Title 芳香族化合物をアクセプタとするプレニルトランスフェ ラーゼの構造

Title
Author(s)
芳香族化合物をアクセプタとするプレニルトランスフェ
ラーゼの構造および機能解析
矢崎, 一史
Citation
(2002)
Issue Date
2002-03
URL
http://hdl.handle.net/2433/85014
Right
学術雑誌掲載論文の抜き刷り、出版社に著作権許諾が得
られていないため未掲載。
Type
Research Paper
Textversion
publisher
Kyoto University
芳香族化合物をアクセプタとするプレニル
トランスフエラーゼの構造および機能解析
(12680589)
平成 12年度
平成 13年度科学研究費助成金(基盤研究 (
C
)(
2
))研究成果報告書
平成 14年 3月
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研究代表者
矢崎一史
(京都大学大学院生命科学研究科助教授)
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ムラサキ (Lithospermume
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) は、中国、朝鮮、および日本に自生する
多年性革本であり、根部に赤色色素を存し赤紫色を呈するため、「紫根 J の漢名で古来より薬
用、また染料として利用されてきたり 2)。現在でも紫根を主成分とする紫雲膏(華隠青州創薬)
は、火傷、凍傷などの種々の皮膚疾患に対する外用薬として、あるいは痔疾用の坐薬に配合さ
れ繁用されている。
紫根の有効成分は、シコニンと呼ばれるナフトキノン系赤色色素を母核としたその誘導体で
あるとされ、その生理活性には抗菌作用
3
)4
)
、高炎症作用、抗腫蕩活性、肉芽細胞増殖促進作用
などが知られており、最近では抗阻V 活性やめ虫管新生抑制作用も報告されている九
5
)
近年の植物バイオテクノ口ジーの発展に伴い、京都大学の田端らは、ムラサキの芽生えから
以A
含有寒天培地で赤色細胞塊を選抜することにより、高いシコニン生産性を示すカルス株
(
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nM18) を確立した九これにより植物体の根皮のみではなく、培養細胞においてもシコ
ニンの生産を行うことが可能となった。この細胞体を用いて、三井石油化学により、植物培養
細胞によるシコニンの大量生産系の確立が試みられ、細胞増殖用培地とシコニン生産を歪適イじ
した液体培地
(M9培地)を組み合わせるこ段階培養法が開発された九この新規な生産培地
にて培養されたムラサキ細胞は、最高で乾重量あたり 20%ものシコニン生産を可能とし、この
系は植物培養細胞を用いた物質生産系として世界で最初の実用化例となった
1
0
)
。
M9培地開発の過程で、シコニン生合成は様々な佑学的因子によって儲御されることが分か
8
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)
つてきた。即ち Cu
)
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、ジヤスモン酸 11)、酸性多糖均 13)などによって促進され、逆に NH
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、
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2
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4
D)などに抑制されることがこれまで、に報告されている (
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1
)。従って M9培地は通常ム
2
ラサキ培養紹胞の継代培養に用いている L
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)培地に比べ、 Cu
+
濃度が約 1
0
倍高く、窒素源、としては NH
のみを含むように設計されており、他
4+性窒素を全く含まず N0
3の補助要因とも合わせてシコニンの大量生産を最も効率良く誘導できる培地である o この物質
は生合成後細胞外に頼粒として放出されるため、 M9培地を用いたシコニン生産においては培
地及び細胞表面が赤色を呈するという特徴を有する (
F
i
g
.1
2
)。一方凶培地は、細胞増殖を目
的とした培地であり、この培地中で培養される細胞のシコニン合成はほぼ完全に抑制されてい
るo
これまでに知られる、シコニン生合成上最も優先的な抑制因子の一つは光で、あり、シコニン
生産は M9培地にあっても、光照射によって特異的かつ強力に阻害される。この現象は、光を
要求するフラボノイドなどの生合成とは全く逆の性質であり、二次代謝の負の制御の好適なモ
デル系であると考えられる。なお、その阻害効果は青色光が最も強いことが分かつておりへ
本二次代謝の光抑制に何らかの形でフラピン色素が関与していることも示唆されている向。
長官
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附 9medlum
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シコニン生産抑制因子
シコニン生産誘導因子
Fig.1-1 シコニン生産に対する調節因子の影響
左関:鍋イオン、メチルジャスモン酸(MJ) 、オリゴガラクツロン酸(OG) によるシコニン生産
の促進作舟。コントロールの LS培地に、終濃度1.2 μ Mの銅イオンや 10μMのメチルジヤスモン酸
(MJ) 、または 100μg/m1
のオリゴガラクツ口ン酸(OG) を加えたもの。アンモニウムイオン除
去培地では、替りに間濃度の硝酸イオンで補完した。
右図:光、アンモニウムイオンおよび 2，
4-Dによるシコニン生産の抑制作用。コントロールの M9培
地に濃度を振り分けてそれぞれの因子を加えた。
F
i
g
.1 2 LS及 び M9培 地 に お け る シ コ ニ ン 生 産
陣
2
シコニンの生合成経路は、ムラサキカルスを材料としたトレーサ一実験により解明されてき
た。要約すると、シキミ酸経路由来の p七ydroxybenzoica
c
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d (PHB) 及びメバロン酸経路産物で
ある g
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数段階の酸化反応を経てシコニンが合成される均 (
P
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.
1
3
)。
F
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.1
3 ムラサキにおけるシコニン生合成経路
これらの生合成経路に関わる酵素の生化学的研究も、京都大学の田端らや Tubingen 大学の
Heideらのグループを中心に進められてきた。現在のところ、 PHB生合成に関与する p
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、GPPs
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、さらには
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PHB と GDP のカップリングを触媒する PHB:g
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る
。
この一連の経路は PHB と GDPのカップリング反応、つまり GT による反応段階を境に、そ
の性質や制御条件を異にする。これ以前の反応経路は、少なくとも PHB 生合成に関して、光照
射下/暗黒、下、 LS 培地/M
9 培地、いずれの条件においても抑制を受けることなく酵素反応が進
3
み、また生合成中間体はほとんどの場合可溶性で、これに関する酵素群も可溶性であるとされ
ている o これに対してカップリング反応は暗黒下でなければ進まず、これ以降の中間体は疎水
性のため、関与する反応は全て ER及びそれに由来する膜系において行われるとされている o
またそれに従い、 GT 以降の酵素は膜結合性であると予想でき、実際にこれまでに検定されて
いる活性は全てミクロソーム画分で確認されている
。そこで、この境界に位置する GT に関
2
3
)
して、現在までに様々な研究が行われてきた。
2
ムラサキ培養細胞における本酵素活性は、光問、 2，
4-D、NH
4+ によって抑制され、 Cu+
ジャスモン酸
、酸性多糖
1
1
)
によって誘導されることが報告されている o この調節は、シコニ
1
3
)
ン生合成に対する先述の調節とほぼ向調しており、様々なシコニン生産制御に対するこの GT
の担う役割は極めて大きいことが指摘されている。またその生化学的解析より、 GT の活性に
は補酵素として Mg2+などの 2 価イオンを要求すること、細胞内局在場所は小胞体膜上であるこ
と 24)、基質として PHB と GPPにのみ高い特異性があること、本酵素の部分精製によるKrn値
の測定均などが報告されてきた。しかしその単一謹白質としての精製は、現在まで成功には至
っていなし ¥0
植物の二次代謝産物には、花粉媒体の誘寄、環境や食害に対する防御(反応)といった生物
的意義が知られる一方、有用天然物質として我々の生活の中で様々な形で利用されている。こ
れらの植物におけるニ次代謝産物の生産調節機構を解明することは、その生合成経路を解明す
ることと同様に学術的重要性が高く、植物科学の研究分野では霊要課題となっている。 GT の
活性調節に依存するシコニン生合成調節は、一つの遺伝子の発現が様々な因子によって多様に
調節されていること、最終産物が肉眼で観察できること、代謝経路物質の検出が確立されてい
ること等の利点があることから、二次代謝研究のモデルとして適していると忠われる。
本研究ではこの GT をクローニングしてその全構造を解明し、様々な因子による発現調節機
構の解明に繋げることを目的としている o また二次代謝産物には、生合成段階で芳香族環のブ
レニル化を必要とする化合物が数百種確認されているが、これらのプレニルイじを触媒する酵素
遺伝子のクローニングは今まで報告がない。そこで、本酵素のクローニングは、これら多くの
代謝産物の生合成酵素同定への足掛かりとなるであろうことも、本研究の位置づけとして
と考える。
さらに、ムラサキのインタクト植物においてシコニン誘導体は、根の外皮膚(コルク層ならび
に表皮細胞)のみに蓄積するが、この器官特異的なニ次代謝産物の蓄積が、何によるものかは長
い間の議論の対象であった。今回、 i
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nにより、ゲラニルトランスフエラーゼ
などシコニン生合成の鍵酵素類の発現を総織レベルで詳細に解析し、その遺伝子発現様式が二
次代謝産物蓄積の組織特異性に対して果たす役割を検定することも呂擦とした。
4
研究組織
研究代表者
: 矢崎一史(京都大学大学院生命科学研究科助教授)
(研究協力者:
図久美由組
藤崎隆広
山本浩文
佐藤文彦)
研究経費
12年度
1，
600千円
平成 13年度
1，
300千円
言
十
2，
900千円
平成
研究発表
(
1) 学会誌等
K.Touno，H.Harada，K.Yoshimatsu，K.Yazaki，
andK.Shimomura
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H.Matsuoka，K.Shimomura，
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剛
(
2
) 口頭発表
園久美由記、佐藤文彦、矢崎一史、ムラサキにおける 4 ヒドロキシ安息香酸ブレニルトラ
ンスフエラーゼのクローニング、日本農芸化学会 2000 年度大会、東京都、 2000 年 3月
園久美由来己、佐藤文彦、矢崎一史、芳香族をアクセプタとするブレニルトランスフエラー
ゼのクローニングと発現解析、日本植物生理学会 2000 年度大会、名古屋、 2000 年 3月
図久美由紀、佐藤文彦、矢崎一史、ムラサキにおける 4ーヒドロキシ安息香酸プレニルト
ランスフエラーゼのクローニングと発現の解析、日本植物細胞分子生物学会 2000 年度 大
会、静岡、 2000 年 8月
P H
ydroxybenzoic a
c
i
d を基質とするプレニルトランスフエラーゼのクローニングとム
蜘
ラサキにおける発現解析、日本生薬学会 2000 年度大会、所沢、 2000 年 9月
-ヒドロキシ安息香酸フ。レニルトラ
図久美由紀、佐藤文彦、矢崎一史、ムラサキにおける 4
ンスフエラーゼ (LePPT-2) のクローニングと発現機能解析、日本分子生物学会 2000 年
度大会、神戸、 2000 年 1
2月
園久美由紀、佐藤文彦、矢崎一史、芳香族化合物を基質とするプレニルトランスフエラー
ゼの構造と機能解析、日本植物生理学会 2001 年度大会、福岡、 2001 年 3月
矢崎一史、園久美由紀、佐藤文彦、酵母における植物 4 ヒドロキシ安息香酸:ゲラエルン
スフエラーゼの発現と機能解析、日本農芸化学会 2001 年度大会、京都、 2001 年 3月
6
ムラサキにおけるプレニルトランスフエラーゼ
cDNAのクローニング
2
1 PCR法によるプレニルトランスフエラーゼの cDNA断片の増幅
(目的)
本研究では、シコニン生合成経路上のゲラニルトランスフエラーゼ (
G
T
) をクローニングす
るために、 GTと類似の反応を触媒するユビキノン生合成酵素のアミノ酸配列を利用して、 PCR
によるクローニングを試みることにした。まずムラサキの持つ p榔ヒドロキシ安息香酸:ポリプ
レニルトランスフエラーゼ (
PHB:PPT
、以後 PPT と仮称)と棺向性のある蛋自質全てを対象と
した探索を試みた。複数のクローンが得られた場合、発現パターンがシコニン生産のそれと対
応しているクローンを GTクローンとして解析することにした。
(結果)
現在までにクローニングが報告されている PPT遺伝子は、大腸菌 (
u
b
iA)均 η
2、出芽酵母
(
COQ2) 28)29)、分裂酵母 (pp
t
1
) 30)からのもののみであり、これらはミトコンドリアに局在し
て呼吸鎖の電子伝達を担うユピキノンの生合成を行っているとされる。アラビドプシスには、
ゲノムプロジェクトにより配列の決定された類似遺伝子 AePPT が存在するが、植物二次代謝系
には参考にできる遺伝子はない。
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PHB
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.
2
1 シコニン及びユピキノン生合成経路における
GTと COQ2産物の触媒反応
i
g
.2
1
しかし、これらの酵素と GTとは、局在や基質、代謝系こそ異なるが、触媒する反応は F
に示すように非常に類似しているため、少なくとも基質認識部位やその周辺において共通の配
7
列を保有しているのではないかと推察した。そこで真核生物の PPT(EST クローンも含む)を
広く検索してマルチアラインメントを作成し、そのアミノ酸保存領域から数種のブライマーを
設計して (
P
i
g
.
2
2
)、ムラサキの cDNAl
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yを鋳型に PCR法により PPTの増幅を行った ocDNA
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して cDNA末端へのアダプター (AP) 付加を行って作成した。
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←Rぃ2←
R
v
5
Rぃ4 n ψ
3
R
v
・1
M
a
r
a
助。n
a
d
a
p
句r
E~直沼
町田図書司匪守胃寄寓棺理
Fig.2-2 真核生物 PPTアミノ酸アラインメントと
PCRプライマー
F
i
g
.2
3 に示すような様々なプライマーの組み合わせで n
e
s
t
e
dPCR を行ったところ、全てを
通じて非常にスメアーなバンドが増幅された。これらの DNA断片を pT7BlueT
v
e
c
t
o
r(Novagen)
にサブクローニングし、ランダムに 35 クローンをシークエンシングした。これらの配列を
8
GenomeN
e
t(DDBJ) において検索した結果 (
T
a
b
l
e1
)、1クローンが真核生物の P
H
B
:PPT
、特
にy
e
a
試のユピキノン生合成酵素 COQ2 と高い相向性(局所的にアミノ酸レベルで約 50%) を
持っていることが判明した。これをLe
PPTと仮称し、ムラサキの GTの cDNA候補として研究
を進めることにした。
D
・
R
C
hm
，
且
陪 ‘
e 官接
u
mrh
い
J
一
一
⋮
⋮
⋮
品
川
ん
河
川
口
・円以⋮紘一向
n
v
崎
町
555
i ST略語︿ム
︾豆、羽三
templateo
f
2ndPCR
Fig.23 N
estedPCR産物の電気泳動写真
闇
本
DNAは全長約 0
.
6
k
b
pの増幅断片で、両端にプライマ-R
v
2の配列を持っており、 5
'
およ
び 3
'
末端のいずれをも含まない断片であった。よってこれをプロープに用いて、
T
v
e
c
t
o
rにサ
ブクローニングされた PCR産物全般に対しコロニーハイブリダイゼーションを行い、 5
'
末端を
含むより長いクローンを得ようと試みた。また更にこれを n
o
n
s
t
r
i
n
g
e
n
t条件下で行うことによ
り、可能な限り多数のLe
PPTのファミリーメンバーを単離しようと考えた。
その結果、プロープと同ーの 0
.
