49 表 2.6.6-18 反復投与毒性試験における血液学的検査パラメータ ..........................................................50 表 2.6.6-19 反復投与毒性試験における血液凝固検査パラメータ ..........................................................50 表 2.6.6-20 反復投与毒性試験における血液生化学的検査パラメータ ..................................................51 5 of 57 表 2.6.6-21 反復投与毒性試験における尿検査パラメータ ......................................................................52 表 2.6.6-22 反復投与毒性における剖検及び重量測定器官 ......................................................................53 表 2.6.6-23 反復投与毒性試験における病理組織学的検査 ......................................................................54 6 of 57 略語一覧 A2 ： ： ALT α2-AP aPTT AST AUC AUC0-xh ： ： ： ： ： ： AUC0-inf ： Avecia DS B2 ： BUN CL C0 Cmax DIC DS ELISA FDP FXIII FXIIIa GLP HMEX ICH IU kDa LDH NA NN DS PT rA2 ： ： ： ： ： ： ： : ： ： ： ： ： ： ： ： ： ： ： ： rFVIIa ： ： homodimer of coagulation factor XIII A subunits（血液凝固第 XIII 因子 A サブユニッ トのホモダイマー） heterotetramer of plasma coagulation Factor XIII, composed of two FXIII A subuints and two FXIII B subuints（血液凝固第 XIII 因子の A サブユニットダイマーと B サブユ ニットダイマーからなるヘテロテトラマー） alanine aminotransferase（アラニンアミノトランスフェラーゼ） alpha 2-anti plasmin（α2-アンチプラスミン） activated partial thromboplastin time（活性化部分トロンボプラスチン時間） aspartate aminotransferase（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ） area under the concentration-time curve（濃度－時間曲線下面積） area under the concentrationtime curve from zero to x hours （時間 0 から投与後 x 時 間の血漿中濃度－時間曲線下面積） area under the concentrationtime curve from zero to infinity（時間 0 から無限大の濃度 －時間曲線下面積） Avecia produced Drug Substance（外部製造所 Avecia 社で製造された原薬 ） homodimer of coagulation factor XIII B subunits（血液凝固第 XIII 因子 B サブユニッ トのホモダイマー） blood urea nitrogen（尿素窒素） clearance（クリアランス） initial plasma concentration（投与直後の血漿中濃度） maximum concentration（最高血漿中濃度） disseminated intravascular coagulation（播種性血管内凝固症候群） drug substance（原薬） enzyme-linked immunosorbent assay（酵素免疫吸着測定法） fibrinogen degradation products（フィブリノゲン分解産物） coagulation factor XIII（血液凝固第 XIII 因子） activated FXIII（活性型 FXIII） Good laboratory practice（医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準） high molecular weight protein complexes（高分子蛋白複合体） International Conference on Harmonisation（日米 EU 医薬品規制調和国際会議） international units（国際単位） kilo Dalton（キロダルトン） lactate dehydrogenase（乳酸脱水素酵素） not applicable（該当せず） Novo Nordisk produced Drug Substance（ノボ ノルディスク社で製造された原薬） prothrombin time（プロトロンビン時間） homodimer of two recombinant coagulation factor XIII A subunits（遺伝子組換え FXIII A サブユニットのホモダイマー） recombinant activated human coagulation factor VII（遺伝子組換え活性型血液凝固第 VII 因子） 7 of 57 rFXIII rFXIIIa rFXIIIa° rFXIIIa* SD SDSPAGE ： ： ： ： ： ： tmax t1/2 tPA ： ： ： recombinant FXIII（遺伝子組換え FXIII） activated rFXIII（活性型 rFXIII） non-proteolytically activated rFXIII（非蛋白分解性活性型 rFXIII） thrombin activated recombinant human factor XIII（トロンビン活性型 rFXIII） Sprague Dawley sodium dodecyl sulfate poly aclylamide gel electrophoresis（SDS-ポリアクリルアミド ゲル電気泳動） time at which the highest concentration occurs（最高血中濃度到達時間） half-life（消失半減期） tissue plasminogen activator（組織プラスミノーゲン活性化因子） 8 of 57 2.6.6.1 まとめ 先天性 FXIII A サブユニット欠乏症の男性及び女性患者への臨床使用を支持するため、遺伝子組換え 血液凝固第 XIII 因子（以下、rFXIII）の非臨床安全性評価プログラムは、日米 EU 医薬品規制調和国際 会議（以下、ICH）のバイオテクノロジー応用医薬品に関する ICH S6 ガイドライン及び ICH M3 ガイ ドライン中のバイオテクノロジー応用医薬品に関する記述に従い計画された。 In vivo 安全性試験は、薬理反応を示す 2 種の動物、すなわちラット及びカニクイザルを用いて、それ ぞれ 4 週間及び 27 週間までの投与期間で実施した。非臨床試験における投与経路は、臨床適用経路で ある静脈内とした。すべての重要な試験は「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準」（以 下、GLP）に準拠して実施した。rFXIII の分子特性及び治療法を考慮した結果、遺伝毒性試験及びがん 原性試験による評価の意義は低いと判断し、これらの試験は実施しなかった。同様の理由から、生殖 発生毒性試験及び幼若動物を用いた試験も実施しなかった。局所刺激性はラット及びカニクイザルを 用いた反復投与毒性試験において、さらにウサギを用いた局所刺激性試験を実施して評価した。 非臨床毒性試験の概括一覧（投与期間・経路、動物種、GLP 適用状況）を表 2.6.6-1 に示す。 表 2.6.6-1 毒性試験一覧 投与経路 動物種 GLP 適用状況 静脈内 サル 非適用 ≤ 1 週間 a 静脈内 ラット、サル ラット：非適用、サル：適用 2 週間 静脈内 サル 適用 4 週間 静脈内 ラット、サル 適用 13 週間 静脈内 サル 適用 27 週間 静脈内 サル 適用 遺伝毒性 実施せず（Module 2.4.4.2 参照） 該当せず 該当せず がん原性 実施せず（Module 2.4.4.3 参照） 該当せず 該当せず 生殖発生毒性 実施せず（Module 2.4.4.4 参照） 該当せず 該当せず 幼若動物毒性 実施せず（Module 2.4.4.5 参照） 該当せず 該当せず 局所刺激性 静脈内、動脈内、静脈周囲 適用 試験の種類及び投与期間 単回投与 a 反復投与毒性 ウサギ 9 of 57 投与経路 動物種 GLP 適用状況 4 週間投与ｂ 静脈内 ラット 適用 2 週間投与ｂ 静脈内 イヌ 適用 静脈内 サル 非適用 ラット 非適用 試験の種類及び投与期間 その他の毒性 単回投与 ｂ ｂ 活性型 rFXIII の毒性評価のた 静脈内 めのメカニズム試験ｂ a 参考資料。 これらの試験は初期の酵母菌株 ZM146 で製造された rFXIII を用いて実施されたものであり、市販予定の rFXIII ではな い。これらの試験は毒性評価をサポートするためだけのものであり、試験報告書は参考資料として Module 4.3 に示した。 b 2.6.6.1.1 単回投与（急性）毒性 カニクイザルに rFXIII の 0～30 mg/kg（0～5010 IU/kg、臨床推奨用量の 0～143 倍量）を単回静脈内 投与した。rFXIII の毒性は急勾配の用量反応関係を示した。すなわち、rFXIII 投与動物には忍容性が認 められるか、高用量（21.9 mg/kg 以上、臨床推奨用量の 104 倍以上）投与では死亡するかのいずれかで あった。 急性毒性の全般的な特徴は、死亡動物の病理組織学的検査で診断された血管内うっ血、血栓症及び 続発性虚血性壊死であり、これは播種性血管内凝固症候群（以下、DIC）の診断に合致していた。一般 的に閉塞性血液凝固障害として扱われる変化が、重症度は様々であるが、副腎、腎臓、眼、肺、心臓、 胃腸管、膵臓、脾臓、肝臓、脳、下垂体（神経性下垂体）及び骨髄に認められた。 臨床病理学的検査では血液学的検査、血液凝固検査及び血液生化学的検査のパラメータに変化が認 められた。これらの変化は、一般的に閉塞性血液凝固障害（虚血性壊死）として取り扱われる各種器 官にみられた所見及び血液サンプル採取による血液損失に合致するものである。 2.6.6.1.2 反復投与毒性 反復投与毒性試験として、ラットでは 4 週間までの試験及びカニクイザルでは 27 週間までの試験を 実施した。当初、臨床試験を支持するための動物種としてカニクイザルを選択した。また、医薬品の 承認申請を支持するための第二の動物種として、また、市販用製剤の原薬の製造を外部製造所 Avecia 社からノボ ノルディスク社へ移管することを支持するため、ラットも使用した。 ラットでは、0～15 mg/kg/日の rFXIII〔ノボ ノルディスク社で製造された原薬（以下、NN DS）、臨 床推奨用量の 72 倍まで〕及び 0～5 mg/kg/日の rFXIII〔外部製造所 Avecia 社で製造された原薬（以下、 Avecia DS）、臨床推奨用量の 24 倍まで〕の 28 日間連日静脈内投与に対して忍容性が認められた。脾 臓における可逆性のリンパ系細胞過形成が、rFXIII（NN DS）の 15 mg/kg/日投与の雄動物ならびに rFXIII（Avecia DS）の 1 及び 5 mg/kg/日投与の雌雄動物に認められた。無毒性量は 15 mg/kg（NN DS） 及び 5 mg/kg（Avecia DS）であった。 10 of 57 カニクイザルでは、用量、投与期間及び投与間隔が異なる 4 種の反復投与毒性試験を実施した。 rFXIII の 12.5 又は 17.5 mg/kg を 72 時間間隔で 2 回静脈内投与（臨床推奨用量の 60 倍以上）した用量 範囲設定（以下、DRF）試験において、4/5 頭が死亡するか又は状態悪化のために 2 回目の投与後に安 楽死処置された。死亡発現及び状態悪化による安楽死処置の原因は広範な血栓症及び虚血性壊死であ り、DIC に合致するものであった。臨床病理学的検査では、血液凝固検査、血液学的検査及び血液生 化学的検査パラメータに変化が認められた。これらの変化は、一般的に閉塞性血液凝固障害（虚血性 壊死）として取り扱われる各種器官にみられた所見に合致するものであった。本試験において無毒性 量は確定しなかった。 カニクイザルにおける rFXIII の 0～6 mg/kg/日の 2 週間反復静脈内投与毒性試験では良好な忍容性が 認められた。無毒性量は 6 mg/kg/日（臨床推奨用量の 29 倍）であった。 カニクイザルの 4 週間反復投与毒性試験では、12.5 mg/kg（臨床推奨用量の 60 倍）までの rFXIII を 2 週に 1 回計 3 回静脈内投与した。脾臓における可逆性のリンパ系細胞過形成が 8 及び 12.5 mg/kg 投与の 雌動物で認められた。投与に関連すると考えられる軽度の腎糸球体変化が 12.5 mg/kg 投与の 1/6 頭（雌） に認められた。無毒性量は 8 mg/kg/2 週（臨床推奨用量の 38 倍）であった。 重要な試験であるカニクイザルにおける 13 及び 27 週間反復投与毒性試験では、10 mg/kg までの rFXIII を 2 週に 1 回静脈内投与した。rFXIII の 10 mg/kg（臨床推奨用量の 48 倍）1 回投与後、1/30 頭 （雄）に死亡がみられ、死因は血栓症及び虚血性壊死であった。rFXIII の 10 mg/kg/2 週を投与された残 り 29 頭の動物は、投与終了後の安楽死処置まで忍容性を示した。無毒性量は 3 mg/kg/2 週（臨床推奨 用量の 14 倍）であった。 免疫を介するクリアランスの変化が試験終了時の曝露に及ぼす影響を検討するため、ラット及びカ ニクイザルの反復投与毒性試験において rFXIII 抗体産生を評価した。ラットの 4 週間試験及びカニク イザルの 27 週間試験で、rFXIII に対する抗体産生が認められた。しかしながら、rFXIII 抗体が試験終 了時の曝露に有意な影響を及ぼすことはなかった。 ラット及びカニクイザルにおける反復投与後の累積は、概ね終末相の消失半減期〔以下、t1/2（ラッ ト 6～10 時間、カニクイザル 2～ 9 日間）〕及び投与間隔から予測される値と一致していた。ラット及 びカニクイザルにおける rFXIII の薬物動態プロファイルに明らかな雌雄差は認められなかった。しか しながら、ラットの内因性 FXIII 活性は雄よりも雌で高い傾向を示した。FXIII B サブユニット（B2） と複合体を形成する FXIII A サブユニット（A2）に関して、ラット及びカニクイザルのいずれにおいて も濃度－時間曲線下面積（以下、AUC）の増大がみられたが、用量比例性は認められなかった。遊離 型 FXIII B サブユニット（B2）に対して過剰となる高用量の rFXIII（rA2）投与では、循環血中の遊離型 A サブユニット（A2）のクリアランスは高く、非線形性の薬物動態を示した。 11 of 57 2.6.6.1.3 局所刺激性 rFXIII の局所刺激性はラット及びカニクイザルにおける反復投与試験ならびにウサギにおける局所刺 激性試験で評価した。概して、rFXIII は局所反応を全く示さないか、又は軽度の変化が認められるのみ であり、その局所反応はヒトへの投与を妨げるものではないと考えられた。 2.6.6.1.4 その他の毒性試験 初期の rFXIII 開発プログラムでは、初期の酵母菌株から製造された rFXIII を用いてラット及びイヌ における完全な非臨床試験プログラムが実行されたが、本質的にこの rFXIII は現行のものと区別され る。情報提供のためにこれらの試験結果を示す。 これらの試験において、ラットでは 15 mg/kg/日以下では良好な忍容性が認められた。イヌでは、25 mg/kg の単回投与後又は 10 mg/kg/日の 6 日間反復投与後の雌動物に毒性（血栓症、虚血性壊死及び死 亡）が認められた。イヌの試験における使用バッチの非蛋白分解性活性型 rFXIII（以下、rFXIIIa°）の 含有量は 7.3%であり、ラットの試験で使用したバッチの含有量（2.5%）よりも高かった。活性型 rFXIII（以下、rFXIIIa）に着目してラットを用いて一連のメカニズム試験を実施した。これらの試験か ら、イヌでは高レベルの rFXIIIa°で毒性がみられたように、ラットにおいても同レベルの rFXIIIa で毒 性（死亡）がみられることが示された。ラットにおけるメカニズム試験から、rFXIIIa°は毒性発現の主 要因であると結論された。 rFXIIIa°低含有量（0.8%）のバッチを用いてイヌの 2 週間反復静脈内投与毒性試験を再度実施した。 このバッチでは 15 mg/kg/日以下で忍容性が認められた。20 mg/kg 以上の用量では少なくとも 6 日間反 復静脈内投与後にみられた毒性に免疫複合体形成を介する毒性（血栓症、虚血性壊死及び死亡発現に 加え血管炎又は腎糸球体変化）が関与している可能性が考えられた。さらに、2 頭の雌カニクイザルを 用いて 12.8 及び 25.5 mg/kg の rFXIII（0.26%の rFXIIIa°を含有）の単回静脈内投与による毒性試験を実 施した。rFXIII の 25.5 mg/kg 投与動物は、状態悪化を来したため、動物愛護の観点から安楽死処置した。 病理組織学的検査により、広範囲な血栓症及び虚血性壊死が認められた。 12 of 57 2.6.6.2 単回投与（急性）毒性 2.6.6.2.1 毒性試験における動物種選択 薬理学的反応性を示す 2 種の動物、ラット及びカニクイザルを用いて毒性試験を実施した。臨床開 発を支持するために、カニクイザル 1 種を用いた。他の動物種（げっ歯類、ウサギ、イヌ及びブタ） では血液凝固・線溶系に著しい種差が認められること、また、これらの動物ではヒト及びサルに比較 して FXIII の基礎レベルが高く、プラスミノーゲンの基礎レベルが非常に低いことから（図 2.6.6-1、図 2.6.6-2 及び図 2.6.6-3 参照）1、カニクイザルは最適な動物種と考えられた。 さらに、血液凝固系に関す る比較評価からサルとヒトは非常に類似していることが示されている 1,2.。このことは、非ヒト霊長類 を使用することにより血液凝固系の類似性の低い動物種よりも毒性試験のばらつきが最小化されるこ とを示唆している。しかしながら、欧州医薬品庁（欧州ヒト用医薬品委員会）の助言に従い、医薬品 の承認申請を支持するための第二の動物種として、また、市販用製剤の原薬製造を外部製造所 Avecia 社からノボ ノルディスク社へ移管することを支持するために、ラットも使用した。 70 60 50 40 PT (s) aPTT (s) TT (s) 30 20 10 an um y H on ke Pi g M og D it bb Ra Pi ui ne a G Ra t g 0 図 2.6.6-1 プロトロンビン時間（PT、秒）、 活性化部分トロンビン時間（aPTT、秒）及びト ロンビン時間（TT、秒）に関する非臨床試験で使用される動物種とヒトとの相違 1 Karges et al., 1994 に示されている平均値。 13 of 57 1400 1200 1000 800 FVII (%) FVIII (%) FXIII (%) 600 400 200 an um y G ui M H on D ke Pi g og t ab bi R ne a R Pi at g 0 図 2.6.6-2 FVII、FVIII 及び FXIII の基礎レベルに関する非臨床で使用される動物種とヒトとの比 較 1 Karges et al., 1994 に示されている平均値、ヒトのレベルを 100%として換算。 160 140 120 100 Plasminogen (%) 80 α2-plasmin inhib tor (%) 60 40 20 an H um y M on ke Pi g og D G R at ui ne a Pi g Ra bb it 0 図 2.6.6-3 線溶系（プラスミノーゲン及び2-プラスミンインヒビター）に関する非臨床で使用 される動物種とヒトとの比較 1 Karges et al., 1994 に示されている平均値、ヒトのレベルを 100%として換算。 カニクイザルの使用を支持するために in vitro 試験が実施され、rFXIII はトロンビンにより活性化さ れ、ヒトと同様にカニクイザルのフィブリンを用量依存的に架橋形成させることが示された〔Module 2.6.3.2（試験番号 RES-FXIII-0024）〕。同じく、活性型 rFXIII（rFXIIIa*又は rFXIIIa°）を血漿に添加し たとき、カニクイザルにおいて架橋を形成させるフィブリノゲン分子種はヒトでみられるものと類似 14 of 57 していることも示されている〔Module 2.6.3.2（試験番号 RES-FXIII-0063）〕。効力を裏付ける試験は、 rFXIII の生物活性を確認するとともに、rFXIII 又は活性型 rFXIII の薬物動態及び毒性検討においてカニ クイザルは適切な動物モデルであることを支持している。 2.6.6.2.2 単回投与（急性）毒性（参考資料） カニクイザルを用いて 3 種の単回投与毒性試験を実施した。rFXIII の 0～30 mg/kg〔臨床推奨用量 35 IU/kg（0.21 mg/kg）の 0～143 倍〕をカニクイザルに単回静脈内投与した（投与用量については表 2.6.6-2 を参照）。以下の表に、個々の試験の包括的要約を示す。 表 2.6.6-2 単回投与毒性試験の概要と結果 試験番号 SBi-1220-175a SBi-1278-175a SBi-1249-175a 動物種/系統 カニクイザル カニクイザル カニクイザル 投与経路 静脈内 静脈内 静脈内 動物数／性 a／用量 雌1 雌1 21.9 mg/kg：雄 1 22.5 mg/kg： 雄 1、雌 1 用量（mg/kg） 0、10、17.5、20（Avecia DS） 0、20、21.2、22.5、25、30 （Avecia DS） 用量（(IU/kg)b 0、1670、2923、3340 0、3340、3540、3758、4175、 3657、3758 5010 rFXIIIa°含有量（%） 0.19 0.33 観察期間 投与日（1 日目）、投与後 8 日 投与日（1 日目）、投与後 8 日 投与日（1 日目） 間 間 GLP 適用 非適用 非適用 適用 特記所見 所見なし。 22.5 及び 30 mg/kg 投与動物： それぞれ投与後 5 日目及び投 与日に死亡。病理組織学的検 査で広範な血栓症及び虚血性 壊死がみられ、DIC の診断に 合致。 投与日に全動物死亡。病理組 織学的検査で広範な血栓症及 び虚血性壊死がみられ、DIC の診断に合致。 21.9、22.5（Avecia DS） 0.26 a 参考資料：SBi-1249-175 試験は単回投与及び反復投与で実施されたが、本表には単回投与による結果を示し、反復投与 による結果は表 2.6.6-3 及び Module 2.6.6.3「反復投与毒性」に示す。 b rFXIII は mg/kg 単位で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 成熟雌性カニクイザルにおける rFXIII の静脈内投与急性毒性予備試験（GLP 非適用試験、Module 2.6.7.5、試験番号 SBi-1220-175） 本試験の目的は、雌性カニクイザルへの単回静脈内投与により rFXIII の急性毒性を評価することで あった。1 頭／群の成熟雌動物（2.6～3.3 kg）に、試験 1 日目、rFXIII の 10、17.5 又は 20 mg/kg の（臨 床推奨用量の 48～95 倍）又は対照（溶媒）を、5 分間かけて緩徐に（1.16～2.08 mL/分）静脈内投与 15 of 57 （infusion）した（表 2.6.6-2 参照）。試験開始前 7 日から試験 8 日まで、摂餌状況を含め一般状態の観 察を毎日 1 回行い、毎日 2 回死亡の有無を確認した。体重は、投与前に少なくとも 1 回、その後投与日 （試験 1 日の投与前値を用量計算に使用）及び投与後 8 日まで毎日測定した。馴化期間中、投与直前 及び投与後一連のタイムポイント（トキシコキネティクス・臨床病理学的検査：0.5、2、8、24、72 及 び 168 時間）で採血した。投与前、投与後約 2、24 及び 48 時間ならびに 8 日目に血圧、心拍数及び体 温を測定した。試験終了後、動物は試験施設の動物集団に戻した。 投与動物はすべて試験終了時まで生存した。一般状態の観察、体重、摂餌量、臨床病理学的検査、 体温、心拍数及び血圧には、rFXIII 投与に関連した明らかな変化は認められなかった。 トキシコキネティクスの評価において、3 用量のいずれにおいても投与後約 72 時間まで血漿中から の遊離型 FXIII B サブユニット（B2）の喪失が認められ、その後投与前のレベルに復した。総 A2（rA2、 rA2B2、A2B2）に関しては、非用量比例的な AUC の増大に対応してクリアランスも増大した。総 A2 の 投与直後の血漿中濃度（以下、C0）にも用量比例的な増加が認められた。A2B2 ヘテロテトラマー （rA2B2、A2B2）の最高血漿中濃度（以下、Cmax）は 36.2～49.2 µg/mL の範囲にあり、カニクイザル血 漿中からの遊離型 FXIII B サブユニット（B2）の完全な喪失との相関性は認められなかった。A2B2 ヘテ ロテトラマーの最高血中濃度到達時間（以下、tmax）はすべての用量群で 72 時間であった。 結論：カニクイザルにおける rFXIII（0.19%の rFXIIIa°を含有）20 mg/kg の単回静脈内投与で忍容性 が認められた。試験期間中死亡はみられず、rFXIII 投与に関連する症状の発現も認められなかった。投 与に関連した摂餌量、体重、生理学的指標の変化又は rFXIII に起因する臨床病理学的検査パラメータ の変化は認められなかった。 成熟若齢雌性カニクイザルにおける rFXIII の静脈内投与急性毒性予備試験（GLP 非適用試験、Module 2.6.7.5、試験番号 SBi-1278-175） 本試験の目的は、雌性カニクイザルへの単回静脈内投与による rFXIII の急性毒性について、さらに 評価することであった。1 頭／群の成熟した雌性カニクイザル（2.6～3.3 kg）からなる 6 群を編成し、 rFXIII の 0〔（対照（溶媒））、20、21.2、22.5、25 又は 30 mg/kg（臨床推奨用量の 0～143 倍）を投与 した。試験 1 日目に、rFXIII 又は対照（溶媒）を緩徐に（2.0 mL/分）静脈内投与（infusion）した（表 2.6.6-2 参照）。試験開始前 7 日から試験 8 日まで、摂餌状況を含む一般状態の観察を毎日 1 回行い、ま た、毎日 2 回死亡の有無を確認した。体重は投与前 1 日から毎日測定し、投与前 1 日目の体重を用量計 算に使用した。馴化期間中、投与直前及び投与後の一連のタイムポイント（トキシコキネティクス・ 臨床病理学的検査：0.5、2、8、24、72 及び 168 時間）で採血した。投与前、投与後約 2、24 及び 48 時 間ならびに 8 日目に血圧、心拍数及び体温を測定した。生存動物はすべて投与後 8 日目に安楽死処置 した。完全な剖検を行い、定められた組織を採取・固定保存し、切片標本を作製して病理組織学的評 価を行った。 16 of 57 トキシコキネティクスの評価において、4/5 頭の動物では投与後約 72 時間まで血漿中からの遊離型 FXIII B サブユニット（B2）の喪失が認められ、その後投与前のレベルに復した。総 A2（rA2、rA2B2、 A2B2）については、2 頭の動物（rFXIII の 20 及び 21.2 mg/kg）でのみ AUC 及びクリアランスが評価可 能であり、クリアランスはそれぞれ 2.6 及び 3.1 mL/h/kg、AUC はそれぞれ 7728.1 及び 6887.3 h*μg/mL であった。すべての用量で C0 は 516.1～776.0 µg/mL の範囲にあった。A2B2 ヘテロテトラマー（rA2B2、 A2B2）の Cmax は 17.3～ 61.8 µg/mL の範囲にあり、投与用量との相関性は認められなかった。 rFXIII の 20、21.2 又は 25 mg/kg 投与には忍容性がみられ、動物は試験終了時まで生存した。rFXIII の 22.5 mg/kg 投与では投与後 5 日目に死亡が認められた。rFXIII の 30 mg/kg 投与では投与日（試験 1 日目）に死亡が認められた。 すべての rFXIII 投与動物で、初期（投与後 4 時間）に血漿中フィブリノゲン及び血小板数の減少が みられたが、投与後 24 時間ではベースラインの値に復した。さらに、rFXIII の 21.2 及び 22.5 mg/kg 投 与動物では赤血球数の軽度減少がみられたが、これは血液凝固経路の変化に続発する二次的変化であ る可能性が考えられた。 rFXIII 投与動物のうち生存した 1 頭に投与との関連性が考えられる所見が認められた。この動物（第 6 群、21.2 mg/kg）では、軽微な心筋線維の変性がみられた。しかしながら、心臓又はその他の器官に この変化及び投与との関連性を示す血栓形成は認められなかった。rFXIII の 22.5 mg/kg 投与動物は、健 康状態の悪化が進行し、投与後 5 日目に死亡した。この動物の観察では、円背様の外観（投与後 2～5 日）、活動低下（投与後 3 日）及び摂餌量低下（投与後 3～5 日）が認められた。投与後 48 時間では血 圧及び体温の低下が認められた。病理学的検査でみられた変化のすべては、一般的に血液凝固障害と して扱われるものに関連していると考えられた。血液凝固障害及びそれに続く腎臓及び心臓の損傷に 対応する臨床病理学的な変化として、血小板数の減少、血中尿素・窒素（以下、BUN）、クリアチニ ン、K、乳酸脱水素酵素（以下、LDH）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、AST）、 アラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、ALT）及び C 反応性蛋白の増加、総蛋白及びアルブミン の減少が認められた。剖検及び病理組織学的検査において、副腎、腎臓、心臓、皮膚、胸腺、脾臓、 胆嚢、胸部及び腎臓周囲の軟部組織に変化が認められた。第 3 群（22.5 mg/kg）の動物では、病理組織 学検査で副腎のほぼ完全な壊死、多発性出血を伴う両側性腎皮質のび漫性壊死、血管内血栓形成を伴 う心筋線維の変性・壊死、赤脾髄及び肝臓の類洞における蛋白沈着、脾臓、腎臓及び副腎被膜の線維 化ならびに脳、直腸及び眼球網膜における血栓形成が認められた。急性腎機能不全及び広範な血管内 膜損傷に一致して多数の器官に浮腫が認められた。この動物の急性死の原因として急性腎不全の可能 性が考えられた。 第 5 群（30 mg/kg）で投与日（試験 1 日目）に死亡した動物では、投与後 4 時間まで毒性症状は認め られなかった。この動物は投与 7 時間後に死亡した。第 3 群（22.5 mg/kg）の死亡動物のように、この 動物の病理学的検査でみられた変化のすべても、一般的に血液凝固障害として扱われるものに関連す ると考えられたが、投与後死亡するまでの時間が短かったこと（約 4～7 時間）から、この動物におけ 17 of 57 る臨床的及び病理学的変化は著しいものではなかった。剖検及び病理組織学的検査では、副腎、肺、 腎臓及び心臓に変化が認められ、すべて血液凝固障害に関連付けられるものであった。死因として肺 における血栓形成が考えられた。この動物にみられた顕著な病理組織学的変化は、腎臓の糸球体のフ ィブリン血栓を伴う尿細管上皮細胞の壊死、副腎の皮質及び髄質における出血及びうっ血を伴う血栓 形成、心筋線維の変性・壊死ならびに肺におけるほとんどの大きな血管にみられた閉塞性血栓であっ た。蛋白沈着／血栓形成が赤脾髄、肝臓の類洞及び眼球網膜（壊死を伴う）にみられ、その他少数の 器官にうっ血が認められた。 カニクイザルにおける rFXIII（試験物質中に 0.33%の rFXIIIa°を含有）の 0～30 mg/kg 単回静脈内投 与試験の結論：rFXIII の 0、20、21.2 及び 25 mg/kg 投与動物に忍容性が認められた。これらの動物では、 死に至るほどではない軽度～中等度の血液凝固／血液学的検査パラメータの変化（フィブリノゲン及 び血小板数の減少）が認められたが、病理組織学的検査で血液凝固障害の痕跡は認められなかった。 これに対して、rFXIII の 22.5 及び 30 mg/kg 単回静脈内投与では、一般的に血液凝固障害として扱われ る変化がみられ、動物が死亡する結果となった。臨床病理学的（血液学、血液凝固、血液生化学）検 査でみられた変化は、種々の器官における血液凝固障害及び凝固壊死に合致するものであった。 試験番号 SBi-1249-175 の試験結果については、Module 2.6.6.3「反復投与毒性」及び Module 2.6.7.7.B （試験番号 SBi-1249-175）を参照のこと。本試験では rFXIII の単回投与及び反復投与が行われたこと から、詳細は「反復投与毒性」に要約する。 18 of 57 2.6.6.3 反復投与毒性 反復投与毒性試験として、Sprague Dawley（以下、SD）ラットを用いた 4 週間までの試験及びカニク イザルを用いた 27 週間までの試験を実施した。臨床試験を支持するための動物種として、カニクイザ ルを選択した。また、医薬品の承認申請を支持するための第二の動物種として、また市販用製剤原薬 の製造を外部製造所 Avecia 社からノボ ノルディスク社へ移管することを支持するため、ラットも使用 した。試験デザイン及び結果を含む反復投与毒性試験の要約を表 2.6.6-3 に示した。この表に続けて、 各試験の概要を示す。 表 2.6.6-3 反復投与毒性試験の概要と結果 試験番号 NN209517* NN209502 （GLP 非適用） （GLP 適用） SBi-1249-175* （GLP 適用） SBi-1394-175 （GLP 適用） SBi-1266-175 （GLP 適用） NN205255 （GLP 適用） 動物種 ラット ラット サル サル サル サル 投与経路 静脈内 静脈内 静脈内 静脈内 静脈内 静脈内 投与期間 <1 週間（5 日 間） 4 週間 <1 週間（試験 1 及び 4 日目） 2 週間 4 週間 13 及び 27 週間 投与間隔 1 回/日 1 回/日 1 回/3 日(72 時間) 1 回/日 1 回/2 週 1 回/2 週 用量 (mg/kg) 0、5、15 (NN DS) 0、1、5、15 （NN DS） 1、5（Avecia DS） 0、12.5、17.5 （Avecia DS） 0、0.3、3、6 （Avecia DS） 0、5、8、12.5 （Avecia DS） 0、1、3、10 （Avecia DS） 用量 (IU/kg)a 0、835、2505 0、167、835、 0、2088、2923 2505（NN DS） 167、835 （Avecia DS） 0、50、501、 1002 0、835、1336、 0、167、501、 2088 1670 試験物質中 rFXIIIa°含有 量(%) 0.16 0.16（NN DS） 0.16（Avecia DS） 0.26 1.02 0.26 0.53 動物数及び 性/群 雄 5b、雌 5b 雄 10b、雌 10b 雄 1～2、 雌 0～1 雄 3～5、 雌 3～5 雄 3～5、 雌 3～5 雄 3～5、 雌 3～5 15 [2505] 無毒性量 (mg/kg)/[IU/k g] 15 [2505]（NN DS） 5 [835]（Avecia DS） 確定せず 6 [1002] 8 [1336] 3 [501] 特記所見 NN DS の 15 mg/ kg 投与の雄、 Avecia DS の 1 及び 5 mg/kg 投 与の雌雄： 脾 臓における可逆 性のリンパ系細 胞過形成 。 所見なし。 17.5 mg/kg の 2 回投与（72 時間 間隔）：1 頭を除 いて全動物が死 亡又は状態悪化 のため安楽死処 置。死因は広範 な血栓症及び虚 12.5 mg/kg 投 与：1/6 頭に軽 微の腎糸球体変 化。 8 及び 12.5 mg/kg 投与の 雌：脾臓におけ 10 mg/kg 単回 投与後、1/30 頭が死亡。死 因は血栓症及 び虚血性壊 死。 所見なし。 19 of 57 試験番号 NN209517* NN209502 （GLP 非適用） （GLP 適用） SBi-1249-175* （GLP 適用） SBi-1394-175 （GLP 適用） 血性壊死（DIC に合致）。 rFXIII の 12.5 mg/kg での 2 回投 与（72 時間間 隔）：死亡な し。 SBi-1266-175 （GLP 適用） NN205255 （GLP 適用） る可逆性のリン パ系細胞過形 成。 a rFXIII は mg/kg 単位で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 b 主試験の動物のみを示す（トキシコキネティクス評価のための動物は含まない）。 参考資料。 *c 以下に示す各試験の包括的な要約を読み易くするため、すべての検査パラメータを一括した表とし て示し（表 2.6.6-16～表 2.6.6-23）、試験ごとには示していない。同様に、概要表には特記すべきパラ メータのみ要約した。この一括表を添付した目的は、評価項目に関する試験間比較を容易にするため である。 2.6.6.3.1 反復投与毒性：ラット ラットにおける DRF 試験（Module 2.6.7.6、試験番号 NN209517、参考資料） SD ラットにおける 4 週間反復投与毒性試験を支持するために、DRF 試験（GLP 非適用、重要でない 試験）を実施した。54 匹のラット（雌雄各 27 匹）から毒性検討用として雌雄各 5 匹／群を対照群及び 2 用量群に配分し、残り 12 匹（雌雄各 6 匹）をトキシコキネティクス検討に使用した（表 2.6.6-4 参 照）。試験開始時の週齢は、第 1 群及び第 2 群で約 8 週齢、第 3 群では 9～10 週齢であり、各群におけ る試験開始時の体重範囲は雄で 238.2～334.0 g、雌で 175.1～232.9 g であった。投与用量は rFXIII の 5 及び 15 mg/kg/日（835 及び 2505 IU/kg/日、臨床推奨用量の 24 及び 72 倍）であり、5 日間連続投与し、 その後 3 日間休薬した。 表 2.6.6-4 毒性及びトキシコキネティクスを検討した DRF 試験（試験番号 NN209517）におけ る投与群、用量及び動物数 試験群 用量（mg/kg） 用量（IU/kg）b 毒性／トキシコキネティクス用の動物数 1 0 0 雌雄各 5／雄雌各 0 835 雌雄各 5／雌雄各 6 2505 雌雄各 5／雌雄各 6 a 2 5 3 15a a b NN DS から製造した rFXIII を使用した。 