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Kaken / 科研費報告書
高等植物における高浸透圧シグナル伝達機
構の解明
小林, 裕子
小林裕子, 2008.
平成18年度∼平成19年度科学研究費補助金 (基盤研究(C)) 研究成果報告書
http://hdl.handle.net/10076/9360
高等 植 物 に お け る 高 浸 透 圧 シ グ ナ ル 伝 達機 構 の 解 明
課 題 番 号1 8 5 7 0 0 3 8
平 成1 8 年 度 平 成1 9 年 度 科 学 研 究 費 補 助 金
( 基 盤 研 究 ( C ) ) 研 究 成果 報 告 書
-
平 成2 0 年 4 月
`
研 究代 表 者 小 林 裕 子
三 重 大 学 生 命 科 学 研 究支 援 セ ン タ
ー
･
学術研 究 員
は じめ に
水 ス トレ ス を 受 けた 植 物 は そ の 合 成 移 動 を介 し て 植 物 ホ ル モ ン ア ブ シ ジ ン 酸( A B A ) の 濃
度 を 上 昇さ せ 気 孔 の 閉 鎖 や 遺 伝 子 発 現 な ど様 々 な応 答 現 象 を 引 き起 こ す また
方で
A B A を介さず に 遺 伝 子 発現 を誘 導す る 水 ス トレ ス 応 答 経 路も知られ て い る A B A の 濃 度 上 昇
に 至 るシ グナ ル 経 路も A B A 非 依 存性 で あると言 える 水 ス トレ ス は 細 胞 レ ベ ル ある い は 実 験
的 に は 浸 透 圧 ス トレ ス として 扱 われる 酵 母 や ほ 乳 類 の 場 合 と同 様 植 物 に お い て も 浸 透 圧
ス ト レ ス に 応 答 し て ある特 定 の M A P ki n a s e ( M A P K ) カ ス ケ
ドが 活 性 化される こ と が 示 され て
い る しか し
方 で M A P K カ ス ケ ドとは 異 なる 高 浸 透 圧 に よ っ て 活 性 化 される 4 0 4 2 K D a
の s e r/t h r p r o t e i n k i n a s e ( P K) が 種 々 の 植 物 に お い て 報 告 され S N F l r e 一a t e d
p r otei n
ki n a s e 2 ( S n R K 2 ) フ ァ ミリ
バ
に 属するタ コ A S K l ホ モ ロ グ ダ イ ズ s p K l お よ び S P K 2 は こ
の 4 0 4 2 K D a の P K に 対 応すると考えられ て い る コ ム ギ の A B A 誘 導 性 P K P K A B A も 同 フ
ァ ミリ
に 属 し オオ ム ギ ア リ ユ
ロ ン 層 に お い て 過 剰 発 現させ ると α a m l a s e プ ロ モ
タ な
y
ベ
ど の ジ レ リン ( G A ) 誘 導性 の 転 写 を抑 制 する こ とか ら G A シ グ ナ リ ン グ の A B A に よ る抑制 経
路 に お い て 機 能す ると報告され て い る
方 同 フ ァ ミリ に 属 す る ソ ラ マ メ の 孔 辺 細 胞 特 異 的
A A P K は A B A に よる 活性 化 を受 け A B A の 受 容 か ら気孔 の 閉 鎖 に 至 るシ グ ナ ル 伝 達 系 に お
い て 機 能 する ことが そ の d o m i n a n t n e g a ti v e 型 変 異タン パ ク質を発 現させ る実 験 か ら示 唆さ
れ て いる
我 々 は イネゲ ノ ム 中 に 存 在 し て い る 1 0 個 す べ て の S n R K 2 フ ァ ミリ メ ン バ をクロ
ニ ン グ
し そ れ らを S A P K l
1 0 と命 名 した こ れ らの 機 能を明らか に す る 目 的 で H i s a 斤i nit y t a
g およ
び H A e p it o p e t a g を 付 けた S A P K を イネ プ ロ トプラ ス トで 過 的 に 発 現 させ た そ の 結 果 1 0
個 全 て が 浸透 圧 ス トレ ス に よ っ て 活 性 化され る こ と が 明ら か とな っ た さら に 興 味 深 い こ と に そ
･
､
一
､
｡
､
｡
｡
.
｡
､
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ー
一
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1
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ー
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-
､
､
一
ー
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､
､
､
､
｡
ー
ー
ー
-
､
-
o
-
一
｡
､
｡
の うち の 3 つ は A B A
に よ っ て も活性 化される ことが 明ら か に な っ た こ の こと は S n R K 2 フ ァ ミ
リ 全体 が 浸 透 圧 ス トレ ス 応 答 に 関わ っ て い る こ と ならび に そ の 内 の い くつ か は A B A シ グ ナ
リ ン グとの ク ロ ス ト ク にも関与 して い る 可 能性 を 示 し て い る
｡
､
ー
､
ー
｡
以 上 の ような研 究 の 経 緯 か ら S
n R K 2
フ ァ ミリ
の P r o t ei n k i n a s e( P K) が 高 浸 透 圧 ス トレ ス
伝 達 系 に お い て 重要 な役 割 を果 た して い る ことが 明らか となり こ れら の P K を
中 心 とし た解 析 を進 め る こと に より 浸透 圧 ス トレ ス お よ び A B A シ グ ナ ル 伝 達 経 路 に 関 する有
用 な知 見 が 得 られ ると考 えられる 我 々 は S A P K が 高 浸 透 圧 ス トレ ス に 応 答 して 速 や か ( 1 分
以 内) に 活 性 化 される こと ならび に こ の 活 性 化 は 未 同 定 の 上 流 キ ナ
ゼ に よる リン 酸 化 に よ
るも の で ある こ とを明らか に し て きた こ の ような こ れ ま で の 成 果 に 基 づ き 本 研 究 で は S A P K
-
､
応答
の シグナ ル
､
､
｡
ー
､
｡
､
をリン 酸 化 し 活 性 化 する 上 流キ ナ ゼと S
行 した そ の 結 果 は 以 下 の 通りで ある
ー
､
｡
( 1) S
A P K
の標
的 因 子 を明らか に する 目的 で 研 究 を遂
｡
A P K 2 のin
に お ける標 的基 質 の 同 定
vi v o
高 塩 処 理 と無 処 理 の 培養 細 胞 か ら抽 出 したタ ン パ ク質 を それ ぞ れ を 二 次 元 電 気泳 動 に よ
っ て 展 開 し リン 酸 化タン パ ク 質を特 異 的 に 染 色 する ことが で きる P r o
Q Di a m o n d に よっ て 染
色 後 両 区 を 比 較 する ことに よ っ て 高 塩処 理 に よ っ て リン 酸 化され るタン パ ク質を選 抜 し た 選 抜
し た ス ポ ッ ト に つ い て T O F M A S S に よりタ ン パ ク 質 を 同 定 し た 結 果 α
チュ
ブリ ン
､
､
｡
-
-
-
､
､
-
i
-
､
S E C 14
ホモ
ロ
ー
グ
､
H S P 70
であっ た
｡
これら の タン パ ク質を 大 腸
質となる か 否 か を検討 した 結 果 α
チュ
ブリン と H S
る ことか らと S A P K 2 の 基 質 で ある 盲絹副生が 示 唆され た
P 70
ー
-
-
.
-
､
( 2)
S A P K
活 性 化 に 関 わ るプ ロ テ イ ン キ ナ
ー
菌 で 発 現させ S A P K 2 の 基
に よ っ て リ ン 酸 化され
､
は S A P K2
o
ゼの 同定の 試み
結合 部 位 の リ ジン を ア ラ ニ ン に 置 換 し た 不 活 性 型 S A P K 2 ( S A P K
質 して S A P K キ ナ ゼ の 特徴 調 べ た結 果 S A P K キ ナ ゼ は カ ル シ ウ ム 依 存 的 に
ン 酸 化 こ とが 明 らか とな っ たが そ の 候 補 の 同 定 に は い た らな か っ た
S A P K2 の AT A
ー
-
､
S A P K
を基
をリ
｡
,
こ れら の
2 K/ A )
研究結果 の
部 は 関 連 学 会 に て す で に 公 表 し て い る 本 書 は こ れら の 内 容 を中
心 に 取りまと め 科 学 研 究 費補 助 金く基 盤 研究( c )) の 研 究 成 果 報告 書 とし た
一
､
｡
､
｡
平成20 年4 月
研究代表者
-
11
一
小林 裕 子
研 究組 織
研究代表者
小 林裕 子(
:
重 大 学生 命 科 学 研 究 支 援 センタ
三
ー
学 術 研 究 員)
･
交付 決定額
( 金 額 単 位 = 円)
直 接経 責
平 成 1 8 年度
2 300 000
平 成 1 9 年度
1 300 000
総計
3 6 0 0 00 0
,
間接経費
.
0
,
,
｣
,
,
合計
,
2 3 00 0 00
,
,
39 0 00 0
,
1 6 90 0 00
39 0 00 0
3 9 90 0 00
,
,
,
,
,
研 究発表
(1)
雑誌論文
1
.
Y
u
h k o K o b a v a shi
a n
d l s s e i K o b a y a s hi
D e p ol y m e ri z 占
ti o n o f th e a c ti n c y t o s k e l e t o n i n d u
J o u r n a l o f G e n e r a I pl a n t P a th o l 2 0 0 7 年 1 0 月
.
2
･
c
e s d ef e n s e r e s p o n s e s i n t o
＼
J ol 7 3
､
36 0 3 6 4
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acc o
pl a n t s
.
-
.
,
.
l s s e i K o b a y a s hi M a s a k o Y a m a d a a n d Y u h k o K o b a v a s h i
C al ci u m i o n i s a s p e cifi c p r o m oti v e f a c t o r f o r s u c c e s s f ul p e n e t r a ti o n o f p o w d e ry m i一d e
t o b a rl e y c ef暮s J o u r n al of G e n e r al P l a n t P a th oE 2 0 0 7 年1 2 月 V o L 7 3 3 9 9 4 0 4
,
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w
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g暮
1
‥
.
( 2)
.
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,
学会発表
1
.
伴 佳 典 小 林 裕 子 筒 井 悠 小)l[ 大 輔 武 田 真 服 部 束 穂
イネ α t u b u li n サ ブ ユ ニ ッ トは 高 浸 透 圧 ス トレ ス に 応 答 して 迅 速 に リン 酸 化 され る 日 本 分 子 生 物 学
会 横 浜 市 平 成 1 9 年〔2 0 0 7 〕1 2 月
､
､
､
､
｡
､
-
.
､
2
.
｡
､
小 林裕 子
鈴 木雅 志 竹内竜 馬 荒川 勉 島田 真 奈美 小 林 成
イネ の い もち 病 抵 抗 性 機 構 に お ける2 つ の 低 分 子 量 G タン パ ク質 O
析 日 本 植 物 生 理 学 会 札 幌 市 平 成 2 0 年〔2 0 0 8 〕3 月
一
､
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｡
(3)
､
､
､
｡
,
3
sR ac
及 びO
s
R a c 5 の 機 能解
0
､
図書
1
.
服 部束穂 小 林裕子
高 浸 透 圧 ス トレ ス 応 答 に お け るア ブシ ジ ン 酸 の シ ナ ナノレ伝 達 に 関 す るプ ロ テ イ ン キナ
プ ロ テ イン キ ナ ゼを中 心 として ｢ 植 物 に お け る環 境 と 生 物 ス トレ ス に 対 す る応 答｣
蛋 白質 核 酸 酵素 別冊 5 2 巻 p p 5 5 7 5 6 4 2 0 0 7 年
､
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ゼ
ー
S
n R k 2
ー
.
-
､
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･
l s s ei K
｡
､
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y a s hi a n d Y u h k o K o b a v a s hi
M i c r ot u b ul e s a n d P at h o g e n D ef e n c e [ n Pl a n t M i c r ot u b uJ e s ? D e v el o p
B y N i c k P ) S p ri n g e r V e r[ a g H eid elb e r g N e w Y o r k T o k y o 2 0 0 8 年
,
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.
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e n t a n d F[ e xi b i[it y
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( ed
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目次
( 1)
イネ S
･
=
･
-
-
高等植物
･
プロ テ イン キナ
R K2
-
ゼ ( D 活性 制御
大 量 発現 系 の 構 築と組 換 え タ ン パ ク質 の 性 質を中心として
一
( 2)
n
･
=
･
-
-
･
1
に お ける高 浸透 圧 ス トレ ス 応 答 の シ グナ ル 伝 達 機 構
-
･
t
65
-
1V
-
イネ S
n
一
第
プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ の 活 性制 御
大 量 発 現 系 の 構 築と組 換 えタン パ ク質 の 性 質 を中心 とし て
R K2
章
一
-
序論
植 物 は 動 物と異 なり自ら移 動 が で きな い た め 環 境 変 化 に 速 や か に 応 答 適 応するた め の き
わ め て 精 巧 な機 構を備 え て い る 水 ス トレ ス す な わ ち 水 分 欠 乏 条件 下 で は 植 物細 胞 は 高 浸
透 圧 ス ト レ ス を受 け たときと同 じ状 態となる 高 浸 透 圧 ス トレ ス に さらされ た 植 物 細 胞 は 遺 伝
･
､
｡
､
､
｡
､
子 誘 導 やタン パ ク質 機 能 変 更修 飾 などを介 し て
細 胞 機 能 を保 護 し 植 物 全 体 を健 全 に 保 とう
とする ( B r a y 1 9 9 7 ; X i o n g a n d Z h u 2 0 0 2 ; Z h u 2 0 0 2) 細 胞 内 成分 を 変性 や 酸 化 か ら保 護
す る機 能 を持 つ タ ン パ ク質 や 浸 透 圧調 節 物 質 ( プ ロ リ ン グ ル タミン 酸 など) の 生 合 成 酵 素
ドす る 遺 伝 子 群 が ス トレ ス に よ っ て 誘 導 され る こ とが 知 られ て い る ( D el a u n e y a n d
をコ
,
､
､
,
｡
,
､
､
ー
V
1 9 9 3; O
e t a 暮,
2 0 0 3; S hin
ki 1 9 9 6
気孔
制 御 を は じ め とす る 様 々 な ス ト レ ス 応 答 調 節 に 関 わ る 植 物 ホ ル モ ン ア ブ シ ジ ン 酸
( A B A) 合成も 水 分 欠 乏 に よ っ て 誘導される ( Z e e v a a 代 1 9 9 9 )
こ れ ま で 水 分 欠 乏 ある い は 浸透 圧 ス トレ ス 応 答 お よ び それ ら の シ グ ナ ル 伝 達 に 関す る数 多
くの 研 究 が 主 に 生 化学 的 生理 学 的ある い は 分 子 生 物 学 遺 伝 学 的 ア プ ロ チ に よ っ て 行 わ
れ て きた ( B r a y 1 9 9 7 ; K n ig h t 2 0 0 0 ; X i o n g a n d Z h u 2 0 0 2 ; X i o n g e t a l 2 0 0 2 ; Z h u e t a ‡
er m
a
開閉
,
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2 0 0 0)
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､
,
1 9 9 7; Z h
u
,
,
2 0 0 2)
その 結 果
｡
､
.
,
プロ テイン キ ナ
ー
ゼ およびプ ロ テイン フォ ス
,
ー
､
､
ー
､
M
u n nik e
t
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1999
2 0 0 0; P ic aJ
e t a暮 ,
1 9 9 9; W
,
ゼとい っ たシ
セ カ ン ドメ ッ セ ン ジ
ファタ
グ ナ ル 伝 達 因 子 や カ ル シ ウ ム イオ ン リン 脂 質 イ ノ シ ト ル リン 酸な ど の
ャ
ならび に そ れ らを合 成 す る酵素 の 関 与 が 明ら か に され て きた ( D e W
､
.
a ]d
ー
et
al
=
2 0 0 1;
a n g 1 9 9 9; X io n g et al
2 0 0 2) し か し それ
ら 因 子 全 て が 同 じ シ グ ナ ル 伝 達 経 路 で 作 用 する の か それ らが 主要 な シ グナ ル 伝 達 経 路 の 中
心 的 因 子 な の か ある い は 他 の シ グ ナ ル と相 互 作 用 する ような因 子 な の か また カ ス ケ ドを
構 成 するそれ ぞ れ の 因 子 が 直接 の 上 流 因 子 か ら情 報 を 受 けとる こ とに よりど の ような 分 子 的
変 化 を 引 き起 こ す の か そ し て 次 の 因 子 に ど の ような分 子 的 変 化をも た らす か など 多くの 問
題 は 未 解 明 の まま で ある
プロ テ イン キナ
ゼ は 多くの 他 の シ グ ナ ル カ ス ケ ドと 同様 浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル 伝 達 に
･
,
,
.
.
,
,
｡
､
､
ー
､
､
､
､
｡
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-
､
､
お い て も重 要 な役 割を果た し て い ると思 わ れ る ( Z h u 2 0 0 1 2 0 0 2) 浸 透 圧 お よ び そ の 他 非 生
物 的 生 物 的 ス トレ ス の シ グナ ル 伝 達 に カ ル シ ウ ム イ オ ン が 関 与 し て い る こ とが 知られ て おり
ス ト レ ス に 応 答 し て 細 胞 内 カ ル シ ウ ム イ オ ン 濃 度 の 上 昇 を 引 き起 こ す こ とが 示 され て い る
( K nig h t 2 0 0 0) カ ル シ ウ ム 依 存 性 プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ ( C a 2 + d e p e n d e n t p r o t e i n ki n a s e ;
,
｡
,
t
､
ー
-
,
C D P K)
らの
｡
は 水 分 欠 乏を含む 様 々 な非生 物 的 ス トレ ス に より誘 導さ れる こ とか ら C D P K
､
ス トレ ス シ グナ ル 伝 達 に 関 与 して い る ことが 示
が これ
唆され て い る ( U r a o e t a l 1 9 9 4 ) さら に
イネ C D P K の 1 つ O s C D P K 7 を過 剰 発 現 させ ると低 温と浸 透 圧 ス トレ ス に 対 する耐 性 を
示 す ように なる ことも報 告され て い る ( S a ij o e t a L 2 0 0 0) こ の ような結 果 か ら C D P K は おそ
らく浸透 圧 ス ト レ ス シ グナ ル 伝 達経 路 で 重 要 な役 割 を果 た し て い ると考 え られ る トウ モ ロ コ シ
の 葉 肉細 胞 プ ロ トプ ラ ス トに お い て シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ C D P K
A t C D P K l の 構 成 的 活 性 型を発
現 させ ると ス トレ ス 誘 導 性 の H Ⅵ＼1 遺 伝 子 の プ ロ モ タ が 活 性 化され る こ とも報 告され て
おり C D P K が ス ト レ ス シ グ ナ ル 伝 達 に お い て 主 要 な機 能 を演 じ て い る こ と は 間違 い なさそう
で ある ( S h e e n 1 9 9 6)
ス ト レ ス シ グ ナ ル 伝 達 で 重要 な役 割 を担 っ て い ると考 え られ る別 の C a 2 + 制 御 型 プ ロ テ イ ン
.
｡
,
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｡
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1
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ki n
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ゼ 群 とし
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R K3
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d H
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テ イ ン キナ
ミリ
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-
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B li k e p
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c a
と 相 互 作 用 する こと に より C
ー
et
( C IP
塩 濃 度 ス トレ ス 下 に お い て
維 持 に 関 わ る こ とが 示 され
､
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2 0 0 0; L
,
K/ P K S
N
の
(S O S 2
が あげられる ( G u o
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2 0 0 0; L
,
と
ン
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(( 1i u
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et
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L
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2 lik
C
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L
2 0 0 2)
.
こ れら
｡
カ ル シ ウ ム イオン セ ン サ
､
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bi n d i n g p
+
r otei n
)
の 制 御 を受 ける こ とが 分 か
+
2 0 0 1;
,
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ファ
て いる
2 0 0 2 ; Li u a n d Z h u 1 9 9 8 ; G u o e t
S O S 3 (C B L/ S c a B P の
つ) の 複 合 体 は
u a n
つ)
一
/Ll +
a +
et
(S O S
a
al
,
ー
タ
,
､
活性 を制 御 し て イ オ ン ホメ オ ス タ シ ス
また P K S 3 と S c a B P 5 の 複 合 体 は
の
ー
2 0 0 2)
,
.
高
一
｡
､
シ グ ナ ル 伝 達 に 関 与 し て い る ことが 報 告され て い る
A B A
ー
KS
)/ P
kin
.
S O S 2
､
1 n t e r a cti n
r elat e
2 0 0 1; Ki m
,
-
ゼ は それ 自 身 で は カ ル シ ウ ム イオ ン と結 合 せ ず
ー
特 定 メン バ
.
'
BL
d p r o t e i n ki n a s e 3) フ ァ ミリ
1 9 9 8; H r a b a k et a L 2 0 0 3; Liu et a L
( c a l ci n e
( A [ b r e c h t e t al
2 0 0 1) 例 え ば
(C
C JP K
(S N F l
a rdie
ある C B L
で
て
(G
u o
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al
.
2 0 0 2;
,
Ki
m
e
t
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.
,
同様 に C B L l は こ れと相 互 作 用 する C ) P K ととも に 浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル 伝 達
経 路 で 重 要 な役 割 を果 たし て い る こ と が 示 唆され て い る ( C h e o n g e t a ‡ 2 0 0 3)
酵 母 で は 高 浸 透 圧 ス ト レ ス シ グ ナ ル は セ ン サ で ある ヒ ス チ ジ ン キ ナ
ゼ に よ っ て 感 知さ
れ ヒ ス チ ジ ン と ア ス パ ラ ギ ン 酸 残 基 間 で の リン 酸 リ レ を経 て m it o g e n a cti v a t e d p r o t e i n
2 0 0 3)
.
､
､
,
.
0
ー
ー
､
ー
-
､
カス ケ
ドに 伝 達され 防御 反 応 を示 す ( M a e d a e t a l 1 9 9 4) シ ロ イヌ ナ ズ
ナ に お い て も 乾燥/ 高 浸 透 圧 誘 導 性 の セ ン サ 様 ヒ ス チ ジ ン キ ナ
ゼ A t H K l が 同 定さ れ
酵 母 の セ ン サ キ ナ ゼ 変異 体 を相補 し て 高 浸透 圧 ス トレ ス 耐 性 を 回 復 さ せ た こ とか ら 植 物
に お い て もセ ン サ
様 ヒ ス チ ジ ン キ ナ ゼ が 浸 透 圧 ス ト レ ス セ ン サ として 機 能 し て い る 可 能
性も 示 唆され て い る ( U r a o e t a L 1 9 9 9 ) 浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル 伝 達 に 関 与 し て い ると思 わ
れ る M A P K と M A P K ki n a s e ( M A P K K) が ア ル フ ァ ル フ ァ ( S I M K K S [ M K ; K i e g e rl e t a [
2 0 0 0) やタ バ コ ( N t M E K 2 S [ P 付V Ⅵ P K ; Y a n g e t a l 2 0 0 1) に お い て 同 定 され て い る ま た
シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の M A P K の うち A l M A P K 4 お よ び A t M A P K 6 が 高 浸透 圧 ス ト レ ス に よ っ て
活 性 化 される こ とも報 告され て い る (書c h i m u r a e t a L 2 0 0 0) し か し 同 じ M A P K カ ス ケ ド
が 浸 透 圧 ス ト レ ス だ け で は なく低 温 や 傷 あ る い は サ リ チ ル 酸 H 2 0 2 や エ リ シ タ など の シ
ki n
a s e
A P K)
(M
ー
､
,
.
.
,
ー
ー
､
,
ー
ー
､
ー
-
ー
.
,
-
.
,
-
.
,
｡
､
l
､
ー
,
｡
,
ー
､
グナ
ル
M ik o ( aJ
2 0 0 1;
分 子 に よっ
k
C Zy
N
A N Pl
u
h
et
s e
aJ
et
.
て
20 00; Z h
,
L
a
も 活 性 化 され る
,
2 0 0 0)
､
こ とが
報 告 され
て い
る (H oy
g a n d Kl e s s lg 1 9 9 8 ; Y u a s a e t a l
シ ロ イヌ ナ ズ ナ の M A P K k i n a s e ki n a
a n
｡
,
構 成 的 活 性 型 を発 現 させ ると
.
o s
a n
Zh
d
2 0 0 1; D
,
s e
(
a n
9
,
e si k a n
M A P K K K)
2 0 0 0;
e
t
al
の 1
.
,
つ
お よ び 6 が 活 性 化 され G S T 6 や
H S P 1 8 2 の ような酸 化 ス ト レ ス 誘 導 性 プ ロ モ
タ が 活 性化され る こ とが 観 察され た が A B A
/ 乾 燥/ 低 温 誘 導 性 R D 2 9 A プ ロ モ
タ の 活 性 化 は み られ な か っ た ( K o v t u n e t a L 2 0 0 0) さ
バ
コ
ロ
らに タ
で A N P l の オ ル ソ グ で ある N P K l を 構 成 的 に 発 現させ ると 凍 結 高 温 高
塩 濃度 など幅 広 い ス トレ ス に 対 して 耐 性を示す ことも報 告され て い る ( K o v t u n e t al 2 0 0 0) こ
れ ら の こ とをあ わ せ て 考 えると M A P K は酸 化 的 ス トレ ス を 伴 う広 汎 な ス ト レ ス 応 答 に 関 わ る
の
At M A P K 3
-
､
4
,
ー
,
､
-
-
｡
,
､
､
､
.
､
,
｡
､
ス ト レ ス シ グナ ル
伝 達 に お い て 機 能 して い るも の と推 測される
タ バ コ 培 養細 胞 ある い は 葉 の 抽 出 液を用 い て m y e li n b a si c p r o t e i n ( M B P) を 基 質 に し た ゲ
ル 内 リン 酸 化 ア ツ セ イを行うと 上 述 の M A P K ととも に 4 0 k D a 周 辺 に 浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ
て 速 や か に 活 性 化される C a 2 + 非依 存 的プ ロ テ イン キ ナ
ゼ が 検 出される ( D r o ‖a rd 2 0 0 0 ;
H o y o s a n d Z h a n g 2 0 0 0 ; M i k o f aj c z y k e t a L 2 0 0 0 ; M o n k s e t a l 2 0 0 1 ) ま た ア ル フ ァ ル フ
ァ ( M u n n ik e t a l 1 9 9 9) や シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 培養 細 胞 ( D r o ‖a r d e t a L 2 0 0 2) に お い て も同様
の 結 果 が 報 告され て い る こ の ような 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ て 活 性 化され るプ ロ テ イ ン キ ナ
ゼとし て 4 2 k D a プ ロ テ イ ン キナ ゼ が タバ コ 培 養 細 胞 か ら精 製さ れ た ( M ik o l aj c z y k e t a l
｡
､
ー
,
,
,
.
=
,
｡
､
,
-
｡
-
.
-a
.
1
,
プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ は そ の 部 分 ア ミノ酸 配 列 の 相 同性 か ら S n R K 2 フ ァ ミリ に
属 する シ ロ イヌ ナ ズ ナ A S K l の ホモ ロ グ で ある こと が 示 され た ( H a (f o rd a n d H a r di e 1 9 9 8 ;
H r a b a k e t a L 2 0 0 3) 最近 に な っ て K e l n e r ら ( 2 0 0 4) に より こ の 4 2 k D プ ロ テ イン キ ナ
ニ ン グされ
ゼ は N t O S A K として ク ロ
生 化 学 的な特 徴 が 報 告され て い る
マ
方 ソ ラ メ の 孔 辺 細 胞 か ら は A B A に よ っ て 活性 化され る S n R K 2 フ ァ ミリ の プ ロ テ イ
ン キナ
ゼ A A P K ( a b s ci s i c a cid a cti v a t e d p r o t e i n k i n a s e) が 精 製され ク ロ ン 化され て
2 0 0 0)
この
｡
ー
ー
､
,
ー
｡
,
､
､
ー
､
｡
一
ー
､
ー
ー
-
､
いる
( Li
a n
d
A
s s m a n n
1 9 9 6 ; Li
,
et
a
L
,
2 0 0 0)
｡
キナ
ゼ 活性 を 持 たな い ドミナ ン トネ ガテ ィ ブ
ー
型 の A A P K 変 異 タン パ ク 質を 孔 辺 細 胞 プ ロ トプラ ス トで 過 剰 発 現させ ると A B A に よ る陰 イ
オ ン チ ャ ネ ル の 活 性 化 が み られ なくなり そ の 結 果 A B A に よ る気 孔 の 閉 鎖 が み られ なくなる
ことが 示 され て い る ( Li e t al
2 0 0 0) また シ ロ イヌ ナ ズ ナ に お い て も A A P K と高 い 相 同 性
示
S
n
R
K
2
フ
ミ
の
プ
ロ
を す
ァ リ
テ イ ン キナ
ゼ O S T l / S R K 2 E が A B A に よ っ て 活 性 化さ
れ る こ と ならび に A B A に よる気 孔 の 閉 鎖 や 遺 伝 子 発 現 誘 導 に 関与 す る こ とが 報 告され て
､
､
.
､
｡
,
､
ー
ー
､
いる
M
u sti[fi e
'
'
さらに コ ム ギ ( T ritl c u m a e s tI v u m ) で は
S n R K 2 フ ァ ミリ
に 属 する P K A B A l が A B A に よ る発 現 誘 導 を受 ける こと ならび に こ れ を
ユ
ロ
アリ
ン層 におい て
過 的 に 過 剰 発 現させ るとジ ベ レ リン に よ る ロ a m yJ a s e 遺 伝 子 プ ロ
モ
タ の 活 性 化 が 抑 制される こ とか ら ジ ベ レ リ ン 応 答 の A B A に よ る抑 制 制 御 系 の シ グ ナ
ル 伝 達 - の 関 与 が 示 され て い る ( G o m e z C a d e n a s e t a L 1 9 9 9 2 0 0 1 ; S h e n et a L 2 0 0 1 ;
(
t
a[
2 0 0 2; Y
,
.
o s
h id
et
a
aJ
.
,
2 0 0 2)
｡
､
ー
､
ー
一
ー
ー
ー
､
-
,
J
h
o
S
et a】,
n s o n
R K2
.
フ ァ ミリ
2 0 0 2)
,
,
0
の プ ロ テ イン
エ チ レン
キ ナ ゼが 傷 浸 透 圧 ス トレ ス 低 温 エ リシ タ
A B A など様 々 な シ グナ ル 伝 達経 路 に 関 与 し て い る p h o s p h a tid i c a cid ( P A ) の タ ゲ ッ トとな
っ て い る可 能 性も 示 唆され て い る ( T e s t e ri n k e t al
2 0 0 4) また N t O S A K の 高 浸透 圧 ス トレ
ス に よ る活 性 化 に
酸化 窒 素 が 関わ るとい う報 告 が なされ て い る ( L a m o tt e e t a L 2 0 0 6)
S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ は N 末 端 側 の よく保 存 され たキ ナ ゼドメ イ ン と C 末 端 側 の
制 御 領 域 と考 え られる酸 性 アミ ノ酸 に 富 む ユ ニ
クな領 域 か らなる ( 図 1 ; H a lf o r d a n d H a rd i e
n
ー
ー
ー
､
､
､
､
､
､
ー
.