6
k
b
p断片が更に 3個
、 5
'
末端のアダプター配列まで含む 0
.
8
k
b
p
断片が 5 価得られ、更にシ…クエンシングから、これらの全てが 2 種のグループに分類できる
。
た
ことがわかった。そこでこれらをLe
PP
下ムLe
P
P
T
2 として、それぞれに解析を行うことにし
9
Table1 PCR
産物の Genen
e
t検索結果
()内はテンプレートとした
prlmers
I PCR
・
Rv3
AP2・
R
v
4
AP2・
(
A
P
l・
R
v
l
)
AP2・
Rv2
R
v
l
)
(
A
P
l・
AP2・
Rv-4
(
A
P
l・
R
v
l
)
AP2・
R
v
5
(
A
P
l・
Rv2
)
AP2・
Rv4
(
A
P
l・
Rv2
)
AP2・
Rv5
Rv4
)
(
A
P
l・
AP2.Rv5
Fw1・
R
v
l
APl Rv3
噛
四
1
s
t
抽
2nd
四
幽
四
問
由
lstPCRのprimerp
a
i
r
identity
Dna1l
i
k
e2p
r
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l
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t
edehydrogenase
unknown
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i
b
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a
c
c
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7
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)
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y
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四
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7
，
GTr
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p
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7
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s
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i
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c
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A
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c
r
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p
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h
a
s
el
i
k
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r
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i
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Y
t
c
1p
r
o
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e
i
n
7
c
l
o
n
i
n
gv
e
c
t
o
rpTZ19U( x2
)
unknown(x2
)
岬
開
1
s
t
・
Fw1 Rv2
四
田
・
Fw-2 Rv1
四
2nd
四
皿
2
2
・
・
v
l
)
(Fw1 R
Fw2 RvZ
幅
四
RACE法によるLe
PPTcDNAの全長の単離
(目的)
前項で得られたLe
PP
下 1及び 2 は、翻訳開始コドンもしくは終始コドンを含んでいなかった
1
0
一一………(仇ザ……マ川…
一 一一
一一……一一
一一
ω w
ため、これらの全配列を得てそれぞれにアミノ酸構造解析を行い、吏にはその機能を明らかに
するための強制発現実験を行う材料とすることにした。
(結果)
Le
PPT の全長クローニングに際し、Le
PPT1 の複数クローンにおいては 5
'
末端に開始コドン
叩
が見られたが、Le
PPT2には見られなかったため、Le
PPT-2の 5'RACEおよびLe
PPT-l、2両ク
開
ローンの 3'RACEを行うことにした。テンプレートは前節で作成した cDNAl
i
b
r
a
r
y、5浪ACEお
よび 3'RACE用ブライマーは、断片の中央あたり (
F
i
g
.24
、 2
5
) で設計した o RACEの結果、
Le
PPT-l，2ともに 5
'
および 3
'
末端までの配列が明らかになった。
これらの配列を参考に更に全長 cDNA を増幅するためのプライマーベアを作成した。すなわ
ち 5
'
末端側はアダプター配列を除き、 3
'
末端側は polyA配列を除いた 2 紐のブライマーペアを
用い、正確性の高い Pfupolymerase(Promega)によって cDNAl
i
b
r
a
r
yをテンプレートに、Le
PPT-l
及び之の全長をそれぞれ改めて増幅した。
cDNA
t
e
m
p
l
a
t
e
苫4こ pt
Rv
・
2
圃圃・圃圃 ー
総司両
Rv2
Rv・2
橿
司膿
AP2
Rv-2
臨
盟
AP2
5'RACE
p
o
げ什
帽
estedPCR
社
4開 園
5'RACE
4ト
醐+
田富
3
'
R
AC
皿 E
酢
叩
3'
R
ACE
~~~
F
u
l
ll
e
n
g
t
hLePPT
P~~
士t
一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一竺'JI'I
F
i
g
.2-4 LePPT全長クローニングの概要
Le
PPT1
、2は互いに DNA レベルで 74% (
F
i
g
.2
5
)、アミノ酸レベルで 93%の相向性を有し
蜘
ており、Le
PPT-l は 306アミノ酸、Le
PP
下 2は 3
07アミノ酸をコードしていた。これらの U1R
には相向性は無く、 5'U1RはいPPT-2の方が約 90塩基ほど長くなっていた。また h
y
d
r
o
p
a
t
h
yp
l
o
t
によると、本蛋白質は非常に疎水性が高く 8
"
"
'
9 回膜貫通型の膜蛋白質であることが示唆され
た (
F
i
g
.
2
6、下線)。
アミノ酸レベルで他の真核生物の PPT と比較すると C
F
i
g
.2
6
)、活性部位と思われる 2箇所
の親水性領域の配列が高く保存されていた。 N 末端に近い方がブレニル基認識部位と推定され
る INDXXD配列
であり、他方が COQ2ファミリ…に良く保存されている GIKSTAL配列であ
3
1
)
1
1
るo 後者は PHB認識部位と推定されているが、実験的根拠は今のところ示されていない。まか、
CBSサ ー バ ー の 叩a
lP(
加t
p
:
/
/
w
w
w
.
c
b
s仰 い 例 制 官 ' / ) を 用 い て 輸 送 シ グ ナ ル の 解 同
P
P
T以外の PPT(
P
P
T
l
i
k
ep
r
o
t
e
i
n
)は全てミトコンドリア移行シグナルを有
行ったところ、Le
しており、 COQ2 と同様ミトコンドリアでのユピキノン生合成に関わるものであると考えられ
た。実際、出芽酵母と分裂酵母では、これらの蛋白質がミトコンドリア局在であるというデー
タがある。一方でLe町はミトコンドリア輸送シグナルを持っておらず、このことから
J
本蛋
白質がユビキノン生合成に関与する他の P
P
Tとは異なり ERに輸送される可能性が示唆され、
これはシコニン生合成における GTが ER膜に局在するというデータとよく一致していた。
1
2
LePPT1
LePPTZ
TCATCACATC TCTCAGTTTT CTCTGCTTCT TTAAATACTT CAAACTAAAT TTGTTAATAC TACTTCCTAC AAGTG
LePPT-1
LePPT2
ATATTT
冊
開
汚
橿!噛臨君!翻意:::趨歯圏;審醐2
母:圏;;薗
叩
T12
開始コドンー
伸 T1
L
e
し
e
伸T
-2
1
4
3
216
1
LePPT・
LePPT2
218
291
LePPT1
LePPT之
293
366
LePPT・.
1
LePPT2
368
441
LePPT“1
LePPT之
4
4
3
516
LePPT1
LePPT之
518
591
LePPT1
LePPT-2
593
666
司
翻
申
4
LePPT1
LePPT-2
働
668
741
司
・
・
区
一
一
L
e押 下1
LePPT-2
743
816
LePPT1
LePP
丁
目2
818
891
LePPT1
LePPT2
893
966
L
白押下1
L
e押 T之
968
1041
命
却
酬
雷鳴霊寝1
1
;
翻;翻 i
お
LePPT1
LePPTZ
岨
TA
叩
回終止コドン
園調~ t~~種目翻密:;::趨額圏構i;j;iiiii;;iE-
LePPT-1
LePPTZ
叩
LePPT1
LePPT-2
1094
1183
情
TTGGTAGTAA AT
Fig.25 LePPT・1、LePPT-2の全長 cDNA配列
圃
1
3
LePP
・
T1
LePPT.2
Sp.
pPT
50
・
PPT
A
t
.
P
P
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.......
.
.
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・
・
・
・ .
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Q
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欝.-VS5時運:t，-・暢咽・・・- -----.
.
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整~L'P 臨'11"
島日甲，・﹃
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50
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PPT
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議...55焔審議手l..・・・・・・・
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44 4
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1
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騨.FIII町時~~しし~51 し宙開 vrVAβIIG 55RKRYT555 55・.555・
・
・ ・・照割<E5AP 警
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・・・・・・
動FFGL5R略 目 し しK55VSVTP55部 品 しQ 5骨iKSLSNPVTTHYTNPFTK CY齢期ON出動If)K噂凶Q EKFFG喝 附 YRL岬 腕 部
睡
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.
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1
週
76
77
119
136
177
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.
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…
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……
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LePP
下1
LePP
・
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5p.
pPT
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PPT
A
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.
P
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154
155
198
214
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鵬麗薗薗麗
.
.
.
品
制 TI
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画
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0
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.
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1
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i
z
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J
j
A
t
:Arabidopsis的 a/
iana
S
c
:SaCc.白'aromycesc按1'evisi~棺
醐燭欄鯨醐翻踊
予想膜質逝飯場
議題女学 PHB:PPT
時保脊アミ/醸配列
麗臨臨踊
プレヱ 基 麗 予 癌 輯 額 犠
)
v
F
i
g
.2-6 LePPTと真核生物 PPTとのアミ ノ酸アラインメント
ムラサキにおけるLe
PP1‘の発現解析
前章までで、単離したLe
PPT-l、2がシコニン生合成の GTかどうかは不明であった。そこで、
これら 2 クローンのムラサキにおける発現解析を行うことで、本クローンがシコニン生合成酵
素の GTであるのか、またはユビキノン生合成酵素等の別の PPTであるのかを推定することに
した。
ムラサキにおけるシコニンの生合成は根部に限られているが、これは生合成酵素の活性、少
なくとも GTが光によって強く抑制されるためと思われる。事実、培養細胞を用いた実験では、
GTは光照射によってほぼ完全にその活性を抑制され、それに伴いシコニンの生産も停止する
ことがわかっている
1
6
)0
またその生理的意義は不明であるが、本酵素はアンモニウムイオン、
2，
4心によっても活性が強く抑えられ、ジャスモン酸
1
1
)
、酸性多糖 13)によっては逆に活性が上
昇することが知られている。 GTがこのように多様な活性調節を受けている一方、生命維持の
基本的機能を担うユピキノン生合成酵素である PHB:PPT にはこのような特徴的な調節は知ら
れておらず、恒常的発現をしているものと考えられる o
またゲノムサザンを行い、本クローンがムラサキに何コピー存在するのか確認を試みた。
3
1 光による発現抑制
シコニン生合成に関与する GTの、発現様式における最大の特徴は光による発現抑制である。
そこで光によるLe
PPT発現への、mR
NA レベルでの影響を調べることにした。ムラサキ培養細
s
) と暗黒下でそれぞれ振とう
胞 (M-18株) 19を M9培地に移植して、光照射下 (80μE/m2・
培養し、経時的(移植時、培養 1日目、 4日目、 8日目、 1
5日目)に細胞をサンプリングした。
これらの細胞からmR
NAを抽出して (
2
1 と同様の k
i
t を使用)ナイ自ンメンブレンにブロッ
ティングし、Le
PPT-l、Le
PPT
之の 5
'
末端側各約 0
.
7
k
b
pをプローブ、に N
o
r
t
h
e
r
nh
y
b
r
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d
i
z
a
t
i
o
nを行
った(これらのプローブ、による c
r
o
s
sh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nは、核酸量が 10ng以下ならばLe
PPT-lと一 2
伽
をほぼ特異的に検出できることを確認した )
0 RIの検出は X線フィルム (Kodak) への感光によ
り、シグナルの定量はバイオイメージングアナライザ --BAS-2000 (富士フィルム)により行
った。発現量を数値イじするため c
o
n
t
r
o
lとして、タバコの ATPs
y
n
t
h
a
s
eβ
s
u
b
u
n
i
tをプローブに
用いた h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nで補正を行い、 o日目の発現量を 1としてmR
NAをグラフにプロットした。
一方、培養細胞のサンプリングと平行して、同条件下での培地へのシコニン蓄積量も、経時的
にサンプリングすることで測定した (
F
i
g
.
3
1
)。
1
5
.
田 PPT・ILight
mRNA
相対量 (
O
d
a
y
=
l
) 酬
No
同h
e
r
nh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n
酬
Ught
O
4
8
D
a
r
k
15
o
4
寄
8
15 何時.)
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1
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咽
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酬 PPT-IILight
10
15 (
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シコニン蓄積量
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… 宰3
活
字
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)
50・o1
， 同
t
同
0 4 8
回
s
官
笛脚{由抑}
Fig.31 暗黒下及び光照射下における
発現量とシコニン蓄積量
帽
LePPTのmRNA
その結果、Le
PPT
・
1
"2 共に光によってmR
NA の発現が制御されていることが明らかとなっ
た。すなわち光照射によって発現は強く抑制されており、逆に精黒下では、移植後 1週 間 目
2 週間自のシコニン蓄積量の急激な増加に先んじて、Le
PPT の発現誘導は約 1週間で最大とな
り、その後も高いレベルで保持されていた。これは、Le
PPT がシコニン生合成と関連している
ことを示唆する結果で、あった。
4-D及びアンモニウムイオンによる発現抑制
3
2 2，
物理的制御因子である光に引き続き、化学的制御因子のLe
PPT遺伝子発現に対する
もあ
わせて観察した。 2，
4-D及 び NHJの影響を見るため、 M9培地に終濃度 1μMの 2，4心または lm M
の NH/を添加し、その時のLe
PPTmR
NA レベルを無添加の M9 培地でのぞれと比較すること
にした。ムラサキの培養細胞は移植して暗黒下で培養後、 7 日目にサンプリングした。ここか
らt
o
t
a
lRNAを抽出し、 3
1と同様にLe
PPT-1、2をプローブに N
o
r
t
h
e
r
n解析を行った (
P
i
g
.
3
2
)。
数値の補正 c
o
n
t
r
o
lには 18SrRNAを用い、 3
1と同様に 0日目の発現量を 1としている。
1
6
N
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b
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mRNA相対量
7
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伺!l
Y
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十+2，4-0
(
L
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1
)
・
ロ 胸 陸 側:.NH4+
> M町+仰}
唖晶
・
4 由
hguaaAV旨冒留意エω巻骨由︽之氏g
L
e
P
P
T1
圃
M
o
7
治醐伸明}
L
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P
P
T
2
(
L
e
P
P
T
2
) 白 胸 臨 M9{+NHの. M明暗ルD)
，h a '
Mess軍事こま24霊区 E
h勝目
1
8SrRNA(controり
。
7
也m伸明}
PHB:GT活性
エキノフラン蓄積量
口M9髄 M9
{
+NH4+)• M9
{
+2
，
4
D
)
NH4勺薗 M9
口 鵬 語 版 町:
+
{
+2
，
4
唱
}
300
2b250
~!
幽
.
内
苦言問。←……
窓堅
苦言問。
~lIC.
