黄色ブドウ球菌の増殖をモニタリングするための 自動化ソリューション

アプリケーションノート
黄色ブドウ球菌の増殖をモニタリングするための
自動化ソリューション
インフィニット 200 PRO マルチモードリーダープラットフォームにおける常時振盪および加熱を用いた細
菌増殖試験の最適化
はじめに
原核細胞および酵母菌増殖のモニタリングは、ライフサイエン
インフィニット 200 PRO マイクロプレートリーダーシリーズと
スや食品産業にとって重要なツールである。細菌および酵母菌
Tecan 社製のその他のマイクロプレートリーダーは、細菌およ
細胞を定量化するための十分確立された方法は、濁度測定法
び酵母菌の増殖を解析する多様な試験で有効に使用されてい
である。この方法は、溶液中の細胞数が増えると溶液が濁って
る（1-7）。
くるという事実に基づく。サンプルを通過する光が微生物によっ
増殖をモニタリングするため、キュベットの代わりにマイクロプ
て散乱するため、濁度は溶液中の微生物数に比例する。この
レートを使用することの利点でもっとも重要なことは、スループ
濁度は分光計を用いて容易に測定できる。細胞には光を吸収
ットがより高いことである。その他の利点として、Tecan 社製マ
する高分子、例えば DNA（260 nm）、蛋白質（280 nm）、チトクロ
イクロプレートリーダーは最適化された振盪能および温度調節
ム（400～500 nm）および細胞の色素などが数多く含まれている。
能を備えており、これは器具の頑健性に対する強い要望に対
光散乱により細菌や酵母菌を測定する場合、吸収が最小とな
応して開発された。これによりリーダー内で手を煩わせることな
る波長を選択するのが最善である。例えば推奨される波長は
く（インキュベーターから分光計まで（その逆も）マイクロプレー
600 nm である。この波長でサンプルの光学濃度（OD）が細胞
トを移す必要がなくなる）長期の動態試験を実施することが可
数に正比例するため、細胞増殖法として使用できる。
能になり、結果的に「一晩のギャップ」なしにデータをグラフ化で
600 nm 吸光度測定によって細胞数を正確に測定するには、各
きる。
標準曲線を作成するほかない（OD の関数として生育可能なプ
レート数または細胞量をグラフ化）。
1
アプリケーションノート
Tecan 社製 Freedom EVOリキッドハンドリングシステムととも
に、このリーダーは全世界の研究者が使用する洗練された
HTS ソリューションを提供する。例えば、米国スタンフォード・
ゲノム・テクノロジー・センターの研究者は、酵母菌をゲノム解
析するためこれらの技術を組み合わせて完全自動化プラット
フォームを開発し、化学的ゲノムアッセイ用に低分子処理した
突然変異株の表現型解析に成功している（8-10）。
材料および方法
・ インフィニット M200 PRO Quad4 モノクロメーターTM ベースの
マルチモードリーダー
・ 黄色ブドウ球菌（DSMZ 18587）
・ トリプシン大豆ブロス（BactoTM TSB、Becton Dickinson 社）
・ Corningプレート 6 ウェル、48 ウェル、平底、透明（米国
Corning 社）
黄色ブドウ球菌は条件的グラム陽性嫌気性球菌である。通
常はヒトの皮膚および上気道に認められ、一般集団における
・ Greinerプレート 12 ウェル、24 ウェルおよび 96 ウェル、平
底、透明（ドイツ、Greiner Bio-One 社）
平均保菌率は 37.2%である（11）。黄色ブドウ球菌は長年にわ
たりヒトの疾患において重要な病原であると認識されており、
入院患者において定期的に感染が生じ、肺炎、心内膜炎、髄
膜炎、毒素ショック症候群および敗血症等、生命を脅かす疾
患を引き起こす（12）。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）
は、ラクタム抗生物質（メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシ
リンおよびオキサシリン等のペニシリンとセファロスポリン）耐
黄色ブドウ球菌（DSMZ 18587）は、トリプシン大豆ブロス 20
mL 中 で 好 気 的 に 培 養 し た 。 MaxQTM4000 振 盪 培 養 器
（Thermo Fisher Scientific 社）で 37C/120 rpm にて一晩培養
後、吸光度 600 nm にて液体懸濁液をインフィニット M200
PRO マイクロプレートリーダーで吸光度 0.05 になるまで希釈し
た。