,
｡
,
一
.
,
ー
ー
､
､
ー
,
1 9 9 8; H
キナ ゼドメ イン の アミノ 酸 配 列をもとに 系 統 樹 を書くと 大きく分
ブ
の サ クラ ス に 分 か れ る ( 図 2 ; K o b a y a s h i e t aI 2 0 0 4 ) 当 研 究 室 で
は イ ネゲ ノム に コ
ドされ る 1 0 個 の S n R K 2 フ ァ ミリ メ ン バ
S A P Kl
S A P KI O を
全 て ク ロ ン 化 し 機 能 解 析を 進 め て き た こ れ ま で に こ れ ら全 て の メ ン バ が 高 浸透 圧 ス ト
レ ス に よ っ て 速 や か に 活 性 化 され る こ と なら び に そ の うち サ ブク ラ ス Ⅲ に 属 す る 3
つ
S
A
P
K8
9
お よ び 1 0) は A B A に よ っ て も 活 性 化 さ れ る こ と な ど を他 の 植 物 由 来 の
(
S n R K 2 プロ テ イン キ ナ
ゼ に 先 駆 け て 明 ら か に し た ( K o b a y a s hi e t a l 2 0 0 4) さら に
S n R K 2 プロ テイン キ ナ
ゼ の 活 性 化 は リン 酸 化 に よ っ て 制 御され て い る ことや A B A シ グ ナ
ル が C 末 端領 域 に よ っ て 認 識される こ とも 同 時 に 報告 し た ( K o b a y a s h i e t a l
2 0 0 4) 続 い
けて
Ⅰ
､
b
ra
Ⅱ
､
k
a
et a]
.
Ⅲ の 3
,
2 0 0 3)
ー
.
､
つ
.
ー
ー
.
,
-
ー
､
ー
ー
､
｡
,
､
､
ー
.
｡
,
､
ー
､
.
て
シ ロ イ ヌ ナズ ナ に お い て も 1 0
,
｡
個 の S n R K 2 フ ァ ミリ の プ ロ テ イン キナ ゼ の うち 9 個
が 浸 透 圧 ス ト レ ス に よ っ て 活 性 化され そ の うち の サ ブク ラ ス Ⅱ およ び Ⅲ に 属 す る 5 個 が
A B A に より活 性 化される こ と 低 温 で は どれも 活性 化 され な い こ とが 示 され た ( B o u d s o c
q et
aJ
2 0 0 4) さら に シ ロ イヌ ナズ ナ の S n R K 2 フ ァ ミリ
の プロ テイン キナ
S
R
K
ゼ
2 C は主
に 根 端 で 発 現 が み られ 浸 透 圧 ス ト レ ス に よ っ て 誘 導 および 活 性 化を 受 け 過 剰 発 現 体 や
T D N A 挿 入 変 異 体 の 解析 か ら ス トレ ス 応 答 性遺 伝 子 発現 を制 御 す る こと に よ っ て 乾 燥 耐 性
に 関 与 する こ とを 示 唆する報 告 が なされ た ( U m e z a w a e t a J 2 0 0 4)
S n R K 2 プロ テ イン キナ
ゼ の C 末 端 領 域 は さら に 2 つ の 領 域 に 分 け られ る ( 図 1 ;
､
ー
ー
､
､
ー
-
.
,
.
､
､
､
-
､
.
ー
､
3
,
.
Yb
ゼドメイ ン に 続く約 3 0 アミノ酸 か らなる領 域 ( ドメ イン 1) お よ
びそ の 後 に 続く約 4 0 ア ミノ 酸 か らなる 領 域 ( ドメイン 2) で ある ドメイン 1 は S n R K 2 フ ァ
ミリ
全 体 で 比 較 的 相 同性 が 高 い
方 ドメイ ン 2 は 酸 性 ア ミ ノ 酸 を多く含 み サ ブク ラ ス
Ⅰ とサ ブクラ ス Ⅱ お よ び Ⅲ の 問 で 大きな違 い が 見られる 当研 究 室 で は A B A に よ る活 性 化
を受 けな い S A P K 2 と 活 性 化 を受 ける S A P K 8 の ドメイ ン 交 換 実 験 に より S A P K 2 の C
末 端領 域 全 体 を S A P K 8 の それ に 置 換 すると 弱 い な がらも A B A に よ る活 性 化 を 受 ける よ
s
h id
a
et
aL
2 0 0 6)
,
キナ
｡
ー
｡
ー
I
､
-
｡
､
､
､
｡
､
､
､
うに なる こ とを報告 した ( K o b a y a s h i e t a l 2 0 0 4) シ ロ イヌ ナ ズ ナ に お い て は O S T l / S R K 2 E
の C 末端 領 域 の ドメイ ン 2 を欠 失 すると A B A に よる活性 化 が起 こ らなくなる
方で C 末
端 領 域 全 体 を欠失 すると A B A に よ らな い 活 性 化も影 響を 受 ける ことが 報 告され た ( Ⅶ s h id a
et al
2 0 0 6 ) また 大 腸 菌 で 発 現させ た組換 え O S T l / S R K 2 E
の C 末 端 領 域 の ドメ イ ン 2
お よび 1 の
部 分 を欠 失 するとリン 酸 化活 性が なくなる ことが 報 告され て い る ( B e ti n e t a r
.
,
｡
､
一
､
.
,
｡
､
一
.
,
さら に O S T l / S R K 2 E の C 末 端 領 域 に は プ ロ テ イ ン ホ ス フ ァ タ ゼ
A B E l が 結 合す るこ とが 酵母 t w o h y b r岳d ア ツ セイ に より示 され て い る( Y o s h id a e t
こ れら の こ とか ら S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ ナ
ゼ の C 末 端 領 域 は 上 流 の シ グナ
るととも に 活 性 を正 に 制 御 する働き が あると推 察 できる
2 0 0 6)
2 C
-
.
､
､
ai
-
､
､
,
で
ある
2 0 0 6)
0
を受 容 す
ル
ー
､
.
｡
リ ン 酸 化 に よ る制 御を受 けるプ ロ テ イ ン キナ
ゼ の 多くに つ い て そ の キ ナ
ゼドメイ ン の 中 央
に 存 荏 する ア クチ ベ
プと 呼 ばれる 領域 の セ リ ン ス レ オ ニ ン ある い は チ ロ シ ン の リ
ション ル
ン 酸 化 に より活 性 化 される こ とが知 られ て い る ( J o h n s o n e t a L 1 9 9 6 ; N o l e n e t a L 2 0 0 4) 当
研 究室 で は S A P K 2 が 高 浸 透 圧 ス トレ ス に 応 答 し て リン 酸 化され た 時 ア クチ ベ シ ョ ン ル
プ 内 で 3 ケ 所 に リ ン 酸 化 が 起 こ っ て い る ことを 二 次 元 電 気 泳 動 を用 い て 明ら か に して い る ( 小
林 ら未 発 表) 同様 に B u r z a ら ( 2 0 0 6) は N t O S A K の ア ク チ ベ シ ョ ン ル
プ内の 1 54
番 目と 1 5 8 番 目 の セ リ ン が 高 浸 透 圧 に 応 答 し て リ ン 酸 化され る こ とを報 告 し た
方 B eli n
ら ( 2 0 0 6) は 大 腸 菌 で 発 現さ せ た 組 換 え O S T l / S R K 2 E は ア クチ ベ
ション ル
プ 内の セ
リン 以 外 に も数 ケ 所 が リン 酸 化 を受 け て い る こ とを報 告 し て い る
ー
ー
ー
､
ー
､
,
,
｡
ー
､
ー
､
ー
｡
､
ー
､
一
｡
､
ー
ー
､
｡
高 浸 透 圧 ス トレ ス や A B A に より活性 化され た S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ ゼ が 植 物細 胞 内
で ど の ようなタン パ ク質 の リ ン 酸 化 に 関 わ っ て い る か に つ い て の 知 見 は 限られ て い る A B A に
より活 性 化 され た A A P K に よ るリ ン 酸 化 の タ ゲ ッ トの 候 補 とし て A K I P l と名 づ けられ た
R N A 結 合 タン パ ク質 が 報 告され て い る ( Li e t a l 2 0 0 2) A K I P l が 酵 母 t w o h y b ri d ア ツ セ
ー
､
｡
ー
､
-
.
.
,
イ に お い て A A P K と結 合 する こと: お よ び試 験 管 内 リ ン 酸 化 ア ツ セ イ に お い て A A P K が
A K I P をリン 酸 化 する こ とが そ の 根 拠 で ある
方 ダイズ の S n R K 2 フ ァ ミリ メン バ
であ
P
K
l
る S
と S P K 2 は 酵 母 細 胞 内 に お い て 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ て 活 性 化され る ことが 示
､
､
一
ー
｡
ー
､
､
2 0 0 1 ) S P K l および S P K 2 が 植 物 細 胞 内 で 実 際 に 高 浸透 圧 ス ト
る(
レ ス に より 活 性 化 され る こ と は 示 さ れ て い な い が
S e c1 4 p 関 連
ダイ ズ の
p h o s p h a tid yEi n o s it o l t r a n s f e r p r o t e i n ( P I T P) を高 浸透 圧 ス トレ ス 依 存 的 に リン 酸 化 す るプ ロ
テイン キナ
ゼ 活 性 に 対 応 す る と 推 定 され て い る ( M o n k s e t a l
2 0 0 1)
P IT P
は
p h o s p h a tid y = n o s it o 1 3 ki n a s e ある い は 4 k i n a s e 活 性 を促進 する ことが 示 され て い る こ とか
ら S P K l と S P K 2 は フ ォ ス フ ァ チ ジ ル イノ シ ト ル 代 謝 を制 御 する こと で 浸 透 圧 ス ト レ ス 応
答 に 関 与 し て い ると想 像され て い る
O S T l / S R K 2 E は A B A に よ る 気 孔 の 閉鎖 だ け で なく遺 伝 子 発 現 誘 導 に も関 与 する こ とが 報
され て い
M
o nk s
et al
.
｡
,
､
-
"
-
｡
-
ー
､
｡
告 され て い る ( Y o
b Z !P 型転 写 因 子
s
h id
a
et
T R A Bl
当 研 究室 で は A B A に よ る 転 写 誘 導 を 担 うイ ネ
を同 定 し こ の 因 子 の 転 写 活 性 化 能 がリ ン 酸 化 に より制 御され
aI
.
,
2 0 0 2)
｡
,
､
4
の
て
る こ と ならび に そ の リ ン 酸 化 部 位 の 1 つ が 1 0 2 番 目 の セ リン で あ る こ とを明 らか に し た
に より活 性 化 され た S A P K 8
1 0 が こ の セ リン を試
( K a g a y a e t a l 2 0 0 2) さらに A B A
験 管 内 で 効 率 よくリ ン 酸 化 する こ とや 培 養 細 胞 内 で 過 剰 発 現 させ た S A P K I O と T R A B l
が 免 疫 沈 降 に より 共 沈 降 する ことなどを 報 告 し た ( K o b a y a s h i e t a l 2 0 0 5)
方 T R A Bl
ロ
のホモ
グ で ある イ ネ や コ ム ギ の A B A 応 答 エ レ メ ン ト ( A B R E ) 結 合 因 子 ( そ れ ぞ れ
い
､
-
.
｡
,
､
､
一
.
.
,
､
お よ び T a A B F) が 酵 母 t w o h y b rid ア ツ セ イ に お い て S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ ゼ
と結 合する こ とが 報 告され て い る ( C h a e e t a l 2 0 0 7 ; J o h n s o n e t a l 2 0 0 2) また シ ロ イ ヌ
ナ ズ ナ の A B R E 結 合 因 子 に つ い て も S n R K 2 に よ るリ ン 酸 化 が 報 告され た ( F u rih a t a e t
O R E Bl
ー
-
,
.
al
2 0 0 6)
"
.
｡
,
､
.
以 上 の ように
お よび 高 浸透 圧 ス トレ
タが 蓄
積 し て き て い る し か し こ れら の プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ を介 する シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 下 流 応 答
や 活 性 化 に 関 わ る 上 流 因 子 に つ い て の 知 見 は 未 だ に 乏 しく 今 後 の 課 題 とな っ て い る また
リ ン 酸 化 に よ る活性 化や C 末端 領 域 に よる 正 の 活 性 制 御 など S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ ナ
ゼ
ユ
ニ
べ
の
クな活 性 調 節 の 分子 機 構 に つ い て 詳細 に 述 る に は 到 っ て い な い こ の ような活 性
の
制 御 分 子 機 構 を 理 解 す るため に は S n R K 2 プ ロ テ イ ン キナ ゼタン パ ク質 の 高 次 構 造 に
関す る情 報 が必 要 不 可 欠 で ある さらに 高 次 構 造 に 関 する情 報 が 得 られ れ ば S n R K 2 で は
未 だ に 得 られ て い な い 構 成 的活 性 化 型キ ナ
ゼ の 作 出 など 下 流 応 答 や 上 流 因 子 の 検 索 に
ゼ 変異 体 を得る重 要な辛 が か りとなる そ こ で 本 研 究 で は S A P K の 立 体 構 造
有 用 なキナ
､
S
n
R K 2 フ ァ ミリ
に 属 するプ ロ テ イン キ ナ
ー
ゼが
ー
A B A
応 答 に おける シ グナ ル 伝 達 に お い て 中 心 的 な役 割 を果 た し て い る 可 能 性 を 示 す デ
ス
ー
ー
｡
､
､
｡
､
ー
､
ー
､
｡
ー
､
｡
､
､
ー
､
ー
｡
､
解 析 お よ び こ れ に 基 づ く活 性 制 御 機 構 の 解 明 を目 的 とし S A P K 2 お よ び そ の 変異 体 の 大 腸
菌 を用 い た大 量 発 現 系 の 構 築 と精 製 プ ロ ト コ J レ の 確 立 を行 っ た ま た 得 られ た 組 換 え
S A P K 2 および そ の 変異 体 に つ い て リ ン 酸 化活 性 お よ びリ ン 酸 化 状 態 を調 べ た さら に X 線
立 体 構 造 解 析 を目 指 した組 換 え S A P K 2 の 結 晶 化 S A P K 2 C 末 端領 域 に 関 する N M R を
用 い た 解 析 お よ び ホ モ ロ ジ モ デ リ ン グ を 用 い た S A P K 2 の モ デ リン グ 構 造 の 構 築 を試 み
た 得 られ た 実験 結 果 に 基 づ き S A P K 2 の 構 造 と活 性 制 御 に つ い て 考 察 し た
､
ー
｡
､
｡
､
､
ー
､
｡
第
1
.
､
二
｡
章 実験
プ ラ ス ミド構築
SA P K2
お よ び そ の 変異 体 の c D N A 断 片 は P G E X 5 X 1 S A P K 2 ( W T) ( 青 田 2 0 0 5 名
古 屋 大 学 農 学 部 応 用生 物 科 学 科 卒 業 論 文) お よ び p 3 5 S s h ロ S A P K 2 K 3 3 A d H A H i s ( 山
本 未 発 表) を 鋳 型 に した P C R に よ っ て 取 得 した S A P K 2 ( W T) は野 生 型 の S A P K 2 を 示 す
コ ン ス トラクト作 製 に は G a t e w a y
法を用 い た 全 て の エ ン トリ ク ロ ン は P C R D ir e cti o n a 一
T O P O クロ
ニ ン グ ( P E N T R / S D / D 丁O P O C l o n i n
g K it s ; [ n v it r o g e n) に よ っ て 作製 した 用
い たプ ライ マ
を表 1 に 示 す c D N A 取 得 の た め の P C R に は セ ン ス プ ラ イ マ
の 5
末
-
-
-
､
､
､
-
ー
-
-
-
｡
｡
ー
ー
｡
ー
一
｡
'
ー
ー
｡
､
端 に C A C C を 付 加 し たプラ イ マ を用 い た ま た こ の セ ン ス プ ライ マ に は C A C C と コ
ド領 域 の 最 初 の A T G の 間 に E n t e r o ki n a s e ( E K) P r e S ci s si o n P r o t e a s e ( P r e S ) ある い は
F a c t o r X a ( F a c X a) の い ずれ か の プ ロ テ ア
ゼ サ イトに 相 当 す る配 列 を導 入 し た 得られ た
c D N A
エ
ベ
ン
ト
E
N
T
/
断片を
リ
クタ
R S D / D T O P O ( l n vit r o g e n) に 組 み 込 み シ
クエ ン
P
ス を確 認 後 G a t e w a y L R C Z o n a s e E n z y m e M i x (l n v it r o g e n) を用 い た L R 反応 に よ っ て
大 腸 菌 用 発 現 ベ クタ
2 0 0 5) に 組 み 込 ん
P D E S T hi s お よ び p D E S T t r x ( T s u n o d a e t a I
ー
ー
｡
ー
､
､
､
､
ー
｡
ー
ー
-
ー
､
､
､
ー
-
-
.
5
,
だ
2
こ れら の ベ クタ
｡
模 式 図 を図 こき に 示 す
の
ー
.
培 養と精 製
.
2 1
培養
-
.
得 られた 発 現 ベ クタ お よ び コ ン トE]
ル とし て p E T 3 2 a ( + ) ( N o v a g e n) を それ ぞ れ 大 腸
菌 に 導 入 し た 発 現 ベ クタ と大 腸 菌 の 組 み 合 わ せ を表 2 に 示 す 得 られ た単
コ ロ ニ
を
L B 液 体 培地 ( 5 0 fL g / m l a m p i c 批 領) を用 い て 3 7
C で O D 60 0 が o 6
0 8 に なるま で 振
畳 培 養し 終 濃 度 5 0 〟 M また は 1 n l M に なる ように 】P T G を加 え さら に 3 0
37
C で 3
時 間もしくは 1 8 ℃ で 晩 培 養 し た そ の 後 培 養 液を 3 0 0 0 x g で 2 0 分 間遠 心 する こ と
に より 大 腸 菌 を回 収 し 8 0 C で 保 存 し た 遠 心 分 離 に は A v a n ti T M H P 2 5 C e n t rif u g e
ー
-
-
､
ー
一
｡
-
.
o
-
,
.
o
-
,
､
一
｡
､
,
o
-
､
-
｡
､
( B E C K M A N C O U L T E R T M ) もしくは M x 3 0 0 ( T O M Y) を使 用 し た
また N M R の 測 定 に 用 い る 1 5 N 安 定 同位 体標 識タン パ ク質 試 料 作 成 の た め に は 発 現 ベ
クタ を 導 入 し た大 腸 菌 を 3 7 C で 4 時間 L B 液 体 培 地 ( 5 0 [コg / m l a m p i c i‖i n) で 前 培
養 した 後 遠 心 に より回収 した 菌体を M 9 培 地 ( 表 3) 1 L に 懸 濁 し さら に 3 7 C で O D 6 0 0
が o 6
0 8 に なるま で 振 畳 培 養し 終 濃度 1 m M
に なる よう に I P T G を加 え 3 7
C
で
-
o
､
､
o
ー
､
o
､
､
o
-
.
‥
.
､
時間 培 養し た そ の 後 培 養 液 を A v a n ti T
分 間遠 心 する こ とに より大 腸 菌を回 収 し
4
｡
20
-
,
2 2
H P 25 C
M
,
-
o
80
e n t rif u
g
で 保存 した
C
を使 用 して
e
3 00 0
,
x
で
g
｡
精製
-
.
過程 に お ける共 通 の 操作 に つ い て 以 下 に 示 す
n m
に お ける 吸 光 度を測 定 し 1 次 構 造 か ら得 たトリ プトフ ァ ン 及 び テ
ロ シ ン の 数 に 基 づ い て 算 出 し た コ の 僅 か ら求 め た 遠 心 分 離 に は
A v a n ti T M
H P 25
C e n t ｢if u g e もしくは M x 3 0 0 を使 用 した タン パ ク質溶 液 の 濃縮 は 分 画 分 子 量 1 0 0 0 0 の
C e n t ri p l u s Y M 1 0 ( M illi p o r e) お よ び C e n t ri c o n Y M 1 0 ( M il)ip o r e) 分 画 分 子 量 3 0 0 0 の
C e n t ｢i p l u s Y M 3 ( M ‖ip o r e) お よ び C e n t ri c o n Y M 3 ( M illi p o r e) を用 い て 限 外 ろ 過 に より行
っ た 濃 縮 する 際 の 遠 心 分 離 は C e n t ri p [ u s
は 3000 x g 4
C で C e n t ri c o n は 5 0 0 0 x g
4
C で 行 っ た S D S Tf リ ア クリ ル ア ミドゲ ル 電 気泳 動 ( S D S P A G E) は 目 的タン パ ク質 の 分
子 量 に 応 じ て 5 2 0 % ゲ ラ ジ エ ン ト 1 2 5 % もしくは 1 5 % の ポ リア クリ ル ア ミドゲ ル を用 い
て 行 い C o o m a s s i e B ri[[i a n t B l u e ( C B B) 染色 ( Q u i c k C B B ; W a k o) に よりタン パ ク 質 バ ン
ドを検 出 した 分 子 量 マ カ とし て H ig h R a n g e R a i n b o w M o l e c u l a r W e ig h t M a r k e r s ( G E
精製
の
､
｡
タ ン パ ク質 濃 度 は 2 8 0
､
-
｡
､
-
｡
､
-
,
-
､
-
,
-
o
｡
､
､
､
､
o
-
｡
J
-
､
-
､
,
.
,
ー
ー
-
o
H
) また は
e alth c a r e
用い
た
2 2 1
-
L
o w
-
R
a ng e
R
a
如b
o w
M
o J e c ul a r
W
eig
ht M
(G
a rk e rs
E
H
) を
e a ]t h c a r e
｡
-
.
発 現 の 確 認 および 発 現 ベ クタ
の 検討
-
■
冷凍 した 菌 体 を s o ni c a ti o n b uff e r 【2 0 m M T ri s H C l ( p H 7 5) 5 0 0 m M N a C l 5 m M
l m id a z o F e] に 懸 濁 し 氷 上 で 超 音 波 処 理 ( T O M Y U D 2 0 1 ; o u t p u t 3 d u t y c y cl e 5 0 % ) 5
8 回行 っ た 得られ た破 砕 液 を 1 5 0 0 0 r p m
分 間を 2
で 1 5 分 間 ある い は 4 0 0 0 0 x g
で 3 0 分 間遠 心 し 可 溶 性 画 分 と不 溶 性 画分 に 分 離 した 目 的融 合タン パ ク質 の 発 現 お よ び
-
.
,
,
-
､
,
,
-
｡
,
､
,
｡
6
可 溶化 の 確認 は
ベ クタ
発現
G J u t a t hi o
S D S P AG E
に より行
-
､
検討 の ため に
の
ー
S tr a
｡
可 溶 性 タン パ ク質 を用 い て ア フ ィ ニ テ ィ
､
( G S T) と
n sfe r a s e
た
っ
精製を行
ー
融 合 タン パ ク質 は G S T ra p H
( H i s 6 ) タグ を含 む 融 合 タン パ ク質 は
の
た
っ
カラ ム
P
｡
G E
(
イオ ン をキ レ
トさ せ た H i T r a p c h e l a ti n g H P 5 m 】 カ ラム ( G E H e a lt h c a r e) を用 い て 精 製を行 っ た N i
イオ ン をキ レ トさ せ た H iT r a p c h e l a ti n g H P 5 m 暮 カ ラ ム は 以 下 5 m I N i c h e l a ti n g カラ ム と
記 す 可 溶 性 G S T 融合タン パ ク質を T ri s H C [ ( p ll 7 5) で 3 倍希 釈 し G S T r a p カラ ム に
吸 着さ せ カラ ム を 4 0 m l の 2 0 m M T ri s H C I ( p H 7 5) 1 5 0 m M N a C J で 洗 浄 後 2 0 m M
T ri s H C l ( p H 8 0) 1 5 0 m M N a C [ 1 0 m M g l u t a t hi o n e で 溶 出 した H i s タグを含 む可 溶 性 融
合 タン パ ク質 は 5 m l N i c h e l a ti n g カ ラ ム に 吸着さ せ 4 0 m J の s o n i c a ti o n b u 斤e r で 洗 浄 後
J m id a z o f e 濃 度 を 5 m M
か ら 3 0 0 m M ま で 5 9 m M / m J の 濃 度 勾配 を か け て 溶 出 し た
目 的融 合タ ン パ ク質 の 発 現 量 お よ び ア フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム に よ る回収 量 の 確 認 は S D S P A G E
に より行 っ た
H
n e
-
) を用 い て
e a [t h c a r e
h
､
e x a
h i s tid i n
e
､
､
Ni
ー
｡
ー
､
-
｡
.
､
-
､
,
.
､
-
･
,
,
.
､
､
.
.
ー
-
､
｡
2 2 2
-
SA P K2
-
･
(W
(
S A P K2
T)
W T)
S A P K2
M l S 3 0 8)
(
S A P K2
,
および
-
( K 3 3 A) の 精 製
SA P K2
お よ び S A P K 2 ( K 3 3 A ) の 大量 精 製 に は 終 濃 度 5 0
〟 M
の IP T G
で 誘導し 18
C
で
晩 培 養 した 大 腸 菌 を用 い た 冷 凍 した 菌 体 を
s o n i c a ti o n b u 斤e r に 懸濁 し
氷 上 で 超音 波処 理 ( o ut p u t 4 5 d u t y c y c一e 5 0 % ) 5 分 間を 8
回 行 っ た 得 られ た破 砕 液を 4 0 0 0 0 x g で 3 0 分 間遠 心 し 可 溶 性タン パ ク質を回収 し た
得 ら れ た 可 溶 性 融 合 タ ン パ ク 質 は C h e l a ti n g S e p h a r o s e F a s t F l o w レ ジ ン ( G E
､
l S 3 0 8)
(M
-
､
o
一
､
｡
､
,
.
｡
,
､
｡
､
H
e a lt h c a r e
20
)
s o n i c a ti o n
b
u
斤e
m
r
l
を充 填 し
で洗浄後 I
､
m
､
イオ ン を キ レ
Ni
id
濃 度 勾 配 をか けて 溶 出した ただし S
とし 他 の タ ン パ ク質 の 精 製 に は
F a st F lo w
レ ジ ン 2 0 m l を充 填 し
｡
7 8
･
濃度を
a z ole
､
､
A P K2
p H
(M
トさ せ た カ ラ ム に 吸 着 さ せ
-
5
から 3 00
M
m
･
の バッファ
7 5
.
h el a ti n g カ ラ ム と記す
( Vis
k
)
して
4
b
｢
u
に移し1 0 0
a s e
肝e
o
C で
【2 0
m
.
時 間透 析するか
2
T ｢i s H C l ( p H 7 5)
M
､
･
また は
1 50
-
,
M
､
m
N
C
e nt rip l u s
a
Cり で 平
m
I
の
m
l
の
のみ p H
ー
ー
.
､
､
-
.
M/
を用 い た C h el a ti n g S e p h a r o s e
トさ せ た カ ラ ム は 以 下 2 0 m l N i
c h e l a ti n g カ ラ ム 溶 出 画分 は
透析膜
N i イ オ ン をキ レ
融 合タン パ ク 質を含 む 2 0 m l N i
倍 容 の 2 0 m M T ri s H C I ( p H 7 5)
ー
､
c
m
.
の 精 製 に 用 い た バ ッ ファ
l S 3 0 8)
･
160
､
まで 1 5
M
m
,
15 0
Y M
-
M
m
N
a
CJ 0 2
,
m
.
M
D TT
に よる 濃 縮 後 に
10
衡 化した
H iL
o a
d 2 6/6 0 S
u
ゲ
､
p
に対
ル ろ過
e rd e x
75
p 9 ( G E H e a lt h c a r e) を用 い て ゲ ル ろ過 に か けた こ れ ら の 精 製 融 合タン パ ク質 に 終 濃 度 0 5
m M
に なる ように D T T を加 え 4 C で 1 6 時 間 0 2 5 U /1 m g p r o t e i n の E n t e r o ki n a s e
｡
.
o
､
(f n v it r o g
で
処理し
S A P K2
) ある い は
17
T hio
( T r x)
e n
(
､
re
K 3 3 A)
d
o xin
に 関 して は
,
2 0 U /1
-
､
-
H is 6
P
re
m
g p
r otei n
の
.
P
タグ の 切 断を行 っ た
S c i s si o
n
P
r ote a s e
S ci s s i o
re
の
P
n
r ot e a s e
(G
E H
)
e a lt h c a r e
ただ し S A P K 2 ( M l S 3 0 8) お よ び
処 理 時 間を 3 日 間 と した プ ロ テ ア
-
｡
､
ー
.
ゼ 処 理 の 後 の 反 応 液 を 5 m [ N i c h el a ti n g カ ラ ム に か け て T r x H i s 6 タグお よ び未 消 化 融 合
タン パ ク質 を吸 着さ せ 非 吸 着 画 分 に 目 的 タ ン パ ク質 を回収 し た 得られ た非 吸着 画 分 を イ
-
､
､
､
オ
｡
交 換 カ ラ ム に よる精 製 後
,
ま た は そ の ま ま C e n t rip J u s Y M 1 0 に よ る 濃 縮 を 行 い
H i L o a d 2 6 / 6 0 S u p e r d e x 7 5 p g を用 い たゲ ル ろ 過 精 製 に 用 い た イオ ン 交換 カ ラム に よる精
製 は 非 吸着 画 分を透析 膜 に 移 し 1 0 0 倍 容 の 2 0 m M T ri s H C l ( p H 7 5) 0 2 m M D T T に
C で 2 時 間透 析後
対して 4
陰 イ オ ン 交 換 カ ラ ム で ある H i T r a p Q H P カ ラ ム ( G E
H e a lt h c a r e) に 吸 着さ せ 4 0 m [ の 2 0 m M
T ri s 日C l ( p H 7 5) で 洗 浄 後 N a C l 濃 度 を 0
ン
-
､
､
､
｡
-
､
､
.
,
.
o
,
一
､
.
7
､
､
から 1
M
m
HiT
に より 精
C
2 2 3
-
-
.
､
Y M
M/
m
F
m
-
目 的タ ン パ ク質 を含 む
e l a ti n g カ ラ ム 非 吸着 画 分 をゲ ル ろ 過
を 加 え C e n t rip ] u s Y M 1 0 お よ び
濃 度 勾 配 をか けて 溶 出した
の
l Ni
m
h
c
終 濃 度 0 5 m M に なる よ う に D T T
1 0 を 用 い て 目 的タン パ ク質を濃 縮 した
｡
-
.