ー
型F
開 Z
~S
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150
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怠
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、
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，
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。 。
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c
7
o
倫n
e
(
d
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y
a
)
7
治隅{白川
Fig.3-2 LePPTのmRNA発現、 GT
活性、エキノフラン蓄積量に対する
2，
4Dの影響
アンモニウムイオンと
圃
サンプリングと平行して培養細胞における GT の酵素活性測定を行い、mR
NAの発現パター
ンと比較した。また同時に、培地中のジヒドロエキノフラン (DHEF)及びエキノフラン B(EFB)
蓄積量も測定した o DHEF等は、 GT によるカップリング反応後、シコニンよりも迅速に生合成
される副産物であることから (
F
i
g
.1
3
)、GT活性変動の代謝産物への反映を短期間で、モニター
するにはより適した化合物である
。
1
3
)3
2
)
PPT-1、2 のmRNA の発現は共に、 2，
4心
、 NH/によって強く抑制されること、
その結果、Le
またその発現の変動は、 GT 活性及ひ、エキノフラン類の蓄積量と良い一致を示すことが明らか
となった。
3
3 ジヤスモン酸及び酸性多糖による発現誘導
1
7
N
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r
t
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t
i
o
n
mRNA相対量
(
L
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P
P
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1
)
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1
y
s
)
ロLS(+Cu何回 LS(+Cu2+，
+M
J
)
副 LS(
+C
u2
+
，
+
0
0
)
zas鷲主要也曲芸館 E
2
官
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L
S +MJ +OG
Le
PPT
輔
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2
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L
S +MJ +OG
5
。
。
2
t
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l
自拘}
(
L
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P
T2
)
圃
ロLS(+Cu2+)踏 LS(+Cu2+，
+M
の
瞳 LS(+Cu2+，+00)
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L
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P
P
T
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，2
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2
a
副ays)
量
L
S +MJ ゃOG
匂
沼
山
・
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弘
骨
骨
骨
抱
幅
血
多
抱
似
錨
畠d白ム宇品m
曹
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必制帽品雌品岨眠
'::;:;:::'、崩踊蝿旋磁調盈掴圃圃圏画面綴弱窃窃語圏踊舗臨
:
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.
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国語障福留鐸臨盟諸園田園冨睡眠鹿沼田醐跡
5
警
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・
・
・
・
・
置
圃
圃
圃
圃
画
面
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
歯
菌
・
・
・
・
・
圃
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圃
・
・
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9鍾園園田園圃冒頭盟国・・・・圃置置園田園圃園眼底~~
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置
:
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複層圏直欝盛田盟国圃置麗留置園田置臨1II1i'::::"
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繍摺勝酒屋置麗擁麗彊霊殿
き
畠
188r
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N
A
(
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2
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(
1
品川
PHB:GT活性
エキノフラン蓄積量
ロLS(+cu2+)盤 LS(.必 u2+刈母由 LS(+Cu2+，+00)
2
5
0
1
.
.
.
.
.
.
.
.
間
p，
50
町
EE
21200
n
w
NE
弘警受諾磁区間
V
E
hち医S
内町民
wn
自
民
唖
咽・・
ロLS(+cu2+)幽 LS(+Cu2+，
+M
J
)
・ LS(
+C
u2
汽+00)
内
c
.
.
50
5
100
g
'
50
4
盟
。
g
。
。
2
o
tlme{l品川
2
t
i
r
隅 (
d
a
y
a
)
Fig.33 L
ePPTのmRNA発現、 GT
活性、 エキノフラン蓄積量に対する
圃
メチルジャスモン酸( 島日)及び酸性多糖( OG) の影響
次に、ジヤスモン酸、酸性多糖の添加によりLe
PPTの発現に誘導がかかるか否かを観察した。
これらの因子による GT誘導には高濃度の銅イオンが必須であるため、あらかじめ終濃度1.2μ
2
M となるよう Cu+を加えた凶培地(通常の L
S培地の Cu2+濃度は 0.1μM) を用い、これに終
0
0
μ g/
mlのオリゴガラクツロン酸 (OG) を
濃度 10μMのメチルジヤスモン酸 (MJ)、または 1
加え、培養細胞を移植した。暗黒下培養 2日目にサンプリングし、
3之と同様に N
o
r
t
h
e
r
n解析、 GT酵素活性測定、 DHEF蓄積量の測定を行った (
F
i
g
.
3
3
)。
その結果、 OGの影響はわずかではあるが、 MJによっては明らかにLe
PP
下1
、2ともにmR
NA
発現が誘導され、 これは GT活性及ひ、エキノフラン類の蓄積量に対する影響と同調していた。
1
8
¥た内線全信号手均認さ:竺慾釜訟話盗益弘￥そ白川将紛然倒的池辺訟とど吟桝バゆでふ伽
ω仰 い 伊 小
3
4 植物体における発現部位
更に、植物体におけるLe
PPT の発現部位を特定するため、ムラサキを根部(主根、側根)、
茎部、葉部に分割してそれぞれmR
NAを抽出し、 3
1と同様の手順で N
o
r
t
h
e
r
n解析を行った (
F
i
J
!
5仏 そ の 結 果 、 L e
PPT-1、2 の発現は根部に限られており、そのうち大部分が側根に集中
L
て
いた。数値は全発現量に対するパーセンテージである。この偏りは、シコニン生合成が根部表
層でのみ行われるため、その関係酵素の発現は、皮膚や中心柱の占める割合が大きい主根では
相対的に低くなっているためと考えられる。
以上の発現解析結果を総合して、今回クローニングした 2 種のクローンは共に、ユピキノン
生合成酵素である可能性は低く、むしろシコニン生合成に関与している GT をコードしている
と考えた。
Northernh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n
側根主根茎
葉
植物体における LePPTの mRNA発現割合
Le
PPT1
(
t
o
t
a
l
=
1
0
0
%)
由PPT-1 口P
P
γ2
，圃
側根主根
茎
(%)
葉
醐
100
80
60
Le
PPT
・
，2
側根主根
茎
40
葉
20
o
側根
主根
茎
葉
部位
ATPsynthase β(control)
瞳
F
i
g
.
3
4 LePPTの植物体における発現部位
3
5 ゲノムサザン法によるLe
PPTファミリーの探索
ムラサキのゲノムの中には、シコニン生合成に携わる酵素プレニルトランスフエラーゼとと
もに、普遍的に存在するユビキノン生合成酵素 (COQ2 のムラサキのホモログ)が存在するこ
とが予想される。そこでLe
PPT をプローブとして、ムラサキに存在する PHB:PPTの遺伝子フ
ァミリーの形成を検定することを試みた。ムラサキ植物体は天藤製薬株式会社にて保存されて
いる系統(長野県産)及び仙台産の 2種、制限酵素には EcoR1
、HindI
I
I
、EcoRV (NEB) の 3
種を用いた。 680bpの いPP
下 1断片をプロープに l
ows
t
r
i
n
g
e
n
tの条件で S
o
u
t
h
e
r
nh
y
b
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i
d
i
z
a
t
i
o
n
を行ったところ、強いバンドが 2
"
"
3、弱いバンドが 2 本認められ、本クローンのホモログは相
1
9
幽圃園田白血田』ーー一
向性の高いものが 2
"
"
'
3コピー、低いものが 2コピー存在すると推定された (
F
i
g
.3
5
)。相同遺
伝子のうち 1つはLe
PPT-2であると予想され、Le
PPTの遺伝子ファミリーは小ミし 1ものであ
i
ことが判明した。すなわちムラサキには、Le
PPT-l、2 によってコードされるシコニン生合成関
連のプレニルトランスフエラーゼ以外には、ユピキノン生合成系の酵素が#在するにすぎない
可能性も考えられた。
m E mz
口
一
哩
.
-
.
.
思9: :
D ~~
<:司 v
=
体b
p
)
Fig.35 LePPT-lのゲノムサザン解析
圃
20
ムャルM 制 令 切 吹 か 悦 ず
久 似 品 ヴ 抑 制W い わ
ω
…
一
酵母におけるLe
PPTの強制発現および機能解析
前章までに、ムラサキにおける Northern解析の結果、化学因子による発現調節パターンが GT
活性のそれと類似していること、及びその発現部位が根部に限られていることより、Le
PPT
・1
、
之はともにシコニン生合成に関与しているであろうことを推定した。またそのアミノ酸配列よ
り、本クローンは膜局在性の、 PHB を基質とするプレニルトランスフエラーゼであると予測し
た
。
そこで本クローンをヘテロなホストにおいて強制発現させ、実際にその酵素としての機能の
証明を行うことにした。すなわち、まずシコニン生合成酵素として、 PHB にゲラニル基を転移
する酵素活性を保有しているか否か、次にその活性がゲラニル基に特異的なものであるかどう
かを検定し、本クローンがシコニン生合成のための GT であり、ユビキノン合成酵素とは異な
る性質を持つことを示すことにした。
Le
PPTの強制発現実験を行うホストとして、最初に試みたのは大腸菌株 XL1-Blueで、あった o
LePPT-1，2の CDSr
e
g
i
o
n全体をそれぞれ、フレームを合わせて p剖 u
e
s
c
r
i
p
tSK (
う (
s
t
r
a
t
e
g
e
n
e
)
の MCS に導入し、 lacZpromotor により強制発現を行うことを計画した。しかし本クローンの
翻訳産物が膜蛋白質であることから大腸菌の締抱膜を破壊しているためか、Le
PPT-1 を発現さ
せた大腸菌は液体培地で全く生育せず、Le
PPT-2 を発現させたものも極端にその生育が悪かっ
た。そこで lacZpromotorの詑p
r
e
s
s
o
rをコードする pREP4(QIAGEN)を前もって大腸菌株 (M15)
に導入し、その後重ねてLe
PPT を導入することによってLe
PPT 蛋白質の大量発現を抑制、コ
ントロールしようと試みたが、その効果は見られず、大腸菌を十分に生育させることはできな
かった。
4
1 COQ2欠損株の作成
大腸閣をホストとしたLe
PPT 発現は不可能と判断したため、一般に膜蛋白質発現実験に用い
られる出芽酵母 (
S
a
c
c
h
a
r
o
m
y
s
e
sc
e
r
e
v
i
s
i
a
e
) をホストとして、本クローンの強制発現を行うこと
にした。
しかし前述の通り、酵母はユビキノン生合成系 PPT遺伝子である COQ2を保有している。こ
の酵素の役割はミトコンドリアにおいて町田とヘキサブレニル基 (C30) のカップリングを行
うことであるが (
F
i
g
.2
1
)、その酵素学的解析より、本酵素はかなり基質特異性が広く
、ヘ
2
9
)
キサプレニル基のみならず、ゲラニル基 (C10) をも基質として認識することが分かつている。
つまり、酵母において外来蛋白質の GT活性を測定する際に、ホスト自身の保有する COQ2 に
より GT 活性のパックグラウンドが上昇してしまうことが考えられた。そこで酵母の COQ2遺
伝子を破壊し、これをホストとすることにした。
野生酵母株としては W303-1A[
a
d
e
2
嫡
1
/h
i
s
2
1
1，
1
5
/l
e
u
2
3，
1
1
2
/t
r
p
1
-l
/u
r
必1]を用い、下図の方
法にしたがって
、相同組換えによって COQ2 の大部分を G
e
n
e
t
i
s
i
n耐性(マーカー)遺伝子
3
3
)
21
jj
明言々
包括 4
と置換した COQ2欠損株を作成した C
F
i
g
.
4
1
)。
4
脈融弘司
PCRによる Genetisin樹
性遺伝子の増幅
Ge
n
e
t
i
s
i
n耐性遺伝子
(pUG
の
増幅断片のトランスフォーメー
ション
.
曹
器製揺
盤盟器
組替え
一骨髄輔蔀溜鴎部滋瀦悶悶瀦器購鴇随一一
COQ2遺伝子
COQ2欠損株の完成
一一品ぬ可部
誕瀦路一一
Ge
n
e
t
i
s
i
n耐性
F
i
g
.
4
1 酵 母 COQ2遺伝子の破壊
COQ2 遺伝子が破壊されていることの確認は、 PCR を用いたゲノムレベル、および COQ2 欠
損株の形質レベルで確認した。 PCR は、野生株酵母および COQ2欠損株酵母からそれぞれゲノ
ムを抽出し、 COQ2遺伝子の両端の配列をブライマーに用いて行った。野生株では COQ2 の全
長約1.5kbp断片が増幅し、 COQ2欠損株では G
e
n
i
t
i
s
i
n抵抗性遺伝子を含む約 2kbp断片が増幅
した (
F
i
g
.4
2
)。また COQ2欠損株は炭素源の発酵経路がうまく機能せず、グリセロールを炭
素源として利用できないことが知られている
。すなわち、 SD 最小培地 (2%グルコース)
3
4
)
においては生育できるものの、 SD C3%グリセロール)では生青できない。この形質を利用し
て COQ2遺伝子欠損の判定を行った結果、得られた G
e
n
e
t
i
s
i
n耐性株 1
6株のうち、 15株の COQ2
遺伝子が破壊されていることが分かつた。また、この欠損株の形質は COQ2 遺伝子を再導入す
ることで回復していた C
F
i
g
.4
3
)。そこで、Le
PPT-1，2 がこの形質を回復させる能力があるか
どうかを調べるため 2種のLe
PPTの形質転換酵母をそれぞれグリセロール培地にて培養したが、
c
o
m
p
l
e
m
e
n
t
a
t
i
o
n は認められなかった (
d
a
t
an
o
t shown)。これにはいくつかの理由が考えられ、
PPT がヘキサブレニル基を基質とできないこと(後述)、第二に、Le
PPT がミトコ
第一に、Le
ンドリアに輸送されていない可能性が高いことが考えられた。いずれにせよLePPTは、そのま
までは COQ2の機能を相補できないことを確認した。
22
D
U
A官 宵 闇 事
・
E
.
噌喜
M
一
陣 t岡弘F
︼
FVE
MW
2kbp.
.
1
.
S
k
b
p...
酔
Fig.42 PCRによる COQ2欠損株の確認
薗
Fig.43 酵母 COQ2破壊株の形質とその回復
瞳
42 Le
PPTのゲラニルトランスフエラーゼ活性
田
酵母 COQ2欠損株への遺伝子の形質転換ベクターには、 T
u
b
i
n
g
e
n大学の Frommer博士より分
与いただいた pDR196 (pDR1953勾の MCS を改変したもの)を用いた。このベクターに組み込ま
れた遺伝子は、酵母の中で P
l
a
s
m
amembraneATPase (PMA) 1p
r
o
m
o
t
o
rにより恒常的に強く発
現する (
F
i
g
.4
4
)。このベクターに 2種のLe
PPTの CDSを EcoR 1(
5
'
)、助o 1(
3
'
) サイト
で接続した p
Le
PPT-1，p
-Le
PPT-2を作成し、ベクターコントロールとしての pDR196 とともに
COQ2 欠損株への形質転換を行った。 pDR196 にはマーカーとして U
r
a
c
i
l要求性の相補遺伝子
23
があるため、選択培地には SDιUraci
I)培地を用いた。酵母へのプラスミド導入の確認は、形
質転換した酵母からプラスミドを抽出し、それを大腸菌に再導入してコロニ- PCR することに
より行った。
Xhol
ADHt
e
r
m
i
n
a
t
e
r
O
r
i
pDR196
6
.
0
4Kb
p
PMA
1promotor:
Pla8mamembraneATPasepromotor
ADHt
e
r
m
l
n
a
t
e
r
:
Alcoholdehyd~enase 加rmlnater
Fig.4-4 酵母形質転換ベクター pDR196の構造
野生株酵母は YPAD培地、形質転換した 3種類の酵母は G
e
n
e
t
i
s
i
n(
2
0
0
μg
/
ml)を加えた YPAD
培地で 30Cで振とう培養 (
1
6h
r
.
"
'
'
3
0h
r
.
) し、酵素活性を測定するために対数増殖期 (OD6∞
ニ
0
1
.5
"
'
'
2
.
