Anti-Human Ago2, Monoclonal (Clone 1B1)

製品コード
M212
研究用
Anti-Human Ago2, Monoclonal
(Clone 1B1)
for Immunoprecipitation
説明書
v201103
真核生物には、21 ～ 24 塩基の単鎖 RNA（microRNA）を介した塩基配列特異的な RNA 翻訳制御による
遺伝子発現制御機構が存在しており、その中でも抑制に働く作用機序は RNA interference（RNA 干渉）、
RNA サイレンシングと呼ばれています。RNA 干渉では、RNA-Induced Silencing Complexes (RISCs) の
主要因子である Argonaute タンパク質と microRNA が複合体を形成することで、microRNA がガイド分
子となり、mRNA 配列依存的な遺伝子発現抑制が行われます 1)。
ヒトの Argonaute タンパク質ファミリーは 8 種類からなり、これらは Ago サブファミリー (Ago1-4) と
Piwi サブファミリー (PIWIL1-4) の 2 つのサブファミリーに分類されています 2)。Ago サブファミリー
の 4 つのタンパク質は、mRNA の翻訳阻害に関与することが報告されていますが 3)、この中でも、Argonaute 2 (Ago2) はエンドヌクレアーゼ活性を有し、RISCs による mRNA 分解を介した RNA 干渉に重
要な役割を果たすことが報告されています 4)。
本製品は、
組換えタンパク質 human Argonaute 2 (Ago2)
（NP_036286.2）
の N 末端領域
（1 ～ 148 アミノ酸）
を抗原として取得したマウスモノクローナル抗体であり、ヒト Ago2 タンパク質に特異的に反応します。
抗原との強い結合能力を持ち、あらかじめビオチン修飾されているためアビジン樹脂による捕捉が可能
であり、免疫沈降実験に利用することができます。
さらに、免疫沈降により回収した抗原抗体複合物からは、microRNA を含む RNA を調製することも可能
です。
I．製品内容
（1）Biotinylated Human Ago2 Antibody (Clone 1B1)（凍結乾燥品）
（2）Lysis and IP Buffer (Cell lysis and wash buffer for IP)
0.1 mg
60 ml × 2
II．本製品以外に必要な試薬や器具（主なもの）
・ Avidin 固定化磁気ビーズもしくは Avidin 固定化樹脂
Magnosphere MS300/Streptavidin（製品コード 5325）など
・ microRNA 精製試薬
RNAiso Plus（製品コード 9108）、NucleoSpin miRNA（製品コード 740971.10）など
・ 抗体希釈用溶液（実験系にあわせて、適宜選択する）
1% BSA/PBS、Blocker™ Casein in PBS（製品コード 37528）、Block Ace™ など
・ PBS（滅菌済）
・ 磁気スタンド（免疫沈降物回収用）
Magnetic Stand (6 tubes)（製品コード 5328）
・ ウェスタンブロット検出用抗体（必要に応じて用意する）
Anti-Human Ago2, Monoclonal（非標識抗体）
（製品コード M211）
・ 微量冷却遠心機
III．保存
（1）Biotinylated Human Ago2 Antibody：4℃
本製品は防腐剤を含んでいません。
復元後のストック溶液は、必要に応じて分注しー 20℃保存で 1 年、もしくは防腐剤（0.1%
アジ化ナトリウム等）を加えて 4℃で 3 か月を目途にご使用ください。凍結融解の繰り返
しは避けてください。
（2）
Lysis and IP Buffer：4℃
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2
製品コード M212
IV．操作方法
IV-1．Ago2 免疫沈降による microRNA 解析の流れ
Step 1 細胞可溶化専用 Buffer (Lysis and IP Buffer＊) で Ago2 タンパク質を含む細胞内成分を
抽出する。
Step 2 ビオチン標識抗体（Biotinylated Human Ago2 Antibody＊）をアビジン磁気ビーズ（も
しくは樹脂）に捕捉・固定化する。
Step 3 細胞可溶化物とビオチン標識抗体固定化ビーズを混合し、免疫複合物を得る。
Step 4 免疫複合物から microRNA を精製する。
Step 5 microRNA 解析
＊：本製品に含まれています。
＜注意＞ 本製品は、ウェスタンブロット解析には適していません。
ウェスタンブロットには、Anti-Human Ago2, Monoclonal（製品コード M211）
（非
標識抗体）をご使用ください。
IV-2．試薬の調製・準備
1．Biotinylated Human Ago2 Antibody（IV-4 で使用）
Biotinylated Human Ago2 Antibody（凍結乾燥品）を純水 100 μl で復元する。1.0 mg/ml の
ストック溶液となる＊。（溶液組成：1% BSA 含有 10 mM PBS, pH7.4）
