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− 291 − ホ．薬理作用 1. 効力を裏付ける試験 295
ホ．薬理作用 1. 効力を裏付ける試験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295 括 ............................................................................ 295 (1) 抗ウイルス作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 1) BVDV 感染 MDBK 細胞培養系における抗ウイルス作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301 2) 抗ウイルス作用のスペクトル . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308 3) 抗ウイルス作用のまとめ及び考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315 (2) 作用機序 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316 1) 細胞内におけるリバビリンのリン酸化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317 2) IMPDH に対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318 3) HCV 及び BVDV 由来 RdRp に対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321 4) HCV 由来 IRES 依存性翻訳調節に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324 5) HCV 由来 NS3 プロテアーゼ活性に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326 6) ポリオウイルスを用いた作用機序の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 327 7) 作用機序のまとめ及び考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 337 (3) 代謝物の効力についての薬理試験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 1) 抗ウイルス作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342 2) 細胞増殖抑制作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 (4) リバビリンと各種 IFN との併用時の抗ウイルス作用の比較 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 345 (5) リバビリン及び IFNα−2b に対する耐性ウイルスの出現について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346 2. 一般薬理試験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 括 ............................................................................ 349 (1) 一般症状に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 (2) 中枢神経系に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 1) 麻酔作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 349 2) 電撃痙攣 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 3) 痛覚に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 4) 体温に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350 (3) 自律神経系及び平滑筋に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 (4) 呼吸・循環器系に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 1) 呼吸及び血流量に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 2) 血圧，心拍数及び心電図に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 (5) 消化器系に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 1) 腸管内輸送能に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351 2) 胃内容排出能に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352 3) 胃粘膜に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352 (6) 水及び電解質代謝に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352 総 総 − 291 − ホ．薬理作用の項の略号一覧表 略号 (略称) 化学名 (一般名) 構造式 由来 リバビリン 1−β−D−Ribofuranosyl− 1H−1,2,4−triazole−3− carboxamide 原薬 RMP Ribavirin monophosphate 代謝物 RDP Ribavirin diphosphate 代謝物 RTP Ribavirin triphosphate 代謝物 TCONH2 1H−1,2,4−Triazole−3− carboxamide 代謝物 RTCOOH 1−β−D−Ribofuranosyl− 1H−1,2,4−triazole−3− carboxylic acid 代謝物 TCOOH 1H−1,2,4−Triazole−3− carboxylic acid 代謝物 − 292 − 略号 (略称) 内 容 A アデノシン (adenosine) ALT アラニンアミノトランスフェラーゼ (alanine aminotransferase) AST アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (aspartate aminotransferase) ATP アデノシン三リン酸 (adenosine triphosphate) BVDV ウシウイルス性下痢症ウイルス (bovine viral diarrhea virus) C シチジン (cytidine) CMV サイトメガロウイルス (cytomegalovirus) CTP シチジン三リン酸 (cytidine triphosphate) DdDp DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ (DNA−dependent DNA polymerase) DdRp DNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (DNA−dependent RNA polymerase) dATP デオキシアデノシン三リン酸 (deoxyadenosine triphosphate) dCTP デオキシシチジン三リン酸 (deoxycytidine triphosphate) dGTP デオキシグアノシン三リン酸 (deoxyguanosine triphosphate) DS デキストラン硫酸 (dextran sulfate) dTTP デオキシチミジン三リン酸 (deoxythymidine triphosphate) FL ホタルルシフェラーゼ (firefly luciferase) FluV A インフルエンザウイルス A 型 (influenza virus A) G グアノシン (guanosine) GMP グアノシン一リン酸 (guanosine monophosphate) GTP グアノシン三リン酸 (guanosine triphosphate) guar グアニジン耐性 (guanidine resistance) HCV C 型肝炎ウイルス (hepatitis C virus) HEF ヒト胎児線維芽細胞 (human embryonic fibroblast) HSV−1 単純ヘルペスウイルス 1 型 (herpes symplex virus 1) IFN インターフェロン (interferon) IMP イノシン一リン酸 (inosine monophosphate) IMPDH イノシン一リン酸脱水素酵素 (IMP dehydrogenase) IRES internal ribosome entry site MLSV 麻疹ウイルス (measles virus) MPA ミコフェノール酸 (mycophenolic acid) MPSV ムンプスウイルス (mumps virus) MTS 3−(4,5−dimethylthiazol−2−yl)−5−(3−carboxymethoxyphenyl)−2− (4−sulfophenyl)−2H−tetrazolium, inner salt NAD ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (nicotinamide adenine dinucleotide) NS 非構造蛋白質領域 (non−structural region) PfluV 2 パラインフルエンザウイルス 2 型 (parainfluenza virus 2) RDP リバビリン二リン酸 (ribavirin diphosphate) RdRp RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RNA−dependent RNA polymerase) − 293 − 略号 (略称) 内 容 RMP リバビリン一リン酸 (ribavirin monophosphate) RL ウミシイタケルシフェラーゼ (Renilla luciferase) RSV RS (respiratory syncytial) ウイルス RTP リバビリン三リン酸 (ribavirin triphosphate) U ウリジン (uridine) UTP ウリジン三リン酸 (uridine triphosphate) − 294 − ホホ. 薬 理 . . . . . . . . 添付資料**タグなし**∼**タグなし**，**タグなし**∼**タグなし** 1. 効力を裏付ける試験 . . . . . . 添付資料**タグなし**，**タグなし**，**タグなし**∼**タグなし** 総 表ホ − 1 試 験 項 ウイルス, 細胞等 目 括 効力を裏付ける試験成績一覧表 (その 1) 薬物，用量，濃度 試 験 成 績 頁 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系における抗ウイルス作用 リバビリン単独作用 BVDV 感染 MDBK 細胞 リバビリン 0.2∼200μM IC50 ＝ 3μM (0.7μg/mL) 12.5μM (3.1μg/mL) 以上で細胞増殖抑制 302 IFNα−2b 単独作用 IFNα−2b 1∼1000 IU/mL IC50 ＝ 30 IU/mL 303 リバビリンと IFNα −2b との併用作用 リバビリン 0.1∼100μM IFNα−2b 7.5∼2000 IU/mL リバビリンと IFNα−2b を併用することにより 相乗的な作用増強が認められた 304 BVDV の RNA 量に 及ぼす影響 リバビリン 0.3∼10μM IC50 ＝ 1.5μM (0.4μg/mL) 307 308 In vitro 抗ウイルス作用 RNA ウイルス FluV A, PfluV 2, RSV, MLSV, MPSV リバビリン IFNα−2b リバビリンはいずれの RNA ウイルスに対しても 作用を示し, IC50 値は 11∼342μM (2.6∼83.6 μg/mL) IFNα−2b は MLSV，MPSV に対して作用を示 し，IC50 値はそれぞれ 142.9 及び 94.5 IU/mL DNA ウイルス HSV−1, CMV リバビリン IFNα−2b リバビリン及び IFNα−2b は CMV に対して作用 を示し，IC50 値 はそれぞれ 267μM (65.1μg/mL) 及び 12.6 IU/mL 細胞増殖抑制作用 HMV−II細胞 リバビリン IFNα−2b Gl−HeLa細 胞 Vero 細胞 RPMI8226 細 胞, HEF MRC−5 細胞 リバビリンは HMV−II 及び RPMI8226 細胞に 対して作用を示し，CC50 値はそれぞれ 240μM (58.6μg/mL) 及び 117μM (28.6μg/mL) IFNα−2b は RPMI8226 細胞に対して作用を示 し，CC50 値は 76.0 IU/mL 1. 抗 ウ 抗 イ ウ ル イ ス ル 作 ス 用 作 用 の ス In vivo 抗ウイルス作用 RNA ウイルス 感染モデル FluV A 感染 リスザル リバビリン 約 13 mg/kg/日, 4 日間吸入投与 ラッサ熱ウイ ルス感染アカ ゲザル リバビリン リバビリンはラッサ熱ウイルスの血清中ウイルス 30, 50 mg/kg/日, 量の増加を抑制し，致死を防御 14, 19 日間皮下投 与 312 Junin ウイル ス感染アカゲ ザル リバビリン リバビリンは Junin ウイルスによる致死を防御 15∼60 mg/kg/日, 15, 18 日間筋肉内 投与 313 デング熱ウイ ルス感染アカ ゲザル リバビリン 30, 50 mg/kg/日, 11 日間筋肉内投 与 314 ペ ク ト ル − 295 − リバビリンはインフルエンザ様症状 (くしゃみ， 咳嗽または鼻漏) を抑制 リバビリンはデング熱ウイルスによる局所リンパ 節の腫張，発熱，血清中ウイルス量，血清 AST 及び ALT 値を抑制または減少させず 311 表ホ − 1 試 験 項 目 効力を裏付ける試験成績一覧表 (その 2) ウイルス, 細胞等 薬物，用量，濃度 試 験 成 績 頁 細胞内におけるリバビリ ンのリン酸化 HepG2 細胞 リバビリン 41μM 細胞内でリン酸化を受け，RMP, RDP 及び RTP として存在 317 細胞内 GTP 量に及 I ぼす影響 M P IMPDH 阻害作用 D 酵素阻害作用 H に 抗ウイルス作用 対 す る 抗ウイルス作用に 作 及ぼすグアノシン 用 添加の影響 HepG2 細胞 リバビリン 41μM 添加後 2，4 及び 8 時間で GTP 量がそれぞれ 31，63 及び 58%減少 318 IMPDH RMP, MPA, IMP Ki 値 : RMP (0.5μM)，MPA (10 nM)，IMP (10 μM) 319 BVDV 感染 MDBK 細胞 IC50 値 : RMP (3μM), MPA (16∼62 nMで弱い 抗ウイルス作用), IMP (>0.5μM) リバビリン 0.2∼200μM グアノシンの添加により，リバビリンの抗ウイル ス作用は減弱したが，消失しなかった 320 HCV 由来 RdRp RTP RTP は GTP の RNA への取込みを抑制 (IC50 ＝49∼152μM, リバビリン換算濃度：12∼ 37μg/mL) 321 BVDV 由来 RdRp RTP RTP は GTP の RNA への取込みを抑制 (IC50 ＝ 49μM, リバビリン換算濃度：12μg/mL) 322 HCV 由来 RdRp RTP 400μM RTP は基質として RNA に誤って取り込まれた 323 HCV 由来 IRES 依存性 用 翻訳調節に及ぼす影響 レポーター遺 伝子導入 Huh−T7細胞 リバビリン及び RTP はいずれの試験系でも， IRES 依存性蛋白質合成を抑制せず 324 機 無細胞系 リバビリン 4∼164μM RTP R 2∼83μM HCV 由来 NS3 プロテ 序 アーゼ活性に及ぼす影響 NS5A/NS5B 切断部位を有 する合成ペプ チド リバビリン, RMP, RDP, RTP 0.065∼10μM リバビリン及びリン酸化体は NS3 プロテアーゼ 活性を抑制せず 326 RTP RTP は基質として RNA に誤って取り込まれ， 取り込まれた RTP は RNA の伸長を抑制せず 327 RTP は RNA に取り込まれ，その取込み効率は シチジン及びウリジンに対して同程度であった 誤って取り込まれた RTP は引続き RNA 合成の 鋳型として利用された 329 HCV 及び BVDV 由来 RdRp に対する作用 GTP の RNA への 取込み 2. RTP の RNA への 取込み 作 ポ リ オ ウ イ ル ス を 用 い た 作 用 機 序 の 検 討 RdRp による RTP の ポリオウイル ス由来 RdRp RNA への取込み RdRp による RTP の RNA への取込みの 反応速度解析 325 RNA の翻訳及び複 製に対する作用 レポーター遺 リバビリン 伝子導入 100∼1000μM 及びポリオウ イルス感染 HeLa S3 細胞 リバビリンはポリオウイルス RNA の翻訳及び複 製にほとんど影響を及ぼさなかったが，感染性ウ イルス量を減少させた 331 変異誘発能 ポリオウイル リバビリン ス感染 100∼1000μM HeLa S3 細胞 リバビリンは 100μM (24μg/mL) 以上で変異ウ イルスの出現頻度を増加させ，感染性ウイルス量 を減少させた 334 リバビリンにより 誘発される変異塩基 の同定 ポリオウイル リバビリン ス感染 1000μM HeLa S3 細胞 リバビリンは G → A 及び C → U への置換変異 をそれぞれ約 11 及び 7 倍に増加させた 336 − 296 − 表ホ − 1 試 験 項 目 抗ウイルス作用 ウイルス, 細胞等 試 験 成 績 頁 リバビリン, TCONH2, RTCOOH, TCOOH 0.2∼200μM リバビリンは抗ウイルス作用を示したが，代謝 物はいずれも作用なし 342 ヒト末梢血 単核細胞 リバビリン, いずれの細胞に対しても増殖を抑制せず 343 HepG2 細胞 RTCOOH, TCOOH 代 物 薬物，用量，濃度 BVDV 感染 MDBK 細胞 3. 