rFXIII は mg/kg で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 以下の検査パラメータを評価した：一般状態の観察、死亡発現、体重及び摂餌量（表 2.6.6-16）、ト キシコキネティクス（表 2.6.6-17）、血液学的検査（表 2.6.6-18）、血液凝固検査（表 2.6.6-19）、尿検 20 of 57 査（表 2.6.6-21）、剖検及び器官重量（表 2.6.6-22）、病理組織学的検査（肺、脳、腎臓）（表 2.6.623）。 rFXIII 投与動物では全身性曝露が確認された。投与後 24 時間の FXIII 活性に雌雄差がみられ、雌動 物はより高い活性を示した。この雌雄差は投与 1 日目の投与前でも認められており、内因性 rFXIII レ ベルには雌雄差のあることが示唆された。 試験期間中、投与に関連する死亡はみられなかった。生存動物では投与に関連した毒性学的意義を 有する所見はみられず、また器官重量に対する影響も認められなかった。rFXIII の作用に起因する剖検 所見は認められなかった。病理組織学的検査では、15 mg/kg/日投与群の雄 1 匹に、対照群動物でみら れた背景変化（軽微）を上回る重症度（軽度）の限局性腎症が認められた。この所見の毒性学的意義 及び投与との関連性は不明である。本試験の後に実施したラットの 4 週間反復投与毒性試験では、限 局性腎症が対照群を含む各群で同程度に認められたことから、本試験における変化も投与との関連性 はないと考えられる。 全身性の毒性はみられなかったことから、無毒性量は rFXIII（0.15%の rFXIIIa°を含有）の 15 mg /kg/ 日とされた。 ラットの反復投与毒性試験 2 試験（試験番号 NN209517 及び NN209502）の全腎組織スライドについ て、外部病理専門家により再検討された。この結果、両試験でみられた限局性腎症はこのラットの系 統では通常みられる背景病変の範囲内にあり、投与との関連性はないと結論された（Module 4.2.3.2 Pathology expert report Rat）。 ラットにおける 28 日間反復静脈内投与毒性試験（Module 2.6.7.7.A、試験番号 NN209502） 本試験の目的は rFXIII を SD ラットに 28 日間連日反復静脈内投与し、rFXIII の毒性を検討すること であった。さらに、本試験の目的は、外部製造所 Avecia 社とノボ ノルディスク社の 2 箇所で酵母菌株 BJ2n-5-LA から製造された rFXIII 原薬について比較することであり、各原薬はノボ ノルディスク社に おいて最終製剤化処方された。市販予定製剤はノボ ノルディスク社で製造した原薬を用いて製剤化さ れる。品質文書は、Avecia 社及びノボ ノルディスク社で製造した原薬の製剤は同等であること、すな わち新規な原薬由来不純物はみられないことを示している。毒性の可逆性及び rFXIII 抗体について、 14 日間休薬することにより評価した。トキシコキネティクスは改変 Berichrom® 測定法による rFXIII 活 性に基づいて評価した。本試験における試験群、用量及び動物数の詳細を表 2.6.6-5 に示した。試験開 始時の動物は約 8 週齢であり、体重範囲は雄で 219～302 g、雌で 177～238 g であった。 21 of 57 表 2.6.6-5 ラット 4 週間反復投与毒性試験（試験番号 NN209502）における試験群、用量及び動 物数 試験群 試験製剤 a 用量（mg/kg）a 用量（IU/kg）b 主試験／回復試験／トキシコキネ ティクス用の動物数 1 対照（溶媒） 0 0 雌雄各 10／雌雄各 5／雌雄各 3 2 rFXIII（NN DS） 1 167 雌雄各 10／雌雄各 5／雌雄各 6 3 rFXIII（NN DS) 5 835 雌雄各 10／雌雄各 5／雌雄各 6 4 rFXIII（NN DS） 15 2505 雌雄各 10／雌雄各 5／雌雄各 6 5 rFXIII（Avecia DS） 1 167 雌雄各 10／雌雄各 5／雌雄各 6 6 rFXIII（Avecia DS） 5 835 雌雄各 10／雌雄各 5／雌雄各 6 a b Avecia DS については、製造量が限られていたため 15 mg/kg の用量の投与はできなかった。 rFXIII は mg/kg で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 動物は、一般状態の観察、体重、摂餌量及び眼科学的検査（表 2.6.6-16）、トキシコキネティクス及 び rFXIII 抗体の評価（表 2.6.6-17）、剖検及び器官重量（表 2.6.6-22 ならびに病理組織学的検査（表 2.6.6-23）でみられた変化に基づいて評価された。また、4 週間試験終了前（主試験動物）又は休薬期 間終了時（回復試験動物）に、血液学的検査（表 2.6.6-18）、血液凝固検査（表 2.6.6-19）、血液生化 学的検査（表 2.6.6-20）又は尿検査（表 2.6.6-21）を行い評価した。rFXIII 抗体評価のための血液サン プルは、投与前（-7 日）、4 週間試験終了時（主試験動物）及び休薬期間終了時（回復試験動物）に採 取した。トキシコキネティクス評価のための血液サンプルは、初回投与後及び 4 週間試験の最終投与 後 0.25、1、2、4、8 及び 24 時間に、サンプリングポイントごとに定めた各用量群の雌雄各 3/6 匹から 採取した。対照群動物のトキシコキネティクス用血液サンプルは、初回投与後及び最終投与後 2 時間 に採取した。全動物について、剖検及び病理組織学的検査を行った。 試験期間中、投与に関連した死亡発現はなく、一般状態観察、体重、摂餌量、眼科学的検査、器官 重量、血液学的検査、血液生化学的検査及び尿検査においても投与に関連した変化は認められなかっ た。各用量群の少数の動物で、血液学的検査、血液生化学的検査及び尿検査のパラメータに軽微な変 化がみられたが、それらの検査値は背景データの範囲内にあり、毒性学的意義はないと考えられた。 プロトロンビン時間（以下、PT）及び部分活性化プロトロンビン時間（以下、aPTT）の測定から示さ れたように、血液凝固系全体の活性化は認められなかった。rFXIII（NN DS 及び Avecia DS）投与群動 物では、フィブリンの血中レベルに軽微な変化が認められた。この変化に対応する臨床病理学的又は 病理組織学的所見は認められなかったことから、有害性変化ではないと考えられた。 rFXIII（NN DS）5 及び 15 mg/kg 群ならびに rFXIII（Avecia DS）5 mg/kg 群で全身性の曝露が確認さ れた。1 mg/kg 群では、血中のピークレベルはいずれも対照群の上限にあったものの、対照群に近い曝 露量であった。したがって、低用量群のトキシコキネティクスデータは決定的なものではないと考え られ、その解釈には注意が必要である。全身性曝露に雌雄差はなかった。4 週間投与での累積は、 22 of 57 rFXIII（NN DS）5 及び 15 mg/kg 群ならびに rFXIII（Avecia DS）5 mg/kg 群のいずれでも低かった（1.6 倍未満）。初回投与時の曝露には用量比以上の増大がみられたが、最終投与時ではほぼ用量に比例し ていた。高用量群の終末相の t1/2 のみが適切に決定され、6～10 時間であった。同用量で NN DS と Avecia DS の rFXIII を比較すると、全身曝露に差異は認められなかった。試験 1 日目及び試験 4 週目の 対照動物の FXIII 活性レベルから、DRF 試験と同様に、雌性ラットにおける内因性 FXIII 活性はより高 いことが示された。しかしながら、曝露及び薬物動態特性に雌雄差がみられなかったことから、解析 結果は rFXIII のクリアランスにも明らかな雌雄差はみられないことを示している。 ヒトの FXIII はラットでは異物であることから、投与試験終了時、FXIII 抗体が rFXIII（NN DS）の 1 mg/kg/日群で 8/20 匹、5 mg/kg/日群で 3/20 匹、rFXIII（Avecia DS）の 1 mg/kg/日群で 12/20 匹、5 mg/kg/日群で 1/20 匹に検出された。休薬期間終了時では、FXIII 抗体が rFXIII（NN DS）の 1 又は 5 mg/kg/日群でそれぞれ 9/10 匹及び 15 mg/kg/日群で 3/10 匹に、rFXIII（Avecia DS）の 1 mg/kg/日群で 10/10 匹及び 5 mg/kg/日群で 8/10 匹に認められた。 4 週間試験終了時の剖検で、rFXIII（NN DS）又は rFXIII（Avecia DS）の局所又は全身性作用による 所見は認められなかった。 病理組織学的検査では、脾臓におけるリンパ系細胞過形成が認められた。リンパ系細胞過形成の発 生頻度は、rFXIII（NN DS）の 15 mg/kg/日群の雄及び rFXIII（Avecia DS）の 1 又は 5 mg/kg/日群の雌 雄で高かった。この所見は白脾髄における胚中心が明瞭なリンパ濾胞の数的増加であった。総合的な リンパ系細胞過形成の重症度は、rFXIII（NN DS）の 15 mg/kg/日群の雄では rFXIII（Avecia DS）の 5 mg/kg/日群よりも低く、rFXIII（Avecia DS）の 1 mg/kg/日群と同程度であった。rFXIII（NN DS）の 1 又は 5 mg/kg/日群の雄及び 1、5 又は 15 mg/kg/日群の雌の脾臓は対照群と同様であった。 投与部位の組織反応は、対照動物、rFXIII（NN DS）及び rFXIII（Avecia DS）投与動物で同程度であ り、NN DS 又は Avecia DS から製造された rFXIII のいずれにも刺激反応を示唆する所見は認められな かった。 休薬期間終了時の剖検では、rFXIII（NN DS）及び rFXIII（Avecia DS）の局所作用又は全身性作用に 起因する所見は認められなかった。休薬終了時の病理組織学的検査では、rFXIII（NN DS）の 15 mg/kg/日群の雄及び rFXIII（Avecia DS）の 1 mg/kg/日群の雌雄又は 5 mg/kg/日群の雄でみられた脾臓の リンパ系細胞過形成の回復が認められ、rFXIII（Avecia DS）の 5 mg/kg/日群の雌でも回復傾向が認めら れた。 文献的に、抗原性を示す外来異物（たとえば蛋白）又は免疫刺激剤の注射により脾臓におけるリン パ系細胞過形成が誘発されることが知られている3, 4, 5, 6, 7。したがって、本試験でみられた脾臓のリン パ系細胞過形成は外来異物の静脈内投与に対する正常な反応であると考えられ、実施施設（Covance laboratories Ltd）で実施されたラットの試験ではしばしば認められている。変化は可逆性を示すことか らもこのことが支持される。 23 of 57 本試験条件において、死亡発現、致死性の有害反応又は病理組織学的所見は認められなかったこと から、28 日間反復投与のラットにおける rFXIII の無毒性量として、rFXIII（NN DS）の 15 mg/kg/日 （臨床推奨用量の 72 倍）及び rFXIII（Avecia DS）の 5 mg/kg/日（臨床推奨用量の 24 倍）が推察され た。 NN DS と Avecia DS の毒性プロファイルに明確な差異はみられなかった。 2.6.6.3.2 反復投与毒性：カニクイザル カニクイザルにおける rFXIII 静脈内投与による急性毒性試験（Module 2.6.7.7.B、試験番号 SBi-1249175、参考資料） 本試験は GLP 適用の急性毒性試験ではあるが、反復投与も行っていることから「反復投与毒性」に 要約する。DRF 試験を兼ねた本試験の目的は、rFXIII の毒性を評価すること及び計 4 回反復投与した ときのトキシコキネティクスプロファイルを明らかにすることであった。成熟若齢カニクイザル 10 頭 （雌雄各 5 頭、体重 2.7 ～5.1 kg）を 5 用量群に配分し、1 及び 4 日目に計画量を投与し、13 及び 14 日 にはその半量を投与する、計 4 回（1、4、13 及び 14 日）の rFXIII 投与計画であった。毒性（致死性） 用量反応曲線の立ち上がりが急であることから、投与計画を変更した。実際の投与用量を表 2.6.6-6 に 示す。投与ミスにより、第 2 群及び第 3 群の動物は試験 1 日目に計画用量とは異なる用量が投与された。 表 2.6.6-6 試験群 カニクイザル試験（試験番号 SBi-1249-175）における試験群、動物数／性、実際の投 与用量及び動物の生死 動物数／性 rFXIII 用量（mg/kg）[IU/kg]a 1 日目 b 4 日目 生死 観察期間 1 雄 1、雌 1 0 0 生存 15 日間 2 雄 1、雌 2 雌 1：12.5 [2088] 雌 1：13.1 [2188] 雄 1：14.5 [2422] 12.5 [2088] 12.5 [2088] 12.5 [2088] 生存 死亡 状態悪化により安楽死処置 15 日間 5 日目 5 日目 3 雄 1、雌 1 雄：17 [2839] 雌：17.4 [2906] 17.5 [2923] 17.5 [2923] 死亡 状態悪化により安楽死処置 5 日目 5 日目 4 雄1 21.9 [3657] - 状態悪化、安楽死処置前に死亡 1 日目 5 雄 1、雌 1 22.5 [3758] - 状態悪化、安楽死処置前に死亡 1 日目 a rFXIII は mg/kg で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 b 投与ミスにより第 2 群及び第 3 群の動物は試験 1 日目に計画用量とは異なる用量が投与された。 検討したパラメータの詳細：一般状態の観察（表 2.6.6-16）、トキシコキネティクス（表 2.6.6-17）、 血液学的検査（表 2.6.6-18）、血液凝固検査（表 2.6.6-19）、血液生化学的検査（表 2.6.6-20）ならびに 剖検（表 2.6.6-22）及び病理組織学的検査（表 2.6.6-23）の一覧に示した。 24 of 57 表 2.6.6-6 に詳細を示したように、1 日目に各群の動物に rFXIII 又は対照（溶媒）を投与した。生存 動物には 4 日目にも rFXIII 又は対照（溶媒）の 2 回目の投与を行った。投与動物の 7/8 頭に予期しえな かった死亡発現及び予定外の安楽死処置が必要となったことから、第 1 群（対照群）又は第 2 群の生 存動物に対し、当初計画した 13 日目及び 14 日目の投与は行わなかった。 rFXIII 投与動物の 1/8 頭、すなわち第 2 群で 1 日目及び 4 日目に 12.5 mg/kg を投与された 1 頭の動物 は生存し、15 日目に安楽死処置した。この動物では、臨床病理学的検査パラメータ又は剖検で投与に 関連した変化はみられなかった。rFXIII 投与に関連する可能性のある病理組織学的検査所見は、片側の 視神経における無細胞性顆粒状物質を伴った少数の毛細血管の軽微な拡張のみであった。この動物で は、小腸に出血及び壊死性残屑がみられ、投与との関連性はないと考えられたが、投与との関連性を 完全に除外することはできなかった。 7/8 頭の動物は死亡するか動物愛護の観点から安楽死処置された（表 2.6.6-6）。第 4 群及び第 5 群 （rFXIII の 21.9 及び 22.5 mg/kg 投与、それぞれ臨床推奨用量の 104 及び 107 倍）の動物は 1 回投与後に 死亡した。第 2 群及び第 3 群の動物は、4 日目に行った 2 回目の投与後死亡するか、状態悪化のために 5 日目に安楽死処置された。 死亡した又は早期に安楽死処置された 5/7 頭の動物には様々な一般状態の変化が認められた。これら の変化は、活動低下、円背様の外観、四肢冷感、粘膜蒼白化及び眼周囲浮腫であり、一般状態の悪化 が示唆された。ある動物では、初めに病的症状を発現した直後、突然虚脱状態となり、死亡した。2 頭 の動物は一般状態の変化を示すことなく 5 日目に死亡が確認された。 投与に関連した明らかな血圧、心拍数又は体温の変化は認められなかった。第 5 群の動物 1 頭には、 瀕死状態を反映して死亡前に体温低下がみられた。 早期に死亡した動物 4/7 頭では、安楽死処置前に血小板数の著しい減少（投与前値との比較）がみら れた。血液生化学的検査パラメータの変化（投与前値との比較）として、ALT、AST、LDH、BUN、 クレアチニン及び血糖値の増加ならびに総蛋白、アルブミン及びグロブリンの減少がみられた。一定 の傾向はないものの C 反応性蛋白の増加もみられた。これらの変化は、特に剖検前に採血した動物に おいて明らかであり、rFXIII の薬理作用が過剰に発揮されたことに起因する閉塞性血液凝固障害に付随 する広範な組織障害を伴う一般状態の悪化に続発したものであると考えられた。 少数の動物にフィブリノゲン、PT 及び aPTT のわずかな変動（投与前値との比較）がみられた。こ の変化は、広範な血栓症に続発する二次的な血液凝固因子の消費である可能性が考えられ、直接 rFXIII に起因するものとは考えられなかった。D-ダイマー及びフィブリノゲン分解産物（以下、FDP）の著し い増加（投与前値との比較）が数頭の動物に認められ、これらの動物でみられた広範な血栓症と線維 素溶解の亢進に合致するものであった。 死亡動物又は動物愛護の観点から安楽死処置した動物にみられた投与に関連した剖検所見は、副腎、 肺、気管などの多数の器官にみられた赤色変色又はその巣状変化であり、病理組織学的検査で血栓形 成に続発したものであることが確認された。湿性で重い肺は収縮が認められず、病理組織学的検査で 25 of 57 みられた肺胞浮腫と関連づけられるものであり、ショックに続発した二次的な変化である可能性が考 えられた。 概して、早期死亡動物における病理組織学的所見の重症度及び発生率は同様であった。rFXIII 投与に 起因する主要な病理組織学的病変は、多数の器官の小口径血管内にみられた均質・好酸性・無細胞 性・顆粒状の血栓形成であった。より大きな血管では細胞が混合した一様な波上斜交平衡紋様（ wavy crosshatched consistency）を示す典型的なフィブリン血栓がみられた。微小血管における血栓症は広 範な組織における虚血とそれに続く出血及び虚血性壊死をもたらした。 影響のみられた器官は、副腎、 腎臓、眼、肺、心臓、胃腸管、膵臓、脾臓、肝臓、脳、下垂体（神経性下垂体）、リンパ節、精嚢、 卵巣及び骨髄であった。投与に関連する剖検でみられた変化及び病理組織学的変化ならびに血液学的 検査及び血液生化学的検査のパラメータの変化はすべて、血栓形成とその後に続いた組織の虚血と壊 死によると考えられる二次的変化であった。しかしながら、組織の自己融解がみられた動物では、生 前の血栓症に続発する凝固壊死を鑑別することはできなかった。 死に至るまでの一連の想定される事象は、1）無細胞性顆粒状物質からなる血栓形成後、虚血及び壊 死の発生、2）続いて、壊死による組織因子を含む全身性の炎症性メディエータの放出と、それによる ショック、炎症及び血液凝固カスケードの活性化の招来であり、血液凝固カスケードの活性化は、大 きな血管における典型的なフィブリン血栓を形成し、その結果血栓症が拡大することになる。瀕死状 態の動物から死亡直前に採取した血液サンプルでは、DIC に合致する血液学的変化が認められた。こ れらの変化は、血小板数の減少、PT 及び aPTT の軽度延長及び D-ダイマー及び FDP の増加であった。 このことから、終末期事象として DIC を起こしていたことが考えられる。病理組織学的変化の像及び 提示した一連の事象は rFXIII/rFXIIIa の作用メカニズムに合致している。したがって、7/8 頭の早期死亡 動物でみられた広範な血栓症は、高用量の試験物質投与により過剰な薬理作用が発揮されたことを示 している。死亡直前にみられた白血球数及び C 反応性蛋白の増加は、組織壊死に続く全身性の炎症に 合致している。 rFXIII 単回投与後の総 A2（rA2、rA2B2、A2B2）のトキシコキネティクスでは、12.5～14.5 及び 17～ 17.4 mg/kg 投与動物でそれらの用量範囲に相当する C0 及び AUC0-72h の増加が認められた。rFXIII の 21.9 及び 22.5 mg/kg 投与動物では測定不能のポイントがあったため、トキシコキネティクスパラメー タは推定しなかった。 要約：第 2 群で rFXIII の 12.5 mg/kg（臨床推奨用量の 60 倍）を 1 及び 4 日目に投与された 1 頭の動 物は 15 日目の安楽死処置まで生存した。この動物では、投与に関連する可能性のある唯一の所見は片 側の視神経でみられた無細胞性・顆粒状物質を含んだ少数の毛細血管の軽微な拡張であった。rFXIII 投 与群のその他の 7 頭の動物は死亡するか、5 日目に動物愛護の観点から安楽死処置された。これら 7 頭 の動物の早期死亡に内在する病理学的変化は、rFXIII の高用量投与により過剰な薬理作用が発揮された ことに起因する多数の器官における血栓形成であった。多様な剖検所見及び病理組織学的検査所見は、 26 of 57 広範な血栓症に関連しており、血栓症は DIC に合致する形態学的特徴又は血管閉塞に対する rFXIII の 直接作用をもたらした。 カニクイザルにおける rFXIII の 1 日 1 回静脈内ボーラス投与による 14 日間反復投与毒性試験及び 30 日間回復試験（Module 2.6.7.7.C、試験番号 SBi-1394-175） 本試験（GLP 適用）の目的は、カニクイザルに rFXIII を 1 日 1 回、少なくとも 14 日間の静脈内ボー ラス投与による毒性を評価することであり、また、少なくとも 30 日間休薬により rFXIII 作用の回復性 を検討することであった。本試験では、32 頭の成熟若齢カニクイザル〔雌雄各 16 頭、試験開始時の年 齢（体重）範囲：雄 3.2～5.9 歳（2.8～5.3 kg）、雌 2.1～5.2 歳（2.2～3.2 kg）〕を使用した。動物は 4 群に配分し、rFXIII の 0、0.3、3 又は 6 mg/kg（0、50、501 及び 1002 IU/kg に相当）を 14 日間静脈内投 与した。試験群の詳細は表 2.6.6-7 に示す。 表 2.6.6-7 カニクイザルにおける 14 日間反復投与毒性試験（試験番号 SBi-1394-175）の試験群、 動物数／性、用量、投与容量、投与液濃度及び試験ごとの動物数 試験群 動物数 （雄／雌） 用量（mg/kg） 投与容量 [IU/kg]a （mL/kg） 投与液濃度 （mg/mL） 主試験動物数 （雄／雌） 回復試験動物数 （雄／雌） 1 5／5 0 1.2 0 3／3 2／2 2 3／3 0.3 [50] 0.06 5.0 3／3 - 5／5 3 [501] 0.6 5.0 3／3 2／2 3／3 6 [1002] 1.2 5.0 3／3 - 4 3 b a rFXIII は mg/kg で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 第 3 群には 1 又は 6 mg/kg のいずれかを投与する計画であった。第 4 群（3 mg/kg）で忍容性が認められたことから、 第 3 群の用量は 6 mg/kg とした。ただし、第 4 群（3 mg/kg）における忍容性の確認に時間を要したため、第 3 群への 投与は遅れて開始した。 -：回復試験群設定せず。 b 一般状態観察、体重、摂餌量、眼科学的検査、血圧、心拍数、体温及び心電図（表 2.6.6-16）、剖検 及び器官重量（表 2.6.6-22）ならびに病理組織学的検査（表 2.6.6-23）でみられた変化を評価した。血 液学的検査（表 2.6.6-18）は投与 3 及び 11 日目に行った。血液凝固検査（表 2.6.6-19）及び血液生化学 的検査（表 2.6.6-20）は、試験開始前、投与 1、8、14、28、35 及び 44 日目の投与前に行った。尿検査 （表 2.6.6-21）は、投与 1、8、14、28 及び 35 日目及び剖検時（膀胱穿刺）に行った。トキシコキネテ ィクス（表 2.6.6-17）の血液サンプルは投与 1 日目及びその後いくつかの投与日の 3 時点で採取した。 rFXIII 抗体（表 2.6.6-17）評価のための血液サンプルは、投与 1、8、14 及び 16 日目の投与前及び最終 安楽死処置前に採取し、また回復試験動物からも投与開始後 18、25、31 日目及び最終安楽死処置前に 追加を採取した。 24 頭の動物（雌雄各 3 頭／群）を最終投与後の 2 日目（試験開始後 16 日目）に安楽死処置した。第 1 群及び第 3 群における残りの動物（雌雄各 2 頭／群）は 4 週間休薬した。 27 of 57 カニクイザルは、rFXIII の 0.3、3 及び 6 mg/kg の 1 日 1 回、14 日間反復静脈内投与に対し忍容性を示 した。試験期間中、死亡はみられず、一般状態の観察、体重、摂餌量、バイタルサイン、眼科学的検 査、臨床病理学的検査（血液学的検査、血液凝固検査、血液生化学的検査）、尿検査、剖検及び病理 組織学的検査では投与に関連した変化は認められなかった。 試験期間中、3 mg/kg/日群の 2/10 頭及び 6 mg/kg/日群の 1/6 頭に FXIII 抗体価が認められた。3 mg/kg/ 日群では、回復試験終了時にも 1 頭に FXIII 抗体価が認められた。この動物の薬物動態プロファイルは 血漿中 A2B2 ヘテロテトラマーのクリアランス増大を示していた。 トキシコキネティクスに雌雄差はみられなかった。対照群を除くすべての用量の動物で rFXIII の曝 露が確認された。2 週間の投与で蓄積は認められなかった。 トキシコキネティクス解析から、rFXIII は投与後速やかに、遊離型カニクイザル FXIII B サブユニッ ト（B2）と遊離型 rFXIII（rA2）が複合体を形成し、ヘテロテトラマー（rA2B2）を形成することが示さ れた。rFXIII の 0.3 mg/kg/日（50 IU/kg/日）の反復投与では、投与後 24 時間までに遊離型カニクイザル FXIII B サブユニット（B2）血漿中濃度はベースラインに復した。rFXIII の 3 又は 6 mg/kg/日（501 又は 1002 IU/kg/日）群動物では、投与後 24 時間でも遊離型カニクイザル FXIII B サブユニット（B2）血漿 中濃度は有意に低かった。このことはヘテロテトラマー（rA2B2）の形成が間断なく起こっていたこと によると考えられた。 FXIII A2B2 ヘテロテトラマー（rA2B2、A2B2）の血漿中濃度は用量依存的に投与前値よりも増加し、 見かけ上投与 8 日にプラトーになった。ヘテロテトラマー形成のピークは投与後 24～72 時間であった。 血漿中 FXIII A2B2 ヘテロテトラマーのトラフ濃度は、用量依存的に投与前値よりも高くなることが示 され、見かけ上投与 8 日にプラトーになった。rFXIII の 0.3、3 及び 6 mg/kg 投与動物の血漿中 FXIII A2B2 ヘテロテトラマーのトラフ濃度は、投与 1 日目の投与前値よりもそれぞれ 5、8 及び 10 倍高くな った。投与間隔及び排泄速度から予想されたように、FXIII ヘテロテトラマーA2B2（rA2B2、A2B2）の 曝露（AUC0-24h）は投与 1～14 日の間で増大し、0.3、3 及び 6 mg/kg 投与の累積比はそれぞれ 4.41、 4.98 及び 4.41 であった。 投与 1 日目に比較して 14 日目の血漿中総 A2（rA2、rA2B2、A2B2）濃度の増加が認められた。rFXIII の 0.3、3 及び 6 mg/kg 投与動物の投与 1 日に対する投与 14 日の累積比はそれぞれ 3.60、1.71 及び 1.53 であった。用量の増加に伴って累積比は低下する傾向にあった。rFXIII 投与動物の血漿中総 A2（rA2、 rA2B2、A2B2）濃度のトラフ濃度は、用量依存的に高くなり、投与 8 日目にプラトーとなった。rFXIII の 0.3、3 及び 6 mg/kg 投与動物における血漿中総 A2 濃度のトラフ濃度は、投与 1 日目の投与前値より もそれぞれ約 6、11 及び 16 倍高くなった。 剖検で投与に関連する変化はみられなかった。病理組織学的検査で、対照群を含む各群で腎糸球体 に変化が認められた。この変化の特徴は、次項に示す毒性試験（試験番号 SBi-1266-175）でみられた 所見と同様に、糸球体における無晶形・均質性・好酸性物質貯留を伴うメサンギウム領域の拡大及び メサンギウムマトリクスの増加であった。これらの所見は糸球体のみにみられ、用量相関性はなく、 28 of 57 また対照群を含む各群で認められたことから、試験物質投与との関連性は考えられなかった。投与部 位の 1 箇所又は複数箇所で出血及び線維化が認められた。投与部位の血栓症が中間用量群においての み認められたが、投与に関連している可能性が考えられる。 精巣及び卵巣（黄体の存在）の成熟度から判定して、本試験群には性成熟の雄（13/16 頭）及び雌 （5/16 頭）が含まれていた（表 2.6.6-10）。雄動物で前立腺、精巣上体、精嚢及び精巣、雌動物では卵 巣、子宮（頸部を含む）、膣及び乳腺について組織学的検討を行った。概して生殖器には特記すべき 変化はなく、投与との関連性を示す所見は認められなかった。 結論：無毒性量は rFXIII の 6 mg/kg/日（臨床推奨用量の 29 倍）であり、試験物質中の rFXIIIa°含有 量は 1.02%であった。 カニクイザルにおける rFXIII の 4 週間反復静脈内投与毒性試験及び 4 週間回復試験（Module 2.6.7.7.D、 試験番号 SBi-1266-175） 本試験（GLP 適用）の目的は、カニクイザルに rFXIII を 2 週間に 1 回、計 3 回（試験 1、15 及び 28 日）静脈内投与（infusion）し、毒性及び 4 週間休薬期間中の rFXIII による影響の回復性を評価するこ とであった。本試験では試験前に投薬経験のないカニクイザル 32 頭（雌雄各 16 頭）を用いた。カニ クイザルの年齢範囲は 2～3 歳であり、体重範囲は雄で 2.4～2.9 kg、雌で 2.0～2.2 kg であった。各動物 に、rFXIII 又は対照（溶媒）を 2 週間に 1 回、3 回（試験 1、15 及び 29 日）静脈内投与（infusion）し た。動物は rFXIII の 0、5、8 又は 12.5 mg/kg を静脈内投与する 4 群に配分した。主試験群は雌雄各 3 頭／群からなる。さらに、対照群及び高用量群に雌雄各 2 頭/群を配分し、4 週間の回復性検討を行っ た。詳細を表 2.6.6-8 に示す。 表 2.6.6-8 サルの試験（試験番号 SBi-1266-175）における試験群、動物数／性、用量、投与容量、 投与液濃度及び試験ごとの動物数 試験群 動物数 用量（mg/kg） [IU/kg]a 投与容量 （mL/kg） 投与液濃度 （mg/mL） 主試験動物数（試験 開始 30 日安楽死処 置） 回復試験動物数（試 験開始後 58 日安楽死 処置） 1 雄 5、雌 5 0 2.5 0 雄 3、雌 3 雄 2、雌 2 2 雄 3、雌/3 5 [835] 1 5 雄 3、雌 3 - 3 雄 3、雌 3 8 [1336] 1.6 5 雄 3、雌 3 - 4 雄 5、雌 5 12.5 [2088] 2.5 5 雄 3、雌 3 雄 2、雌 2 a rFXIII は mg/kg で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 -：回復試験群設定せず。 一般状態観察（ケージサイドの観察：初回投与後 48 時間までは 3 回／日、その後安楽死措置までは 2 回／日）、体重（1 回／週測定）及び毎日の摂餌量（定性的評価）でみられた変化を評価し、血圧、 心拍数及び体温を試験開始前に 2 回、試験 2 及び 29 日の投与後 24 時間ならびに回復試験期間終了時に 29 of 57 測定した（以上、表 2.6.6-16）。トキシコキネティクス及び抗体産生の評価（表 2.6.6-17）、血液学的 検査（表 2.6.6-18）、血液凝固検査（表 2.6.6-19）及び血液生化学的検査（表 2.6.6-20）のための血液サ ンプルを、試験中多くの時点で採取した。各動物について完全な剖検を行い、定められた器官重量を 測定し、また定められた組織を採取・保存し、病理組織学的検査のために切片標本を作製して観察し た（表 2.6.6-22 及び表 2.6.6-23）。 試験期間中、死亡はみられなかった。一般状態の観察、体重、摂餌量、体温、血圧、心拍数、血液 凝固検査及び血液生化学的検査では rFXIII 投与に関連した影響は認められなかった。投与後 24 時間に、 一過性で散発性の血小板数の減少が数頭の rFXIII 投与動物に認められた。この変化は、その他の時点 ではみられず、用量相関性はなく、さらに関連するその他の評価項目に関連する反応は認められなか ったことから、rFXIII 投与との関連性はないと考えられた。 試験 28、43 及び 57 日目の検査で、FXIII 抗体は検出されなかった。 血漿中総 A2（rA2、rA2B2、A2B2）濃度の経時的データに関するトキシコキネティクスでは雌雄差は 認められなかった。 投与 1 日の総 A2 の濃度データは、用量に比例した総 A2 の C0 の増大、用量比例性 のない AUC0-inf の増大及び用量に比例した総 A2 クリアランスの低下を示した。投与前の内因性 FXIII A2B2 濃度に比較して、5、8 及び 12.5 mg/kg 投与後の FXIII A2B2 濃度には 2～3 倍の増加が認められたこ とから、時間とともに循環血中への遊離型 FXIII B サブユニット（B2）の誘導（産生）及び放出が起こ り、rA2B2 が形成される可能性が示唆された。 投与 1、15 及び 28 日に rFXIII の 5、 8 又は 12.5 mg/kg 投与後 6 時間で採取した血漿サンプルの測定 値を比較すると、総 A2 又は FXIII A2B2 濃度に累積又は免疫介在性クリアランスを示唆する兆候は認め られなかった。 主試験終了時（試験 30 日）の剖検及び器官重量測定では、投与に関連した変化は認められなかった。 少数の rFXIII 投与動物に、腎糸球体メサンギウムの軽微な肥厚が認められた。この所見に用量相関性 はなく、また先に示した試験（試験番号 SBi-1394-175）では同様の発生率及び重症度を示す所見が対 照群動物でも認められていたことから、rFXIII 投与との関連性は考えられなかった。投与と関連する可 能性のある所見として、糸球体に限定した軽度の変化が rFXIII の 12.5 mg/kg 群の 1/6 頭（雌）に認めら れた。この所見の特徴は、好酸性物質の増加と細胞充実度が増大したことによる糸球体血管の不明瞭 化であった。試験 30 日では、rFXIII の 8 及び 12.5 mg/kg 群の雌に脾臓におけるリンパ系細胞過形成の 発生率と重症度の軽度増大が認められた。試験 58 日の回復試験動物では、腎糸球体に変化はなく、脾 臓におけるリンパ系細胞過形成の発生率と重症度は rFXIII 投与動物と対照動物で同程度であり、この 脾臓におけるリンパ系細胞過形成と rFXIII 投与との関連性は考えられなかった。高用量投与の雌では、 投与部位に血栓が認められ、投与に関連するものと考えられる。 糸球体変化について詳細な検討するため、第 1 群、第 3 群及び第 4 群（rFXIII の 0、8 及び 12.5 mg/kg 群）のすべての雌動物の腎組織切片から、リンタングステン酸－ヘマトキシリン（PTAH）染色、 30 of 57 過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色及び過ヨウ素酸シッフ-ヘマトキシリン（PAS-H）染色及び 過ヨウ素酸銀（PA-銀）染色標本を作製した。これら染色標本の観察において、糸球体変化が認められた動物も含 め第 1 群、第 3 群及び第 4 群の間で組織学的差異は認められなかった。これらの観察から、糸球体には 血栓症及び免疫介在性の損傷はみられないことが示された。 本試験において、高用量群の雌 1 頭に糸球体変化がみられたことから、無毒性量は rFXIII の 8 mg/kg/2 週（臨床推奨用量の 38 倍）であり、試験物質中の rFXIIIa°含有量は 0.26%であった。 カニクイザルにおける反復投与毒性試験（試験番号 SBi-1394-175、SBi-1266-175 及び NN205255）の 腎臓について外部病理専門家によるピアレビューを行った結果、試験物質 rFXIII に関係する腎病変は みられないと結論された（Module 4.2.3.2 Pathology expert report monkey）。本試験（試験番号 SBi-1266175）において投与との関連性が考えられた糸球体変化は、試験番号 SBi-1394-175 にいて対照群動物を 含む他の動物でみられた変化と同様であると考えられた。これらの結果から、先に示した無毒性量に 対して、本試験の無毒性量は rFXIII の 12.5 mg/kg/2 週であると結論する。 rFXIII のカニクイザルにおける 27 週間間欠的静脈内投与試験及び 8 週間回復試験（Module 2.6.7.7.E、 試験番号 NN205255） 本試験（GLP 適用）の目的は、カニクイザルに rFXIII を 2 週間に 1 回反復静脈内投与し、毒性なら びに 13 及び 27 週の免疫原性及びトキシコキネティクスを評価し、さらに 8 週間休薬により試験物質に 関係する作用の可逆性を検討することであった。本試験では、52 頭の成熟若齢カニクイザル（雌雄各 26 頭）を用いた。試験開始時の週齢は 75～182（3～7 歳）であり、体重範囲は雄で 2.99～5.47 kg、雌 で 2.21～3.34 kg であった。動物は 0、1、3 又は 10 mg/kg（0、167、501 及び 1670 IU/kg 相当）の 6 試験 群に配分した。各試験群は雌雄各 3 頭又は 5 頭からなる。詳細な試験デザインを表 2.6.6-9 に示す。当 初、試験期間を第 1 群～第 4 群は 39 週間とし、第 5 群及び第 6 群の動物は投与 13 及び 27 週目に安楽 死処置する計画であった。しかしながら、FXIII 抗体価の上昇に相関して反復投与時の投与前 FXIII 活 性に低下がみられ、交差反応性抗体の産生が示唆されたことから、曝露への影響を回避するために全 群 27 週間投与後に試験を終了することとした。対照（溶媒）群及び高用量群（第 4 群～第 6 群）では、 主試験の動物に加え雌雄各 2 頭を配分し、8 週間の休薬後に安楽死処置した。 31 of 57 表 2.6.6-9 カニクイザルにおける反復投与毒性試験（試験番号 NN205255）の試験群、用量、投 与容量、投与期間、試験ごとの動物数 試験群 rFXIII の用量 （mg/kg）[IU/kg]a 投与容量 （mL/kg） 投与期間（週） 主試験の動物数 （雄／雌） 回復試験の動物数 （雄／雌） 1 0 2.0 27c 3／3 2／2 2 1 [167] 0.2b 27c 3／3 - 3 3 [501] 0.6b 27c 3／3 - 2.0 b 27 c 3／3 2／2 b 27 3／3 2／2 13 3／3 2／2 4 10 [1670] 5 10 [1670] 2.0 6 10 [1670] 2.0b a rFXIII は mg/kg で投与した。1 mg = 167 IU として求めた概算の IU/kg を示す。 投与液濃度：5 mg/mL。 