性が生じている世界中で非常に恐れられている菌株である
（13）。例えば、米国では 2004 年の全臨床分離株の 56.8%が
MRSA 陽性であり（14）、治療選択肢が限定されているため、
米国では院内感染により毎年推定 80,000 例の患者が死亡し
プレートフォーマットおよび充填量の影響を解析するため、以
下の表に従ってプレートを充填した。
プレート
ている（15）。欧州では、German Robert-Koch Institut により、
ドイツにおけるこれらの感染の年間コストは推定 15 億～30 億
ユーロとなっている（16）。結果として、黄色ブドウ球菌に関す
る世界規模の研究がきわめて重要になり、抗菌光線力学療
最高ワーキ サンプル量（最 S.aureus 培 TSB 量
ングボリュー 高ワーキングボ 養液量（μL） （μL）
ム（μL） リュームに占め
る割合［%］）
COS6ft
5000
GRE12ft
3000
GRE24ft
1200
COS48ft
800
GRE96ft
200
法等、きわめて有望な新しい治療選択肢が大きな科学的関
心の対象となっている（17）。
このアプリケーションノートでは、Tecan 社製インフィニット 200
PRO マイクロプレートリーダーを用いて 600 nm 吸光度測定を
行う、黄色ブドウ球菌増殖の検出方法について述べる。アッ
セイ用パラメータおよび器具の設定がデータの質に及ぼす影
響について検討する。
25%
50%
75%
25%
50%
75%
100%
25%
50%
75%
100%
25%
50%
75%
100%
25%
50%
75%
100%
1250
1250
1250
750
750
750
750
300
300
300
300
200
200
200
200
50
50
50
50
0
1250
2500
0
750
1500
2250
0
300
600
900
0
200
400
600
0
50
100
150
表 1 マイクロプレートのサンプル充填手順
2
アプリケーションノート
菌体液と培地の分注後、プレートを Parafilmで覆って密封し、
COS 6 ウェル、2500 μL、振幅 6 mm
インフィニット 200 PRO マイクロプレートリーダーへ移した後、
スクリプトを用いて黄色ブドウ球菌の増殖曲線を作成した。マ
イクロプレートを振盪した影響について解析するため、振幅の
種類（表 2）とサンプル量を表 1 に記載した。
細菌増殖プロトコル
Plate
表 1 参照
Temperature
37 °C
Wait for Temperature
36.5 - 37.5 °C
Kinetic cycle
(duration)
14 時間
Kinetic interval
30 分
Shaking (10 sec)
回転；振幅の種類：1, 3, 6 mm
Absorbance
600 nm, 25 フラッシュ,
暫定時間 100 ms
Incubation
Shaking (800 sec): 回転、
振幅の種類：1, 3, 6 mm
図 1 Costar 社製 6 ウェルプレートにおける黄色ブドウ球菌の
増殖（2.5 mL および振盪幅 6 mm）
GRE 12 ウェル、1500μL、振幅 6 mm
Shaking (800 sec): 回転、
振幅の種類：1, 3, 6 mm
残り待ち時間(タイマー)
表 2 黄 色 ブド ウ 球 菌 の 増 殖 を モ ニ タ リ ング す る た め の
i-controlTM ベースのプロトコル
結果および考察
1 つのプレートフォーマットに対し考えられるすべての組み合
わせについて解析したところ、ワーキングボリューム 50%充填
図 2 Greiner 社製 12 ウェルプレートにおける黄色ブドウ球菌
の増殖（1.5 mL および振盪幅 6 mm）
GRE 24 ウェル、600μL、振幅 3 mm
量における増殖曲線が最適であった。
注：プレートのワーキングボリュームは、i-control ソフトウェア
（Plate stripe→Details→Well Geometrie）で確認できる。さらに、
最善の結果を得るには、6 ウェルおよび 12 ウェルのプレート
には振盪幅 6 mm が推奨され、24 ウェル、48 ウェルおよび 96
ウェルには 3 mm の振盪幅 3 mm が必要となる（図 1～5）。
図 3 Greiner 社製 24 ウェルプレートにおける黄色ブドウ球菌
の増殖（600 μL および振盪幅 3 mm）
3
アプリケーションノート
COS 48 ウェル、400 μL、振幅 3 mm
