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Instructions for use Title イネ萎縮ウイルス分節ゲノム10番
Title Author(s) Citation Issue Date イネ萎縮ウイルス分節ゲノム１０番 RNA 転写産物の in vitro 合成 松村, 健; 上田, 一郎; 四方, 英四郎 北海道大学農学部邦文紀要, 17(1): 107-112 1990-03-31 DOI Doc URL http://hdl.handle.net/2115/12121 Right Type bulletin Additional Information File Information 17(1)_p107-112.pdf Instructions for use Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers : HUSCAP 北大農邦文紀要 1 7(1): 107~ 1 1 2，1 9 9 0 イネ萎縮ウイルス分節ゲノム 1 0番 RNA転写産物の i nv i t r o合成 松村 健*・上田一郎・四方英四郎 (北海道大学農学部植物学教室〉 (*北海道グリーンパイオ研究所〉 〔平成 2年 1月 1 0日受理〕 ProductionofcompletetranscriptsofRiceDwarfVirus genomesegment 1 0i nv i t r o へ I c T a k e s h iMATSUMURA h i r oUYEDAandE i s h i r oSHIKATA a c u l t yo fA g r i c u l t u r e， ( D e p a r t m e n to fB o t a n y，F HokkaidoU n i v e r s i t y，S a p p o r o0 6 0，J a p a n ) 6 9 1 3Naganuma，J a p a n ) ( * H o k k a i d oG r e e n B i oI n s t i t u t e，0 I.緒 従ってこれら重要な末端構造の配列が変化する。 言 この問題点を解決するため，新しく構築した '末端の最初の 6塩基と 3 '末端の 4塩 基 ゲノムの 5 RNA転写ベクターを開発した。 更に， cDNA合 成 の 際 に 付 加 さ れ た ホ モ ポ リ 0番の cDNN>を マー配列を除去した分節ゲノム 1 の配列が各分節ゲノム間で保存されており，この配 用いて試験管内で完全長分節ゲノム RNAを転写す 列の近傍に逆向き相同配列が認められる。 る系を確立した。 イネ萎縮ウイルスと同じ植物レオウイルスクールー プ 1に属する Wo undTumorV i r u sでは，各分節 この各分節ゲノムの末端構造がウイルスゲノムの 1 1 . 材料と方法 増殖及び，ウイルス粒子内に取り込まれる際の認識 DNA合成装置により合 oRI 成された T7プロモーター配列を制限酵素 Ec で切断した pUC118 ，または 1 1 9ベクターに挿入し た ( F i g .l ) 。 部位として働き，更には翻訳産物の合成量の調節を 転写ベクターの作成 10)。 行っていると推測されている 2， 0番で， 著者らはイネ萎縮ウイルス分節ゲノム 1 5 '末端の最初の 4塩基と 3 '末端の最後の 4塩 基 が woundtumorv i r u sと同ーの配列を持ち，またこ 連結反応は， TakaraDNAl i g a t i o nk i tを用い の配列を含む逆向き相同配列が存在することが明ら て行った。連結反応後の組換え体 DNAを用いて大 カ叶こし T こ8， 11 ) 。 腸菌 MV1184株の形質転換を行った。 この事実から， woundt umorv i r u sと同様にイ 試験管内 RNA転 写 合 成 DNA依 存 RNA合 ネ萎縮ウイルスゲノムでも末端配列による構造が， 成反応は， 40mM トリス一塩酸緩衝液， pH7.2 ， ゲノム RNAの複製及び，発現に大きくかかわって 6mM塩化マグネシウム， 10mMジ チ オ ス レ イ トール， 4mMス ペ ル ミ ジ ン ， 0.4mM ATP ， CTP，GTP，UTP，20Uの T7RNAポ リ メ ラ ー いると推測される。 この仮説を明らかにしていく上で，試験管内でイ ネ萎縮ウイルスゲノムと全く同一な配列の RNAを ゼを含む反応液中に DNA1μgを加え，3TC， 1時 合成する系が必要とされるが，現在の RNA転写ベ 間反応させた後， 23Uの DNase1( R N a s e f r e e ) クターを用いた RNA合成系では， cDNAの 上 流 を加え，更に 1 5分間反応させた。 