謝 細胞増殖抑制作用 効力を裏付ける試験成績一覧表 (その 3) TCONH2, 344 0.2∼200μM 4. 各種 IFN との併用時の抗 ウイルス作用の比較 BVDV 感染 MDBK 細胞 リバビリン 0.2∼200μM 各種 IFN 1∼500 IU/mL リバビリンとα型 IFN との併用で抗ウイルス 作用の増強が認められたが，βまたはγ型 IFN との併用では作用の増強は認められな かった 345 5. 耐性ウイルスの出現 ヒト免疫不全 ウイルス リバビリン リバビリンを反復投与しても，IC50 値は上昇 1200 mg/日, せず，耐性の発現はみられなかった 5∼9ヵ月間経口投与 346 RSV リバビリン 41, 61μM リバビリン存在下で 1 または 2 回継代しても, プラック形成抑制作用は減弱せず，耐性の発 現はみられなかった HSV−1 リバビリン 41μM リバビリン存在下で 10 回継代しても，プラッ ク形成抑制作用は減弱せず，耐性の発現はみ られなかった A : アデノシン ALT : アラニンアミノトランスフェラーゼ AST : アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ BVDV : ウシウイルス性下痢症ウイルス C : シチジン CMV : サイトメガロウイルス FluV A : インフルエンザウイルス A 型 G : グアノシン GTP : グアノシン三リン酸 HEF : ヒト胎児線維芽細胞 HSV−1 : 単純ヘルペスウイルス 1 型 IMPDH : IMP 脱水素酵素 IRES : internal ribosome entry site MPSV : ムンプスウイルス NS : 非構造蛋白質領域 MLSV : 麻疹ウイルス IMP : イノシン一リン酸 MPA : ミコフェノール酸 PfluV 2 : パラインフルエンザウイルス 2 型 PHA : phytohemagglutinin RDP : リバビリン二リン酸 RMP : リバビリン一リン酸 HCV : C 型肝炎ウイルス IFN : インターフェロン RdRp : RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ RSV : RS (respiratory syncytial) ウイルス RTCOOH : 1−β−D−ribofuranosyl−1H−1,2,4−triazole−3−carboxylic acid RTP : リバビリン三リン酸 TCONH2 : 1H−1,2,4−triazole−3−carboxamide TCOOH : 1H−1,2,4−triazole−3−carboxylic acid U : ウリジン (1) 抗ウイルス作用 1) BVDV 感染 MDBK 細胞培養系における抗ウイルス作用 リバビリンは HCV の近縁ウイルスである BVDV に対して単独で抗ウイルス作用を示し， その IC50 値は 3μM (0.7μg/mL) であった．12.5μM (3.1μg/mL) 以上の濃度では，リバビ リンの細胞増殖抑制作用による生細胞数の減少がみられた． リバビリンと IFNα−2b を併用した場合は，IFNα−2b の抗ウイルス作用が増強され， その程度は相乗的であった．一方，リバビリンと IFNα−2b を併用してもリバビリンの細 胞増殖抑制作用は増強されなかった． − 297 − また，リバビリンは BVDV の RNA 量を減少させ，その IC50 値は 1.5μM (0.4μg/mL) で あった． 2) 抗ウイルス作用のスペクトル 1 In vitro 抗ウイルス作用 リバビリンは試験に用いた全ての RNA ウイルスに対して抗ウイルス作用を示し，その IC50 値は 11∼342μM (2.6∼83.6μg/mL) であった． また，リバビリンは DNA ウイルスである CMV に対して抗ウイルス作用を示し，その IC50 値は 267μM (65.1μg/mL) であった．HSV−1 に対しては，抗ウイルス作用を示さな かった． リバビリンは HMV−II 細胞及び RPMI8226 細胞に対して増殖抑制作用を示し，その CC50 値はそれぞれ 240μM (58.6μg/mL) 及び 117μM (28.6μg/mL) であった． 2 In vivo 抗ウイルス作用 リバビリンはサルを用いた FluV，ラッサ熱ウイルス及び Junin ウイルス感染モデルに おいて，約 13∼60 mg/kg/日の反復投与により，症状，血清中ウイルス量，死亡率等を抑 制または減少させた．しかし，リバビリンはサルを用いたデング熱ウイルス感染モデルに おいて，30 または 50 mg/kg/日を反復投与しても，症状，血清中ウイルス量等を抑制また は減少させなかった． (2) 作用機序 1) 細胞内におけるリバビリンのリン酸化 リバビリンは細胞内でリン酸化を受け，RMP，RDP 及び RTP として存在することが示 された． 2) IMPDH に対する作用 リバビリンは IMPDH を阻害することにより細胞内 GTP 量を減少させた．しかし，グア ノシンを添加しても，リバビリンの BVDV に対する抗ウイルス作用は消失しなかった．ま た，IMPDH 阻害剤である MPA は明らかな抗ウイルス作用を示さなかった．これらから， リバビリンは IMPDH 阻害作用を有するものの，この阻害作用は抗ウイルス作用の主要な 作用機序ではないと考えられた． 3) HCV 及び BVDV 由来 RdRp に対する作用 1 RNA への GTP の 取込みに対する RTP の抑制作用 (HCV 由来 RdRp) RTP は HCV 由来 RdRp による RNA への GTP の取込みを抑制した (IC50 ＝ 49∼152μM， リバビリン換算濃度：12∼37μg/mL)． − 298 − 2 RNA への GTP の 取込みに対する RTP の抑制作用 (BVDV 由来 RdRp) RTP は BVDV 由来 RdRp による RNA への GTP の取込みを抑制した (IC50 ＝ 49μM，リ バビリン換算濃度：12μg/mL)． 3 HCV 由来 RdRp による RTP の RNA への取込み RTP は HCV 由来 RdRp の基質として認識され，RNA に誤って取り込まれることが示さ れた． 4) HCV 由来 IRES 依存性翻訳調節に及ぼす影響 リバビリン及び RTP は HCV のウイルス RNA の翻訳開始点である IRES 依存性の蛋白質 合成を抑制しなかった． 5) HCV 由来 NS3 プロテアーゼ活性に及ぼす影響 リバビリン及び 3 種類のリン酸化体は HCV の NS3 プロテアーゼ活性に影響を及ぼさな かった． 6) ポリオウイルスを用いた作用機序の検討 1 ポリオウイルス由来 RdRp による RTP の RNA への取込み RTP はポリオウイルス由来 RdRp の基質として認識され，RNA に誤って取り込まれ た．RNA に取り込まれた RTP は，それ以後の RNA 鎖の伸長を抑制しなかった． 2 ポリオウイルス由来 RdRp による RTP の RNA への取込みの反応速度解析 RTP は鋳型 RNA 中のシチジン及びウリジンと対合し RNA に取り込まれた．シチジン 及びウリジンに対する RTP の RNA への取込み効率は同程度であった． RNA に取り込まれた RTP は，引続き RNA 合成の鋳型として利用された． 3 ポリオウイルス RNA の翻訳及び複製に対する作用 リバビリンをウイルス感染細胞に 2 時間または 8∼10 時間作用させた結果，ウイルス 由来 RNA の翻訳及び複製にはほとんど影響はみられなかったが，感染性ウイルス量は減 少した． 4 ポリオウイルスに対する変異誘発能 リバビリンをウイルス感染細胞に 4∼7 日間作用させた結果，100μM (24μg/mL) 以上で 変異ウイルスの出現頻度が増加し，感染性ウイルス量が減少した． 5 リバビリンにより誘発されるポリオウイルスの変異塩基の同定 リバビリンをウイルス感染細胞に 10 時間作用させた結果，G から A 及び C から U への 置換変異の頻度が増加した． − 299 − (3) 代謝物の効力についての薬理試験 6 種類のリバビリン代謝物のうち，リン酸化体を除く 3 種類の代謝物 (TCONH2，RTCOOH 及び TCOOH) の効力を BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いて検討した結果，いずれも抗ウ イルス作用を示さなかった．また，ヒト末梢血単核細胞及びヒト肝細胞癌細胞株 HepG2 細胞 を用いて細胞増殖抑制作用を検討した結果，いずれも 200μM までの用量範囲で増殖を抑制し なかった． (4) リバビリンと各種 IFN との併用時の抗ウイルス作用の比較 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いてリバビリンと各種 IFN との併用時の抗ウイルス作用 を比較した．その結果，IFNα−2b を含むα型 IFN と併用した場合はリバビリンの抗ウイル ス作用が増強したのに対し，β型 IFN またはγ型 IFN と併用した場合はリバビリンの抗ウイ ルス作用は増強しなかった． (5) リバビリン及び IFN α−2b に対する耐性ウイルスの出現について これまで，in vitro または in vivo でリバビリンに対する耐性ウイルスの出現が誘導されたと の報告はない．また，C 型慢性肝炎患者にリバビリンと IFNα−2b を併用投与しても，投与期 間中の血清 HCV RNA 量の再増加はみられず，IFNα−2b に対する耐性ウイルスまたは増殖能 の強いウイルスが出現する可能性は低いと考えられた． 以上から，リバビリンは HCV の代替ウイルス感染系において抗ウイルス作用を示し，その 作用は IFNα−2b を含むα型 IFN との併用により相乗的に増強された．リバビリンの詳細な 作用機序は十分に解明されていないものの，これまでの試験結果から，リバビリンは細胞内で リン酸化された後，ゲノムである RNA に変異を誘導することにより抗ウイルス作用を示すと 考えられた． リバビリンのリン酸化体以外の代謝物には抗ウイルス作用は認められなかった．また，リバ ビリン及び IFNα−2b に対する耐性ウイルスの出現の可能性は低いと考えられた． − 300 − C 型肝炎ウイルス (HCV) の近縁ウイルスを用いて，リバビリン及びインターフェロン (IFN) α−2b をそれぞれ単独で作用させた場合の抗ウイルス作用並びに両者を併用した場合の増強作 用を記載し，あわせて，種々の RNA 及び DNA ウイルスに対する抗ウイルス作用のスペクトル を示した．作用機序の項では，イノシン一リン酸脱水素酵素 (IMPDH) 阻害作用及び HCV 由来 RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRp) に対する作用等を記載した．この他，リバビリンの代謝 物の作用，リバビリンと各種 IFN を併用した場合の薬理試験成績を記載し，最後にリバビリン 及び IFNα−2b に対する耐性ウイルスの出現の有無に関して考察した． (1) 抗ウイルス作用 1) BVDV 感染 MDBK 細胞培養系における抗ウイルス作用 . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 現在，HCV を一過性に複製できる細胞培養系は存在するが，抗ウイルス剤の作用を再現性 よく評価できる HCV 感染細胞培養系は確立されていない．このため，リバビリンの抗ウイル ス作用の評価に際しては，ウシウイルス性下痢症ウイルス (BVDV) を HCV の代替ウイルスと して用いた．BVDV は HCV と同じフラビウイルス科に属し，系統発生樹解析では BVDV と HCV との間には密接な関連があることが示されており1)，HCV の代替ウイルスとして妥当と 判断した．感染細胞にはウシ腎細胞株 MDBK 細胞を用い，BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を確 立した． − 301 − リバビリンの単独作用 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いて，リバビリンの抗ウイルス作用を検討した． 方法 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系： MDBK 細胞を 8×103 細胞/well で 96 well プレートに播種後，37℃にて一晩培養し，プ レートに付着させた．細胞を洗浄後，BVDV の NADL 株 (BVDV から分離した細胞変性作 用を有する株) を感染させ，2 時間後にリバビリン (0.2∼200μM) を加え，45 時間培養し た．細胞を洗浄し，MTS (テトラゾリウム化合物) 試薬を加え，2∼3 時間培養後，生細胞 のミトコンドリアでの還元によるホルマザン生成物量を 490 nm の吸光度にて測定した． 吸光度の値は，ウイルス感染による細胞傷害から逃れた細胞の割合を示す．また，ウイル ス感染細胞のウイルスによる細胞傷害を 50%防御するのに必要な被験薬物濃度 (IC50 値) を 算出した． 成績 試験結果を図ホ − 1 に示した．リバビリンは BVDV による MDBK 細胞の細胞傷害を抑制 し，BVDV に対して抗ウイルス作用を有することが示された．細胞傷害の抑制が最大となる 至適濃度は 6.25μM (1.5μg/mL)，IC50 値は 3μM (0.7μg/mL) であった．一方，12.5μM (3.1 μg/mL) 以上の濃度では吸光度が減少し，リバビリンの細胞増殖抑制作用により生細胞数が 減少することが示された． 1.2 1 吸光度 1 0.8 0.6 0.4 0 0.2 0.39 0.78 1.56 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 1 BVDV に対するリバビリンの抗ウイルス作用 各点は 2 例の平均値を示す． − 302 − IFNα−2b の単独作用 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いて，IFNα−2b の抗ウイルス作用を検討した． 方法 1 に記載した BVDV 感染 MDBK 細胞培養系で，1∼1000 IU/mL の IFNα−2b を作用させ た． 成績 試験結果を図ホ − 2 に示した．IFNα−2b は BVDV に対して抗ウイルス作用を示し，そ の至適濃度は 250 IU/mL，IC50 値は 30 IU/mL であった． 0.8 0.7 吸光度 2 0.6 0.5 0.4 0.3 1 2 4 8 16 31 63 125 250 500 1000 IFNα−2b 濃度 (IU/mL) 図ホ − 2 BVDV に対する IFNα−2b の抗ウイルス作用 各点は 2 例の平均値を示す． − 303 − 3 リバビリンと IFNα−2b との併用作用 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いて，リバビリンと IFNα−2b を併用した場合の抗ウ イルス作用を検討した． 方法 1 に記載した BVDV 感染 MDBK 細胞培養系で，リバビリンと IFNα−2b を併用した． 試験を 2 回行った．