0
) で回収した。スブエロプラスト法により縮胞壁を消化、ダウンス型破砕器で細胞破
砕し、 1
0
，
000g遠心分離によりミトコンドリア圏分を、 1
0
0，
000g超遠心分離によりミク口ソー
ム画分を回収し、粗酵素液として用いた。この粗酵素液を用いて GT活性の澱定を HPLC で行
った結果、野生株のミトコンドリア薗分で見られる COQ2 による GT活性は、 COQ2 欠損株で
は完全に無くなっていることを確認した。これにLe
PPT-1 または 2 を導入した酵母では、その
ミクロソーム画分で、ベクターコントロールには見られない明らかな GT活性が観察された (
F
i
g
.
4
5
)。このことよりLe
PPT の遺伝子産物は共に、少なくとも酵母において、ミクロソーム上で
GT 活性を示す酵素であることが確認できた。更に、熱変成させた粗酵素液を用いて同様の活
性測定を行い、 HPLC で反応産物 GBA(
g
e
r
a
可l
p
h
y
d
r
o
x
y
b
e
n
z
o
i
ca
c
i
d
) が全く検出されないこ
とを確認した。
2
4
350
出
町
・
唱
3
跡
割加
g
回
世
帥
250
g苗 2∞
冨手
zι
掘 z
t
=
ー 1弱
宮
h百
EE T∞
匙4
2
a
関
国
z
凪
o
Wild
dcoq2+
v
e
c
t
o
r
(
c
o
n
t
r
o
l
)
m
i
t
o
c
h
o
n
d
r
i
a
dcoq2+ d∞q2+
PPT-2
Le
PPT-1 Le
m
i
c
r
o
s
o
m
e
P
'
I
'
の GT
活性
Fig.45 酵母における強制発現 LeP
帽
LePPTの強制発現による遺伝子産物の蓄積を観察するために、抽出したミクロソーム画分の
kDa
)付近に
粗酵素液を用いて SDS-PAGEを行ってみたが、残念ながら予想できるサイズ (
3
4
ベクターコントロールと明らかな差があるバンドは見られなかった (
d
a
t
an
o
tshown)0 Le
PPT
は、活性は高いものの発現量は SDSPAGEや CBB染色で確認できるほどの高いレベルではな
佃
いと判断された。
43 Le
PPTの酵素基質特異性
阻
Le
PPT遺伝子産物が GT活性を有していることが確認されたことにより、さらにこの基質特
異性を検定し、 COQ2 遺伝子産物のように広い基質認識性を持つものであるのか、それともゲ
ラニル基にのみ高い基質特異性を示すシコニン生合成系の酵素であるのかを明らかにすること
を試みた o
前述の 4
2 項における方法で粗酵素液を抽出し、酵素反応を行った。プレニル基質としては
ジメチルアリルニリン酸 (DMAPP/C5)、ゲラニルニリン酸 (GPP/CI0)、フアルネシル二リン
酸 (FPP/C15)、ゲラニルゲラニルニリン酸 (GGPP/C20) の 4種を、プレニルアクセプターに
はベンゼン環を 1
4
C標 識 し た 放 射 性 PHB (Sigma) を用いた。 FPP との反応産物 f
a
r
n
e
s
y
l
h
y
d
r
o
x
y
b
e
n
z
o
a
t
e (四A) や GGPP との反応産物 g
e
r
a
n
y
l
g
e
r
a
n
y
lh
y
d
r
o
x
y
b
e
n
z
o
a
t
e (GGBA) の検出
は、反応産物を1L
C で展開した後、その1L
C 上の放射活性を BAS2000を用いて測定すること
で、行った。
1
誌は PHBに転移したブレニル鎖長に比例しているとされ、実際に検出
1L
C においては、 Rfi
した酵素反応物のスポットは、 CI0、C15、C20 と鎖長が長くなるに従って段階的に高くなって
2
5
いる o スポットの下部の強いシグナルは未反応の放射性 PHBである o GBAのスポットは標品
との直接比較により向定した。 4 種の基質に対する反応には同じ粗酵素液を用いているため、
反応あたりの酵素蛋白質量は一定になっている。これらの酵素活性を、ゲラニル基に対する活
性を 100%として数値化した結果、野生株のミトコンドリア画分において酵母の COQ2 遺伝子
産物はゲラニル基のみならずフアルネシル基、そして特にゲ、ラニルゲ、ラニル基に対して強い基
PPTは双方ともゲラニル基のみを基質としていた (
F
i.
Q
:
質認識性を示したのに対し、ムラサキのLe
4仏ジメチルアリル基に関しては
ωQ2産物もあまり活性を有しないようであったが、これ
と同じ現象は E
.c
o
l
iの o
c
t
a
p
r
e
n
yI
t
r
a
n
s
f
e
r
a
s
eにおいても知られている (
D
r
.L
.Wessjohanより)。
また、このような反応産物のシグナルは、熱変成させた粒酵素液、およびベクターコントロー
ルによる実験では全く見られないことを確認した。
PPTは従来ク口一ニングされている COQ2等のユピキノン生合成酵素と
以上のことから、Le
は性質を異にし、二次代謝系においてシコニン生合成を行う GT をコードしていると結論付け
られた。
26
D
:DMAPP(n=1)
G:GPP(
n
=
2
)
ド
:FPP(
n
=
3
)
D
GFGGDGFGGDGFGG
COQ2
L
ePPT
・
1
十r
l
pp
o
.
H
L
eP
P
T
2
ロGPP
n=2
聞 FPP
n=3
国 GGPP n=4
∞
4
ggm
，
e
.
;
;
島正
宣
告
∞
邑
'
'2
鴎
書
担
帥
31∞
o
CO
Q2
LePPT-1
LePPT2
，聞
F
i
g
.4-6 Le
PPTのプレニル基質に対する基質特異性
左:反応産物を展開した I工Cプレートを、 BAS2000で放射活性検出したもの o
右:測定した放射活性を数値化し、
GPPに対する活性を 1
∞%としてグラフ化したもの。
27
ムラサキ hariyrootにおけるシコニン生合成遺伝子の紐
織特異的発現の解析
LePGT はシコニン生合成における重要な r
egulatory enzyme であることがムラサキ培養細胞
を用いた実験により明らかにされてきた。一方、シコニンはムラサキ植物体において、根の表
皮細胞にのみ局在している。この章では、シコニン生合成の鍵酵素遺伝子である LePGT がム
ラサキの根のどの細胞において特異的に発現しているか、その細胞特異性を調べることを目的
とし、 M9 培地(暗黒下、および光照射下)で培養したムラサキの hairy root をモデル材料に
用いて、 i
ns
i
t
uh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nを行った o また、特異的発現部位を他の遺伝子と比較するため、
シコニン生合成に対して regulatory でなく、かつシコニン以外の二次代謝産物の生合成にも
深く関与している LePAL、および Le4CL 遺伝子の解析も同様に行うこととした。なお、
phenylalanine anmonia l
y
a
s
e (PAL)および ιcoumarate: CoAl
i
g
a
s
e (4CL)はシコニン生
側
合成において、ごく初期の生合成反応を触媒している酵素である。
I
ns
i
t
uh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n の結果および、考察
I
ns
i
t
uh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nの条件検討、ならびに LePGT-lの発現解析
まず、材料であるムラサキの h
a
i
r
yr
o
o
tの回定条件として 4%FAE(formaldehyde、
a
c
e
t
i
ca
c
i
d、
0
e
t
h
a
n
o
l
)固定液で 4Cにて 3 時間、 4%FAEで常温にて一晩、 2%FAEで 4Cにて 3 時間の 3
0
種類を設定した。 DIGラベル RNAプローブは、 DIGRNALabeling K
i
t (Roche)を用い、標準
プロトコールに従って作成した。抗 DIG 抗体にはアルカリフオスフアターゼを結合させた抗体
(Ant
i
-Digoxigenin-APFabfragments、Roche)を用いた。また、発色基質として NBT(
N
i
t
r
o
b
l
u
e t
e
t
r
a
z
o
l
i
u
m c
h
l
o
r
i
d
e
) / BCIP (
5 Bromo-4
-chloro 3
-i
n
d
o
l
y
l phosphate) stock
“
叩
s
o
l
ut
i
o
n (Roche)を用い、室温で発色反応を進行させ、青色発色をシグナルとした。上記の試
料を用い、 proteinaseK濃度を 20陪 /ml
、probe濃度を 0
.
8ng/μ、h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n温度を 48C、
0
NBT/BCIP処理を 5時間として LePGT-lの a
n
t
i
s
e
n
s
e、および senseプローブを用いた i
ns
i
t
u
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n を行った (
T
a
b
l
e
. 1 Exp. 1 参照)。この最初の実験の結果では、 antisense プロ
ープを用いた hybridization において、表皮、および皮膚細胞に強い青色のシグナルが確認さ
れたが、同時に sense プローブを用いた場合にもシグナルが確認された。これは sense プ口一
ブの非特異的な hybridization による background と考えられたため、次回は hybridization
温度を上げることとした。また、 proteinase K 処理が過剰だったためか、特に試料の表皮にお
ける損傷が著しく、次回は proteinase K 濃度を下げることとした。なお、試みた 3 種類、の固
定条件関で、試料の強度や組織の状態に明確な差が見られなかったので、次回の実験での画定
条件は 4%FAEで 4Cにて 3時間処理することとした。
0
28
Table1
1
Experiment
2
2%FAEa
t4C 3hour
0
4%FAEa
t4C 3hour
F
i
x
a
t
i
o
n
0
4%FAEa
t4C 3hour
0
4%FAEa
tRTo/n
1n
bakinga
t80C 0
P
r
e
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
ntreatment
0
P
r
o
t
e
i
n
a
s
eK concentration
20μg/ml
1
.0開 Iml
RNAprobeconcentration
0
.
8nglml
0
.
8nglml
H
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
ntemperature
48C
53C
NBTIBCIPt
reatment
5hour
8hour
0
0
3
Experiment
F
i
x
a
t
i
o
n
G NPFAat4C 0
1n
P
r
e
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
ntreatment
bakinga
t80C 0
1n
P
r
o
t
e
i
n
a
s
eK concentration
1
0
μg/ml
RNAprobeconcentration
1
.2nglml
H
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
ntemperature
48C
NBTIBCIPt
reatment
25.
5hour
0
0
0
次に、 LePGT-} の a
n
t
i
s
e
n
s
e、 お よ び s
e
n
s
e プロープを用い、 p
r
o
t
e
i
n
a
s
eK 濃度を1.0 同 I
m
l，
h
yb
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n温度を 5
3C、NBTIBCIP処理を 8持間としてぐT
a
b
l
e
. 1E
x
p
. 2参照)、他の条件は初
0
回と同様に的 s
i
t
uh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nを行った σ
i
g
.4、 5
)。その結果、 p
r
o
t
e
i
n
a
s
eK濃度を大幅に下げた
ため、試料の損傷は緩和され、また h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n温度を上げることによって s
e
n
s
e プローブを
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n での b
a
c
k
g
r
o
u
n
d を軽減することができた。Ant
i
s
e
n
s
e プローブを用いた
用いた h
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nでは、 M9培地中暗黒下で培養した ha
均T r
o
o
tで表皮細胞全体、およびその内側の
a
i
r
yr
o
o
t を試料とし
皮層細胞でシグナルが確認された。また、 M9培地中光照射下で培養した h
た h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n の場合、同じ細胞層でシグナルが見られたが、シグナルは暗黒下のものに比べ
て明らかに弱く、また局所的に確認されただけであった。この結果は、 M9培地において、光
照射下で培養した h
a
i
r
yr
o
o
tでも、ある程度の mRNAが検出されたという前述の Northem解析
の結果と矛盾しないものと考えられた。
2
9
h
a
i
r
yr
o
o
tc
u
l
t
u
r
e
di
ndark
h
a
i
r
yr
o
o
tc
u
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u
r
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o
n
t
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n
u
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u
sl
i
g
h
t
G
Nヲ
B
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r
s
;500μm
F
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.
5
1I
ns
i
t
uh
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b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
no
fLePGT-la
n
t
i
s
e
n
s
ep
r
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b
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u
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nM9medium.
T
r
a
n
s
v
e
r
s
a
ls
e
c
t
i
o
n
sa
r
e2
5
μ
m
.
V
e
r
t
i
c
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ls
e
c
t
i
o
n
sa
r
e2
0
μ
m
.
h
a
i
r
yr
o
o
tc
u
l
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u
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ndark
h
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sl
i
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h
t
.
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i
J
￨
手正予
ぺ Eぐ士一予零
!y)
十、
ペ
『
B
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r
s
;500μm.
F
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5
2I
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uh
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fL
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A
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i
r
yr
o
o
t
swerec
u
l
t
u
r
e
di
nM9medium.
5
μ
m
.
T
r
a
n
s
v
e
r
s
a
ls
e
c
t
i
o
n
sa
r
e2
V
e
r
t
i
c
a
ls
e
c
t
i
o
n
sa
r
e2
0
μ
m
.
条件の再検討により、試料の状態は良くなったものの、この条件においても依然 r
o
o
th
a
i
rの
欠落など組織の一部は損傷していた。このため、ベイキングにより試料のスライドグラスへの
接 着 を 促 進 し 、 ま た 固 定 条 件 は 本 研 究 室 の 松 昭 氏 が 採 用 し た GNPF
A (
g
l
u
t
a
r
a
l
d
e
h
y
d
e、
P紅 a
f
o
r
m
a
l
d
e
h
y
d
e
)固定液で、 4Cにて一晩器定する方法を採用することとした。この固定条件は上
0
r
o
t
e
i
n
a
s
eK濃度は 1
0問 I
m
lとし、 probe濃度を l.
2
n
g
/
凶
、
記の条件に比べて強いものであったため、 p
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n温度を再び 48C、NBTIBCIP処理は 2
5
.