c 第 1 群～第 4 群の当初計画投与期間は 39 週間であった。交叉反応性抗体の産生により投与は 27 週間で終了した。反復 投与時の投与前 FXIII 活性と抗体価には統計学的に負の相関性がみられた。 -：回復試験群設定せず。 b 一般状態観察、体重、摂餌量（目視評価）、眼科学的検査及び心電図（表 2.6.6-16）、トキシコキネ ティクス、FXIII 活性及び抗体の評価（表 2.6.6-17）、血液学的検査（表 2.6.6-18）、血液凝固検査（表 2.6.6-19）、血液生化学的検査（表 2.6.6-20）、尿検査（表 2.6.6-21）、剖検及び器官重量（表 2.6.6-22） ならびに病理組織学的検査（表 2.6.6-23）を行った。 トキシコキネティクスパラメータに雌雄差は認められなかった。1 及び 3 mg/kg の用量では累積はみ られなかったが、10 mg/kg では多少の累積が認められた。 すべての rFXIII 群で、初回投与（試験 1 日）及び反復投与（試験 13 及び 27 週）の投与後 0.5 時間ま で、血漿中の遊離型 FXIII B サブユニット（B2）濃度の著しい低下がみられた。多くの場合、血漿中の 遊離型 FXIII B サブユニット（B2）濃度は投与後 48～72 時間にベースライン（投与開始前の値）に復 した。 総 A2〔 rA2、 rA2B2、A2B2（酵素免疫吸着測定法、以下、ELISA）〕：rFXIII 投与後、用量とともに AUC 及び AUC0-48h の増大が認められた。限られたデータに基づくものではあるが、この増大に用量比 例性は認められなかった。rFXIII の反復投与では、用量に比例する AUC0-48h のわずかな増大が認められ た。高用量（10 mg/kg）では、わずかな AUC0-48h の増大が経時的に認められた。低用量（1 及び 3 mg/kg）では、一定の傾向を示す変化は認められなかった。これらの所見は、1 及び 3 mg/kg の用量で は明らかな累積（AUC0-48 h に基づく）がみられなかったのに対し、高用量（10 mg/kg）では累積がみら れたことを反映している。 A2B2〔rA2B2、A2B2（ELISA）〕：tmax は用量の影響を受けることなく、8～120 時間であった。rFXIII 単回投与後の AUC 及び Cmax に用量比例性はなかったもののわずかな増大が認められた。反復投与後の AUC0-48h 及び Cmax には試験 27 週の Cmax を除いて低下が認められたが、用量比例性はなかった。すべて 32 of 57 の用量で Cmax の経時的な低下が認められた。10 mg/kg 投与の雌を除いて、すべての用量で AUC0-48h の 経時的な低下が認められた。明確な雌雄差は認められなかった。 改変 Berichrom®測定法による FXIII（rA2、rA2B2、A2B2）活性：試験中の動物から採取された血液量 に限りがあったことから、投与前の採取サンプルについてのみ改変 Berichrom®測定法により FXIII 活性 を測定した。投与開始前の活性値に比較して、試験 15 日又は 29 日の投与前の血漿中 FXIII 活性に一過 性の上昇が認められたが、試験 7、13 及び 27 週の投与前の血漿中 FXIII 活性は低下を示した。投与開 始前の活性値に比較して、試験期間中の対照群動物及び抗体が検出されなかった第 4 群の 2 頭の動物 では血漿中 FXIII 活性に低下は認められなかった。 試験中の FXIII 抗体産生：試験 2 週（1/41 サンプル）及び 7 週（23/36 サンプル）に過半数の rFXIII 投与動物は抗体陽性となった。rFXIII 投与動物の 2 頭を除いて、すべての動物で抗体価が認められた。 しかしながら、3 頭の動物では rFXIII に対する特異性が確認できなかったことから、概要表にはこれら の動物は抗体陽性例として示さなかった。FXIII 抗体は休薬期間中にも認められた。統計学的解析によ り、FXIII 活性に及ぼす抗体価の影響は高い有意性（P<0.01）を有することが示された。改変 Berichrom®測定法で測定した反復投与時の投与前平均活性には明らかな低下がみられ、産生抗体は交叉 反応性であることが示唆された。しかしながら、ELISA で測定した全用量群の 総 A2 及び A2B2 に関す る曝露データ（AUC0-48h）から、試験 27 週でもすべての高用量投与動物では曝露が確認され、高用量 群で有意な免疫介在性の rFXIII のクリアランスはみられないことが示されたことから、本試験の妥当 性が確認された。 本試験において 2 頭の死亡がみられた、高用量（rFXIII 10 mg/kg）群の 1 頭の雄が初回投与後 4 日目 （試験 5 日）に死亡した。病理組織学的検査で、腎臓、心臓、肺及び副腎（うっ血、出血、血栓症及 び壊死）ならびに胸腺及びその他のリンパ組織（萎縮）など、多くの器官に変化が認められた。これ らの所見は、血栓症に関連する虚血性壊死（腎臓、心臓、肺及び副腎）及びストレス性変化（リンパ 組織）に一致するものであると考えられた。最も顕著な変化は腎臓でみられた出血及び再生尿細管を 伴う糸球体及び尿細管の重度かつ広範な壊死であり、おそらく毒血症及び循環障害をもたらすもので あった。この変化は rFXIII/rFXIIIa°の作用によるものと考えられた。試験 75 日に、低用量（1 mg/kg、 167 IU/kg 相当）群の雌 1 頭が、それに至るまでの 11 日間に 16%の体重減少を来して瀕死状態にあった ことから、安楽死処置した。病理組織学的検査から、この動物は腸炎を主として小膿瘍及び軽微な寄 生虫感染を伴う胃腸管障害を来していたことが判明した。この胃腸管の変化は rFXIII/rFXIIIa°の作用と 関連しないと考えられた。 rFXIII の 10 mg/kg 群の雄では、試験開始後 4 週間の体重増加量は他の用量群よりも低かった。rFXIII の 10 mg/kg 群のほとんどの雄で、試験 7 週にヘマトクリット及び試験 13 週に網状赤血球数のわずかな 減少が認められた。その他、一般状態観察、摂餌量、眼科学的検査、心電図、血液学的検査、血液生 化学的検査、尿検査、器官重量、剖検及び病理組織学的検査で変化はみられなかった。 33 of 57 各試験群には、精巣及び卵巣の成熟度から判定すると、性成熟に達した雌雄動物が含まれていた。 生殖器でみられた病理組織学的所見は、概して低発生率で病的意義の少ない、通常の背景所見のパタ ーンに一致するものであった。 結論として、rFXIII の 1、3 又は 10 mg/kg を 2 週間に 1 回、27 週間静脈内投与されたカニクイザルで は、10 mg/kg 群の 1/30 頭に初回投与後 4 日目に投与に関連した死亡がみられたが、それを除いて良好 な忍容性が認められた。死因は、 過剰な rFXIII/rFXIIIa の薬理作用が腎臓の血栓症及び虚血性壊死を招 来し、結果的に循環障害を来したことが考えられる。rFXIII の 10 mg/kg 群雄動物では体重増加量の減 少及び一過性のヘマトクリット及び網状赤血球数の減少も認められた。 結論：本試験における無毒性量は rFXIII の 3 mg/kg/2 週（臨床推奨用量の 14 倍）であり、投与され た rFXIII の rFXIIIa°含有量は 0.53%であった。 34 of 57 2.6.6.4 遺伝毒性 試験は実施しなかった。その科学的な妥当性は Module 2.4.4.2「遺伝毒性」に示した。 2.6.6.4.1 遺伝毒性 - in vitro 試験は実施しなかった。その科学的な妥当性は Module 2.4.4.2「遺伝毒性」に示した。 2.6.6.4.2 遺伝毒性 - in vivo 試験は実施しなかった。その科学的な妥当性は Module 2.4.4.2「遺伝毒性」に示した。 2.6.6.5 がん原性 がん原性試験は実施しなかった。カニクイザルの 27 週間反復投与毒性試験（Module 2.6.7.7.E、試験 番号 NN205255）において、細胞増殖又は血管新生増強の兆候は認められなかった。この試験は臨床推 奨用量 35 IU/kg/月の 48 倍の rFXIII 又は有効期間終了時規格値の 42 倍に相当する rFXIIIa°の用量で実施 したものである。目的とする臨床における rFXIII 投与ががん原性ポテンシャルに関する懸念を生ずる ものとは考えられない。ICH S6 ガイドラインに鑑みて、動物モデルにおける追加の必要はないと考え られる。さらなる科学的妥当性及び文献レビューの結果は Module 2.4.4.3「がん原性」に示した。 2.6.6.6 生殖発生毒性試験 毒性試験プログラムから生殖毒性に関連する懸念は特定されていない。授受胎能試験は実施しなか ったが、性成熟に達したラット及びカニクイザルが含まれる反復投与毒性試験における生殖器の病理 組織学的検査から、授受胎能を評価した。これら試験では生殖器に rFXIII 投与による影響は認められ なかった。さらに、生殖発生毒性試験を実施しなかったことに関する科学的妥当性は Module 2.4.4.4 「生殖発生毒性」に示した。 なお、2 種のカニクイザル反復投与毒性試験〔Module 2.6.7.7.C（試験番号 SBi-1394-175）及び Module 2.6.7.7.E（試験番号 NN205255）〕では、各試験群には性成熟動物が含まれていた。両試験合わ せて、雄性カニクイザルの 23/41 頭及び雌性カニクイザルの 26/41 頭が性成熟に達しており、それらの 生殖器の評価を行った（ 表 2.6.6-10）。これらの動物の生殖器には rFXIII 投与に関連する形態学的変化 は認められなかった。 35 of 57 表 2.6.6-10 カニクイザル反復投与毒性試験の 2 試験〔Module 2.6.7.7.C（試験番号 SBi-1394-175） 及び Module 2.6.7.7.E（試験番号 NN205255）〕における雌雄動物の性成熟 試験番号及び投与 SBi-1394-175: 14 日 間反復静脈内投与及 び 30 日間休薬 NN205255: 2 週間に 1 回 27 週間反復静 脈内投与及び 4 週間 休薬 試験群（用量：mg/kg）、動物数 a 雄 雌 未成熟 成熟 b 未成熟 成熟 b G1（0）、雌雄各 5 1 4 5 0 G2（0.3）、雌雄各 3 1 2 1 2 G3（6）、雌雄各 3 1 2 1 2 G4（3）、雌雄各 5 0 5 4 1 動物数（合計） 3 13 11 5 G1（0）、雌雄各 5 3 2 1 4 G2（1）、雌雄各 3 1 2 0 2c G3（3）、雌雄各 3 2 1 2 1 G4（10）、雌雄各 5 2 3 1 4 G5（10）、雌雄各 5 3 2 0 5 G6（10）、雌雄各 5 4 c 0 0 5 動物数（合計） 15 10 4 21 a 回復試験群動物を含む。 b 性成熟は組織学的に判定した。雄動物：精巣組織の組織学的完成度、雌動物：卵巣における黄体出現。 c 死亡動物（1 頭）を除く。 2.6.6.7 幼若動物を用いた毒性試験 rFXIII の補充療法は小児科集団に対して特定のリスクを有しないと考えられ、幼若動物を用いた試験 は実施していない。rFXIII の主たる標的器官は止血系である。FXIII に関し、FXIII A サブユニット及び FXIII B サブユニットは出生後 5 日には成人のレベルに達しており、この部分の血液凝固系は出生直後 に完成していると考えられている8。さらなる総合的レビュー及び本試験を実施しないことの妥当性の 検討結果は Module 2.4.4.5「幼若動物を用いた毒性試験」に示した。 2.6.6.8 局所刺激性 ラット及びカニクイザルにおける反復投与毒性試験において局所刺激性について評価した。概して、 反復投与毒性試験では局所反応が全くないか、又は軽微な局所反応がみられる程度であった。詳細は Module 2.6.7.7.A～E に示した。 血管周囲又は動脈内への意図しない rFXIII 投与による局所反応について、ニュージーランド白色種 ウサギを用いて評価した。本試験では、第 3 臨床相試験用の製剤バッチ（Avecia DS から製造した rFXIII 製剤）を用い、臨床適用経路である静脈内投与と比較検討した。12 羽のウサギを、投与経路ご とに各 4 羽用いた。動物の一側の耳の静脈内又は動脈内のいずれかに rFXIII の 0.35 mg/kg（58 IU/kg） 36 of 57 を、又は静脈周囲に rFXIII の 0.0313 mg/site（5.2 IU/site）を投与し、投与部位組織と反対側無投与耳の 投与部位に相当する部位の組織を病理組織学的に比較した。 結論：静脈内、動脈内又は静脈周囲への rFXIII 単回投与後 96 時間でみられた局所作用は、rFXIII の 作用に関連するものではなく、投与経路の違いに関係するものであると考えられた。各投与経路のい ずれにおいても rFXIII 投与に関連する所見は認められなかった〔Module 2.6.7.16（試験番号 NN205496）〕。 意図しない血管周囲又は動脈内への rFXIII 投与による局所反応について、ニュージーランド白色種 ウサギで評価した。本試験では、市販予定製剤（NN DS から製造した rFXIII 製剤）を用い、臨床適用 経路である静脈内投与と比較検討した。12 羽のウサギを用い、投与経路ごとに各 4 羽用いた。動物の 左側耳の静脈内、動脈内又は静脈周囲のいずれかに rFXIII 製剤（835 IU/mL）の 0.13 mL（34～41 IU/kg、 動物の体重範囲：2671～3169 g）を投与した。右側耳は比較対照として溶媒を投与した。左右の耳の注 射針刺入部位、刺入注射針の先端が接する部位及び注射針刺入部から 0.5～1 cm 離れた部位について、 病理組織学的評価を行った。 結論：動物ごとに rFXIII 製剤（835 IU/mL）の 0.13 mL/部位（34 ～41 IU/kg）の静脈内、動脈内又は 静脈周囲への単回投与により、概して軽微な局所反応が引き起こされた。rFXIII の静脈内投与後、注射 針刺入部位では対照（溶媒）投与よりもわずかに強い反応が認められた〔Module 2.6.7.16（試験番号 NN209504）〕。 結論：rFXIII の局所刺激性は非臨床試験で適切に評価され、許容範囲内のものであると考えられる。 概して、rFXIII の投与は局所反応を全く引き起こさないか、又は軽微な局所反応がみられる程度であっ た。 37 of 57 2.6.6.9 その他の毒性 2.6.6.9.1 抗原性 非臨床でみられる抗原性は、臨床で起こる可能性を予測するものではないと考えられる。 ラット及びカニクイザルの反復投与毒性試験において、免疫介在性クリアランスが試験終了時の曝 露に及ぼす影響及びそのことによる試験の妥当性を確認するため、rFXIII 抗体の評価を行った。ラット の 4 週間反復投与毒性試験及びカニクイザルの 27 週間反復投与毒性試験において、FXIII 抗体産生が認 められた。しかしながら、rFXIII 抗体が試験終了時の曝露に著しい影響を与えることはなかった。 詳細は Module 2.6.7.7.A（試験番号 NN209502）、Module 2.6.7.7.C（試験番号 SBi-1394-175）、 Module 2.6.7.7.D（試験番号 SBi-1266-175）及び Module 2.6.7.7.E（試験番号 NN205255）に示した。 2.6.6.9.2 メカニズム検討 現行の酵母菌株（BJ2n-5-LA）から製造された rFXIII について、特別なメカニズム検討は実施しなか った。 2.6.6.9.3 試験物質関連不純物 反復投与毒性試験において不純物の毒性学的評価を行った。詳細は Module 2.4.4.10「非臨床試験及び 臨床試験で使用された試験物質の同等性／同質性及び市販予定製剤の申請規格値」に示した。 2.6.6.9.4 その他 初期の酵母菌株（ZM146）で生産した rFXIII の毒性試験（Module 2.6.7.17、試験番号 HWA 2642-100、 HWA 2642-101、HWA 2642-102 及び SNBL.002.02） 初期の rFXIII 開発プログラムにおけるすべての非臨床計画では、初期の酵母菌株（ZM146）で製造 した rFXIII を用いてラット及びイヌにおける試験を実施した。しかしながら、本質的にこの rFXIII は 現行のものとは区別される。これらの毒性試験情報は rFXIII の各種薬事協議の議事録に引用されてい ること、また、これらの試験データから毒性発現に関係する rFXIIIa の役割が示されていることから、 情報提供のためにこれらの毒性試験の概要を本 CTD に含めることにする。試験結果の要約を表 2.6.611 に示した。 要約すると、ラットにおいて rFXIII は 15 mg/kg/日以上で良好な忍容性を示すが、雌性イヌでは 25 mg/kg の単回投与又は 10 mg/kg/日の 6 日間反復投与後、毒性（血栓症、虚血性壊死及び死亡）がみら れた。イヌの試験で使用した原薬バッチには 7.3%の rFXIIIa°が含まれており、ラットの試験で使用し た原薬バッチに含まれる rFXIIIa°（2.5%）に比較して高かった。 rFXIIIa に着目してラットを用いた一連のメカニズム試験を実施した（以下の Module で要約する）。 これらの試験から、イヌとほぼ同じ用量の rFXIIIa を投与したとき、ラットにおいても毒性（死亡）が 38 of 57 発現することが示された。また、これらのメカニズム試験から、主として rFXIIIa°が毒性発現に寄与す ると結論された。 rFXIIIa°低含有量（0.8%）の rFXIII バッチを用い、イヌ 2 週間反復投与毒性試験を繰り返し実施した。 この rFXIII バッチでは 15 mg/kg/日以下で忍容性が認められた。イヌにおいて 20 mg/kg/日以上の用量を 少なくとも 6 日間連続投与後にみられた毒性には、免疫複合体が介在する毒性（血管炎、血栓症、虚 血性壊死及び死亡、又は腎糸球体変化）が関与している可能性が考えられた。 さらに、 rFXIII（0.26%の rFXIIIa°含有）の 12.8 又は 25.5 mg/kg の用量で雌性カニクイザルの単回投 与毒性試験を実施した。rFXIII の 25.5 mg/kg 投与動物は瀕死状態となったため、動物愛護の観点から安 楽死処置した。この動物の病理組織学的検査では、広範な血栓症と虚血壊死が認められた。 表 2.6.6-11 初期の酵母菌株（ZM146）で製造した rFXIII を用いたラット及びイヌの反復投与毒性 試験ならびにカニクイザルの単回投与毒性試験の要約 試験番号 HWA 2642-101 HWA 2642-100 HWA 2642-102 SNBL.002.02 動物種 ラット ビーグル犬 ビーグル犬 カニクイザル rFXIII（ZM146） rFXIII（ZM146） rFXIII（ZM146） 被験物質（酵母菌株） rFXIII（ZM146) バッチ No. F249127 F249124 FE92007X FC93001X rFXIIIa°含有量(%) 2.5 7.3 0.8 0.26 投与経路 静脈内 静脈内 静脈内 静脈内 用量（mg/kg） 0、1、5、15 0、5、10、25 0、5、15、20、25 12.8、25.5 動物数／群 雌雄各 5～10 雌雄各 3 雌雄各 1～3 雌1 投与期間 2 及び 4 週間 2 週間 2 週間 単回投与、2 週間観察 投与間隔 1日 1回 1日 1回 1日 1回 1日 1回 無毒性量 (mg/kg) 15 5 15 <12.8 これらの結果、rFXIIIa°含有量が低くかつ含有量変動の少ない rFXIII を製造するため、酵母菌株を ZM146 から BJ2n-5-LA へ変更し、そのため製造法も変更された（Module 2.3.S.2.6「製造工程の開 発」）。 初期の酵母菌株（ZM146）から製造された rFXIII で得られた成績に基づく rFXIIIa が毒性の主要因であ ることを支持するメカニズム試験 rFXIII 投与の雌性イヌに予測不能な急性的な致死性の毒性〔Module 2.6.7.17（試験番号 HWA 2642100）〕がみられたことから、rFXIII の開発会社 Zymogenetics では毒性の原因を検討するための一連の 社内試験を実施した。イヌの試験と同様の投与計画で処置されたラットでは、概してイヌと同じタイ プの毒性反応が認められたことから、rFXIIIa が毒性の原因であるとの仮説を立て、検証した。 39 of 57 考慮した条件は以下のとおりである。 - 毒性は、ラットの反復投与毒性試験（HWA 2642-101）ではみられず、イヌの反復投与毒性試験 （HWA 2642-100）で認められた。 - これらの試験で使用された 2 種のバッチに注目すると、最初のイヌの試験で使用されたバッチ （F249124）の rFXIIIa°含有量はこの時期に製造された他のバッチと比較して高かった（表 2.6.612）。 以上のことから、rFXIIIa°含有量がイヌでみられた毒性の主要因であると推察された。 表 2.6.6-12 初期の酵母菌株（ZM146）から製造されたバッチのラット又はイヌにおける用量に 対応する rFXIIIa°含有量及び試験結果の要約 バッチ rFXIII 用量 （mg/kg） rFXIIIa° 含有量 rFXIIIa°用量 (%) （mg/kg）a 動物種 結果 b 試験番号 F249124 25 7.3 1.83 イヌ 毒性あり HWA 2642-100 26.57 7.3 1.95 ラット 毒性あり KHS91003 25 9.2 2.30 ラット 毒性あり KHS92002 10 9.2 0.92 ラット 毒性なし KHS92002 15 2.5 0.38 ラット 毒性なし HWA 2642-101 31.7 2.5 0.79 ラット 毒性なし KHS92001R F249130 26.5 13.2 3.5 ラット 毒性あり KHS92003 FA92001X 28.5 4.0 1.14 ラット 毒性あり KHS92006 F219101 16.91 5.7 0.97 ラット 毒性なし KHS92006 FA92001X 22.46 3.9 0.88 ラット 毒性なし KHS92006 FA92003X-1 32.03 1.2 0.38 ラット 毒性なし KHS92006 FB92003X-2 31.52 1.2 0.24 ラット 毒性なし KHS92006 FB92003X-3 33.92 1.6 0.56 ラット 毒性なし KHS92006 FB92003X-4 27.82 1.0 0.29 ラット 毒性なし KHS92006 FC92005X-1 26.57 0.7 0.19 ラット 毒性なし KHS92006 FD92006X 35.05 0.8 0.30 ラット 毒性なし KHS92006 FE92007X 44 0.8 0.36 ラット 毒性なし KHS92007 F249127 a 各バッチの rFXIIIa°含有量（%）は、rFXIII 活性を蛍光ストップアッセイ（fluorometric stop assay）で測定し、トロンビ ン存在下の rFXIII 活性に対するトロンビン非存在下の rFXIII 活性の比を求めた。表示した値は、各試験の被験物質の 用量を基に計算した。 b 投与されたバッチごとの単回又は反復投与試験の結果を示した。「毒性あり」は単回投与で死亡又は反復投与で所見 が認められたことを示し、「毒性なし」は毒性症状がなく忍容性が認められたことを示す。 40 of 57 ラットにおける最初の試験〔Module 2.6.7.17（試験番号 KHS91003）〕において、バッチ F249124 （試験番号 HWA 2642-100 で使用）の 26.57 mg/kg の静脈内投与は、イヌの試験と同じように致死性で あることが示された。ラットにおける毒性の経過は非常に急速であった。 努力性呼吸が主たる症状で あり、多くの場合、投与後 3 時間未満に発現した。ラットでは、呼吸困難を来した後 10 分以内に死亡 した。剖検では、主要な変化として肺における液体貯留を伴う重度のうっ血が認められた。血小板数 の減少がみられることもあった。また、AST、BUN 及びクレアチニンの高値が認められた。この臨床 病理学的な様相はイヌでみられた変化に極めて類似していた。イヌと相違する主な点は、ラットでは、 雌雄とも同程度に影響を受けたように考えられること、症状発現が早く急速に進展すること及び主要 な標的器官が肺であったことであり、それに対してイヌの肺が影響を受けることはなかった。イヌと 相違して、ラットでは腹部器官における広範な出血の兆候はみられなかった。 rFXIII 製造バッチの 25～44 mg/kg をラットに投与した一連の試験から、毒性は各バッチの rFXIIIa°含 有量に相関することが見出された〔Module 2.6.7.17（試験番号 KHS92001R、KHS92002、KHS92003、 KHS92006 及び KHS92007）〕。クロマトグラフィーで FXIIIao を除去した 2 バッチ（F249124 及び F249130）の精製品をそれぞれラットに投与したとき、毒性は認められなかった〔Module 2.6.7.17（試 験番号 KHS92003 及び KHS92004）〕。これらの精製品を室温で 4 週間放置すると再び FXIIIao 含有量 が増加するが、これをラットへ投与すると毒性が発現した〔Module 2.6.7.17（試験番号 KHS92003）〕。 さらに、rFXIIIa の毒性を検討するために、rFXIII をトロンビンで活性化した（rFXIIIa*）。rFXIIIa° 低含有量の rFXIII バッチ（FC92003X）にこの rFXIIIa*を添加して rFXIIIa を増量し、これを用いてラッ トにおける用量反応性検討試験を実施した〔Module 2.6.7.17（試験番号 KHS92005）〕。rFXIIIa*を添 加した rFXIII バッチの適正な用量では、バッチ F249124 及び F249130 でみられた毒性が再現された。 用量反応性を表 2.6.6-13 に示す。 41 of 57 表 2.6.6-13 rFXIII の 30～35 mg/kg 投与によるラットの試験（KHS92005）における rFXIIIa*含有 量増加に対応する死亡発現時間 rFXIIIa*用量（mg/kg） 雄性ラットの死亡発現時間 雌性ラットの死亡発現時間 対照（溶媒） 全例生存 全例生存 0.55 全例生存 全例生存 1.18 全例生存 2 匹生存、3 回及び 4 回投与後各 1 匹死亡 1.58 1 回投与後 1 匹、2 回投与後 3 匹死亡 2 回投与後 2 時間に 1 匹、それより遅れて 3 匹死亡 2.07 1 時間未満に死亡 1 時間未満に死亡 2.25 2 回目投与後 2 時間未満に 3 匹、投与直後に 1 1 時間未満に死亡 匹死亡 2.35 1 時間未満に 3 匹、6 時間に 1 匹死亡 1 時間未満に死亡 3.29 30 分未満で死亡 30～90 分に死亡 毒性発現に関わるトランスグルタミナーゼ前駆体である rFXIII の役割を検討するため、ラットに rFXIIIa*のみを投与した〔Module 2.6.7.17（試験番号 KHS92008）〕。rFXIIIa*の用量反応性は先に実施 した rFXIIIa（rFXIIIa*又は rFXIIIa°）で認められたものと類似していた（表 2.6.6-14）。このことはラ ットでみられた毒性反応にトランスグルタミナーゼ前駆体である rFXIII それ自身は関与していないこ とを示唆している。しかしながら、トランスグルタミナーゼ前駆体である rFXIII が in vivo で活性型に 変換され、バッチ F249124 及び F249130 でみられた毒性に寄与していた可能性は否定できない。 42 of 57 表 2.6.6-14 トランスグルタミナーゼ前駆体（rFXIII）存在下又は非存在下での rFXIIIa による毒性 比較 a rFXIIIa（mg/kg）＋トランスグル 1 回投与後の毒性 b タミナーゼ前駆体（rFXIII）30～ 35 mg/kg トランスグルタミナーゼ前駆体 1 回投与後の毒性 c （rFXIII）非存在下での rFXIIIa 投 与（mg/kg） 対照（溶媒） 0/4 対照（溶媒） 0/4 0.55 0/4 0.41 0/4 1.18 0/4 0.75 0/4 1.58 4/4 1.33 0/4 2.07 4/4 1.92 3/3 2.25 4/4 - - 2.35 4/4 - - 3.29 4/4 - - a トランスグルタミナーゼ前駆体（rFXIII）の存在下又は非存在下で表示用量の rFXIIIa を静脈内投与した。毒性は投与 動物数に対する症状又は死亡が発現した動物数で示す。 b 試験番号 KHS92005 の試験データ。 c 試験番号 KHS92008 の試験データ。 要約すると、rFXIIIa 高含有 rFXIII バッチは雌雄の SD ラットに対し毒性を発現することが示された。 12 バッチの rFXIII のスクリーニング試験から、毒性は投与時の rFXIIIa°含有量と相関することが確認 された。クロマトグラフィーで rFXIIIa°を除去すると毒性は消失するが、rFXIIIa°を増加させると毒性 も復活した。さらなる詳細な用量反応試験では、rFXIII をトロンビンで分解して rFXIIIa*を産生し、ト ランスグルタミナーゼ前駆体 rFXIII の存在下又は非存在下で種々の用量で毒性を検討した。rFXIIIa*投 与後にみられた毒性は、同量の rFXIIIa°含有 rFXIII バッチの毒性と同様であった。雌性ラットにおける 単回投与による無影響量は rFXIIIa（rFXIIIa*又は rFXIIIa°）の 1.1 mg/kg であった。反復投与による無 影響量は rFXIIIa（rFXIIIa*又は rFXIIIa°）の 0.5～1.1 mg/kg の間であった。 43 of 57 2.6.6.10 考察及び結論 rFXIII 及び活性型 rFXIII の病態生理学的仮説 単回投与（急性）及び反復投与後みられた毒性所見は単一の作用メカニズムに合致しており、FXIIIa の架橋形成の役割と密接に関連している。高用量の rFXIII/rFXIIIa は in vivo での蛋白架橋を形成させる ことにより、血漿中高分子蛋白複合体（以下、HMEX）を形成し（例えばフィブリノゲン α 及び γ、フ ィブロネクチン）、血漿の粘性を高め、微小微血管系に捕捉され、虚血壊死をもたらす閉塞性凝固障 害を引き起こす。この作用様式は血液凝固カスケードの活性化を招来し、終末期事象として DIC へと 導く。In vivo では、1 試験（試験番号 SBi-1249-175）において組織の虚血及び壊死へと続く無細胞性の 顆粒状物質からなる血栓形成が認められた。これに続いて、壊死は組織因子を含む全身性の炎症性メ ディエータの放出を促し、それによってショック、炎症及び血液凝固カスケードの活性化を来し、広 範な血栓症に至る大血管の典型的なフィブリン血栓がもたらされる。 文献的に、活性型 FXIII は蛋白を架橋結合させて複合体を形成させることが報告されている9,10。この ことから、rFXIII の血漿蛋白架橋形成能について in vitro 及び in vivo で検討した。 In vitro での rFXIII の実験において、rFXIIIa*及び rFXIIIa°は濃度依存的かつ臨床使用濃度と同様の様 式でフィブリノゲンを架橋形成させることが示された（2～50 µg/mL、すべての rFXIII が活性化された 場合、臨床推奨用量 35 IU/kg 投与時の濃度の 0.4 から 10 倍に相当）。高濃度（400 µg/mL 以上、臨床推 奨用量 35 IU/kg 投与時濃度の 80 倍）では、rFXIII は単独でもフィブリノゲンを架橋形成させることが 示された〔Module 2.6.3.2（試験番号 RES-FXIII-0063）〕。 Ponce ら11は、in vivo での血漿蛋白の架橋形成について、カニクイザルの急性毒性試験及び薬物動態 試験から得られた血漿を用いて検討した。この検討では、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （SDS-PAGE）、ウェスタンブロッティング及び N 端シークエンシングが行われた。rFXIII を静脈内投 与されたカニクイザルでは、130 kDa よりも大きな分子量の複数のバンドがみられ、このバンドはフィ ブリノゲン α 鎖及び γ 鎖の単鎖若しくは α2-アンチプラスミン、α2-マクログロブリン及びフィブロネク チンが結合物した種々のオリゴマーを含むものと考えられた。用いた分析方法は定性的なものである が、概してより高用量の rFXIII を投与されたサルでは容易に検出された。 さらに、Schaal-Jensen ら12,は、安全性バイオマーカー開発を目的としてヒト及びカニクイザルの血漿 中 HMEX の特性検討を行った。カニクイザルの 27 週間反復投与毒性試験（試験番号 NN205255）から 得られた血漿及びヒト血漿に rFXIIIa*を添加した系で、SDS-PAGE、銀染色、ウェスタンブロッティン グ及び定量的強化ランタニド蛍光免疫測定法（quantitative dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay）による検討を行った。ヒトとカニクイザルの HMEX はよく似ていた。カニクイザ ルにおいて、循環血中 HMEX 濃度は rFXIII 投与後 1 時間以内で最大レベルに達し、24 時間以上維持さ れた。250 kDa よりも大きな HMEX にはフィブリノゲン α 鎖及びフィブロネクチンが含まれていた。 フィブリノゲン γ 鎖は 250 kDa よりも小さな HMEX 中で検出された。カニクイザルにおける in vivo の 検討において、HMEX の出現と rFXIII 投与との間には非線形性の相関がみられ、rFXIII の 1～3 mg/kg 44 of 57 投与では 3 倍の HMEX 増加がみられたのに対し、rFXIII の 3～10 mg/kg 投与では 40 倍の HMEX 増加が 認められた。用量に対する HMEX 増加の非線形性は、急性毒性試験で立ち上がりの急な用量反応曲線 がみられたことに一致している。重要な試験である第 3 相臨床試験（NN1841-1725 試験）では安全性 調査のバイオマーカーとして HMEX を組み入れているが、ヒトにおける 35 IU/kg/月投与したときの HMEX のレベルは概して定量下限よりも低かった。 状態悪化を来して死亡する直前の動物から得られた血漿サンプルでは、DIC に合致する血液学的変 化が認められた。これらの変化は血小板数の減少、PT 及び aPTT の短縮ならびに D-ダイマー及び FDP の増加であった。したがって、終末期事象として DIC を来していた可能性が極めて高い。古典的な DIC の概念には、凝固・線溶系の不均衡を介して全身性のトロンビン及びプラスミン産生に関わる制 御系の喪失が含まれている13。rFXIII による毒性は、虚血性組織損傷に先行して、血漿中蛋白の架橋結 合による複合体形成とそれに続く二次的な全身性凝固カスケードの活性化によって引き起こされるも のであることから、診断のためにトロンビン活性化の確認を試みても、初期の rFXIII を介する変化を 検出することは期待できない。要約すると、カニクイザルへの単回投与（急性）及び反復投与後にみ られた毒性（血栓症、虚血性壊死及び死亡発現）は、FXIIIa の架橋形成の役割と HMEX 形成に関係す るものであり、その結果血管閉塞が引き起こされたものと考えられる。続いて、虚血及び細胞の損傷 が起こり、血液凝固カスケードが活性化されて、最悪のケースでは致死性の DIC を来すことになる。 病理組織学的検査所見、臨床病理学的変化及び血漿中 HMEX 存在との相互関係は、前述した毒性事象 の連続性を支持している。以上のように、高用量での死亡発現を含む毒性は、予期された rFXIII 又は rFXIIIa の過剰な薬理作用によるものであることを示している。 腎臓の変化は rFXIII 投与に関連するものとは考えられない 腎糸球体変化／限局性腎症は、いくつかの試験において通常みられる背景病変としてみられたもの であるが、カニクイザルの反復投与毒性試験の 1 試験では、糸球体変化は投与に関連する可能性があ ると考えられると記述した。腎糸球体変化／限局性腎症に関する過大又は過少な評価を避けるため、 カニクイザルの反復投与毒性試験（試験番号 SBi-1394-175、SBi-1266-175 及び NN205255）及びラット の反復投与毒性試験（試験番号 NN209517 及び NN209502）における腎臓の組織標本について、腎臓を 専門とする外部病理学者によるピアレビューを行った。ピアレビューの結論は、試験物質 rFXIII に関 連する腎病変はみられないこと、また、試験番号 SBi-1266-175 の試験で投与との関連性が考えられる と報告された糸球体変化は、試験番号 SBi-1394-175 の試験の対照動物を含む他の動物でみられたもの と同様の変化であると考えられた。ラットにおける DRF 試験の高用量でみられた限局性腎症もまた一 般的にみられる背景病変であると考えられた。これらのことを踏まえ、ラットにおける DRF 試験（試 験番号 NN209517）の無毒性量を 15 mg/kg/日、サルにおける 4 週間反復投与毒性試験（試験番号 SBi1266-175）の無毒性量を 12.5 mg/kg/2 週と結論する。詳細は、Module 4.2.3.2 Pathology expert report Rat 及び Module 4.2.3.2 Pathology expert report monkey に示した。 45 of 57 イヌにおける初期の酵母菌株で生産した rFXIII の 14 日間連続投与でみられた腎糸球体変化（試験番 号 HWA 2642-100 及び HWA 2642-102）は、以下に示す理由で安全性の懸念を有さないと考えられた。 すなわち、イヌで糸球体変化がみられた用量（20 mg/kg 以上、0.8%の rFXIIIa°含有）は、カニクイザル における最小致死用量〔72 時間間隔での 12.5 mg/kg の 2 回投与：0.26%の rFXIIIa°を含有（試験番号 SBi-1249-175）、又は、10 mg/kg 単回投与：0.53%の rFXIIIa°を含有（試験番号 NN205255）〕を超える ものであった。さらに、イヌでみられた糸球体変化は免疫複合体が介在している可能性が考えられる、 種特有の変化であった（試験番号 HWA 2642-100）。 脾臓におけるリンパ系細胞過形成について ラットの 4 週間反復投与毒性試験（試験番号 NN209502）及びカニクイザルの反復投与毒性試験の 1 試験（試験番号 SBi-1266-175）において、脾臓にリンパ系細胞過形成がみられた。リンパ系細胞過形 成は、外来蛋白をラット 3,4,5,6,7 及びサル,14,15,16 に投与したとき、通常みられる免疫学的反応である。 rFXIII 抗体産生と脾臓のリンパ系細胞過形成との間に直接的な相互関係はみられなかったが、宿主酵母 菌株由来蛋白又は原薬関連不純物に対する抗体産生を反映している可能性がある。この所見は可逆性 であり、有害反応ではないが異物蛋白（ヒト型 rFXIII 又は宿主細胞蛋白）に対する適応反応であると 考えられる。 トキシコキネティクスにおける雌雄差 ラット及びサルにおける rFXIII の薬物動態特性には明らかな雌雄間の差は認められなかったが、雄 性ラットよりも雌性ラットはより高い内因性 FXIII 活性を示す傾向にあった。 