､
｡
S A P K2
S A P K2
20
カ ラ ム 溶 出 画 分 また は 濃縮 した 5
製し
e n t ri c o n
まで
M
p Q H P
ra
(P 2 8 4
(P 2 8 4
L 3 3 9)
-
安 定 同位 体標 識タン パ ク質を
精 製 した 冷凍 し た 菌 体を 1 0 0 m I の s o n i c a ti o n b u q e r に 懸 濁 し 氷 上 で 超 音 波処 理 ( o u t
p u t 4 5 d u ty c y cl e 5 0 % ) 5 分 間 を 8 回行 っ た 得 られ た 破砕 液を 4 0 0 0 0 x g で 3 0 分 間
遠 心 し 可 溶 性タン パ ク 質を回 収 した 得られ た 可 溶 性 融合タン パ ク質 は 2 0 m l N i C h e l a ti n g
カ ラ ム に 吸着させ 1 0 0 m l の s o ni c a t b n b u W e r お よ び 2 0 0 m [ の 2 0 m M T ri s H C l ( p H
7 5) 5 0 0 m M N a C [ 5 4 5 m M ! m id a z o l e で 洗 浄 後 2 0 m M T ri s H C I ( p H 7 5) 5 0 0 m M N a C L
5 00
m M
l m id a z o l e で 溶 出 し た さら に
融 合 タ ン パ ク 質 を含 む 溶 出 画 分 を C e n t ri p 山 s
Y M l O に より濃 縮 後
ゲ ル ろ 過 b u 汗e r で 平 衡 化 した H i L o a d 2 6 / 6 0 S u p e r d e x 7 5 p g を用
い て ゲ ル ろ過 精 製 を行 い 1 0 0 倍 容 の 2 0 m M T ri s H C ‡( p H 7 5) 0 2 m M
D T T に 対 して
4 ℃ で 1 時 間 半 透 析 し た そ の 後 H iT r a p Q H P カ ラ ム に 吸 着さ せ 4 0
m l の 20
m M
-
L 3 3 9)
は
の精製
の 測 定 に 用 い るため 1 5 N
N M R
､
､
-
.
､
,
･
｡
､
,
｡
-
､
-
,
･
､
･
,
｡
,
.
､
-
､
-
､
.
｡
.
,
､
,
濃 度を
か ら 1 M まで 1 0 m M / m L の 濃 度 勾 配
を か け て 溶 出 した そし て 融 合タ ン パ ク 質を含 む 溶 出画 分を C e n t ri p l u s Y M 1 0 に より濃 縮
し さらに H iL o a d 2 6 / 6 0 S u p e rd e x 7 5 p g を用 い たゲ ル ろ 過 精 製を行 っ た 得 られ た融 合タ
ン パ ク質 を C e n t rip l u s Y M 1 0 に より濃 縮 し N M R 測定 の 試 料 とし た N M R 測 定 後 融 合タ
ン / i ク 質を回 収 し 2 5
C で 1 3 時 間 0 1 6 U / 1 m g p r o t e i n の E nt e r o ki n a s e (l n vit r o g e n)
T ri s H C l ( p H
-
で洗浄後
7 5)
.
N
､
a
Ci
O
m
M
-
.
､
､
｡
-
､
.
､
o
､
.
､
処 理 し 再 びゲ ル ろ 過 精 製を 行 っ た そ の 後 目 的 の S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) が 含 まれ る溶
出 画 分を回収 し 5 m ] N i c h e [ a ti n g カ ラム を 用 い た精 製を行 い 非 吸 着 画 分 に 目的タン パ ク質
を回 収 し た 得 られ た 目 的タン パ ク質を C e n t rip l u s Y M 3 お よ び C e n t ri c o n Y M 3 を用 い て
で
-
､
｡
､
､
､
-
｡
濃縮 し
T
rx
-
N M R
｡
-
m
､
､
Y M
3
測 定 の 試 料 とし た ま た 前 述 の 5
H i s 6 タグ は ゲ ル ろ 過 b u 仔e r で 5 倍 希 釈 し
1 0 を用 い て 濃 縮 し N M R 測 定 の 試 料とした
､
1
､
､
､
C
l
Ni
c
カ ラ ム より溶 出 し た
h e l a ti n g
e n t rip [ u s
Y M
-
および
10
C
e nt ri c o n
｡
試験 管 内リ ン 酸 化 ア ツ セ イ
.
精 製した S
T ri s
JJ
一
日C I ( p H 7 5) 5
.
は よび
〟l に し た
,
m
M
DT T
〟g
50
rrl
〟 C i の【γ 3 2 P] A T P
-
基 質とし て 加 え た
｡
,
2
.
､
倍 ある い は
ア ミドゲ ル を用
M B P
も しくは
M
M
n
0 04
C I2] を4
に
〃g
.
､
5
×
ki n
基 質 とし て
FL L
a s e
M B P
､
b
u
1 00
斤e
r
[100
jJ M
m
M
AT P 2
( 比 放 射 能 3 0 0 0 C i/ m m o J) を加 え 滅 菌 水 で 総 容 量を 2 0
の 量 は S A P K 2 ( W T) 0 2 〟 g と等 m o l ( 9 1 n g) そ の
､
4
M B P
､
なしの
､
.
o
段 階とし た 3 0 C で 1 0 分 間 の 反 応 後 1 5 % ポ リ
ア クリ ル
い た S D S P A G E で 分 画した 分 子 量 マ
カ
は P r e ci si o n P ] u s
P r o t e i n A ‖ B l u e S t a n d a rd s ( B 套o R a d) を用 い た 電 気 泳 動 後 洗 浄 液 ( 5 %
TC A
1 %
1
N a4 P 2 0 7
0 H 2 0) で 1 5
分 間 の 洗 浄 を 2 回 行 い C B B 染 色 ( S i m p ly B J u e T M
S a f e S t a i n ; l n v it r o g e n) を行 っ た 後 J P プ レ ト ( K o d a k) に 露 光 し T y p h o o n 9 2 0 0 ( G E
h e a 肘1 C a r e) を用 い て 検 出 した
また 精 製 した S A P K 2 ( W T) も しくは S A P K 2 ( M l S 3 0 8) 1 L L g に 5 ×k i n a s e b u ff e r を 4
1/4
倍
2
( W T) 0
A P K2
4
｡
､
ー
ー
-
o
-
.
､
,
1
､
ー
,
｡
-
,
､
8
もしくは G S T 融合 p h o s p h a ty d y- i n o sit o ト4 k i n a s e ( G S T P E4 K ) を 1
〟 g 2 0 0 〟 M A T P l 〟l および 2 jj C i の【γ 3 2 P】A T P ( 比 放 射能 3 0 0 0 C j/ m m o l) を加 え
滅 菌水 で 総 容 量 を 2 0 〟 l に し た 基 質 の コ ン ト ロ
ル とし て G S T 1 〟 g を加 え た反 応 液も
用 意 した 3 0 C で 1 時 間 反 応 を行 い 1 0 % もしくは 1 5 % ポ リア クリ ル アミドゲ ル を用 い た
〟l
基 質 とし て
､
M B P
I
-
,
､
ー
｡
､
o
｡
､
S D S PA G E
で分画後
-
4
フ ォ ス フ ァタ
.
精 製 した
同様 に 検 出 した
､
｡
ゼ処 理
ー
S A P K2
( W T) S A P K 2 ( M l S 3 0 8) お よ び S A P K 2 ( K 3 3 A) をゲ ル ろ 過 b u 斤e r
で 2 0 0 n g / L L l に なる ように 希 釈 し 仔ウ シ 胸 腺 ア ル カリ フ ォ ス フ ァ タ
ゼ ( C I A P T a k a r a B i o)
っ
×
処 理を行 た 試 料 1 〟l に 酵 素 に 添 付され た 1 0 B u 斤e r 【5 0 0 m M T ri s H C = p H 9 0) 1 0
-
,
ー
､
｡
M
,
-
､
M g C I 2]
C IA P
,
.
を
を 1 〟 l 加 え 滅 菌 水 で 総容 量を 1 0 J J l に し
時 間 反 応させ た 対 照とし て C [ A P の 代 わり に 滅 菌水 1 F L ほ 加 えた反 応も行 っ
た 反応 後 1 0 % ポ リア クリ ル アミドゲ ル を用 い た S D S P A G E で 分 画 した
m
o
37
C
J
JJ
､
24
､
(1 0
3 0 U / J] l)
-
｡
｡
5
1
､
､
､
-
､
｡
リ ン 酸 化タン パ ク質 の 検 出
.
S D S
後 の ゲ ル に 対 して 固 定液 ( 5 0 % m e t h a n o l 1 0 % a c e tj c a ci d) で 3 0 分 以 上
の 振 とうを 2 回 行 い
蒸 留 水 に よる 1 0 分 間 の 洗 浄 を 3 回行 っ た そ の 後 P ro Q
D i a m o n d p h o s p h o p r o t e i n g e 一 st a i n ( M o l e c u 一a r P r o b e s) 液 中 で 1 時 間 振とうする こ とに より
リ ン 酸 化タ ン パ ク質を特 異 的 に 染 色 した こ れ 以 降 の 操 作 は 遮 光 し て 行 っ た 次 に 脱 色 液
【2 0 % a c e t o nit ril e 5 0 m M s o d i u m a c e t a t e ( p H 4 0)] に 置 換 し 3 0 分 間 の 脱 色 を 3 回行 い
蒸 留 水 に よ る 5 分 間 の 洗 浄を 2 回行 っ た こ の ゲ ル を T y p h o o n 9 2 0 0 ( G E h e a [t h c a r e) を
用 い て 5 3 2 n m レ ザ 光 に より励起 し 5 6 0 n m l o n g p a s s の e m i s sj o n fift e r を通 し て リ
ン 酸 化タン パ ク質を検 出 した そ の 後 S Y P R O R u b y
p r o t e i n g e l s t a i n ( M o l e c u l a r P r o b e s)
で
晩 振とうす る こと に より 全タン パ ク 質を染色 した 洗 浄 液 ( 1 0 % m e t h a n o l 7 % a c e ti c
a ci d)
に 置 換 し て 3 0 分 間振 とうし 蒸 留 水 に よる 5 分 間 の 洗 浄 を 2 回 行 っ た こ の ゲ ル を
T y p h o o n 9 2 0 0 を用 い て 5 3 2 n m
レ
ザ 光 に より励起 し 6 1 0 B P 3 0 の e m i s s i o n filt e r
を通 し て 全タン パ ク質を検 出 した
-
PA G E
,
-
､
｡
､
､
｡
､
,
.
｡
､
､
､
.
ー
ー
､
､
.
､
一
､
｡
,
､
｡
ー
ー
､
､
｡
6
.
次元 電気泳動
二
次 元電気泳動 の
次 元 目 の 泳 動 は Z O O M J P G R u n n e r シ ス テ ム ( l n vit r o g e n) を用 い
添 付 の 説 明 書 に し たが っ て 行 っ た 上 述 の ように 精 製 し タン パ ク量 を 測 定 し た S A P K 2 ( W T )
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) お よ び S A P K 2 ( K 3 3 A ) をゲ ル ろ過 b u 斤e r で 2 0 0 n g / 〟l に なる ように
希 釈 し 1 □l を S a m p [ e b u ff e r [ 7 M U r e a 2 M T i o u r e a 2 0 m M D T T 0 5 % Z O O M
二
一
､
｡
､
､
-
､
C
a r ri e r
1 5 00 0
,
A
m
ph
(p
o fy t e s
o
H 4 7 ; [ n vit r o g
-
) 0
e n
､
.
,
%
0 02
B
ro m
o
,
Ph
e n oI
Bl u
加え
カ セ ッ トを 平 らな実
】1 6 0
e
.
FL H =
､
分 間 遠 心 後 上 溝 をサ ン プ ル 溶 液 とし た Z O O M
験 台 上 に 置 き サ ン プ ル 溶 液 1 5 5 〟 l をサ ン プ ル ロ
ディ ン グディ バ イ ス に 充 填 し
次元
等 電 点 電 気 泳 動 用 の Z O O M ス トリ ッ プゲ ル ( p H ∠ト7 ; [ n v it r o g e n) をカ セ ッ トに 添加 し そ の
まま室 温 で 9 0 分 間 静 置 し て ス トリッ プゲ ル を膨 潤させ た
電 極 用 ろ 紙 2 枚 に 蒸 留 水 を 浸 み 込 ま せ ゲ ル の 両 端 に 置 き カ セ ッ トを Z O O M
｢p m
､
4
C
､
15
､
｡
ー
一
､
､
､
､
｡
､
9
､
､
lP G R
に セ ットして 電 気 泳 動を 開始 し た 通 電 条件 は 表 4
u n n e r
に 示 した 3
｡
流 値 及 び限 界 電 力値 は それ ぞれ ス トリ ッ プゲ ル 1 本 当り 1 m A
次 元 電 気泳 動 終 了 後 次 の ような S D S 平 衡 化 処理を行 っ た
取り 出 し ゲ ル 1 本 当り 5 m l の S D S 処 理 溶 液 【1 × N u P
､
｡
A G E
､
(J n v it r o g
らに
)
e n
ゲ
1
,
×
N
u
PA G E S
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g
限界電
､
｡
)]
LD S
pl e
a m
B
u
q
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分 間 振とうし た さ
で 15
e n
S
｡
キ ル 化 溶 液 【1 2 5 m M I o d o a c e t a m id e ( W a k o) 1 ×
N u P A G E L D S S a m p l e B u 斤e r (! n v it r o g e n)] で 1 5 分 間 振 とうした
N u P A G E I O % ビ ス トリ ス ゲ ル 1 m m 1 w e l 川 n vit r o g e n) を用 い て 次 の ように 二 次 元 目
の 電 気 泳 動を行 っ た S D S 平 衡 化 処 理 し た 次 元 ス トリッ プ ゲ ル を 二 次 元 目 ゲ ル の ウ ェ ル に
乗 せ ゲ ル 同 士 が 密 着 する ように ミ ク ロ ス パ
テ ル で 軽く押 し 分 子 量 マ
カ
( P r e ci si o n
P 一u s P r o t e i n A " B l u e S t a n d a r d s) 3 J J l を浸 み 込ま せ た小 片ろ 紙を ス トリ ッ プ ゲ ル の 陽 極 外
側 に 挿 入 し た 二 次 元 目 の ゲ ル を 泳 動 槽 に セ ッ トし 泳 動 B u 斤e r [ 1 × N u P A G E M E S S D S
R u n n i n g B u q e r (? n v it r o g e n)] を 注 ぎ 通 電 条 件 は 定 電 圧 2 0 0 V で 3 5 分 間 ゲ ル
枚あ
たり の 限 界 電 流 値及 び 限 界電 力 債 は それ ぞれ 1 2 0 m A 及 び 2 5 W に 設 定 し 泳 動 した 泳
動 後 C B B 染 色 ( S i m p ly B 山 e T M S a f e S t a 叶) に より目 的タン パ ク質 を検 出 した
､
本 当り
ple
a m
で
ス トリッ プゲ ル をカ セ ッ トか ら
一
,
段階
に 設 定 した
2 W
ル 1
5
m
l
の
s
ア ル
-
,
｡
ー
､
一
｡
-
ー
､
ー
､
｡
､
ー
､
､
､
､
7
｡
｡
結晶化
.
線 法を用
X
SA P K2
量
(
W T)
3 0 00 0
い
SA P K2
､
の C
,
に より濃 縮 した
た立体 構造解 析
(M
e n t ri pl u s
l
Y
-
結 晶 化 条 件 を検 討 し た 上 述 の よ う に 精 製 し た
S 3 0 8) お よ び S A P K 2 ( K 3 3 A) の タン パ ク質 溶 液 を 分 画分 子
M 3 0 ( M i"i p o r e) および C e n t rip J u s Y M 1 0 を 用 い て 限 外 ろ 過
の
ため
､
｡
､
1
1
遠 心 分離 は A = e g r a T M X 2 2 R C e n t rif u g e ( B E C K M A N C O U L T E R T M ) を
使 用 し て 1 0 0 0 x g 4 C で 行 い タン パ ク質 最 終 濃 度 2 9
2 0 m 9 / m l ま で 濃 縮 した タン パ
ク質 濃 度 は 2 8 0 n m に お ける 吸 光 度を測定 し 1 次 構 造 か ら得 たトリプトフ ァ ン 及 び テ ロ シ ン
ニ ン グを
の 数 に 基 づ い て 算 出 した 号 の 値 か ら求 め た そ の 後 結 晶 化 条 件 の 初 期 ス クリ
1
.
o
-
､
､
｡
.
､
ー
.
表 5
に 示 す 市 販 の 結 晶 化 キ ッ トを用 い て 行
､
､
た 結 晶 化 は2 4 穴 V D X プ レ ト ( H a n p t o n
バ
を使 用 し た
の 体積を 50 0 〟 L
行 い リザ
ドロ ッ プ レ ッ ト体 積 はタン パ ク質 溶 液 0 7 iL L とリ ザ バ 溶 液 0 7 JJ L を混 合 し て 1 4 〟
L とし た タン パ ク 質溶 液 は 2 9
1 6 4 m g / m l タン パ ク質 2 0 m M T rj s H C I p H 7 5 1 5 0
m M N a Cl 0 5 m M D T T
とし た ただし S A P K 2 ( M l S 3 0 8) に 関 し て は 3 0
7 8 m g/ m J タ
ン パ ク質 2 0 m M T ri s H C I p H 7 息 1 5 0 m M N a C l 0 5 m M D T T とした ハ ン ギ ン グドロ ッ プ
蒸 気拡 散 法 の 模 式 図を 図 4 に 示 し た 結 晶 化 プ レ トの セ ッ ト後 2 0 C の イ ン キ ュ ベ タ
内 に 静 置 し 1 日 か ら数 日 間 の 間 隔 をあけ て 結 晶析 出 の 有 無 を偏 光 顕 微 鏡 に よ っ て 観 察 し
た
R
h)
e s e a rc
ハ
ンギン
っ
ー
.
グ ドロ ッ プ蒸 気 拡 散法 で
ー
ー
ー
､
ー
,
.
,
-
.
-
.
､
.
.
,
｡
･
,
-
-
､
､
.
.
-
､
,
｡
.
o
ー
ー
｡〉
ー
,
､
｡
8
｡
す
N M R
測 定と解 析
クトル 測 定 は 2 7 C で 5 m m の C H N 三 重 共 鳴ク ライ オ検 出器 を装
し
た
B
r
u
k
e
r
A
V
6
0
0
N M R 装 置 ( B u rk e r B i o S pi n) を用 い て 行 っ た タン パ ク質試 料 は 濃 度
着
を測 定 し 1 0 % D 2 0 を加 え て シ ゲ ミチ ュ
ブ ( s H I G E M l) に 充填 し 測 定 に 供 した 測 定 に
用 い たタン パ ク質 試 料 の 濃 度 および b u ff e r 条 件を表 6 に 示 した ス ペ クト ル は X w i n n m r ソ
フ トウ ェ ア ( B u r k e r B i o S p i n) で 処 理 し S p a rk y ソ フ トウ ェ ア ( U n i v e r sit y o f C aJif o r n i a の
べ て
の N M R
スペ
o
､
｡
ー
､
､
.
､
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｡
､
､
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析 した
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に よる開発; h モ
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.
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.
u
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p
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)
解
で
｡
標 識 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) と非標 識 S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を 用 い た N M R 滴 定 実 験
用 の サ ン プ ル は 次 の よう に 調 整 し た 上 述 の ように 精 製 し た 1 5 N 標 識 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9)
の 最終濃度 0 1 6 m M
に 対 し て 非 標識 S A P K 2 ( M l S 3 0 8 ) の 濃 度 比 が 1 : 2 となる ように
混 合 し N M R 滴 定実 験 用 サ ン プ ル とした
15N
-
-
-
｡
-
.
､
9
モ デリン グ
.
デ リン グ に は
モ
P
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｡
"
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.
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.
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.
との 相 同 性 が 最も高 か
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w w
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.
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.
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.
を用 い た テ ン プ レ
2 0 0 3)
,
"
st r u ct u r e
) を用 い た検 索 に より S
､
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o
cg i
.
2 H A K ) を用 い
:
1 9 9 7; S
,
3 D
is
w
/
た
b /) か ら
d
っ
イ ル を 取 得 し た ま ず S V V I S S M O D E L の F ir st A p p r o a c h m o d e で S A P K 2
の ア ミノ 酸 配 列 を 入 力 し たとこ ろ P D B に 登 録され て い るタ ン パ ク質 の 中 で S A P K 2
(
( W T) と相 同 性 が 高 い も の を サ バ が 選 択 し 2 H A K A C D E および F c h a i n をテ ン プ
レ
トとした モ デ リ ン グ構 造を得た 以 後 こ の 構 造 を F i r s t A p p r o a c h l と表記 す る 次 に 同
じく F i r st A p p r o a c h m o d e で S A P K 2 ( m ) の 配 列 を入 力 し テ ン プ レ トとして 2 H A K E
P D B
ファ
-
.
､
､
W T)
､
ー
ー
､
､
､
､
ー
｡
､
｡
､
ー
､
c
h
ain
｡
k/
フ ァ イ ル を添 付 し
P D B
の
た さら に
S W IS S
､
c ] u st a l w
､
M O DE L
-
の
以 下 で First A p p
､
A Iig
n m e nt
l n t e rf a
ro a c
h
で
2
c e
C LU STAL W
､
( h tt p :// w
) と 2H A K
w
w
.
e
bi
.
a c
.
作 成した
の ア ラ イメ
p
(
力 し テ ン プ レ トとし て 2 H A K E c h a i n を指 定 し 以 下 で A Iig n m e n t I n t e rf a c e l と
表 記 す る モ デ リ ン グ構 造を得た 最 後 に S W IS S M O D E L の A lig n m e n t ] n t e rf a c e で 上 述
の ア ラ イ メ ン トを より詳 細 に 確 認 し なが ら 変 更 を 加 え て 入 力 し テ ン プ レ トとし て 2 日A K E
c h ai n
を指 定 し 以 下 で A lig n m e n t I n t e rf a c e 2 と表 記 する モ デ リ ン グ 構 造 を得 た 2 H A K E
c h ai n
およ び そ れ ぞ れ の モ デ リ ン グ構 造 は P y M O L ソ フ トウ ェ ア ( D e L a n o S ci e n tifi c の
u
; Th
ン トを 入
o m
et al
s o n
.
1 9 9 4)
,
を用 い て
と表 記 する モ デ リン グ 構造 を得
S A P K2
m
ー
､
､
-
｡
､
､
ー
､
､
.
､
D
L
e
a n o
W
,
L
.
に よ る開発; h tt p :// p y
･
電 化 構 造 を 示 した
p
a
pia
1
g i/ s
c
p bi o d
c o m
第
-
･
三
章
s
m
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S A P K2
｡
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d
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.
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.
u
･
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の
Ch
k/ % 7 E
o u
w
o l s o u r c e f o rg e
.
次 構造 予 測 は
二
a n
w
m
d
F
a s m
j p r e d /;
-
C
a n
,
斤 et
u
.
19
a
L
て
､
リボン 構造 お よび表 面
法 ( h tt p :// m b s c b r c j p /
7 4) お よ び ｣ p r e d
法 ( h tt p :// w w w
1 9 9 8) に より行 っ た
C h
､
) を用 い
n e t/
o u
-
F
a s m a n
.
.
.
,
｡
結果
精製
.
1 1
-
.
大 量 発 現 系 の 構 築 と精 製 プ ロ トコ
S A P K
ー
ル の確立
の 立 体 構 造 解 析 お よ び こ れ に 基 づく活 性 制 御 機 構 の 解 明を目 的とし
実験 に 用 い る
タン パ ク質 の 大 量 か つ 高純 度 で の 精 製 条 件 の 検 討 を行 っ た 発 現 系 は 大 腸 菌を用 い た イ ネ
ゲ ノ ム に コ ドされ た 1 0 個 の S A P K の うち リン 酸 化 部 位 の 解 析など当 研 究 室 に お い て 最
も機 能 解 析 が 進 め られ て い る S A P K 2 に 焦 点をあ て て 実 験 を 行 っ た 本 研 究 で 発 現 お よ び 精
｡
｡
ー
､
｡
ll
､
製 を試 み た S
1 1 1
の ドメイ ン 構造 を図 5
に 示 した
｡
S A P K 2 (V V T)
'
J
-
および そ の 変異 体
A P K2
.
野 生 型 の S A P K 2 ( S A P K 2 ( W l )) の 大 量精 製 を 目 指し て 発 現 に 用 い る大 腸 菌 株 誘 導
の ため の I P T G 濃 度 お よ び誘 導 後 の 培 養 温 度 に つ い て 検 討を行 っ た そ の 結 果 を図 6 に 示
し た まず 大腸 菌 発現 株 に よる S A P K 2 ( W T ) の 発 現を比較 し た結 果 1 8
C で
晩培養し
た場 合 に は 大 きな違 い は 見られ な か っ た ( 図 6 ( C ) および ( D)) し か し 3 7 ℃ 3 時 間 培 養
した 場 合 B L 2 1 ( D E 3) 株 で 発 現させ ると目的タン パ ク質 は ほ とん ど不 溶 性 画 分 に 存 在 し た の
-
､
､
｡
o
一
｡
､
､
｡
､
､
､
に 対 し て ( 図 6 ( A )) B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 で は 目 的タン パ ク 質 の 半 分 以 上 が 可 溶 化 し た
( 図 6 ( B)) こ の 結 果 か ら B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 の 方 が 目的タン パ ク質 の 可 溶 化傾 向 が 見ら
れ ると判 断 し B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 を 発 現 株 とし て 用 い る こ とに した 次 に 目的タン パ ク 質
､
｡
､
,
｡
､
誘 導 に 用 い る IP T G 濃 度 に つ い て 検 討 した そ の 結 果 培 養 温 度 や 菌 株 に 関 わ らず
IP T G 濃度が 1 m M
の 時 よりも 5 0 〟 M の 時 の 方 が 目的タ ン パ ク 質 は 可 溶 化 す る傾 向 が
こ
見 られ た
の 結 果 か ら 5 0 〃 M の I P T G で 誘 導 を行 うこ ととし た さら に 培 養 温 度 の 検
討 を行 っ た そ の 結 果 発現 量 は 3 7 C で 培 養し た方 ( 図 6 ( B) L a n e 3) が 1 8 C の 時 ( 図
の
｡
｡
､
､
､
｡
､
o
｡
o
､
( D ) L a n e 3) よりも多 か っ た し か し 1 8 C で 培養を行 っ た 場 合 目的タン パ ク質 の 可 溶 化
する割 合 が 高 い こ とが わ か っ た ( 函 6 ( D ) L a n e 4 5) 本研 究 で は 構 造 解 析 および 活 性 測 定
に 用 い る活 性 型タン パ ク 質 を精 製す る こ とを目 的 に し て い る 不 溶 化 したタ ン パ ク 質 は 活 性 が
失 われ て い る場 合 が 多く 上 記 の 目 的 に は 可 溶 性タン パ ク 質 とし て 発 現 する 条 件 で 培 養 する こ
とが 必須 で ある そ こ で 目的タン ′i ク質 の 発 現 量 よりも可 溶 化 を優 先 し 1 8 C で 晩 培 養 す
o
6
｡
､
､
,
｡
､
｡
､
o
一
｡
､
,
る こ ととし た 以 上 の 結 果 か ら 組 換 え S A P K 2 の 発 現 に は 大 腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p Ly s S 株
を用 い 5 0 〟 M I P T G で 誘 導 し. 1 8 C で 晩 振とう培 養する方 法 が 最 適 で あると結 論 した
次 に 発現 ベ クタ の 検 討 を行 っ た
そ の 結 果を図 7 に 示 し た 異 なるタグ が N 末 端 側
ベ
に そ れ ぞ れ 付 加 される 3 種 類 の
クタ に S A P K 2 ( W T) を組 み 込 み 発 現 量 および ア フィ
｡
,
､
o
一
,
､
｡
ー
､
｡
｡
ー
､
精 製 の 収 量 が 高く な る 発 現
クタ
を調
た G S T タ グ が 付 加 され る
H i s 6 タグ が 付加される p D E S T h i s E K S A P K 2 ( W T) お よ び
T r x 日i s 6 タグ が 付 加 され る p D E S トt r x E K S A P K 2 ( W T) をそ れ ぞれ 大 腸 菌 B L 2 1 ( D E 3)
p L y s S 殊 に 導 入 し 4 0 m l の L B 培 地 を 用 い て 前 述 し た 条 件 で 目 的タン パ ク質を発 現させ
ア フィ ニ テ ィ 精 製 を行 っ た こ の 3 つ の ベ クタ を比 較 した 結 果 p D E S T t r x ベ クタ を用 い
たとき に 目的タン パ ク 質 の 発現 量 およ び 回収 量とも に 最も多くなる ことが分 か っ た
S A P K 2 ( W T) の 直 上 に 導 入 し たプ ロ テ ア ゼ サイトに つ い て 検 討 を行 っ た そ の 結 果を図
8 に 示 した E K サイトを導 入 した p D E S T t r x E K S A P K 2 ( W T) お よび P r e S サイトを導 入
ニ
ティ
ベ
ー
p G E X 5 X 1 S A P K 2 ( W T)
1
-
べ
ー
｡
-
-
-
-
､
､
■
一
-
-
､
､
ー
ー
ー
｡
､
､
｡
ー
｡
-
-
-
｡
-
し た p D E S T t r x P r e S S A P K 2 ( W T) に つ い て 検 討を行 っ た それ ぞ れ の ベ クタ を大 腸 菌
B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 に 導 入 し 上 述 した 条件 で 目 的タン パ ク質 の 発 現 および 精 製を行 っ た
-
-
-
ー
.
､
導 入 した プ ロ テ ア
｡
ゼ サ イトに よる T r x H i s 6 タグ 融合タン パ ク 質 の 発 現 量 や 可 溶性 に 違 い は
っ たが
プ ロ テ ア ゼ 処理 に より現 れる S A P K 2 ( m ) の 大きさが 異 な っ
て い た ( 図 8 ( B)) P r e S で 処 理 し た 場 合 推 定 分子 マ ス 3 8 7 k D a と
致 する位置 にタグが
切 断され た S A P K 2 ( W T) の バ ン ドが 現 れ た ( 図 8 ( B) 赤 矢 印)
方 E K で 処 理 した 場 合
ー
-
ほ とん ど見られ な か
-
,
一
0
､
.
一
｡
には
､
推 定 分 子 マ ス 3 8 5 k D a よりも大き い 位 置 に バ ン ドが 現 れ た ( 図 8 ( B) 青 矢 印) こ れ
は 直 上 に 導 入 した E K サ イトで は 切 断されず ベ クタ 由 来 の E K サイト ( 図 3 ( B )) で の
み 切 断され た こ とを 示 す また E K 処 理 後 で は S A P K 2 ( W T) 内 部 で の 分解 が 徐 々 に 見 られ
､
.