使用時には、タンパク質含有溶液（1% BSA 含有 PBS、
Blocker™ Casein in PBS、Block Ace™ など）
で 5 μg/ml の濃度に希釈する。1 回の反応で 5 μg/ml の溶液 1 ml を使用する。
＊： 復元後のストック溶液は、必要に応じて分注しー 20℃保存、もしくは防腐剤（0.1% ア
ジ化ナトリウム等）を加えて 4℃で保存する。
希釈後の保存はできるだけ避けてください。
2．Lysis and IP Buffer（IV-3-6 および IV-4 で使用）
細胞の可溶化および免疫沈降反応中の洗浄に使用する。
使用の際には不純物混入を避けるため、別チューブに分注して使用することが望ましい。
microRNA 解析を行う場合は、必要に応じて RNase Inhibitor を添加する。その場合は使用す
る分量のみを分注後、RNase Inhibitor を用事添加する（IV-3-6 参照）。
3．固定化アビジン担体：Magnosphere MS300/Streptavidin（製品コード 5325）
（IV-4 で使用）
1 サンプルにつき 50 μl の Magnosphere MS300/Streptavidin（以下、「ビーズ」と呼ぶ）をマ
イクロチューブに移す。
Magnetic Stand を使用して、滅菌済 PBS 1 ml でビーズを洗浄する。洗浄後、PBS は除去する。
Magnosphere MS300/Streptavidin 50 μl は 0.5 mg ビーズに相当し、ビオチン結合量は 400
～ 600 pmol Biotin/mg- ビーズである。
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3
製品コード M212
IV-3 細胞内成分の調製
1．細胞を用意する。
・ Ago2 タンパク質陽性の培養細胞として HeLa S3（ヒト子宮癌）、HepG2（ヒト肝癌）、
MCF7（ヒト乳癌）等が使用できる。
＊その他の細胞の場合、あらかじめ Anti-Human Ago2, Monoclonal（非標識抗体）による
ウェスタンブロット解析で Ago2 陽性であることを確認して使用する。（ウェスタンブ
ロット解析による確認方法は、VI-1. Ago2 タンパク質陽性細胞のウェスタンブロット
解析を参照。）
・ 1 回の免疫沈降実験に必要な細胞数は、5 × 106 ～ 1 × 107 cells である＊1。
細胞数測定用として、免疫沈降用とは別に、同条件で培養したシャーレ 1 枚分を別途用
意する。
＊ 1：10 cm シャーレで培養した各細胞の 95% コンフルエント時の細胞数（参考値）
HeLa S3
2.4 × 107 cells
5 反応分
HepG2
1.1 × 107 cells
2 反応分
106 cells
1 反応分
MCF7
5.6 ×
2．セルスクレーパーにより細胞を剥がす＊2。回収しやすいように培養上清の量は調整する。
＊ 2：細胞を剥がす際に、トリプシン処理は行わない。トリプシン処理を行うと、免疫沈
降の結果に影響をおよぼす場合がある。
3．回収した細胞懸濁液を 50 ml の遠心チューブに回収し、1,500 rpm (440 × g) で 5 分間、室温
で遠心する。
4．上清を除去し、滅菌済 PBS 10 ml を加えて細胞を洗浄し、1,500 rpm (440 × g) で 5 分間、室
温で遠心する。
5．上清を除去し、滅菌済 PBS 10 ml 加えて細胞を懸濁する。1 反応分 (5 × 106 ～ 1 × 107 cells) ご
とに細胞懸濁液をチューブに分割し、1,500 rpm (440 × g) で 5 分間、室温で遠心する＊3。
＊ 3：細胞を保存する場合は上清を除去した後、可溶化せずにー 80℃で保存する（1 ヶ月
まで保存可能）。
なお、複数サンプルを同時に処理する場合は、この段階で細胞を分割せず、Lysis
and IP Buffer を加えた後、分割してもよい。
6．上清を除去し、チューブあたり 1 ml の Lysis and IP Buffer＊4 を加えて 10 分間氷中に置いた後、
細胞をピペッティングにより可溶化する。
＊ 4：必 要 に 応 じ て RNase Inhibitor を Lysis and IP Buffer に 添 加 す る。（Recombinant
RNase Inhibitor（ 製品コード 2313A）を Lysis and IP Buffer 1 ml あたり約 400 unit
加える。）
7．可 溶化した細胞溶液 1 ml を 1.5 ml のマイクロチューブに移し、微量冷却遠心機を用いて
14,500 rpm (20,000 × g) で 20 分間、
4℃で遠心し、
その上清を免疫沈降の 1 サンプル分とする＊5。
＊ 5：Lysis and IP Buffer で可溶化した細胞溶液は、必ず当日に使用する。
Lysis and IP Buffer 抽出物を BCA Protein Assay でタンパク質定量する場合は、タン
パク質定量の反応阻害を抑えるために、5 倍以上希釈して定量する。
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4
製品コード M212
IV-4．免疫沈降