しかしながら、ヒトでは全身の FXIII レベルに性差はなく、重要な臨床試験（F13CD-1725 試験）に おいて、18 例の女性患者及び 23 例の男性患者にそれぞれ 202 回及び 269 回 rFXIII を投与して比較した 場合、投与前と投与後の rFXIII 活性に性差を示す統計学的な兆候はなかった。女性患者では、投与前 及び投与後 1 時間の FXIII 活性の平均値は数字の上では高かったが、統計学的に有意差はなく、対応す る患者間の標準偏差よりもかなり小さいものであった。 雌雄のイヌにおける毒性の特異性及びイヌの妥当性に関する考察 限られたデータに基づくものであるが、rFXIII の毒性に対して雌性イヌは雄性イヌよりも高い感受性 を示すようであった。雌性イヌが高感受性であることを立証することはできなかった。しかしながら、 本試験における性差を免疫反応に基づいて説明しようとするならば、「性はイヌの免疫病における最 も一般的な第二の補助因子である」と記載している文献情報17に合致する。さらに、イヌにおける自己 免疫性溶血性貧血及び全身性紅斑性狼瘡（SLE）の性素因は雌性であり18、また、スルフォンアミド治 療による免疫介在性の多発性動脈炎には性差が認められる19。 イヌにおける rFXIII 反復投与でみられた遅発性死亡の原因として、免疫複合体沈着の影響を受けて 血管損傷が招来された有害作用が考えられ、腎糸球体及び小血管は免疫複合体沈着の好発部位である 46 of 57 （試験番号 HWA 2642-100 における 10 mg/kg 投与ならびに試験番号 HWA 2642-102 における 20 及び 25 mg/kg 投与）。これに対し、イヌの最初の試験（試験番号 HWA 2642-100）の 25 mg/kg でみられた早期 死亡は免疫複合体の沈着によるものとは考えにくく、本試験で使用した試験物質バッチは高濃度 （7.3%）の rFXIIIa°を含有していたことから、活性型 rFXIII で起こされた腎及び副腎の HMEX 沈着に より始まった可能性が考えられる。 イヌの早期死亡及び遅発性死亡でほぼ同じような病理組織学的所見がみられることは、血管損傷に 至る血管反応の範囲は限定されていることに一致しており20、このことから、蛋白複合体（HMEX）及 び免疫複合体のどちらも同様の形態学的病変を招くことが考えられる。 イヌの血管壁への免疫複合体沈着による静脈炎及び動脈炎はよくみられる病変であり、イヌは薬物 誘発性血管損傷を発症し易いと考えられている21,22。イヌにおける静脈炎及び動脈炎は他の生物製剤で もみられている（タクロリムス®23、Revasc® 24及びアルブミン25）が、その他の非臨床試験で使用され る動物種ではみられない。これらの報告書は、「イヌはヒトよりも動脈炎形成易感受性である」とす るレギュラトリーコミュニティの見識と合致している26。 29 感作前の結果としての免疫学的反応は、イヌにおける活性化第 VII 因子27,28及び第 IX 因子 の反復投 与でもみられており、類似の反応が最初の試験（試験番号 HWA 2642-100）において用量が変更された 雄性イヌでも認められた。これらの反応はイヌにおいてヒトの分子は異物であることを反映している のみであることから、イヌはヒト血液凝固因子産物の毒性評価に適切な動物種ではないことを示して いる。 現行の酵母菌（BJ2n-5-LA）で製造した rFXIII を用いてラット及びカニクイザルで実施した非臨床試 験では毒性に性差は認められなかった。現行の酵母菌で製造した rFXIII を用い、イヌにおける試験を 再実施することも考えられた。しかしながら、イヌは外来異物に対する免疫反応を発生し易いこと及 び血管損傷に対する高感受性動物であることから、ヒトの安全性を支持するために適切な実験成績を 提供することにはならないと考えられた。 rFXIII/rFXIIIa の毒性に対してサルはラット及びイヌよりも易感受性であることが示されている。 初期の酵母菌で製造した rFXIII の活性型を用いたラットにおけるメカニズム試験及び現行の酵母菌で 製造した rFXIII との関係について 活性型 rFXIII（rFXIIIa°又は rFXIIIa*）を用いたラットにおけるメカニズム試験の結果は現行の酵母 菌で製造した rFXIII にも適用可能であると考えられる。このことから、現行の酵母菌で製造した rFXIII を用いたメカニズム試験は実施しなかった。非臨床試験で使用した試験物質バッチの rFXIIIa°含 有量から、カニクイザルにおける rFXIII 高用量投与での rFXIIIa°量が特定された。 初期の酵母菌で製造した rFXIII を用いたラットにおけるメカニズム試験から、活性型 rFXIII の直接 投与、すなわち rFXIIIa°高含有非臨床試験物質バッチの投与に比較して、rFXIII の in vivo での活性化は rFXIII の毒性発現に主要な役割を果たしているとは考えられないと結論された。しかしながら、FXIII 47 of 57 B サブユニットとの結合を超える生理的レベル以上の rFXIII 投与により、意図しない in vivo での活性 化が起こる可能性を否定することはできない。文献的に、FXIII A サブユニットの活性部位は、血漿中 の FXIII B サブユニットと結合すると隠蔽され、このため偶発的な活性化が抑制されていると記述され ている30。さらに、in vitro 試験はカニクイザルの毒性用量に相当する高濃度の rFXIII が HMEX を形成 させることが示された。以上のことを踏まえ、Module 2.4「非臨床試験の概括評価」の表 2.4-11 に、 rFXIII の用量（in vivo での活性化能を含む）及び原薬中の rFXIIIa°含有量の比を示した。 種特異性及び初期の酵母菌で製造した rFXIII を用いて実施した試験との関係について ZM146 又は BJ2n-5-LA で製造した rFXIII の各バッチについてレトロスペクティブに分析したところ、 rFXIIIa°含有量を除いて、不純物プロファイルは同様であることが示されている（Module 2.3.S.3.2「不 純物」）。 カニクイザルにおける初期の酵母菌で製造した rFXIII（表 2.6.6-11）及び現行の酵母菌で製造した rFXIII（表 2.6.6-2）のいずれの投与でも、同等の用量レベルで同程度の急性毒性が認められた。 効力 を裏付ける薬力学的作用は、初期の酵母菌及び現行の酵母菌で製造した rFXIII 間で類似していること が示されている〔Module 2.6.3.2（試験番号 RES-FXIII-0024 及び RES-FXIII-0025）〕。異なる酵母菌株 で製造された rFXIII は、定義上は区別されるべき産物と考えられるものの、非臨床的な毒性の観点ま た薬力学的特性から類似していることが示された。初期の酵母菌株で製造した rFXIII のラット、イヌ 及びサルにおける毒性試験成績ならびに現行の酵母菌株で製造した rFXIII のラット及びカニクイザル における毒性試験成績から、カニクイザルはラット及びイヌよりも高感受性であることが示された （表 2.6.6-15）。 48 of 57 表 2.6.6-15 動物種 初期の酵母菌株製造 rFXIII 及び現行の酵母菌株製造 rFXIII の毒性試験における無毒性 量、致死量及び rFXIIIa°含有量の比較 投与期間、 投与間隔 無毒性量 致死量（mg/kg） （mg/kg） rFXIIIa°含有 rFXIIIa°比（致死量 量(%) vs.有効期間終了時 規格に基づく臨床 用量 35 IU/kg） 試験番号 現行酵母菌：BJ2n-5-LA ラット 4 週間連日投与 15 - 0.16 該当せず NN209502 サル 単回投与 ≥21.9 0.26-0.33 30 SBi-1220-175 SBi-1278-175, SBi-1249-175 サル 2 回投与、72 時 確定せず 間間隔 ≥12.5（2 回投与） 0.26 34 SBi-1249-175 サル 2 週間連日投与 6 - 1.02 該当せず SBi-1394-175 サル 4 週間、1 回/2 週投与 8 - 0.26 該当せず SBi-1266-175 サル 13-27 週間、 1 回/2 週投与 3 10（1 回投与） 0.53 28 NN205255 4 週間連日投与 15 - 2.5 該当せず HWA 2642-101 反復投与による 該当せず メカニズム試験 1.58 rFXIIIa° 該当せず ≥836 KHS92005 イヌ 2 週間連日投与 5 ≥10（>6 回投与） 7.3 ≥25（1 回投与） ≥386 HWA 2642-100 イヌ 2 週間連日投与 15 ≥20（>7 回投与） 0.8 85 HWA 2642-102 サル 単回投与 ≥25.5 35 SNBL.002.02 該当せず 酵母菌：ZM146 ラット 12.8 0.26 結論 薬理学的に反応性を示す 2 種の動物種ラット及びカニクイザルにおいて、rFXIII の毒性の特性が明確 にされた。rFXIII の高用量投与のカニクイザルでみられた毒性は、予期された通り、rFXIII／rFXIIIa の 薬理作用によるものであることを示し、内因性 FXIII／FXIIIa で知られている架橋を形成させる役割に 合致していた。動物において rFXIII は異物であることから、ラット及びカニクイザルで免疫学的反応 が認められた。この反応は脾臓のリンパ系細胞過形成又は抗薬物抗体の産生として認められた。概し て、rFXIII はラット、ウサギ及びカニクイザルにおいて局所刺激性が全く認められないか、みられた場 合でも軽微であり、臨床適用においてこの局所反応は許容されるものであった。 49 of 57 各種検査パラメータの一覧 表 2.6.6-16 反復投与毒性試験における一般状態の観察及び検査項目 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 一般状態 X X X X X X 体重 X X X X X X 摂餌量 X X X X X X 眼科学的検査 - X - X - X 血圧 - - X X X - 心拍数 - - X X X X 体温 - - X X X - 心電図 - - - X - X 投与期間（週） 試験番号 パラメータ X：観察／測定。-：観察／測定せず。 表 2.6.6-17 反復投与毒性試験におけるトキシコキネティクス及び抗体産生の評価 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 総 A2 - - X X X X A2B2 - - X X X X B2 - - X X X X 活性（Berichrom®）a X X - - - Xa 抗体 - X - X X X 投与期間（週） 試験番号 パラメータ トキシコキネティクス ELISA X：測定。-：測定せず。 a 改変 Berichrom®測定法による測定は投与前のみ実施した。 50 of 57 表 2.6.6-18 反復投与毒性試験における血液学的検査パラメータ 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/ 27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 ヘモグロビン濃度 X X X X X X 平均赤血球容積 X X X X X X 平均赤血球ヘモグロビン濃 度 X X X X X X 赤血球分布幅 X X X X X X ヘマトクリット値 X X X X X X 赤血球数 X X X X X X 網状赤血球数 X X X X X X 平均赤血球ヘモグロビン量 X X X X X X 血小板数 X X X X X X 平均血小板容積 X X - - - X 総白血球数/白血球百分率 X X X X X X 投与期間（週） 試験番号 パラメータ X：測定。-：測定せず。 表 2.6.6-19 反復投与毒性試験における血液凝固検査パラメータ 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/ 27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 プロトロンビン時間（PT） X X X X X X 活性化部分トロンボプラス チン時間（aPTT） X X X X X X フィブリノゲン X X X X X X D-ダイマー - - X X X X トロンビン-アンチトロン ビン（TAT） - - - - - X フィブリノゲン分解産物 （FDP） - - X X X - 投与期間（週） 試験番号 パラメータ X：測定。-：測定せず。 51 of 57 表 2.6.6-20 反復投与毒性試験における血液生化学的検査パラメータ 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/ 27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 アスパラギン酸アミノトラ ンスフェラーゼ（AST） - X X X X X アラニンアミノトランスフ ェラーゼ（ALP） - X X X X X アルカリフォスファターゼ - X X X X X γ-グルタミルトランスフェ ラーゼ - - X X X X 乳酸脱水素酵素（LDH） - - X X X - Na - X X X X X K - X X X X X Ca - X X X X X 無機リン - X X X X X Cl - X X X X X 総蛋白 - X X X X X アルブミン - X X X X X グロブリン - X X X X X アルブミン/グロブリン比 - X X X X X 総コレステロール - X X X X X トリグリセリド - - X X X - グルコース - X X X X X 総ビリルビン - X X X X X クレアチニン - X X X X X 尿素窒素（BUN） - X X X X X C 反応性蛋白 - - X X X - CO2 - - X X X - 投与期間（週） 試験番号 パラメータ X：測定。-：測定せず。 52 of 57 表 2.6.6-21 反復投与毒性試験における尿検査パラメータ 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 尿色調/性状 X X - X - - 尿潜血 X X - X - X 尿沈渣（顕微鏡観察） X X - X - X 尿量 X X - - - X 尿比重 X X - X - X pHa X X - X - X 濁度 - X - - - - 尿蛋白 a X X - X - X 尿糖 a X X - X - X ケトン体 a X X - X - X ビリルビン a X X - X - X 還元物質 a - - - - - X ウロビリノゲン a X X - X - X 硝酸 - - - X - - 白血球エステラーゼ - - - X - - 投与期間（週） 試験番号 パラメータ X：観察／測定。-：観察／測定せず。 a 半定量的検査。 : 53 of 57 表 2.6.6-22 反復投与毒性における剖検及び重量測定器官 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 副腎 X X - X X X 脳 X X - X X X 心臓 X X - X X X 腎臓 X X - X X X 肝臓 X X - X X X 肺 - - - X X - 卵巣 X X - X X X 下顎リンパ節 X X - - - - 腸間膜リンパ節 X X - - - - 下垂体 X X - X1 X1 X 膝窩リンパ節 X X - - - - 前立腺 X X - - - X 脾臓 X X - X X X 2 X 2 X 投与期間（週） 試験番号 パラメータ 精巣/精巣上体 X X - X 胸腺 X X - X X - 甲状腺/上皮小体 X X - X X X 子宮 - - - - - X X：剖検時、測定（両側器官は左右一緒に重量を測定した。1： 固定してから重量を測定した。2 ：精巣及び精巣上体は 左右別々に重量を測定した）。 -：検査／測定せず（SBi-1249-175 試験では死亡又は安楽死動物ならびに第 2 群の生存動物についてのみ剖検した）。 54 of 57 表 2.6.6-23 反復投与毒性試験における病理組織学的検査 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/27 NN209517 NN209502 SBi-1249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 副腎 - X X X X X 大動脈 - X X X X X 脳 X X X X X X 盲腸 - X X X X X 結腸 - X X X X X 十二指腸 - X X X X X 眼球/視神経 - X X X X X 大腿骨 - X X X X X 胆嚢 - - X X X X 剖検で異常のみられた部位 - X X X X X 心臓 - X X X X X 回腸 - X X X X X 注射部位 - X X X X X 空腸 - X X X X X 腎臓 X X X X X X 喉頭 - X - - - X 肝臓 - X X X X X 肺 X X X X X X 乳腺 - X X X X X 下顎リンパ節 - X X X X X 腸間膜リンパ節 - X X X X X 筋肉 - X X X X X 食道 - X X X X X 卵管 - X - - - - 卵巣 - X X X X X 膵臓 - X X X X X パイエル板 - X - - - - 投与期間（週） 試験番号 パラメータ 55 of 57 動物種 ラット サル <1 4 <1 2 4 13/27 NN209517 NN209502 SBi-249-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 NN205255 下垂体 - X X X X X 膝窩リンパ節 - X - - - - 前立腺 - X X X X X 直腸 - X X X X - 肋骨 - - X X X - 唾液腺 - X X X X X 坐骨神経 - X X X X X 精嚢 - X X X X X 皮膚 - X X X X X 脊髄 - X X X X X 脾臓 - X X X X X 胸骨/骨髄 - X X X X X 胃 - X X X X X 精巣/精巣上体 - X X X X X 胸腺 - X X X X X 甲状腺・上皮小体 - X X X X X 舌 - X X X X X 気管 - X X X X X 膀胱 - X X X X X 尿管 - X - - - - 子宮（頸部を含む） - X X X X X 膣 - X X X X X 投与期間（週） 試験番号 X：検査。-：検査せず。 56 of 57 参考文献 1 Karges HE, Funk KA, Ronneberger H. 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単回投与（急性）毒性試験 ............................................................................................................12 2.6.7.6 重要な試験以外の反復投与毒性試験.............................................................................................14 2.6.7.7 重要な反復投与毒性試験 ................................................................................................................15 2.6.7.7.A ラットにおける 28 日間反復静脈内投与毒性試験：NN209502............................................15 2.6.7.7.B カニクイザルにおける単回及び反復投与毒性試験：SBi-1249-175（参考資料）.............18 2.6.7.7.C カニクイザルにおける 2 週間反復静脈内投与毒性試験：SBi-1394-175 .............................29 2.6.7.7.D カニクイザルにおける 2 週間に 1 回投与による 4 週間反復静脈内投与毒性試験： SBi-1266-175 ................................................................................................................................32 2.6.7.7.E カニクイザルにおける 2 週間に 1 回投与による 27 週間反復静脈内投与毒性試験： NN205255 .....................................................................................................................................36 2.6.7.8 遺伝毒性試験：in vitro.....................................................................................................................41 2.6.7.9 遺伝毒性試験：in vivo......................................................................................................................41 2.6.7.10 がん原性試験 ....................................................................................................................................41 2.6.7.11 生殖発生毒性試験：重要な試験以外の試験.................................................................................41 2.6.7.12 生殖発生毒性試験：受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験.....................................41 2.6.7.13 生殖発生毒性試験：胚・胎児発生に関する試験.........................................................................41 2.6.7.14 生殖発生毒性試験：出生前及び出生後の発生並びに母体の機能に関する試験 .....................41 2.6.7.15 幼若動物を用いた毒性試験 ............................................................................................................41 2.6.7.16 局所刺激性試験 ................................................................................................................................42 2.6.7.17 その他の毒性試験 ............................................................................................................................43 3 of 49 2.6.7.1 毒性試験 Test Article: rFXIII Duration of Dosing Dose of rFXIII (mg/kg) GLP Testing Facility Compliance Study Number Location in CTD Cynomolgys monkey Intravenous Single 0, 10, 17.5, 20 No Sierra Biomedical SBi-1220175*** 4.2.3.1 Cynomolgus monkey Intravenous Single No Sierra Biomedical Single Yes Sierra Biomedical SBi-1278175*** SBi-1249175*** 4.2.3.1 Cynomolgus monkey Intravenous (part of repeated dose study) Repeated Dose Toxicity Rat Intravenous Rat Intravenous 0, 20, 21.2, 22.5, 25, 30 21.9, 22.5 < 1 week 4 weeks 5, 15 0, 1, 5, 15 No Yes Covance Laboratories Covance Laboratories NN209517*** NN209502 4.2.3.2 4.2.3.2 Cynomolgus monkey Intravenous < 1 week (Day 1 +Day 4) Yes Sierra Biomedical SBi-1249175*** 4.2.3.2 Cynomolgus monkey Intravenous 2 weeks 0, 12.5+12.5, 13.1+12.5, 14.5+12.5, 17.0+17.5, 17.4+17.5 0, 0.3, 3, 6 Yes Sierra Biomedical SBi-1394-175 4.2.3.2 Cynomolgus monkey Intravenous 4 weeks 0, 5, 8, 12.5 Yes Sierra Biomedical SBi-1266-175 4.2.3.2 Cynomolgus monkey Intravenous 0, 1, 3, 10 Yes Covance Laboratories NN205255 4.2.3.2 NA 13 and 27 weeks NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Type of Study Species/Strain Single Dose Toxicity Genotoxicity Carcinogenicity Not performed (rationale provided) Not performed (rationale provided) Reproductive and Not performed Developmental Toxicity (rationale provided) Juvenile Toxicity Not performed (rationale provided) Method of Administration 4.2.3.1 4 of 49 Type of Study Species/Strain Method of Administration Duration of Dosing Local Tolerance New Zealand white rabbit Intravenous, Single intraarterial and perivenous New Zealand white rabbit Intravenous, Single intraarterial and perivenous CRL:CD BR Rat Beagle dog Beagle dog Cynomolgus monkey Sprague Dawley rat Sprague Dawley rat Sprague Dawley rat Sprague Dawley rat Intravenous Intravenous Intravenous Intravenous Intravenous Intravenous Intravenous Intravenous 28 days 14 days 14 days Single Single Single Single Single Sprague Dawley rat Sprague Dawley rat Sprague Dawley rat Intravenous Intravenous Intravenous Single Single 7 days Sprague Dawley rat Sprague Dawley rat Intravenous Intravenous 6 days Single Dose of rFXIII (mg/kg) GLP Testing Facility Compliance Study Number Location in CTD Yes intravenous: 0.35, intraarterial: 0.35, perivenous: 0.0313 mg/site 0, 0.2 Yes LAB Scantox NN205496 4.2.3.6 LAB Scantox NN209504 4.2.3.6 0, 1, 5, 15 0, 5, 10, 25 0, 5, 15, 20, 25 12.8, 25.5 0, 26.57 0, 25 10, 25 24.8, 25.5, 26.5, 37.5 25 30.20*-34.91* 16.91*, 17.40*, 22.46*, 26.57*, 27.82*, 28.50*, 31.52*, 32.03*, 33.92*, 35.05* 27.5, 44.00 0, 0.41*, 0.74*, 1.33*, 1.92*, 2.34** Yes Yes Yes No No No No No Hazleton Washington Hazleton Washington Hazleton Washington SNBL USA Zymogenetics Inc. Zymogenetics Inc. Zymogenetics Inc. Zymogenetics Inc. HWA 2642-101 HWA 2642-100 HWA 2642-102 SNBL.002.02# KHS91003 KHS92001R KHS92002 KHS92003 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 No No No Zymogenetics Inc. Zymogenetics Inc. Zymogenetics Inc. KHS92004 KHS92005 KHS92006 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 No No Zymogenetics Inc. Zymogenetics Inc. KHS92007 KHS92008 4.2.3.7.7 4.2.3.7.7 Other Toxicity Studies Other Studies # Toxicokinetic of rFXII produced by early yeast strain ZM146. * rFXIIIao. ** 19.6 mg/kg of rFXIII containing 2.34 mg/kg of rFXIIIao. *** 参考資料. 5 of 49 2.6.7.2 トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験の一覧表 Test Article: rFXIII Type of Study Test System Method of Administration Dose of rFXIII (mg/kg) GLP Compliance Study Number Location in CTD Single dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (female) Intravenous 0, 10, 17.5, 20 No SBi-1220-175a 4.2.3.1 Single dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (female) Intravenous 0, 20, 21.2, 22.5, 25, 30 No SBi-1278-175a 4.2.3.1 Single dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (male/female) Intravenous 12.5, 17.5 Yes SBi-1249-175a 4.2.3.2 Single dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (male/female) Intravenous 12.8, 25.5 No SNBL.002.02# 4.2.3.7.7 Repeated dose toxicokinetic Rat (male/female) Intravenous 0, 1, 5, 15 Yes NN209502 4.2.3.2 Repeated dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (male/female) Intravenous 0, 5, 8, 12.5 Yes SBi-1266-175* 4.2.3.2 Repeated dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (male/female) Intravenous 0, 0.3, 3, 6 Yes SBi-1394-175 4.2.3.2 Repeated dose toxicokinetic Cynomolgus monkey (male/female) Intravenous 0, 1, 3, 10 Yes NN205255 4.2.3.2 * Repeated dose study with TK on Day 1 only. # Toxicokinetic of rFXIII produced by early yeast strain ZM146, see table 2.6.5.3.A. a 参考資料. 6 of 49 2.6.7.3 トキシコキネティクス：トキシコキネティクス試験成績の一覧 Test Article: rFXIII 2 種の測定法によるヒト並びにラット及びカニクイザルにおける単回及び反復投与後のトキシコキネティクス（Cmax、AUC） Species Single dose Man Rat FXIII activity by Modified Berichrom® Assay Cmax (µg/mL) or (% activity) AUC (h* µg/mL) Male Female Male Female Dose mg/kg [IU/kg] Total FXIII A2 Cmax or Co AUC (h*µg/mL) (µg/mL) 0.07 [12] 2.96 361 6.13 661 1.33 0.28 IU/mL - 0.14 [24] 0.17 [30] 0.18 [30] 0.21 [35] 3.32 4.57 - 6684 561 - 8.04 25.17 6.22 - 25104 63544 831 - 4.23 4.79 3.67 0.85 IU/mL - - - - - 0.77 IU/mL - 0.21 [35] - - - - 0.90 IU/mL - 0.35 [60] 0.35 [60] 0.54 [89] 1 [167] 8.57 6.00 10.91 - 24484 10314 15004 - 19.94 15.2 15.95 - 120364 34554 51254 - 6.14 8.66 12.65 269% 405% 1 [167] - - - - 334% 592% 5 [835] - - - - 1180% 1340% 5 [835] - - - - 1310% 1700% 15 [2505] - - - - 4020% 5600% - FXIII A2B2 Cmax AUC (h*µg/mL) (µg/mL) 201 183/1064 IU*h/mL 11774 12374 681 533/2864 IU*h/mL 423/1854 IU*h/mL 543/3164 IU*h/mL 20474 16254 22704 57905 h*%/mL 53505 h*%/mL 68605 h*%/mL 110005 h*%/mL 263005 h*%/mL Study Number - F13-1662 F1810-3733a - F13-1663a F13-1661a F13-1662a NN1841-3788a - F1810-3733a - NN1841-3788b 72105 h*%/mL 60905 h*%/mL 98505 h*%/mL 107005 h*%/mL 353005 h*%/mL F13-1661a F13-1663a F13-1663a NN209502b NN209502a NN209502b NN209502a NN209502b 7 of 49 Species Monkey Dose mg/kg [IU/kg] 0.3 [50] 1 [167] 3 [501] 3 [501] Total FXIII A2 Cmax or Co (µg/mL) 6.89 9.40 74.5 34.4 5 [835] 6 [1002] 8 [1336] 10 [1670] 10 [1670] 97.4 173 144 182 177 12.5 [2088] 12.5-14.5 [2088-2422] 17.0-17.5 [2839-2923] 17.5 [2923] 20 [3340] 20 [3340] AUC (h*µg/mL) 1331 2782 / 6674 7741 8092 / 22054 FXIII A2B2 Cmax (µg/mL) 19.7 54.6 AUC (h*µg/mL) FXIII activity by Modified Berichrom® Assay Cmax (µg/mL) or (% activity) AUC (h* µg/mL) Male Female Male Female - SBi-1394-175a NN205255a SBi-1394-175a NN205255a - - - - SBi-1266-175 SBi-1394-175 SBi-1266-175 SBi-1220-175* NN205255 - - - - SBi-1266-175 SBi-1249-175* Study Number 38.7 36.0 46.1 87.2 232 292 28574 14911 32135 4722 16202 / 40104 50554 37453 39.7 - 4081 43104 6711 17852 / 85854 86604 6131 83994 14017 12552 / 169504 83664 - 396 48763 - - - - - - SBi-1249-175* 304 360 516.1 4964 5462 51525 36.2 49.2 57.4 - - - - SBi-1220-175* SBi-1220-175* SBi-1278-175* 21.2 [3540] 535.8 57335 61.8 - - - - SBi-1278-175* 25.0 [4175] 533.5 43625 38.6 10227 11328 194074/75 965 176514/81 115 24705 - - - - SBi-1278-175* 8 of 49 Species Repeated dose Man Rat Monkey Total FXIII A2 Cmax or Co AUC (h*µg/mL) (µg/mL) 0.07 [12c] 0.18 [30c] 1 [167d] 5.36 10.22 - 991 1651 - 14.62 17.9 - 2451 3431 - 5.16 10.84 153% 264% 1 [167d] - - - - 130% 104% 5 [835d] - - - - 1350% 1470% 5 [835d] - - - - 1080% 2070% 15 [2505d] - - - - 4380% 4660% 0.3e 1 [167f] 3 [501f] 3 [501e] 6 [1002e] 10 [1670f] 23.5 6.43 37.1 131 186 128 4281 1192 7852 13201 21921 25952 /34804 7.11 12.4 37.7 15711 29831 28771 12252 / 117004 - - a Avecia DS. Novo Nordisk DS. c 4 daily doses. d 28 days daily dosing. e 14 days daily dosing. f 27 weeks fortnightly dosing. . 