｡
ー
､
､
｡
､
12
_
､
たが
処 理 後 の S A P K 2 ( W T) に は 分 解 が見られ な か っ た こ れら の 結 果 か ら 発 現 ベ
クタ に 導 入 する プ ロ テ ア ゼサ イトとし て P r e S サ イトが適 切 で ある こ とが 分 か っ た
精 製 条 件 に つ い て 検 討を行 っ た そ の 結 果 を 図 9 に 示 した 大 腸 菌 抽 出 液を N i c h e l a ti n g
カ ラ ム に より精 製 した後 透 析 に より b u 斤e r 交換 を行 い P r e S 処 理 を行 っ た結 果 消 化 効 率
が 著 しく低 い こ とが 分 か っ た ( 図 9 ( A) L a n e 2) そ こ で N i c h e l a ti n g カ ラ ム 精 製 後 の 溶 液 に つ
い て ゲ ル ろ 過 精 製 を行 い P r e S 処 理 を行 っ た そ の 結 果 同 じ 処 理 条 件 で の 消 化 効 率 が 著 し
く向 上 し た ( 図 9 ( A ) L a n e 5) こ の とき の ゲ ル ろ 過 精 製 の ク ロ マ トグ ラム を 図 9 ( B ) に 示 し た
P
､
S
re
｡
､
ー
ー
､
｡
｡
｡
､
､
.
､
､
｡
､
｡
｡
消 化 効 率 の 向 上 は ゲ ル ろ 過 精 製を行うこと に より 主 に 排 除限 界 で 溶 出される凝 集 し た
目 的タン パ ク 質 および 爽 雑 物 が 除 か れ た た め と考 え られ る こ の 結 果 か ら 組 換 え S A P K 2
の 精製 に は プロ テア
ゼ 処理 の 前 に ゲ ル ろ 過 精 製を 行うこ ととした
この
､
､
｡
､
ー
､
0
以 上 の 結 果 を考 慮 して 決 定 した S A P K 2 ( W T) の 最 終 精 製 プ ロ トコ
果 を図 1 0 に 示 し た 本 実 験 で 確 立 し た 条 件 で 精 製を行う こ と に より
｡
S A P K2
1 1 2
-
-
S
･
S A P K2
お よ びそ の 精 製 結
バ ン ドとし て
ほ ぼ単
､
の 精 製 が 可能 とな っ た
W T)
(
ル
ー
一
｡
M l P 2 6 5)
(
-
フ ァ ミリ
プロ テ イン キ ナ
ゼ は N 末 端 側 の 高 度 に 保存 され た キ ナ ゼ 領 域 と
C 末 端 側 の 酸 性 ア ミノ 酸 に 富 む ユ ニ
クな制 御 領 域 か らな っ て い る S A P K 2 の 2 6 5 番 目
の プ ロ リ ン ま で の 領 域 は S n R K 2 フ ァ ミリ
プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ で 相 同性 が 高く 他 の プ ロ チ
イ ン キ ナ ゼ の キナ ゼ 領 域 と の 相 同 性 が 高 い 領 域とも ほ ぼ
致 し て い る ( 図 1) そ こ で こ
の 2 6 5 番 目 の プ ロ リン ま で の N 末 端側 領 域 を S A P K 2 の キナ
ゼドメイ ン として 精 製 す る
ニ ン グを行 っ た
ため に サ ブク ロ
n
R K2
ー
ー
-
､
､
ー
｡
ー
ー
､
-
､
ー
一
.
､
ー
､
ー
｡
SA P K2
( W T) と同様 に 大腸 菌用 発 現 ベ クタ P D E S T t r x に 組
み 込 み p D E S T t r x E K S A P K 2 ( M l P 2 6 5) を作 成 した 直上 に 導 入 し た プ ロ テ ア ゼ サ イト
は 前 述 した P r e S で は なく E K を用 い た S A P K 2 ( W T) で は 導 入 した プ ロ テ ア ゼ サ イ
(
M l P 2 6 5)
-
-
は
､
SA P K2
ー
､
-
-
ー
､
｡
ー
､
､
｡
､
ト に よ る目 的 タン パ ク質 の 発 現 量 や 可 溶 化 に 違 い は 見 られ な か
M l
P 2 6 5)
の 場 合 に おい て も P
､
を用
E K
-
S
re
と
っ
た
｡
結 果か ら S A P K 2
が 見 られな い と 予想さ
この
で発現量や可
､
溶化に 違い
は
い
と
問題 な
判 断 した
p D E S T t r x E K S A P K 2 ( M l P 2 6 5) を 大 腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 に 導 入 し 5 0 □ M
ま
た は 1 m M の I P T G に より遺 伝 子発 現 を誘 導 後 3 7 C もしくは 1 8 C で 培養 し 発 現 お よ
び可 溶 化 を確 認 し た その 結 果を図 1 1 ( A ) に 示 した 目的タン パ ク 質 の 発 現 量 は 多 い も の の
ど の 条 件 で 培 養 し て も目 的タン パ ク質 は ほ とん ど 不 溶 性 画 分 に 存 在 し 可 溶 性 画 分 に は 得ら
れなか っ た
(
れ るた め
-
E K
い ても可 溶 化 の 確 認 に
-
｡
-
､
o
o
､
､
｡
｡
､
､
｡
1 1 3
-
-
.
SA P K2
(M
上 述 の よう に
l イ 2 8 3)
ゼドメ イ ン と し て 精 製 を試 み た S A P K 2 ( M l P 2 6 5) の
T r x H i s 6 融 合 タン パ ク質 は 可溶 化 し な か っ た 図 2 1 に 示 し た ように ｣ p r e d 法 に よ る 二 次 構
造 予 測 で は 2 6 5 番 目 の プ ロ リン の 周 辺 に 二 次 構 造 は 予 測され な い が C h o u F a s m a n 法 で
は 2 5 9 番 目 の トリ プトフ ァ ン か ら 2 7 1 番 目 の グ ル タミン 酸 ま で に ロ ヘ リツ ク ス が 予測され た
欠 失 変異 体 を作 成 する 際 に □ ヘ リ ツク ス や □ シ トなど 二 次 構 造 の 途 中 で 欠 失させ るとこ
の 部 分 の 二 次 構 造 が 崩 れ こ れ が タン パ ク質 の 凝 集 など の 原 因 となる こ とが ある そ こ で 1
､
S A P K2
の キナ
ー
-
-
｡
､
-
､
ー
-
-
-
､
､
｡
13
､
｡
番 目 の メチ オ ニ ン か ら J p r e d 法 お よ び C h o u F a s m a n 法 とも に 二 次構 造 が 予測 され て い な
い 2 8 3 番 目 の ス レ オ ニ ン ま で ( S A P K 2 ( M I T 2 8 3)) の サ ブク ロ
ニ ン グを行 っ た
S A P K 2 ( M l 丁2 8 3)
は 大 腸 菌 用 発 現 ベ ク タ
に 組 み 込 み
P D E S T trx
-
､
ー
｡
一
ー
-
,
P D E S T tr x P
S S A P K2
を作成 し た プ ロ テ ア ゼ サイトは S A P K 2 ( W T) で 用
を導 入 し た
発現
クタ を 大 腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 に 導 入 し
S A P K 2 ( M l P 2 6 5) と 同 様 に 発 現 お よ び 可 溶 化を確 認 した そ の 結 果を図 1 1 ( B ) に 示 し た
し か し S A P K 2 ( M l 丁2 8 3) も 可 溶 性 画 分 に 得る こ とは で きな か っ た
-
い
た
P
re
-
S
｢e
(M
-
l T 2 8 3)
-
｡
ベ
この
｡
ー
､
ー
､
-
.
｡
一
､
1 1 4
-
｡
.
S A P K2
(M
た
っ
M l S 3 0 8)
-
l 丁2 8 3)
一
と同様 に
に 加 え さらに C
( M I T 2 8 3)
を行
(
S A P K2
-
､
次 構 造 予 測 の 結 果 を考慮 し C 末 端 側 を S A P K 2
へ 2 5
残 基 の ば した S A P K 2 ( M l S 3 0 8) に つ い て 検 討
ニ
末端 側
､
-
｡
を 大 腸 菌 用 発 現 ベ ク タ
に 組 み 込 み
P D E S T trx
D
E
S
T
t
r
x
P
r
e S S A P K 2 ( M l S 3 0 8)
を作 成 した プ ロ テ ア ゼ サ イト は P r e S を導 入 した
p
こ の 発現 ベ クタ を 大腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 に 導 入 し S A P K 2 ( M l P 2 6 5) と 同様 に 発
現 お よ び 可 溶 化を確 認 した そ の 結 果を図 1 2 ( A ) に 示 し た 1 8 C で 培 養 した 場 合 目 的タン
パ ク質 が 可 溶 化 する ことが わ か っ た 以 上 の 結 果 か ら S A P K 2 ( W T ) と同様 に 5 0 □ M J P T G
で 誘 導し 1 8
C で
晩 振 とう培 養 す る こととし た
図 1 0 ( A) に 示 し た 精 製 プ ロ トコ
ル に 従 っ て S A P K 2 ( W T) と同 様 に 精 製 し た 結 果
S A P K 2 ( W T) と同 じ 条件 で P r e S 処 理を行 っ たとこ ろ 切 れ残りが 大 変 多 か っ た し か し 時 間
が 経 過 すると P r e S に より ほ ぼ完 全 に 酵 素 消 化 される こ とが わ か っ た の で 処 理 時 間 を 1 6
SA P K2
M l S 3 0 8)
(
ー
-
-
-
､
-
-
ー
｡
､
｡
ー
-
､
o
｡
｡
｡
､
､
､
o
一
､
｡
ー
､
､
｡
､
､
時間から
の マ イナ
1 1 5
-
3
ー
日 間 に 変更 し た S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の 精 製 結 果を図 1 2 ( B)
バ ン ドが 2 本 ほ ど残るも の の ほ ぼ 単
バ ン ドとし て 精 製 で きた
.
爽雑 物
｡
一
｡
S A P K2
-
に 示 した
-
｡
ソラ マ メの
( K 3 3 A)
プロ テイン キ ナ ゼ A A P K で は プ ロ テ
イン キナ ゼ で 高 度 に 保 存され た A T P 結 合 部位 の リジン を ア ラ ニ ン に 置 換 すると 孔 辺 細 胞
プ ロ トプ ラ ス トで 発 現させ た G F P 融 合 A A P K の リン 酸化 活 性 がなくなり こ の 変異 型タ ン パ
ク質を発 現させ たトラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク植 物 で は A B A に 応 答 し た気 孔 の 閉 鎖 が 見られ なくなる こ
とが 報 告 され て い る ( Li e t a I 2 0 0 0) また A T P 結 合 部 位 の リジ ン を ア ラ ニ ン に 置 換 し た
S A P K 2 ( S A P K 2 K 3 3 A ) をイネ 培 養 細飽 プ ロ トプ ラス トで 発現さ せ た 場 合 ドミナ ン トネガテ ィブ
効 果 は 確 認 で きな い も の の そ の リン 酸 化 活 性 は失 わ れる こ とが 示 され て い る ( 山 本 未 発 表)
A B A
シ グナ リ ン グ に 関 わる S
R K2
n
ー
､
-
､
､
､
.
.
,
､
､
0
さら に 大腸 菌 で 発現 させ 不 溶 性 画 分 か ら回収 し た G S T 融 合 S A P K 2 K 3 3 A で は 自 己
リン 酸 化 活 性 お よ び M B P リン 酸 化 活 性 が 失 わ れる こ とを確 認 し た ( 青 田 2 0 0 5 名 古 屋 大
学 農 学 部 応 用生 物 科 学 科 卒 業論 文)
後 述 す る よう に S A P K 2 ( W T) お よび S A P K 2 ( M l S 3 0 8) は 大 腸 菌 中 で す で に リ ン 酸 化
､
,
､
,
､
0
-
､
､
され て おり そ の リン 酸 化 状 態 は 均 で な い こ とがわ か っ た こ れら の S A P K 2 の 結 晶 が 得 ら
つ として
れ ない 要 因 の
不 均 な リン 酸 化 に より表 面 電 荷 が 異 なるタン パ ク質 の 集 合とな っ
て い る こ とが 予 想され た そ こ で 大 腸菌 の 中 で リ ン 酸 化され な い も しくは リン 酸化 状 態 が 均
で あ るような S A P K 2 タン パ ク質を得 る ことを検 討 した 大腸 菌 に お ける リ ン 酸 化 は 自 己 リ
-
､
｡
一
-
､
｡
､
､
一
｡
】
.4
､
酸化
ある ことが 予 想される た め 自 己 リ ン 酸 化 活 性 を持 たな い S A P K 2 変 異 体 S A P K 2
( K 3 3 A) に つ い て 検 討 を行 っ た
二
S A P K 2 ( K 3 3 A ) を 大 腸 菌 用 発 現 ベ クタ
ゼ サ イトと
P D E S l t rx に組 み 込 み プロ テ ア
して P r e S を導 入 した p D E S T t r x P r e S S A P K 2 ( K 3 3 A) を作 成 し た こ の 発 現 ベ クタ を大
腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p Ly s S 株 に 導 入し S A P K 2 ( M l P 2 6 5) と 同 様 に 発 現 お よ び 可 溶 化 を確
認 した そ の 結 果 を図 1 3 ( A ) に 示 した 5 0 ⊂] M I P T G で 誘 導 し 1 8 C で 培 養 した 場 合 目的
タン パ ク質 の 可 溶 性 が 最も 高くなる ことが わ か っ た 以 上 の 結 果 か ら S A P K 2 ( W T) お よ び
ン
で
､
｡
ー
ー
､
､
-
-
-
ー
｡
-
､
o
｡
｡
､
｡
､
と同 様 の 条 件 で 培 養 する こととし た
(
図 1 0 ( A ) に 示 した 精 製 プ ロ トコ
ル に 従 っ て 精 製 した結 果 S A P K 2 ( M l S 3 0 8) と同様 に
P ｢ e S 消 化 の 効 率 が 低 か っ た こ の 場合も処 理 時 間 を 3 日 間 に 変 更 す ると ほ ぼ 完 全 に 酵 素
消 化 される こ とが わ か っ た S A P K 2 ( K 3 3 A) の 精 製 結 果 を図 1 3 ( B) に 示 し た 爽雑 物 の マ イ
バ ン ドとし て 精 製 で き た ただ し S A P K 2 ( W T) や S A P K 2
ナ バ ン ドが 残 るも の の ほ ぼ 単
S A P K2
M l S 3 0 8)
-
｡
ー
-
､
｡
｡
｡
ー
一
.
(
M l S 3 0 8)
に比
-
1 1 6
-
S A P K2
-
･
べ て
(P 2 84
-
､
タン パ ク質 が 不 安 定 で あり 短 時 間 で 分解 する傾 向 が 見られ た
､
､
｡
L 3 3 9)
これ ま で に
当研 究 室 お よ び他 の 研 究グ ル プ に より 行わ れ た 研 究 の 結 果 か ら S n R K 2 フ ァ
ミリ プ ロ テ イ ン キ ナ
ゼ の C 末端 側 の 領 域 は 上 流 か らの シ グ ナ ル を受 容す るととも に 活
性 を 正 に 制 御 す る機 能 が あ る と 考 えられ て い る( K o b a y a s h i e t a l 2 0 0 4 ; Ⅶ s hi d a e t a i
2 0 0 6)
そ の た め リ ン 酸 化 に よ る活性 化ととも に こ の 領 域 が 関 わ る 活 性 調 節 の メ カ ニ ズ ム に
興 味 が 持 たれ る こ の よう に ユ ニ
クなプ ロ テ イ ン キ ナ
ゼ活 性 制 御 の 分 子 機 構 の 理 解 に は
次
に
高 構造
関す る情 報 が 必要 不 可 欠 で あ る そ こ で C 末 端 領域 の 構 造 解 析 を目 的とし て
ー
､
ー
ー
､
.
｡
.
,
,
､
ー
ー
｡
｡
SA P K2
(P 28 4
-
､
､
の 2 84
番 目 の プ ロ リン か ら 3 3 9 番 目 ( C 末 端)
の 発 現 お よ び 精 製 に つ い て 検 討を行 っ た
L 3 3 9))
の ロ イシ ン
まで
の
領域
(S A P K 2
｡
S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) を大 腸 菌 用 発 現 ベ クタ
ゼサ
p D E S T t r x に 組 み 込 み プE= テ ア
イトとし て F a c X a サ イトを 導 入 した p D E S T t r x F a c X a S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) を作成 した 目 的
タン パ ク 質 の 直 上 に プ ロ テ ア ゼ サイトを導 入 す る 場 合 そ の プ ロ テ ア ゼ サ イトと目 的タ ン パ
ク 質 の N 末 端 の 局 所 的 p l が 近 い 方 が 可 溶 化 し や す い と い う報 告 が なされ て い る
-
-
ー
､
-
-
-
-
｡
ー
ー
､
( T s u n o d a e t a [ 2 0 0 5) S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の N 末 端 側 5 残 基 の 局 所 的 p l は 6 5 と
中 性 付 近 で あ っ た の で 同 じく中 性 付近 の 局 所 的 p t を持 つ F a c X a サ イトを 選 択 した こ の
発現 ベ クタ を大 腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 に 導 入 し 他 の S A P K 2 変異 体 と 同様 に 発 現
お よ び 可 溶 化 を確 認 した そ の 結 果を図 1 4 ( A ) に 示 した 目 的タン パ ク質 は 培 養温 度 に 関
わ らず 可 溶 化 す る こ とが わ か っ た N M R 測 定 に は 1 5 N 安 定 同 位 体 標 識 し たタン パ ク質 が
-
.
.
,
.
､
｡
ー
､
｡
｡
.
､
､
必 要 で ある そ の た め に M 9 培 地 で の 培 養 を検 討 した そ の 結 果 L B 培 地 で 発 現 さ せ た 時
と同 様 の 結 果 が M 9 培 地を用 い た 場 合 に も確 認 で きた こ の ため 1 m M I P T G で 誘 導 し
発 現 量 が 多くなる 3 7 C で 4 時間 振とう培 養 する こ ととした
S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 精 製 プ ロ トコ
ル を 図 1 5 に 精 製 結 果を 図 1 4 ( B ) に 示 し た
T r x H i s 6 融 合タ ン パ ク 質 も N M R 測 定 に 供 す るた め 爽雑 物 を取り除く目 的 で 1 回 目 の ゲ
ル ろ過 精 製 を 行 っ た 後 陰 イ オ ン 交換 カ ラ ム で 精 製 し 再 度 ゲ ル ろ 過 精 製を行 っ た こ の 操 作
に より 目的 融 合タン パ ク質 は ほ ぼ単
の バ ン ドま で 精 製 で きた そ の 結 果を図 1 4 ( B ) ( L a n e
｡
｡
､
､
｡
､
､
o
｡
ー
-
､
｡
-
､
,
､
､
｡
一
､
6)
｡
ベ クタ
に 示 す S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 発 現
処 理 を行 っ たとこ ろ 著 しく消 化効 率 が 悪 か っ た
1
｡
｡
15
ー
には F
そこ で
､
X
a c
発現
a
サ イトを導 入 し たが
ベ クタ
ー
由来
のプロテア
F
､
ー
a c
ゼ
X
a
のう
ち タグと切 断 後 の 目 的タン パ ク質 の 大きさが異 な っ て おり 比 較 的 分 離 が 行 い や す い E K で
処 理 する こ ととした ( 図 3 ( B)) N M R. 測 定 に 用 い た T r x H i s 6 融合タ ン パ ク質を回収 し 適 当
な濃 度 に 希 釈 後 E K 処 理 を行 っ た E K 処 理 後 ゲ ル ろ過 精 製 に より プ ロ テ ア ゼ と目 的タ
ン パ ク質 を分 離 した 切 断され たタグと目 的タン パ ク質 は 大きさ が 異 なる の に も 関 わ らず 目
､
､
-
0
､
ー
､
｡
､
｡
､
的タン パ ク質 が存 在 する 画 分 に は タグも含 まれ て い
た (図
､
14
( B) L a n e 8) こ の ため 目 的タ
カ ラ ム に 供 し 目 的タン パ ク質 S A P K 2
P
2
8
4
L
3
3
9
1
4
を非
吸
着
画分
図
B
L
a
n
e
9
に
T r x H i s 6 タグを溶 出画 分 ( 図 1 4 ( B )
(
)
(
( )
)
L a n e 1 0) に 回収 し た そ の 後 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) が 含 まれる非 吸 着 画 分 を濃縮 し N M R
測 定 に 用 い た また T r x H i s 6 タグ が 含 まれる溶 出画 分 は ゲ ル ろ 過 バ ッ フ ァ
で 希 釈した後
濃縮 し 同様 に N M R の 測 定 に 供 した
ン パ ク質
が 含 まれ て
い る画 分 を集 め て
Nj
｡
c h e l a ti n g
､
､
-
-
､
-
｡
,
､
-
.
ー
､
､
､
｡
2
組 換え S
.
2 1
の リ ン 酸 化 活 性 とリ ン 酸化 状 態
A P K2
リン 酸 化活 性
-
.
精 製 した組 換 え S
および S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の リ ン 酸 化 活 性を調 べ た ま ず
S A P K 2 ( W T) を酵 素とし M B P を基 質として 試 験 管 内 リン 酸 化 ア ツ セ イを行 っ た そ の 結 果
を 図 1 6 に 示 し た 5 倍 の 酵素 濃度 で 反 応させ ると 酵 素タン パ ク質 あ たり の 自 己 リ ン 酸 化 活
性が 2 8
5 2 倍 高くな っ た ( 図 1 6 ( B)) ま た 酵素 濃 度 が
定の 時 基質濃度の 上 昇に対
応 して S A P K 2 ( W T) の 自 己 リン 酸 化 活 性も高くな っ た ( 図 1 6 ( B))
次 に S A P K 2 O N T) およ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を 酵 素 とし M B P お よ び G S T P J4 K を
基 質 とし て 試 験 管 内リン 酸 化 ア ツ セ イ を 行 っ た そ の 結 果 を 図 1 7 に 示 し た 基 質 で ある
P 1 4 K が G S T 融 合タン パ ク質 な の で コ ン ト ロ
ル として G S T を基 質 に 用 い た反 応も 行 っ
A P K2
(W
T)
-
｡
､
､
｡
｡
､
-
､
一
.
.
｡
､
､
､
0
-
､
-
､
､
｡
｡
ー
､
た C
末端の 31
残 基を欠 失した
お よび 自 己 リン 酸化 活 性 は S A P K
｡
,
に 対 する基 質 リン 酸 化活 性 は
､
S A P K 2 ( M l S 3 0 8)
-
の M BP
に 対 する基 質 リ ン 酸 化 活 性
と比 較 して 顕 著 に 低 下 し た そ れ に 対 し て P 14 K
と S A P K 2 ( M l S 3 0 8) で ほ とん ど変 化 が な か
(
た 場 合 S A P K 2 ( W T) の 自 己 リン 酸 化 活性 が 図 1 6 と同
2
(V V T )
SA P K2
.
W T)
､
-
た また M B P を基 質として 用 い
様 に 高くな っ た が S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の 自 己 リン 酸 化 活 性 に 対 する M B P の 影 響 は あ っ て
もごくわ ず か で あ っ た
方 P 14 K を基 質とし て 用 い た場 合 S A P K 2 ( W T) の 自 己 リ ン 酸 化
は
に
活性
逆 低 下 し た ( 図 1 7 ( B カ S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の 自 己 リ ン 酸 化 活 性 に 対 し て も
P f4 K は 抑制 作 用 を 示 し たが そ の 程 度 は S A P K 2 ( W T) に 対 するそれ に 比 べ て わ ず か で
あっ た
っ
｡
､
､
-
､
一
.
､
､
-
､
｡
､
､
｡
2 2
-
.
リン 酸 化状 態
が活 性 をも つ に は 酵 素タン パ ク 質 の リ ン 酸 化 が 必要 で ある こ とが 当 研 究室 に お
ける研 究 か ら明らか に され て い る ( K o b a y a s h i e t a l 2 0 0 4) 上 述 の よう に 精 製 し た組 換 え
S A P K 2 が 顕 著 な リン 酸 化 活 性 を持 っ て い た こ とか ら 精製 タン パ ク質 が リ ン 酸 化され て い る
か 否 か を調 べ た ま ず 精 製 し た S A P K 2 ( W T)
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) お よ び S A P K 2
S AP K2
､
,
.
,
.
､
､
-
｡
(K
S DS
ph
に 対して
3 3 A)
o s
-
PA G E
ph
o
p
､
ア ル カ リフ ォ ス フ ァ タ
､
で展
r o t ei n
､
開した その 後
g
｡
el
st a i n
(P
ro
､
-
リン
ゼ ( C [ A P ) 処理 あ る い は コ ン トロ
酸 化タン パ ク質 を特 異 的 に 検 出する
ー
ー
P
Q :) および全タン パ ク質 を検 出す る S Y P R O
16
処 理 を行 い
ル
ro
-
R
Q
ub
Di a
y
p
m
o n
r ote
､
d
in
､
el
st ain
染 色 した
結 果を 図 1 8 ( A ) に 示 し た S A P K 2 ( W T) お よ び S A P K 2
(
処 理 の 場 合 は P r o Q で 強く染 色 され C I A P 処 理 を 行 うと
P r o Q に よ る 染 色 レ ベ ル が 低 下 し た こ の こと か ら 両タ ン パ ク 質 は 大 腸 菌 中 で す で に リン 酸
化され て い た こ と が わ か っ た また S A P K 2 ( K 3 3 A:‡ は C I A P 処 理 の 有 無 に 関 わ らず
P ro Q
で ほ とん ど染 色され な か っ たため 大 腸 菌 中 で は ほ とん どリ ン 酸 化され な い こ とが わ か
っ た
こ れ らの 結 果 か ら S A P K 2 ( W T) および S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の 大腸 菌 中 に お けるリン
酸 化 は 自 己 リ ン 酸 化 に よるも の で ある こ とが 推 定された
次 に 精 製 した S A P K 2 ( W T)
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) お よ び S A P K 2 ( K 3 3 A) をそれ ぞ れ
二 次 元 電 気 泳 動 で 展 開し C B B
染 色 で 検 出 し た そ の 結 果を 図 1 8 ( B) に 示 し た S A P K 2
g
で
M l S 3 0 8)
は
-
｡
そ
ントロ
コ
､
の
｡
ル
ー
-
､
-
｡
｡
､
､
､
､
-
､
-
｡
､
､
｡
-
､
､
､
｡
｡
( W T) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) は それ ぞれ 少 なくとも 3 つ 以 上 の ス ポ ッ トに 分 か れ た こ
とか ら こ れら の リ ン 酸 化 状 態 は 均 で な い と考 え られ た こ れ に 対 して S A P K 2 ( K 3 3 A) は
ほ ぼ単
の ス ポ ッ トとして 検 出され た こ の 結 果 は 図 1 8 ( A ) の 結 果 と
致 して い た
リン 酸 化 が 確 認され た精 製 S A P K 2 ( W T) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8 ) は 1 8 C で
晩培
養 し た 大 腸 菌 か ら精 製 した 培 養 温 度 は 低 い が 培 養 時 間 が 長 い た め 菌 体 内 で の 自 己 リン 酸
化 が 進 行 した 可 能 性 が 考 えられる そ こ で 培 養 時 間 が 短くなるとリ ン 酸 化 が 起 こ らな い もし
-
､
一
､
｡
､
一
一
｡
､
｡
o
一
-
､
｡
､
｡
くは リン
S A P K2
酸化
(
る(Ts
u n o
d
､
が 下 が ると い う可 能 性 を 考 え T r x H i s 6 融 合 S A P K 2 ( W T) お よ び
大 腸 菌 の 培 養 温 度 お よ び 時 間を変 化させ て 検 討 した こ
に 示 した 今 回 使 用 した p D E S T t r x ベ クタ は p E T 3 2 a ( + ) を改 変 し て い
af
2 0 0 5) そ こ で 融 合タン パ ク 質 の リン 酸 化 が T r x H i s 6 タグ部 分 で は なく
起 こ っ て い る ことを示 す コ ン トロ
ル とし て は P E T 3 2 a ( + ) を使 用 し た
19
SA P K2
部分
PE T 32
+
､
､
｡
ー
-
-
｡
et
a
-
の リン 酸 化状 態を
K 3 3 A)
結 果 を図
の
､
レベ ル
.
で
-
｡
,
､
､
-
-
､
｡
a ( )
p D E S T t r x P ｢ e S S A P K 2 ( W T) お よ び p D E S T t r x
大 腸 菌 B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株 に 導 入 し それ ぞれ の 大 腸 菌を 5 0
発 現 を誘 導 後 3 7 C また は 3 0 C で 3 時 間 も しくは 1 8 ℃ で
-
-
-
-
､
-
P
S S A P K2
LL M I P T G
,
o
re
( K 3 3 A) を
-
に より遺 伝 子
o
晩 培 養した その 後 大
腸 菌 を超 音 波 処 理 に より破 砕 し 融 合 タン パ ク質 誘 導 前 誘 導 後 超 音 波 破 砕 後 の 可 溶 性 画
分 および 不 溶 性 画 分 に 分 け て S D S P A G E で 展 開 した そ し て 図 1 8 ( A ) と同 様 に P r o Q
D i a m o n d p h o s p h o p r o t e i n g e 一s t a i n ( P r o Q ) お よ び S Y P R O R u b y p r o t e i n g e l st a i n で 染 色
し た T r x H i s 6 S A P K 2 ( W T) の バ ン ドは 他 の タ ン パ ク 質 と比 較 し て P r o Q に より顕 著 に 染
色され て い た 予 想 に 反 し て そ の 染色 の 程 度 は 培 養 温 度 お よび 時 間 に よる違 い が 見 られ な
か っ た また 融 合タン パ ク質 誘 導 後 お よ び 超 音 波 破 砕 後 の 可 溶 性 画 分 に 見 られたタン パ ク質
だ け で なく 不 溶 性 画 分 に 見 られ たタン パ ク質もリ ン 酸 化され て い た
方 T r x 日i s 6 S A P K 2
K
3
3
A
P
r
o Q
に よる 染色 の 程 度 は 他 の タン パ ク質と ほ ぼ 変 わ らず T r x S A P K 2 ( K 3 3 A )
(
) の
は リン 酸 化され て い な い こ と が わ か っ た p E T 3 2 a ( + ) を導 入 して 発 現さ せ た T r x H i s 6 タグ
は わ ず か に リ ン 酸 化され て い た が タン パ ク 質 あ たり の リ ン 酸 化 レ ベ ル を 比 較 すると S A P K 2
一
､
､
､
｡
､
､
-
-
､
｡
､
､
-
-
-
-
.