最初に 0.2∼100μM のリバビリンと 10∼200 IU/mL の IFNα−2b を 併用し (試験 1)，次に，リバビリン及び IFNα−2b の濃度幅を広げ，0.1∼100μM のリバビ リンと 7.5∼2000 IU/mL の IFNα−2b を併用した (試験 2)． なお，試験 2 では，リバビリンと IFN α −2b を併用した時の作用増強が相加的 ( 単独 作用の和) か，相乗的 (単独作用の和よりも強く増強) かを検討する目的で，交互作用係数 (interaction parameter) αを SAS にある非線形回帰プロセジャを用いて，以下の式より算出 した2)． D1 1= IC50, 1 × D2 ＋ 1 m1 E IC50, 2 × Emax − E E 1 m2 Emax − E α×D1×D2 ＋ IC50, 1 × IC50, 2 × 1 1 ＋ 2 m1 2 m2 E Emax − E E: 抗ウイルス作用, 細胞増殖 (吸光度) IC50, 1, IC50, 2: それぞれ最大吸光度の 50% を得るための リバビリン及び IFNα−2b 濃度 D1: リバビリン濃度 (IU/mL) D2: IFNα−2b 濃度 (μM) Emax : 最大吸光度 α: 交互作用係数 m1, m2: リバビリン及び IFNα−2b それぞれの 濃度−作用曲線の IC50 における傾き IC50, 1，IC50, 2，m1 及び m2 の各値は，リバビリンまたは IFNα−2b それぞれ単独の抗ウ イルス作用から与えられる値を示す．右辺の第一項はリバビリン単独の抗ウイルス作用項 を，第二項は IFNα−2b 単独の抗ウイルス作用項を，そして第三項はリバビリンと IFNα −2b の交互作用項を示す．上記の式において，α=0 のとき 2 剤の併用は相加的，α>0 の とき相乗的，α<0 のとき拮抗的であることを示す． − 304 − 成績 試験 1 の結果を図ホ − 3 に示した．リバビリンと IFNα−2b を併用した場合は，リバビ リン単独処理の場合と比較してリバビリンの濃度−吸光度曲線が低濃度側にシフトし，リバ ビリンの抗ウイルス作用の至適濃度が低下し，さらに，吸光度の最大値が増加した．一方， リバビリンが細胞増殖抑制作用を示す濃度領域の濃度−吸光度曲線が低濃度側にシフトする ことはなかった． 2 IFNα−2b 濃度 (IU/mL) 200 ■ ◆ 50 ● 10 ▲ 0 吸光度 1.5 1 0.5 0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 3 リバビリンと IFNα−2b を併用した場合の BVDV に対する作用 (試験 1) 各点は 2 例の平均値を示す． − 305 − 試験 2 の結果を図ホ − 4 に示した．濃度範囲を広げた場合でも，試験結果は試験 1 とほぼ 同様であった． なお，リバビリンと IFNα−2b を併用した場合の交互作用係数αは 3.17 (95%信頼区間 1.08−5.27) で，95%信頼区間は 0 を含まなかった．併用時の作用増強が相加的である場合， αは 0 となることから，リバビリンと IFNα−2b を併用した場合は抗ウイルス作用が相乗的 に増強することが示された (p<0.05)． IFNα−2b 濃度 (IU/mL) ■ 2000 ◆ 1000 ● 500 ▲ 250 × 125 + 62.5 ■ 31.3 ▲ 15.6 ◆ 7.5 ● 0 1.5 吸光度 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 4 リバビリンと IFNα−2b を併用した場合の BVDV に対する作用 (試験 2) 各点は 2 例の平均値を示す． − 306 − BVDV の RNA 量に及ぼす影響 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いて BVDV の RNA 量を測定することにより，リバビ リンの抗ウイルス作用を検討した． 方法 MDBK 細胞を 8×103 細胞/well で 96 well プレートに播種後，37℃にて一晩培養し，プ レートに付着させた．細胞を洗浄後，BVDV を感染させ，2 時間後にリバビリンを加えて 24 時間培養した．細胞を洗浄後，40μL の細胞溶解試薬を加え，70∼80℃で 10 分間イン キュベートした．定量的 RT−PCR 法 (Taqman アッセイ) を用いて，BVDV の RNA 量を測 定した．リバビリン非添加時の RNA 量に対する IC50 値を求めた． 成績 試験結果を図ホ − 5 に示した．リバビリンは BVDV の RNA 量を減少させ，その IC50 値 は 1.5μM (0.4μg/mL) であった．したがって，BVDV の RNA 量の推移からも，BVDV 感染 MDBK 細胞培養系におけるリバビリンの抗ウイルス作用が確認された． 120 100 BVDV RNA 量 (%) 4 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 5 BVDV の RNA 量に及ぼすリバビリンの 影響 各点はリバビリン非添加時の RNA 量に対する割合 (%) の平均値を示す (n=2)． − 307 − 2) 抗ウイルス作用のスペクトル リバビリンは 1972 年に報告されて以来，多くの研究者により抗ウイルス作用が研究されて おり，各種 RNA 及び DNA ウイルスに対して幅広い抗ウイルス作用スペクトルを有すること が報告されている3)．本項では，培養細胞を用いて，各種 RNA 及び DNA ウイルスに対する リバビリン及び IFNα−2b の作用を示した．また，サルを用いて，RNA ウイルス感染モデル におけるリバビリンの抗ウイルス作用について報告されていることから，その成績を参考とし て記載した． 1 In vitro 抗ウイルス作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 方法 細胞にウイルスを感染させ，同時に被験薬物を添加し，35℃にて培養した．MTT 法，プ ラック法または TCID 法を用いて，抗ウイルス作用を検討し，IC50 値を算出した．また， MTT 法，TCID 法または顕微鏡下での肉眼観察により，ウイルス非感染細胞における細胞増 殖を 50%抑制するのに必要な被験薬物濃度 (CC50 値) を求めた．対照薬には，IFNα−2b，デ キストラン硫酸 500000 (DS500000)，アシクロビル及びガンシクロビルを用いた． RNA ウイルスには，インフルエンザウイルス A 型 (FluV A)，パラインフルエンザウイル ス 2 型 (PfluV 2)，RS (respiratory syncytial) ウイルス (RSV)，麻疹ウイルス (MLSV) 及びム ンプスウイルス (MPSV) を用いた． DNA ウイルスには，単純ヘルペスウイルス 1 型 (HSV−1) 及びヒトサイトメガロウイルス (CMV) を用いた． 感染細胞には，ヒト悪性黒色腫細胞株 HMV−II 細胞，グルコース依存性ヒト子宮頸癌細 胞株 Gl−HeLa 細胞，アフリカミドリザル腎細胞株 Vero 細胞，ヒト B リンパ腫細胞株 RPMI8226 細胞，ヒト胎児線維芽細胞 (HEF) 及びヒト胎児肺細胞株 MRC−5 細胞を用いた． 成績 RNA ウイルスに対する作用を表ホ − 2 にまとめた．リバビリンは，試験に用いた全ての RNA ウイルスに対して抗ウイルス作用を示し，その IC50 値は 2.6∼83.6μg/mL (11∼342μM) であった．一方，IFNα−2b は MLSV 及び MPSV に対して抗ウイルス作用を示し，その IC50 値はそれぞれ 142.9 及び 94.5 IU/mL であった．DS500000 は RSV に対して抗ウイルス 作用を示し，その IC50 値は 0.31μg/mLであった． DNA ウイルスに対する作用を表ホ − 3 にまとめた．リバビリンは CMV に対して抗ウイ ルス作用を示し，その IC50 値は 65.1μg/mL (267μM) であったが，HSV−1 には作用を示さ なかった．IFNα−2b も CMV に対して抗ウイルス作用を示したが (IC50＝12.6 IU/mL)， リバビリンと同様，HSV−1 には作用を示さなかった．DS500000 及びアシクロビルは， HSV−1 に対して抗ウイルス作用を示し，その IC50 値は，DS500000 では 16.9μg/mL，ア − 308 − シクロビルでは 0.022 及び 0.028μg/mL であった．ガンシクロビルは CMV に対して抗ウイ ルス作用を示し，その IC50 値は 0.614μg/mL であった． 細胞増殖に対する作用を表ホ − 4 にまとめた．リバビリンは HMV−II 細胞及び RPMI 8226 細胞の増殖を抑制し，その CC50 値はそれぞれ 58.6μg/mL (240μM) 及び 28.6μg/mL (117μM) であった．IFNα−2b は RPMI8226 細胞の増殖を抑制し，その CC50 値は 76.0 IU/mL であった．DS500000，アシクロビル及びガンシクロビルはいずれも 100μg/mL ま での用量範囲で細胞増殖抑制作用を示さなかった． 表ホ − 2 リバビリンの RNA ウイルスに対する作用 IC50 値 細胞 試験法 培養 期間 (日) FluV A (Ishikawa 株) HMV−II MTT 5 09.9±0.7 PfluV 2 (Greer 株) HMV−II MTT 5 34.0±7.4 >100 − 15.0±1.2 a)>400 a) − ウイルス RSV (Long 株) リバビリン (μg/mL) IFNα−2b (IU/mL) DS500000 (μg/mL) >100 − Gl−HeLa MTT 5 83.6±1.3 >100 0.31 (n=2) MLSV (Edmonston 株) Vero プラック 3 14.3±8.3 142.9±48.3 a) − MPSV (EXCH−3 株) Vero プラック 4 02.6±0.5 94.5±5.5 a) − 各値は 3 例の平均値 ± S.E. を示す． a)：IFNα−2b を細胞と共に 1 日間前培養した後ウイルスを添加し，表に示した期間培養した． −：試験せず． − 309 − 表ホ − 3 リバビリンの DNA ウイルスに対する作用 ウイルス 細胞 試験法 培 養 期 間 ( 日) HSV−1 (KOS 株） RPMI8226 MTT 5 .>28.6 00>76.0 a) − 0.028 ± 0.001 − HEF TCID 5 >100 >100 IC50 値 リバビリン (μg/mL) IFNα−2b (IU/mL) DS500000 (μg/mL) アシクロビル (μg/mL) ガンシクロビ ル (μg/mL) >100 CMV (AD169 株) MRC−5 プラッ ク 10 65.1 (n=2) − 16.9 ± 3.3 0.022 (n=2) − 0 >400 a) − <0.16 − 00<12.5 a) − − 0.614 ± 0.205 − − − 12.6 ± 0.6 a) 各値は 3 例の平均値 ± S.E. を示す． a)：IFNα−2b を細胞と共に 1 日間前培養した後ウイルスを添加し，表に示した期間培養した． −：試験せず． 表ホ − 4 細胞 HMV−II リバビリンの各種細胞株に対する増殖抑制作用 CC50 値 試験法 培養 期間 ( 日) リバビリン (μg/mL) IFNα−2b (IU/mL) DS500000 (μg/mL) アシクロビル (μg/mL) ガンシクロビ ル (μg/mL) MTT 5 >100 >100 − − − >400 a) − − − 58.6±2.1 Gl−HeLa Vero >100 肉眼観察 3 4 RPMI8226 MTT HEF TCID MRC−5 肉眼観察 5 10 >100 >100 28.6±3.0 >100 − − >400 a) − − − >400 a) − − − >100 76.0±7.8 a) − >1 − >100 >10 − >400 a) − >100 − a) − − >100 >100 >100 >100 >100 >400 各値は 3 例の平均値 ± S.E. を示す． a)：培養期間は表に示した期間より 1 日長い． −：試験せず． − 310 − In vivo 抗ウイルス作用 HCV 以外の種々のウイルスによる感染動物モデルを用いて，リバビリンの抗ウイルス作 用を検討した結果がこれまでに多数報告されている4)−7)． サルを用いて，RNA ウイルスである FluV，ラッサ熱ウイルス，Junin ウイルス及びデン グ熱ウイルス感染モデルにおけるリバビリンの抗ウイルス作用について検討された成績を以 下に示す． i ) FluV に対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** Stephen らは，FluV をリスザルに吸入感染させた際の，インフルエンザ様症状に及ぼ すリバビリン (吸入投与) の影響について検討している． 方法 FluV A (Aichi/2/68 株) をリスザルに吸入感染させ (Day 0)，感染 6 時間後より約 13 mg/kg/日のリバビリンを 4 日間吸入させた．Day 1∼10 に 1 日 2 回，インフルエンザ様症 状 (くしゃみ/咳嗽または鼻漏) を観察した．各群 4 例の 1 日 2 回観察時の症状を合計した 1 日あたりの症状の出現数 (1 日の最大値は 8 ) から，毎日の発症率を求めた． 成績 試験結果を図ホ − 6 に示した．無処置対照群ではくしゃみまたは咳嗽が Day 1∼4 で全 例にみられ，Day 6 にはいずれの症状も消失した．リバビリン投与群では，くしゃみまた は咳嗽の症状の抑制が認められた．また，鼻汁の分泌を指標とした時，無処置対照群では Day 1∼7 で全例に鼻漏がみられたのに対し，リバビリン投与群では Day 10 までいずれの サルにも鼻漏症状は認められなかった． くしゃみ/咳嗽 鼻漏 100 100 80 80 発症率 (%) 発症率 (%) 2 60 40 20 ▲ ▲ 無処置対照群 ● ● リバビリン投与群 60 40 20 0 0 0 図ホ − 6 2 4 6 感染後経過日数 8 10 0 2 4 6 感染後経過日数 FluV 感染リスザルにおけるリバビリンの抗ウイルス作用 − 311 − 8 10 ii ) ラッサ熱ウイルスに対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** らは，ラッサ熱ウイルスをアカゲザルに皮下接種した際の，ウイルス血症及 Jahrling び生存率に及ぼすリバビリン (皮下投与) の影響について検討している． 方法 1.2×106 PFU のラッサ熱ウイルス (Josiah 株)をアカゲザルに皮下接種した (Day 0)． 感染日から感染 18 日目 (Day 0∼18 投与群)，または感染 5 日目から感染 18 日目 (Day 5∼ 18 投与群) まで，リバビリンを各初回投与日には 50 mg/kg を 1 日 1 回，その後 10 mg/kg を 1 日 3 回皮下投与した．血清中ウイルス量をプラック法により測定し，生存率を Day 24 の時点で評価した． 成績 試験結果を図ホ − 7 に示した．リバビリンの Day 0∼18 投与群では，血清中ウイルス の出現日が Day 7 まで遅れ，無処置対照群の生存例と比較して血清中ウイルス量の最大値 が低値を示した．Day 5∼18 投与群では，血清中ウイルス量は無処置対照群の死亡例のよ うに増加せず，104 PFU/mL を超えなかった． また，無処置対照群の生存率が 40% (10 例中 4 例生存）であったのに対し，リバビリン の各投与群では，いずれも 100% の生存率を示した． 血清中ウイルス量 (log10 PFU/mL) 6.0 無処置対照群 (死亡例, 6 例) 5.0 4.0 リバビリン Day 5∼18 投与群 3.0 無処置対照群 (生存例, 4 例) 2.0 1.0 <0.6 リバビリン Day 0∼18 投与群 0 5 10 15 20 25 感染後経過日数 図ホ − 7 リバビリン投与によるラッサ熱ウイルス感染アカゲザルの血清中ウイルス量の推移 各点は幾何平均値 ± S.E. を示す (リバビリン各投与群 n=4，無処置対照群 n=10)． − 312 − iii ) Junin ウイルスに対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** McKee らは，アルゼンチン出血熱の原因ウイルスである Junin ウイルスをアカゲザル に筋肉内接種した際の，生存率に及ぼすリバビリン (筋肉内投与) の影響について検討して いる． 方法 1.9×104 PFU の Junin ウイルス (P3790 株) を 1 群 4 匹のアカゲザルに筋肉内接種した (Day 0)．予防投与群では，感染 30 分後より Day 0∼3 に 60 mg/kg/日，Day 4∼7 に 30 mg/kg/日，Day 8∼17 に 15 mg/kg/日のリバビリンを 1 日 2 回に分けて筋肉内投与した． 治療投与群では，Day 6 に 60 mg/kg/日，Day 7∼20 に 15 mg/kg/日のリバビリンを 1 日 2 回に分けて筋肉内投与した．感染 9 週後まで死亡の有無を観察した． 成績 試験結果を表ホ − 5 に示した．溶媒対照群では Day 26 に全例死亡したのに対し，リバ ビリンの予防投与群では感染後 9 週目でも全例生存していた．治療投与群では Day 8， Day 36 及び Day 43 に各 1 例ずつ死亡した． 