完全長分節ゲノム 1 0番の RNA転写ベクターの にベクター由来の配列が付加されたまま転写され， 1 0 7 1 0 8 北海道大学農学部邦文紀要第 1 7巻 第 1号 B g lI I ↓ a a t t c T A ATACGACTCACTA T A g a t c t g gATTATGCTGAGTGATATctagacttaa Eco T7p r o m o t o r E c oR I E c oR I 町 、 Xba1 の D i g e s t i o nw i t h E c oR I P s t1d i g e s t i o n 5 1n u c l e a s e X b a1d i g e s t i o n 己 一 」 L i g a t i o n D i g e s t i o nw i t hB g lI I 5 1n u c l e a s e D i g e s t i o nw i t hX b a1 [ s t a r t→ s t o p1 ， ・ … ・ ・t a a t a c g a c t c a c t a t a G G T A A A . . .. . . T C C T G AT ' a t c t a g . . ..~. T7p r o m o t o r RDVs e g . l 0 EcoRV F i g .2 . S t e p s f o r t h e c o n s t r u c t i n g t h e c 10ne pUMRDI0.The s e q u e n c e so ft r a n s c r i p t i o n s t a r tands t o ps i t e swerei n d i c a t e d . F i g .1 . Strategyf o rmakingat r a n s c r i p t i o nv e c t o r pUCT7.TheT7promotorsequencea r eu n . d e r l i n e d DNAを大腸菌 MV1184株の形質転換に用いた。 作成 完全長分節ゲノム 1 0番 RNA転写クロー 開始部位の塩基配列解析は， 7-DEAZA DNAシー ンは，作成した pUCT7転写ベクターと完全長分節 クエンスキット (TAKARA) を用い，プラスミド ゲノム 1 0番 cDNAを持つクローン pUpRD28を用 DNAを ア ル カ リ 変 性 し て 行 っ た 。 プ ラ ス ミ ド glI Iで切断した いて作成した (Fig.2)。制限酵素 B DNAのアルカリ変性は，キットの操作手順にした 塩基配列の解析 作成した完全長分節ゲノム 1 0番を含む RNA転写ベクター pUMRDl Oの転写 pUCT7 119-12と 制 限 酵 素 P s t Iで 切 断 し た がって行った。 pUpRD28の末端平滑化は，一本鎖 DNAを特異的 1 11 . 実 験 結 果 に分解する酵素 SIヌクレアーゼを用いて行った。 即ち， 30mM酢酸ナトリウム pH4.6， 100m M塩 転写ベクターの作成 合 成 し た T7プロモー 化 ナ ト リ ウ ム ， l m M塩化亜鉛， 1O ~50μg の タ ー 配 列 と 制 限 酵 素 Eco RI切 断 し た ベ ク タ - DNAを含む反応液中に 20USIヌクレアーゼ (TA. pUC119を 用 い て 連 結 反 応 を 行 っ た 後 ， 大 腸 菌 KARA) を加え，3TCで反応を行った。 M V1 l84株を形質転換させた結果，数個のクロー SIヌ ク レ ア ー ゼ 末 端 を 平 滑 化 し た 各 DNAは ， 制 限 酵 素 Xba Iで 切 断 を 行 っ た 。 プ ラ ス ミ ド ンが得られ，以後このクローンを pUCT7とした ( F i g .l ) 。 pUpRD28は ， 7.5%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 得 ら れ た pUCT7が，実際に RNA転 写 活 性 を 泳動 (TBE緩衝液， 20mA定電流， 6時間〕し，約 持っているか，また，転写の方向がポリリンカー側 1300塩基対のバンドを切り出した。ゲルから回収 に向かつて行われるかを解析するために， pUCT7 した DNA断片と SIヌクレアーゼ処理後，制限酵 119-9と pUCT7 119-12をそれぞれ制限酵素 S c aI ， 素 Xba Iで切断したプラスミド pUCT7 119-12を EcoOl09，NaeIを用いて切断後， T7 RNAポリ TakaraDNAL igationKitを用いて連結し，この メラーゼを用いて転写反応を行った。 