5時間としたぐT
a
b
l
e
. 1E
x
p
. 3参照)。その結
0
果
、 LePGT-l の a
n
t
i
s
e
n
s
e プローブを用いた h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nでは、上記の場合と同様に表皮細胞、
およびその内側の皮膚細胞でシグナルが確認された (
d
a
t
an
o
t shown)。また、べイキング、固定
条件の変更により試料の損傷はさらに改善された。しかし逆に、上記より強い罰定条件であっ
たためか、シグナルは全体的に弱くなった。
LePGT-2、LePAL-l、ならびに Le4CL-lの発現解析
LePGT-2、LePAL-l、および Le4CL-l それぞれの a
n
t
i
s
e
n
s
e、s
e
n
s
e プロープを作成し、上記の
条件で i
ns
i
t
uh
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nを行った。 LePGT-2の a
n
t
i
s
e
n
s
eプロープを用いた h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nにお
いて、 LePGT-l の a
n
t
i
s
e
n
s
e プローブを用いた場合と同様の発現パターンを示す傾向が認められ
たが、全体的にシグナルが極めて弱かったため、 a
n
t
i
s
e
n
s
e、s
e
n
s
eプロープを用いた h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n
の間で明確な結論を出すには至らなかった (
d
a
t
an
o
tshown)。
LePAL-l、および Le4CL-l の a
n
t
i
s
e
n
s
e
、s
e
n
s
e プロープを用いた h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
nの場合、 LePGT-
l、および2 のシグナルが確認された締胞層を含め、さらに内側の皮層細胞でもシグナルの発
色が認められる傾向があった σig. 9
、1
0
)。なお、 LePAL-l の a
n
t
i
s
e
n
s
e プロープを用いた場合、
M9培地中暗黒下で培養した h
a
i
r
yr
o
o
tに比べ、光照射下で培養した h
a
i
r
yr
o
o
tでわずかながらシ
グナルが強い傾向を示した σig. 1
0
)。これはムラサキの h
a
i
r
yr
o
o
tを新鮮な M9培地(暗黒下、お
よび光照射下)に移植後、一過的に LePAL-lの発現量が増大し、暗黒下ではすそに減少する一方、
光照射下ではある程度の発現量を保っているという Northem解析の結果と矛盾しないと考えら
れた mo しかし、いずれにおいても、固定条件が強すぎたためか、先の LePGT-2 の場合と同様
に切片の状態は良いものの全体的にシグナルが極めて弱かったため、明確な発現パターンは得
られなかった。
考察
LePGT-l、およびJ はそれぞれ 306 アミノ酸、 307 アミノ酸をコードしており、 DNA レベル
で 74%
、アミノ酸レベルで 93%の高い相向性を示すものの、これらの発現組織特異性に関する
知見は今まで得られていなかった。本研究により、両遺伝子は同様の発現パターンを示す傾向
にあり、根組織におけるそれぞれの mRNA局在部位は表皮細胞から皮層細胞の最外層に摂られ
ると考えられた。生合成の最終産物であるシコニンは、根組織の表皮細胞にのみ特異的に局在
しており、これは上記の LePGTの発現パターンとよく一致するものである。このことから、本
研究はシコニンの局在組織特異性に対する LePGTの s
p
a
c
i
a
l な遺伝子発現の特異性に関する産
接的な証拠を与えるものとなった。また、 PAL、および 4CL はシコニン生合成経路上、ゲラニ
3
2
ル基受容体の PHB生合成に関与する酵素である o 両遺伝子発現の制御は LePGTとは異なり、
光照射下/暗黒下、および LS培地励。培地、いずれの条件においても抑制を受けない
1
2
)
問。本
研究では、これら遺伝子の組織特異的発現の解析を試みたが、明確な結論を出すには至らなか
った。
33
まとめ
ムラサキにおけるシコニン生合成の鍵酵素、 PHB:ゲ、ラニルトランスフエラーゼ (GT) は
、
芳香族環を基質とするプレニルトランスフエラーゼとして植物において、または二次代謝系に
おいてもっともその性質が研究されている酵素のひとつである o しかし植物においては、この
ような芳香族環"プレニルトランスフエラーゼ遺伝子のクローニング例は無いため、本酵素の
cDNA を単離するにあたって、既にクローニングされている PHB:プレニルトランスフエラーゼ
(PHB: PT) である酵母のユビキノン合成系酵素遺伝子 COQ2 及びそのホモログを検索し、そ
のアミノ酸保存配列を利用することにした。すなわち、その配列が植物二次代謝系 PHB:PT に
も保存されていることを期待し、ブライマーを設計してムラサキの cDNAl
i
b
r
a
r
y をテンプレー
トに PCR を行った。増幅した断片をランダムにシークエンシングした結果、 COQ2遺伝子産物
CCOQ2 酵素とする)と部分的にアミノ酸配列で 50%の棺向性を示すクローンが 2 種類得られ
た。これらを、ムラサキ CLithospermumg
r
y
t
h
r
o
r
h
i
z
o
n
)町田:E
.
r
e
n
y
1
1
r
a
n
s
f
e
r
a
s
eの意で、Le
PPT-l、
LePPT-2と仮称した。
これらはおのおの 306、307 アミノ酸からなる蛋白質をコードしており、その相向性は立い
に 93%であった。両者ともに高い疎水性を示し、 8
9 回膜貫通型の膜蛋白質であると推定さ
れた。また K
y
t
e
D
o
o
l
i
t
t
l
eh
y
d
r
o
p
a
t
h
yp
l
o
tによると、これらは全体に COQ2酵素のそれと酷似し
ていた。しかし COQ2 酵素や、データベースに見られるそのホモログのほとんど全てがミトコ
ンドリア輸送シグナルを N 末端に保有していたのとは対照的に、Le
PPT にはこの輸送シグナル
は見られず ER 局在性と推定された。このことは本クローン 2 種がいずれもユビキノン生合成
酵素とは異なることを示唆していた。 COQ2 酵素と高いアミノ酸相向性を示したのは親水性部
分のおそらく反応基質認識部位であると推定される 2 箇所、 INDXXD 配列及び GIKSTAL配列
とその周辺部位であった。 INDXXD 配列はあらゆるプレニルトランスフエラーゼに共通するこ
とから、この周辺配列がプレニル基を認識すること、また GIKSTAL配列は PHB: PT サブファ
ミリーにのみ共通することから、 PHBと何らかの作用があるものと考えられる。
ここで得たLe
PPT2 種が実際にシコニン生合成に関係する遺伝子であるのかを検定するため
に、ムラサキ培養細胞におけるいPPT-l、2 おのおのの発現パターン解析を行い、向時に GT
活性の増減パターン、またはシコニンもしくはエキノフラン類の生産パターンをモニターし、
これと比較した。その結果、両Le
PPT の発現はいずれも光により強く抑制され、タイムコース
もその発現量が最大になった後に、シコニンの生産量が増大するという強い相関性が示された。
また、他の因子、アンモニウムイオンや 2，
4-D によっても向Le
PPT の発現は抑制され、逆にメ
チルジヤスモン酸、酸性多糖によっては発現促進を受けた。このパターンも、モニターした GT
活性の変動および代謝産物量の増減と良く対応していた。また、植物体を用いた Northern解析
によりLe
PPT の発現器官を検定したところ、シコニン生産部位である根部、特に側根に発現が
限られていた。これらのことから、Le
PPT は 1
、2 ともにシコニン生合成に関連し、その調節
に大きな役割を果たす遺伝子であると結論付けた。様々な因子によるムラサキの GT 活性調節
は、翻訳レベルではなく転写レベルで行われていると報告されているが、今回の結果はそれを
裏付けるものであった。
34
以上、Le
PPT のアミノ酸配列とその発現解析より、本遺伝子はともにシコニン生合成に関わ
る鍵酵素、 PHB: GTであることが推定できた。そこで実際にLe
PPT を酵母において強制発現さ
せ、その酵素活性を測定してみたところ、酵母のLe
PPT形質転換体では主にミク口ソーム面分
において、ベクターコントロールでは見られない明らかな GT活性が検出された。このことは、
Le
PPT のコードする蛋白質が実際に、ゲラニル基 (GPp) を PHB のメタ位に転移する活性を有
していること、更に、少なくとも酵母においてはミクロソーム画分(おそらく ER 膜)に局在
することが示された。この知見は、ムラサキ培養細胞において GT が ER膜に局在するという
データと一致している o また、この酵母発現系を用いてLe
PPT蛋白質の基質特異性実験も試み、
ゲラニル基以外の他のプレニル基も基質として認識するかどうかを確認したむその結果、酵母
の内在性 COQ2酵素は報告されているように広い基質特異性を示し、本来基質とするヘキサフ。
レニル基 (C30) のみならず、 Cl0、C15、C20 の様々なプレニル基に対して活性を示すのに対
し、Le
PPT蛋白質は Cl0 のゲラニル基のみを基質とする非常に高い特異性を示した。このこと
からLe
PPT蛋白質は PHB: ぼであって、他のプレニル基転移活性を持つものではないことが
示された。
以上より、Le
PPT がシコニン生合成を行う GT をコードしていることが裏付けられ、Le
PGT
と改称することにしたが、Le
PGT-l と3 との差異は、ムラサキにおける発現様式においてもそ
の機能においても明確でなく、若干のアミノ酸配列の違い以上のものは見つけられなかった。
この 2 つの酵素の生理的な役割の差異は、より詳細な実験によって今後明らかにされていくと
思われる。またゲノムサザン解析によって、Le
PGT に相同なファミリーメンバーは、この 2 種
以外には、あつでもあと 1コピー程度であろうことが推定できた。ただし、今回のスクリーニ
ングでは第 3 の分子種は得られておらず、仮に発現していたとしてもかなり低いレベルであっ
たことが予想できる o
また、本酵素のクローニングの成功により、この遺伝子をムラサキにおいて過剰発現させシ
コニンの増産を図るという議論については、既に行われている、大腸菌の u
b
iA を植物体に導
入して GTの触媒反応を補強するという実験 3
ηよ
り、 GTの反応産物である GBAが蓄積するだ
けでシコニン増産には結びつかないであろうことが予想される o シコニン生産量を決定する制
御段階は GT の他に、更にその下流にも帯在していると思われ、その段階の解明が、遺伝子エ
ンジニアリングによるシコニン増産には必須であろう o
LePGT の上流部分は、植物二次代謝の複雑な調節機構の鍵として興味が持たれることから、
i
n
v
e
r
s
ePCR法によりこの部位のクローニングを試みた。結果的には、ゲノムの物理的もしくは
化学的切断が原因で十分な長さの上流域が得られず (300bp 程度)、十分なプロモーター解析に
繋げることはできなかった。しかし今後、クローニング技術の改良を重ね、更に上流域をクロ
ーニングしてLe
PGT の、更にはシコニン生合成の調節機構の全容を明らかにし、二次代謝系の
生合成調節機構のモデルを構築できることを期待する。
更に、Le
PGTはユビキノン生合成酵素とは対照的に、非常に基質認識に関して特異性が高い。
これらが共通のアミノ酸モチーフを持つにも関わらず、このような認識の差異が生ずることは
興味深く、基質の特定がどのアミノ酸構造に由来するのかを分子的に解明することは、今後の
二次代謝系プレニル化反応の基質改変やエンジニアリングに寄与するものと考える。今回確立
し た いPGT の酵母での発現系は、Le
PGT をはじめとする酵素遺伝子のポイントミューテーシ
35
ョン等の改変効果を検定するために有用であり、今後、この系を用いて時四:プレニル化酵素の
分子的解析を行うことも考えている。
一方、二次代謝産物には、シコニンやカンナピノイドの他、フラボノイドやクマリンなど生
合成段階で芳香族環のプレニル化を必要とする化合物が数百種確認されている。これらプレニ
ル佑フラボノイドなどは、ファイトアレキシンとして重要な生理的役割を果たしているものも
多く、様々な生理活性を有することから天然医薬品としての応用が期待できる化合物も少なく
ない。しかし、こういった芳香族環のプレニル化を触媒する酵素遺伝子のクローニングは今ま
で成功しておらず、本研究が最初の報告例となる。こういった意味で本研究が、本来のシコニ
ン生産をエンジニアリングするためのみならず、上述したような多くの代謝産物の生合成酵素
同定のためのプローブとして役立つことを期待している。
36
幽圃幽幽-
実験方法
本研究を通じて共通した手法および機器を下に記しておく。本章においては、特筆しない限
り以下の方法または機器を用いたものとする。
￨ムラサキ培養締胞の継代￨
6
通常の培養細胞の継代は、 Linsm瓜e
randS
k
o
o
g
'
s (凶)液体培地 (
1
0
MIAA
、105Mk
i
n
e
t
i
n
)
司
30ml (
1
0
0ml フラスコ中)にて行い、暗黒下、 90rpm
、25Cでロータリーシェーカにおいて振
0
とう培養した。 2
"
"
'
3週間に一度、新しい培地に移植した。
￨大腸菌の形質転換￨
PCR産物を p
T
7
B
l
u
e(Novagen) にライゲーションした後、 H
e
a
tShock法により XL1-Blue株
にトランスフォーメーションし、 LB (
a
m
p
i
c
i
l
l
i
n80μ g
/
ml) 選択培地にて培養した。
!使用機器￨
・微量遠心機(エツペンドルフチューブ用)
冷却遠心機:himacCR15D (mTAcm)
室温遠心機:himacCT15D (
田TAC
回)
・冷却遠心機(フアルコンチューブ用、約 2，
000gまで)
M叫t
i
p
u
r
p
o
s
eRe
台i
g
e
r
a
t
e
dC
n
t
r
i
f
u
g
eLX-120 (TOMY)
・冷却遠心機(専用遠心チューブ使用、 10，
000g用)
A
u
t
o
m
a
t
i
c回 ghSpeedR
e
f
r
i
g
e
r
a
t
e
dC
e
n
t
r
i
f
u
g
e20PR
5
2 (mTAcm)
・
(ロータ-RPR2
0
2
9
0
3
)
・超遠心機(専用遠心管使用、 100，
000g用)
日t
蹴 e
n
t
r
i
f
u
g
e1L
I
0
0 (BECKMAN)
(ローター百.A
I
0
0
.
3
)
-ハイブリダイゼーションオーブン
M
u
l
t
i
S
h
a
k
e
rOvenHB (TAITEC)
-菌用振とう培養器 (37C及び 30Cで使用)
0
0
S
o
f
tI
u
α
l
b
a
t
e
rSLI-600ND (EYELA)
• PCR用サーマルサイクラー
ProgrammableThermalC
o
n
t
r
o
l
l
e
rPTC-100™ (フナコシ)
• HPLC (
S回 MAZU)
液体クロマトグラフ:LC-I0AD
ヂィテクタ:SPD-MI0A
シスチムコント口ーラー:SCL-I0A
カラムオーブン:CTO-10AC
解析ソフト:CLASS-VP (LCワークステーション)
37
-シークエンス用 k
i
t
ThermoS
e
q
u
e
n
c
ef
l
u
o
r
e
s
c
e
n
tl
a
b
e
l
l
e
dp
r
i
m
e
rc
y
c
l
es
叩 e
n
c
l
時 k
i
t (Am
e
泊 a
m)
ムラサキにおけるプレニルトランスフエラーゼのクローニング
PCR法によるLe
PPTク ロ ー ニ ン グ
Ld
円のクローニング
N
e
s
t
e
dPCR に際し、 F
w
1
"
"
'
2、Rv
・1
"
"
"
'
5 の 7 種のヂィジェネレートプライマー、およびアダ
プタープライマ-AP1，AP2 を用いた。この内、結果的にLe
PPT が得られた PCRのプライマ
ーペアは次の 2組であった。
(
1託 P
陀CR
叫) AP1/
恥
R
V1
:5
'
G
伶
嶋
胸
蜘
桐
帽
剛
∞
(
ω
2
n
d
陀
PC
R
ω
) 沼
AP2/
恥
R
は
V♂
♂
:5
'
'
'
:
守
T
詑CY
刊TG
侃RT
叩GDG
配C
R
即
'
TA
油DATD
G昧
T
RT
陀C (
12OHA
羽
Y
IT
凶
D
)♂
31
program
5μ1
MarathoncDNAl
i
b
r
a
r
ys
o
l
v
. (X5
0
)
(2ndPCRでは 1
s
tPCRmix (x20d
i
l
.
)
アダプターブライマー
ディジェネレートブライマ-
2
. 92C
10pmol
3
.5
5C
Kl
enTaq(CLONTEC
H)
Kl
enTa
司b
u
宜e
r
dNTPmix
t
o
t
a
l
0
5μ 1
)
1
0
0
"
"
"
'
1
5
0pmol
1m
i
n
.
1
. 94C
30s
e
c
.
0
0
lC
/
2s
e
c
.