表ホ − 5 処 置 Junin ウイルス感染アカゲザルにおけるリバビリン投与の効果 投与スケジュール (1 日 2 回筋肉内投与) 生存例/処置例 死亡日 (Day) 0/4 21, 24, 25, 26 溶媒 Day 0∼27 リバビリン予防投与 Day 0∼3 に 60 mg/kg/日; Day 4∼7 に 30 mg/kg/日; Day 8∼17 に 15 mg/kg/日 4/4a) − リバビリン治療投与 Day 6 に 60 mg/kg/日; Day 7∼20 に 15 mg/kg/日 1/4b) 8, 36, 43c) a)：溶媒対照群に比して有意差あり (p=0.03; Fisher の正確検定，両側)． b)：溶媒対照群に比して有意差なし (p=0.99; Fisher の正確検定，両側)． c)：溶媒対照群に比して有意差なし (p>0.05; Mann−Whitney U 検定)． − 313 − iv ) デング熱ウイルスに対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** Malinoski らは，デング熱ウイルス (フラビウイルス科) をアカゲザルに筋肉内接種した 際の，ウイルス血症，肝機能，発熱等に及ぼすリバビリン (筋肉内投与) の影響について 検討している． 方法 2×105 PFU のデング熱ウイルス 1 型 (Western Pacific 74 株) を 1 群 10 匹のアカゲザル に筋肉内接種した (Day 0)．無作為化盲検法により Day −1 に 50 mg/kg のリバビリンまた は溶媒を単回筋肉内投与し，その後 Day 0∼9 に 1 日 3 回，10 mg/kg のリバビリンまたは 溶媒を筋肉内投与した．血清中ウイルス量を Day 1∼14 に 1 日 1 回，プラック法により 測定した．血清 AST (アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ) 及び ALT (アラニンア ミノトランスフェラーゼ) 値を Day −1，6，14 及び 28 に測定し，症状観察を Day −1∼ 14 に 1 日 2 回実施した． 成績 局所リンパ節の腫脹及び 39.5 ℃を超える直腸温の上昇が，溶媒対照群では 10 例中 8 例 に，リバビリン投与群では 10 例中 7 例にみられた．血清中ウイルス量，血清 AST 及び ALT 値のいずれにおいても溶媒対照群とリバビリン投与群間に有意差はみられなかった． − 314 − 3) 抗ウイルス作用のまとめ及び考察 HCV の近縁ウイルスである BVDV を用いてリバビリンの抗ウイルス作用を検討するととも に，他の RNA 及び DNA ウイルスに対する作用スペクトルを検討した．その結果，リバビリ ンは BVDV に対して単独で抗ウイルス作用を示し，IFNα−2b と併用した場合には相乗的に 作用が増強した．また，リバビリンは，in vitro において FluV 等の RNA ウイルスに対して作 用を示すとともに，DNA ウイルスの一つである CMV に対して作用を示し，サルを用いた実 験感染モデルにおいて，FluV 等の一部の RNA ウイルスによる感染を抑制することが確認さ れた． BVDV 感染 MDBK 細胞培養系では，リバビリン単独処理時の BVDV に対する IC50 値は 3μM (0.7μg/mL) であった．海外の C 型慢性肝炎患者を対象としたリバビリン (600 mg, 1 日 2 回) の 6 週間反復投与試験では，リバビリン最終投与時の最高血漿中濃度は 15μM (3.68μg/mL) で あり (本資料概要 439 頁，表ヘ − 25 参照)，細胞培養系での IC50 値の約 5 倍高濃度であっ た． なお，BVDV 感染 MDBK 細胞培養系では，IFNα−2b 単独処理時の BVDV に対する IC50 値 は 30 IU/mL であった．癌患者に IFNα−2b の 6×107 及び 1×108 IU を単回筋肉内投与した 時の最高血清中濃度は，それぞれ 1.22×103 及び 3.13×103 IU/mL であり8)，細胞培養系での IC50 値と比較すると，それぞれ約 40 及び 100 倍高濃度であった． − 315 − (2) 作用機序 抗ウイルス剤の作用を再現性よく評価できる HCV 感染細胞培養系が確立されていないことか ら，リバビリンの HCV に対する作用機序は十分に解明されていない．しかし，各種ウイルスに よる感染系を用いたこれまでの検討から，プリン生合成の律速酵素の一つであるイノシン一リン 酸脱水素酵素 (IMPDH) を阻害することにより細胞内のグアノシン三リン酸 (GTP) の量を減少さ せ，間接的にウイルスの RNA の複製を抑制するという機序9)，及びウイルスの RdRp を直接阻 害することによりウイルスの RNA の複製を抑制するという機序10)が提唱されている． こうしたことから，細胞内におけるリバビリンのリン酸化について確認した後，BVDV 及び HCV 由来 RdRp 等を用いて上記の作用機序を検証するとともに，ウイルス RNA の合成に対する 作用を検討した．あわせて，HCV 由来 IRES (internal ribosome entry site) 依存性翻訳調節及び NS3 プロテアーゼ活性に及ぼす影響を検討した．なお，HCV と同じ一本鎖 RNA ウイルスであ るポリオウイルスを用いてリバビリンのゲノム RNA 突然変異誘発能を検討した試験成績が最近 報告されたことから，参考として記載し，HCV に対するリバビリンの作用機序を考察した． HCV のゲノムは約 9500 塩基からなるプラス鎖の一本鎖 RNA である．この RNA が mRNA として働い た結果，約 3000 アミノ酸からなる一本の前駆体蛋白質が翻訳され，この前駆体蛋白質から宿主あるいは HCV のプロテアーゼにより構造蛋白質や RdRp，プロテアーゼ等の非構造蛋白質が切断される．RdRp に よりゲノムの RNA を鋳型としてマイナス鎖が複製され，このマイナス鎖より，多量のプラス鎖が合成さ れ，mRNA 及びゲノム RNA として働くと考えられている． 5’ の非翻訳領域にはリボソームが直接結合して翻訳を開始する IRES が存在する．非構造蛋白質領域の NS3 にはセリンプロテアーゼとヘリカーゼ，NS5B には RdRp の活性が認められる． 非翻訳領域 5’ 構造蛋白質領域 C E1 IRES E2/ NS1 ↑ 翻訳開始 非翻訳領域 非構造蛋白質領域 NS2 NS3 NS4A NS4B ↑ プロテアーゼ/ ヘリカーゼ活性 NS5A NS5B ↑ RdRp 活性 HCV の遺伝子の構造 C：コア蛋白質領域 E：エンベロープ蛋白質領域 − 316 − NS：非構造蛋白質領域 3’ 1) 細胞内におけるリバビリンのリン酸化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** ヒト肝細胞癌細胞株 HepG2 細胞を用いて，細胞内でのリバビリンの各リン酸化体の量を経 時的に測定した． 方法 HepG2 細胞 (5×106 細胞) を 37℃にて一晩培養した後，41μM (10μg/mL) のリバビリンを 含む培地に交換し，2，4 及び 8 時間後に細胞を回収した．低張リン酸緩衝液にて細胞を破壊し た後，各リン酸化体の量を HPLC にて測定した． 成績 試験結果を表ホ − 6 に示した．リバビリンは HepG2 細胞内に取り込まれた後，リバビリン 一リン酸 (RMP)，リバビリン二リン酸 (RDP) 及びリバビリン三リン酸 (RTP) に代謝された． 表ホ − 6 HepG2 細胞内のリバビリンのリン酸化体量 リバビリン 添加後時間 (時間) RMP (pmol/106 細胞) RDP (pmol/106 細胞) RTP (pmol/106 細胞) 2 12 10 170 4 10 13 200 8 09 16 200 各値は 2 例の平均値を示す． 表に示すいずれの時間においても，未変化体 (リバビリン) は検出されなかった． − 317 − 2) IMPDH に対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** リバビリンとグアノシンの立体構造が類似していることから11)，RMP はグアノシン一リン 酸 (GMP) と同様に IMPDH を阻害すると報告されている9)．このため，リバビリンは IMPDH 阻害作用により細胞内の GTP 量を減少させ，ウイルスの RNA 複製を抑制すると考えられて きた．このようなことから，今回，リバビリンは細胞内の GTP 量を減少させるか否か，リバ ビリンの抗ウイルス作用には IMPDH 阻害作用が関与しているか否かを検討した． リボースリン酸 IMPDH は GMP の de novo 合成の律速 酵素であり，細胞内の GMP 量によりア NAD++H2O IMP NADH +H+ IMPDH ⊖ ロステリック阻害を受けている． アデニロ コハク酸 シンターゼ アデニロコハク酸 XMP IMP : イノシン一リン酸 GMP IMPDH : IMP 脱水素酵素 AMP XMP : キサントシン一リン酸 GDP ADP GMP : グアノシン一リン酸 AMP : アデノシン一リン酸 GDP : グアノシン二リン酸 ADP : アデノシン二リン酸 GTP : グアノシン三リン酸 ATP : アデノシン三リン酸 NAD+ : 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド GTP 1 NADH : 還元型 NAD ATP 細胞内 GTP 量に及ぼす影響 方法 HepG2 細胞 (5×106 細胞) を 37℃にて一晩培養した後，41μM (10μg/mL) のリバビリンを 含む培地に交換し，2，4 及び 8 時間後に細胞を回収した．低張リン酸緩衝液にて細胞を破壊 した後，GTP 量を HPLC にて測定し，各時間における細胞内 GTP 量の減少率を求めた． 成績 試験結果を表ホ − 7 に示した．リバビリン添加後 2，4 及び 8 時間の細胞内 GTP 量の減 少率はそれぞれ 31，63 及び 58%であり，リバビリン添加によって細胞内 GTP 量は減少す ることが示された． 表ホ − 7 リバビリン添加後の HepG2 細胞内の GTP 量の減少率 GTP 量 (pmol/106 細胞) リバビリン 添加後時間 (時間) 溶媒 リバビリン 減少率 (%) 2 5500 3800 31 4 5900 2200 63 8 4000 1700 58 各値は 2 例の平均値を示す． − 318 − 2 IMPDH 阻害作用 リバビリンの一リン酸化体である RMP が IMPDH 阻害作用を有するか否かを検討した． 対照薬には，ミコフェノール酸 (MPA) 及びイノシン一リン酸 (IMP) を用いた．MPA は IMPDH に対する選択的かつ可逆的な非競合性の阻害薬である．あわせて，RMP，MPA 及 び IMP が抗ウイルス作用を有するか否かを検討した． 次に，基質としてグアノシンを培養系に添加することにより細胞内 GTP 量の減少を抑制 した場合にリバビリンの抗ウイルス作用が消失するか否かを検討した． i ) 酵素阻害作用 方法 基質である IMP，酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD+) 及び被験薬 物を含む反応溶液に IMPDH (0.2∼0.4μM) を加え，37℃にてインキュベートした．還元 型 NAD (NADH) の生成量 (ε340 = 6200 M−1cm−1) を 340 nm の吸光度で測定し，比活性 (μmol/min/mg) を求め，Ki 値を算出した． また，BVDV 感染 MDBK 細胞培養系 (本資料概要 302 頁参照) を用いて，RMP，MPA 及び IMP の抗ウイルス作用を検討し，IC50 値を算出した． 成績 試験結果を表ホ − 8 に示した．RMP は IMPDH 阻害作用を示し，その Ki 値は 0.5μM (リバビリン換算濃度：0.1μg/mL) であった．また，RMP は抗ウイルス作用も示し，その IC50 値は 3μM (リバビリン換算濃度：0.7μg/mL) であった．一方，MPA は IMPDH 阻害 作用を示したが (Ki = 10 nM)，抗ウイルス作用は弱かった． 表ホ − 8 IMPDH 阻害作用及び BVDV に対する抗ウイルス作用 薬物 IMPDH 阻害作用 (Ki 値) 抗ウイルス作用 (IC50 値) RMP 0.5μM (リバビリン換算濃度：0.1μg/mL) 3μM (リバビリン換算濃度：0.7μg/mL) MPA 10 nM Less active IMP 10μM >0.5μM 試験を n=2 で実施した． Less active：MPA の 16∼62 nM (0.5∼2μg/mL) で弱い抗ウイルス作用を示したが，細胞増殖抑制作用も 同時にみられたため，IC50 値を算出できなかった． − 319 − ii ) 抗ウイルス作用に及ぼすグアノシン添加の影響 方法 リバビリンの抗ウイルス作用に及ぼすグアノシン添加の影響を検討するために，20また は 40μM のグアノシンをリバビリンと同時に添加し，BVDV 感染 MDBK 細胞培養系 ( 本資料概要 302 頁参照) で試験を実施した． 成績 試験結果を図ホ − 8 に示した．グアノシンの添加により，リバビリンの濃度−吸光度曲 線が高濃度側にシフトしたが，リバビリンによる吸光度の上昇は低下しなかった． 結論 IMPDH 阻害作用を有する MPA が弱い抗ウイルス作用しか示さなかったこと，及びグ アノシンを添加してもリバビリンの BVDV に対する抗ウイルス作用は減弱するものの， 消失しなかったことは，リバビリンの抗ウイルス作用の作用機序を IMPDH 阻害による細 胞内 GTP 量の減少だけでは説明できないことを示している． リバビリン + グアノシン (20μM) 1.75 吸光度 1.5 1.25 リバビリン 1 0.75 リバビリン + グアノシン (40μM) 0.5 0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 12.5 25 50 100 200 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 8 リバビリンの BVDV に対する抗ウイルス作用に及ぼすグアノシン添加の影響 各点は 2 例の平均値を示す． − 320 − 3) HCV 及び BVDV 由来 RdRp に対する作用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 1 RNA への GTP の取込みに対する RTP の抑制作用 (HCV 由来 RdRp を用いた場合) リバビリンはグアノシンと立体構造が類似していることから，RTP が RNA への GTP の 取込みを抑制するか否かを検討した． 方法 試験には，C 型慢性肝炎患者血清から RT−PCR 法を用いて単離した cDNA より調製した 6 種 類の遺伝子型 (genotype) RdRp を用いた．HCV 由来 RdRp (50 nM)，ポリ C 鋳型 (250 ng)，オリゴ G (12−mer) ビオチン化プライマー (25 ng) 及び種々の濃度の RTP からなる反応溶液に 3H−GTP 及び非標識 GTP (5μM) を添加し (全量 50μL)，室温にて 3 時間インキュベートした．EDTA を 添加することにより反応を停止させ，ストレプトアビジン標識フルオロミクロスフェアビーズを加 え，ビオチン化 RNA をビーズに捕獲した．ビーズをグラスファイバーフィルター上に濾取し，洗 浄後，3H 由来放射線によるビーズ内のシンチラントの発光をシンチレーションカウンターにより 測定し，3H−GTP の RNA への取込み量を測定した．測定結果から RTP 非添加時に対する抑制率 を求めて IC50 値を算出した．図には RTP をリバビリンに換算した濃度を示した． 成績 試験結果を図ホ − 9 に示した．いずれの RdRp の場合でも RTP は RNA への GTP の取込みを 抑制したが，genotype 1b に対する取込み抑制作用はやや弱く，その IC50 値は 143 及び 152μM (リバビリン換算濃度：35 及び 37μg/mL) であり，その他の genotype の IC50 値は 49∼111μM (リバビリン換算濃度：12∼27μg/mL) であった． 100 IC50 値 □ ◇ ◆ ○ ● ╋ ▲ × ■ 抑制率 (%) 75 □ ◆ ◇ □ 0 ● 0 ■ ● ▲ ◇ ■ ＋ ■ ╋ × ● × ■ × ▲ ○◇ ▲○ ▲ ╋ ●◇ ○ ╋ ■ ◆ ■◆ ◆ ■ ● ×◆ ◆ □ ◆ ▲ × ● □ □ 25 ● ▲ ╋ ○ × □ 50 genotype × ○ 1a 1b 2a 2b 2c 3a 4a 5a 6a 10 20 30 40 50 (μg/mL) 41 82 123 164 205 (μM) 実験 1 実験 2 (μg/mL) (μM) (μg/mL) (μM) 17 35 21 22 12 20 22 24 23 70 143 86 90 49 82 90 98 94 16 37 17 24 16 17 23 27 22 66 152 70 98 66 70 94 111 90 リバビリン換算濃度 図ホ − 9 RNA への GTP の 取込みに対する RTP の抑制作用 (各種 genotype の HCV 由来 RdRp) 各点は 3 例の平均値を示す． 