1 0-24 h, 20-48 h, 30-72 h, 40-inf, * 参考資料. b 5 0-tau. FXIII A2B2 Cmax AUC (h*µg/mL) (µg/mL) FXIII activity by Modified Berichrom® Assay Cmax (µg/mL) or (% activity) AUC (h* µg/mL) Male Female Male Female Dose mg/kg [IU/kg] 1011 2241 3800 h*%/mL 2410 h*%/mL 15800 h*%/mL 14600 h*%/mL 39500 h*%/mL - 3450 h*%/mL 3840 h*%/mL 13400 h*%/mL 14500 h*%/mL 39100 h*%/mL - Study Number F13-1662a F13-1662a NN209502b NN209502a NN209502b NN209502a NN209502b SBi-1394-175 NN205255 NN205255 SBi-1394-175 SBi-1394-175 NN205255 9 of 49 2.6.7.4 毒性試験：使用バッチ Test Article: rFXIII 2.6.7.4.A 市販予定製剤をサポートするための rFXIII 非臨床試験で使用された各バッチの概括 Purity (%)1 Specified Impurities (%) 2 Proposed end-of-shelf life specification Batch No. A6574 A6834 XR40307 TR40400 217-01-001 86.3 94.7 94.7 94.7 92.4 90.2 (97.6) 90.2 (98.6) 90.2 (97.6) Study Number Type of Study Pilot acute intravenous toxicity study in female cynomolgus monkeys (non-GLP) Acute intravenous toxicity study in female cynomolgus monkeys 5 days dose range finding study in rats 4 weeks repeated dose toxicity study in rats Local tolerance rabbits 4 weeks repeated dose toxicity study in rats Acute intravenous toxicity study in male and female cynomolgua monkeys A 14-day toxicity study of rFXIII administered by intravenous bolus injection once daily to cynomolgus monkeys, with a 30day recovery period A repeated dose toxicity study of rFXIII administered by intravenous infusion to male and female cynomolgus monkeys, with a 4-week recovery period A rFXIIIao 0.8 B Aggregates 2.0 C Impurities 6.2 0.19 (0.3) 0.33 (0.51) 0.16 0.16 0.16 0.16 0.26 (0.4) 1.02 (1.6) 0.05-0.06 - SBi-1220-1755 0.68 - SBi-1278-1755 <0.1 <0.1 <0.1 <0.1 2.4 1.3 1.3 1.3 4.3 4.13 NN2095175 NN209502 NN209504 NN209502 SBi-1249-1755 - 4.13 SBi-1394-175 0.26 (0.4) 2.4 4.13 SBi-1266-175 10 of 49 Purity (%)1 Specified Impurities (%) 2 Study Number Type of Study B C A rFXIIIao Aggregates Impurities 27 week intermittent intravenous administration toxicity study in RLDS002 91.8 0.53 0.2 2.73 NN205255 the monkey followed by an 8-week reversibility period (96) (0.83) 3 Local tolerance in rabbits 4 days after intravenous, perivenous 91.8 0.53 0.2 2.7 NN205496 and intraarterial injection (96) (0.83) 1 Purity was measured early in development by one method which is the value in bracket taken from certificate of analysis, the specification limit are based on the current method not in bracket based on retrospective analysis for comparability, please refer to 3.2.S.2.6 Manufacturing Process Development, Comparability of Novo Nordisk and Avecia Manufacturing Sites. 2 At the time the nonclinical studies were performed a different assay was used to measure rFXIIIao, since a more robust assay has been developed . The o specification limit is based on the assay, 1% rFXIIIa in the assay corresponds to 0.64% in the assay. In bracket value from certificate of analysis based on , the values not in bracket is based on or adjusted with 0.64 for comparison to specification limits, in the written summary the adjusted value has been used. 3 Values based on retrospective analysis for comparability, please refer to 3.2.S.2.6 Manufacturing Process Development, Comparability of Novo Nordisk and Avecia Manufacturing Sites. 4 Batch analysis data in quality documentation not included for these non-pivotal single dose toxicity studies. 5 参考資料. 11 of 49 2.6.7.4.B 初期の酵母菌株 ZM146 を用いて製造された rFXIII の毒性試験における使用バッチの概略 rFXIIIao (%)1 Study Number Type of Study 2.5 HWA 2642-101 28-Day Intravenous Toxicity Study of rFXIII in rat 2.5 KHS92001R Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat F249124 7.3 HWA 2642-100 14-Day Intravenous Toxicity Study of rFXIII in dog 7.3 KHS91003 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat 9.2 KHS92002 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat 2 FC93001X 0.4 (0.26) SNBL.002.02 Single Dose Intravenous Administration Toxicity study in cynomolgus monkey F249124PS2 0.52 KHS92003 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat F249124PS2 1.8 KHS92004 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat FE92007X 0.8 HWA 2642-102 14-Day Intravenous Range-finding Study of rFXIII in dog 0.82-0.84 KHS92007 6-Day Intravenous Toxicity study in rat F249130 13.2 KHS92003 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat F249130PS3 0.67 KHS92003 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat 4 F249130PS + 4 wk RT 4.67 KHS92003 Single Dose Intravenous Administration Toxicity Study in rat FC92003X 1.5 KHS92005 Single and Repeated Dose Intravenous Administration Study in rat F219101 5.7 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FA92001X 3.9 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FB92003X-1 1.2 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FB92003X-2 1.2 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FB92003X-3 1.6 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FB92003X-4 1.0 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FC92005X-1 0.7 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FD92006X 0.8 KHS92006 7-Day Intravenous Toxicity Study comparing different batches of FXIII FG92008X NA KHS92008 Toxicity of neat rFXIIIa in rats 1 Only analytic information on rFXIIIao is available these values is based on analytical method . The impurity profile at time of dosing is not known. Retrospectively, the batches have been analysed, these analysis showed comparable impurity profiles for rFXIII produced by the early and the current yeast strain, please refer to 3.2.S.2.6 Manufacturing Process Development, Comparability of Current and Former Production Strain. 2 In bracket value corrected with 0.64 for comparison to specification limit which is based on analytical method , this value is used in written summary. 3 o PS mean the batch has been purified by chromatography to remove content of rFXIIIa . 4 + 4 wk RT means that the purified batch was allowed 4 weeks at room temperature which elevated the content of rFXIIIao again. Batch No. F249127 12 of 49 2.6.7.5 単回投与（急性）毒性試験 Test Article: rFXIII Species/Strain Method of Administration (Vehicle/ Formulation) Dose (mg/kg) [IU/kg]c Gender and No. per Group Cynomolgus monkeya (Macaca fascicularis) Intravenous infusion (vehicle: 2% sucrose, 10 mM histidine, pH 8.0 Formulation: 5 mg/mL (low and high dose) and 10 mg/mL (mid dose), 2% sucrose, 10 mmol/L histidine, pH 8.0) Intravenous infusion (vehicle/ formulation: 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01% (w/v) polysorbate 20, pH 8.0 Formulation: 5 mg/mL rFXIII, 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol\ glycine, 0.01% (w/v) polysorbate 20, pH 8.0) 0, 10, 17.5, 20 [0, 1670, 2923, 3340] 0, 20, 21.2, 22.5, 25, 30 [0, 3340, 3540, 3758, 4175, 5010] Cynomolgus monkeyb (Macaca fascicularis) Approximate Lethal Dose rFXIII (mg/kg) Noteworthy Findings Study Number F1 Observed Maximum Non-Lethal Dose rFXIII (mg/kg) 20 > 20 Intravenous infusion of a single dose of rFXIII up to 20 mg/kg was well tolerated. There was no mortality or clinical signs related to the administration of rFXIII. There were no treatment related changes in food consumption, body weights, physiologic indices or clinical pathology. SBi-1220-175d (non-GLP) F1 21.2 22.5 The animals treated with 20.0, 21.2 and 25.0 tolerated dosing. In these animals slight to moderate non-life threatening alterations in the coagulation/haematology parameters (i.e. decrease in fibrinogen and platelets) were observed but there was no evidence of coagulopathy by histopasthology. SBi-1278-175d (non-GLP) Two animals died after a single dose administration of 22.5 mg/kg rFXIII (died Day 5) or 30 mg/kg (died Day 1), respectively. In both animals that died there were macroscopic and microscopic evidence of generalized coagulopathy in adrenals, kidneys, heart, skin, thymus, spleen, gall bladder, thorax and perirenal soft tissues. Clinical pathology 13 of 49 Species/Strain Method of Administration (Vehicle/ Formulation) Dose (mg/kg) [IU/kg]c Gender and No. per Group Observed Maximum Non-Lethal Dose rFXIII (mg/kg) Approximate Lethal Dose rFXIII (mg/kg) Noteworthy Findings (haematology, coagulation, serum chemistry) changes were consistent with coagulopathy and coagulative necrosis in various organs especially heart and kidney. All monkeys died on Day 1. Histopathology revealed widespread thrombosis and ischemic necrosis consistent with disseminated intravascular coagulation (DIC). Study Number SBi-1249-175d 21.9, 22.5 M1, F0-1 < 21.9 21.9 Vehicle: 3% sucrose, 20 mmol/L [3657, 3758] (part of repeated histidine, 200 dose study, GLP) mmol/L glycine, 0.01%(w/v) polysorbate 20, pH 8.0. For further details please refer to 2.6.7.7.B. Formulation: 5 mg/mL rFXIII, 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%(w/v) polysorbate 20, pH: 8.0. a Animal were in the age range from 2.8 to 4.5 years and with weight range 2.6 to 3.3 kg at the outset of the study, infusion rate 1.12-2.08 mL/min b Animals were young adults with an age ranged from 3.0 to 6.2 years and weight range of 2.6 to 3.3 kg at the outset of the study, infusion rate 2.0 mL/min c The dose was administered as mg/kg and the content of IU was not known, therefore the dose in [~ IU/kg ] is an estimated dose in IU/kg based on the content in the product intended to be marketed where 1 mg corresponds to approximately 167 IU. d 参考資料.. Cynomolgus monkeysd (Macaca fascicularis) 14 of 49 2.6.7.6 重要な試験以外の反復投与毒性試験 Test Article: rFXIII Species/Strain Rat/Sprague Dawley *参考資料。 Method of Administration (Vehicle/ Formulation) Intravenous (vehicle: 20 mmol/L Lhistidine, 50 mmol/L NaCl, 5.8% Sucrose, 0.01% Polysorbate 20, pH 8.0, Formulation: 1 (low) and 5 (high) mg/mL rFXIII, 20 mmol/L Lhistidine, 50 mmol/L NaCl, 5.8% Sucrose, 0.01% Polysorbate 20, pH 8.0) Duration of Dosing Dose rFXIII (mg/kg ) [IU/kg] Gender and No, per Group NOAEL rFXIII (mg/kg) Approximate lethal dose rFXIII (mg/kg) Noteworthy Findings 5 Days (daily dosing) 0, 5, 15 [0, 835, 2505] Main study: M5, F5 Exposure part: M6, F6 15 > 15 NN209517* No treatment related mortalities during the course of the study. No treatment (non-GLP) related effects on any of the parameters assessed except for histopathology. There were no toxicologically significant drugrelated findings in relation to administration of 5 mg/kg/day of rFXIII. Minimal focal nephropathy was seen in all dose groups including vehicle control. In one animal dosed 15 mg/kg/day the severity of focal nephropathy was graded slight, which is higher than in the vehicle control group. The relation to treatment was considered unlikely (Expert report rat, located in 4.2.3.2). Systemic exposure to rFXIII in the dosed animals was confirmed A sex-dependent difference in FXIII activity was observed with higher activity in female rats. This difference was also observed for pre-dose levels on Day 1 indicating an underlying sex-difference in endogenous levels. Study Number 15 of 49 2.6.7.7 重要な反復投与毒性試験 Test Article: rFXIII 2.6.7.7.A ラットにおける 28 日間反復静脈内投与毒性試験：NN209502 報告書の題名：28 Day Intravenous (Bolus) Administration Toxicity Study in the Rat with Two Comparator Arms Followed by a 14 Day Treatment-free Period（試験番号 NN209502） Species/Strain: Rat Initial Age: 8 weeks (body weight range males: 219-302 g, females: 177-238 g) Date of First Dose: 17 March 2010 Duration of Dosing: 28 Days (Once daily) Duration of Post-dose: 14 Days Location in CTD: 4.2.3.2 GLP Compliance: Yes Method of Administration: Intravenous (Bolus) Vehicle:5.8% sucrose, 20 mmol/L L-histidine, 50 mmol/L NaCl, 0.01% polysorbate 20, pH 8.0. Formulation: 5 mg/mL rFXIII, 5.8% sucrose, 20 mmol/L L-histidine, 50 mmol/L NaCl, 0.01% polysorbate 20, pH 8.0 Parameters collected: Body Weight, Food Consumption, Clinical Observations, Ophthalmoscopy, Haematology, Coagulation, Clinical Chemistry, Urinalysis, Organ Weights, Gross Pathology, Histopathology, Anti-FXIII Antibody Analysis, Toxicokinetics Special Features: None No Observed Adverse-Effect Level (NOAEL): NOAEL was 15 mg/kg/day (rFXIII, Novo Nordisk DS) and 5 mg/kg/day (rFXIII, Avecia DS) following 28 days of administration. Brief conclusion: Body weight, food consumption, clinical observations, ophthalmoscopy, haematology, coagulation markers (PT, aPTT, fibrinogen), clinical chemistry, urinalysis, macroscopic findings (systemic and local) and organ weights were all unaffected by treatment with rFXIII (Novo Nordisk DS or Avecia DS). Minor changes were found in fibrinogen levels in animals receiving rFXIII (Novo Nordisk DS and Avecia DS). These changes were considered not to be adverse as there were no correlating clinical or histopathological findings. There was one decedent during the study (animal 181M) from the toxicokinetic control group, this animal was electively euthanized due to poor tail condition. Cause of demise was unrelated to effects of rFXIII. Consistent with the species-foreign nature of rFXIII in rats, at the terminal sacrifice and the treatment-free sacrifice, antibodies were detected in animals given 1 mg/kg/day or 5 mg/kg/day (rFXIII of Novo Nordisk DS or the comparator rFXII of Avecia DS), and few animals given 15 mg/kg/day. The incidences of the positive antibody specific response were similar between the genders. There was no significant difference in the incidence of positive antibody specific responses between animals treated with the Novo Nordisk DS or Avecia DS. Microscopically, at the terminal sacrifice, the incidence of lymphoid hyperplasia in the spleen was higher in males given 15 mg/kg/day rFXIII (rFXIII, Novo Nordisk DS), and males and females given 1 or 5 mg/kg/day of the comparator (rFXIII, Avecia DS), when compared with the controls. The overall severity of the lymphoid hyperplasia was lower in the males given 15 mg/kg/day rFXIII (rFXIII, Novo Nordisk DS), when compared with the 5 mg/kg/day comparator (rFXIII, Avecia DS) group, and comparable with the 1 mg/kg/day comparator (rFXIII, Avecia DS) group. The spleen of females given 1, 5 or 15 mg/kg/day rFXIII (rFXIII, Novo Nordisk DS) and males given 1 or 5 mg/kg/day rFXIII (rFXIII, Novo Nordisk DS) was comparable with controls. The lymphoid hyperplasia was considered to be a normal response in the 16 of 49 rat to the administration of a foreign protein. The generally minor level of microscopic findings at injection sites was comparable for the control and treated with rFXIII animals, with no findings suggestive of an irritant response due to rFXIII (Novo Nordisk DS) or the comparator rFXIII (Avecia DS). Daily intravenous administration of rFXIII at doses of 1, 5 or 15 mg/kg/day was well tolerated and based on the absence of mortality or adverse in-life or histopathological findings, under the conditions of this study, the NOAEL for rFXIII in the rat was 15 mg/kg/day (rFXIII, Novo Nordisk DS) and 5 mg/kg/day (rFXIII, Avecia DS) following 28 days of administration. There was no significant difference in toxicological profile between the Novo Nordisk DS or Avecia DS-treated animals. Dose group Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5 Group 6 Daily Dose rFXIII, Novo Nordisk DS (mg/kg) 0 1 5 15 Daily Dose rFXIII, Avecia DS (mg/kg) 0 1 5 No. of Animals (Toxicity/Treatment-free/Toxicokinetics) 10/5/3 10/5/3 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 Sex M F M F M F M F M F M F Toxicokinetics: Day 1 Endogenous level 105 195 C0 25h (%) 269 405 1180 1340 4020 5600 334 592 1310 1700 AUC0-24h (%*h) 5790 7210 6860 9850 26300 35300 5350 6090 11000 10700 Week 4 Endogenous level 184 196 C0 25h (%) 153 264 1350 1470 4380 4660 130 104 1080 2070 AUC0-24h (%*h) 3800 3450 15800 13400 39500 39100 2410 3840 14600 14500 Accumulation Ratio 0.81 0.57 1.6 1.3 1.5 1.1 0.45 0.64 1.3 1.4 Noteworthy Findings: Died or Sacrificed Moribund No. of animals with anti-FXIII antibody specific titre/No. of animals examined: Pre-treatment Toxicity necropsy Treatment-free necropsy 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/15 0/10 0/5 0/15 0/10 0/5 0/15 4/10 4/5 0/15 4/10 5/5 0/15 0/10 5/5 0/15 3/10 4/5 0/15 0/10 2/5 0/15 0/10 1/5 0/15 7/10 5/5 0/15 5/10 5/5 0/15 0/10 4/5 0/15 1/10 4/5 17 of 49 Dose group Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5 Group 6 Daily Dose rFXIII, Novo Nordisk DS (mg/kg) 0 1 5 15 Daily Dose rFXIII, Avecia DS (mg/kg) 0 1 5 10/5/3 10/5/3 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 10/5/6 No. of Animals (Toxicity/Treatment-free/Toxicokinetics) Sex M F M F M F M F M F M F Fibrinogen: Week 4 % change compared to Group 1 NA NA -3 -3 -7 -5 -13 -13 -4 -11 -6 3 Week 7 % change compared to Group 1 NA NA 23* -3 11 -3 19 -7 26* -6 19 -22* Histopathologya: Spleen: Lymphoid hyperplasia Toxicity necropsy No. of animals examined 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Grade 7 8 7 8 8 6 4 6 3 3 3 2 1 3 2 2 2 2 4 6 4 6 7 3 2 2 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 4 4 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 Treatment-free necropsy No. of animals examined 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Grade 4 5 5 5 3 4 3 4 4 5 3 1 1 1 0 0 0 2 1 2 1 1 0 2 4 *Wilcoxon rank sum test (Group 1 vs. Group 2, 3, 4, 5 and 6), P<,0.05. . a Histological diagnosis: - finding not present, 1 minimal, 2 slight, 3 moderate. 