､
｡
｡
､
､
､
一
一
､
｡
-
､
-
-
､
1
-
.
､
(
W T)
の 方 が よりリン 酸化され て い た
ン酸化 は
3
､
ほ とん どが S A P K 2
｡
この結
部分で起
こっ
果 か ら T rx
たと言 える
､
-
Hi s 6 S A P K 2
-
(
W T)
で検
出され た リ
｡
立体構造解析
.
3 1
-
.
X
線 立 体 構 造 解 析 の ため の 結 晶化
S A P K2
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) お よ び S A P K 2 ( K 3 3 A ) に つ い て X 線法 に よる立 体
構 造 解 析 を 目 指 し て 結 晶 化 条 件 探 索 の た め の 初 期 ス クリ ニ ン グ を 行 っ た まず S A P K 2
(W
T)
-
､
､
ー
､
｡
17
､
( W l ) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の 結 晶 化 を 市 販され て い る結 晶 化 キ ッ トを 用 い て ハ ン
ギ ン グドロ ッ プ蒸 気 拡 散 法 に より試 み た ( 図 4) S A P K 2 ( W T) に つ い て は 表 5 に 示 した よう
に 6 キ ッ ト 計 2 9 0 条 件 S A P K 王 ( M l S 3 0 8) に つ い て は 3 キ ッ ト 計 1 4 4 条 件 の リ ザ
バ
溶 液 に つ い て 結 晶化を試 み たが 現 時 点 で 結 晶 は 得 られ て い な い
-
､
､
.
､
'
､
ー
L
､
-
､
､
ー
､
上 述 の ように
｡
精 製 した S A P K 2 ( V 〉丁) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) は す で に 大腸 菌 中 で リ
おり そ の リ ン 酸 化 状 態 は 均 で な い ことが わ か っ た ( 図 1 8) リン 酸 化 に より タ
ン パ ク質 に は リン 酸 基 の 負 電 荷 が 導 入される こ の こ とに より リン 酸 化され たタン パ ク 質 で は
リン 酸 化され る前 と比 較 し て 表 面 電 荷 に 変 化 があると予 想され る また 二 次 元 電 気 泳 動 で
ス ポ ッ トが 分 か れ た ( 図 1 8 ( B)) こ と か ら リン 酸化され た こ とに よりタン パ ク 質 の p l に 変 化
が あ っ た こ とが わ か る し た が っ て こ れら の タン パ ク質 溶 液 に は 表 面 電 荷 や p l の 異 なる い く
-
､
ン 酸 化され て
一
､
｡
｡
､
､
,
､
｡
､
､
｡
､
か の タン パ ク質 が 含 まれ て い ると考 えられ る タン パ ク質 の 結 晶 化 に お い て タン パ ク 質 試
料 の 均 質 性 は重 要 で あり こ れ ら の タ ン パ ク質 の リ ン 酸 化 状 態 の 不 均 さが 結 晶化 の 妨 げ に
つ
｡
､
一
,
なっ
て い る ことが 可
能 性 とし て 考 えうる 現 状 で は リ ン 酸 化され たタン パ ク 質 か ら 効 率 的 に す
べ て の リ ン 酸 基 を脱 リン 酸 化 する 方 法 は な い と思
わ れる そ こ で 全くリ ン 酸 化され な い もしく
は リ ン 酸 化 は され て い る が リ ン 酸 化 状 態 が 均
な S A P K 2 タ ン パ ク 質 が 必 要 で あると考 え
S
A
P
K
2
K
た 精 製 した
( 3 3 A ) は 図 1 8 お よ び 図 1 9 の 結 果 か ら ほ とん どリン 酸 化され て い
な い と い う こ とが わ か っ た そ こ で S A P K 2 ( W T) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) と同 様 に
｡
､
｡
､
､
一
､
｡
､
､
-
c
､
S A P K 2 ( K 3 3 A ) の 結 晶 化を試 み た 表 5 に 示 し たように 2 キ ッ ト 計 9 8 条 件 の リザ
バ
溶 液 に つ い て 結 晶化 を試 み た が s A P K 2 ( K 3 3 A) に 関 し て も 現 時 点 で 結 晶 は 得 られ て い な
ー
｡
､
ー
､
い
｡
3 2
N M R
-
.
SA P K2
測定
末 端 領 域 の 構 造 解 析 お よ び機 能解 明を目 指 し て N M R 法 に よる 解 析 を行
っ た
最 初 に 1 5 N 標 識 した T r x H i s 6 融合 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) お よ び T r x H i s 6 タグ の
1 H 15 N
HS Q C
の 測 定 を行 っ た そ の 結 果 をそ れ ぞれ 図 2 0 ( A) お よ び ( B) に 示 し た
1 日 1 5 N H S Q C は 各 アミノ 酸 の ア ミド基 の N H を観 測 する ことが 可 能 で あり N H の プ ロ トン
( 1 H ) と窒 素 ( 1 5 N ) の 相 関を検 出す る つ まり 1 H 1 5 N H S Q C ス ペ クト ル 上 の それ ぞ れ の シ
グナ ル が タン パ ク質を 構 成 する ア ミノ酸 それ ぞ れ に 対応 して い る 試 料 タ ン パ ク 質 が 立 体 構 造
C
の
､
-
.
-
-
､
-
｡
｡
-
､
､
-
｡
､
.
｡
を保 持 し て い る場 合 各 アミノ 酸 の 化 学 環 境 は そ れ ぞ れ が 大きく異 な る の で 1 H 1 5 N H S Q C
の 各 シ グ ナ ル は 分 離 す る そ れ に 対 して 明確 な立 体構 造を保 持し な い ラ ン ダ ム コ イ ル の 場 合
そ れ ぞれ の ア ミノ酸 が 置 か れ た 化学 環 境 が ほ ぼ 同 じとなるため こ の 分 散 度 は 消 失 し 各 シ グ
-
､
､
｡
､
､
ナ
ル
は
ス ペ
クトル の 中 心 に 集 中 す る
( P 2 8 4 L 3 3 9)
の 1 H 15N HS Q C
-
-
図
｡
の ス ペ クトル
20
は
(
､
､
に 示 した
A)
ス ペ クトル の
､
T
rx
-
H is 6
中 心 に シ グナ
融 合 SA P K2
が集 ま っ て い
ル
る 部 分 が 見 られるも の の 全 体 的 に シ グナ ル が 分 散 し て い た こ の 結 果 は 少 なくとも明 確 な
立 体構 造 をと っ て い る部 分 が ある ことを 示 し て い る 続 い て 図 2 0 ( B ) に 示 し た T r x H i s 6 タ
グの ス ペ クト ル は それ ぞ れ の シ グ ナ ル が 分 散 して おり T r x タグ は 安 定 な立 体 構 造 を保 持 し
､
｡
､
-
｡
､
､
､
て い る こ とを 支 持 す る結
果 が 得 られ た 園 2 0 ( C ) に は T r x H i s 6 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) ( マ ゼ
ン ダ) と T r x H i s 6 タ グ ( シ ア ン) の H S Q C を 重 ね 合 わ せ た ス ペ ク ト ル を 示 し た ま た
T r x H i s 6 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の ス ペ クト ル の み で 見 られ た シ グナ ル お よ び T r x H i s 6 タグ
の み で 見られ た シ グナ ル をそれ ぞれ 赤 お よび 青 で 囲 ん だ T r x H i s 6 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の
ス ペ クト ル で は 見られ る が S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) を 除 去 した T r x H i s 6 タグ の み の ス ペ クト
-
｡
-
-
､
-
｡
-
-
-
-
-
1
.
-
-
､
】
_8
-
､
ルには
見られ な い シ グ ナ ル が いくつ か 見 られ た こ の ような シ グ ナ ル は 中 心 に シ グ ナ ル が集
ま っ て い た 部 分 だ け で なく 周 辺 に 分 散 した 特 徴 的 な シ グナ ル の 部 分 に も い くつ か 見 られ た
例 え ば 1 H : l l 2 6 p p m 1 5 N : 1 0 2 5 p p m ある い は 1 H : 6 8 4 4 p p m 1 5 N : 1 0 7 2 p p m の
シ グ ナ ル で ある こ の 結 果 か ら S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9 ) が 明 確 な立体 構 造 を保 持 し て い る 可 能
性 が 予 想 され た そ こ で 本 実 験 の 目 的 で ある 1 5 N 標 識 し た S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9 ) の
｡
､
,
､
.
｡
,
.
.
.
,
-
｡
､
-
｡
1 H 15 N
､
そ の 結 果 を 図 2 0 ( D) に 示 した 予想 に 反 して こ の ス ペ クト
ル で は それ ぞ れ の シ グ ナ ル が 中心 に 集 中 し て おり S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) は 明 確な 立 体 構 造
を保 持 し て い な い ことを 示 唆す る 結 果 が 得られ た
次 に S A P K 2 C 末 端領 域 は キ ナ ゼドメイン と 相 互 作 用す る か どうか を N M R 測 定 に よ
り調 べ た 1 5 N 標 識 した S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 1 日 1 5 N H S Q C の 測 定を行 っ た 直 後 に
HS Q C
-
の 測 定を行 っ た
｡
｡
､
-
､
｡
ー
､
､
-
-
｡
､
標 識 して い な い
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を 2
の 1 日 1 5 N H S Q C の 測 定 を行
再び
クト ル を 図 2 0 ( E) に 示 した
また 図 2 0 ( F) に は S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の み の 時 ( マ ゼ ン ダ) と S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を
加 え た 時 ( シ ア ン) の H S Q C を重 ね 合わ せ た ス ペ クトル を 示 し た 図 2 0 ( F) 中 に S A P K 2
( M l S 3 0 8) を加 えると消 え る シ グナ ル を赤 で S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を加 え ると現れ る シ グ ナ
ル を青 で 囲 ん だ こ の ような シ グナ ル の 変 化 は S A P K 2 C 末 端 領 域 が キ ナ
ゼドメ イン と相
互 作 用 する 可 能 性 を示 して い る
( P 2 8 4 L 3 3 9)
-
倍 濃 度 に な る よ うに 加 え て
-
-
た
っ
(,
この
S A P K2
､
時の ス ペ
-
､
-
､
｡
､
-
-
､
ー
｡
､
｡
3 3
モ デリン グ
-
.
線
X
N M R
とも に S
の 構 造 解 析 に は 至 らな か
た 立 体 構 造を決 定 する方 法 は
線 電 子 線 顕 微 鏡 など) の 他 に モ デ リ ン グ 法 が あ
る モ デ リ ン グ 法 はさらに 2 つ に 分 けられ る 1 つ は ア ミノ 酸 配 列 に 基 づ き構 造 未 知タン パ
ク質 の 立 体 構 造 を予 測 する モ デ リ ン グ法 で あ る もう 1 つ は ホ モ ロ ジ モ デ リン グ法 と呼 ば
れ ア ミノ酸 配 列 に 相 同 性 の ある 構 造既 知タン パ ク質 の 立 体構 造 をテ ン プ レ トとし て 構 造未
知タ ン パ ク 質 の 立 体 構 造 を予 測 する手 法 で ある ホ モ ロ ジ モ デ リ ン グ 法 で は ア ミノ 酸 相 同
性 の 高 い タ ン パ ク質 の 立 体 構 造 が 既 知 で ある こ と が 必 須 条 件 となる 近 年 P r o t e i n D a t a
､
A P K2
実 験 に より直 接 決 定する方 法 ( N M R
､
X
っ
｡
､
､
｡
.
｡
､
､
.
ー
｡
､
ー
､
､
ー
｡
､
｡
B
k
a n
の タン パ ク質 構 造 が 登 録され て い る
41 385
,
上 がり
こ の こと か ら
.
､
2 00 7
､
年
ホモロ ジ
､
1
月
日 現在
30
モ デ リ ン グ法 の
ー
､
精度が
そ の 有 用 性 が 高まり つ つ ある
に は 微 生 物 や 動 物 な どの プ ロ テ イ ン キ ナ
ゼ の 構 造も数 多く含 まれ て い る そ こ で
に 登 録 され て い るタ ン パ ク質 の うち S A P K 2 と 相 同 性 の 高 い も の の 構 造 を もと に
K 2 の 立 体 構 造 モ デ ル をホ モ ロ ジ
モ デ リ ン グ法 に より 構 築 し た P D B に 登 録され て い
､
｡
P D B
P D B
S A P
に 登 録され るタン パ ク質 構 造 は 著 しく増 加 し
(P D B)
ー
､
｡
､
,
ー
｡
るタ ン パ ク質 の うち S
W T)
と相 同 性 を 示 すも の の 検 索 を B L A S T s e a r c h a g a i n st
(
3 D st r u ct u r e に より行 っ た そ の 結 果 S A P K 2 ( W T) と 3 4 %
の ア ミノ 酸 が 同 で ある 2 H A K
P
D
B
I
パ
D ; タン
ク質 名 は M A R K l) の 立 体構 造 が P D B に 登 録され て い る ことが わ か っ た
(
そ こ で こ の 2 日A K を テ ン プ レ トとし て S W I S S M O D E L に よる モ デ リ ン グ を行 っ た
A P K2
一
-
.
､
｡
ー
-
､
､
モ デ リ ン グ構 造 は
App
h
l
S W [S S M O D E L
-
､
および
｡
の F ir st A p p
ro a c
h
m o
d
e
を利 用 して
2
種 類 ( F i r st
を利 用 し て 2 種 類 ( A 一ig n m e n t l n t e げa c e 1
お よ び 2) 合 わ せ て 4 種 類 の 構造を得 た こ れ ら の モ デ リン グ構 造を図 2 2 に 示 した 図 2 2
( B) は リボ ン 構 造 を ( C ) は 表 面 電 荷 構 造 を 示 した. テ ン プ レ トとした 2 H A K は X 線 結 晶
構 造 解 析 に より A c h a i n か ら H c h a i n ま で の 八 草 体とし て 構 造 が 解 析され て い る ( M a r x e t
ro a c
､
2)
､
A lig
n m e nt
l n t e げa
c e
｡
｡
ー
､
｡
､
19
､
｡
al
,
2 0 0 6)
こ の うち
ア クチ ベ
プ部 分 の 電 子 線密 度 が 検 出 で き 構 造 が 登 録され て
い るも の は E お よ び F c h ai n の み で ある そ こ で F i r s t A p p r o a c h 2
A lig n m e n t I n t e rf a c e
l お よ び 2 で は 2 H A K E c h a i n をテ ン プ レ
トに 指 定 し モ デ リン グを行 っ た 2 H A K E c h a i n
の リ ボ ン 構 造 お よ び 表 面 電 荷 構 造を園 2 2 ( A) に 示 した
テ ン プ レ トとした 2 H A K E c h a i n の 構造 および S A P K 2 ( W T) の モ デ リ ン グ 構 造を詳 細
に 比 較 す るため に こ れら の 構 造 の こ 次 構 造 お よび S A P K 2 の 二 次 構 造 予 測 の 結 果 を含 め
た S A P K 2 ( W T) お よ び 2 日 A K の ア ライメ ン トを図 2 1 に 示 した S A P K 2 ( W T) の モ デリ ン
グ 構 造 の 二 次 構 造 は テ ン プ レ 卜 で ある 2 H A K E c h ai n の 二 次 構 造 や J p r e d を 用 い た
S A P K 2 の 二 次 構 造 予 測 の 結 果とよく 致 して い た ( 図 2 1)
方 古典的 C h o u F a s m a n 法
に よ る 予 測 とは あまリ 致 し な か っ たも の の C 末 端領 域 に 関 し て は ロ ヘ リツ ク ス が 予 測さ
れ て い るとい う共 通 点 は あ っ た ( 図 2 1 )
.
.
､
ショ ン ル
-
ー
､
.
､
､
ー
､
｡
o
ー
､
｡
-
､
一
一
-
｡
､
ー
ー
､
｡
得 られ た モ デ リ ン グ 構 造 を 比 較 し た結 果 以 下 の こ とが 明らか とな っ た F i r s t A p p r o a c h の
両 モ デリン グ 構 造 は キ ナ ゼドメイ ン と ほ ぼ 致する 2 6 4 番 目 の ロ イ シ ン ま で し か 予 測され
て い な か っ た ( 図 2 1 お よ び 2 2 ( B)) F i r s t A p p r o a c h m o d e で は テ ン プ レ
トと相 同 性 が 高
､
｡
-
-
､
ー
0
､
部 分 の み し か モ デ リ ン グされ な い と言 え る
方 A lig n m e n t h t e rf a c e で は 2 H A K の 配
列 とア ライメ ン トされ な い C 末 端 の 7 残 基を除 い て 全 長 が モ デ リ ン グされ て い た ( 図 2 1 お
よ び 2 2 ( B )) F i r s t A p p r o a c h l で は テ ン プ レ ト構 造 を 指定 して い な い が それ 以 外 の 構 造
で は 2 H A K E c h ai n を テ ン プ レ
トとし て 指 定 し て モ デ リ ン グ を行 っ た そ の 結 果 F ir st
A p p r o a c h l 以 外 の 構 造 で は アク チ ベ
シ ョ ン ル プ の 領 域 に ロ ヘ リツ ク ス が 存在 す る構 造
が 得 られ た また A = g n m e n t l nt e 什a c e を用 い て 行 っ た モ デ リン グ 構造 で は F ir st A p p r o a c h
で 予 測 し たとき に 存 在 し て い な い 【ニト ヘ リ ツ ク ス ( F 2 0 9 S 2 1 8 ) が 予 想 され た こ の 違 い は
A = g n m e n t l n t e rf a c e と F ir s t A p p r o a c h に 用 い た ア ラ イ メ ン ト で の ギ ャ ッ プ の 挿 入 位 置
い
･
一
｡
､
､
ー
0
､
､
-
｡
ー
､
ー
ー
.
､
､
-
｡
､
( A lig n m e n t l n t e rf a c e で は P 2 0 3 P 2 0 6 を 2 H A K の ギ ャ ッ プとした) の 違 い に 起 因すると思
わ れ る 以 上 の 結 果 か ら ホ モ ロ ジ モ デ リ ン グ構 造を 構 築 するとき の 重 要 な 点とし て ア ミノ
酸 相 同性 の 高 い テ ン プ レ トを使 用 する こと 精 度 の 高 い 既 知 構 造を テ ン プ レ トに 用 い る こと
そ し て ア ライメン ト精度 を高 め る ことが 重 要 で ある ことが わ か っ た A lig n m e n t ] nt e rf a c e で 得
られ た 2 つ の 構 造 は 類 似 性 が 高 い し か し ニ 次 構 造を 加 味 し て C L A S T A u 〃 に よ る ア ラ
-
-
.
-
､
､
ー
ー
､
､
.
､
｡
､
イメ ン トを補 正 し て い る こ とか ら 本 研 究 で は
､
グ構造 は
A lig
の
n m
結果
がわか
､
､
っ
A lig
､
e nt
e nt
n m
I n t e rf a
I n t e rf a
c e
2
22
( A)
2
､
構造 機 能 相 関 を議 論 するた め に 用 い る モ デ リ ン
が 適 当 で あると判 断 し た
.
と
分子表面 の細部 の
た(図
c e
､
2 日A K. の 構 造をリボ ン 表 記 および 表 面 電 荷構 造 で 比 較 し た そ
構 造 が 異 なる こ とに 加 え て 表 面 の 電荷 の 分 布 に 違 い が ある こ と
｡
､
および ( C))
0
第四 章 考察
l
.
S A P K2
(
W T)
タン パ ク 質
お よ び そ の 変異 体 の 精 製 条件 の 確 立
立 体 構 造 解 析 手 法 とし て
線 結 晶 構造解析 および 溶 液 N M R 法 が 般 的
に 用 い られ る どちら の 手 法 を選 択する場 合 で も 大 量 か つ 高 純 度 の 試 料 タ ン パ ク質 が 必 要と
なる また i n v it r o で の 活 性 測 定 実 験 に も組 換 えタン パ ク質 は 必 須 で あり か つ 定 量 性 の あ
る精 度 の 高 い 活 性 実 験 に は 活性 型 で か つ 純度 の 高 い タン パ ク質 を用 い る こ とが 重要 で ある
目 的タ ン パ ク質を活 性 型 で 高 純 度 か つ 大 量 に 得る た め に は 様 々 な発 現 お よ び 精 製 条 件 の
の
､
X
一
｡
｡
､
､
､
､
､
､
20
｡
検 討を行う必 要 が ある 本 研 究 で は 培 養 が 容 易 で 短 時 間 で 行 え る大 腸 菌発 現 系を 用 い て
S A P K 2 お よび そ の 変異 体 の 発現 およ び 精 製 の た め の 様 々 な検 討 を行 っ た
大 腸 菌 内 で 発 現 させ た 組 換 え タン パ ク質を 可 溶 性 の 形 で 得 る た め に は 目的タン パ ク質 と
融 合 させ て 発 現 するタグタン パ ク質 の 選 定 が 重 要 で ある T s u n o d a ら ( 2 0 0 5) は 様 々 な イ
ネタン バ ク質を検 討 した結 果 T r x 融 合タン パ ク質として 目的タン パ ク質 を発 現させ た 場 合 に
｡
､
､
｡
､
｡
､
,
,
可 溶 化 し や す い 傾 向 が ある ことを報 告 し て い る
また K a p u s t ら ( 1 9 9 9) お よ び L a V a lli e ら
はタ グとし て T r x G S T および m a lt o s e b i n d i n g p r o t e i n ( M B P) を使 用 し た場 合 目
的 の 融 合 タン パ ク質 は 効 率 良く大 腸 菌 内 の 可 溶 性 画 分 に 回 収される ことを報 告 して い る な か
で も T r x は バ ク テ リ ア だ け で なく 広く動 植 物 に 分 布 し て おり ( B a y e r 1 9 6 8 ; H o l m g r e n
( 2 0 0 3)
｡
､
､
､
｡
､
1 9 8 5)
ヒ トや マ ウ ス の イ ン タ
､
,
ロ イキ ン タ ン
ー
,
パ ク 質を 含 む 数 々 の タ ン パ ク 質 は T r x
融 合タン パ
ク質とし て 大腸 菌 内 の 可 溶 性 画 分 に 回 収 され る ことが 報 告され て い る ( L a V a lli e 1 9 9 3) 加 え
て 目 的タン パ ク質 の 可 溶 化 に は 大 腸 菌 発 現 株 の 選 択 や 培 養 条 件 な ども大 きな影 響 を与 え
,
､
｡
､
る S A P K 2 ( W T) に つ い て こ れらの 条 件 の 検 討 を行 っ た結 果 発 現 お よ び 精 製 に 用 い るタグ
に よ る 発 現 量 の 違 い や 大 腸 菌発 現 株 に よ る 可 溶 化 の 違 い が 大き い こ とが わ か っ た 特 に
S A P K 2 に お い て も融 合タ ン パ ク質とし て T r x を 用 い た 場 合 タン パ ク 質 の 可 溶 化 に 効 果 が
ある こ とが わ か っ た
S A P K 2 ( W T) と そ の そ れ ぞれ の 変 異 体 で は 培養 条 件 を 変 化させ た 時 の 挙 動 が 大きく異
なる こ とが わ か っ た こ の 結 果 か ら 目的タン パ ク質 の ドメ イ ン 化 を検 討 する こ との 重 要 性 が 示
唆さ れた
｡
､
､
｡
､
､
｡
､
｡
､
｡
構 造 解 析 に 用 い るた め に は 活 性 測 定 に 用 い る 場 合 と は 異 なり タグな ど の 余 分 な配 列 が
付 加 しな い こ とが 望 まし い そ こ で 本 研 究 で は 目 的タ ン パ ク質 の N 末 直 上 に 任 意 の プ ロ テ
ア
ゼ サ イトを導 入 し て 発 現 ベ クタ を 構 築 した そ の 結 果 導 入 する プ ロ テ ア ゼ サ イトに
より 切 断 効 率 や プ ロ テ ア ゼ 処 理後 の 安 定性 に 大 きな差 が ある ことが 明ら か とな っ た 例 え
ば 図 8 に 示 した ように S A P K 2 ( W T) に E K を 導 入 し た 場 合 直 上 の プ ロ テ ア ゼ サ イトで
切 れ な い こ と 分 解 が 起 こ る こ とが 問題 とな っ た 直 上 の プ ロ テ ア ゼ サ イトで 切 れ な い とい う
､
､
｡
､
､
ー
ー
ー
､
｡
､
ー
､
｡
ー
､
､
､
ー
､
｡
現 象 は T E V p r o t e a s e ( T E V ) を導 入 した 場 合 で も 見られ た ま た P r e S 処 理 で は 正 し い 位
置 で 切 断 が 起 こ る が 酵 素 量とし て は 添 付 の プ ロ ト コ
ル に 記 載 され て い る最 小使 用 量 の 約
2 倍 を用 い て い る プ ロ テ ア
ゼ 処 理 の 効 率 が 悪 い 理 由 は 以 下 に 示 す 2 つ の こ とが 考 え ら
れ る 1 つ 目 は プ ロ テ ア ゼ サ イトの す ぐ近 傍 に S A P K 2 が 物理 的 空 間 を占 め て い て プ
ロテア
ゼとプ ロ テ ア ゼ サ イトの 相 互 作 用 を阻 害 す る 可 能 性 が 考 えられ る 図 2 1 に 示 した
､
｡
､
ー
､
ー
｡
ー
｡
､
､
ー
ー
｡
次 構造 予 測
デ リン グ の 結 果 に よる と S A P K 2 の 3 番 目 の ア ル ギ ニ ン か ら ロ シ
トが 予 測され て い る ことか ら こ の 可 能 性 は 高 い と 考 え られる
2 つ 目 は 導 入 した プ ロ テ
ア
ゼ サ イトや G a t e w a y ベ クタ 由 来 の 付 加 的 配 列 が S A P K 2 の 立 体 構 造 形 成 を阻 害 し
u n f o k】 構 造 の た め に プ ロ テ ア
ゼ が作 用 で きな い と い う可 能 性 で ある E K サ イト の 導 入 に よ
る 目 的タン パ ク質 の 分 解 は プ ロ テ ア ゼ サ イトの 認 識 が 甘く また活 性 が 強 い ため 非特 異 的
およ びモ
二
ー
､
ー
､
｡
ー
､
ー
ー
｡
ー
､
､
こりやす い ためと考 え られる
な切 断 が起
般 的 に E K T h r o m bi n お よ び F a c X a な ど の 認
識 配 列 が 短 い プ ロ テ ア ゼ は プ ロ テ ア ゼ サ イトの 配 列 特 異 性 が 低 い こ とが 知られ て い る
実 際 E K サ イトを導 入 し た T r x H i s 6 S A P K 2 ( W T) を こ れ ら 3 つ の プ ロ テ ア ゼ で 処 理
す ると 認 識 サ イ ト 以 外 で も非 特 異 的 な 切 断 が 起 こ っ た それ に 対 し て 認 識 配 列 が 長 い
一
､
.
ー
､
ー
､
.
-
-
ー
､
､
､
P
re
S
｡
および
S A P K2
(
T E V
P 2 84
1
､
で 同様 に 処 理 す ると 非 特 異 的 な 切 断 は 全く起 こらな か
､
L 3 3 9)
の
場合
､
N
末端側
5
2 1
残基の 局所 的
pl
は 6 5
.
っ
た
｡
と中性 付 近 で あ っ
､
た こ とか ら 同 じく中性 付 近 の 局 所 的 p [ を持 つ F a c X a サ イトを選 択 し た し か し T r x H i s 6
融 合タ ン パ ク質を F a c X a で 処 理 し た 結 果 消 化 効 率 が 著 しく悪 か っ た 上 記 で 示 し た理 由 と
同様 の 可 能性 が考 え られ る 導 入 し た F a c X a サ イトで の 切断 が 行 え な か っ た の で P E T 3 2 a
( + ) 由来 の E K もしくは T h r o m b i n サ イトで の 切 断を試 み た ( 図 3 ( B)) こ れら の 位 置 で は
切 断され たが どちら の プ ロ テ ア ゼを 用 い た場 合も目 的 の S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9 ) に 加 え て
分 解 産 物も見られ た T h r o m bi n サ イトで 切 断 した 場 合 タグと目 的タン パ ク質 の 大 きさ ( 推 定
分 子 マ ス が それ ぞ れ 1 3 9 k D a お よ ぴ 1 2 3 k D a) が 近 い の で そ の 後 の 分 離 が 難 し い と考
､
-
｡
､
､
｡
｡
-
､
｡
ー
1
､
｡
､
.
､
.
え E K サイトで 切 断 す る こと に し た E K サ イトで 切 断 すると 精製 お よ び濃 縮 の 過 程 で 再 び
分 解 する 傾 向が 見 られ た 以 上 の 結 果 か ら 今 後 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 研 究 を進 め るた
め に は 直 上 に 導 入 し た時 に 正 しく切 断 が 起 こり か つ 目的タン パ ク質 が 分 解 しな い ような プ ロ
テ ア ゼ サイトの 再 検 討 を 行う必 要 が ある
プ ロ テ ア ゼ 処 理 効 率 に 処 理 す る 前 の タン パ ク質 純度 が 大 きく影 響 す る こ とが わ か っ た
､
｡
､
-
｡
､
､
､
ー
｡
ー
､
( 図 9) つ まり 少な い 酵 素 量 で 効率 的 に 切 断 するため に は 爽 雑 物 や 可 溶 性 で ある に も か か
わ らず あ る程 度 凝 集 して い る目 的タン パ ク質 を 取り除くこ とが 重 要 で あると考 えられ た 用 い る
プ ロ テ ア ゼ の 酵 素 量を減らす こ とは 非 特異 的な切 断を抑 え る こと に も つ な が ると思 わ れる
｡
､
､
｡
ー
､
また S
｡
は S A P K 2 ( V V T) や S A P K 2 ( M l S 3 0 8) に 比 べ て タン パ ク質 が
(
不 安 定 で あっ た P re S 処 理 後 に
部 分 解 産 物 が 見られ ゲ ル ろ過 に より こ れ を除 去 し て も
精 製 後 に 再 び 分 解 産 物 が 増 加 した こ の 結果 は 3 3 番 目 の リジ ン が リ ン 酸 化 活 性 ば か り で な
く S A P K 2 タ ン パ ク質 の 安 定性 に 重要 で ある 可 能性 を 示 唆す る
A P K2
､
K 3 3 A)
-
､
､
-
｡
､
｡
､
､
､
2
｡
組 換え S
.