図は実験 1 の結果を示す． − 321 − RNA への GTP の取込みに対する RTP の抑制作用 (BVDV 由来 RdRp を用いた場合) 方法 1 に記載した方法で，BVDV 由来 RdRp (50 nM) を用いて試験を実施した． 成績 試験結果を図ホ − 10 に示した．RTP は，BVDV 由来 RdRp による RNA への GTP の取 込みを抑制し，その IC50 値は 49μM (リバビリン換算濃度：12μg/mL) であった． 100 75 抑制率 (%) 2 50 25 ● 実験 1 ▲ 実験 2 0 0 50 205 100 410 150 614 200 819 (μg/mL) (μM) リバビリン換算濃度 図ホ − 10 RNA への GTP の取込みに対する RTP の抑制作用 (BVDV 由来 RdRp) 各点は 3 例の平均値を示す． − 322 − 3 HCV 由来 RdRp による RTP の RNA への取込み HCV 由来 RdRp により RTP が RNA に誤って取り込まれる可能性を検討した． 方法 RNA の鋳型として U7CC または G7CC を，プライマーとして 33P 標識したジヌクレオチ ド (GG*) を用いた．HCV 由来 RdRp (50 nM) を含む反応液に，非標識アデノシン三リン酸 (ATP，100μM)，シチジン三リン酸 (CTP，100μM) または RTP (400μM, リバビリン換算 濃度：98μg/mL) 及び鋳型/プライマー (0.4μg) を添加し (全量 40μL)，30℃にて 1 時間イン キュベートした．酢酸アンモニウムを添加することにより反応を停止させ，RNA を単離後， 15%ポリアクリルアミド/尿素ゲルを用いて電気泳動し，オートラジオグラフィーを行った． 成績 試験結果を図ホ − 11 に示した．鋳型にウリジンを用いた場合は，RTP は RNA に誤って 取り込まれた．しかし，鋳型がグアノシンの場合は取り込まれなかった．このことから， RTP は HCV 由来 RdRp によりヌクレオチド基質として認識され，RNA に誤って取り込ま れることが示された． GG* 鋳型/プライマー： 非標識ヌクレオチド： GG* UUUUUUUCC − ATP GGGGGGGCC RTP − CTP RTP P+2 P+1 P レーン： 図ホ − 11 1 2 3 4 5 6 HCV 由来 RdRp による RTP の RNA への取込み P：プライマーのみ P+1：プライマー+ヌクレオチド 1 分子 P+2：プライマー+ヌクレオチド 2 分子 レーン 1：下から，鋳型/プライマー，鋳型/プライマーの夾雑物 (未知) レーン 2：下から，鋳型/プライマー，鋳型/プライマー＋AMP 1 分子，鋳型/プライマーの夾雑物 (未知)， 鋳型/プライマー＋AMP 2 分子 レーン 3：下から，鋳型/プライマー，鋳型/プライマー＋RMP 1 分子，鋳型/プライマーの夾雑物 (未知) レーン 4：下から，鋳型/プライマー，鋳型/プライマーの夾雑物 (未知) レーン 5：下から，鋳型/プライマーよりヌクレオチド 1 分子が外れたと考えられる分解物 (未知)， 鋳型/プライマー，鋳型/プライマー＋CMP 1 分子，鋳型/プライマーの夾雑物 (未知)， 鋳型/プライマー＋CMP 2 分子 レーン 6：下から，鋳型/プライマー，鋳型/プライマーの夾雑物 (未知) − 323 − 4) HCV 由来 IRES 依存性翻訳調節に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** HCV では，mRNA の翻訳開始時にリボソームが mRNA の 5’ 末端にあるキャップ構造以 外に，IRES に結合することが知られている12),13)． このため，2 種類のレポーター遺伝子を有するプラスミドを用いて，IRES 依存性の翻訳 調節に及ぼすリバビリン及び RTP の影響を検討した．使用したプラスミドには，コント ロールとしてキャップ構造依存性の翻訳活性をモニターするための上流レポーター遺伝子で あるウミシイタケルシフェラーゼ (RL) と，そのすぐ下流に HCV の非コード蛋白質領域及び HCV コア蛋白質領域の一部 (IRES エレメントを含む 1−763 ヌクレオチド) にキャップ構造 非依存性 (IRES 依存性) の翻訳活性をモニターするためのレポーター遺伝子であるホタルル シフェラーゼ (FL) を融合させた領域が組み込まれている．細胞培養系及び無細胞系で試験 を実施した． 1 細胞培養系を用いた検討 方法 T7 RNA ポリメラーゼを発現し，上記プラスミド DNA を導入した Huh−T7 細胞 (1.2× 104 細胞/well) に，リバビリンまたは RTP を加え，37℃にて 18 時間培養した．細胞溶解試 薬により細胞を破壊し，ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え，ルミノメーターにて RL 及び FL による各々の蛍光を測定した．RL 及び FL による相対蛍光強度はそれぞれキャップ構造 依存性及び IRES 依存性の蛋白質合成量を示す． 成績 試験結果を図ホ − 12 に示した．Huh−T7 細胞培養系では，リバビリン及び RTP は HCV の IRES 依存性の蛋白質合成を抑制しなかった． IRES 依存性 1×107 1×106 キャップ構造依存性 1×105 1×104 1×103 1×107 1×106 1×105 キャップ構造依存性 1×104 1×103 0 40 (μg/mL) 1 2 3 5 10 20 4 8 12 20 41 82 164 (μM) リバビリン濃度 図ホ − 12 IRES 依存性 1×108 相対蛍光強度 相対蛍光強度 1×108 0 1 2 3 5 10 20 40 (μg/mL) 2 4 6 10 21 41 83 RTP 濃度 リバビリン及び RTP の IRES 依存性翻訳調節に及ぼす影響 (Huh−T7 細胞培養系) 各点は 2 例の平均値を示す． − 324 − (μM) 2 無細胞系を用いた検討 方法 先に記載したプラスミド DNA (0.1μg)，T7 RNA ポリメラーゼ，ヌクレオシド三リン 酸，アミノ酸混合液，ウサギ網状赤血球抽出液 (35μL) 及びリボヌクレアーゼ阻害剤を含む 反応溶液にリバビリンまたは RTP を添加し (全量 50μL)，30℃にて 90 分間インキュベート した．ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え，ルミノメーターにて RL 及び FL による各々の 蛍光を測定した．RL 及び FL による相対蛍光強度はそれぞれキャップ構造依存性及び IRES 依存性の蛋白質合成量を示す． 成績 試験結果を図ホ − 13 に示した．無細胞系でも，リバビリン及び RTP は HCV の IRES 依 存性の蛋白質合成を抑制しなかった． 1×108 キャップ構造依存性 1×107 1×106 IRES 依存性 1×105 1×104 相対蛍光強度 相対蛍光強度 1×108 1×106 IRES 依存性 1×105 1×104 1×103 1×103 0 40 (μg/mL) 1 2 3 5 10 20 4 8 12 20 41 82 164 (μM) リバビリン濃度 図ホ − 13 キャップ構造依存性 1×107 0 1 2 3 5 10 20 40 (μg/mL) 2 4 6 10 21 41 83 RTP 濃度 リバビリン及び RTP の IRES 依存性翻訳調節に及ぼす影響 (無細胞系) 各点は 2 例の平均値を示す． − 325 − (μM) 5) HCV 由来 NS3 プロテアーゼ活性に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** HCV 由来 NS3 プロテアーゼ活性に及ぼすリバビリン及びリン酸化体 (RMP, RDP, RTP) の 影響を検討した． 方法 HCV の NS5A/5B 切断部位を有し，N 末端をビオチン化，C 末端を 3H 標識した合成ペプチ ドを用いて，NS3 プロテアーゼ活性を測定した．被験薬物と NS3 蛋白質 (8 nM) を 4℃にて 1 時間プレインキュベートした後，基質である合成ペプチド (5μM) を加え，室温にて 1 時間イ ンキュベートした．ストレプトアビジン標識フルオロミクロスフェアビーズを添加し，ぺプチ ドをビーズに捕獲した．ビーズをグラスファイバーフィルター上に濾取し，洗浄後，酵素によ り切断されなかった C 末端の 3H 由来放射線によるビーズ内のシンチラントの発光をシンチ レーションカウンターにより測定した．測定した合成ペプチドの切断率から，被験薬物非添加 群に対する被験薬物添加群の合成ペプチド切断の抑制率を求めた． 成績 試験結果を図ホ − 14 に示した．リバビリン及びリン酸化体を添加しても合成ペプチド切断 の抑制率に変化はなく，リバビリン及びリン酸化体は HCV 由来 NS3 プロテアーゼ活性を抑制 しないことが示された． 100 100 A プレインキュベーション (有) 80 B プレインキュベーション (無) ■ 80 抑制率 (%) 抑制率 (%) ◆ 60 40 20 0 0 0.13 0.26 0.52 1.04 0.078 0.156 0.313 0.625 薬物濃度 (μM) 図ホ − 14 ▲ 40 20 0.065 ● 60 リバビリン RMP RDP RTP 1.3 2.5 5 薬物濃度 (μM) HCV 由来 NS3 プロテアーゼ活性に対するリバビリン及びリン酸化体の抑制率 各点は 3 例の平均値を示す． A 及び B の被験薬物非添加群における合成ペプチドの切断率は，それぞれ 25.5 及び 27.3%であっ た． − 326 − 10 6) ポリオウイルスを用いた作用機序の検討 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** HCV と同じ一本鎖 RNA ウイルスであるポリオウイルスを用いてリバビリンの作用機序を検 討した試験結果が報告されたことから，参考として以下に記載した． 1 ポリオウイルス由来 RdRp による RTP の RNA への取込み ポリオウイルス由来 RdRp により RTP が RNA に誤って取り込まれるか否か，RNA に取 り込まれた RTP により以後の RNA の伸長が抑制されるか否か，の 2 点を検討した． 方法 RNA の鋳型及びプライマーに用いた 32P 標識オリゴヌクレオチドを図ホ − 15 及び図 ホ − 16 の上段に示した．鋳型/プライマー，ポリオウイルス由来 RdRp，RTP またはウリジ ン三リン酸 (UTP) を反応溶液に加え，0∼600 秒間インキュベートした後，EDTA を添加す ることにより反応を停止させた．ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動後，オートラジ オグラフィーを行った． 成績 RdRp による RTP の RNA への取込みを図ホ − 15 に示した．鋳型中の対応する塩基がシ トシン (S+1) またはウラシル (S+2) のいずれでも，RTP は RNA に取り込まれた．この結果 から，HCV 及び BVDV 由来 RdRp と同様，ポリオウイルス由来 RdRp によってもヌクレオ チド基質として認識され，また，RTP の取込みが新生 RNA の伸長を抑制しないことが示さ れた． 取り込まれた RTP によりヌクレオチドの取込みが抑制されるか否か検討した結果を図 ホ − 16 に示した．RTP 存在下では，RTP が取り込まれた 11 ヌクレオチド産物 (S+1) が認 められた (図ホ − 16 A)．RTP 及び UTP の両者の存在下では，11 ヌクレオチド産物の蓄積 はみられず，RTP 及び UTP が取り込まれた 12 ヌクレオチド産物 (S+2) が，さらに RTP が 誤って取り込まれた 13 ヌクレオチド産物 (S+3) が認められた (図ホ − 16 B)．この結果か らも，RNA に取り込まれた RTP はそれ以後の RNA 鎖の伸長を抑制しないことが示され た． − 327 − 鋳型/プライマー：32P−5’−GAUCGGGCCC−3’ 3’−CCCGGGCUAG−5’−32P 0 600 ( 秒) S+2 S+1 S 図ホ − 15 ポリオウイルス由来 RdRp によるRTP の RNA への取込み S：鋳型/プライマー S+1：S＋RTP 1 分子 S+2：S＋RTP 2 分子 鋳型/プライマー：32P−5’−GCAUGGGCCC−3’ 3’−CCCGGGUACG−5’−32P A B RTP (1 mM) 0 600 ( 秒) RTP (1 mM)+UTP (10μM) 0 S+3 S+2 S+1 S 図ホ − 16 RNA に取り込まれた RTP による RNA 鎖の伸長 S：鋳型/プライマー S+1：S＋ヌクレオチド 1 分子 S+2：S＋ヌクレオチド 2 分子 S+3：S＋ヌクレオチド 3 分子 − 328 − 600 ( 秒) S+3 S+2 S+1 S 2 ポリオウイルス由来 RdRp による RTP の RNA への取込みの反応速度解析 前項 1 (図ホ − 15 参照) に記載したように，鋳型中の対応する塩基がシトシンまたはウラ シルのいずれでも，RTP はポリオウイルス由来 RdRp によって RNA に取り込まれたという 結果及び図ホ − 17 に示した分子モデルから，RTP はシチジン及びウリジンと塩基対を形 成する可能性が考えられるため，シチジンまたはウリジンを含む鋳型を用いて，RTP の RNA への取込みにおける反応速度を解析した．あわせて，誤って取り込まれた RTP が鋳型 として機能するか否かを検討した． 方法 RNA の鋳型/プライマーとして，表ホ − 9 に示す 32P 標識オリゴヌクレオチドを用いた． 鋳型/プライマー，ポリオウイルス由来 RdRp 及び種々の濃度のヌクレオチドを反応溶液に 加えてインキュベートした後，EDTA を添加することにより反応を停止させた．ポリアク リルアミドゲルを用いて電気泳動後，オートラジオグラフィーを行い，ホスホイメージング により 32P 標識 RNA 量を測定した．RNA に取り込まれたヌクレオチド量から，ヌクレオチ ドの見かけの解離定数 (Kd) 及び RNA への最大取込み速度 (kpol) を算出した． 成績 試験結果を表ホ − 9 に示した．シチジンを鋳型として含む sym/sub−C を用いて RTP の取込 み効率を検討した場合の Kd 及び kpol は，それぞれ 430μM (リバビリン換算濃度：105μg/mL) 及び 0.019 /s であった．ウリジンを鋳型として含む sym/sub−U を用いて RTP の取込み効率 を検討した場合の Kd 及び kpol は，それぞれ 496μM (リバビリン換算濃度：121μg/mL) 及 び 0.014 /s で，sym/sub−C を用いた場合の値と類似していた．一方，リバビリンを鋳型と して含む sym/sub−R を用いて CTP 及び UTP の取込み効率を検討した場合は，CTP 及び UTP のいずれも RNA に取り込まれ，その時の kpol はそれぞれ 8.5 及び 7.6 /s と，RTP がシ チジンまたはウリジンを鋳型にして取込まれる時の速度の約 500 倍速いものであった． 以上から，RTP はシチジンまたはウリジンを鋳型に用いた時に同程度の効率で RNA に取り 込まれること，また，誤って取り込まれた RTP が引続き RNA 合成の鋳型として利用される ことが示され，RTP が変異原となりウイルスの点突然変異を誘発する可能性が示唆された． なお，核磁気共鳴の結果から，リバビリンは主にシンコンフォメーションをとっているこ とが示されている14)．また，図ホ − 17 に示したように，RTP がアンチコンフォメーション をとっている場合は，シチジンとウリジンに対して容易に水素結合を形成する．CTP また は UTP が取込まれる速度は RTP が取込まれる速度よりも約 500 倍速かったことから， RTP が RNA に取り込まれた後は，主にアンチコンフォメーションをとることでピリミジン 塩基と容易に塩基対を形成するようになるものと考えられた． − 329 − 3.2 Å 2.8 Å RTP (アンチコンフォメーション) シチジン ウリジン RTP (アンチコンフォメーション) 4.2 Å シチジン RTP (シンコンフォメーション) 図ホ − 17 表ホ − 9 RTP の分子モデル ポリオウイルス由来 RdRp に対するヌクレオチドの見かけの 解離定数及び RNA への最大取込み速度 鋳型/プライマー Sym/sub−C： *GAUCGGGCCC GAUCGGGCCC *GAUCCCCGGGCUAG* Sym/sub−U： *GCAUGGGCCC GCAUGGGCCC *GCAUCCCGGGUACG* ヌクレオチド 見かけの解離定数 Kd (μM) 最大取込み速度 RTP .430 430 ± 79. 79 0 019 ± 0.002 0.019 0 002 GTP 03 8 ± 0.7 03.8 07 56 7 ± 2.80 56.7 2 80 RTP .496 496 ± 21. 21 0 014 ± 0.001 0.014 0 001 GTP .310 310 ± 30. 30 0 013 ± 0.001 0.013 0 001 CTP 19 2 ± 3.2 19.2 32 157 ± 800 CTP .493 493 ± 41. 