18 of 49 2.6.7.7.B カニクイザルにおける単回及び反復投与毒性試験：SBi-1249-175（参考資料） 報告書の題名：An Acute Toxicity Study of Intravenous rFXIII in Young Adult Cynomolgus Monkey（試験番号 SBi-1249-175） Species/Strain: Cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) Initial Age: 4.4 to 6.1 year of age (body weight range males: 4.3 to 5.1 kg, females: 2.7 to 4.6 kg) Date of First Dose: 21 February 2002 Duration of Dosing: Single (Day 1) or two repeated dose (Day 1 and 4) Dose interval: 72 hours or 4 days Duration of Post-dose: Up to 11 days Location in CTD: 4.2.3.2 GLP Compliance: Yes Method of Administration: Intravenous Vehicle: 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%(w/v) polysorbate 20, pH 8.0. Formulation: 5 mg/mL rFXIII, 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%( w/v) polysorbate 20, pH: 8.0 Parameters collected: Body Weight, Food Consumption, Clinical Observations, Blood Pressure, Heart Rate, Body Temperature, Serum Chemistry, Haematology, Coagulation, Gross Pathology, Histopathology Special Features: None No Observed Adverse-Effect Level: No NOAEL identified in this study with the lowest dose being 12.5 mg/kg (0.26% rFXIIIao in test article at time of dosing) Brief conclusion: One animal from group 2 dosed on Days 1 and 4 with 12.5 mg/kg rFXIII survived until the terminal sacrifice on Day 15. In this animal, no test article related effects were observed on clinical signs, food consumption, body weight, blood pressure, body temperature, heart rate, clinical pathology and gross pathology. Histopathology in this animal revealed minimal vascular thrombosis in one optic nerve. The other seven animals from all dose groups treated with 12.5 to 22.5 mg/kg rFXIII either died or were sacrificed early for humane reasons. Animals of group 4 and 5 dosed with 21.9 and 22.5 mg/kg rFXIII, respectively, died after a single dose on Day 1. Two in each dose group 2 and 3, dosed with rFXIII (12.5 – 17.5 mg/kg) on Days 1 and 4 were found dead or were sacrificed for human reasons on Day 5. In all seven animals that died or were sacrificed, the underlying pathology was systemic thrombosis in multiple organs, which was attributed to an exaggerated pharmacology of rFXIII/activated rFXIII. Various macroscopic and microscopic findings were related to this widespread thrombosis, which produced a morphological picture similar to DIC. Changes in haematology, coagulation and serum biochemical parameters were particularly evident in the animals where blood could be collected just prior to necropsy. These changes were secondary to the moribundity and/or widespread tissue injury associated with the observed occlusive coagulopathy resulting from exaggerated pharmacology of rFXIII/activated rFXIII. 19 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Dose rFXIII (mg/kg) No. of animals Sex Toxicokinetics: Group 1 Day 1 Day 4 a C0, total A2 (µg/mL) AUC(0-72), total A2 hr*µg/mL Noteworthy Findings: Fate of animal Haematologyb: Platelet count (103/µL) Pre-dose Day 1, 6 h post-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 4, 6 h post-dose Day 5 Day 5,pre-necropsy Day 13 Polysegmented neutrophils (103/µL) Pre-dose Day 1, 6 h post-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 4, 6 h post-dose Day 5 0 0 1 M 0 0 1 F 14.5 12.5 1 M - Group 2 12.5 12.5 1 F 13.1 12.5 1 F Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F Group 4 21.9 1 M Group 5 22.5 22.5 1 1 M F 396 4876 - - Found Sacrificed dead Day moribund Day 5 5 Moribund died prior to sacrifice Day 1 Moribund Moribund died prior died prior to to sacrifice sacrifice Day 1 Day 1 292 3745 survived survived Found dead Day 5 Survived Sacrificed moribund Day 5 253 260 NA 236 290 320 NA 313 300 272 NA 403 338 217 NA 377 309 263 NA 158 271 - 391 453 NA 372 399 330 NA 487 337 300 NA 216 297 60 31 - 420 366 NA 300 376 - 219 217 NA 212 234 14 21 - 391 NA 17 - 338 21 74 - 316 - 4.93 6.06 NA 3.44 5.24 7.45 1.77 3.35 NA 2.53 2.85 2.24 2.53 9.82 NA 5.33 9.40 - 1.60 3.71 NA 2.82 4.39 1.83 2.64 4.40 NA 4.00 6.04 11.42 4.19 4.61 NA 4.07 3.63 - 1.62 6.37 NA 5.16 8.25 11.02 3.92 NA 10.81 - 3.16 10.88 9.66 - 2.60 - 20 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Day 1a Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex Day 5, pre-necropsy Day 13 b Serum Chemistry : ALT (U/L) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 Group 1 0 0 0 0 1 1 M F NA NA 3.19 3.02 14.5 12.5 1 M - Group 2 12.5 12.5 1 F NA 1.97 13.1 12.5 1 F 11.46 - Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F 10.39 - Group 4 21.9 1 M - Group 5 22.5 22.5 1 1 M F - 59 NA 64 72 NA - 49 NA 59 52 NA 43 47 NA 47 - 43 NA 48 50 NA 28 57 NA 78 169 261 - 62 NA 58 - 34 NA 43 95 216 - 38 - 57 50 - 57 - AST (U/L) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5 pre-necropsy Day 13 38 NA 82 79 NA 36 59 NA 107 65 NA 170 67 NA 82 - 66 NA 92 101 NA 42 81 NA 182 547 862 - 65 NA 79 - 48 NA 68 451 870 - 40 - 56 155 - 67 - LDH (U/L) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy 273 NA 501 442 NA 360 NA 428 479 NA 538 NA 590 - 339 NA 398 726 NA 315 NA 1214 1966 2608 337 NA 370 - 352 NA 449 2207 5940 313 - 263 989 - 639 - 21 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Day 1a Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex BUN (mg/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 Creatinine (mg/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 Glucose (mg/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 Group 1 0 0 1 Group 2 12.5 12.5 1 13.1 12.5 1 Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 Group 4 21.9 1 Group 5 22.5 22.5 1 1 0 0 1 14.5 12.5 1 M F M F F M F M M F 15 NA 13 17 NA 8 0.7 NA 0.7 0.9 NA 0.8 64 NA 79 98 NA 82 17 NA 16 20 NA 21 0.8 NA 0.9 0.9 NA 0.7 80 NA 88 87 NA 83 16 NA 15 1.0 NA 1.1 80 NA 107 - 17 NA 17 25 NA 9 0.8 NA 0.8 0.8 NA 0.8 65 NA 84 94 NA 69 23 NA 22 52 61 0.9 NA 1.0 2.8 3.7 67 NA 91 143 99 - 19 NA 16 0.9 NA 1.1 90 NA 115 - 14 NA 10 50 55 0.7 NA 0.8 3.5 4.0 75 NA 100 153 99 - 15 20 1.0 1.1 99 90 - 20 25 1.0 1.5 72 184 - 16 0.6 94 - Total Protein (g/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 6.4 NA 6.3 6.4 NA 6.2 7.0 NA 6.4 6.9 NA 6.3 6.5 NA 6.3 6.9 NA 6.7 6.2 NA 6.2 7.6 - 7.1 5.1 - 6.9 - Day 5, pre-necropsy Day 13 NA 6.9 NA 6.0 - NA 6.9 6.0 - - 5.5 - - - - 22 of 49 Dose group Group 1 a Dose rFXIII (mg/kg) Day 1 Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex Albumin (g/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Globulin (g/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy C-reactive protein (mg/dL) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5 0 0 1 M 4.6 NA 4.6 4.5 NA 1.8 NA 1.7 1.6 NA 0.50 NA 3.00 1.30 0 0 1 F 4.6 NA 4.6 4.4 NA 1.8 NA 1.6 1.4 NA <0.1 NA 1.20 <0.1 14.5 12.5 1 M 4.7 NA 4.5 2.3 NA 1.9 0.60 NA 3.70 - 12.5 12.5 1 F 4.7 NA 4.6 4.5 NA 2.2 NA 1.7 1.8 NA <0.1 NA <0.1 <0.1 13.1 12.5 1 F 4.4 NA 4.3 4.1 4.0 2.1 NA 2.0 2.3 2.0 <0.1 NA 0.40 3.10 17.0 17.5 1 M 4.7 NA 4.7 2.2 NA 2.0 <0.1 NA 1.30 - 17.4 17.5 1 F 4.5 NA 4.6 4.1 3.9 1.7 NA 1.6 1.6 1.6 0.40 NA <0.1 9.10 21.9 1 M 4.4 3.2 <0.1 1.8 - 22.5 1 M 4.8 4.0 2.3 1.1 <0.1 1.0 - 22.5 1 F 4.3 2.6 1.20 NA - 263 NA 373 385 NA 302 11.8 NA 11.4 10.9 NA 11.8 236 NA 236 245 NA 234 10.8 NA 11.5 10.2 NA 10.6 266 NA 247 14.2 NA 11.7 - 245 NA 266 358 NA 238 11.7 NA 11.0 10.5 NA 11.4 266 NA 278 253 298 11.6 NA 11.6 10.7 11.9 - 302 NA 213 10.7 NA 16.9 - 211 NA 148 247 288 11.9 NA 12.1 11.2 12.9 - 234 39.4* - 385 227 11.0 19.6 - 247 12.5 - Coagulationb: Fibrinogen (mg/dL) PT (seconds) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 23 of 49 Dose group Group 1 a Dose rFXIII (mg/kg) Day 1 Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex aPTT (seconds) Pre-dose Day 1, pre-necropsy Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 D-dimer (µg/mL) Pre-dose ]Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 FDP (µg/mL) Pre-dose Day 2 Day 5 Day 5, pre-necropsy Day 13 Histopathologyc: Brain Capillary distention choroid plexus Congestion cappilaries Edema choroid plexus Thrombosis vasculature Spinal cord Distension capillaries, acellular material Haemorhage 0 0 1 M 22.9 NA 21.6 20.6 NA 21.9 545.7 1084.7 5840.2 NA 1082.8 20.0 20.0 80.0 NA 20.0 0 0 1 F 23.0 NA 24.6 20.3 NA 21.9 347.5 901.8 1729.7 NA 344.0 2.5 20.0 40.0 NA 2.5 14.5 12.5 1 M 28.9 NA 25.4 870.0 2810.8# 160 40.0 - Group 2 12.5 12.5 1 F 26.7 NA 23.3 21.5 NA 22.8 370.4 617.2# 1201.3# NA 691.1 10.0 40.0 160.0 NA 10.0 NA NA NA NA NA NA NA NA ++ +++ + - + + +++ +++ ++ + - ++ ++ ++ +++ ++ ++ - + ++ - NA NA NA NA - - - + - - + + - - 13.1 12.5 1 F 24.7 NA 25.1 21.7 26.0 293.3 909.4# 33277.0# 27676.0# 20.0 80.0 160.0 320.0 - Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F 24.7 28.9 NA NA 40.2 27.9 24.2 33.4 775.4 759.1 1254.2# 910.7# 47639.4# 49274.6 40.0 10.0 80.0 160.0 160.0 320.0 - Group 4 21.9 1 M 12.6* 1076.9 80.0 - Group 5 22.5 22.5 1 1 M F 21.3 31.9 41.7 725.5 1508.6 10.0 80.0 - 24 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Day 1a Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex Adrenal glands Distension capillaries, acellular material Haemorhage Thrombosis capillaris Congestion Coagulative necrosis Pituitary gland Distension capillaries, acellular material Congestion Haemorrhage Neurohypophysis Kidney Distension capillaries, acellular material Congestion Thrombosis parenchymal capillaries Thrombosis, glomerular capillaries Thrombosis renal vasculature Vasculitis, arcuate arteries Coagulative necrosis Haemorrhage Seminal Vesicles Distension vasculature, acellular material Ovary Congestion Trachea Edema Urinary bladder Distension capillaries acellular material 0 0 1 M Group 1 0 0 1 F 14.5 12.5 1 M Group 2 12.5 12.5 1 F 13.1 12.5 1 F Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA +++ ++ ++ +++ - - ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++ ++ +++ ++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ + + ++ - ++ + + ++ - ++ ++ ++ +++ - NA NA NA NA NA NA - - ++ ++ ++ - + + + - ++ - + - NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ++++ ++++ - - ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++++ +++ ++ ++++ + ++++ - ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++++ +++ ++ ++++ + ++++ +++ - ++++ ++++ ++ ++++ +++ - ++ ++++ ++ ++++ +++ ++ NA NA - + - NA NA - - - NA NA ++ - - ++ - NA NA - - - - - + Group 4 21.9 1 M - Group 5 22.5 22.5 1 1 M F - ++ - - - + - - 25 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Day 1a Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex Lung Distension capillaries, acellular material Congestion cappilaries Haemorrhage Edema Thrombosis Heart Distension vasculature, acellular material Thrombosis vasculature Thrombosis cardiac chamber Congestion Necrosis, myocardial Haemorrhage, myocardial Stomach Distension capillaries ,acellular material Congestion, lamina Propia Thrombosis, capillaries Haemorrhage superficial lamina propria Degeneration/necrosis, glandular epithelium Duodenum Distension cappillaries, acellular material Thrombosis capillaries Congestion Necrotic debris Haemorrhage 0 0 1 M Group 1 0 0 1 F 14.5 12.5 1 M Group 2 12.5 12.5 1 F 13.1 12.5 1 F Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F Group 4 21.9 1 M Group 5 22.5 22.5 1 1 M F NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ++ ++++ + ++ +++ - + ++ +++ + ++ ++ - ++++ + ++ ++ ++++ + ++ NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA + ++ - - ++ ++ ++ ++ + ++ ++ - ++ ++ ++ ++ ++ ++ - ++ + - ++ ++ ++ ++ - NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA - - + ++ +++ - + + ++ + + - - + ++ + + NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA - + + - - - - + + + - - 26 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Day 1a Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex Ileum Haemorrhage superficial lamina propria Necrotic debris Jejunum Distention cappillaris acellular material Thrombosis capillaris Necrotic debris Ileocecal valve (non-protocol tissue) Haemorrhage, lamina propria Ulceration Thrombosis, vasculature Cecum Distension capillaries acellular material Thrombosis capillaries Ulceration Haemorrhage Colon Congestion Rectum Congestion lamina propria Thrombosis vaculature Haemorrhage Coagulative Necrosis, transmural Mesenteric lymphnode Distension capillaries, acellular material Thrombosis vasculature 0 0 1 M Group 1 0 0 1 F 14.5 12.5 1 M Group 2 12.5 12.5 1 F 13.1 12.5 1 F Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F Group 4 21.9 1 M Group 5 22.5 22.5 1 1 M F NA NA NA NA - + + - + - - - - NA NA NA NA NA NA - - - - + - - + + - NA NA NA NA NA NA - - - - +++ +++ ++ - - - NA NA NA NA NA NA NA NA - - + + + - - + + + + - - - NA NA - - - ++ - ++ - ++ NA NA NA NA NA NA NA NA - - ++++ ++++ - ++++ ++++ ++++ ++++ - + - + - NA NA NA NA - - - ++ ++ ++ + - - - 27 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Day 1a Dose rFXIII (mg/kg) Day 4 No. of animals Sex Pancreas Distension capillaries, acellular material Thrombosis cappillaries Thrombosis Haemorrhage Coagulative necrosis Mandibular Salivary Gland Congestion Coagulative Necrosis Thrombosis vasculature Spleen Distension sinusoids, acellular material Thrombosis, red pulp Thrombosis, white pulp Liver Distension sinusoids, acellular material Edema, periportal Congestion Thrombosis, sinusoids/ portal vasculature Coagulative Necrosis, hepatocytes Injection site Thrombosis vessel distal to injection site Thrombosis Necrosis skelethal muscle Haemorrhage perivascular 0 0 1 M Group 1 0 0 1 F 14.5 12.5 1 M Group 2 12.5 12.5 1 F NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA ++ - - ++ ++ NA NA NA NA NA NA - NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA 13.1 12.5 1 F Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F Group 4 21.9 1 M Group 5 22.5 22.5 1 1 M F ++ - + + - ++ ++ ++ ++ + - + + - + + - - - +++ - + + - - - ++ - - +++ ++ ++ - +++ ++ ++ + + - ++ ++ - + + - NA NA NA NA - - ++ ++ - + - - +++ - ++++ - NA NA - - ++ - + - - - NA NA NA NA NA NA NA NA ++ - - - - ++ + + - - ++ 28 of 49 Dose group Dose rFXIII (mg/kg) Dose rFXIII (mg/kg) No. of animals Sex Eye/optic nerve Group 1 Day 1a Day 4 0 0 1 M 0 0 1 F 14.5 12.5 1 M Group 2 12.5 12.5 1 F 13.1 12.5 1 F Group 3 17.0 17.4 17.5 17.5 1 1 M F Group 4 21.9 1 M Group 5 22.5 22.5 1 1 M F Congestion NA NA ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ Thrombosis, vasculature NA NA + ++ +++ ++ + Thrombosis optic nerve NA NA +++ Distension choroidal vasculature, NA NA +++ ++++ erythrocytes Bonemarrow/sternum Distension capillaries, acellular material NA NA + ++ ++ Thrombosis NA NA + + Bone marrow/rib Distention cappillaris acellular material NA NA + + + Bone marrow/femur Distension capillaries, acellular material NA NA + +++ + + Thrombosis, capillaries NA NA + Autolysis NA NA ++/++++ ++/++++ ++/++++ + a Due to dosing errors animals of dose group 2 and 3 were not given the same dose on Day 1. b For reference interval of the chinese cynomolgus monkey from the CRO, please refer to the study report page 305 for haematology, page 306 for coagulation parameters and page 307 for clinical chemistry. NA: not applicable, -:No data (e.g. not measured, no sample, animal dead), *look like pre-dose values for PT and aPTT has been swabbed for animal number F19696. #small clot noted in sample. c Histological diagnosis: - no noteworthy finding, + minimal, ++ mild, +++ moderate, ++++ marked. 29 of 49 2.6.7.7.C カニクイザルにおける 2 週間反復静脈内投与毒性試験：SBi-1394-175 報告書の題名：A 14-Day Toxicity Study of rFXIII Administered by Intravenous Bolus Injection Once Daily to Cynomolgus Monkeys, with a 30 –Day Recovery Period（試験番号 SBi-1394-175） Species/Strain: Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) Initial Age: Males 3.2-5.9 years (body weight range 2.8 to 5.3 kg), females 2.1 to 5.2 years (body weigh range 2.2 to 3.2 kg) Date of First Dose: 4 September 2002 Duration of Dosing: 14 Days Dose interval: Daily Duration of Post-dose: 30 Days Location in CTD: 4.2.3.2 GLP Compliance: Yes Method of Administration: Intravenous Vehicle: 3%sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%( w/v) polysorbate 20, pH: 8.0. Formulation: 5 mg/mL rFXIII, 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%( w/v) polysorbate 20, pH: 8.0. Parameters collected: Body Weight, Food Consumption, Clinical Observations, Ophthalmic Examination, Electrocardiograms (ECG), Blood Pressure, Heart rate, Body Temperature, Haematology, Serum Chemistry, Coagulation, Urinalysis, Toxicokinetic, anti-FXIII-antibodies, Organ Weights, Gross Pathology, Histopathology Special Features: None No Observed Adverse-Effect Level: 6 mg/kg/day rFXIII or ~1002 IU/kg/day [approx.1.02% rFXIIIao in test article at time of dosing] Brief conclusion: Intravenous administration of rFXIII once daily over 14-days at dose levels of 0.3, 3 and 6 mg/kg rFXIII was well tolerated by cynomolgus monkey. There was no mortality during the course of this study. There were no changes in any pre- or post mortem parameters that were attributable to rFXIII treatment. Two of ten animals treated with 3.0 mg/kg and one of six animals treated with 6.0 mg/kg had a positive antibody titers after the start of dosing. Day 14 toxicokinetic data were inspected for changes in the concentration-time profiles measured on Day 1 as a result of possible antibody titers and subsequent immune-mediated clearance changes. In the kidneys glomerulopathy was seen in all groups, including the control group. The glomerulopathy was described as increased mesangial matrix in glomeruli characterized by the expansion of the mesangium by amorphous, homogeneous and eosinophilic material. The finding was not regarded treatment related, as there was no clear doserelationship and the finding was seen in both control and treated groups. Mild injection site reaction was seen in all dose groups including control animals. Thrombosis at the injection site was only seen in the mid dose group, this may be treatment related. NOAEL is based on lack of systemic histopathological changes. 