の リン 酸 化 活 性
A P K2
ソラ マ メ A A P K
タバ コ N t O S
プロ テイン キ ナ
お よ び シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ O S T l / S R K 2 E など様 々 な植 物
由 来の S n R K 2
ゼ を大腸 菌 で 発 現させ た場 合 こ れら の 組 換 え S n R K 2 タ
/
i
ン
ク 質 は リン 酸 化 活 性を持 たな い とい う報 告 がなされ て い た ( L i e t a L 2 0 0 0 ; K e l n e r e t a [
2 0 0 4 ; M u s ti[li e t a I 2 0 0 2)
方 最近 に な っ て N t O S A K お よ び O S T l / S R K 2 E を 大 腸 菌
で 発 現さ せ た組 換 えタン パ ク質 は リ ン 酸 化活 性をも っ て おり 大 腸 菌 内 で リン 酸 化され て い る
ことが 報 告され た ( B u r z a e t a r
2 0 0 6 ; B e [i n e t a L 2 0 0 6) また 大 腸 菌 で 発現 させ たイネ
A K
､
ー
､
,
.
,
一
.
｡
,
､
､
､
.
､
,
,
.
､
S A P K 6/ O S R K l
もリン 酸 化 活 性 を持 つ こ とお よ び そ の 生化 学 的な 特 徴 が 報 告され た ( C h a e
et a L
2 0 0 7) 本 研 究 で は 構 造 解 析 を目的とし た大量 か つ 高 純 度 の S A P K 2 お よ び そ の 変
異 体 の 精 製 に 成 功 した 上 記 の ように 報 告 に よ っ て 結 果 が 大 きく異 なる の は 実 験 に 用 い た 組
換 え タン パ ク質 の 純 度 ( 活 性 型 非 活 性 型 の 存 在 量 不 純物 の 混 入 等) が 異 なる 可 能 性 を 示
,
｡
､
｡
,
､
､
唆 し て い る 本 研 究 で 確 立 し た手 法 に より得られ たタン パ ク 質 は ゲ ル ろ 過 分 析 の 結 果 単 分
散 で 存在 し て い る こ とを確 認 して おり 会 合 状態 で なく活 性 型 で ある可 能 性 が 高 い また 精製
純 度も高 い こ れ ら の ことか ら こ の 研究 で 得 た組 換 え S A P K 2 タン パ ク質 は そ の 生 化 学 的 性
｡
､
､
､
｡
-
.
S A P K2
S A P K2
､
､
質 の 解析 に 適 し て
2 1
｡
い ると考 えられ た
()
( W T)
の
自 己 リン 酸 化 様 式
認され た自 己 リン 酸 化 が 分 子 内自 己 リ ン 酸 化 また は 分 子 間 自 己 リン 酸
化 の どちらで 起き て い る の か を検 討 した S A P K 2 の 自 己 リン 酸 化 が 分 子 内 自 己 リン 酸 化 で あ
る 場 合 は それ ぞ れ の 分 子 の み が 酵 素 で あり基 質 で あると仮 定 で きる すなわち 酵 素 濃 度 が
(
W T)
で確
｡
､
｡
22
､
上 昇 し て も酵 素 あたりの 基 質 濃度 は 増 え な い の で
酵 素 タン パ ク 質 あ たり の 自 己 リン 酸 化 活 性
は 同 じ に なる は ず で ある
方 分 子 間 自 己 リン 酸 化 の 場 合 は 酵 素 濃 度 の 上 昇 に 伴 い 酵
素 あたり の 基 質 濃 度 も上 昇 し て い くと考 えられ る の で 酵 素タン パ ク質 あ たり の 自 己 リ ン 酸 化 レ
ベ ル は 酵 素 濃 度 に 比 例 し て 上 昇すると考 え られる 図 1 6 に 示 した実 験 か ら 酵 素とし て 加 え
.
た S A P K 2 ( W T) を 5 倍 濃 度 で 反 応させ ると 酵 素タン パ ク 質 あ たり の 自 己 リン 酸 化 レ ベ ル
が 2 8
5 2 倍 高くなるとい う結 果 が 得 られ た 本 実験 で は 酵素 濃 度を 2 点 し か とっ て い
な い が こ の 結 果 は S A P K 2 ( W T) で 見 られ る自 己 リ ン 酸 化 が 分子 間 自 己 リ ン 酸 化 で ある こ
とを 強く示 唆 す る
､
一
｡
,
､
､
､
｡
､
､
-
､
.
.
.
､
､
､
｡
2 2
SA P K2 C
-
.
末端 領 域
残 基 の 欠 失 が 自 己 リン 酸 化活 性 に 与 える影 響
の 31
図 1 7 に 示 した実 験 で は S A P K 2 ( M l S 3 0 8 ) の 自 己 リ ン 酸 化 レ ベ ル は S A P K 2 ( W T) と
比 較 して 顕 著 に 低 下 して い た こ の 結 果 は S A P K 2 の C 末 端 領 域 が S A P K 2 の リン 酸 化
活 性 も しくは 活 性 化 に 重 要 で ある ことを強く示 唆 し て い る 培 養 細 胞 で
過 的に S A P K l
( M l M 3 1 9) お よ び S A P K 2 ( M l L 3 1 9) を過 剰 発 現さ せ た場 合 浸 透 圧 ス トレ ス で 誘 導され
る こ れ らの リ ン 酸 化 活 性 は W T の 1 0 分 の 1 以 下 で あ っ た ( K o b a y a s h i e t a[ 2 0 0 4 ) 本
-
､
､
｡
､
､
一
｡
-
-
､
.
研 究の 結 果 は i n
,
｡
で の 結 果 とよく 致 して おり C 末 端 領域 の ドメイン 2 は S n R K 2 の
活 性 化 に 重要 な 役 割 を果 たし て い る の か もし れ な い
方 S A P K 2 ( M l S 3 0 8) とほ ぼ 同 じ領
域 を欠 失さ せ た O S T l / S R K 2 E の C 末 端 領 域 欠 失 変 異 体 は 大 腸 菌 で 発 現させ た 場 合
自 己 リ ン 酸 化 活 性 の 低 下 は 見 られ な い と い う結 果 が 得 られ て い る ( B e !i n e t a l 2 0 0 6 )
O S T l /S R K 2 E
は S A P K 8 と同 じ サ ブク ラ ス Ⅲ に 属 し て おり 我 々 が 着 目 し て い る S A P K 2
と は C 末 端 領 域 の 相 同性 が低く か つ S A P K 2 と は 異 なり A B A に よ っ て も活 性 化され るな
ど の 相 違 点 が あ る S A P K 2 と O S T l / S R K 2 E で 見 られ た組 換 え C 末 端 領 域 欠 失 変異 体
の リ ン 酸 化 活 性 の 違 い は サ ブクラ ス の 違 い
つ まり は C
末端 領 域 の 配 列 の 違 い ( 図 1) に
起 因 するも の で ある か もしれ な い
､
viv o
一
､
一
-
(,
､
､
､
.
,
0
､
､
｡
､
､
｡
2 3
基質が S
-
.
図
A P K2
の
自 己 リ ン 酸 化 活 性 に 与 え る影 響
お よ び 1 7 に 示 し た 2 つ の 実 験 で は M B P を基 質 と し て 用 い た 場 合 S A P K 2
( W T) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) とも に 自 己 リ ン 酸 化 レ ベ ル が 酵 素 単 独 の 場 合 よりも高くな
っ た
方 P I4 K を 用 い た 場 合 に は 逆 に 低 下 し た 類 似 し た現 象 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ
O S T l / S R K 2 E や イ ネ S A P K 6 / O S R K l で も 見られ た ( B e Ji n e t a L 2 0 0 6 ; C h a e e t a L
2 0 0 7) た だ し こ れ ら の タ ン パ ク質 の 自 己 リン 酸 化 レ ベ ル は 基 質 とし て ヒ ス トン を加 え る こ と
で 高 くな っ て い た 加 え て S A P K 6 / O S R K l で は ヒ ス トン 以 外 に 標 的 基 質 で ある こ とが 示 唆
16
､
､
-
一
.
､
､
｡
､
,
｡
､
,
､
｡
､
､
され た イ ネ b Z [ P 型 転写 因 子 O R E B l の 場 合 に も こ の 現 象 が 見られ た ( C h a e e t a l 2 0 0 7)
また S A P K 6 / O S R K l で は 基 質 とし て M B P を加 え た 場 合 は 逆 に 自 己 リ ン 酸 化 レ ベ ル は
下 が っ て い た ( C h a e e t a l 2 0 0 7) S A P K 2 と S A P K 6 / O S R K l の 間 で M B P の S A P K 自 己
リ ン 酸 化 に 与 え る 影 響 が 逆 に なると い う結 果 は 基 質 と の 相 互 作 用 ある い は 認 識 様 式 が
.
､
,
=
,
､
o
､
､
S
n
R K2
S
n
R K2
i (C
h
メン バ
間 で 異 な っ て い る こ とを 示 唆 す る S A P K 6 / O S R K l に 関 す る 論 文 で は
と標 的 基 質 の 相 互 作 用 に より オ リ ゴ マ
形 成 が 促 進され る 可 能 性 が 指 摘され て い
ー
｡
ー
､
a e
et
a[
.
,
2 0 0 7)
.
23
､
.
2 4
S A P K2 C
-
･
S AP K2
(M
末端 領 域
l S 3 0 8)
の
残 基 の 欠 失 が 基 質 リン 酸 化 活 性 に 与 え る影 響
31
対する基 質 i ル 酸 化 活 性 は S A P K 2 ( W T) と比 較 し て 顕著
に 低 下 し て い た が p J4 K に 対 す る 基 質 リ ン 酸 化 レ ベ ル は S A P K 2 ( W T) と S A P K 2
( M l S 3 0 8) で 変 化 が 見られ な か っ た こ の 結 果 か ら 基 質 の 種 類 に よ っ て S A P K 2 の 基 質
認 識 の メカ ニ ズ ム が 異 なる ことが 示 唆される P 14 K が S A P K 2 ( W T) の 自 己 リ ン 酸 化 を阻害
し た こと は P I4 K と基 質 S A P K 2 は 酵 素 S A P K 2 に 対 し て 競 合 し て い る こ とを意 味 す る
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を 用 い た 場 合 に は P !4 K に よる 阻 害 効 果 が 大 幅 に 減 少 し た こ と か ら
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) で 欠 失 し た 領 域 すなわちドメ イン 2 は 酵 素 基 質 問 相 互 作 用 に 何 ら か
の 形 で 関与 して い る ことを示 唆 する S A P K 2 ( M l S 3 0 8) の P ) 4 K に 対 するリ ン 酸 化 活 性 は
S A P K 2 ( W T) とほ ぼ 同 レ ベ ル で あ るに もか か わ らず自 己 リン 酸 化 活 性 の み が 低 下 し た こと は
の
-
M B P
に
､
､
-
｡
､
､
｡
､
｡
-
､
,
-
一
､
-
c
S A P K2
M l S 3 0 8)
(
､
に お い て 欠 失 し た領 域 が 基 質 S A P K 2
が 酵素 S
と相 互 作 用 する
お よ び基 質とし て の S A P K 2 は こ の 領
域 以 外 に お い て 酵 素 とし て の S A P K 2 に 認 識され て い る こと に なる
方 基 質が M B P で
ある 場 合 に は S A P K 2 ( M l S 3 0 8 ) に よるリン 酸 化 活性 が S A P K 2 ( W T) に 比 べ て 顕著 に 低
下 し た ことか ら 酵 素 S A P K 2 と M B P との 相 互 作 用 に は ドメイン 2 が 関 与 し て い る こ とが 予
想される S A P K 2 ( M l S 3 0 8) で は S A P K 2 ( W T) に お い て み られ た M B P に よる 自 己 リ ン 酸
化促 進 効 果 が ほ とん ど み られ なくな っ た ことは こ の ことを 裏 付 ける
それ で は M B P に よ る自 己 リン 酸 化 促進 効 果 は ど の ようなメカ ニ ズ ム に よ るもの で あ ろう
上 記 の ような M B P とドメイ ン 2 と の 相 互 作用 に よりコ ン プ オ メ シ ョ ン 変 化 が 引き起 こ される
ことが 予 想され る そ の 結 果 酵 素 S A P K 2 が 基 質 S A P K 2 の ドメ イ ン 2 と相 互 作 用 する
の に 必 要 な 領 域 をより露 出 させ 反 応 性 が 高 まる こ とに より S A P K 2 の 自 己 リン 酸 化 が 先 進
する の で はな い だ ろうか
-
A P K2
の に 必 要 な領 域 で はな い か と推 察され る ま た P 1 4 K
｡
､
一
.
､
-
､
､
-
｡
､
0
､
｡
ー
｡
､
､
｡
こ の ような仮 説 は
実 験 に よっ て 検 証 可 能 で あ ろう たとえ ば こ の 仮 説 で は P 1 4 K
は 基 質 S A P K 2 と 同 様 な メカ ニ ズ ム で 酵 素 S A P K 2 に よ っ て 認 識 され る こ とを仮 定 し て い る
こ と か ら P [4 K の S A P K 2 に よ るリ ン 酸 化 は S A P K 2 自 己 リ ン 酸 化 の 場 合と同様 に M B P
に よ っ て 促進 される こ とが 予想され る ただし こ の 仮 説 で は S A P K 2 ( M l S 3 0 8) で 欠 失 した
領 域 に 自 己 リ ン 酸 化部 位 の
部 が 含まれ て い る可 能 性 を 考 慮 に 入 れ て い な い ことか ら こ の
,
い くつ か の
｡
､
､
-
｡
,
､
一
､
点に
実 験 的 に 確 認 する必 要 が あろう い ず れ に して も 本 実 験 の 結 果 は 基 質 に よ っ て
S A P K 2 との 相 互 作 用 メカ ニ ズ ム が 異 な っ て い る こと また こ の ような相 互 作 用 に C 末 端 領 域
が 深く関 与 して い る こと は 間 違 い な い で あ ろう こ れ ま で の 報 告 で C 末 端 領 域 は 上 流 シ グ
つ い て
｡
､
､
､
､
｡
､
ナ ル の 認 識 に 重 要 な働 きをし て い る ことが 明らか にされ て きた こ れ に 加 え て 本研 究 で は 同
領 域 が 下 流 因 子 ( 基 質) との 相 互 作 用 にも機 能 して い る 可 能 性 を示 す こ とが で きたとい え る
｡
､
｡
3
組 換え S
.
3 1
-
.
S A P K2
A P K2
の リン 酸 化 状 態
(
とS
W T)
A P K2
(
M l S 3 0 8)
に お けるリン 酸 化 状 態
-
図 1 8 に 示 した 二 次 元 電 気 泳 動 0 ) 結 果 S A P K 2 ( W T) の 方 が S A P K 2 ( M l S 3 0 8) よりも
ス ポ ッ トの 数 が 多く 多くの 部 位 で リ ン 酸 化され て い る ことが わ か っ た S A P K 2
( W T) の 方 が
べ
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) にくら て 多くリン 酸 化され て い るとす れ ば こ の 原 因 が リ ン 酸 化 活性 の
違 い に 起 因 するも の な の か そ れ とも 〇 末端 側 に もリ ン 酸 化され る部位 が あるた め な の か と
-
､
､
､
｡
-
､
･
､
､
2 4
､
い うこ と に 興 味 が 持 たれる
3 2
培 養 条件 が S
-
.
A P K2
｡
(W
T)
の リン
酸 化 に 与 え る影 響
培養 時 間 が 短くなるとリン 酸 化 が 起 こ らな い もしくは リ ン 酸 化 効 率 が 下 が るとい う可 能 性 を
考 え 実 験 を行 っ た し か し 培 養 温 度 や 培 養 時 間 に 関 わ らず 大 腸 菌 で 発 現 させ た S A P K 2
､
｡
､
は リ ン 酸 化され て い た
､
方 大 腸 菌 で 発 現さ せ た N t O S A K は 培 養 温 度 に よりリ ン
酸 化される部 位 お よび リン 酸化 活 性 が 異 な っ て い ると報 告され た ( B u r z a e t a [ 2 0 0 6) 3 0 C
と 1 8 ℃ とで リ ン 酸 化 され て い る部位 が 異 なる こ と お よ び 3 0 C 3 時 間 の 培 養 で は 活 性 化
に 必 要 な 1 5 8 番 目 の セ リン の リ ン 酸 化 は 起 こ らな い た め こ の 条 件 で 培 養 するとリ ン 酸 化 活
性 が 低 下 す る こ とが 言 わ れ て い る 本研 究 で は 培 養条 件 の 違 い に よ るト タ ル の リ ン 酸 化 状
(
W T)
一
｡
､
､
o
.
,
.
o
､
､
､
ー
｡
､
態 の み を調 べ た 今 後 は リ ン 酸 化 部 位 を特 定 し そ れ ぞ れ
験 が 必 要 か もし れ な い
｡
､
の
部位
の リン
酸 化 状 態 を調
べ
る実
｡
3 3
大 腸 菌 で 発 現させ たタ ン パ ク質 と植 物 で 発 現させ たタン パ ク質 の リ ン 酸 化 活性 の 違
-
.
タバ
NtO S A K
大 腸 菌 か ら精 製 した N t O S A K お よ びそ の 変 異 体 の M B P に 対 する
化活 性 は
処 理 し た 培 養 細 胞 か ら精 製 し たも の と比 較 し て 1 4 % の 活 性 し か 持
たな い ことが 報 告され て い る ( B u r z a e t al 2 0 0 6 ) こ れ は 植 物 の 中 で 厳 密 に 制 御され た シ
グナ ル 伝 達 経 路 に お ける 活性 化 と 大腸 菌 内 に お け る自 己 リ ン 酸 化 で は リ ン 酸 化 部 位 が 異
なるた め で あ ろうと予 想され て い る 実 際 に N a C ( 処 理 した 培 養 細 胞 か ら精 製 し た N t O S A K
で は ア クチ ベ
ション ル
プ の 1 5 4 番 目と 1 5 8 番 目 の セ リン ( S A P K 2 に お い て も 同 じ残
に
が
ン
基 相 当)
リ 酸 化され て い た の に 対 し て 大 腸 菌 か ら精 製 した N t O S A K お よ び そ の 変異
コ
リン 酸
N
､
では
い
､
Cl
a
-
.
,
｡
､
､
､
.
､
ー
ー
､
､
体
番 目 の セ リ ン に 加 え て い くつ か の セ リ ン お よ び ス レ オ ニ ン 残 基 が リ ン 酸 化 され
て い た こ とが 報 告され た ( B u r z a e t al
2 0 0 6 ) こ の とき 1 5 4 番 目 の セ リン は リン 酸 化され て
い な か っ た また 大 腸 菌 で 発 現させ た O S T l / S R K 2 E
の リ ン 酸 化 部 位 も B e li n ら ( 2 0 0 6 )
ベ
に より 同 定され たが ア クチ
ション ル
プの 1 7 5 番 目 の セリン および 1 7 6 番 目 の ス レ オ
では
､
158
､
.
｡
,
｡
､
､
●
ー
ー
,
はそれ ぞれ 1 5 8 番 目 の セ リン お よ び 1 5 9 番 目 の ス レ オ ニ ン に 相 当) に 加
え て 試 験 管 内 の リ ン 酸 化 ア ツ セ イ に お い て キ ナ ゼ 活 性 に 必 要 の な い ことが 示 され た い くつ
か の セ リ ン 残 基 が リン 酸 化され て い た S A P K 2 に お い て も 大 腸 菌 か ら精 製 し たタ ン パ ク質と
植 物 か ら精 製 した タン パ ク質 の リン 酸 化 状 態 お よ びリ ン 酸 化 活 性 の 比 較 が 必要 で あ ろう
ン
ニ
(S
A P K2
で
ー
､
｡
､
｡
3 4
-
.
S A P K2
S A P K2
(
(
W T)
W T)
の 不 溶 性 画分 に お けるリ ン 酸 化
の 不 溶 性 画 分 に 見られ るタ ン パ ク 質 は
､
可 溶 性タン パ ク 質 と同 様 に リ ン 酸 化
され て い る ことが 明 らか とな っ た こ の 結 果 は 大 腸 菌 の 中 で す で に 封 入 体 を 形 成 し て
で はなく 破 砕 時 に 凝 集 し沈 殿するとい う可 能 性を 示 唆 し て い る
｡
､
､
4
.
いるの
｡
植 物 内 に お ける
S A P K2
の 活性 化 と自 己 リ ン 酸 化 と の 関 係
植 物 内 に お ける S A P K 2 の 活 性 化 に 自 己 リ ン 酸 化 は 関 係 し て い る か どうか に
に 考 察 す る 大 腸 菌 で 発 現させ た N t O S A K や O S T l / S R K 2 E と同様 に S A P K
｡
､
25
つ い て
2
(
以下
W T)
お
､
よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8) は 大腸 菌内 で 自 己 リ ン 酸 化 に よりリン 酸 化され 活 性 化 され て い
た こ れ は S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ が 上 流 の キ ナ ゼ に よる リン 酸 化 だ け で なく 自 己
リ ン 酸 化 に よ っ て も 活 性 化される ことを 示 して い る また N t O S A K で は 活性 化 に 必 須 で ある
-
､
､
-
ー
｡
､
､
､
｡
､
､
が 十 分 で は な い と示 され た 1 5 8 番 目 の セ リ ン が 自 己 リン 酸 化 に よりリン 酸 化され て い た こ と
か ら ( B u r z a e t a I 2 0 0 6 ) S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ は自 身 の 活 性化 に 関 わる セ リン 残 基
をリ ン 酸 化す るこ とが で きると言 える し か し 上 述 し た よう に 自 己 リン 酸 化 に より活 性 化され た
N t O S A K の 活 性 は 浸 透 圧 ス トレ ス より活 性 化され た 時 の 1 4
%
しか な い ことか ら ( B u r z a
ー
.
､
,
｡
､
-
et
al
2 0 0 6)
自 己 リン 酸 化 に よ る活 性 化 の み で は 十 分な活 性 が 得られ な い と考 え られる こ
植 物 内 に おける S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ の 活性 化 に は 上 流 の キ ナ ゼ に よ るリ
ン 酸 化 が 必 須 で あると思 わ れる ただし 自 己 リン 酸 化 に より活 性 化されるキナ
ゼも い くつ か
報 告され て い る こ とか ら ( J o h n s o n e t a l 1 9 9 6 ; N o l e n e t a l 2 0 0 4) S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ
ゼ の 活 性 化 に も 上 流 キ ナ ゼ に よるリ ン 酸 化 に 加 え て 自 己 リ ン 酸 化 に よる活 性 化 が 関わ
っ て い る 可 能 性も否 定 で きな い
･
,
の ため
､
｡
ー
ー
､
ー
｡
､
.
ー
.
,
,
､
ー
､
､
｡
5
SA P K2
.
の 立 体構造 解析
タ ン パ ク質
立 体 構 造 解 析 の 主 な 手 段 とし て は X 線 結 晶 構 造 解 析 と溶 液 N M R に よる
構 造 解 析 の 2 つ が 挙 げられ る X 線 結 晶 構 造 解 析 は 解 析 を行うタン パ ク質 の 大きさ に 制
限 がな い とい うメリッ トが ある が 結 晶化 の 段 階が 大きな障壁となる また 結 晶 中 の 構 造 を解
析 す るた め 溶 液 中 で の タン パ ク質 の 動き に 関 す る情 報 は 得 られ な い
方 溶液 N M R に
よる 構 造 解 析 は 溶 液 状 態 で 測 定 が 可 能 で あ るた め 溶 液 中 で の タ ン パ ク質 の 動 的 な 情 報 が
の
､
｡
､
､
｡
､
一
､
｡
､
､
,
得 られると い うメリ ッ トが あ る し か し 解 析 で きるタン パ ク質 の 大 きさ は 3 0 k D a くら い ま で と
デ メ リッ トも あ る タ ン パ ク質 に よ っ て は 実 験 的 に 構 造 解 析 が 不 可 能 な場 合 が ある 近 年
P D B デ
ス ヘ の 構 造 情 報 の 登 録 が著 しく増 加 し た こ と ま た 簡便 に 使 え るホ モ ロ ジ
タベ
｡
､
､
｡
ー
､
｡
､
ー
ー
､
モ
つ
デリ ン グ ソ フ トが 普 及 した こと に より ホ モ ロ ジ モ デ リン グ に よる立 体 構 造 の 精 度 が 向 上 し
つ ある
本 研究 で は S A P K 2 の 構 造 解 析を目 指して 研究を行 っ た 解 析 す るタン パ ク質 の 分 子 量 を
ー
､
｡
､
考 慮 して S
晶 化を S
､
5 1
.
( W T) お よ び そ の 変 異 体 に 関 し て は X 線 結 晶 構 造 解 析 法 を目 指 し て 結
C 末端 領 域 に 関 し て は N M R に よる構 造 解 析を試 み た
A P K2
A P K2
｡
線 結 晶 構 造 解析 法を目 指し た 結 晶化 の 検 討
X
-
｡
表 5 に 示 し たように S A P K 2 ( W T ) S A P K 2 ( M l S 3 0 8) および S A P K 2 ( K 3 3 A) の 結 晶
化 を試 み た が 現 時 点 で 結 晶 は 得 られ な か っ た S A P K 2 ( W T) お よ び S A P K 2 ( M l S 3 0 8 )
は 大腸 菌 の 中 で 不 均 に リ ン 酸 化され て い た こ とか ら こ の 不 均 なリ ン 酸 化 が 結 晶 化 し な い
原 因 の 1 つ で あると考 え た そ こ で リン 酸 化 活 性 が ほ とん どなく ほ ぼリン 酸 化 さ れ て い な
-
､
､
-
､
.
一
一
､
｡
い S A P K2
( K 3 3 A)
に
､
､
つ い て も結 晶 化 に
供 したが 結 晶 は 得 られ な か っ た こ の こ とか ら リ ン
酸 化 の 有 無 以 外 に 精 製 したタン パ ウ質 の 性 質 の 方 が 結 晶 化 しな い 大 きな要 因 で あると考 え
られ た 結 晶 化 に 用 い るタン パ ク質 濃 度 は 通 常 5 m g / m 暮 以 上 で あるが S A P K 2 および そ
の 変 異 体タン パ ク質 は 濃 縮 に より濃 度 が 高くなると凝 集 し 沈 殿 する 傾 向 に あ る また 沈 殿 せ
ず に 5 m g / m r 以 上 ま で 濃 縮 で き て も 結 晶 化 に 用 い るタン パ ク質 濃 度 を検 討 す る た め の
P r e C ry s t a " i z a ti o n T e s t を行うと 5 m g / m ] 以 下 の 濃 度 で も結 晶 化 する に は 濃 すぎるとい う
､
､
｡
､
､
｡
､
､
｡
､
-
､
26
､
結 果とな っ た こ れら の 結 果 か ら B u ff e r 条 件 の 検 討 お よ びタン パ ク質 の 濃 縮 条 件 の 検 討 が
必 要 で ある と考 え られ る ま た 今 回 は す べ て 2 0 C で 結 晶 化を行 っ た の で 4 C で の 結 晶 化
も検 討 の 余 地 が あ る
.
､
o
｡
o
､
､
｡
5 2
-
.
に よる S A P K 2 C
N M R
SA P K2
末 端 領域
の
構 造 解析 の 検 討
の C
末 端 領 域 は S A P K 2 の 機 能 発 現 に 重 要 な役 割 を担 っ て い ると予想され て
い るが
そ の 分 子 機 能 は 未 知 の 部 分 が 多 い こ の 領 域 ( S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9)) に つ い て
N M R を用 い た構 造 解析 を検 討 し た 図 2 0 に 示 した 実 験 か ら S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) は明 確
な立 体 構 造 を保 持 して い な い ことを 示 唆 する結 果 が 得 られ た 今 回 の 測 定 に 用 い た S A P K 2
-
､
｡
-
｡
､
｡
立 体 構 造 を持 たな い と推 察され る G a t e w a y 由来 の 余 分 な配 列 が N 末 端
側 に 3 0 残 基 ほ ど残 っ て い る 5 6 残 基 か らなる S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) に 対 して こ れ ら の 配
列 が 占 め る 割 合 は 大き い と 考 え られ る こ の 結 果 こ の 部 分 の シ グ ナ ル が 中 心 に 集 ま っ て
( P 2 8 4 L 3 3 9)
は
-
､
-
｡
｡
､
S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 部 分 に 対 応す るシ グナ ル を見 え にくくする こ とで 見 か け上 明 確 な立
体 構 造 を保 持 し て い な い と い う結 果 が 得 ら れ た 可 能 性 も わ ず か で は あ る が 考 えられ る
-
､
｡
P 2 8 4 L 3 3 9)
が 明確 な立 体 構 造 を保 持 し て い る か どうか の 結 論 を出す ため に は 前
(
述 し た ように プ ロ テ ア ゼ サ イトの 検 討 を行 い S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 部 分 だ け で もう 度
測 定 をす る必 要 性 が ある こ れ に 加 え て ドメ イン の 最 適 化も検 討 す る必 要 が ある か もしれ な
い また S A P K 2 だ け で なく 他 の S A P K メ ン バ
の C 末 端 領 域 に つ い て の 検 討 が有 用
か も しれ な い
S A P K2
-
､
ー
ー
-
､
｡
､
-
.
､
､
｡
SA P K2
(P 2 8 4
-
L 3 3 9)
ナ ル の 変 化を観 測 した
に S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を 加 え S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の N M R シ グ
こ の 結 果 S A P K 2 C 末 端領 域 が キ ナ
ゼドメ イン と相 互 作 用 す る 可
-
-
､
ー
｡
､
能 性 を 示 唆 す る 結 果 が 得 られ た し か し S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を 加 え る こ と で S A P K 2
( P 2 8 4 L 3 3 9) に 劇 的 な 変 化 が 起 こ っ たとは言 い が た い 今 回 の 実 験 に 用 い た キ ナ ゼドメ イ
ン ( S A P K 2 ( M l S 3 0 8)) と C 末 端領 域 ( S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9)) に は 2 5 残 基 の 重複 が あ
る さらに S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) は G a t e w a y 由 来 の 余 分 な配 列 が N 末 端 側 に 3 0 残基
ほ ど余 分 に つ い て い る 実 際 に は S A P K 2 の キ ナ
ゼドメイン と C 末 端 領 域 は 相 互 作 用 し
て い る けれ ども こ れら の 重 複 部 分 や 余 分 な配 列 が 物 理 的 な妨 げとな っ て 相 互 作 用 の 形 成
を阻 害 して い る 可 能 性も 考 えられ る こ の ため 重 複 が な い ように S A P K 2 キ ナ ゼドメイ ン
お よ び S A P K 2 C 末 端 ドメイ ン に つ い て ドメ イ ン の 最 適 化 を検 討 し 再 実 験 を行う必 要 が あ
る S PA K2 の キナ
ゼ ドメ イ ン と C 末 端 領 域 が 相 互 作 用 し て い る 場 合 は S A P K 2
( P 2 8 4 L 3 3 9 ) と 単 独 で は 不 溶 性 で あ っ た S A P K 2 ( M l T 2 8 3) を共 精 製 する こ と で 可 溶 化
する 可 能 性 も残され て い る こ の 共 精 製 に つ い て も検 討 の 余 地 が ある
-
｡
､
-
-
｡
-
-
-
｡
､
､
-
.