41 8 5 ± 0.3 8.5 03 UTP ..551 551 ± 127 7 6 ± 0.6 7.6 06 kpol (/s) Sym/sub−G： *CAUGCCCGGG CAUGCCCGGG *CAUGGGGCCCGUAC* Sym/sub−R： *CAURCCCGGG CAURCCCGGG *CAURGGGCCCRUAC* Sym/sub：symmetrical primer/template substrate − 330 − ポリオウイルス RNA の翻訳及び複製に対する作用 レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだポリオウイルス RNA を用い て，RNA の翻訳及び複製に対するリバビリンの作用を検討した．あわせて，ポリオウイル スを感染させた細胞から RNA を単離し，直接ウイルス RNA の複製に対する作用を検討し た． i ) 翻訳に対する作用 方法 試験には，ポリオウイルスのキャプシドをコードする領域をルシフェラーゼ遺伝子で置換 したレプリコン (PolioLuc) RNA を用いた． 種々の濃度のリバビリン及び 2μg/mL のブレフェルジン A 存在下で，ヒト子宮頸癌細 胞株 HeLa S3 細胞に PolioLuc RNA を導入した (ブレフェルジン A はポリオウイルス RNA の複製を抑制するが，翻訳過程に影響しない)．PolioLuc RNA の導入によりルシフェラー ゼを含むポリペプチドが翻訳されると，ウイルスのプロテアーゼによる切断を受けて活性 のあるルシフェラーゼが遊離されるため，導入の 2 時間後にルシフェラーゼ活性を測定す ることで，リバビリンの作用を評価した． 成績 試験結果を図ホ − 18 に示した．ブレフェルジン A で処理することにより RNA の複製 を抑制した条件下で，PolioLuc RNA からのルシフェラーゼ合成に及ぼすリバビリンの影 響を検討したところ，リバビリンは 100∼1000μM の濃度範囲では PolioLuc RNA の翻訳 をほとんど抑制しなかった． 1×105 ルシフェラーゼ活性 (相対蛍光強度) 3 1×104 1×103 1×102 0 100 400 1000 neg リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 18 PolioLuc RNA 導入 HeLa S3 細胞における PolioLuc RNA の翻訳に 対する作用 neg：PolioLuc 非導入細胞 − 331 − ii ) 複製に対する作用 方法 種々の濃度のリバビリン存在下で，HeLa S3 細胞に PolioLuc RNA を導入し，さらに 10 PFU/細胞のポリオウイルスを感染させた．2 時間後，ルシフェラーゼ活性を測定する とともに，プラック法を用いて細胞中の感染性ポリオウイルス量を測定した． 次に，ポリオウイルスの RNA 量を直接測定する目的で，HeLa S3 細胞に 10 PFU/細胞 のポリオウイルスを感染させ，種々の濃度のリバビリンを添加して培養した．感染後 8 ま たは 10 時間に細胞数を揃え，RNA をオリゴ dT25 ビーズを用いて単離し，エチジウムブ ロマイド存在下で非変性アガロースゲル電気泳動を行った．あわせて，プラック法を用い て細胞中の感染性ポリオウイルス量を測定した． 成績 PolioLuc RNA を導入し，ポリオウイルスを感染させた細胞を用いた試験の結果を図 ホ − 19 に示した．リバビリンで処理することにより PolioLuc RNA の複製がわずかに抑 制された (白抜きのバー)．一方，感染性ポリオウイルス量は減少し，リバビリンの 1000 μM (244μg/mL) の添加によりウイルス量は 0.08%に減少した (黒塗りのバー)． ポリオウイルスの RNA 量を直接測定した結果を図ホ − 20 に示した．ポリオウイルス 感染細胞をリバビリンで処理した場合でも，ポリオウイルスの RNA 量はリバビリンで処 理していない場合と同程度であり，PolioLuc RNA を用いた結果と一致した (図ホ − 19 ， 白抜きのバー)．一方，その時の感染性ポリオウイルス量は，上述の結果と同様にリバビリン の 1000μM (244μg/mL) の濃度で 0.08%まで減少した． 結論 リバビリンはポリオウイルス RNA の翻訳及び複製にほとんど影響を及ぼさなかったこ とから，ウイルス粒子の産生量を減少させないと推定されるが，一方では，感染性ウイル ス量の減少が認められた．これは，後述のとおり (本資料概要 334∼335 頁参照)，リバビ リンによりウイルスのゲノム RNA に変異が誘導され，その結果，ウイルス粒子の感染能 が消失するためであると考えられた． − 332 − 4×108 2×108 1×108 1×107 1×107 1×106 1×106 1×105 感染性ウイルス量 (PFU) ルシフェラーゼ活性 (相対蛍光強度) 1×108 1×105 0 100 200 400 1000 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 19 PolioLuc RNA の複製及び感染性ウイルス量に対するリバビリンの作用 リバビリン濃度 (μM) 0 100 400 1000 1 1/2 1/70 1/1200 neg ポリオウイルス RNA 18S rRNA 感染性ウイルス量 (リバビリン非添加群に対する比率) 図ホ − 20 ポリオウイルス感染 HeLa S3 細胞におけるポリオウイルス RNA 量及び感染性 ウイルス量に対するリバビリンの作用 neg：ポリオウイルス非感染細胞 rRNA：リボソーム RNA (内部コントロール) − 333 − 4 ポリオウイルスに対する変異誘発能 リバビリンのポリオウイルスに対する遺伝子変異誘発能を，グアニジン耐性 (guar) ウイ ルスの出現頻度を測定することにより評価した．グアニジンは 2CATPase 蛋白質を阻害する ことによりポリオウイルスの増殖を抑制するが，ポリオウイルスは 2C をコードする領域の 特定の一塩基変異 (4605 番目のシトシンがウラシルに変異) によりグアニジン耐性となる． この突然変異は野性のポリオウイルスでも約 1×10−5 の頻度でみられる．あわせて，リバ ビリンの抗ウイルス作用を評価する目的でウイルス力価を測定した． 方法 被験薬物存在下で HeLa S3 細胞 (5×105 細胞) に 100 PFU (5−フルオロウラシルの場合，1 ×104 PFU) のポリオウイルスを感染させ，4 ∼7 日間培養し，ウイルスを回収した．対照薬 には，5−アザシチジン，5−フルオロウラシル，RIB4C 及びブレフェルジン A を用いた． guar ウイルス出現頻度を測定した試験では，HeLa S3 細胞に上述の回収したポリオウイ ルス (1×106 PFU) を感染させ，2 mM のグアニジンを含む 1%寒天培地中で 72∼80 時間培 養した．クリスタルバイオレットで染色し，プラック数を計数した． 抗ウイルス作用を検討した試験では，上述の回収したウイルスの力価をプラック法にて測 定した． 成績 試験結果を表ホ − 10 に示した．リバビリンは，100μM (24μg/mL) 以上の濃度で guar ウイルスの出現頻度を増加させ，感染性ウイルス量を減少させた．また，既知の変異原物質 である 5−アザシチジン及び 5−フルオロウラシルも，リバビリンと同様に，変異原性を示 す濃度で抗ウイルス作用を示した．これに対して，抗ウイルス作用を持たない IMPDH 阻 害剤である RIB4C は変異原性を示さなかった．ブレフェルジン A はポリオウイルスの増殖 を抑制したが，変異原性を示さなかった． 以上から，リバビリンはポリオウイルスに対して変異原性を示す濃度で抗ウイルス作用を 示すことが確認された． − 334 − 表ホ − 10 薬 ポリオウイルスに対する変異原性及び抗ウイルス作用 物 ─ リバビリン 5−アザシチジン 5−フルオロウラシル RIB4C ブレフェルジン A guar ウイルス 出現頻度 a) (/1×106 PFU) guar 増加率 (%) 1130 1110 2 × 109 100μM 2) 1174 1480 9 × 108 0.200μM 2) 1437 1360 2 × 108 0400μM 1243 4040 5 × 106 1000μM 濃 度 ─ ウイルス力価 (PFU/mL) − − .1μM 2) 1163 1110 1 × 109 .75μM 2) 1165 1150 5 × 108 .1900μM 2) 1588 2170 2 × 107 .7500μM 2) − − < 1 × 105 < .400μM 2) 1136 1120 2 × 109 .0.1μg/mL 2) 1123 1110 5 × 107 060 a)：各値は少なくとも 3 実験の平均値を示す (標準偏差は 10∼20%)． −：ウイルス力価の低下が激しいために変異ウイルスの出現頻度の測定ができなかった． RIB4C：1−β−D−ribofuranosyl−1,2,3−triazole−4−carboxamide − 335 − 5 リバビリンにより誘発されるポリオウイルスの変異塩基の同定 リバビリン存在下で増殖させたウイルスからクローニングしたポリオウイルスのキャプシ ド蛋白質領域 VP1 の cDNA の塩基配列を解析し，リバビリンによりポリオウイルスに誘発 される変異塩基を同定した． 方法 1000μM (244μg/mL) のリバビリン存在下で，HeLa S3 細胞に 10 PFU/細胞のポリオウイ ルスを感染させて 10 時間培養した．細胞 (1×106 細胞) を回収し，オリゴ dT25 ビーズを用 いて RNA を単離した．ランダムプライミング法により 1μg の RNA から cDNA を合成し， 高信頼性ポリメラーゼを用いて PCR により VP1 コード配列を増幅した．VP1 遺伝子を含む NheI−PstI フラグメントをサブクローニングした後，独立な細菌コロニーからプラスミド DNA を調製した．サイクルシークエンシングによってポリオウイルスゲノム (2625∼3400 番) の塩基配列を決定した．リバビリン処理群の 32 クローンとリバビリン未処理群の 23 ク ローンについて，VP1 配列を解析した． 成績 試験結果を表ホ − 11 に示した．リバビリン処理により G から A 及び C から U への置換 変異数が，リバビリン未処理群と比較してそれぞれ約 11 及び 7 倍に増加した．このことか ら，リバビリンは G から A 及び C から U への置換変異を誘発することが示され，無細胞系 で予測された G から A への変異誘発能が，細胞培養系においても確認された．また，C か ら U への変異は，マイナス鎖の RNA 合成時に，RTP が GTP として取り込まれることによ り誘導される G から A への変異から説明できる． 表ホ − 11 リバビリン処理ポリオウイルスのゲノムの解析 変異数 (/104 ヌクレオチド) リバビリン濃度 (μM) G→A 0 0.6** 1.71 2.81 1000 6.5 a) 11.8 a) 20.3 b) C→U 総変異数 総変異数には，G → A 及び C → U 以外にトランジション変異 (U → C 及び A → G) 及びト ランスバージョン変異 (G → U，G → C 及び U → A) も含む． a)，b)：それぞれ p<0.0004 及び p<0.0000002 でリバビリン未処理群に比して有意差あ り (t 検定)． − 336 − 7) 作用機序のまとめ及び考察 1 リバビリンの抗 HCV 作用の機序について 今回試験を実施した結果，従来の報告のとおり，リバビリンは IMPDH を阻害すること により細胞内の GTP 量を減少させることが確認された．しかし，グアノシンを培養系に添 加してもリバビリンの抗ウイルス作用は消失せず，また，IMPDH の選択的阻害薬である MPA が抗ウイルス作用を示さなかったことから，IMPDH 阻害作用はリバビリンの抗ウイ ルス作用の主要な作用機序でないと考えられた． 次に，HCV 及び BVDV 由来 RdRp を用いて，RNA への GTP の取込みに対するリバビリ ンの作用を検討した結果，リバビリンのリン酸化体である RTP は RNA への GTP の取込み を抑制するとともに，HCV 由来 RdRp によりヌクレオチド基質として認識されて RNA に取 り込まれることが明らかとなった．また，ポリオウイルスを用いた試験でも，RTP はポリ オウイルス由来 RdRp により RNA に取り込まれ，突然変異を誘発した． RNA ウイルスはゲノムの変異頻度が高いため，カタストロフの直前の状態にあり，変異原 により複製エラーを増加させることでウイルス集団を死滅させることが可能であると考えら れている15)−18)．したがって，RNA に取り込まれた後に RNA ウイルスのゲノムの変異を誘 導することで，リバビリンは HCV 等の RNA ウイルスに作用を示すものと考えられた． なお，RNA への GTP の取込みを抑制する際のリバビリンの IC50 値は，HCV 及び BVDV 由来 RdRp それぞれで 49∼152μM (12∼37μg/mL) 及び 49μM (12μg/mL) であり，ポリオ ウイルスに突然変異を誘発する濃度は 100μM (24μg/mL) であった．海外の C 型慢性肝炎 患者を対象としたリバビリン (600 mg, 1 日 2 回) の 6 週間反復投与試験では，リバビリン最終 投与時の最高血漿中濃度は 15μM (3.68μg/mL) であった (本資料概要 439 頁，表ヘ − 25 参 照)．バイオプシーを行わない限り，ヒト肝臓でのリバビリン濃度を測定することはできない が，ラットにリバビリン (20 mg/kg, 1 日 1 回) を 3 週間反復経口投与した時の肝臓でのリバビ リン濃度の最高値は，最高血漿中濃度よりも約 22∼26 倍高いことが確認されている (本資 料概要 391 頁参照)．これらから，ヒト肝臓でのリバビリン濃度の最高値は約330∼390μM と推定され，RNAへの GTP の取込みを抑制する濃度及び RNA ウイルスに変異原性を示す 濃度よりも高いと考えられた． また，最近では，リバビリンの免疫系への作用として，細胞性免疫機能を高める 1 型ヘル パー T 細胞 (Th1 細胞) のサイトカイン産生を増加させ，液性免疫機能を高める 2 型ヘル パー T 細胞 (Th2 細胞) のサイトカイン産生を減少させることにより，細胞性免疫を介した ウイルス感染に対する宿主の抵抗性を増強する可能性のあることが報告されている19),20)．し かしながら，ヒト末梢血 T 細胞を用いた検討では，リバビリン及び IFNα−2b の単独添加 − 337 − 並びに両者の併用添加により，Th1 サイトカイン (IFNγ) の産生には影響がみられず，Th2 サイトカイン (IL−4 及び IL−10) の産生が増強されるという逆の結果が得られている21)． さらに，C 型慢性肝炎患者にリバビリンを単独 (5 例) または IFNαと併用 (4 例) 投与した臨 床試験では，末梢血中の Th1 細胞 (IFNγ産生細胞) 数の減少傾向が認められたことが報告 されている22)．これらから，現時点では，リバビリンが抗 HCV 作用を示す際に宿主免疫系 を介した作用が関与しているか否かは不明である． 2 リバビリンの抗 HCV 作用が IFNα−2b との併用により増強する機序について IFNα−2b はウイルスに直接作用するのではなく，宿主細胞に働くことにより，細胞を抗 ウイルス状態にすると考えられている．すなわち，IFNαは細胞上の IFN 受容体に結合し， その細胞の 2’−5’ オリゴ A 合成酵素系23) または蛋白質リン酸化酵素の生合成の誘導24) を通じ て，ウイルス蛋白質の合成阻害作用を示す．これら宿主細胞への作用以外に，IFNα−2b は ナチュラルキラー細胞活性増強作用及びマクロファージに対する活性化作用といった免疫系 への作用を示す25)．このように，リバビリンと IFNα−2b の作用点及び作用機序は異なっ ている．今回の試験では，両者を併用した場合には抗ウイルス作用は相乗的に増加したが， こうした作用点及び作用機序の違いが原因となって相乗作用が認められたものと考えられ た． 3 細胞の核酸代謝及び蛋白質合成に及ぼす影響について リバビリンはヌクレオシド類似体であることから，RNA 及び DNA ウイルスに対する作 用以外に，ヒトの細胞内に存在する核酸合成酵素及び核酸分解酵素に対しても影響を及ぼす 可能性がある． 文献検索を行った結果，宿主細胞の RNA 及び DNA 合成に関与する酵素に対する直接作 用，細胞増殖，RNA 合成，DNA 合成，蛋白質合成及び細胞内ヌクレオチド量に及ぼす影響 並びに細胞 RNA 及び DNA へのリバビリンの取込みを検討した論文が得られたため，以下 にその要約を記載した (表ホ − 12 )． リバビリンは 100μM で DNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (DdRp) I 及び II，DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ (DdDp) α及びβ並びにポリ A ポリメラーゼに対して抑制作用を示さな かった (無細胞系) 26)．