図 6 は、96 ウェルプレートフォーマットにおける振盪幅の影響
を示す。振盪幅 6 mm を使用すると「二相性」の増殖曲線が生
成され、約 12 時間後にプラトーに達する。最適化された振幅
3 mm については、「二相性」の形状は認められず、細胞数は
培養時間 7 時間以内に最高値に達する。
アッセイパラメータの影響（プレートフォーマット、充填量、器
具の設定、振盪幅等）は、原核細胞増殖試験にとって重要な
要因である。Tecan 社は、これらのパラメータを最適化してか
図 4 Greiner 社製 48 ウェルプレートにおける黄色ブドウ球菌
の増殖（400 μL および振盪幅 3 mm）
GRE 96 ウェル、100 μL、振幅 3 mm
ら実験データの生成を始めることを推奨している。
結論
細菌細胞および酵母菌増殖のモニタリングは、ライフサイエン
スや食品産業にとって重要な研究ツールである。Tecan 社製
品、特にマイクロプレートリーダーはこの研究分野では定評
があり、顧客の要求をサポートするため革新的な機能を備え
ている。
このアプリケーションノートにより、黄色ブドウ球菌の増殖曲
線を生成する際インフィニット M200 PRO の優れたパフォーマ
ンスが示されており、6 ウェル～96 ウェルプレートの全プレー
トフォーマットで実証されている。しかし、この試験用に生成さ
図 5 Greiner 社製 96 ウェルプレートにおける黄色ブドウ球菌
れたデータによると、データの質は厳密には充填量および振
の増殖（100 μL および振盪幅 3 mm）
等幅によって異なることから、予備的最適化実験の重要性が
明確に示された。
GRE 96 ウェル、振幅 3 mm 対 6 mm
参考文献
1)
Amit, R. et al. (2011). Building Enhancers from the
Ground Up: A Synthetic Biology Approach. Cell, 146, p.
105-118.
2)
Kesarwani, M. et al. (2011). A Quorum Sensing Regulated
Small Volatile Molecule Reduces Acute Virulence and
Promotes Chronic Infection Phenotypes. PLoS
Pathogens, Vol. 7, Issue 8.
Levert, M. et al. (2010).
図 6 Greiner 社製 96 ウェルプレート（100 μL および振盪幅 3
3)
mm または 6 mm における黄色ブドウ球菌の増殖曲線の比較
Molecular and Evolutionary Bases of Within-Patient
Genotypic and Phenotypic Diversity in Escherichia coli
Extraintestinal Injections. PLoS Pathogens,
Vol.6, Issue 9.
これらの結果から、Tecan 社は細菌増殖試験には 96 ウェルプ
4)
Heurlier, K. et al. (2009). Growth Deficiencies of
レートを使用することを推奨している。このプレートフォーマッ
Neisseria meningitis pfs and luxS Mutants Are Not to
トは最適化されたパフォーマンスと最高のスループットを兼ね
Inactivate of Quorum Sensing. Journal of Bacteriology,
備えており、完全な増殖曲線が生成される。
Vol 191, No. 4, p. 1293 -1302.
5)
Zaslaver, A. et al. (2009). Invariant Distribution of
Promoter Activities in Escherichia coli. PLoS
Computational biology, Vol. 5, Issue 10.
4
アプリケーションノート
6)
Shachrai, I. et al. (2010). Cost of Unneeded Proteins in
E.coli Is Reduced after Several Generations in
15)
Starfield, B. (2000). Is US health really the best in the
16)
Robert-Koch-Institut (2002).
world? JAMA. 284(4):483-5.