O
4
. 37C
30s
e
c
.
0
1μl
5
.+31C
+
1
.
1C
/
2s
e
c
.
X10
6
. 68C
1
.5
"
"
'
2m
i
n
.
1
0島盟0
1
50μl
0
0
0
9
)
7
. X29t
o2 (2ndPCRでは X1
8
. 68C
0
7min.
9
. end
この PCRにより、 1
s
tPCRでは1.1kbp付近、 2ndPCRでは 0
.
9kbp付近を中心にスメアーな
バンドが増幅した (
F
i
g
.2
3
/p
.7 参照)。この増轄断片をランダムにシークエンシングしたとこ
ろ
、 COQ2と相同性を持つLe
PPT(
0
.
6kbp断片)が得られた。
RACE法による全配列の決定
Le
PPT-2の 5'RACE
、およびLePPTの 3'RACEに用いたプライマー配列と PCRプログラムは
以下の通り o
(
L
e
PPT25'RACE) 5'-GCCAACATTTTTGGTAGACTGC-3'
(
L
e
PPT3'RACE) 5'-CCCTTTGTGTTTGCTTAYCCTCTC-3'
S'RACEprogram-()内は 3'RACE
MarathoncDNAl
i
b
r
a
r
ys
o
l
v
. (X5
0
) 5μl
1
. 94C
1
m
i
n
.
アダプターブライマ-AP1
2
. 94C
30s
e
c
.
0
1
5pm01
0
38
RACE用プライマー
1
0pmol
AdvanTaq (CLONTECH)
0
1μl
AdvanTaqb
u
f
f
e
r
dNTPmix
3
. 57C (
6
0oC)
4
. 6
8C
0
X10
5
.
40s
e
c
.(
1m
i
n
.
)
X29t
o2
10nmol
6
. 6
8C
50μl
7
. end
t
o
t
a
l
30s
e
c
.
0
5min.
Le
PPT2の 5'RACEでは約 0.
4k
bpに
、 3'RACEでは約 0
.
8kbpにシングルバンドが得られた。
叩
シークエンシングの結果、 5京ACE産物は目的のLe
PPT-2であったが、 3'RACE産物もLe
PPT-2
だけしか得られなかったため、この PCR産物に対してLe
PPT
・
15'RACE産物でコロニーハイブ
リダイゼーションを行ったところ、Le
PP
下 1の 3
'RACE産物が得られた。
LeP
PI'全長の増幡
PPT-1、2 の全長を改めてク Eーニングするために、以下のブライマー配列と PCR プログ
Le
ラムを用いた。
(
L
e
PPT-1Fw) 5
'
・
・G
CTCTCTTATTATTCTTCCAATTTGGC-3'
(
L
e
PPT-1Rv) 5'-GATGGAAATGGTGACACACACC
♂
(
L
e
PPT2Fw) 5'-TCATCACATCTCTCAGTTTTCTCTGC-3'
(
L
e
PPT-2Rv) 5'-CGGAAGTATTTACTACCAAACAATGGC-3'
program
MarathoncDNAl
i
b
r
a
r
ys
o
l
v
. (X1
0
0
)
5μ1
1
. 94C
1m
i
n
.
Fwブライマー
50pmol
2
. 94C
3
0
8
e
c
.
Rvブライマー
50pmol
3
. 46C
30s
e
c
.
2
"
"
'
3u
n
i
t
4
. 72C
2min.
P釦 p
o
l
y
m
e
r
a
s
e(
P
r
o
m
e
g
a
)
Pfub
u
f
f
e
r
X10
dNTImix
1
0nmol
t
o
t
a
l
0
0
0
0
5
.
X29t
o2
6
. 72C
0
10min.
5 0 μ 7 . end
Le
PPT-1は約1.1kbpに、Le
PPT-2は約 1.
2k
bpに強いバンドが増幅し(約 0
.
6kbpにも薄いバ
ンドが見られたが)、これがLe
PPTの全長であることをシークエンシングで確認した。
コロニーハイブリダイゼーション
メンブレンの作成
(試薬)
D
e
n
a
t
u
r
a
t
e801n~: 0.
5M NaOH
、1.5M NaCl
N
e
u
t
r
a
l
i
z
e8
0
1
s
.:1
.
5M NaCl
、0.
5M T
r
i
s
H
C
l
!
pH7.
5
2OXSSC:3MNaCl
、0.3M クエン酸三ナトリウム二水和物
(方法)
39
• PCR産物をエタノール沈殿し、そのまま p
T
7
B
l
u
e(
n
o
v
a
g
e
n
) にサブクローニングして
XL1-Blueに H
e
a
tShock法で導入し、これを p
l
a
t
e(
9.
5cmφ) あたり 1
0
0
"
'
"
'
3
0
0コロニー
程度の密度に生育させた o
・この上に間に空気が入らないようにナイロンメンブレン(Am
e
r
s
h
a
mHybondN+)を約 1min
間のせた(この聞に注射針で、メンブレンと p
l
a
t
eの位置関係の印をつけておく)。
-菌のついた面を上にして D
e
n
a
t
u
r
a
t
es
o
l
n
.に 2min湿潤させた。
-さらに N
e
u
t
r
a
l
i
z
es
o
l
n
.~こ 2min 湿潤させた。
• 2xSSC (20XSSCを希釈)で軽く洗浄し、ラップで包んで u
v
-クロスリンカーで 1200
カウントの紫外線を照射し、 DNAをメンブレンに盟定した。
ハイプリダイゼーション
(試薬)
H
y
b
r
i
d
i
z
es
o
l
v
.:1MNaCl、10%D
e
x
t
r
a
nS
u
l
f
a
t
e
、20m MT
r
i
s
引C
l(pH7.
5
)
、 1%SDS、
50%Formamide
、5XDenhardt'ssolution
∞1140010g、PVP(polyvinylpyrrolodon) 10g、
100XD
e
n
h
a
r
d
t
'
ss
o
l
u
t
i
o
n
:F
i
BSA (
f
r
a
c
t
i
o
nV) 1
0g
!
500凶 H20
変性サケ精子 DNA
TE (
1
0m MT
r
i
s
H
C
l(
p
H
8
.
0
)，1m MEDTA)
(方法)
1
) DNAのラベリング (RandomP
r
i
m
e
dDNALabelingK
i
t(
B
e
h
r
i
n
g
e
rMannheim))
・プローブにする DNA断片約 50ng (9μ1H20) を熱変性させた。
• DNAに deoxyATP
/GTP
!
fTPm
i
x
t
u
r
e3μl
、10Xreactionmixture2μl、klenow
32
enzyme (
e
x
o
) (NEB) 1μI
、 α_[
P
]
_
d
e
o
x
yCTP5μ1 (
1万 MBq) を加え、 3
7Cで 40min
0
i
n
c
u
b
a
t
eした。
・反応液を Q
u
i
c
ks
p
i
ncolumn (
B
e
h
r
i
n
g
e
rMannheim) に通して取り込まれなかった αー
32
[ P
]
d
e
o
勾
CTPを除き、これをプローブとして用いた。
2
) ハイブリダイゼーション
・メンブレンを h
y
b
r
i
d
i
z
es
o
l
v
.に浸し、 100μ g
!
mlとなるように熱変性したサケ精子 DNA
を加えた。
n
c
u
b
a
t
eした (
p
r
e
h
y
b
r
i
d
i
z
a
t
i
o
n
)0
・ハイブリダイゼーションオープンで位。C、1hr以上 i
・ラベリングしたプロープを熱変成させて i
n
c
u
b
a
t
e した h
y
b
r
i
d
i
z
es
o
l
v
.に加え、 42Cで
0
更に 1
2h
r以上 i
n
c
u
b
a
t
eし た (n
o
n
s
t
r
i
n
g
e
n
tの時は 37Cで i
n
c
u
b
a
t
e
)。
0
3
) メンブレンの洗浄 (Wash)
40
-メンブレンをタッパーに移し、 0
.
2
>
くS
SC、0.1%SDSを加え、 6
5Cで 20min振とう洗浄
0
した (
n
o
n
s
t
r
i
n
g
e
n
tの時は 2XSSC
、0.1%SDSで 5
5Cで洗浄)。
0
・上記の洗浄操作をもう一度繰り返した。
・メンブレンの水を軽くきり、ラップに包み解析した (BAS2000 (
F
u
j
if
i
l
m
)、オートラジ
オグラフィ等)。
Le
PPT を得たプライマーペアによる PCR産物を導入した大腸菌に対してコロニーハイブリダ
イゼーションを行った結果、約 500 コロニー中 20個がLe
PPT プローブに対してポジテイブシ
グナルを示した。これから 8 個をランダムにシークエンシングしたところ、 2 つの分子種に分
類できた。
ムラサキにおけるLe
PPTの発現解析
￨ム ラ サ キ 培 養 細 胞 の サ ン プ リ ン グ ￨
本章の発現解析のサンプリングにあたっては、 1
0
0ml フラスコ中の LSまたは M9培地 30ml
に 1gの培養細胞 M18-1株を移植し、更にその上に 4.
5mlの流動パラフィンを重層することに
よって細胞が産出するシコニンなどの代謝産物をこの有機層にトラップすることにした(細胞
にシコニンが残っていると、 GT 活性測定に大きな障害が出るため)。ただし、 3・1 の実験では
GT活性測定を行わないためパラフィンは重層しなかった。培養条件は継代培養と伺様である。
細胞のサンプリングは、ミラクロスを敷いた自血漏斗を用いて細胞を吸引漉過し、蒸留水で良
く洗沖して培地等を除いてから、生鮮重を測定して液体窒素で凍結保存した。
培地中シコニンの定量
a
m
y
la
l
c
o
h
o
lを加え、 v
o
r
t
e
xした 0
・液体培地に 5mlの n
・約 100mlの蒸留水をくわえ、上層の amyla
l
c
o
h
o
l層を遠心分離して細胞残津を除いた 0
・Am
y
la
l
c
o
h
o
l層 60μlをエツペンドルフチューブに採り、これに 2.5% KOH1mlを加
え懸濁、シコニンを抽出した。
・これを遠心分離して下層の KOH溶液(青色となる)を OD620で測定した。
計算方法
=
a
b
s
>
く1
8
.
7
/(
2
8
8X生鮮軍 g
) X1
.0
6
/
0
.
0
6X5 (μmo
l
/
g
)
(生鮮重あたりのシコニン蓄積量 ) =
培地中エキノフラン類の定量
4
1
-液体培地に 3mlの h
e
x
a
n
eを加え、パラフィン層と混合した 0
• Hexane/
パラフィン層を遠心分離して細胞残津を除いた。
.H
e
x
a
n
e
/
パラフィン層 5μlを直接 HPLCに i
n
i
e
c
t
i
o
nして、分離、定量した。
(HPLC条件)
HPLCs
y
s
t
e
m:S
l
丑MAZULC
・
10AD
カラム:L
i
C
h
r
o
s
p
h
e
r1
0
0RP-18250mmX4mm (
M
e
r
c
k
)
溶媒:CH
CN:H20:CH
COOH:(
C
H
3
)
3
N
=6
5
:3
5
:0ふ 0
.
3
3
3
温度:40C
0
流速:1
.
5m
l
/
m
i
n
.
検出:254nm
保持時間:(DHEF) 5
.
3--v5.
5m
i
n
. (EFB) 7
.
8--v8
.
1m
i
n
. (
a
c
e
t
y
ls
h
i
k
o
n
i
n
)6
.
8--v7
.
0m
i
n
.
計算方法
エキノフラン類の定量は、 HPLCにおけるピーク面積 (
a
r
e
a
)を用いて以下の式で算出した。
(DHEF蓄積量) =
=a
r
e
aX4
.
9
6
2X1
0
旬1.5
/(
2
5
6X生鮮重 g
) (μmo
l
!
g
)
3
(EFB蓄積量) =
=a
r
e
aX5
3
.
8
1
9X1
0
-X1
.
5
/(
2
5
6X生鮮霊 g
) (μmo
l
!
g
)
これらの総和をエキノフラン類蓄積量とした。
ムラサキ培養細胞における GT活性の測定
粗酵素液の抽出
-操作は全て氷上 (
4C) で行った。
0
・サンプリングした培養細胞 1
9をあらかじめ 4Cに保存しておいた乳鉢に入れた o
0
・乳鉢に 0
.
1M K
P
iB
u
f
f
e
r (戸6.
5
) 3 凶、 1 M DTT (
D
i
t
h
i
o
t
h
r
e
i
t
o
l
)1
/
1
0
0 vo
l
.
、 PVPP
可l
p
o
l
y
p
y
r
r
o
l
i
d
o
n
e
)約 0
.
1gを加え、細胞を 3minほど破砕した。
(
p
o
l
y
v
i
・2重のミラクロスで絞りながら漉過し、鴻液を 4C、 1
0
，
000gで 1
5min遠心分離して細胞残
0
j
宰や核・ミトコンドリア画分を除いた。
5mlを 4Cで
、 0
.
1MTr
か HClb
u
f
f
e
r (pH7.5)で飽和した PD-10カラムに通し、脱
・上清 2.
0
塩した。以下全てこれと同じ Tris-HObu
笠e
rを用いた。
• T
r
i
s
H
C
lb
u
f
f
e
r3.
5m1で溶出した溶出液に1/
1
0
0vo
l
.
の 1MDTTを加えた 0
・4C、 1
0
0，
000gで 40min超遠心分離にかけ、膜画分を沈殿させた。
0
・ピペッティングを繰り返して沈殿を 150μlの T
r
i
s
任 C
lbu
能 rに懸濁し、1/
1
0
0vo
l
.
の 1M
DTTを加え、そのうち 85μlを粗酵素液として酵素活性測定に、 20μIを蛋白質定量
に用いた o
GT活 性 の 測 定
・一反応あたり 85μlの粗酵素液を用い、 1
0m MMgC1
、2m MGPP (
t
o
t
a
l1
0
0
2 、 1m MPHB
42
μ1)として、エツペンドルフチューブ内において 30Cで 1h
ri
n
c
u
b
a
t
eした 0
0
・反応停止時に蟻酸 5μ1を加えた。
・反応液に、内部標準として 0.
5 nmolの t
e
s
t
o
s
t
e
r
o
n
ep
r
o
p
i
o
n
a
t
eを加え、 150μlの酢酸エチル
で有機物を分配抽出した。
-窒素ガスを用いて酢酸エチル層を揮発させ、乾燥した酢酸エチル可溶踊分を HPLC用メ
タノール 10μ1に溶解した。
-このメタノール溶液 5μlを HPLC用のサンプルとし、以下に示す条件で GBAの検出、
定量を行った。
(条件)
l
l
MAZULC-10AD
HPLCs
y
s
t
e
m:SI
カラム:L
i
C
h
r
o
s
p
h
e
r1
0
0RP-18250mmX4mm (
M
e
r
c
k
)
H:H20
:CH
0
:2
0
:0.
3
溶媒:CH
30
3COOH=8
温度:40C
0
流速:1m
l
/
m
i
n
.
キ食出:254nm
保持時間:6
.
1"
'
6
.
3m
i
n
.
計算方法
内部標準である t
e
抵抗e
r
o
np
r
o
p
i
o
n
a
t
e(
T
P
) での換算を行い、 HPLCにおける反応産物 GBAの
ピーク面積 (
a
r
e
a
)から以下の式により、酵素活性を算出した。
庁Pa
r
e
aX1
2
0
/(
0
.