30 of 49 Daily Dose (mg/kg) No. of Animals in main and (recovery) groups Sex Toxicokinetics, both sexes, mean: Total FXIII A2 (rA2, rA2cnB2, cnA2cnB2) Day 1 AUC0-24h (h*µg/mL) Co (µg/mL) Day 14 AUC0-24h (h*µg/mL) Co (µg/mL) Accumulation ratio (AUC0-24h Day 14/ AUC0-24h Day 1) FXIII A2 B2 (rA2cnB2, cnA2cnB2), both sexes, mean Day 1 AUC0-24h (h*µg/mL) Day 14 AUC0-24h (h*µg/mL) Accumulation ratio (AUC0-24h Day 14/ AUC0-24h Day 1) Free FXIII B2, both sexes, mean ± SD Day 1 pre-dose (µg/mL) 0.25 h (µg/mL) 6 h (µg/mL) 24 h (µg/mL) Day 14 pre-dose (µg/mL) 0.25 h (µg/mL) 6 h (µg/mL) 24 h (µg/mL) 0 (Control) 3 (2) M 3 (2) F 0.3 3 (0) M 3 3 (0) F 3 (2) M 6 3 (2) F 3 (0) M 3 (0) F - 133 6.89 774 74.5 1491 173 - 428 23.5 3.2 1320 131 1.7 2192 186 1.5 - 408 671 613 - 1571 3.9 2983 4.4 2877 4.7 1.12 ± 0.33 1.11 ± 0.26 1.06 ± 0.32 1.25 ± 0.33 1.11 ± 0.53 0.21 ± 0.04 0.41 ± 0.24 0.93 ± 0.29 1.43 ± 0.48 0.16 ± 0.00# 0.21 ± 0.01¤ 0.42 ± 0.15 1.43 ± 0.63 LTR LTR 0.21 ± 0.05 1.36 ± 0.37 1.43 ± 0.29 1.50 ± 0.51 1.59 ± 0.32 1.33 ± 0.39 0.75 ± 0.51 1.05 ± 0.48 1.68 ± 0.37 0.63 ± 0.22 0.20 ± 0.02 0.33 ± 0.05 0.79 ± 0.26 0.47 ± 0.14 LTR 0.22 ± 0.02 0.58 ± 0.18 31 of 49 Daily Dose (mg/kg) 0 (Control) No. of Animals in main and (recovery) groups Sex No. of animals with FXIII-antibody titre/ No. of animals examined Day 1, pre-dosea Day 8, pre-dose Day 14, pre-dosea Day 16 (48 h post-dose)a Day 18 (96 h post-dose) Day 25 (264 h post-dose) Day 32 (432 h post-dose) Day 43 (696 h post-dose) Histopathology: Main study No. of animals Injection site Haemorrhage, present Fibrosis, perivascular, present Thombosis, present Kidneys Glomerulopathy, increased matrix minimal mild Recovery No. of animals Injection site Haemorrhage 0.3 3 6 3 (2) M 3 (2) F 3 (0) M 3 (0) F 3 (2) M 3 (2) F 3 (0) M 3 (0) F 0/5 1/5b 1/5b 1/3b 0/2 0/2 0/2 0/2 1/5b 1/5b 0/5 0/3 0/2 0/2 0/2 0/2 0/3 0/3 0/3 0/3 - 1/3b 0/3 0/3 0/3 - 0/5 0/5 0/5 0/3 1/2 1/2 1/2 1/2 1/5b 0/5 1/5 0/3 0/2 0/2 0/2 0/2 0/3 0/3 0/3 1/3 - 0/3 0/3 0/3 0/3 - 3 2 1 0 3 3 2 0 3 2 1 0 3 3 2 0 3 3 2 2 3 3 2 0 3 2 3 0 3 2 3 0 0 1 1 1 1 1 1 0 2 0 2 0 1 2 2 0 2 1 2 0 0 - 0 - 2 1 2 0 0 - 0 - - - Kidneys Glomerulopathy, increased matrix minimal 1 2 1 2 a rFXIII present in plasma may have interfered with the antibody assay. b This titre may be explained by a false positive rate of approximately 5% for the assay and a low cut-point. # 2 of 10 had measurable, ¤5 out of 10 had measurable values, LTR: less than reportable, - No noteworthy findings, *p<0.05, p<0.01.NA 32 of 49 2.6.7.7.D カニクイザルにおける 2 週間に 1 回投与による 4 週間反復静脈内投与毒性試験：SBi-1266-175 報告書の題名：A Repeat-Dose Toxicity Study of rFXIII Administered by Intravenous Infusion to Male and Female Cynomolgus Monkeys, with a 4-week Recovery Period（試験番号 SBi-1266-175） Species/Strain: Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) Initial Age: 2-3 years, body weight range 2.4 to 2.9 kg for males and 2.0 to 2.2 kg for females Date of First Dose: 21 March 2002 Duration of Dosing: 4 weeks (Day 1, Day 15, Day 28) Dose interval: 2 weeks Duration of Post-dose: 4 weeks Location in CTD: 4.2.3.2 GLP Compliance: Yes Method of Administration: Intravenous Vehicle: 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%( w/v) polysorbate 20, pH: 8.0 Formulation: 5 mg/mL rFXIII, 3% sucrose, 20 mmol/L histidine, 200 mmol/L glycine, 0.01%( w/v) polysorbate 20, pH: 8.0 Parameters collected: Body Weight, Food Consumption, Clinical Observations, Blood Pressure, Heart Rate, Body Temperature, Serum Chemistry, Haematology, Coagulation, Toxicokinetic, anti-FXIII antibodies, Organ Weights, Gross Pathology, Histopathology Special Features: None No Observed Adverse-Effect Level: 8.0 mg/kg/2 weeks rFXIII or ~1336 IU/kg/2 weeks [0.26% rFXIIIao in test article] Brief conclusion: Intravenous administration of three doses of rFXIII administered fortnightly over 4 weeks (Day 1, 15 and 28) at dose levels of 5, 8 and 12.5 mg/kg rFXIII was well tolerated by cynomolgus monkeys. There was no mortality during the course of this study. There were no changes in any in life or post mortem parameters that were attributable to rFXIII treatment. A transient and sporadic reduction in platelet count was noted in some of the rFXIII-treated animals within 4 hours post-dose. The finding was judged to be due to poor sample integrity. Results of antibody assay revealed no evidence of anti-FXIII antibody formation. No treatment related findings in gross pathology. Histopathology of animals terminated Day 30 revealed minor histopathological changes. In the kidney thickened mesangium was noted in few males treated with rFXIII. The finding was not considered treatment related as there was no dose-relation and this finding also was seen in control animals in SBi-1394-175. Possibly treatment related histologic findings were limited to mild glomerulopathy in one out of six animals that received 12.5 mg/kg rFXIII. The glomerulopathy was characterized by loss of defined glomerular capillaries due to increased eosinophilic material and cellularity. A slight increase in the incidence and severity of splenic lymphoid hyperplasia in animals treated with 8 and 12.5 mg/kg rFXIII was seen on Day 30. On Day 58 glomerulopathy was not observed in the recovery animals and the incidence and severity of the splenic lymphoid hyperplasia were similar between the controls and the animals treated at 12.5 mg/kg. Therefore, this finding was not considered to be related to administration of rFXIII. Changes observed at the injection sites consisted mainly of hemorrhage and inflammation (mixed cellular infiltrate). However, since neither the incidence nor the severity of these findings was dose-related, changes at the injection sites were attributed to the injection procedure rather than to rFXIII. An organizing thrombus was observed in the injection site of one Group 4 animal that had no other rFXIII-related findings. Thrombosis in the injection site is an infrequent complication of intravenous injections even in control animals. Therefore, the injection site thrombus in the Group 4 was considered possibly, but not likely, related to the test article. An external pathology peer review of the kidneys from the studies (SBi-1266-175, SBi-1394-175 and NN205255) in cynomolgus monkeys concluded that there were no 33 of 49 renal lesions associated the test article rFXIII (expert report monkey, located in 4.2.3.2). The glomerulopathy reported as treatment related in study SBi-1266-175 was considered to be similar to those seen in other monkeys, including controls in SBi-1394-175. Therefore Novo Nordisk considers the NOAEL of this study 12.5 mg/kg rFXIII oppose to the original conclusion from the study report. Daily Dose (mg/kg) No. of Animals main /recovery animals Sex Toxicokinetics, both sexes Total FXIII A2 (rA2, rA2cnB2, cnA2cnB2), mean C0 (µg/mL) T½ (h) AUC0-24h (h*µg/mL) AUCinf (h*µg/mL) Cl (mL/h/kg) Vss (mL/kg) FXIII A2B2 (rA2cnB2, cnA2cnB2), Day 1: Cmax (µg/mL) AUC (h*µg/mL) Mean Free FXIII B (cnB2) plasma levels µg/mL, Day 1, 6 h post-dose Day 15, 6 h post-dose Day 28, 6 h post-dose Noteworthy Findings: No. of antibody positive animals/No. of examined animals Day 28 (pre-dose) Day 43 Day 57 0 (Control) 3/2 M 0/2 0/2 0/2 5 3/2 F 3/0 M 8 3/0 F 3/0 M 12.5 3/0 F 3/2 M 3/2 F - 97.4 186 2857 3965 1.29 289 144 134 3213 3927 2.18 277 232 147 5055 5752 2.23 300 - 38.7 8660 36.0 8399 39.7 8366 1.16 0.90 0.94 LTR LTR LRT (except 1 animal) LTR LTR LTR LTR LTR LTR 0/2 0/2 0/2 - - - - 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 34 of 49 Daily Dose (mg/kg) No. of Animals main /recovery animals Sex Platelet count (103/µL, mean ± SD): Pre-dose Day 1 (6 hours post-dose) Day 2 (24 hours post-dose) Day 3 (24 hours post-dose) Day 15 (pre-dose) Day 15 (6 hours post-dose) Day 16 (24 hours post-dose) Day 17 (24 hours post-dose) Day 28 (pre-dose) Day 28 (6 hours post-dose) Day 29 (24 hours post-dose) Day 30 (24 hours post-dose) Day 43 (recovery) Day 57 (recovery) Histopathology main animals (No affected/ No treated): Injection site, Haemorhage, perivascular Inflamation, mixed infiltrate Thrombus Kidney, Glomerulopathy, mild Thickened mesangium Spleen, Hyperplasia, lymphoid minimal mild 0 (Control) 5 8 12.5 3/2 M 3/2 F 3/0 M 3/0 F 432 ± 138 394 ± 112 380 ± 133 376 ± 111 481 ± 103 482 ± 117 457 ± 125 454 ± 132 457 ± 121 447 ± 109 439 ± 135 418 ± 129 488 ± 152 416 ± 65 406 ± 116 395 ± 76 342 ± 45 353 ± 73 466 ± 83 331 ± 243 340 ± 149 428 ± 63 440 ± 79 435 ± 96 405 ± 63 402 ± 56 - 464 ± 48 390 ± 52 382 ± 39 392 ± 73 506 ± 50 347 ± 153 395 ± 101 435 ± 60 477 ± 15 436 ± 26 406 ± 25 421 ± 30 - 420 ± 97 343 ± 83 353 ± 89 367 ± 55 402 ± 160 424 ± 111 377 ± 143 428 ± 80 471 ± 107 436 ± 106 389 ± 151 427 ± 82 405 ±110 411 ± 96 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0/3 0/3 1/3 1/3 0/3 0/3 1/3 2/3 2/3 0/3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 2/3 1/3 2/3 0/3 0/3 0/3 2/3 0/3 0/3 0/3 1/3 1/3 1/3 1/3 1/3 0/3 2/3 0/3 1/3 1/3 2/3 0/3 2/3 0/3 3/3 0/3 1/3 2/3 3/3 0/3 0/3 3/3 35 of 49 Daily Dose (mg/kg) 0 (Control) 5 8 12.5 No. of Animals main /recovery animals 3/2 3/2 3/0 3/0 Sex M F M F Histopathology (Recovery animals): Kidney, Glomerulopathy (No. of animals affected) Thickened mesangium Spleen, Hyperplasia, lymphoid, minimal 0/2 0/2 NA 0/2 0/2 NA 1/2 1/2 NA LTR: Less than reportable, - no noteworthy finding or not examined, NA: Not applicable. NA NA NA NA NA NA NA NA NA 0/2 0/2 1/2 0/2 0/2 1/2 36 of 49 2.6.7.7.E カニクイザルにおける 2 週間に 1 回投与による 27 週間反復静脈内投与毒性試験：NN205255 報告書の題名：NN1841 recombinant FXIII: 27 Week Intermittent Intravenous Administration Toxicity Study in the Monkey Followed by an 8 Week Reversibility Period(試験番号 NN205255） Species/Strain: Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) Initial Age: 71 – 172 weeks Date of First Dose: 17 August 2005 Duration of Dosing: 13 or 27 Weeks Dose interval: 2 weeks Duration of Post-dose: 8 weeks Method of Administration: Intravenous Vehicle: 8.5%(w/v) sucrose, 40 mmol/L histidine, 0.02%(w/v) polysorbate 20 Formulation: 12.5 mg rFXIII reconstituted with 2.5 mL sterile water for injection, 8.5%(w/v) sucrose, 40 mmol/L histidine, 0.02%(w/v) polysorbate 20 Location in CTD: 4.2.3.2 GLP Compliance: Yes Parameters collected: Body Weight, Food Consumption, Clinical Observations, Ophthalmoscopy, Electrocardiography (ECG), Toxicokinetics, anti-rFXIII antibodies, FXIII activity, Haematology, Coagulation, Serum Chemistry, Urinalysis, Organ Weights, Gross Pathology, Histopathology Special Features: Pre-dose FXIII activity by modified Berichrom® assay No Observed Adverse-Effect Level: 3 mg/kg/2 weeks rFXIII or 501 IU/kg/2 weeks [0.53% rFXIIIao in test article ] Brief conclusion: Intravenous administration of rFXIII at dose levels of 1 and 3 mg/kg administered fortnightly for 13 or 27 weeks was well tolerated by cynomolgus monkey. There were two deaths during the study. One high dose male animal (10 mg/kg rFXIII) died 4 days after the first dose. Pathological changes were observed in many organs including kidneys, heart, lungs, adrenals (congestion, haemorrhage, thrombosis and necrosis), thymus and other lymphoid tissue (atrophy). The range of findings was considered consistent with ischemic necrosis related to thrombosis. The most pronounced changes were found in the kidneys, probably resulting in toxaemia and circulation failure and included severe generalised necrosis of both glomeruli and tubular elements, with haemorrhage and areas of tubular regeneration. These findings were considered effects of rFXIII. One low-dose animal (1 mg/kg) was killed on Day 75 in a moribund condition having lost 16% body weight over 11 days. Microscopically, this animal had gastrointestinal lesions characterised primarily by enteritis, together with micro abscesses and a minor parasite infestation. These gastrointestinal changes were not considered related to treatment with rFXIII. High dose males (10 mg/kg rFXIII) gained less weight than other treatment groups. Small reductions in packed cell volume in Week 7 and reticulocytes in Week 13 were seen in most male groups given 10 mg/kg rFXIII. No other effects were seen on clinical signs, food consumption, ophthalmoscopy, electrocardiography, organ weights, haematology, clinical chemistry, urine parameters, macro- or microscopic pathology. All animals dosed intravenously with rFXIII were exposed systemically to the compound after single (Day 1) and repeated (Week 13 and 27) administration. All but two rFXIII treated animals developed anti-rFXIII antibodies during the cause of the study. However, in three animals specificity to rFXIII was not confirmed and these animals are therefore not listed as anti-body positive in the tabulation below. There was a statistical significant decrease in mean pre-dose FXIII activity measured by the activity assay (modified Berichrom assay) with increasing antibody titre indicating development of cross reacting neutralising antibodies. No indication of an antibody effect on TK (AUC0-48 h) measured by ELISA of total A2 or A2B2 was seen. Microscopic findings at injection sites of the high dose group were generally comparable with the controls. 37 of 49 Daily Dose (mg/kg) Sex No. of Animals main/recovery Duration of treatment weeksa Toxicokinetics: Total FXIII A2 (rA2, rA2cnB2, cnA2cnB2) AUC0-inf (h*µg/mL), mean Total FXIII A2 (rA2, rA2cnB2, cnA2cnB2) AUC0-48h (h*µg/mL) 0 (control) M 3/2 27 F 3/2 27 1 (Group 2) 3 (Group 3) M 3/0 27 M 3/0 27 F 3/0 27 F 3/0 27 10 (Group 4) M 3/2 27 F 3/2 27 10 (Group 5) M 3/2 27 F 3/2 27 10 (Group 6) M 3/2 13 F 3/2 13 Day 1 Week 27 - 667 - 2205 - 4010 3480 - - Day 1 Week 27 - 278 119 809 785 1620 2595 - - Day 1 Week 27 - 4310 - 8585 - 16950 11700 - - FXIII A2B2 (rA2cnB2, cnA2cnB2), AUC0-inf (h*µg/mL), mean 38 of 49 Daily Dose (mg/kg) 0 (control) Sex M No. of Animals main/recovery 3/2 Duration of treatment weeksa 27 Noteworthy Findings Died or Sacrificed Moribund/total No. of animals 0/5 No. of antibody positive animals/ No. of animals examinedd Week - 1 0/5 Day 15 0/5 Day 29 0/3 Week 7 0/5 Week 13 0/5 Week 17 (recovery) Week 21 (recovery) Week 27 0/5 Week 31 (recovery) 0/2 Weight gain g (group mean % of Group 1 ) Start to week 4e 160.2g Start to week 13 321.2g Start to week 27 579.0g Packed cell volume PCV % (% change from group 1) Week - 1 47.4 Week 7e 48.8 Week 13 47.3 Week 27 47.8 Week 31 (4 weeks recovery) 44.7 Week 34 (8 weeks recovery) 48.8 1 (Group 2) 3 (Group 3) 10 (Group 4) 10 (Group 5) 10 (Group 6) F 3/2 27 M 3/0 27 F 3/0 27 M 3/0 27 F 3/0 27 M 3/2 27 F 3/2 27 M 3/2 27 F 3/2 27 M 3/2 13 F 3/2 13 0/5 0/3 1c/3 0/3 0/3 0/5 0/5 0/5 0/5 1b/5 0/5 0/5 0/5 0/3 0/5 0/5 0/5 0/2 0/3 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 - 0/3 0/3 0/3 1/3 2/2 2/2 - 0/3 0/3 2/3 3/3 2/3 3/3 - 0/3 0/3 0/3 0/3 2/3 3/3 - 0/5 1/5 1/3 4/4 5/5 3/5 1/2 0/5 0/5 0/3 0/4 3/5 2/5 1/2 0/5 0/5 3/4 4/5 3/5 1/2 0/5 0/5 2/4 5/5 3/5 2/2 0/5 0/5 3/3 4/4 1/2 2/2 - 0/5 0/5 4/5 5/5 2/2 2/2 - 201.8g 303.6g 376.0g 90.1%* 107.8% - 45.0 45.3 44.8 44.9 42.2 43.7 +4 +2 +1 -2 - 59.8% 121.7%* 79.2% 145.5% - +4 -2 -7 +1 - +3 -3 -1 -2 - 80.8% 38.1%* 79.2% 69.7%* 89.6% 22.8%* 105.7% 112.6% 63.8% 124.8% 84.3% 93.8% 94.1% 194.8% 140.4% - +14 +7 +2 +2 - -3 -6 -3 -3 -2 -5 +6 +4 +1 +3 +5 +6 +6 -7* ±0 +11 -3 +9 -7 -4 -3 +17 -3 -13*** 4 - +8 -4 -2 - 39 of 49 Daily Dose (mg/kg) Sex No. of Animals main/recovery Duration of treatment weeksa Reticulocytes % (% change from group 1) Week - 1 Week 7 Week 13e Week 27 Week 31 (4 weeks recovery) Week 34 (8 weeks recovery) Noteworthy histopathology finding main animals: No. of animals examined Injection sites Left saphenous Phlebitis/periphlebitis, minimal Dermatitis, minimal Right saphenous Phlebitis/periphlebitis, minimal Dermatitis, minimal Noteworthy finding recovery animals No. of animals examined No. of noteworthy findings 0 (control) 1 (Group 2) 3 (Group 3) 10 (Group 4) 10 (Group 5) 10 (Group 6) M 3/2 27 F 3/2 27 M 3/0 27 F 3/0 27 M 3/0 27 F 3/0 27 M 3/2 27 F 3/2 27 M 3/2 27 F 3/2 27 M 3/2 13 F 3/2 13 0.5 0.5 0.6 0.6 0.9 0.5 0.4 0.5 0.7 0.7 0.5 0.4 ±0 ±0 -33 -17 - ±0 +40 +57 +14 - -20 -20 -17 -17 - -25 -20 -29 +29 - -40 -20 -50* -33 -33 -20 ±0 ±0 -14 ±0 +40 +50 ±0 -20 -50** -33 -11 ±0 +100 -20 ±0 -14 +40 +125 ±0 -40 -67* - +25 +20 -29 - 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 2 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 2 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 40 of 49 Daily Dose (mg/kg) Sex No. of Animals main/recovery Duration of treatment weeksa Histopathology of high dose dead animal (M24, dose group 6), death considered treatment related (animal partly autolysed) Kidney Necrosis, severe Haemorrhage, severe Multi focal tubular regeneration, slight Heart Arterial thrombus, moderately severe Ventricular thrombosis, moderately severe Myocardial necrosis, multifocal, moderate Lungs Oedema, slight Thrombi, slight Congestion/haemorrhage, moderate Adrenals Congestion/haemorrhage, present Multi focal necrosis, moderate Thymus Atrophy, moderately severe Spleen Lymphoid atrophy, slight Mesenteric ln Atrophy, slight Mandibular ln Atrophy, slight 0 (control) M 3/2 27 F 3/2 27 1 (Group 2) 3 (Group 3) 10 (Group 4) 10 (Group 5) 10 (Group 6) M 3/0 27 M 3/0 27 M 3/2 27 M 3/2 27 M 3/2 13 F 3/0 27 F 3/0 27 F 3/2 27 F 3/2 27 F 3/2 13 + + + + + + + + + + + + + + + a Duration of treatment was originally planned to be 39 weeks for dose group 1, 2, 3 and 4. However, due to the decrease in mean pre-dose FXIII activity measured by the activity assay (modified Berichrom® assay) with increasing antibody titre and the indication of development of cross reacting neutralising antibodies, the study was terminated after 27 weeks. b High dose animal died 4 days after first dose. c Low dose animal sacrificed due to gastrointestinal tract lesion on Day 75. d Only antibody responses confirmed to be specific for FXIII are included. e Statistical test used: ANOVA, dose response and Dunett’s *P<0.05, **<0.01, ***P<0.001. – in histopathology means “not applicable”. 