1．5 μg/ml に希釈した Biotinylated Human Ago2 Antibody 1 ml と、50 μl 分の洗浄した Magnosphere MS300/Streptavidin（ビーズ）を混合し、4℃で 1 時間、転倒混和にてビオチンアビ
ジン結合反応を行う。
2．Magnetic Stand を使用して上清を除去し、Lysis and IP Buffer 1 ml を加え、軽くボルテック
スした後、Magnetic Stand を用いて Buffer を除き、ビーズを回収する。
3．IV-3-7 で調製した細胞可溶化溶液の上清 1 ml をビーズに加え、4℃ 1 時間の転倒混和にて抗
原抗体結合反応を行う。（回転式振とう機の使用が望ましい。）
4．Magnetic Stand を使用して上清を除去し、Lysis and IP Buffer 1 ml を加え、軽くボルテック
スした後、Magnetic Stand を用いて Buffer を除き、ビーズを回収する。
この操作を 3 回実施し、最後に Buffer を完全に除いた状態にする。
同一サンプルを同時に複数の処理（RNA 調製とウェスタンブロット解析を並行して行う場合
など）に用いる場合には、最低量（50 μl）の Lysis and IP Buffer でビーズを懸濁し、分割する。
RNA 調製を行う場合
5．得られた免疫沈降物（ビーズ）に、RNAiso Plus（製品コード 9108）または NucleoSpin® miRNA
（製品コード 740971.10）の Lysis Buffer ML を加えて、製品のプロトコールに従って RNA
(microRNA) を調製する。RNAiso Plus で調製を行う場合は、イソプロパノール沈殿のステップ
での Gen とるくん™ エタ沈キャリア（製品コード 9094）の使用を推奨する。なお、最終精製
RNA の液量は 1 サンプルあたり約 50 μl とする。
ウェスタンブロットで確認する場合
5．得られた免疫沈降物（ビーズ）に対して、SDS-PAGE 用 sample buffer（還元剤含む）を 50 μl
添加し、1 レーンあたり約 10 ～ 20 μl を用いてウェスタンブロット解析を行う。
検出用抗体として、Anti-Human Ago2, Monoclonal（製品コード M211）
（非標識抗体）が利用
できる。5 μg/ml の濃度に希釈した検出抗体で 1 時間反応する。
6．抗マウス IgG - ペルオキシダーゼ標識二次抗体を反応させ、発光もしくは発色（沈着性）基質
を用いて、免疫沈降物を解析する。
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5
製品コード M212
V．実施例：Ago2 免疫沈降物からの microRNA 調製とリアルタイム PCR 解析
＜方法＞
HeLa S3 細胞（5 × 106 cells）からの本製品を使用して得られた免疫沈降物より、1 ml の RNAiso
Plus を用いて microRNA の精製を行った。得られた microRNA 精製サンプルおよび免疫沈降前の
細胞より得た精製 RNA それぞれに含まれる microRNA（miR-23a、miR-92a）を、Mir-X™ miRNA
qRT-PCR SYBR® Kit（製品コード 638314）を用いて検出し、microRNA の回収率を算出した。また、
それぞれの RNA サンプルに含まれる 18S rRNA および GAPDH mRNA を PrimeScript® RT reagent
Kit (Perfect Real Time)（製品コード RR037A）および SYBR® Premix Ex Taq ™ (Perfect Real Time)（製
品コード RR041A）を用いて検出を行い、microRNA 画分の精製効率を調べた。
回収率(%)
15
＜結果＞
検 出 対 象 と し た microRNA（miR-23a、
miR-92a）が Ago2 免疫沈降画分に高効
率に回収できた。また、microRNA 以外
の 18S rRNA お よ び GAPDH mRNA が、
Ago2 免疫沈降画分から効果的に除去さ
れており、microRNA 画分が精製される
ことが確認できた。
10
5
0
miR-23a
miR-92a
18S rRNA
GAPDH
リアルタイム PCR による免疫沈降物中の microRNA 解析
VI．Appendix
VI-1．Ago2 タンパク質陽性細胞のウェスタンブロット解析
＜方法＞
3 種類の Ago2 タンパク質陽性の培養細胞（HeLa S3、HepG2、MCF7）から、同じ細胞濃度（5
× 10 6 cells/ml) の細胞抽出液を調製して Ago2 タンパク質のウェスタンブロット解析を
行った。検出用抗体として Anti-Human Ago2, Monoclonal（ 非標識抗体）を 5 μg/ml の濃
度で使用し、抗マウス IgG - ペルオキシダーゼ標識二次抗体と発光基質を用いて検出した。
M
1
2
3
(kDa)
100
80
60
50
Ago2
レーン M：ウェスタン用マーカー
レーン 1：HeLa S3
レーン 2：HepG2
レーン 3：MCF7
40
＜結果＞
一定細胞数で比較した場合、細胞種により
Ago2 タンパク質の存在量が異なることがウェ
スタンブロット解析で確認できた。
30