､
､
､
ー
｡
､
､
､
ー
｡
､
-
-
,
｡
6
.
S A P K2
SA P K2
0
の 立 体 構 造と機 能 との 相 関
と
ゼドメイン ( それ ぞ れ M l F 2 6 0 と G 3 7 M 3 0 4) は 4 1 % の
ア ミ ノ酸 が 同
で あ っ たが C 末 端 領 域 ( そ れ ぞれ L 2 6 1 L 3 3 9 と N 3 0 5 K 3 7 1 ) で は 1 3 %
しか 同
で な い こ の ため キ ナ
ゼドメ イ ン に 関 し て は モ デ リン グ 構 造 と実際 の 高 次 構 造 に
あまり差 異 は な い と推察 で きる が C 末端 領 域 に つ い て は モ デ リン グ構 造 が 正 し い か どうか の
議 論 は 難 し い し か し 二 次 構 造 予 測 の 結 果 を踏 ま え ると C 末 端 領 域 に ロ ヘ リツ ク ス が 存
在 する 可 能 性 は 高 い 特 に A lig n m e n t [ n t e rf a c e の 両 モ デ リン グ構 造 で 予 想され た 2 8 6 番
のキナ
2 H A K
-
-
-
一
-
-
､
一
ー
｡
､
､
､
ー
｡
､
｡
､
､
27
目 の グ ル タミン か ら 2 9 5 番 目 の イ ソ ロ イ シ ン ま で の ロ ヘ リッ クス は 多少 の 前 後 や 長さ に 違
い は あ っ て も 実際 に 存 在 する の で は な い か と思 われる
テ ン プレ
トと し た 2 H A K で は . キ ナ
ゼド メ イ ン の N 末 端 側 で 活 性 部 位 の 裏 側
( N 一o b e s) に C 末 端側 の U B A ( u bi q uiti n a c c o ci a t e d) ドメイ ン が 相 互 作 用 して い るとい う構
造 が 見られ る ( 図 2 2 ( A ); M a r x e t a [ 2 0 0 6) U B A ドメ イン は い くつ か の タン パ ク質 に お い て
ユ ビ キ チ ン と相 互 作 用 する こ とが わ か っ て い るドメイ ン で ある が
2 H A K の U B A ドメ イ ン は
他 の タン パ ク質 の U B A ドメイ ン が エ ビキ チ ン と相 互 作 用 する位 置 で N 1 o b e s と相 互 作 用 し
て い る ( M a rx et aI
2 0 0 6 ; P a m e e r s e [ v a m e t a l 2 0 0 6) S A P K 2 の モ デリ ン グ 構 造 で も
ー
､
(,
､
ー
ー
､
-
-
､
,
,
0
､
､
-
.
,
,
.
.
､
お よ び 2 で テ ン プ レ トに 合 わ せ て C 末 端側 は 同様 に N 末 端側
と相 互 作 用 するような 構造 が 得 られ た ( 図 2 2 ( B ) お よ び ( C )) 2 H A K の N 】o b e s と U B A
ド メ イ ン の 相 互 作 用 は 疎 水 性 相 互 作 用 で あ ると報 告 され て い る ( M a r x e t a J 2 0 0 6 ;
P a n n e e r s e l v a m e t a し 2 0 0 6) それ に 対 して S A P K 2 の C 末 端 領 域 は 酸 性 ア ミノ 酸 に 富 ん
で い る 特 に S A P K 2 の 最も C 末 端 側 で N 末 端 との 相 互 作 用 に 重 要 で は な い か と考 えら
れ る α ヘ リツ ク ス は 酸 性 パ ッ チ と呼 ば れる S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ ゼ に 特 有 の 酸 性 ア ミ
ノ酸 が 多 い 領 域と ほ ぼ
致する
方 F ir st A p p r o a c h l お よ び 2 で は C 末 端領 域 が モ デ
リン グされ て い な い ため キ ナ ゼ ドメ イ ン の N 末 端 側 は表 面 に 露 出 す る 形 とな っ て おり
A =9
nt
n m
I n t e rf a
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c e
ー
､
-
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､
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ー
,
A =g
､
で C
および
末端 側と相互 作 用す ると予想され た領 域 に は 塩 基性
った
こ の こ とか ら S A P K 2 の キ ナ
ゼ ドメイン の N 末端 側と C
末 端 側 は 静 電 的相 互 作 用 に より 相 互 作 用 し て い るとい う 可 能 性 が 考 えられる よ っ て S A P K 2
で は 2 H A K で 見 られる の とは 異 なる様 式 で N 末端 側 と C 末 端 側 領 域 が 相 互 作 用 し て い る
こ とが 推 察される
二 次構 造 予 測 で は キ ナ
ゼドメイ ン と C 末 端領 域 の 境 界 部 分 に 2 H A K で は 見られ な い
ロ ヘ リツ ク ス が 予測され て おり モ デ リン グ構 造 に お い て も 2 6 5 番 目 の プ ロ リ ン か ら 2 6 8 番
e nt
n m
I n t e rf a
l
c e
2
ア ミノ 酸 が 多 い ことが わ か
ー
｡
､
｡
､
｡
ー
､
ー
､
目
の イソ ロ イシ ン ま で
が α ヘ リ ツ ク ス で あると予 測され て い る こ の こと か ら S A P K 2 の キ ナ
ゼドメイ ン の 末 端 か ら C 末 端 領 域 の 最 初 に か け て の 構 造 は 2 H A K と全く異 な っ て い る 可
能性 も高 い S n R K 2 フ ァ ミリ で 高度 に 保存され て い る領 域 が 2 6 5 番 目 の プ ロ リン ま で で あ
る こ と および 他 の プ ロ テ イ ン キ ナ ゼと相 同 性 が 高 い 部 分も こ の 周 辺 ま で で ある こ とを考 慮
ニ ン グおよび 発 現 を
し S A P K 2 の キ ナ ゼドメイン とし て S A P K 2 ( M l P 2 6 5) の サ ブク ロ
行 っ た しか し こ の タン パ ク 質 は 可 溶 性 画 分 に 得られ な か っ た こ の 原 因 の 1 つ とし て は
前 述 し た よう に ニ 次 構 造 の 途 中 で 欠 失させ たと い う可 能 性 が 挙 げられ る そ こ で ニ 次 構 造
-
｡
､
ー
､
ー
｡
-
､
､
ー
ー
-
､
｡
､
｡
､
､
｡
予測 の 結 果を 考 慮 し て S A P K 2 ( M
および 発 現 を 行 っ た そ の 結 果 S
ニ ング
( M l S 3 0 8) の サ ブク ロ
A P K2
( M l 丁2 8 3) は 可 溶 性 画 分I こ 得 られ な か っ た が
S A P K 2 ( M l S 3 0 8) は 可 溶 性 画 餅 こ 得 られ た こ れ ら大 腸 菌 で の 発 現 実 験 の 結 果 か ら
S A P K 2 の 2 6 5 番 目 の プ ロ リン および 2 8 3 番 目 の ス レ オ ニ ン とそ の 周 辺 の ア ミ ノ 酸 は 予
想 に 反 し て 二 次 構 造 の 形 成 に 関 わ っ て い る 可 能 性 が 考 えられ た こ の 結 果 と S n R K 2 プ ロ テ
イ ン キ ナ ゼ の 活 性を結 び つ け る 興 味 深 い 報 告 が なされ て い る シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の S n R K 2
プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ O S T l /S R K 2 E で は C 末 端 領 域 の 部 もしくは 全 体を 欠失さ せ た 変 異
､
｡
I T 2 8 3)
および S
､
A P K2
ー
-
一
､
､
-
｡
､
､
｡
ー
｡
ー
一
､
体 を培 養 細 胞
ある い
は 大 腸 菌 で 発現 させ そ の リン 酸化 活 性 が 調 べ られ た ( Ⅵ) s h id a e t a l
2 0 0 6 ; B e = n e t a l 2 0 0 6) C 末 端 領 域 の ドメイ ン 2 の み を欠 失させ ると A B A に よ る活 性 化
の み が 起 こ らなくなる 方 で C 末 端 領 域 全 体 を 欠 失 すると浸 透 圧 ス トレ ス お よ び A B A に よ
る活 性 化 の 両 方 が 起 こ らなくな っ た ( Y o s h id a e t a L 2 0 0 6) また 大腸 菌 で 発 現させ た 場 合
.
､
.
｡
,
､
一
､
,
28
o
､
､
,
ドメ イ ン
イン
1
の
S A P K2
れば
(
M l
､
S
S3
-
部 ある い は 全 体を欠 失さ せ て もリ ン 酸 化 活 性 が 見られ た が それ に 加 え て ドメ
部 ある い は 全 体 を欠 失させ るとリ ン 酸 化 活 性 が 失 わ れ た ( B e li n e t a L 2 0 0 6)
で は 12 6 6 P 3 0 1 がドメイ ン 1 に G 3 0 2 L 3 3 9 がドメ イ ン 2 に 相 当 す る 言 い 換 え
A P K 2 ( M l 丁2 8 3) は ドメイン 1 の
部 とドメイ ン 2 全 体を 欠 失 し た 変 異体 S A P K 2
0 8) はドメ イ ン 2 を 欠 失 し た 変 異 体 と ほ ぼ
致 して い る 大 腸 菌 で 発 現 さ せ た
2
の
一
､
一
｡
,
-
-
､
､
｡
一
一
､
一
｡
O S T l /S R K 2 E
の
C
末 端 欠 失 変異 体 は S
､
A P K2
の 場 合と異 なり す べ て 可 溶性 画 分 に 得
､
られ て い た ( B e = n e t a l 2 0 0 6) O S T l /S R K 2 E に お ける結 果 か ら S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ
ゼ C 末端 領 域 の ドメイン 1 は S n R K 2 の キ ナ ゼ 活 性 に 必 須 で あると考 えられ た ( B e li n
et al
2 0 0 6) こ れ らの 結 果と本 研 究 の 結 果を合 わ せ て 考 え ると C 末 端領 域 の ドメイ ン 1 は
S n R K 2 プ ロ テ イ ン キナ
ゼ の キ ナ ゼドメイ ン の 構 造 維 持 に 関 わ っ て おり ドメイ ン 1 が なく
なるとキ ナ
ゼドメイ ン の 構 造 が 維持 で きなくなり そ の 結 果とし て リン 酸 化 活 性 が 失 わ れ ると
い う仮 説 が 成り 立 つ また S A P K 2 の C 末 端領 域ドメイ ン 1 の 実 際 の 構 造 は テ ン プ レ
ト
とし た 2 H A K や 二 次 構 造 予 測 結 果と異 な っ て い る こ とも 示 唆され る 構 造とリ ン 酸 化 活 性 の
ー
.
0
,
､
-
.
,
.
､
ー
､
-
､
ー
､
ー
｡
､
､
｡
相関の 観点 から S
れる
､
A P K2
の構造
､
特にこの
C
｡
29
末 端 領 域 ドメイ ン
1
の 構 造 の 解 明が 期 待 さ
表1
ン ス トラ クト
コ
E K S A P K2
-
-e S
P
T
-
P
F
P
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√e
ac
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-
X
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-
セ ンス
S A P K2
ア ン チ セ ンス
S A P K2
セ ンス
S A P K2
アンチ センス
S A P K2
センス
S A P K2
_
アンチ センス
S A PIQ
_
センス
S A PK2
ー
アンチ センス
S A P K2
センス
S A P K2
アンチ センス
S A P K2
センス
S A P K2
こ'2
アンチ センス
SA P K2
L 33 9 R
センス
SA P K2
＼
乃1 F P
アンチ センス
SA P K2
一名
ー
I
M
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.
配
F Ek
ニ ン
ー
グに 用 い た プ ライ マ
ー
.
列(5 t o 3 )
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:
し3 3 9 R
_
M 1F P
reS :
__
{ _
T CA C AA T G C G CA C A C G
:
339R
M 1F Ek
CA C C C T G G A A G T TC T G T TC C A G G G G C C C A TG G A G A G G TA C G A G G T G A T
T CA C AA T G C G CA C A C G
二
二C
A C C G A C G A C G A C G A CA A G A T G G A G A G G TA C G A G G T G A T
二C
T A C G G C A G G T TC TT G A G G
-
( M 1 T 28 3 )
; ⊃26
M 1
5 R
-
f
P
es :
√
CA C C C T G G A A G T TC T G TT C C A G G G G C C C A TG G A G A G G TA C G A G G T G A T
-
( M l S 3 08 )
■
_
_
r2 8 3 R
W lF P
二C
T A G G T G T TG A T G T C G TT C A T C
reS :
i
C A C C C T G G A A G T TC T G TT C C A G G G G C C C A TG G A G A G G TA C G A G G T G A T
-
S A PK2
S SA P K2
-
( M トL 3 3 9 )
( M l P 2 6 5)
S A PK2
I
クロ
プラ イ マ
-
S A P K2
-
E K S A P K2
Pr
( M l L3 3 9 )
T O P O
方向
( P 2 8 4 L 3 39 )
( K 33 A)
_
ミ
; 30 8 R
CT A G G A G A A ¶ TG G A G C C A T C
:
84F X
a :
CA C C A TC G AA G G T C G T C C G T C A C A G G G C C TG
-
こ
_
｣
re
33 9 R
TC A CA A TG C G CA C A C G
二
:
S
:
C A C C C T G G A A G TT C T G TT C C A G G G G C C C A TG G A G A G G T A C G A G G T G A T
TC A CA A TG C G C A C A C G
30
表
発 現 ベ クタ
2
ベ クタ
発現
ー
と大 腸菌
ー
G ST
E
Hi s 6
E
P D E S T tⅨ E K S A P K 2 ( W ¶
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P D E S T t ry
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sc
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T
E
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PG EX 5X 1 S A P K2
-
-
-
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p D E S T J li s E K S A P K 2
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P D E S T try
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-
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-
-
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S S A P K2
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-
P
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S S A P K2
-
P D E S T try
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B L 21
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B L 21
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3 3 A)
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E
( P 2 8 4 L 3 3 9)
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B L 21
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31
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T r x Hi s 6
S 3 0 8)
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S AP K2
S S A P K2
-
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-
-
( M l P 2 6 5)
S S A P K2
P D E S T tr y F a c X
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-
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B L 21
( D E 3) 樵
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B L 21
( D E 3)
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B L 2 1 ( D E 3) p L y s S #
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B L 21
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株
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株
( D E 3)
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( D E 3)
pLy
p Ly
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s
S
棟
B L 2 1 ( D E 3) p L y s S 株
表
3
M9
培地の 組 成
試薬
N
a 2
終漉 度
HP O
KH
2
N
C1
a
g ly
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1 2 H 20
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.
0 3 %
4
.
0 05 %
.
c e r o1
D ( +) g l u
-
15
4
･
N H
4
0 5 %
.
0 4 %
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CJ
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0 05 %
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i
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hl o ri d
32
e
0 0 02 %
.
m
1
表4
ニ
次 元 電 気泳動 の 通電条 件
段階
電圧 ( Ⅵ
時間 ( 分)
1
2
1 75
20
3
1 75
･
-
20 00
20 00
33
45
30
表
試 料タ
ン/
( ク質
ス クリ
W iz
a e
W iz a
S A P K2
( W T)
e
S A P K2
( M l S 3 0 8)
-
( K 3 3 A)
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ニ
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Ⅱ (E
d
I
d
条件数
Bi o S y st e
m e r a一
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I
C ry s t a l S
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Ⅱ ( H a n pt o
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S A P K2
検討した 結晶 化 条件
5
ー
W iz
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d
W iz
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n
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S
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m e r a一
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C ry s t a l S
C Ⅳ st al S
I
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48
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50
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48
e s e ar c
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c re e n
I
(H
Ⅱ rH
e s e a rc
34
Bi o S v s t e m
h
a
144
条件
48
48
48
sl
n
R
e s e ar c
h)
R
e s e a rc
hl
pt o
条件
48
n Dt O n
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29 0
48
R
Bi o S y s t e m s)
Ⅱ (E m e r a一
d Bi o S y s t e m s)
c
合計
48
)
s)
m s
98
条件
表
6
N M R
測定 に 用
い たタン パ ク葺 の 濃度お よぴ b
試 料タン ′i ク井
15
N T
IX
N T
rx
I
15
I
15
-
-
M)
b u ff e
r
u fF e r
条件
条件
0 25
20
m
M T ri s H CI ( p H 7 5) 1 5 0
m
M N
a
C1
Hi s s t a g
0 23
20
m
M T ri s H C( ( p H 7 5) 1 5 0
m
M N
a
CJ
O 16
20
m
M T ri s H Cl ( p H 7 5) 1 5 0
m
M N
a
CJ
20
m
M T ri s H Cl ( p H 7 6) 1 5 0
m
M N
a
CJ
-
.
.
N S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9)
N S AP K2
-
m
Hi s 6 S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9)
-
15
濃 度(
-
P 28 4 L3 3 9
-
.
+
n o n
-
S A P K2
Ml S308
-
0 09
.
35
+
0 18
.
-
.
･
.
,
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-
.
,
-
.
,
皇主皇
巨
富
芳
書
董
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蔓
蔓
蔓
書
芸
書
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書
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…
蔓
≦
書
書
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書
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暮
夏
茎
葉
≡
書
芸
喜
書
g≦
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書
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書
裏
書
喜
蔓
喜
善
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董
書
萱
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ミ
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国 1
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ー
ゼ ファ ミリ
メン バ
ー
ー
の ア ミノ酸 配 列 の ア ライメ
鼓 洗 基 は A で 田 れ 類 似 の 残基 は 灰 色 で 形 を つ けた また C 末藩 領 域 の ドメイン
s A P K 2 の K33
P 2 6 5 T 2 8 3 およ ぴ s 3 0 8 の 各 溝 基 をo でEEl ん だ
で 囲 ん だ まT =
｡
n
｡
.
､
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｡
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36
1
を⊂コで ドメイン
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2
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イネ お よぴシ ロ イヌ ナ ズ ナ S
国 2
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R K 2 プE ) テ ィン キ ナ
ー
ゼ フ ァ ミリ
メン バ
ー
ー
の
系故 関 係
イ ネお よぴ シロ イヌ ナズ ナ の 全 s n R K 2 メン バ と他 の 稚 でd L 能 解析が 行 われ たメン バ の ア ミ ノi l i E 列 ( S A P K l の 卜 2 6 8
の ア ミノi [ 貼 に 相 判 を主 に 系tk 8 1 を作 成 した イネお よび シ ロ イヌ ナ ズ ナメン ′(
は そ れ ぞれ 鼻 と自 の 背J t で 強iI) した 慕
統8 t 内の h 隼 は B o 血 tr a p ( % ) を表 す シE ) イヌ ナズ ナメン J ( の 命名 は Pl a n t 6 P d a t a b 且S e ( h t t p :/I p_l a_n t s p 写d s c e d u I ;
H r a b a k e t a l 2 0 0 3 ‖= 混 血され て い るもの を採 用 した S n R K 2 6 1 ま O S T ll S R K 2 亡 とも名 づ けられ て い る シE ) イヌ ナ ズナ メ
ンバ
の A G l i L 長 子 書 号lま次 の とおりで ある S n R K 2 1 ( A t5 g O 8 5 9 0) S n R K 2 2 ( A t 3 g 5 0 5 0 0) S n R K 2 3 ( A t5 g 6 8 8 8 0)
ー
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( A tl g l O 9 4 0 I S n R K 2 5 ( A t5 g 6 3 6 5 0) S n R K 2 8 1 0 S T I I S R K 2 E ( A t 4 g 3 3 9 5 0) S rl R K 2 7 ( A I 4 g 4 0 0 1 0) S rl R K 2 8
A
t
l
7
8
2
9 0) S n R K 2 9 ( A t 2 g 2 3 0 3 0 ) S n R K 2 1 0 ( Atl g 6 0 9 4 D) 他 の 種 メン バ
の G e n B a n k ア クセ ッ ショ ン 書号 は次 の とお
(
g
りで ある A A P K ( A A F 2 7 3 4 0) P K A 8 A l ( B A B 6 1 7 3 5 ) H v P K A B A l ( B A B 6 1 7 3 5) S P K l ( L O 1 4 5 3) S P K 2 ( L 1 9 3 6 0)
S A P K l ( A B 1 2 5 30 2l S A P K 2 ( A B 1 2 5 3 0 3) S A P K 3 ( A B 1 2 5 3 0 4) S A P K 4 ( A B 1 2 5 3 0 5) S A P K 5 ( A B 1 2 5 3 0 6) S A P K 6
( A B 1 2 5 3 0 7) S A P K 7 ( A B 1 2 5 3 0 8) S A P K 8 ( A B 1 2 5 3 0 9) S A P K 9 ( A B 1 2 5 3 1 0) S A P K I O ( A B 1 2 5 3 1 1 ) T a S A P K 2 と
H v S A P K 2 の 全 長 配 列 は E S T 部 分 寵 列 をつ な げることで 得 た( T a S A P K 2 は E L J2 5 1 8 4 1 およぴ B J 3 1 7 8 1 7 H v S A P K 2 (i
S h R K 2 4
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A V 8 3 4 9 9 8 . B J 4 7 1 7 2 5 およぴ B J 4 6 3 5 0 8) ｡
37
( A)
Tb
rD n
b
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P
r o t e a 暮e
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( B)
図 3
(A) P
( a)
発現
ベ
クタ
D E S T h is の
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P D E S T tr
-
x
ー
の 模 式 B)
模式 臥
l
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at e w a
y 由来 の 配 列 を示 した ｡ また .
の 模 式 臥 ( A ) と同様に 示した ｡
38
I
は任 意 に導 入したプl= テ ア
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ぜサ イ 幡 示 した
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D
P
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,
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R e s e rv o ir 0 7 lll
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図 4
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ン ギン グドE )
ツ
プ蒸 気 拡散法 の 模 式 図
39
L 33 9
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S A P K2
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C t e T m i n aJ
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l P 2 6 5)
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S A P K2
l 丁2 8 3)
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S A P K2
(M
l S 3 0 8)
S A P K2
(P 2
-
L3 3 9
P284
8 4 L 3 3 9)
-
33
K
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-
A
L339
C te
-
S A P K2
図5
( K 3 3 A)
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rm
o m ai n
発 現 お よび精製を5 ( み た S A P K 2 ( W T) およぴ そ の 変異 体 の ドメイ ン 構造 の 模 式 図
S A P K 2 の キナ
ゼドメイ ン をピンク e
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､
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末 端ドメイン を発 色 で 示 した
40
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IP
TG
E 3) p L y s S
大腸菌発 現 扱 お よび培 養 条件 の 検 肘
S A P K 2 ( W T) の 発 現 に 用 い る大J I 古株 I P T 6
.
J LJ* お よび 培 書条 件 の 検 討 に お け る S
DS P A O E
の 掩果｡ S D S J ? A Q E は
カ
5 2 0 % ポリア クリル ア ミドゲラジ 工 ントゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た ｡ 各L J
ン は それ ぞれ 分 子 t マ
ン I ( クJ[ 凍i > 前( U) 諌j > 故( W 7 血音 波 破砕 故 の 可38 性 圃 分( s) 超 音 波 破 砕 故 の 不58 性圃51( I ) を示 す｡ ■
-
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( M ) k 合タ
ー
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.
.
HJ86 k 合 S A P K2
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.
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図 7
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･
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.
の 検肘
) の 先 攻 に 用 い る発 現 ベ クタ の 検 討 に お ける S D S P A G E の 椿 果 S D S P A G E は 5 2 0 % ポリア ケJ ル アミ
ドゲラ ジ 工 ン トゲ ル を用 い 全 て 還 元条件 で 行 っ た 各 レ シ はそ れ ぞれ 分 子 t マ カ ( M ) 超 音 波破 砕 攻 の 可i8 性 西 分
( S ト ア フ ィ ニ テ ィ カラム のi8 出 宵 分( E ) を示 す ー は T rx H $ 6 取 合 S A P K 2 ( W T I タン パ クーを 示 す
S A P K2
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1
｡
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.
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42
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の 直 上 にir 入 す るプE) テ ア
ゼ サ イトの 検 討を行 っ た 醇 の ♯ 製 プE ) トコ
-
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耗 勲 を行 っ た 時 の S A P K 2 P V T ) 各 港 製 段 階 に お ける s D S P A G E 結 果 S D S P A (; E は 5
ポ J ア クリル ア ミr ケラ ジ 工 ン トゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン はそ れぞれ 分 子J L マ カ ( M ) 烏 合タン
パ ク文 音i r 故 ( L a n e 1) 超音 波 破砕攻 の 可 溶 性 両 分( L a rt e 2 ト N i c h e l a t h g カラ ム を用 い た♯ 強硬t L a n e 恥 プI ) テ ア
ゼ 処 理 後( L a n e 4) N I c h e l d i n g カラム 非 吸 書画 分 ( L a n e 恥 姓 イオ ン 交 ♯カラ ム を用 い た耕 具 壌 ( L a rL e 恥 t 稔 の ゲ ル
ろi L ♯ 製 & ( L a r[ e 7 ほ 示 す ■ は T r x J li s 6 k 合 S A P K 2 ( m ) タン ′( クエ - は E K 処 理 に より切 ホされ た 推 定分 子 マ ス
3 8 5 k D a よりも 大きい S A P K 2 タン J ( ク ー ト は P r e S 処 理l こ より切 斬され た 推 定 分 子 マ ス 3 8 5 k D a とほ ぼ
致する
S A P K 2 タン J ( クJt を示 す
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20 %
A ) の プロ トコ
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45
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P D E S T tr x E K S A P K 2
( A)
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.
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43
( A)
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h e l a ti n g カラ ム 精製後 の ゲ ル ろ過 精製f こ より プ ロ テ ア
ー
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ゼ 処 理 の 消 化 効率 が 向 上 する
カラム 書 製 彼 の 処 甥 の 速 い に よる S A P K 2 ( W T ) の P r e S 処 理 の 洲 ヒ地車 を比 較 した 耗 盤 プE ) トコ ル
お よぴ プE) テ ア ゼ処 理 前 故 に おけ る s D S J } A (; E の 椅果 を示 した s D S P A G E は 5 2 0 % ポリ アクリル ア ミドゲラ ジエ ン ト
ゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン は それ ぞれ N i c h e l a ti n g カラ ム を用 い た 稚 載 壌( L a n e l およぴ 3 ) 透 析 凌 の
P r e S 処 理( L a n e 2 ト N [ c h e l d h g カラ ム 特 製 稜 の ゲ ル ろ5A 頼 製 ( L a n e 4) ゲ ル ろi L 耕 製 彼 の P r e S 処 理 ( L a n e 5) を 示
す ■ は T r x 日i $ 6 浪 合 S A P K 2 ( W T ) タン パ ク文 ー は S A P K 2 ( W T ) を示 す
(A)
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S A P K2
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ル お よび精製結 果
｡
結 果 S D S P A (3 E は 5 2 0 % ポリアクIJ ル アミドダラジ D トゲ ル を
用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン は それ ぞれ 分 子 t マ カ ( M ) h 合タン l ( クT 議 事 後 ( L a n e l ト 血 書泣 破砕 攻 の
可 薄性両 分 ( L a n e R ♭ m c h e l d f n g カラ ム を用 い た耗Il 攻( L a n e 3) ゲ ル ろiL ♯ 載 故( L a n e 4) P r e S 処 理 故( L a rt e 5 )
N J c h e ) d l n g カラム 非 吸 書 画 分( L a n e 6) JL 徒 の ゲ ル ろiL ♯J l 故( L a n e 7) を 示 す ■ は T r x Hi s 6 計 合 S A P K 2 P ∼T ) タ
ー は S A P K 2
ン パ クー
( W T ) を示 す
( 8)
S A P K2
r W T) 各♯ 載 段 階 に お ける S
D S P A G E の
ー
-
-
｡
ー
ー
｡
､
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M
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P 2 6 5) の 発 現 お よび可5 8 1ヒを確 証 した S D S P A G E の 轄 果 . S D S P A G E は 5 2 0 %
-
･
I
ラ ジ 工 ントゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た ｡ 各 レ ン は それ ぞ れ 分 子 t マ カ
( w ト 超 音 波 破 砕 故 の 可 溶 性両 分 ( S ト超 音 波 破砕 故 の 不5 8 性 宵 分( P ) を示 す ■
ー
ー
-
､
-
-
ポリアクリ ル アミドケ
h 合タン l ( ク 寛 舞g[ 前( U) 話 中 後
(
は T r x H i s 6 融 合 S A P K 2 ( M l P 2 6 5) タ
M)
.
.
I
D
IP T G
-
ン I ( ク王を示 す｡
現 および 可 新 ヒを確 認 した S D S P A G E の 轄果 S D S J > A G E I * 5 2 0 % ポリア クリ ル アミドケ
ラ ジ 工 ン トゲ ル を用 い 全 て 遺 元 条件 で 行 っ た 各 レ ン は それ ぞ れ 分子 t マ カ ( M ) 息 合タン パク 文 誘尊 前( U) 誘 専 攻
( w ) 逸 音 波 破 砕 稔 の 可 溶 性 両 分 ( S 一 連 音 波 破砕 後 の 不i 8 性 両 分( I ) を示 す ー は T r x H i s 6 散 合 S A P K 2 ( M l T 2 8 3) タ
ン I ( クーを示 す
S A P K2
( a)
(
M l 丁2 8 3) の 発
一
-
-
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ー
-
ー
､
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.
.
-
､
｡
.
46
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( A)
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( k D 3)
220
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22 0
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一
一
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℃
18
C 3 hr
ー
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巴ヱ ユ 巴 ヱユ
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⊥≡ 1 ニ
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S AP K2
(M
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M
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1
2
3
4
5
6
7
発現 と可 剰 ヒの 確 認 およ び 輔製錯果
l $ 3 0 8) の
-
)
( M l S 3 0 8) の 発 現 および 可58 1ヒを捷 記 した S D S J A G E の 頼果 S D S P A O E は 5 2 0 % ポリア クリル ア ミドゲ
ラ ジ 工 ン トゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン はそれ ぞれ 分 子 t マ カ ( NI) 息 合タン I ( ク文革gI 前 ( U ) 誘j* 凌
( w ト 起 音 波 破 砕 故 の 可i8 性 画 分 ( s) 超 音 波破 砕 攻 の 不j 8 性 西 分( p) を示 す ◆ は T r x Hi 8 8 k 合 S A P K 2 ( M I S 3 0 8) タ
ンJ ( ク井 を示す
( A)
S A P K 2
-
-
｡
ー
ー
ー
｡
.
.
.
-
-
｡
.