Exponential Growth. Molecular Cell, 38, 1-10.
7)
8)
9)
Hazan, R. et al. (2010). Homeostatic Interplay between
Bacterial Cell-Cell Signaling and Iron in Virulence. PLoS
Gesundheitsberichterstattung des Bundes, Heft 8,
Pathogens, Vol. 6, Issue 3.
Nosikomiale Infektionen.
Giaever, G. et al. (2004). Chemogenomics profiling:
17)
Engelhardt, V. et al. (2010). Antibacterial photodynamic
Identifying the functional interactions of small molecules
therapy using water-soluble formulations of hypericin or
in yeast. PNAS, Vol. 101, No.3, p. 793-798.
mTHPC is effective in inactivation of Staphylococcus
Dean, EJ. et al. (2008). Pervasive and Persistent
aureus. Photochem Photobiol Sci. 9(3):365-9.
Redundancy among Duplicated Genes in Yeast. PLoS
Genetics, Vol. 4, Issue 4.
10)
ACCESSing yeast genomics. Tecan Journal 2009, Vol. 2,
p. 16-17.
11)
12)
略語一覧
Kluytmans, J. et al.(1997). Nasal carriage of
HTS
高処理スクリーニング
Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying
MRSA
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
mechanisms, and associated risks. Clin. Microbiol. Rev.
OD
光学濃度
10 (3): 505-20.
TSB
トリプシン大豆ブロス
Foster, TJ. (2005). Immune evasion by staphylococci.
Nat. Rev. Microbiol. 3, 948-58.
13)
Neu, HC. (1992). The crisis in antibiotic resistance.
Science 257(5073):1064-73.
14)
謝辞
Rosenthal, VD. et al. (2010) International Nosocomial
Dr. Kristjan Plaetzer（Univ.-Doz）および Sandra Winter（BSc：
Infection Control Consortium (INICC) report, data
ザルツブルク大学材料科学・物理学部物理・生体物理科）に
summary for 2003-2008, issued June 2009. Am. J. Inf.
は細菌株の提供および実験にご協力いただき感謝申し上げ
Cont. 38:95-104.
ます。
397049J V.1.0, 03-2012
Austria +43 62 46 89 33 Belgium +32 15 42 13 19 China +86 21 2898 6333 Denmark +45 70 23 44 50 France +33 4 72 76 04 80 Germany +49 79 51 94 170
Italy +39 02 92 44 790 Japan +81 44 556 73 11 Netherlands +31 18 34 48 174 Singapore +65 644 41 886 Spain +34 93 490 01 74 Sweden +46 31 75 44 000
Switzerland +41 44 922 89 22 UK +44 118 9300 300 USA +1 919 361 5200 Other countries +41 44 922 8125
Tecan Group Ltd.では本文書において正確かつ最新の情報をご提供するよう最善の努力を尽くしておりますが、誤謬や脱漏が生じる可能性があります。したがっ
て、Tecan Group Ltd.では明示的または暗示的にかかわらず、本文書における情報の正確性または完全性につき、何らの表明または保証を行うものではありませ
ん。また、本文書は予告なく変更する場合があります。記載された商標はすべて法律によって保護されています。本文書に記載された仕様書の技術的詳細および
詳しい手順については、テカンの担当者までご連絡ください。本文書で取り上げたアプリケーションおよび製品は一部の市場で入手困難な場合がありますので、営
業担当者にお問い合わせください。
Tecan、Infinite および Freedom EVO は主要諸国における Tecan Group Ltd.（スイス、Männedorf）の登録商標です。i-control、Quad4 Monochromators は同社の商
標です。Greiner は独国 Greiner Bio-One GmbH の登録商標です。Corning は米国 Corning Corp の登録商標です。Parafilm は独国 Brand GmbH の登録商標です。
Bacto は米国 BD 社の登録商標です。MaxQ は Thermo Fisher Scientific の商標です。
©2012 Ｔｅｃａｎ Ｔｒａｄｉｎｇ スイス、著作権所有
www.tecan.com www.tecan.co.jp
5