1 0 9 松村・上回・四方: イネ萎縮ウイノレス分節ゲノム 1 0番 RNA A E c o R I Scal T7ーー+ pUCT7 』 欝叩四時 E c o 0 1 0 9 E c oR I NaeI 』 3190bp A p o l yl i n k e r s t o p Sca 1 . 1 7 8 1b s t o p Eco0109 s t o P 2 8 3 2 b . Nae 1 B 2 2 8 8 b . N 1 2 3 4 5 6 7 8 91 0 1112 F ig .3 . A:P h y s i c a lmapo fpUCT7ande x p e c t e dl e n g t ho ft r a n c c r i p t sfrompUCT7which d i g e s t e dw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e s . B:A n a l y s i so ft r a n s c r i p t s from pUCT7v e c t o r DNA which d i g e s t e dw i t he a c h ，Eco0109，Nae1 .R e s t r i c t i o nenzymed i g e s t e dpUCT7 r e s t r i c t i o nenzymesSca 1 t 'st r a n s c r i p t swerea n a l y z e don1 .5%a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s . andi . l a n eN:pUCT71 1 9 9DNA pUCT71 1 9 9d i g e s t e dw i t h Nae 1( la n e1 )，Eco0109 ( la n e2 )，Sca 1( la n e3 ) andt r a n s c r i p t so fe a c hr e s t r i c t i o n enzyme d i g e s t e d pUCT71 1 9 9DNA，Nae 1 ( la n e7 )，Ec o0109 ( la ne8 )，Sca1( la ne9 ) . la n e4)，Eco0109 ( la n e5 )，S c a 1( la ne6 ) pUVT71 1 9 1 2d i g e s t e dw i t h Nae 1( andt r a n s c r i p t so fe a c hr e s t r i c t i o nenzymed i g e s t e dpUCT71 1 9 1 2DNA，Nae1 ( la n e1 0 )，Eco0109 ( la n e1 1 )，Sca 1( la n e1 2 ) Arrows i n d i c a t er e s u l t i n gt r a n s c r i p t s . 即ち，作成したベクターがポリリンカ一方向に働 くプロモーターを持っていれば，制限酵素 S c a '1で 度は，ベクタ -DNAを 切 断 に 用 い た 制 限 酵 素 に よって異なっていた ( Fig.3B)。 7 8 1塩 基 対 の RNAが，制 切 断 し た DNAか ら 約 1 即ち，制限酵素 Nae1切 断 さ れ た DNAか ら 転 o0109及び Nae1で切断された DNAか 限酵素 Ec F i g .2Al a n e 7， 写された RNAの移動度が最も遅く ( らは，それぞれ約 2 2 8 8，2 8 3 2塩基対の RNAが転 1 0 )，Sca1切断された DNAから転写された RNA 写されるはずである。 の移動度が最も早かった ( F i g .3Al a n e 9，1 2 )。この この DNAを用いて行った RNA転写反応産物を ことから両方のベクタ -DNAともポリリンカ一方 1 .5%アガロースゲル電気泳動解析した結果，予測 向に働く RNA転写プロモーターが組み込まれてい される位置に RNAのバンドが検出され，その移動 ることが明らかにされた。 1 1 0 北海道大学農学部邦文紀要 第 1 7巻 第 1号 G ATC < ( 1 ZI 001 C υl cl I ωl AA G ? で ωl T TT ωぷc= oa C ﹄ A C ﹄ OHOEgahト 日 「 一 同 、 A 5 ' end ATTAACAATGC TCGTTTGGCAC dHzouOF・ 0 ω ω G A TC 3 '-end 国 日g .4 . The5 ' e n da n d3 ' e n ds e q u e n c e so fi n s e r t e dcDNAf r a g m e n to fpUMRDI0 2 分節ゲノム 1 0番完全長 RNA転写ベクターの作 制限酵素 P s t 1で 切 断 し た 後 の ク ロ ー ン 成 pUpRD28及び，制限酵素 BglI Iで切断した後のク ローン pUCT7の両方とも， S1ヌクレアーゼで反 ， 1 0分 ， 1 5分でそれぞれ反応液の 応開始から 5分 一部を取り，反応を停止させた。