1
3
8X蛋白質量 X274(GBA分子量)) (nmo
l
/
h
r
.• mg)
(GT活性) =area
N'orthem解 析
N'orthemメンブレンの作成
(試薬)
2OX MOPS:0.4MMOPS、0.1M酢酸ナトリウム、 20m MEDTA(KOHで pH7.0に調整)
RNA泳動パップアー:ホルムアルヂヒド 1
.
6ml、ホルムアミド 5.0ml
、20XMOPS0.
5ml
、
グリセリン色素液1.6mlmix
、XC1mg.
、0.
5M EDTA
(
pH
8
.
0
)20μ1
、
グリセリン色素液:グリセリン 5ml，BPB1mg
H20 4
.
9
8mlmix
(方法)
・凍結した培養細胞からの t
o
t
a
lRNA及びmR
NAの抽出は、第三章で述べた k
i
tにより行
った 0
・抽出した RNA10μg相当に RNA泳動バッファーを適当量 (
5
"
'
1
0
μ1)加え、 6
5Cで
0
10min放置した後、氷上で 5min冷却した。
• RNAサンプルをアガロースゲル (1XMOPS、約 1.3%ゲルにエチジウムブロマイド 0
.
6
1
/
2
0
ml、ホルムアルデヒドを1/
20vo
l.加えたもの)にアブライし、最初の 5minは 50V
、そ
4
3
の後は 100Vで電気泳動した。泳動バッファーには 1XMOPSを用いた 0
.トランスファーバッファーには 20XSSCを用いた。
• 20xSSCで十分に湿らせた Whatman3MM漉紙を 3枚重ね、その上に気泡が入らないよ
うに RNA泳動ゲ、ルを置いた。
e
r
s
h
a
mHybondN+)を乗せ、その
・ゲルの上に、気泡に注意してナイロンメンブレン(Am
上に更に 20XSSCに浸しておいた Whatman3MM漉紙 3枚を重ねた。
4
.
.
1
8h
r トランスファーした 0
・漉紙の上に十分量のキムタオル、ガラス板、重しをのせ 1
.ウェル部に水性色鉛筆(ファーパー・カステル社の DOCUMENT) で印をつけてからメ
ンブレンを剥がし、 2XSSCで軽くゆすいでラップに包み、クロスリンカーで RNAをメ
ンブレンに固定した。
s
t
r
i
n
g
e
n
tな条件)。
・ハイブリダイゼーションの方法は、第二章参照 (
プロープ
.LePPT-1のプローブには 5
'
末端側 680bpに Mara
出o
n
k
i
tのアダプター配列がついたも
'
末端側 756bpに同様の配列がついたものを用いた。(こ
の、LePPT-2のプローブには 5
れらは RT
♂ CRにおけるブライマ -Rv-2と AP2の増幅産物である。)
ゲノムサザン解析
GenomicSo
uthemメンプレンの作成
*本研究室の '
9
9年度修士卒業生の氏原ともみ民、学土卒業生の小円善正氏による。
・ムラサキ(武田薬品工業京都試験農園産、仙台産) 5gより、 CTAB法によりゲノムを抽
出
、 DNeasyP
l
a
n
tMi
出Ki
t(QIAGEN) で精製した。
I
I
、EcoRV (NEB) を用いた。ゲノム 5μg相当に対し各酵素
・制限酵素は EcoRI、HindI
100Uを用い、 t
o
t
a
lvolume100μlで終夜 i
n
c
u
b
a
t
eした。反応後、エタノール沈殿により
回収した DNAを 15μlの TEb
u
f
f
e
rに溶解し、ゲルにロードした 0
・電気泳動は W15cm、 L20cm
、 T1cmの 0.8%アガロースゲルにて行った。上記サンプ
ルをロードした後、 30Vで 1
5.
5h
r
、さらに 40Vで 2hr泳動し、トランスイルミネータ
ーで DNAの泳動パターンを確認した。
-このゲルをタッパーに移し、 D
e
n
a
t
u
r
a
t
es
o
l
n
.に浸して 1hr振とうし、次に液を N
e
u
t
r
a
l
i
z
e
s
o
l
n
.に入れ替え、吏に 1hr振とうした。
-以降のトランスファー及びハイブリダイゼーションの方法は、 N
o
r
t
h
e
r
n解析と同様。
ハイプリダイゼーション条件
ハイブリダイゼーション温度:3アC
Wash温度:60C
0
Wash溶液:O.
2xSSC
、O.l%SDS
44
酵母におけるLe
PP'I'の強制発現および機能解析
i大 腸 菌 お よ び 酵 母 発 現 用 L ePPrプラスミドの作成
￨
p
B
l
u
e
s
c
r
i
p
tSK(
) (大腸菌発現用ベクター)及び pDR196(酵母発現用ベクター)の EcoRI
/
Xho
Iサイトを利用して、Le
PPT-1、2 の CDS 全長をサブクローニングすることにした。Le
PPT に
はこれらの制限酵素サイトが無かったため、制限酵素サイトを加えたブライマーを設計し、既
に第二章で作成したLe
PPT全長を鋳型として、 PCR により制限酵素サイトを導入した全長を増
幅し直した。
pDR196 にサブクローニングするための CDS を増幅するために用いたプライマー配列と PCR
プログラムは以下の通り o (下線部;制限酵素サイト、太字;開始コドン)
(
L
ePPT-1Fw-EcoR1
) 5'-CGCGAAT1'CAGAAATGGTTTCCAGCAAACAAAC-31
(
L
e
PPT-1Rv
劫 oI
) 5'-GCGCTCGAGTGACACACACCATCATACCATAACATAC-3'
(
L
e
PPT-2Fw-EcoR1
) 5'-CGCG.AATTCTAGAATGAGTTCCAAACAAACACAGC
♂
(
いPPT♂ Rv劫 01) 5'-GCGCTCGAGTACTACCAAACAATGGCTTGATAATCC-3'
program
0.
5 μg
1
. 94C
1m
i
n
.
Le
PPT-1 (
2
) Fw-EcoRIプライマー
1
0
0pmol
2
. 94C
30s
e
c
.
Le
PP
下 1(
♂) R
v
:
励 。 1プライマー
100pmol
3
. 46C
30s
e
c
.
6u
n
i
t
4
. 72C
2min.
2
2で増幅した全長Le
PP
下 1(
2
)
P
f
up
o
l
y
m
e
r
a
s
e(
P
r
o
m
e
g
a
)
0
0
0
0
P
f
ubu
:
f
f
e
r
X10
dNTPID1x
2
u
盟l
l
i
l
l
6
. 72C
t
o
t
a
l
100μl
7
. end
5
.
X29t
o2
0
1
0m
i
n
.
こうして増幅した断片を、 EcoRI/
Xho1で処理し、同じく EcoRII
Xho1で処理した p
-B
l
u
e
s
c
r
i
p
t
(大腸菌発現用)及び pDR196 (酵母発現用)にうイゲーションした。
なお、 COQ2を酵母変異株で発現させるための pDP196・COQ2も作成した。 p
B
l
u
e
s
c
r
i
p
tSK
(-)に挿入されていた COQ2遺伝子の全長(小門氏作成)を SacI
1
Spe1サイトで切り出し、
pDR196の Sma1サイトに Sac1リンカーを挿入した上で、その Sac1
βpe1サイトにサブク口一
ニングした。
酵 母 COQ2欠 損 株 の 作 成
相同組換えによる C002遺伝子の破壊
4
5
(試薬)
W A D培地 (lL):Y
e
a
s
t凶 r
a
c
t (DIFCO) 1
旬、 p
o
l
y
p
e
p
知郎 (
DIFCO) 2旬、 g
l
u
∞s
e2旬、
Adenins
u
l
f
a
t
e40mg
e
a
s
tn
i
t
r
o
g
e
nb
a
s
ew/oaminoa
c
i
d (DIFCO) 6
.
7g、c
a
r
b
o
ns
o
u
r
∞
、 r
e
q
"
凶r
e
d
SD培地 (1L1:Y
aminoa
c
i
d(
a
d
da
f
t
e
ra
u
t
o
c
l
a
v
e
d;Le
u60μg/ml
、 Trp40μ g
/
ml
、 出S
20μg/ml
、 Ura20μ g
/
ml
)
(方法)
e
n
e
t
i
s
i
n耐性遺伝子を、遺伝子破壊用ベクタ
まず、両端に COQ2遺伝子と相同の配列を持つ G
- pUG6 をチンプレートとして PCR によって増幅した。使用したブライマー配列及び PCR条
件は次の通り o (下線部 ;COQ2遺伝子配列)
(
COQ2-disrFw) 5
'
-QIAAGGTTATCAGAAGGGCGGAGTATACTATAGATTACAGTAGAACA
GCTGAAGCTTCGTACGC-3'
(COQ2-disrRv) 5
'
-QCACGCTATATCTACAAGAATCCAAACAGTCTCAAGATGTAGTCGGC
ATAGGCCACTAGTGGATCTG-3'
program
pUG6
60ng
1
. 94C
2min.
COQ2-disrFwプライマー
100pmol
2
. 94C
1
5s
e
c
.
COQ2-disrR
vプライマー
100pmol
3
. 53C
30s
e
c
.
2.
5u
n
i
t
4
. 68C
2min.
PL
A
:
百NUMP
fxpolymerase(GIBCO)
0
0
0
0
x10
PLATlNUMb
u
f
f
e
r
50mM乱19S04
5
.
2μl
dNTPtnl五
30nmoI
t
o
t
a
l
100μl
X29t
o2
6
. 68C
0
1
0m
i
n
.
7
. end
その結果、約 1.
5kbp (
G
e
n
e
t
i
s
i
n耐性遺伝子サイズ)の断片がシングルバンドとして増幅でき
た。この 1
β 量を用いて、後述する方法に従って酵母株 W303-1A[
a
d
e
2
鋤
1
/h
i
s
2
1
1，
1
5
/l
e
u
2
3，
1
1
2
/
t
r
p
1
-1
!ura31
] にトランスフォーメーションを行った。この酵母を G418 (200μ g
/
m
l
) を加え
n
c
u
b
a
t
eして G
e
n
e
t
i
s
i
n耐性株を選抜した。しかし酵
た YPAD培地に拡線し、約 2 日間、 30Cで i
0
母が培地一面に生えたため、これを元に新しい YPAD 培地 (+G418) にレプリカを取り、 30C
0
でi
n
c
u
b
a
t
eしたところ、 2日後に約 20個のコロニーが生育した。このうち 1
6コロニーを選び、
SD (2%g
l
u
c
o
s
e
) 培地で生育し、 SD (3% g
l
y
c
e
r
o
l
) 培地では育たないものを選抜したところ、
1
5クローンが COQ2破壊株の p
h
e
n
o
t
y
p
eを示した (
F
i
g
.4
3
/
p
.21参照)。
酵 母 か ら の ゲ ノ ム 抽 出 及 び PCR
(ゲノム抽出法)
46
• YPAD培地 10mlに酵母を移植し、 30Cで飽和するまで i
n
c
u
b
a
t
eした 0
0
・4C、1
，
6
0
0gで 2min遠心分離して細胞を沈殿させた。
0
5mlの H20 に懸濁してエツペンドルフチューブに移した 0
・上清を除き、 0.
・4C、1
0
，
000gで 5s
e
c遠心し、上清を除いた 0
0
・1%SDS/1
0
0m MNaC
l
/1
0m MT
r
i
s
丑C
l(
p
H
8
.
0
) /1m MNa2EDTA溶液を 0
.
2凶加えた 0
• P
h
e
n
o
l
:c
h
l
o
r
o
f
o
r
m
:i
s
o
a
m
y
la
l
c
o
h
o
l(
2
5
:2
4
:1
) 溶液を 0
.
2凶加えた。
・硝酸で洗浄したガラスビーズ (φ0.
5mm) を 0
.
3g加えた。
・4 minv
o
r
t
e
xし
、 TEb
u
f
f
e
r(
p
H
8
.
0
) 0
.
2mlを加えた。
，
600gで 5min遠心し、水層を新しいチューブに移して 1mlの 100%エタノー
・常温、 1
ルを加え、混合した 0
・4C、1
0，
000gで 2min遠心し、上清を除いた 0
0
・TEbu
賀町 0
.4mlと RNaseA溶液 (9μg相当)を加えて懸濁し、 37Cで 1
0mini
n
c
u
b
a
t
e
0
した。
/μIとなるように適当量の H2
0 に懸濁した。
・通常のエタノール沈殿を行い、 DNAを 1μ g
(PCRによる確認)
確認に用いた COQ2遺伝子用プライマー配列及びプログラムは以下の通り o
(COQ2f
u
l
l
F
w
) 5'-ATCAATCTTCGAGAAAAGGCTAAACGAGCC-3，
(COQ2f
u
l
l
R
v
) 5'-GCGTTGTGAAGAATGACGCCAGGATC-3
program
ゲノム DNA
0.
5 μg
1
. 9
4C
1m
i
n
.
l
1
Fwブライマー
COQ2f
u
50pmol
2
. 94C
30s
e
c
.
COQ2f
u
l
l
R
vプライマー
50pmol
3
. 52C
30s
e
c
.
5u
n
i
t
4
. 72C
.
5m
i
n
.
1
Am
p
l
iTaq(
R
o
c
h
e
)
査は
Taqbu
0
0
0
0
X10
X29t
o2
5
.
dNTPf
f
i
l
x
1.Q型高0
1
6
. 72C
t
o
t
a
150μl
7
. end
0
5min.
この結果、酵母野生株については約 1
.
5kbpの
、 COQ2欠損株については約 2kbpの断片が増
幅された (
F
i
g
.4
2
/
p
.2
1参照)。
酵母の形質転換(酢酸リチウム法5l
(試薬)
IXTE
札i
Ac:1
0XTEb
u
f
f
e
r (pH7.
5
) 1凶
、 10XLiA
c(pH7.
5
) 1ml
、H2
08凶
1
oXTEb
u
f
f
e
r CpH7.
51
:
T
r
i
s2
.
4
2g、EDTA・
3Na0
.
8
2
4gf
i
1
1upω200ml (
pH7.
5wi
也 HC
I
)
1
oXL
iA
c CpH7.
5
):酢酸リチウムニ水和物 2
.
0
4gf
i
l
lu
pt
o50ml (pH7.
5w
i
t
ha
c
e
t
i
ca
c
i
d
)
47
PEG
l
L
i
A
c :1
0XTEb
u
f
f
e
r (pH7.
5
) 1m
1
、 10XL
iA
c(
p
H
7
.
5
) 1凶
、 50%PEG40008凶
(方法)
• YPAD培 地 5mlで、酵母 W303-1A株または COQ2欠損株 (W303剛
ム COQ2) を前培
養した。
• YPAD培地 50mlに
、 OD600=
O
.
2
0
.
3になるよう前培養液を移植した 0
・菌体濃度が OD600=
1
.0
2
.
0になるまで培養する。通常 3--5h
rかかる o
・常温、 1
，
600gで 5min遠心して、沈殿した菌体を 25mlの H20 に懸濁した。
.