しかしながら，リバビリンはマウスリンパ腫細胞株 L5178y 細胞，ヒト 新鮮肝細胞またはマウス T リンパ腫細胞株 S−49 細胞の増殖，RNA 合成，DNA 合成または蛋 白質合成を抑制し，L5178y 細胞内 GTP 及び dGTP 量を減少させた (表ホ − 12 ) 26)−28)． S−49 細胞での作用は培地にグアノシンを添加することにより拮抗されたため，リバビリンの IMPDH 阻害に基づく作用であると考察されている 28)． − 338 − 一方，リバビリンが細胞の RNA または DNA に取り込まれるか否か検討した試験では， 3H 標識リバビリン存在下でヒト類上皮癌細胞株 KB 細胞を 6 時間培養するとリバビリンは RNA には取り込まれたが，DNA には取り込まれなかった．また，3H 標識リバビリンを ラットに 9 日間腹腔内投与しても，肝臓から調製した RNA には取り込まれたが，DNA に は取り込まれなかった29)．宿主細胞では DNA は DdDp によってのみ合成されるが，これら 酵素の基質特異性は厳密であり，ヌクレオチドのデオキシ体のみを認識し，2’−ヒドロキシ 体を認識しないため，2’−ヒドロキシ化されているリバビリンが DNA に取り込まれなかっ たと考えられる． 以上の成績から，リバビリンは IMPDH 阻害作用を介して細胞内 GTP 及び dGTP 量に影 響を与えることにより，細胞増殖抑制作用を示すが，宿主細胞の DNA には取り込まれず， DNA に直接的に損傷を与えることはないと考えられた．なお，リバビリンはウイルス RNA に取り込まれるのと同様に，細胞の RNA にも取り込まれるが，細胞にとって RNA は最終 産物であり，mRNA に RTP が取り込まれても RTP を含むコドンに対応して適切に塩基対 を形成することができるアミノアシル tRNA のアンチコドンはないと考えられ，その部分 で蛋白質への翻訳が停止すると考えられる．また，リバビリンにより，mRNA に変異が誘 導されると変異蛋白質が生成する可能性があるが，mRNA の半減期が短く，リバビリンに より誘導される突然変異の位置がランダムであるため，特定の一次構造を有し，有害作用を 示す変異蛋白質が持続的に産生される可能性は低いと考えられる．なお，細胞は RNA 依存 性 DNA ポリメラーゼを持たないため，リバビリンにより変異 RNA が生成されても細胞の DNA 情報には影響しないと考えられる． − 339 − 表ホ − 12 リバビリンの核酸合成酵素，細胞増殖，RNA 及び DNA 合成，蛋白質合成，細胞内 GTP 及び dGTP 量に及ぼす影響，並びに RNA 及び DNA への取込みに対する検討 酵素，細胞等 精製酵素 項 目 方 法 結 存在下で 3H 果 DdRpⅠ，Ⅱ マウス肝臓由来酵素を RTP 標識 GTP, 非標識 ATP, CTP, UTP 及び DNA と共に 15 分間インキュベートし，酸不溶性画分の放 射活性を測定した 100μM で抑制せず DdDp α，β L5178y 細胞由来酵素を RTP 存在下で 3H標識 dGTP, 非標識 dCTP, dATP, dTTP 及び DNA と 共に 30 分間インキュベートし，酸不溶性画分 の放射活性を測定した 100μM で抑制せず 引用文献 26) ポリ A ポリメ ウズラ卵管由来酵素を RTP 存在下で 3H 標識 100μM で抑制せず ATP 及び oligo (pA)10 と共に 30 分間インキュ ラーゼ ベートし，酸不溶性画分の放射活性を測定した マウスリンパ 腫細胞株 L5178y 細胞 細胞増殖 細胞をリバビリン (0.1∼5μg/mL) 存在下で 72 IC50 = 1.15μg/mL (4.7μM) 時間インキュベートした．洗浄後，さらに 72 時間インキュベートし，フローサイトメーター により細胞数を測定した RNA 合成 細胞をリバビリン (38, 76μM) 存在下で 2 時間 インキュベート後，3H 標識ウリジン，3H 標識 デオキシチミジンまたは 3H 標識リジンを加え て 30 分間インキュベートした．細胞中の放射 分間インキュベ トした 細胞中の放射 活性を測定した DNA 合成 dGTP 量 ヒト新鮮肝 細胞 マウス T リ ンパ腫細胞株 S−49 細胞 標識ウリジンの取込みを 38, 76μM でそれぞれ 57, 45%に抑制 3H 標識デオキシチミジンの 取込みを 38, 76μM でそれぞ れ 42, 28%に抑制 3H 標識リジンの取込みを 38, 76μM でそれぞれ 88, 83%に 抑制 蛋白質合成 GTP 量 3H 細胞をリバビリン (38, 76μM) 存在下で 3 時間 GTP 量を 38, 76μM でそれ インキュベート後，細胞内 GTP 及び dGTP 量 ぞれ 74, 49%に減少 を RNA または DNA ポリメラーゼを用いた酵 ポリメラ ゼを用いた酵 dGTP 量を 38, 76μM でそれ 素反応にて測定した ぞれ 46, 41%に減少 DNA 合成 細胞をリバビリン (1∼500μM) 存在下で 24 ま DNA 合成を 24 時間では 500μM, 72 時間では 60μM たは 72 時間インキュベート後，3H 標識デオ キシチミジンを加えて 24 時間インキュベート 以上で有意に抑制 した．細胞中の放射活性を液体シンチレーショ ンカウンターにより測定した 蛋白質合成 細胞をリバビリン (1∼500μM) 存在下で 24∼ 蛋白質合成を 10μM 以上で 72 時間インキュベート後，14C 標識ロイシン 有意に抑制 を加えて 2 時間インキュベートした．細胞中 の放射活性を液体シンチレーションカウンター により測定した 細胞増殖 細胞をリバビリン (5∼30μM) 存在下で 24 時 IC50 ＝ 10μM 間インキュベート後，フローサイトメーターに より生細胞数を測定した RNA 合成 細胞をリバビリン (5∼30μM) 存在下で 4 時間 インキュベート後，3H 標識ウリジンまたは 3H 標識デオキシチミジンを加えて 30 分間イ ンキュベートした．細胞中の放射活性を液体シ ンチレーションカウンターにより測定した RNA 合成を 10μM で約 50 ％抑制 RNA には取り込まれたが， DNA には明らかな取込みは みられなかった DNA 合成 ヒト類上皮癌 細胞株 KB 細 胞 RNA 及び DNA への取 込み 3H ラット RNA 及び DNA への取 込み 3H 標識リバビリン存在下で 6 時間インキュ ベート後，RNA 及び DNA を調製し，放射活 性を測定した 28) DNA 合成を 5μM で約 50 ％ 抑制 標識リバビリン (50 mg/kg) をラットに 1 日 RNA には取り込まれたが， 2 回，9 日間腹腔内投与し，最終投与 4 時間後 DNA には明らかな取込みは に肝臓から RNA 及び DNA を調製し，放射活 みられなかった 性を測定した − 340 − 27) 29) 図ホ − 21 にリバビリン及び IFNα−2b の 抗 HCV 作用において推定される機序につい て示す． IFNα−2bの間接的 抗ウイルス作用 リバビリンの突然変異誘導に 基づく直接的抗ウイルス作用 リバビリンの核酸合 成阻害に基づく作用 NK 細胞 マクロ ファージ HCV IFNα−2b 肝細胞 IMP IFN 受容体 IMPDH ⊖ リバビリン ウイルス感染細胞 細胞傷害性 ウイルス RNA XMP 核 GMP DNA 遺伝子発現 GDP dGDP GTP ↓ dGTP ↓ ＋鎖 翻訳 複製 −鎖 2’−5’ AS 活性化 PK 活性化 ＋鎖 集合 リバビリンによる 突然変異の誘導 ウイルス mRNA 分解 蛋白質合成阻害 宿主細胞 ウイルス DNA 合成↓ mRNA 合成↓ RNA 合成↓ 蛋白質合成↓ 蛋白質合成↓ 増殖↓ 増殖↓ 非増殖性ウイルスの産生 dGDP : デオキシグアノシン二リン酸，dGTP : デオキシグアノシン三リン酸，GDP : グアノシン二リン酸， GMP : グアノシン一リン酸，GTP : グアノシン三リン酸，HCV : C 型肝炎ウイルス，IFN : インターフェロン， IMP : イノシン一リン酸，IMPDH : IMP 脱水素酵素，NK 細胞 : ナチュラルキラー細胞， PK : 蛋白質リン酸化酵素，XMP : キサントシン一リン酸，2’−5’ AS : 2’−5’ オリゴ A 合成酵素 図ホ − 21 リバビリン及び IFNα−2b の抗 HCV 作用における作用機序 (推定) リバビリンの突然変異誘導に基づく直接的抗ウイルス作用：リバビリンはウイルスのゲノムである RNA に取り込まれ，RNA ウイルスのゲノムに突然変異を誘導し，感染性ウイルスの産生を抑制する と考えられる． リバビリンの核酸合成阻害に基づく作用：IMPDH 阻害作用により細胞内の GTP 量を減少させ，そ の結果，ウイルスの RNA 合成，蛋白質合成及び増殖を低下させるという機序も関与している可能性 がある． IFNα−2b の間接的抗ウイルス作用：IFNα−2b では，宿主の細胞膜に発現した IFN 受容体に結合 し，核内に情報が伝達され，2’−5’ オリゴ A 合成酵素及び蛋白質リン酸化酵素の活性化を介して細胞 を抗ウイルス状態にすることにより抗ウイルス作用を示す機序，並びにナチュラルキラー細胞及びマ クロファージを活性化し，ウイルスに対する宿主の防御機構を増強する機序が報告されている． − 341 − (3) 代謝物の効力についての薬理試験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** リバビリン代謝物として，TCONH2, RTCOOH 及び TCOOH 並びに 3 種類のリン酸化体 (RMP, RDP, RTP) が同定されている (本資料概要 413 頁，図ヘ − 27 参照)．リン酸化体はラット 及びサルの血漿中に存在しないことから (本資料概要 415 頁，表ヘ − 18 参照)，リン酸化体以外 のリバビリン代謝物の抗ウイルス作用及び細胞増殖抑制作用を検討した． 1) 抗ウイルス作用 BVDV 感染 MDBK 細胞培養系を用いて，TCONH2，RTCOOH 及び TCOOH の抗ウイルス 作用を検討した． 方法 前述の BVDV 感染 MDBK 細胞培養系 (本資料概要 302 頁参照) を用いて試験を実施した． 成績 試験結果を図ホ − 22 に示した．抗ウイルス作用を示したのはリバビリンのみで，TCONH2, RTCOOH 及び TCOOH はいずれも抗ウイルス作用を示さなかった． 1 ■ ● ▲ ◆ 吸光度 0.8 リバビリン TCONH2 RTCOOH TCOOH 0.6 0.4 0.2 0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 200 薬物濃度 (μM) 図ホ − 22 リバビリン及びその代謝物の BVDV に対する抗ウイルス作用 各点は 2 例の平均値を示す． − 342 − 2) 細胞増殖抑制作用 ヒト末梢血単核細胞及びヒト肝細胞癌細胞株 HepG2 細胞を用いて，TCONH2, RTCOOH 及 び TCOOH の細胞増殖抑制作用を検討した． 1 ヒト末梢血単核細胞に対する細胞増殖抑制作用 方法 ヒト末梢血単核細胞 (2×105 細胞/well) を刺激剤である PHA (phytohemagglutinin) 存在 下または非存在下で，被験薬物と共に 37℃にて 3 日間培養し，細胞を増殖させた．MTS 試 薬を加え，2∼3 時間培養後，ホルマザン生成物量を 490 nm の吸光度にて測定した．被験薬 物非添加群の生存率を 100%として示した． 成績 試験結果を図ホ − 23 に示した．リバビリン及び 3 種類の代謝物は，いずれも 200μM ま での用量範囲でヒト末梢血単核細胞の増殖を抑制しなかった． ■ PHA 刺激 無刺激 ● 140 140 120 120 100 100 % of Control % of Control ▲ ◆ 80 60 40 20 リバビリン TCONH2 RTCOOH TCOOH 80 60 40 20 0 0 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200 25 50 100 200 薬物濃度 (μM) 薬物濃度 (μM) 図ホ − 23 3.125 6.25 12.5 リバビリン及びその代謝物のヒト末梢血単核細胞に対する細胞増殖抑制作用 各点は 2 例の平均値を示す． − 343 − HepG2 細胞に対する細胞増殖抑制作用 方法 HepG2 細胞 (7.5×103 細胞/well) を被験薬物と共に 37℃にて 3 日間培養し，細胞を増殖さ せた．MTS 試薬を加え，2∼3 時間培養後，ホルマザン生成物量を 490 nm の吸光度にて測 定した． 成績 試験結果を図ホ − 24 に示した．リバビリン及び 3 種類の代謝物は，いずれも 200μM ま での用量範囲で HepG2 細胞の増殖を抑制しなかった． 2 ■ リバビリン ● TCONH2 RTCOOH TCOOH ▲ 1.5 吸光度 2 ◆ 1 0.5 0 0 0.2 0.4 0.8 1.6 3.1 6.3 12.5 25 50 100 200 薬物濃度 (μM) 図ホ − 24 リバビリン及びその代謝物の HepG2 細胞に対する細胞増殖抑制作用 各点は 2 例の平均値を示す． − 344 − (4) リバビリンと各種 IFN との併用時の抗ウイルス作用の比較 . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 現在，臨床の場では，各種 IFN が C 型慢性肝炎の治療に使用されていることから，BVDV 感 染 MDBK 細胞培養系を用いてリバビリンと各種 IFN とを併用した時の抗ウイルス作用を検討 し，3 種類 (α型，β型，γ型) の IFN の間で併用効果に違いがあるかどうかを比較した． 方法 前述の BVDV 感染 MDBK 細胞培養系 (本資料概要 302 頁参照) を用いて試験を実施した．試験 には，α型 IFN として IFNα−2b，IFNα−2a，コンセンサス IFN (cIFNα) 及び IFNα−n3， β型 IFN として IFNβ−T1 及び IFNβ−1a，γ型 IFN を用いた． 成績 試験結果を図ホ − 25 に示した．IFNα−2b を含むα型 IFN の 100 及び 500 IU/mL をリバビ リンと併用した場合は，リバビリンの抗ウイルス作用が増強したが，β型 IFN またはγ型 IFN を併用した場合は，500 IU/mL まで増量してもリバビリンの抗ウイルス作用に変化は認められ ず，IFN の種類により併用効果の異なることが示された． IFN : 1 IU/mL IFN : 10 IU/mL 1 1 吸光度 1.5 吸光度 1.5 0.5 0.5 0 0 0 0.2 0.8 3.1 12.5 50 0 0.2 200 リバビリン濃度 (μM) 0.8 3.1 12.5 50 200 リバビリン濃度 (μM) IFN : 100 IU/mL IFN : 500 IU/mL 1.5 1 1 吸光度 吸光度 1.5 0.5 0.5 0 0 0 0.2 0.8 3.1 12.5 50 200 0 0.2 リバビリン濃度 (μM) 図ホ − 25 0.8 3.1 12.5 50 200 リバビリン濃度 (μM) 各種 IFN との併用時のリバビリンの抗ウイルス作用の比較 各点は 2 例の平均値を示す． ■ IFNα−2b ● ◆ IFNα−2a ＋ cIFNα IFNα−n3 − 345 − × × IFNβ−T1 IFNβ−1a ＋ IFNγ ▲ IFN 非添加群 (5) リバビリン及び IFNα−2b に対する耐性ウイルスの出現について添付資料 先に記載したように，抗ウイルス剤の作用を再現性よく評価できる HCV 感染細胞培養系は確 立されていないため，リバビリンが HCV の耐性ウイルスの出現を誘導するかどうかを検討する ことはできなかった．このため，MEDLINE (1970∼2000 年) を用いて文献検索を行い，リバビ リンに対する耐性ウイルスの出現について報告されているかどうかを調査した．なお，検索時に はキーワードとして「ribavirin 」及び「resistant または resistance」を用いた． 検索の結果，リバビリンの耐性に関連した内容を示すと考えられる論文の内容を表ホ − 13 に 要約した．In vitro または in vivo のいずれでも，リバビリンに対する耐性ウイルスが出現すると いう報告はなかった． 表ホ − 13 ウイルス リバビリンに対する耐性ウイルスの出現に関する公表論文 方 法 論文中の結論 ヒト免疫不全 後天性免疫不全症候群患者 3 例に 1 日 リバビリンを反復投与しても，IC50 値 ウイルス 1200 mg のリバビリンを 5∼9 ヵ月間反 は上昇せず，耐性の発現はみられなか 復経口投与し，患者から分離したウイル った スに対するリバビリンの抗ウイルス作用 を検討した RSV (Long 株) HSV−1 10 または 15μg/mL (41 または 61μM) リバビリン存在下で継代しても，プラ ック形成抑制作用は減弱せず，耐性の のリバビリン存在下で 1 または 2 回継 代し，各継代後のウイルスに対するリバ 発現はみられなかった ビリンの抗ウイルス作用を検討した 10μg/mL (41μM) のリバビリンまたは リバビリン存在下で継代しても，プラ 10μg/mL (28μM) のイドクスウリジン ック形成抑制作用は減弱せず，リバビ (IDU) 存在下で 10 回継代し，10 回継代 リンに対する耐性の発現はみられなか 後のウイルスに対するリバビリンの抗ウ った IDU 存在下で継代すると，IDU に対 イルス作用を検討した する耐性が発現したが，リバビリン に対する交差耐性の発現はみられな かった − 346 − リバビリンは HCV の突然変異を誘発することにより抗ウイルス作用を示すと考えられるが， 突然変異の結果として IFNα−2b 無効性のウイルスや極めて増殖能の強いウイルス等，耐性ウ イルスが生じる可能性について，臨床での併用投与時における血清中 HCV RNA 量の結果に基 づいて以下に考察した． IFN 未治療 C 型慢性肝炎患者を対象に，二重盲検法を用いて IFNα−2b とプラセボまたは IFNα−2b とリバビリンを併用投与した試験の成績 について，投与 期間中の血清 HCV RNA 量の再増加率を解析した結果を表ホ − 14 に示した．