これら両 DNAを DAN連結反応に用いた。 形質転換操作の後，得られたクローンのプラスミ ドDNAを抽出し， 1%アガロースゲノレ電気泳動に より分節ゲノム 1 0番 cDNAの組みまれた数個のグ ローンを得た。 これらのクローンの塩基配列解析した結果 3 '末 端に構築した E coRV認識配列の内， A が欠失し て い る こ と が 明 ら か に さ れ た た め ， gapped m u t a g e n e s i s法 6) を用いて修正し，欠失していた塩 F i g . 4 )。 基を挿入した ( また 5 '末端は，プロモーター配列のすぐ後に分 節ゲノム 1 0番の 5 '末端の配列が認められた ( F i g . 4 )。即ち，分節ゲノム 1 0番 RNAの最初の塩基か ら最後の塩基まで相同な配列の RNAを転写するク ローン pUMR DlOが得られた。 I nv i t r o分 節 ゲ ノ ム 10番 完 全 長 RNAの 転 写 0番 塩基配列解析の結果，完全長分節ゲノム 1 RNAを 転 写 す る こ と が 予 測 さ れ た ク ロ ー ン pUMRDlODNAを 制 限 酵 素 Ec oRVで 切 断 し た 後 ， T7RNAポ リ メ ラ ー ゼ 反 応 し た 反 応 産 物 を F i g .5 . T r a n s c r i p t so f pUMRDI0a n a l y z e do n1 . 5%a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s . l a n e1 :P l a s m i d pUMR DlOd i g e s t e dw i t h oR Ia n dEc oRV. Ec c oR IandE c o l a n e2 :T r a n s c r i p t sfromE RV digested fragment o f pUMR DlOby T7RND p o l y m e r a s e _ 長 RNAの転写反応が行われたことが確認された ( F i g . 5 )。 I V . 考 察 l .5%アガロースゲノレ電気泳動を行った結果，単一 本実験に用いたイネ萎縮ウイルスの属するレオウ の RNAバンドが認められ，分節ゲノム 1 0番完全 イルスグルーフ.では，末端の数塩基対が各分節ゲノ 松村・上回・四方: イネ萎縮ウイノレス分節ゲノム 1 0番RNA 1 1 1 この保存さ モーター配列をベクター pUC1 l9のポリリンカー上 れた配列の近傍に逆向き相同配列が存在することが に組み込み新しく RNA転写ベクター pUCT7を作 知られており l μム7)，イネ萎縮ウイルスの分節ゲノ 成した。 ムにおいて保存されていること，また， ムにも同様な配列が見いだされている 8.11)。これら 2 . 作 成 し た RNA転写ベクタ -pUCT7を 制 限 '末 端 の 非 翻 訳 領 域 の 配 列 が， i n の配列，及び， 5 v i v oまたは， i nv i t r oにおける翻訳調整を行ってい 酵素 S c a1 ，N ae 1 ，E c o O l 0 9でそれぞれ切断後， ることが明らかにされている 3.10)。 pUCT7ベクターがポリリンカ一方向に働く T7プ このような事実から，実際のウイルスゲノム T7 RNAポリメラーゼを用いて転写反応を行い， ロモーターを持っていることを確認した。 RNAの機能を解析するには，その cDNAを用い 3 .S lヌクレアーゼ処理により平滑末端を形成さ て完全にウイルスゲノム RNAと相同な RNAを試 せた完全長分節ゲノム 1 0番 cDNA断片と，同様な 験管内で合成する系を持つことが必要である。 平滑末端を形成させた RNA転写ベクタ -pUCT7 本実験では，イネ萎縮ウイルスゲノムの完全長 RNAを転写するベクタ一系を開発し，試験管内で 分節ゲノム 1 0番の完全長 RNAの転写を行うこと に成功した。 を用いて完全長分節ゲノム 1 0番の RNA転写ベク ター pUMR DlOを作成した。 4 .制限酵素E c o RV切 断 を 行 っ た pUMRD. 10DNAと T7RNAポリメラーゼを用いて試験管内 即ち， DNA合成装置により T7プロモーター配 で完全長分節ゲノム 1 0番 RNAの転写を行った結 列の 3 '末 端 に 制 限 酵 素 Bgl I I認 識 配 列 を 持 つ 果，完全長分節ゲノム 1 0番 RNAの転写が行われ DNA鎖を合成した。このプロモーター鎖をポリリ た 。 