2
5m1の 1XTE
l
L
i
A
cに懸濁する o これをコンピタントセル
・同条件で再遠心し、菌体を 0
とした。
.100μlのコンピタントセルにプラスミド DNA1
""10μl
、熱変成したサケ精子 DNAを
100μg
、PEG
/
L
i
A
c0
.
7m1を加え、ピペッティングで懸濁した。
• 30Cで 30min
、シェーカーで i
n
c
u
b
a
t
eした。
0
• DMSO94μlを加え、ゆっくりと混合した。
• 42Cで 1
5min熱ショックを与え、 30min室温に放置した。
0
• 1
0
，
000gで 1
5s
e
c遠心し、集菌して 0
.
8m1の H20で洗浄した 0
・再遠心して、菌体を 0.
4m1の YPAD培地に懸濁した。
• 30Cで 3hr
、シエーカーで、培養した。
0
• YPAD (+G418)、SD (
U
r
a
) などの選択培地に拡線し、約 2日
、 30Cで培養した。
0
酵母からのプラスミド抽出
(試薬)
酵母溶解液:2% T
r
i
ωn
X
叩1
0
0
、 l%SDS、 1
0
0m MNaα、 1
0m MT
r
i
s
H
C
l(
p
H
8
.
0
)、 1m M
EDTA
(方法)
・2m1の YPAD培地で酵母を培養した。
5m1をエツペンドルフチューブに移し、 1
0
，
0
0
0gで 5s
e
c遠心した 0
・1
.
.菌体を 0.
2m1の酵母溶解液に懸濁した。
• P
h
e
n
o
l
:c
h
l
o
r
o
f
o
r
m
:i
s
o
a
m
y
la
l
c
o
h
o
l(
2
5
:2
4
:1
) 溶液を 0
.
2m1加えた 0
・硝酸で洗浄したガラスビーズ (φ0.5mm) を 0
.
3g加えた。
• 3
"
"4minv
o
r
t
e
xし
、 1
0
，
000g、室温で 5min遠心した。
・上清を採り、通常のエタノール沈殿を行った。
• DNAを適当量の TEb
u
f
f
e
rに溶解した。
酵 母 に お け る GT活 性 測 定
48
粗酵素液の抽出
(試薬)
1
0
0m MT
r
i
s
H
C
l (vH7.
5
)
1
0
0m MT
r
i
s
S
04 (pH9.
41
: (pH9.4withH2S04)
1MK
九P
ibu
首位 (
pH7.
41
:
1M KJ
:
I
P04200ml、1M K H2P04 50ml
S
o
l
b
i
t
o
l
/
K
九P
ib
u
f
f
e
1:1
.
2M S
o
l
b
i
t
o
l
、20m MK+P
ib
u
f
f
e
r
B
r
e
a
k
i
n
g
b
u
妊c
r:0
.
6M S
o
l
b
i
t
o
l
、20m MTris-HCl (pH7心
(方法)
1a
s
k
) で 30Cで酵母を培養し、 OD6oo=
1
.
5-2.0にした *10
• YPAD培地 200ml (
3
0
0mlt
0
・培地を 50mlフアルコンチューブ 4本に分注し、 4C、2，
400gで 5min遠心し、集菌し
0
た*20
-菌体 0.
5gあたり T
r
i
s
S
045ml、 1MDTT1
/1
0
0v
o
lを加え、 30Cで 30min
、 90rpmで
0
振とうした。
• 2，
400g、4Cで 5min遠心し、 5mlの S
o
l
b
i
t
o
l
lK九日 bu
能 rに懸濁した 0
0
.上操作を 2度繰り返した。
• Z
y
m
o
l
y
a
s
e2
0
T (生化学工業)0.
5mgを加え、 30C、 90rpmで、 OD
/
20程度に減
∞が 1
6
0
r
)振とうした(細胞壁の消イ!:J) *
30
少するまで(約 1h
• 2，
400g、4Cで 5min遠心し、 5mlの S
o
l
b
i
t
o
l
/
K+
P
ib
u
f
f
e
rに懸濁した 0
0
.上操作を 2度繰り返した。
• 2，
4
00g、4Cで 5min遠心した後、菌体に Breakingbu
旺e
r5ml
、1MPMSF
0
1
u
o
r
i
d
e
fi
nH20) 5μ1、 1MDη を 1
1
1
0
0v
o
lを加えた。
(
P
h
e
n
y
l
m
e
t
h
y
l
s
u
l
f
o
n
y
lt
・懸濁液をダウンス型破砕器に移し、ピストンを 20回上下させて細胞を破砕した *40
・細胞破砕溶液を 50mlフアルコンチューブに戻して 2，
400g、4Cで 5min遠心し、細胞
0
残津や核を除いた o
・上清を氷冷しておいた 50ml用プラスチック遠心チューブに移して 1
0，
000g、4Cで 5min
0
遠心し、沈殿はミトコンドリア画分として回収した *50
・上清を 1
0
0，
000g、4Cで 1hr超遠心し、沈殿を膜画分として回収した。
0
・ミトコンドリア及び膜画分を 1
0
0m MT
r
i
sHCl(pH7.
5
)(
+
1M DTT1
1
1
0
0vo
1)で 1度洗
司
浄し、同条件で、再遠心して塩類を除去した。
/
1
0
0vo
l)に懸濁し、これを
・各画分を適当量 (200-450μ 1)の T
r
i
s
H
C
l(
+
1M DTT1
粗酵素液として 1反応に 85μlを用いて GT活性測定を行なった。
・粗酵素液 20μlをタンパク質定量に用いた。
注) *1 ・ODは、低すぎると菌量が十分でなく、高すぎるとプロテアーゼにより酵素が分解されるため
か、酵素活性が検出できなくなる。
• YPAD培地への形質転換株の植菌は、必ず SD ト U
r
a
)培地等で選抜をかけたものから行う
こと。 YPAD培地で前培養を行うと、かなりの高頻度でプラスミドが脱落するという結果が出
ている。
49
-培養時間については 16h
r
.
.
.
.
.
.
.
.
3
0h
rまで様々だが、植菌する種の保存期間が長ければ長いほど増
0
h
rを超えるようであれば、本実験が失敗する可
殖速度も遅くなるようである。培養時間が 3
能性は高い
<
*
5
)。
*2 ・一度目の遠心で 4本のチューブにそれぞれ菌を沈殿させ、上清を少し残して捨て、再び残った
培地に懸濁する。この懸濁液を 1本のチューブに集め、再逮心することで菌を 1本のチューブ
に集める。
*3 ・50mlフアルコンチューブをバンドで振とう培養器に固定し、振とうする。
*
4・ピストンは手で操作する。酵素が失活する恐れがあるため、泡が入らないように注意する。
*
5・この段階で沈殿が見られないときは実験は失敗である。たとえ上清を超遠心しでも、沈殿が得
られることはほとんどない。原因は不明だが、最初の培養時闘が長すぎた時、植菌の種が古す
ぎた時に起こることが多い<*1)。
GT活 性 測 定
活性測定、および反応産物 GBAの検出・定量方法は、第三章における GT活性測定法と同様
である o
基質特異性の検定
粗酵素液の抽出方法は、上述したプロトコルに従った。
活性測定のブレニル基質としては、
g
e
r
a
n
y
l
p
y
r
o
p
h
a
s
p
h
a
t
e
(GPP-C10)
d
i
m
e
t
h
y
l
a
l
l
y
l
p
y
r
o
p
h
o
s
p
h
a
t
e (DMAPP-C5)、
、 farnesylpyrophosphate
( 目 下C
1
5
/
Sigma )
、
g
e
r
a
n
y
l
g
e
r
a
n
y
l
p
y
r
o
p
h
o
s
p
h
a
t
e (GGPP-C20/Sigma) の四種を用い、それぞれに対する酵素活性を
比較した。
反応生成物の同定及び定量は RIにより BAS2000で行うため、もう一つの基質である PHBは
14Cラベルされたもの傘を用いた。
*p・.
H
y
d
r
o
x
y
[
r
i
n
g
べJ
-14C
]
b
e
n
z
o
i
ca
c
i
d(
3
3mCi/mmo
I
) CSigma)
、400μMGPP (
-一反応あたり、 1
0m MMgC1
o
rDMAPP/FPP/GGPp)、24μM14C-PHB
2
、3kBq
) とし、粗酵素液 85μlを加えて t
o
ta
1100μlでエツペンドルフチュー
(
8
0nCi
ブにて 30C、 1 h
ri
n
c
u
b
a
t
eした。(四種の反応に対して同じ粗酵素液を用いるため、
0
反応中の蛋白質量は一定である。)
・蟻酸 5μlで酵素反応を停止させ、酢酸エチルで有機物を抽出し、ヘリウムガスで乾燥
させた。
• 10μl メタノールに溶解させ、全量を1L
Cプレート (
2
0cmx20cm
、Ki
e
s
e
lg
e
l60F
、
254
MERCK) にスポットした(スポットは直径 5mm程度に抑える)。
・1L
Cの展開溶媒にはベンゼ、ン:酢酸エチルヰ 8:2を 1
0
0m1用い、展開は溶媒がプレート
の上端から 2cmのところで終了した(約 2h
r
.
)。
.1L
Cプレートをよく乾かしてラップで包み、 BAS2000のイメージングプレートに 48hr
50
挟んでから解析した。
参考) PHB:Rf=0
.
1
2 GBA:Rf=0
.
2
4 FBA:Rf=0
.
2
8 GGBA:Rf=0
.
3
2
ムラサキ bariy root におけるシコニン生合成遺伝子の組織特異
的発現の解析
1
・
3
.実験材料および方法
￨ムラサキの h
a
i
r
yr
o
o
tの培養￨
a
i
r
yr
o
o
tを MS液体培地 30ml(
100ml容三角フラスコ)で暗黒下、 90叩 m、
通常の継代培養は、 h
25C
にてロータリーシェーカーで振とう培養し、 1 か月に一度、その一部を新鮮な培地に移植
0
した。また、本研究においてはシコニン生産中の h
a
i
r
yr
o
o
tを用いたが、シコニン生産の誘導は、
a
i
r
yr
o
o
tを M9培地(暗黒下、および光照射下)に移植することで行った。
この MS培地中の h
a
i
r
yr
o
o
tt7J片の調製￨
￨ムラサキ h
M9培地(暗黒下、および光照射下)で培養したムラサキの h
a
i
r
yr
o
o
tをカミソリ刃で約 lcm に
切断し、 FAE固定液 (4%、および 2%)、または GA/PFA固定液で国定した後、エタノールで脱
水し、ワックス
σaplastp1us、OXFORD)に包埋した。包埋後、メスを用いてフリーハンドで適
訂
e
i
c
a
)で厚さ
当な大きさにトリミングし、ミクロトーム(全自動回転式ミクロトーム R M2155、L
20μm の縦切り切片、および 25μm の輪切り切片を作成した。その後、切片をスライドグラス(ス
ーパーフロスト APS コート付、 MATSUNAMI)に滴下した蒸留水の上に乗せ、パラフィン伸展
器(H
OTPLATESP-45D、HlRASAWA)上で 4rcにて一晩乾燥した。
PIGラ ベ ル 悶A プローブの作成 (
i
nv
i
t
r
o蜘
s
c
r
i
p
t
i
o
n
)
1
テンプレートとしては、目的の DNAがサブクローニングされている p
B
1
u
e
s
c
r
i
p
tを i
n
s
e
r
tの
i
g
e
s
t して直鎖状にした後、フェノール・クロロホルム処理、および
一端の適当な制限酵素で d
Et
O
H 沈殿を行ったものを用いた (
S
a
c など、切断後に 3
'末端突出となる制限酵素は不適)。用
いた t
e
m
p
1
a
t
eDNAは F
i
g
.1
1に示した。 DIGラベルした RNAプロープは、 DIGRNAL
a
b
e
1
i
n
gKi
t
侭o
c
h
e
)を用い、標準プロトコールに従って作成した。また、操作はすべて陪'Il
a
s
e合e
eで行った。
プロトコールは以下の通り o
p
u
r
i
f
i
e
dt
e
m
p
l
a
t
eDNA1μgi
nsHzO13μl
a
d
d(
o
ni
c
e
)NTPl
a
b
e
l
i
n
gmix2同
1
0Xc
o
n
ct
r
a
n
s
c
r
i
p
t
i
o
nbu
宜er2μI
RN
a
s
ei
n
h
i
b
i
t
o
r(
4
0U/
μ
1
)
:1μl
T7o
rT3RNAp
o
1
y
m
e
r
a
s
e
:2μ1(制限酵素処理によりどちらか決定)
5
1
i
n
c
u
b
a
t
ea
t37C 2
h
r
0
制
a
s
e企e
e
)2μl
a
d
dDNase (RN
i
n
c
u
b
a
t
ea
t37C
.1
5m出
0
a
d
d0.
2M EDTA2μ1(反応停止)
s
t
o
r
ea
t 20C
0
剛
反応停止後、 s
i
z
em
a
r
k
e
r とともに電気泳動して反応産物の確認を行った。 RNA濃度は Gene
Quant (
p
h
a
r
m
a
c
i
aB
i
o
t
e
c
h
)で 260nmの吸光度を測定することで決定した。
旨削ocolf
o
ri
ns
i
t
uh
y
b
r
i
d
i
z
a
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・
50%EtOH2
0
2
5mloni
c
e，20min
嶋
噸
70%EtOH20
・
25mloni
c
e，
2
0
3
0min
80%EtOH2
0
2
5ml，2
0
3
0min
・90%E
tOH2
0
2
5ml
，20・30min
剛
1
0
0
0
/
0E
tOH20
・2
5ml，2
0
3
0min
・
1
%E
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n
e
Y
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l
l
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n100%日OH
・2
5ml，
2
0
3
0min
-100%EtOH20
占tOH/tBuOH(
3
:
1
)2
0
2
5ml
，30min
占 tOH/
tBuOH(
1
:1
)2
0
2
5ml，30min
占 tOH/
tBuOH(
1:
3
)2
0
2
5ml
，30min
-tBuOH20
・2
5mla
t32C，
30min
0
P
a
r
a
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l
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tp
l
u
s(OXFORD)s
a
t
u
r
a
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i
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htBuOH2
0
2
5mla
t32C，
4h
r
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l
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u
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i
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0
2
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0
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・
勾r
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1
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O
H，
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ノ
ノ
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蜘
-95%EtOH
，0.85%NaCli
nHzO
，5min
85%Et
O
H，0.85%NaCli
nHzO
，5min(
ノ
ノ
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節要因に関する研究 J (
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5
謝辞
本研究は、京都大学大学院・生命科学研究科・全能性統御機構学分野・佐藤文彦教授の
研究室において行われた。
本研究の遂行にあたっては、本学修士の園久美由紀氏の多大なる協力を得た。また、同修
士課程の藤崎隆広氏の協力も研究締部において大いに役に立った。長崎大学山本浩文博士
にはムラサキのシコニン誘導に対する新たな知見を提供頂いた。
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この他、酵母発現用ベクターを分与頂いた T
リーシーケンサーの使用を許可頂いた本大学農学研究科天然高分子化学分野の林力丸教授、
酵母の遺伝子欠損株作成法を御指導いただいた本研究科微生物細胞機構学分野の玉置尚憲
博士、そしてムラサキ植物体を分与下さいました武田薬品工業株式会社および天藤製薬株
式会社の皆様に深謝する o
56