20
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6
製品コード M212
VI-2．アビジンコート 96 ウェルプレート上での免疫沈降
少量サンプルの多検体で免疫沈降を行うため、アビジンコート 96 ウェルプレートを用いてビオ
チン標識 Ago2 抗体での免疫沈降を行った。
＜方法＞
1．Biotinylated Human Ago2 Antibody（1 mg/ml）を Blocker™ Casein in PBS で 10 μg/ml に
希釈し、アビジン固定化プレート（BioBind ストレプトアビジンコートプレート Thermo
Scientific 社：Code. 95029 263）の各ウェルに 50 μl 加えて Ago2 抗体を固定化した。プレー
トの各ウェルを滅菌済 PBS で 3 回洗浄した。
2．5 × 106 cells の HeLa S3、HepG2、MCF7 細胞を Lysis and IP Buffer 1 ml で可溶化し、遠
心して得た上清を、4 ウェルに 50 μl ずつ加え、4℃ 1 時間遮光下で反応させた。その後、
滅菌済 PBS で 4 回洗浄し、ペーパータオルに軽くプレートを当てて液を完全に取り除いた。
3．SDS-PAGE 電気泳動用 sample buffer（還元剤含む）50 μl を 1 つのウェルに加え、ピペッティ
ングを行い、固相面上の免疫複合物を回収した。回収した溶液を同一サンプルの別ウェル
に加え、同様の操作を行う。この操作を繰り返し、同一サンプルの 4 ウェル分の免疫複
合物を回収した。
4．回 収した免疫複合物を 1 レーンあたり 20 μl ずつ 2 レーンにアプライし、Anti-Human
Ago2, Monoclonal（非標識抗体）によるウェスタンブロット解析を行った。
(kDa)
M
1
2
3
4
5
6
100
80
60
50
40
7
8
9
Ago2
30
20
レーン M．
レーン 1．
レーン 2．
レーン 3．
レーン 4．
レーン 5．
レーン 6．
レーン 7．
レーン 8．
レーン 9．
ウェスタン用マーカー
HeLa S3 細胞抽出液 5 × 106 cells/ml 10 μl 分
HeLa S3 免疫複合物 96 ウェルプレート 2 ウェル分
HeLa S3 免疫複合物 96 ウェルプレート 2 ウェル分
HepG2 細胞抽出液 5 × 106 cells/ml 10 μl 分
HepG2 免疫複合物 96 ウェルプレート 2 ウェル分
HepG2 免疫複合物 96 ウェルプレート 2 ウェル分
MCF7 細胞抽出液 5 × 106 cells/ml 10 μl 分
MCF7 免疫複合物 96 ウェルプレート 2 ウェル分
MCF7 免疫複合物 96 ウェルプレート 2 ウェル分
＜結果＞
96 ウェルプレートの 2 ウェル分の免疫沈降物のウェスタンブロットによる解析が可能であった。
多検体の Ago2 タンパク質のスクリーニングにはプレート免疫沈降法が利用できる。
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7
製品コード M212
VII．参考文献
1) Grgory RI, Chendrimada TP, Cooch N, Shiekhattar R: Human RISC couples microRNA
biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell 2005, 123:631-640.
2) Sasaki T, Shiohama A, Minoshima S, Shimizu N: Identification of eight members of
the Argonaute family in the humangenome. Genomics 2003, 82:323-330.
3) Pillai RS, Artus CG, Filipowicz W: Tethering of human Ago proteins to mRNA mimics
the miRNA-mediated repression of protein synthesis. RNA 2004, 10:1518-1525.
4) Meister G, Landthaler M, Patkaniowska A, Dorsett Y, Teng G, Tuschl T: Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 2004,
15:185-197.
VIII．関連製品
Anti-Human Ago2, Monoclonal ( 製品コード M211)
Magnosphere MS300/Streptavidin（製品コード 5325）
Magnetic Stand (6 tubes)（製品コード 5328）
RNAiso Plus（製品コード 9108/9109）
Gen とるくん™ エタ沈キャリア（製品コード 9094）
NucleoSpin® miRNA（製品コード 740971.10）
Mir-X™ miRNA qRT-PCR SYBR® Kit（製品コード 638314）
Blocker™ Casein in PBS（製品コード 37528）
v201103