41 of 49 2.6.7.8 遺伝毒性試験：in vitro No studies performed - justification provided in Module 2.4.4.2. 2.6.7.9 遺伝毒性試験：in vivo No studies performed - justification provided in Module 2.4.4.2. 2.6.7.10 がん原性試験 No dedicated studies performed - justification provided in Module 2.4.4.3. 2.6.7.11 生殖発生毒性試験：重要な試験以外の試験 No dedicated studies performed - justification provided in Module 2.4.4.4. 2.6.7.12 生殖発生毒性試験：受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 No studies performed - justification provided in Module 2.4.4.4. 2.6.7.13 生殖発生毒性試験：胚・胎児発生に関する試験 No studies performed - justification provided in Module 2.4.4.4. 2.6.7.14 生殖発生毒性試験：出生前及び出生後の発生並びに母体の機能に関する試験 No studies performed - justification provided in Module 2.4.4.4. 2.6.7.15 幼若動物を用いた毒性試験 No studies performed - justification provided in Module 2.4.4.5. 42 of 49 2.6.7.16 局所刺激性試験 Test Article: rFXIII Species/Strain New Zealand White rabbit New Zealand White rabbit Method of Administration Intravenous, intraarterial, and perivenous (rFXIII drug substance produced at Avecia) Intravenous, intraarterial, and perivenous (rFXIII drug substance produced at Novo Nordisk) Dose rFXIII (mg/kg) [IU/kg] intravenous: 0.35 / [~58] intraarterial: 0.35 / [~58] perivenous: 0.0313 mg/site / [~5.2 IU/site] 0.25 [42] 0.25 [42] 0.25 [42] Gender and No. per Group F4 F4 F4 F4 F4 F4 Noteworthy Findings The local effects observed 96 hours after a single injection in the ears were related to the different routes of administration rather than to an effect caused by the test item. A single dose of 0.13 mL (~42 IU/kg) per animal of rFXIII at a concentration of 835 IU/mL, administered either intravenously, intraarterially or perivenously in the ears of female rabbits caused generally mild local clinical reactions. Only after intravenous injection, rFXIII caused a slightly more severe reaction than the vehicle at the site of introduction of the needle. Local tolerance was also assessed as part of the repeated dose toxicity studies, for details please refer to 2.6.7.7.A - E noteworthy findings. Study Number NN205496 NN209504 43 of 49 2.6.7.17 その他の毒性試験 Test Article: rFXIII Species/Strain Method of Administration Duration of Dosing Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] Gender and No. per Group Noteworthy Findings Study Number Other toxicity studies: The studies included below are only supportive in nature as they were performed early in development on rFXIII produced by an early yeast strain ZM146. This is therefore a different product than the product to be marketed. No qualitative data available on batches used below except for content of non-proteolytic activated rFXIII, rFXIIIao. Retrospective analysis of impurity profile was performed, showing similar impurity profile except for content of rFXIIIao. All study reports of these studies were included M4.3 References. Toxicity studies on rFXIII produced by ZM146 CRL:CD® BR Rat Intravenous 28 Days 0, 1, 5, 15 rFXIII was well tolerated in rats dosed up to 15 HWA 2642-101 M5, F5 mg/kg/day rFXIII for up to 28 day. (GLP) [0, 0.025, 0.125, 0.375] NOAEL: 15 mg/kg/day 0, 1, 5, 15 M10, F10 [0, 0.025, 0.125, 0.375] Beagle Dog Intravenous 14 Days 0 [0] M3(1)a, F3(1)a Both male and female dogs tolerated 5 mg/kg/day HWA 2642-100 rFXIII (~0.365 mg/kg/day rFXIIIao) administered (GLP) M3, F3 for 14 consecutive days. 5 [0.365] M3a, F3a Three female dogs died within three days after a 10 [0.730] M3c, F3 single dose of 25 mg/kg rFXIII (~ 7.3% rFXIIIao in 25 [1.825] test article). Microscopically revealed widespread visceral haemorrhage, thrombosis and extensive necrosis, which were caused by ineffective blood supply in affected areas (infarction). The lesions were primarily affecting the gastrointestinal tract, kidneys and adrenals. Clinical signs, gross pathology and clinical pathology reflected the microscopic findings. The microscopic picture resembled that of DIC. The three males given a single dose of 25 mg/kg were discontinued due to the overt toxicity seen in females. The males were redirected to a dose group given 10 mg/kg. Beginning on Day 6, adverse postdose clinical signs were seen in two of the three the 44 of 49 Species/Strain Beagle Dog Method of Administration Intravenous Duration of Dosing 14 Days Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] 0 [0] 5 [0.04] 15 [0.12] 20 [0.16] 25 [0.20] 0 [0] 20 [0.16] Gender and No. per Group M2, F2 M3, F3 M1, F1 M1, F1 M1, F1 M1, F1 M2, F2 Noteworthy Findings males administered 10 mg/kg/day. Clinical signs started within 5 to 30 minutes following dosing and included dyspnoea, cyanosis, injected sclera, hypoactivity, thready peripheral pulse, mydriasis, pale mucous membranes and/or urination/defecation at the time of dosing. Both animals appeared to stabilize after 10 to 15 minutes. This post-dose reaction generally continued up through Day 14. The reaction was similar to an immunological reaction/hypersensitivity as a result of prior sensitization. Death by Day 9 occurred in two of three females dosed 10 mg/kg/day rFXIII (7.3% rFXIIIao in test article). Similar clinical observations, clinical pathology, macroscopic and microscopic changes were seen as in females given a single dose 25 mg/kg. NOAEL: 5 mg/kg/day This study was a follow-up study to HWA 2642100. In this study 15 mg/kg/day rFXIII (0.8% rFXIIIao in test article) administered for 14 consecutive days was generally well tolerated in both male and female dogs. One female dog administered 25 mg/kg/day rFXIII died after 7 consecutive doses and one female dog administered 20 mg/kg/day rFXIII died after 8 consecutive doses. Histopathology revealed necrotizing vasculitis and vascular thrombosis, widespread haemorrhage accompanied by extensive necrosis especially in kidneys and adrenal cortex. The necrosis occurred as a result of ineffective blood supply within affected areas (infarction). The microscopic picture was similar of the diagnosis of DIC. Study Number HWA 2642-102 (GLP) 45 of 49 Species/Strain Cynomolgus monkey (macaca fascicularis) Method of Administration Intravenous Duration of Dosing Single Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] 12.8, 25.5 [0.051,0.102] Gender and No. per Group F1 Noteworthy Findings In one female and three males administered 20 mg/kg/day rFXIII for 14 consecutive days proliferative glomerulopathy was diagnosed at terminal sacrifice. The finding was considered to possibly reflect an immune response to the test material resulting in immune complex deposition or partly resolved acute lesions caused by high molecular weight protein complex deposition. NOAEL: 15 mg/kg/day Administration of 12.8 mg/kg was well tolerated. Only finding was low fibrinogen and slightly prolonged PT 24 hours post dosing. The animal was not terminated and therefore no gross and microscopic evaluation performed. Administration of 25.5 mg/kg produced a morbid condition consisting of bruising (ecchymosis), emesis, lethargy, poor clotting and bleeding (epistaxis) and the animal was euthanized 47 hours after dosing. Gross pathology disclosed multifocal haemorrhage and infarction in adrenals, kidneys, liver, heart, small intestine, stomach and other organs. Histpathology demonstrated diffuse microvascular thrombi in these and other organs and tissues. Thrombosis and haemorrhage with accompanying necrosis, were considered to be the major histopathological changes induced by the test article (rFXIII) and was consistent with the diagnosis of DIC. Changes in clinical pathology (coagulation, haematology, serum chemistry) and urinalysis were consistent with DIC and the organ/ tissue injury seen. Study Number SNBL.002.02 (non-GLP) 46 of 49 Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] Mechanistic studies performed on rFXIII produced by ZM146 Sprague Dawley Rat Intravenous Single 0, 26.57 [0, 1.95] Gender and No. per Group Noteworthy Findings Study Number M3, F3 KHS91003 (non-GLP) Sprague Dawley Rat Intravenous Single 0, 31.7 [0, 0.8] M3, F3 Sprague Dawley Rat Intravenous Single 10 [0.9] 25 [2.3] M3, F3 M1, F1 Sprague Dawley Rat Intravenous Single Batch: F249130 26.5 [3.5] Batch: F249130PS 25.5 [0.17] M1 Intravenous injection of 26.57mg/kg rFXIIIa (~1.95 mg/kg rFXIIIao) caused severe toxicity. All rFXIII treated rats (male and females) were dead within 21 hour of dosing and most died within 3 hours. The primary finding was acute pulmonary oedema. The time cause of the mortality was extremely rapid, with animals progressing from the first evidence of reaction to death within minutes. Platelet counts were decreased in the severely affected rats, aPTT was significantly prolonged in two of the affected rats from which plasma samples were collected. The placebo injected rats were unaffected. Injection of 31.7 mg/kg rFXIII (~0.8 mg/kg rFXIIIao) to Sprague Dawley rats caused no adverse reaction. All rFXIII treated rats (male and female) were alive and normal at 7 days post injection. At 24 hours after injection, blood was drawn for analysis of platelet counts, aPTT, BUN, SGOT and creatine. All values were normal. The toxicity of batch F249124 rFXIII at dose levels of 25 mg/kg (~2.3 mg/kg rFXIIIao) was confirmed. At necropsy the female rat had severely congested lungs and significant oedema. The male rat was less severely affected at the time of death but had centrilobular pulmonary congestion and oedema. When the dose was decreased to 10 mg/kg rFXIII (~ 0.9 mg/kg rFXIIIao) the rats exhibited no adverse reactions up to 7 days post injection. Activated FXIII (FXIIIaº) was removed by rechromatography from two batches (F249124 and F249130) of FXIII that previously showed acute and lethal toxicity. Rats were dosed with the batches before (F249130) purification, after Species/Strain Method of Administration Duration of Dosing M3 M3 KHS92001R (non-GLP) KHS92002 (non-GLP) KHS92003 (non-GLP) 47 of 49 Species/Strain Method of Administration Duration of Dosing Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] Batch: F249124PS 24.8 [0.13] Batch: F249130PS + 4 weeks at RTb 37.5 [1.75] Gender and No. per Group M1 Sprague Dawley Rat Intravenous Single 25 [0.45] M3 Sprague Dawley Rat Intravenous Up to 7 days 0 [0] 34.91 [0.55] 33.84 [1.18] 31.29 [1.58] 33.17 [2.07] 35.68 [2.35] 33.24 [2.25] 30.20 [3.29] M4, F4 Noteworthy Findings purification (F249130PS and F249124PS) and after the purified batches were kept 4 weeks at room temperature (reactivating rFXIII). The rat dosed with the un-manipulated batch (F249130) died 30 minutes after dosing. On necropsy the kidney pelvis and lungs were dark red. The six rats dosed chromatographed rFXIII (F249124PS, F249130PS) showed no adverse effects over a seven days period. After 4 weeks at room temperature (F249130PS + 4 weeks at RT) the level of FXIIIao were elevated in the purified batch. Injection of 37.5 mg/kg rFXIII (~ 1.75 mg/kg rFXIIIao), caused the rat began to mild distress 4 hours after dosing and the status did not change over the next 5 hours. The rat died between 9 and 20 hours post-injection. Activated FXIII (FXIIIao) was removed by rechromatography from a batch of FXIII that previously showed acute and lethal toxicity (F249124). Reduction of the high levels of rFXIIIao in batch F249124 to 1.8% resulted in loss of toxicity. No signs of toxicity was seen when F249124PS was dosed at 25 mg/kg rFXIII (~0.45 mg/kg rFXIIIao). Male and female rats were injected with doses of 30.20-34.91 mg/kg rFXIII containing a range of thrombin activated rFXIII, rFXIIIa*, levels (0.553.29 mg/kg rFXIIIa*). Doses above 2.07 mg/kg rFXIIIa* (6.2%) were lethal in less than one hour. Doses above 158 mg/kg rFXIIIa* (5.0%) were also lethal, but with slower onset. At doses of 118 mg/kg rFXIIIa* (3.5%), 50% of the female rats dosed died after several doses. The affected rats exhibited respiratory distress, quickly followed by death. The lungs were grossly congested and fluid was often present in the trachea. The kidney pelvis Study Number KHS92004 (non-GLP) KHS92005 (non-GLP) 48 of 49 Species/Strain Method of Administration Duration of Dosing Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] Gender and No. per Group Sprague Dawley Rat Intravenous Up to 7 days 16.91 [0.97] 22.46 [0.88] 26.57 [0.19] 27.82 [0.29] 31.52 [0.24] 32.03 [0.38] 33.92 [0.56] 35.05 [0.30] 17.4 [0.69] 28.5 [1.14] F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F4 F3 Sprague Dawley Rat intravenous Up to 6 days 27.5 [0.23] 44 [0.36] F4 F4 Sprague Dawley Rat intravenous Single dose 0 [0.41]d 0 [0.74]d F4 F4 Noteworthy Findings was dark and haemorrhagic. All other organs looked normal. Blood collected from symptomatic animals revealed elevated SGOT, BUN and creatinine and variable decrease in platelet count. Overall, these results indicate that rFXIIIa (rFXIIIao or rFXIIIa*) can cause the same toxicological changes that were observed in batches F249124 and F249130 with high content of rFXIIIao, implying that rFXIIIa was the primary toxic agent in those batches. This study which was a follow-up to KHS92005. Several batches that were not previously tested in vivo were administered to female rats at dose levels ranging from 16.91-35.05 mg/kg (~0.19-1.14 mg/kg rFXIIIao). At doses of rFXIIIao ranging from 0.19-0.97 mg/kg, no symptoms were observed in any of the rats during the course of the experiments. Body weight changes were similar for all treatment groups. On necropsy, no changes were noted in the lungs, liver or kidneys. One batch, FA92001X, was administered at 28.5 mg/kg rFXIII with 1.14 mg/kg rFXIIIao. These doses resulted in the death of all the treated rats between 5 and 20 hours post-injection. The results of these experiments support the hypothesis that the acute toxicity of rFXIII to rats is related to the rFXIIIa levels administered. Batch FE92007X rFXIII was administered to rats at doses of 27.5 and 44 mg/kg rFXIII (0.23 and 0.36 mg/kg rFXIIIao). No adverse effects were seen in 6 days of dosing. The body weight gain of the rats was normal and there were no gross changes in the liver, kidney and lungs on necroscopy. Rats dosed 1.92 mg/kg rFXIIIa* alone (dose group 4) and dosed 2.34 mg/kg rFXIIIa*+19.6 mg/kg rFXIII (dose group 5) started exhibiting symptoms Study Number KHS92006 (non-GLP) KHS920067 (non-GLP) KHS92008 (non-GLP) 49 of 49 Species/Strain Method of Administration Duration of Dosing Dose rFXIII (mg/kg), [mg/kg rFXIIIao] 0 [1.33]d 0 [1.92]d 19.6 [2.34]d 0 [0]d Gender and No. per Group Noteworthy Findings Study Number and dying 30 minutes post injection. All were dead by 1 hour post dosing except one rat from dose group 4 (1.92 mg/kg rFXIIIa* alone). This rat did not receive a full scheduled injection volume. The symptoms of dying animals were similar to what had been observed in previous studies: Lethargy, laboured raspy respiration, rapid progression to death. Mild elevation in AST (SGOT), alkaline phosphasphatase, BUN and creatinine suggesting hepatocellular and renal injury. Histopathology was examined in one animal of group 5 (2.34 mg/kg rFXIIIa*+19.6 mg/kg rFXIII). The pathological changes were the same as previously observed in rats. The lung had widespread capillary congestion and small vessel occlusion. The kidney had moderate glomerular thrombotic occlusion and mild tubular injury. None of the rats in the other dose groups exhibited symptoms during the experimental period. These animals were euthanized 26 hours post injection. In conclusion, rFXIIIa in the absence of the zymogen (rFXIII) can cause the same spectrum of toxicity as it does in the presence of a large excess of zymogen. The dose response is similar with and without zymogen. a treatment of the group receiving 10 mg/kg were performed as a satellite study with one additional male and female as untreated controls. b 4 wk RT mean after 4 weeks at room temperature, the levels of rFXIIIao were elevated in the purified F249130 batch c The three male animals of the 25 mg/kg/day group was redirected to a new group given 10 mg/kg/day rFXIII (~ 0.73 mg/kg/day rFXIIIao) a month later, this group was supplied with three new female dogs. F4 F4 F4 F4