こ組み込んだ後， ンカ一部位を持つベクタ -DNAi 制限酵素 B glI Iを用いて切断し， S lヌクレアーゼ 処理により平滑末端を形成させた。 このようにして，プロモーター配列の直後に平滑 末端を形成させ，どの様な配列の DNAでも平滑末 端を形成させることによりベクタ -DNA配列が付 加される事なく期待する配列をもっ転写産物が得ら れることになった。 イネ萎縮ウイルス分節ゲノム 1 0番は， 5 '末端の 配 列 が 5)GGUAAA-ーであり， cDAN合 成 の 際 に 5 '末端に制限酵素 P s t1切断部位を構築することに より最初の塩基から始まる cDNAを得ることがで s t1で 切 断 きる。即ち，この cDNAを 制 限 酵 素 P し，更に末端を平滑にすることにより最初の塩基か ら始まる cDNA断片を得ることが可能となり，こ の cDNA断片を RNA転写ベクター pUCT7に挿入 することにより完全長の分節ゲノム 1 0番 RNAを F i g . 2 )。 転写させることが可能となる C この 5 '末端の 6塩基対はイネ萎縮ウイルス全分 節ゲノムに共通していると考えられるため，全ての 分節ゲノムにおいて同様の方法を用いることにより 完全長分節ゲノム RNA転写ベクターを構築するこ とが可能である。 V .摘 要 1 . DNA合成装置により合成した T7RNAプロ 引用文献 1 . ANTCZAK，J .B .，CHMERO，R . ， PICKUP，D .] . ， and ]OKLlK，W.K .( 1 9 8 2 ) "Sequence a tb o t h t e r m i n io ft h eg e n e so fr e o v i r u ss e r o t y p e3 0 7 3 1 9 . C s t r a i nD e a r i n g ) . "V i r o l o g y1 2 1，3 .V .，Xu，Z .，ASAMlZU，T .，andNuss， 2 . ANZOLA，] D .L .( 19 87 )" S e g m e n t s p e c i f i ci n v e r t e dr e p e a t s f o u n da d j a c e n tt oc o n s e r v e dt e r m i n a ls e q u e n c e i n wound tumor v i r u s genome and d e f e c t i v e .A c a d .S c i .USA i n t e r f e r i n gRNAs."P r o c .Natl 3 0 1 8 3 0 5 . 8 4，8 .V .，DALL，D .， . ] Xu ，Z .，andNussD 3 . ANZOLA，J L .( 19 8 9 ) "Complete nuc 1e o t i d e s e q u e n c e o f woundtumorv i r u sgenomics e g m e n t se n c o d i n g 2 2 n o n s t r u c t u r a lp o l y p e p t i d e s . "V i r o l o g y1 7 1，2 2 2 8 . .W.，BELLAMY，A .R . ， STREET，] .E .， 4 . BOTH，G andSIEGMAN，L .J .( 19 8 2 ) "Ag e n e r a ls t r a t e g y f o rc l o n i n gd o u b l es t r a n d e dRNA: N u c l e o t i d e s e q u e n c eo ft h es i m i a n 1 1r o t a v i r u sg e n e8 . " 5 . IBA，H.，WATANABE，T.，EMORI，Y.，and .( 19 8 2 ) "3d o u b l es t r a n d e d genome OKADA，Y segment o fb a c t e r i o p a g e φ 6have homologus 1 1 1 1 5 . t e r m i n a ls e q u e n c e s . " FEBS L e t t .1 4 1，1 87) 6 . KRAMER，W.，and FRITZ，H.]. (19 Methodsi nenzymology1 5 4，p p .5 5 5 . Academic c 1e i cA c i d sR e s .1 0，7 0 7 5 7 0 8 8 . P r e s sNu 1 1 2 北海道大学農学部邦文紀要第 1 7巻 第 1号 7 . 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UYEDA， T .