リバビリンにより HCV が変異し，IFNα−2b に対する耐性ウイルス等が出現するのであれば，リバビリン併用投 与群における血清 HCV RNA 量の再増加率はプラセボ併用投与群のそれと比較して高くなると 予想されるが，リバビリン併用投与群における血清 HCV RNA 量の再増加率 (9%) は，プラセボ 併用投与群のそれ (14%) よりも低値を示した． このことから，リバビリン投与による IFNα−2b 無効性のウイルスの出現，または増殖能の 極めて強いウイルスの出現の可能性は低いものと考えられた． 表ホ − 14 IFN 未治療 C 型慢性肝炎患者における IFNα−2b とリバビリンの 併用投与時の血清 HCV RNA 量の再増加率 薬 物 投与期間 IFNα−2b + プラセボン 投与期間中の血清 HCV RNA 量の 再増加率 (例数) 48 週間 IFNα−2b + リバビリン 14% (54/390) 19% (28/316) IFNα−2b: 3×106 IU/日，週 3 回皮下投与 リバビリン: 1000 または 1200 mg/日，連日経口投与 投与量の違いによる影響を小さくするために，両薬剤が 80% 以上投与され，服薬率が 80% 以上で あり，80% 以上の期間投与された患者集団について評価した． − 347 − 引用文献 1) Muerhoff, A.S., et al.: Genomic Organization of GB Viruses A and B: Two New Members of the Flaviviridae Associated with GB Agent Hepatitis. J. Virol. 69, 5621−5630 (1995) 2) Greco, W.R., et al.: The Search for Synergy: A Critical Review from a Response Surface Perspective. Pharmacol. Rev. 47, 331−385 (1995) 3) Sidwell, R.W., et al.: Broad-Spectrum Antiviral Activity of Virazole: 1-β-D -Ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide. Science 177, 705−706 (1972) 4) Allen, L. B.: Review of In Vivo Efficacy of Ribavirin. In: Smith, R.A. and Kirkpatrick, W., eds. RIBAVIRIN; A Broad Spectrum Antiviral Agent. Academic Press, 43−58 (1980) 5) Stephen, E.L., et al.: Ribavirin Treatment of Toga−, Arena− and Bunyavirus Infections in Subhuman Primates and Other Laboratory Animal Species. In: Smith, R.A. and Kirkpatrick, W., eds. RIBAVIRIN; A Broad Spectrum Antiviral Agent. Academic Press, 169−183 (1980) 6) Canonico, P.G.: Ribavirin; A Review of Efficacy, Toxicity and Mechanisms of Antiviral Activity. In: Hahn, F.E., eds. Antibiotics. Modes and Mechanisms of Microbial Growth Inhibitors. 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Academic Press, 99−118 (1980) − 348 − 2. 一般薬理試験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし**，**タグなし** 総 括 リバビリンの一般症状，中枢神経系，自律神経系及び平滑筋，呼吸・循環器系，消化器系並び に水及び電解質代謝に及ぼす影響を検討した．その結果，表ホ − 15 に示すとおり，一般症状に おいて，推定臨床投与量の約 23 倍の 300 mg/kg (経口) で，体位変換時の受動性の低下が 5 例中 2 例，反応性の低下，うずくまり，耳介攣縮及び弱い非特異的な行動変化が 1 例に認められた． 麻酔作用において推定臨床投与量の約 15 倍の 200 mg/kg (経口) で麻酔時間の延長がみられた． その他の試験項目においてはいずれも作用はみられなかった． (1) 一般症状に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 5 例) に溶媒またはリバビリン (10∼300 mg/kg) を経口投与 した際の一般症状に及ぼす影響を Irwin の変法に基づいて検討した．リバビリンの投与後 1，2 及び 4 時間に，警戒性，体位変換時の受動性，常同行動，反応性，自発運動，体姿勢，四肢姿 勢，歩行異常，カタレプシー，眼瞼下垂，瞳孔径，排泄，呼吸，振戦，痙攣，致死及び攣縮につ いて観察した．また，投与後 24 時間までの死亡の有無を観察した． その結果，リバビリンの 10，30，100 mg/kg 投与群及び溶媒投与群のいずれにおいても，観 察した一般症状に対して作用は認められなかった．300 mg/kg 投与群で体位変換時の受動性の低 下 2 例，反応性の低下 1 例，うずくまり 1 例及び耳介攣縮 1 例が投与後 4 時間でのみ観察され，1 例に弱い非特異的な行動変化がみられた．いずれのラットも 24 時間以内の致死は認められなかっ た． 自発運動に対しては，リバビリンを経口投与しても 300 mg/kg まで作用は認められなかった． (2) 中枢神経系に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 1) 麻酔作用 一晩絶食した ICR 系雄性マウス (1 群 10 例) に溶媒またはリバビリン (10∼200 mg/kg) を経口 投与して 2 時間後に 40 mg/kg のペントバルビタールを腹腔内投与した．正向反射消失持続時 間を麻酔時間として測定した． その結果，リバビリンの 10, 30 及び 100 mg/kg 投与群のいずれにおいても溶媒投与群と比較 してペントバルビタール麻酔に対する影響は認められなかった．リバビリンの 200 mg/kg 投与 群の麻酔時間は溶媒投与群と比較して 45%有意に延長した． − 349 − 2) 電撃痙攣 1 協力作用 一晩絶食した ICR 系雄性マウス (1 群 10 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投 与して 2 時間後に小動物用電撃刺激装置を用いて，パルス間隔 10 ms，パルス幅 3 ms，出力 25 mA，持続時間 0.1 秒の電撃刺激を両眼より与え，強直性伸展痙攣の発現の有無を観察し た． その結果，溶媒投与群では 1 例に痙攣が認められたが，リバビリン投与群では痙攣はみら れなかった． 2 拮抗作用 一晩絶食した ICR 系雄性マウス (1 群 10 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投 与して 2 時間後に小動物用電撃刺激装置を用いて，パルス間隔 10 ms，パルス幅 5 ms，出力 50 mA，持続時間 0.3 秒の電撃刺激を両眼より与え，強直性伸展痙攣の発現の有無を観察し た． その結果，溶媒投与群及びリバビリン投与群の全例に痙攣が認められた． 3) 痛覚に及ぼす影響 一晩絶食した ICR 系雄性マウス (1 群 10 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投与 し，投与前並びに投与後 30, 60, 120, 180 及び 240 分の疼痛閾値を測定した．マウスの尾根部を 圧刺激測定装置で加圧刺激することにより疼痛を誘発した． その結果，リバビリン投与群の疼痛閾値には溶媒投与群と比較していずれの時点でも有意差 は認められなかった． 4) 体温に及ぼす影響 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 8 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投与 し，投与前並びに投与後 30, 60, 120, 180 及び 240 分の直腸温をサーミスタ体温計を用いて測定 した． その結果，リバビリン投与群の体温には溶媒投与群と比較していずれの時点でも有意差は認 められなかった． − 350 − (3) 自律神経系及び平滑筋に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** Hartley 系雄性モルモットの摘出回腸 (n=5) を用いて，アセチルコリン (1μM)，ヒスタミン (3μM)，セロトニン (50μM) または塩化バリウム (3 mM) による収縮に及ぼすリバビリン (1∼ 100μg/mL) の影響を検討した． その結果，1, 10 及び 100μg/mL のリバビリンを摘出回腸に添加しても，アセチルコリン，ヒ スタミン，セロトニン及び塩化バリウムによって誘発される収縮には，溶媒添加群と比較して有 意な変化は認められなかった． (4) 呼吸・循環器系に及ぼす影響 1) 呼吸及び血流量に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 5 例) をペントバルビタールで麻酔した後，溶媒または リバビリン (200 mg/kg) をゾンデにより胃内投与し，投与前並びに投与後 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 及び 240 分における呼吸数及び腹大動脈血流量を測定した． その結果，リバビリン投与群において溶媒投与群と比較していずれの時点でも呼吸数及び血 流量に対する作用は認められなかった． 2) 血圧，心拍数及び心電図に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 6 例，無麻酔) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経 口投与し，投与前並びに投与後 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 及び 240 分における血圧，心拍数 及び心電図を測定した． その結果，リバビリン投与群において溶媒投与群と比較していずれの時点でも血圧，心拍数 及び心電図に対する作用は認められなかった． (5) 消化器系に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 1) 腸管内輸送能に及ぼす影響 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 6 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投与 し，30 分後に 11% (V/V) 炭末懸濁液 0.5 mL を経口投与した．10 分後に頸椎脱臼死させ，小腸 を摘出した．小腸全長 (幽門部から回盲部まで) 及び幽門部から炭末の移動先端部までの長さ を測定し，腸管輸送率 (小腸全長に対する炭末移動率) を算出した． その結果，リバビリン投与群と溶媒投与群との間で腸管輸送率に有意差は認められなかっ た．陽性対照として用いたアトロピン (10 mg/kg) 投与群では腸管輸送率を 78% 抑制し，溶媒 投与群との間に有意差が認められた． − 351 − 2) 胃内容排出能に及ぼす影響 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 6 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投与 し，30 分後に 3 mL の試験食 (300 mL の蒸留水にメチルセルロース 10 g，カゼイン 16 g，粉砂 糖 8 g，コーンスターチ 8 g 及び固形ビーフブイヨン 2 個を懸濁させたもの) を胃内投与した． さらに，30 分後に頸椎脱臼死させ，胃 (食道から幽門部まで) を摘出し，重量を測定した．胃 を切開し，内容物を洗浄した後，再度胃の重量を測定し，胃内容排出率 (与えた試験食重量に 対する胃内容物の重量の百分率) を算出した． その結果，リバビリン投与群と溶媒投与群との間で排出率に有意差は認められなかった．陽 性対照として用いたアトロピン (10 mg/kg) 投与群では溶媒投与群と比較して排出率の有意な 低下が認められた． 3) 胃粘膜に及ぼす影響 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 6 例) に溶媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投与 し，4 時間後に屠殺し，胃を摘出した．胃を大弯にそって切開し，胃粘膜上の障害部位の長さ を測定した． その結果，リバビリン投与群と溶媒投与群には胃粘膜障害は認められなかった．陽性対照と して用いたインドメタシン (10 mg/kg) 投与群では全例に胃粘膜障害が認められた． (6) 水及び電解質代謝に及ぼす影響 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 添付資料**タグなし** 一晩絶食した SD 系雄性ラット (1 群 6 例) に生理食塩水を 15 mL/kg の容量で経口投与した．溶 媒またはリバビリン (200 mg/kg) を経口投与後 5 時間まで及び 6∼24 時間の 2 回の蓄尿中の尿量 及び電解質 (Na+, K+) を測定した．また，投与後 24 時間に血清クレアチニンを測定し，糸球体 濾過速度の指標としてクレアチニンクリアランスを算出した． その結果，リバビリン投与群と溶媒投与群との間で，投与後 5 時間まで及び 6∼24 時間のいず れの尿量及び電解質にも有意差は認められなかった．また，クレアチニンクリアランスもリバビ リン投与群と溶媒投与群との間で有意差は認められなかった． − 352 − 表ホ − 15 リバビリンの一般薬理試験成績 動物種 (n/群) 適用 経路 投与量 または濃度 ラット (5) 経口 10, 30, 100, 300 mg/kg 300 mg/kg で体位変換時の 受動性の低下 (2), 反応性の低下 (1), うずくまり (1), 耳介攣縮 (1), 弱い 非特異的な行動変化 (1) 349 自発運動 (Irwin の変法) ラット (5) 経口 10, 30, 100, 300 mg/kg 作用なし 349 麻酔作用 (ペントバルビタール麻酔) マウス (10) 経口 10, 30, 100, 200 mg/kg 200 mg/kg で麻酔時間を45% 延長 試 験 項 目 試 験 成 績 頁 1. 一般症状に及ぼす影響 Irwin の変法 2. 中枢神経系に及ぼす影響 痙攣作用 (電撃痙攣) 協力作用 350 マウス (10) 経口 痛覚 (圧刺激) マウス (10) 経口 200 mg/kg 作用なし 体温 ラット (8) 経口 200 mg/kg 作用なし 拮抗作用 200 mg/kg 作用なし 作用なし 3. 自律神経系及び平滑筋に及ぼす影響 摘出回腸 (アセチルコリン, ヒスタミン, セロトニン, 塩 化バリウムによる収縮） モルモッ ト (5) in vitro 1, 10, 100 作用なし μg/mL 351 4. 呼吸・循環器系に及ぼす影響 呼吸，血流量 ラット (5) 胃内 200 mg/kg 作用なし 血圧，心拍数，心電図 無麻酔 ラット (6) 経口 200 mg/kg 作用なし ラット (6) 経口 200 mg/kg 作用なし 351 作用なし 352 351 5. 消化器系に及ぼす影響 腸管内輸送能 胃内容排出能 胃粘膜 作用なし 6. 水及び電解質代謝に及ぼす影響 尿量 尿中電解質 (Na+, K +) ラット (6) 経口 200 mg/kg g g 作用なし 作用なし 糸球体濾過速度 (クレアチニンクリアランス) 作用なし − 353 − 352