，OHSHIMA，K .，MATUMURA，T .，and SHI KATA，E .( 19 8 9 )" N u c l e o t i d es 巴q u e n c eo fr i c e e g m e n t9"J .G e n .V i r ol . dwarfv i r u sg巴nomes 7 0，1 2 9 7 1 3 0 0 . Summary Igenomes e g m e n t so fav i r u si nt h eR e o v i r i d a e Al s h a r ecommon5 'and3 't e r m i n a ls e q u e n c e sands e g . m e n t s p e c i f i ci n v e r t e dr e p e a t s . Both t h ec o n s e r v e dt e r m i n a ls e q u e n c e s and s e g . m e n t s p e c i f i c domains o fi n v e r t e dr e p e a t sp l a ya s i g n i f i c a n tr o l ei nt h es o r t i n ganda s s e m b l yo fs e g . mentedRNA g e n o m e s . We t h e r e f o r e have c o n s t r u c t e dat r a n s c r i p t i o n v e c t o rt h a ty i e l d e dt r a n s c r i p t sc o n t a i n i n g5 'and3 ' t e r m i n a ls e q u e n c e si d e n t i c a lt oa u t h e n t i cRDVt r a n . s c r i p t s . S y n t h e s i z e d T7promotor DNA f r a g m e n t sw e r e s u b c l o n e di n t o pUC119v e c t o rt oc o n s t r u c tat r a n . s c r i p t i o nv e c t o r pUCT7.The pUCT7 1 1 9 1 2w h i c h i g e s t e dw i t hBglI I h a st r a n s c r i p t i o na c t i v i t y，wasd and t r e a t e dw i t hS In u c l e a s ef o rc o n s t r u c t i n ga b l u n te n da tt h e3 'e n do fpromotors e q u e n c e . 10ne pUpRD28 which has removed The c homopolymer f r a n k i n gs e q u e n c e from f u l ll e n g t h i g e s t e d cDNA o f RDV genome segment1 0，was d s t1andt r e a t e dw i t hS In u c l e a s et oforma w i t hP . b l u n te n da t5 'e n do ft h ecDNA Both SIn u c l e a s e t r e a t e d pUCT7v e c t o r a n d . T hen pUpRD28cDNA wered i g e s t e dw i t h Xba 1 cDNA f r a g m e n t o f pUpRD28was i n s e r t e d t o pUCT7t oc o n s t r u c tt h e RNA t r a n s c r i p t i o nv e c t o r Of romwhicht h eRDVgenomesegment1 0 pUMRDl wast r a n s c r i b e d . c o RV d i g e s t e d The t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yo fE pUMRDIOwas c o n f i r m e d by1 .5% a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i sa f t e rT7RNAp o l y m e r a s er e a c t i o n .