｡
各 ♯ 製 段 階に お ける S D S P A Q E の 祐乗 S D S P A G E は 5 2 0 % ポリア クl) ル ア ミドゲラジ D ト
ゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行っ た 各 レ ン は それ ぞれ 分 子 暮 マ カ ( M ) k 合タン I i ク ー 謝 俵 ( L a n e 1) 超 音 波 破
砕 故 の 可 溶 性 簡 分( L a n e 2) N i c h e l a ti11 g カラム を用 い た ♯ 製雀( L a n e 3 ) ゲ ル ろiL ♯ 製 雀 (L a rt e 4) P r e S 処 理 故
( L a n e 5) M c h e l a tl n g カラ ム 非 吸 書 画 分( L a n e 8 トJ L a の ゲ ル ろ3A ♯ 叔 故 I L a n e 7) を示 す I は T r x H i s 6 h 合
ー
s A P K 2 ( M l S 3 0 8) タン パ クJ(
は S A P K 2 ( M l S 3 0 8) を示す
( B)
S A P K 2
( MI
S 3 0 8)
-
I
-
｡
ー
ー
ー
｡
､
.
.
.
.
､
-
-
D
.
･
-
､
.
47
( A)
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( k D a)
2 20
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｢ コiiii
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･
司 :弓
喜岳こ ｢ 1
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1
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30
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･
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｢ 二=
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M
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TG
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( B)
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20 1
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( A)
SA PK2
S A P K2
(K3
( K 3 3 A)
3 A ) の 発 現 と可
些
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1
2
3
4
5
6
7
の 確艶 お よび精製積果
溶化
の 尭 現 および可 剃 ヒを祉 記 した s D S P A G E の 椿 果 ｡ S D S P A G E は 5 2 0 % ポ リア クリル アミドゲラ ジ
-
-
-
工 ン トゲ ル を用 い 全 て 違 元 条 件 で 行 っ た 各 レ
ン は それ ぞれ 分 子 t マ
カ ( M ト 払 合タン J i クJ( 誘 導 前 ( u ト 誘 導 後
( w ト 超 音 波 破 砕 龍 の 可i8 性 両 分( s l 超 音 波破 砕 象 の 不38 性 宵 分( I) を示 す ◆ は T r x H i $ 6 息 合 s A P K 2 ( K 3 3 A) タン
-
.
ー
ー
｡
-
-
｡
､
′( ク■ を示 す ｡
( B)
S A P K 2
( K 3 3 A) 各 ♯ 製 段 階に おける S t) S
･
P A (; E a ) 措 果 ｡ S D S P A 6 E は 5 2 0 % ポリア クリ ル アミドゲ ラジ エ ン トゲ ル
-
･
を用 い 全 て 遭 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン はそれ ぞ れ 分 子 1 マ カ ( M ト 払 合タン′1 ク ー誘 導 攻 ( L a n e 17 超 音 波破 砕 彼
の 可 溶性 画 分 ( L a n e 2) M c h e l d h g カラム を用 い た 頼基 徒( L a n e 3) ゲ ル ろ過 ♯製 後( L a n e 4 ) P r e S 処 理 後( L a n e 5 ト
N i c h e l d irl g カラム 非 吸 書 画 分 ( L a n e 6) J L 故 の ゲ ル ろ過 ♯ 製 壌 ( L a n e 7 ほ 示 す ■
は T r x J l i s 6 k 合 S A P K 2 ( K 3 3 A)
タ ン パ ク耳 ー は S A P K 2 ( K 3 3 A 姥 示 す
-
-
ー
｡
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､
.
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｡
.
､
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巴ヱユ 巴三ユ
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℃ 3 hr
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( B)
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3 5
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国 14
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7
8
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10
剃 ヒの 確 思 および特発括果
2 8 4 L 3 3 9) の 発現 と可
-
l
( P 2 8 4 1 3 3 9) の 発現 および 可 * 1ヒを 臆 した s D S P A G E の 頼果 S D S P A G E は 1 5 % ポリア ク) ル アミドゲ
ル を用 い 全 て 還 元 条件 で 行 っ た 各 レ ン はそ れ ぞれ 分子 t マ カ ( M ト 亀 合タン I ( クt 昏gF 前t u ト 昏g[ 徒 P V) 逸 書
波 破 砕 故 の 可 治 性両 分 ( s) 超 音 波 破 砕 捷 の 不38 性 簡 分( P ほ 示 す I は T r x H ( s 6 払 合 S A P K 2 ( P 2 8 4 L ) 3 9) タン パ ク
ー を示 す
( A)
S A P K2
I
I
｡
ー
ー
ー
､
｡
､
-
-
｡
.
｡
S A P K 2 ( P 2 8 4 ⊥3 3 9) 各 耗製 段 階 に お ける S D S P A Q E の 結 果 S D S P A G E lま 1 5 % ポリア ク1) )I ア ミドゲ ル を用 い
全 て 丑 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン は それ ぞれ 分 子Jt マ カ ( M ) 払 合タン I ( クJt 帯ir 故I L a n e l ト超 音 波破 砕 彼の 可 溶性
両 分( L a n e 2) N i t h e ) a t h g カラム を用 い た 頼 製 壌( L a n e 3) 1 回 目 の ゲ ル ろi L 清 泉 攻 ( L a n e 4) 払 イオ ン 交 換カラム ♯ 製
鼓 IL a n e 5 ) 2 回 目 の ゲ ル ろi L # 製 鼓( L a n e 8) E K 処 理 壌 ( L a n e 7 ト 3 回 目 の ゲ ル ろ且 耗81 故 t L a n e 恥 N i c h e l a tl n g
カラ ム 非吸 着国 分 ( L a n e 9 ) N i c h e l d i rt g カラム 竹薮 の 再 出 宵 分( L a n e 1 0) を示 す ■ は T r x H I s 6 h 合 S A P K 2 ( P 2 8 4
L 3 3 9 ) タン l ( クエ
は T r x Hi $ 6 タグ - lま S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) を示 す
( B)
｡
ー
･
I
.
ー
ー
｡
.
.
.
.
.
.
｡
.
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.
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49
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c h r o m at o g r a p
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c h r o m at o g r a
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c h r o m at o g r a
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phy
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15
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2 8 4 L 3 3 9))
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l
G el filt r a ti o n
c h r o m at o g r a p
hy
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h y (p
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C
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園 15
m e a s u r e m e nt
(
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S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9) の 精製プ ロトコ
-
N S A P K 2 ( P 2 8 4 L 3 3 9)
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-
-
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N tr x t a g)
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0 0 4 帽J2 0 pJ
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▲
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0 2 p g f2 0 pl
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●
一
15
15
C
B B 染色
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■
S A PK 2
J
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叩
ー
トラジ オ グラム
0 0 4 LL g 21) p A
叩¶0
.
.
.
2 p 9 /2 0 pI
要
妻:
毒
害
i:
2
0
∝
M BP
国16
租換 え
( A ) ♯ 鼓 した
オ
ー
S A P K 2 の 京浜管 内リン 敢 化 ア ツ セ イ
S A F' K 2
( Ⅵ T ほ さ 兼とし
.
トラジオ グラ ム を 示 した ｡ M
( B) ( A )
の SAP K2( m
)
M B P
は 分子t マ
ー
ー
その 1
を益 王として 駄 故 管 内リン 軌 ヒア ツ セイ を行 っ た 左 に C B B 染 色 ♯ 右 に
カ を示 す ◆ は S A P K 2 P V T ) + は M B P を示 す
｡
､
-
の 自 己IJ ンi( 他 レ ベ ル の 走JE
.
-
｡
.
｡
堵果 群集タン パ クJ( あ たりの 相 対放 射5 性 を示 した
｡
51
,
｡
( A)
SA P K2
+
+
-
-
S 3 08
_
_
+
+
M BP
-
+
+
+
-
.
-
+
-
-
+
I
-
+
-
+
+
-
-
(k D a) U
__
2 5 0 :-
(k D a) M
= 二i
畠
75
50
150
10 0
.
-
-
+
S 3 08
+
+
G ST
P[4 K
-
+
-
-
-
I
'
r T
25
;
+
･
■■
1
ー
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染色
S AP K2
-
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37
C B B
1
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⊂ =
ー
一
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-
-
･
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く +
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ー
-
-
二
二
25
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●
_
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ー
ー
■ ■
■ ■
250
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=
75
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●
●
ー
37
●●
ー
■■
-
■■
ー
-
⊂ =
25
10
10 鶴 S D S P AG E
-
( B)
3 O EI
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一O
.
.
rEii i 1
g
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喜
巨
目
自
∃
室
:
…
二
:
看
喜
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:
蓋
喜
.
1 0
.
l
.
D5
<
<
A P K2
ー
BP
.
.
ー
-
辞 兼 の 自 己 リン 酬 ヒレ ベ
､
ルの
およぴ
C B B
-
.
の
.
D B9
その 2
A P K 2 ( W T ) およぴ S A P K 2 ( M I S 3 0 8) を辞 兼 とし M
化 ア ツ セイ を行 っ た G S T は 益 井 の コ ン トl ) ル として 用 い た 上 段 に
ー は辞 乗
十 は基J(
◆
は 分 子 t マ カ を示 す
は G S T を示 す
( a ) ( A)
.
1 OD
.
のま式験管 内リン 酸化 ア ツ セ イ
｡
6 S ｢ FI IK
1Jl
d EK)
( A ) 書 製した s
ー
8 吉T
,5d
.
D 00
.
租換 え S
ー
I
l)
0 58
国 17
■
2 ユ9
如 堅_｣
r
G S T
-
P 14 K
を基 王として 民 政 管 内リン 散
トラ ジオ グ ラム を示 した M
染 色億 下 段 に オ
.
､
ー
｡
-
､
定t 結 果 左 に 基 文が
｡
52
M 8 P
.
の書 合の 轄果
.
右[ =
pr4 K
の 場 合 の 結 果 を示した ｡
( A)
S A P K2
S A P K2
(W
CIA P
+
-
■ -
Pro Q
(M
T)
S AP K2
( K 3 3 A)
1 $ 3 0 8)
-
+
-
+
-
■
-
R
u
by
･
-
･
⊥
-
･
⊥
■
_
÷
†
( B)
S A P K2
SAP K2
(M
SAP K2
租換 え
囲18
( A) 頼義した
いて
､
コ
で展 開し P
､
ro
( B) ♯ 載した
出 した
ー
l
P
ル 処理
Q D I a lT
s A P K2
W T)
NT
■ ■
1 $ 3 0 8)
-
(K
3 3 A)
およぴ s A P K 2 ( K 3 3 A ) の リンi[ 1ヒ状 態をi ∼ぺ た こ れら の タン / 1 ク ーに つ
ある い はア ル カーJ ホ ス フ ァタ ゼ 処 理 ( + c LA P ほ 行 い 1 0 % の ゲ ル を用 い た S D S P A G E
(F 'rEI Q ) と S Y P R O R LJ b y (F h b y ) で 染 色した
トS A
P K 2 ( M I S 3 0 8)
トC r A P)
D r[d
(W
-
は 大 腸菌 の 中 で すで にリン 酸化 され て い る
S A P K2
s A P K2
ン トロ
(
T)
｡
ー
･
.
I
.
SA P K 2
｡
(M
I S 3 0 6)
およぴ s A P K 2 ( K 3 3 A ) を 二 次 元 t 気 泳tb で 展 開し
｡
53
､
C B B
染 色 にJ : り検
( A)
T
rx
-
Hi s 6
S A P K 2 ( W T)
tK
S A P K2
3 3 A)
U
W
S
P
W
S
P
W
I
l l
l
37 ℃
S
P
1
l
30 ℃
18 ℃
( B)
T
rx
-
Hi s s
.
･
i 〕 占i ii F
L
S A P K 2 ( W T)
.
一
S A P K 2 ( K 3 3 A)
■
一
-
-
-
-
■■ t
W
S
P
W
ll
l
37 ℃
組換 え
■■ ■
p
1
丁
■■
■
'
-
ー
▼
ー
■
S
+
｢
丁
-
■■
一
■
-
与
U
図 19
-
･
-
_
P
30 ℃
l
L
S
P
_
W
l
+++
ト
■
こi
+
++
1
18 ℃
S A P K 2 は 培養温 度 に 関わらずリン 酸 化 され て い る
タグ T r x N [ $ 6 S A P K 2 ( W T ) およぴ T r x H i s 6 S A P K 2 ( K 3 3 A) の l) ン書如ヒ状 態をP rt) 4 Dl a rTI O n d に より胡
た S D S P A O E は 1 2 5 % ポ リア クリ ル ア ミドゲ ル を用 い 全 て 還 元 条 件 で 行 っ た 各 レ ン は それ ぞれ k 合タン パ ク f 琵
j r 前( U ) 誘gI 鼓( W ) 超 音波 破 砕 壌 の 可58 性国 分( s ト 超 音 波 破 砕 徐 の 不i 8 性 圃 分( P) を示 す
( A)
べ
T
-x
I
H i8 8
1
-
.
ー
｡
.
.
.
,
.
.
( B ) (A ) の ゲ ル の S Y P R
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1
( F)
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タグ の 1 H 1 5 N H S Q
C
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H ( 脚 ))
に よる解析
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( c) ( A ) お よぴ ( 8) の ス ペ クトル の 圭 ね 合 わせ ( A) の ス ペ クト ル をマ ゼ ン ダで 示 し ㈹ の み で 見 られ る主 なシ グナ ル を o
由 ん だ また ( a ) の ス ペ クトル をシ ア ン で 示 し ( B ) の み で 見 られ る主 な シグナ ル を ○ で 田 ん だ
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( F) ( D ) およぴ( E ) の ス ペ クトル の 重 ね 合 わ せ ( D ) の ス ペ クトル をマ ゼ ン ダで 示 し ( D ) の み で 見 られ る主 なシ グ ナ ル を o で
囲 ん だ また ( E ) の ス ペ クト ル をシ ア ン で 示 し ( E) の み で 見ら れ る主 なシ グ ナ ル を o でE g ん だ
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書 但し アク
糠
末ヰ 領 域 を
ク
+ ( ま同
の アミノ敢 残 基 : お よぴ は類似 の 残 益 を示 す X r a y は 構造 辞析 され た 2 H A K E c h a h の 二 次書 遣 c h o u
F a s m a n は S A P K 2 f W T) の C h o u F a s TTl a n 法[ = よる 二 次g t 遁 予 測 の 掠 果 J p re d l およぴ J p r e d 2 は それ ぞれ S A P K 2
'
r w T ) およぴ s A F K 2 ( L 2 6 1 L 3 3 9) の J p r e d 法 に よる 二 次 ♯造 予 測 の 措 果を示 す また F i r s t l F i r s t 2 A Jig n l および
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2
2
S A P K 2 の モ デリン グ♯ 造
園 22
( A) モ デリ ン グの テ ン プレ トに 用 い た 2 H A K E c b a l n の リボン 構 逢お よび表 面 t 帯f[ 遭 リボ ン ♯造 で(i キナ ゼF メイ
ン を書 C 兼ヰドメイン を マ ゼン ダで 示 した 但 し キ ナ ゼドメイン の うちアクチ ベ
ション ル プは 簸 で 示 した 表 面t 帯f (
造 は 眺 領域 を赤 吐基 仕儀城 を書 疎 水 性官 墳を白 で 示 した
ー
ー
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.
､
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.
｡
.
( B)
SA P K2
の モ デリン グ群 丑 ｡ ( A) と同 様 の
( C)
SA P K 2
の
色を用 い て 示 した
表面 t 菰構 造 ( A) と同 様 の 色を用 い て 示 した
.
.
ー
｡
｡
57
参考 文 献
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J G e n Mi c ｢ o bi o l 5 3 3 9 5 4 0 4
Vavasse ur
B e li n C d e F ra n c o P 0 B o u r b o u s s e C
C h a ig n e p a l n S S c h m itt e r J M
A
a n d T h o m i n e S (2 0 0 6) 1 d e n tifi c a ti o n o f f e a t u re s
G j ra u d a t J B a rbi e r B ry g o o H
r e g uJ a ti n g O S T l ki n a s e a cti vity a n d O S T I A ) n c tj o n i n g u a r d c e lJ s P la n t P h y s i o l 1 4 1
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B r a y E A ( 1 9 9 7) Pl a n t re s p o n s e s t o w at e r d e fi cit T r e n d s Pl a n t S ci 2 4 8 5 4
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B u rz a A M
P e k al a I Sik o ra J
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i n A r a b id o p s IS Pl a n t C e " 1 5 1 8 3 3 1 8 4 5
C h o u P Y a n d F a s m a n G D ( 1 9 7 4) P r e di c ti o n o f p r o te i n c o nf o r m a ti o n B i o c h e m i s t ry
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63
.
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.
.
要約
( S n R K 2) フ ァ ミ リ の プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ 群 に 属 す る
プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ は 植物 に お い て 高 浸 透 圧 ス ト レ ス や ス ト レ ス ホ ル モ ン と し て 知
こ れ ら の プ ロ テ イ ン キナ
ゼが
られ て い る ア ブ シ ジ ン 酸 ( A B A ) に よ り活 性 化さ れ る
A B A や 高 浸 透 圧 ス ト レ ス 応 答 に お ける シ グナ ル 伝 達 に お い て 中 心 的 な 役 割を果 た し て
い る こ と を 示 唆す る 報告 が 相 次 い で い る し か し S n R K 2 プ ロ テ イ ン キナ
ゼの ユ ニ
ク な 活 性制御 の 分 子 機構 に つ い て は 不 明な 点が 多 い こ の 分 子 機構 の 理 解 に は S n R K 2
タ ン パ ク 質 の 高次 構 造 に 関 す る 情報 が必要 不可 欠 で あ る 本研 究 で は S n R K 2 フ ァ ミ リ
に 属 す るイ ネ S A P K 2 の 立 体構 造 およ ぴ こ れ に 基 づ く 機 能 メ カ ニ ズ ム の 解 明 を 目 的
こ れに 成
と し S A P K 2 およ び そ の 変 異 体 タ ン / ( ク 質 の 大 量 か つ 高純度 の 精 製 を 試 み
功 し た 得 られ た 組換 えタ ン パ ク 質 の プ ロ テ イ ン キナ ゼ 活 性 や リ ン 酸 化 状態の 解 析を
に リ ン 酸 化 され
行 い S A P K 2 が 大 腸菌 内 に お い て は 分子 間 自 己 リ ン 酸 化 に よ り不 均
る こ と C 末端領域 の ドメ イ ン 2 が S A P K 2 の 酵素 活 性 も し く は 自 己 リ ン 酸 化 に よ る
被 リ ン 酸 化 能 に 重 要 で あ る こ と な どを 明ら か に し た ま た X 線立 体 構 造解析を 目 指 し
た 組換 え S A P K 2 の 結 晶化 S A P K 2 C 末端領域 に 関 す る N M R を 用 い た 解 析 お よ ぴ ホ
モ ロジ
モ デ リ ン グを 用 い た S A P K 2 の モ デリ ン グ構造 の 構築 を試 み た
こ れ らの 実験
か ら S A P K2 のキナ
ゼ ドメ イ ン が C 末 端領域 と相 互 作 用 す る可 能性 な ら び に C 末
端領 域 の ドメ イ ン 1 が キ ナ ゼ ドメ イ ン の 構 造維持 に 重 要 で あ る こ と が 示 唆 され た
S N Fl
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一
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,
､
ー
｡
-
､
､
ー
｡
64
高 等植 物 に お ける高浸 透 圧 ス トレ ス 応 答 の シ グ ナ ル 伝 達 機 構
第
章 序論
一
植物 の 成 長 に と っ て 水 欠乏 は 致 命 的 で ある 植物 は 利用 可 能 な水分 が 制 限され ると 個体
および細 胞 レ ベ ル で 水分 の 損 失を抑 えたり 吸 収 を促 進するこ と に より 水 欠 乏 に よる ス トレ
ス( 水 ス トレ ス) 状態を 回 避する ような反応 を 示 す たとえ ば 個体 レ ベ ル で の 短期 間 の 応 答と
して は 気 孔 閉鎖 の 誘 導 長 期 の 応 答として は 根系発 達 の 促進 な どが 挙 げられ る また 細胞
レ ベ ル で の 応答とし て は プロ リン を はじめとす るア ミノ酸 や 糖 など の 適合溶質 の 蓄積 の 誘導
に より 浸 透ポ テ ン シ ャ ル を調 整 し 水 の 流 出 を防 い で 膨 圧 を保 つ また 細 胞 は脱 水 に よる
様 々 な悪 影響 に 対 して その 機能を保護する 仕 組 み を誘 導する([ n g r a m a n d B a n eL s 1 9 9 6 )
乾燥 な どに よる水 ス トレス に よっ て 誘導され る 連 の L E A 関 連タン パ ク質 は 様 々 な 機能タン
パ ク 茸 に 対 して 保護作 用をも つ とされ て い る 多くの 場 合 細胞 レ ベ ル で の 水 ス トレス は 高浸
透 圧 ス トレ ス に よ っ て 模倣される ことから 実 験 的 に は 高 浸 透 圧 ス トレ ス 応 答 が 様 々 な 視 点か
ら研 究され て い る
こ れ ま で に 水 欠 乏 ある い は 浸 透 圧 ス トレ ス 応 答 お よぴそれ ら の シ グナ ル 伝 達 に 関 す る 数
多くの 研 究 が 主 に 生 化 学 的 生理 学 的 ある い は分 子 生 物学 遺 伝 学 的 ア プ ロ チ に よ っ て 行
｡
､
､
､
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一
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､
｡
､
､
ー
･
.
わ れ て きた( B r a y 1 9 9 7 ; K ni g h t 2 0 0 0 ; X i o n g a n d Z h u 2 0 0 2 ; X i o n g e t a L 2 0 0 2 ; Z h u e t al
1 9 9 7 ; Z h u 2 0 0 2 ) そ の 結 果 プ ロ テ イン キ ナ
ゼ( タン パ ク賞リン 酸 化 酵素) および プ ロ テ イ
ン フ ォス フ ァタ
ゼと い っ たシ グナ ル 伝 達 因 子 や カ ル シ ウ ム イオ ン リン 脂 質 イノ シト ル リ
ン 酸 など の セ カン ドメッ セ ン ジ ャ
ならび に そ れらを合成す る 酵素 の 関与 が 明 らか に され て き
T = ( D e W a fd e t al 2 0 0 1 ; M u n nik e t aJ 1 9 9 9 2 0 0 0 ; P i c al e t a [ 1 9 9 9 ; W a n g 1 9 9 9 ; Xi o n g
et al
2 0 0 2 ) しか し それらの 因子 全 て が 同じカス ケ ドで 機 能す るとは 考 え にくく 情報 伝 達
経路 の 全 容をそ の 素 反応 の 連続として 理 解 するま で に は至 っ て い な い
,
,
,
.
,
,
ー
｡
,
､
ー
ー
,
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､
,
｡
さまざまなシ グナ ル 伝 達 因 子 の 中 でもプ ロ テ イ ン キナ ゼ は 多くの シ グナ ル 伝 達経 路 に お
い て 鍵 的 役 割を果 たす 酵 母 で は 高 浸透 圧 ス トレ ス シ グナ ル は セ ン サ
で あるヒ ス チ ジン キ
パ
ナ
ゼ に よ っ て 感 知 され ヒ ス チ ジ ン と ア ス
ラギ ン 酸 残 基 間 で の リン 酸リレ を 経 て
m it o g e n a c ti v a t e d
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k
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M
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ドに 伝 達 さ れ 防 御 反 応 を 示 す
(
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p
( M a e d a e t al 1 9 9 4 ) シ ロ イヌ ナ ズ ナ に お い ても 乾燥/ 高 浸 透 圧 誘導性 の セ ン サ 様 ヒ ス チ
ジ ン キナ ゼ A t H K l が 同 定され 酵 母 の セ ン サ キナ ゼ 変異 体を相補 して 高 浸 透 圧 ス トレ
-
.
ー
｡
､
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ー
,
ー
-
､
ー
.
｡
,
､
ー
ー
ー
､
耐性を 回 復さ せ た ことから 植物 に お い てもセ ン サ 様 ヒ ス チ ジ ン キ ナ ゼ が 浸 透 圧 ス トレ
ス セン サ
として 機能して い る可 能性も示 唆され て い る( U r a o e t al 1 9 9 9 ) しか し 受 容体 ヒ
つ で あ るサイトカイ ニ ン 受容体も 酵 母 に お い て は 浸 透 圧 セ ン サ
ス チ ジンキ ナ
ゼの
とし
て 機能す るこ とが 報告され て い る( R ei s e r e t al 2 0 0 3 ) した が っ て A t H K l が 植物 に お い て も
浸透 圧 セ ン サ として 機能する か どうか は 今 後 の 研 究を待 たなけれ ばならな い
低温 や 傷 あ る い はサリチ ル 酸 H 2 0 2 や エ リシタ な どの シ グナ ル 分 子 に よっ て 活 性 化さ
れ る M A P キナ ゼカ ス ケ ドが 高浸 透 圧 ス トレ ス で 活 性 化され る こ とや タJ くコ の M A P K K K
( M A P K ki n a s e ki n a s e ) で ある N P K l の 構成 的発 現 に より 植物 が 凍結 高 温 高塩濃度 な ど
幅広 い ス トレ ス に 対して 耐性を示 すように なる ことも報告され て い る( H o y o s a n d Z h a n g 2 0 0 0 ;
l c hi m u r a e t a l 2 0 0 0 ; M ik o l aj c z y k e t a l 2 0 0 0 ; Z h a n g a n d Kl e s si g 1 9 9 8 ) こ れらの こ とを
合 わ せ て 考 えると M A P K は 酸化 的 ス トレ ス を伴う広 汎 な ス トレ ス 応 答 に 関 わる ス トレ ス シ グナ
ス
ー
ー
､
ー
.
ー
,
｡
､
一
ー
､
.
｡
,
､
ー
､
｡
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､
､
-
ー
､
､
､
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､
65
｡
ル 伝 達 に お い て 機 能 して い るも の と推 測される
シ ロ イヌ ナ ズ ナ A
｡
ゼとして 最 初 に 同 定され た
もの で ある( P a rk e t a L 1 9 9 3 ) それらの 触 媒ドメイ ン の C 末端 側 に 酸性 ア ミノ 酸に 富 んだ 領
域を含むドメイン をも つ 特 徴 が 指摘され て い た そ の 後 タ/ くコ 培養細 胞 あ る い は 菓 の 抽 出 液
を用 い て m y eLi n b a si c p r o t e i n ( M B P ) を基質に したゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イを行うと 4 0 k D 周
S K l およぴ A S K 2 は S
R K 2 プ ロ テイ ン キナ
n
,
ー
一
.
,
.
､
､
辺 に 浸透 圧 ス トレ ス に よ っ て 速 やか に 活 性 化され る C a 2 非 依存 的 プロ テ イン キ ナ ゼが 検 出
される こ とが 報告され た( D r o i" a r d e t a l 2 0 0 0 ; H o y o s a n d Z h a n g 2 0 0 0 ; M ik ol aj c z y k e t ar
2 0 0 0 ; M o n k s e t al 2 0 0 1 ) また ア ル フ ァ ル フ ァ( M u n nik e t a L 1 9 9 9 ) や シ ロ イヌ ナ ズナ 培養
細胞( D r o i" a r d e t at 2 0 0 2 ) に お い て も同 様 の 結果 が 報告され て い る こ の ような 高浸透 圧 ス
+
.
.
.
,
.
ー
,
.
,
,
,
.
.
,
トレ ス に よ っ て 活 性 化される プロ テ イン キ ナ ゼとして 4 2 k D プ ロ テ イン キナ ゼがタJ くコ 培養
細 胞 から精製され た( M ik ol aj c z y k e t a L 2 0 0 0 ) こ の プ ロ テ イン キナ ゼ は そ の 部 分 アミノ 酸
配 列 の 相 同 性 から S n R K 2 フ ァ ミリ に 属 し シ ロ イヌ ナ ズ ナ A S K l の ホ モ ロ グで ある こ とが 示
ー
ー
ー
,
｡
ー
､
され た( H a(f o r d
､
最 近 に な っ て K e[ n e r ら( 2 0 0 4 ) に
より こ の 4 2 k D プ ロ テ イン キナ ゼ は N t O S A K としてク ロ ニ ン グされ 生化 学 的な 特徴 が
報告され て い る
方 ソラ マ メ の 孔 辺 細 胞 からは A B A に よ っ て 活 性 化される A A P K ( a b s ci si c
a ci d a c ti v a t e d p r o t ei n ki n a s e ) が 精製 ク ロ
ン 化され S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ
ゼの A B A
シ グナ ル 伝 達 に お ける重 要 性 が 決 定 的 に な っ た( Li a n d A s s m a n n 1 9 9 6 ; L i e t aI 2 0 0 0 ) 活
性 を 持たな い ドミナ ン トネ ガ テ ィブ 型 の A A P K 変異タン パ ク質 を孔 辺 細 胞 プ ロ トプラス トで 過 剰
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d H
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1 9 9 8; H
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2 0 0 3)
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一
｡
､
ー
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､
､
.
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,
発現さ せ ると A B A に よる 陰イオ ン チ ャ ネ ル の 活 性 化 が み られ なくなるとともに A B A に よる気
孔 の 閉鎖 が 阻 害され た( Li et aJ 2 0 0 0 )
シ ロ イヌ ナ ズ ナ に お い ても 遺 伝 学 および逆 遺伝学 の 手 法 に より A A P K ホ モ ロ グの A B A シ
グナ ル 伝 達 へ の 関 与 が 明 らか にされ た 気孔 が 開 い た 状態で は 蒸散 に より気 化 熱 が 奪わ れ る
ため 閉鎖状態 に 比 べ 葉温 度 が 低 下 する o p e n S t o m a t a l ( o s t l ) は 赤外 線イメ ジ ン グを用
､
､
.
.
,
､
｡
ー
､
､
｡
た ス クリ ニ ン グに より葉 温 度 の 低 い 変異 体として 分 離され そ の 原 因 遺 伝 子 が A A P K l と
高 い 相 同 性を も つ S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ を コ ドす る こ とが わ か っ た( M u s ti = e t a l
2 0 0 2 ; Y o s hid a et a[ 2 0 0 2 ) また ほ ぼ 同 時期 に ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セイ で 検 出され る A B A
活 性 化プ ロ テ イ ン キナ ゼ の 性 質とゲ ノム 情報 に 基 づき S R K 2 E が 同 定され O S T l と同 様
の 機能 が 明ら か に され 両 者 は 同 の プ ロ テ イン キ ナ ゼ で あ る ことが わ か っ た( Y b s hid a e t
al
2 0 0 2 ) さら に コ ム ギ( T rjti c u m a e s ti v u m ) で は S n R K 2 フ ァ ミリ に 属 する P K A B A l が
い
ー
､
ー
ー
.
.
｡
,
,
,
ー
､
､
一
ー
,
ー
.
.
,
､
に よる発現 誘 導を 受 けるこ と ならびに こ れ を
ロン 層
過 的 に 過 剰 発現さ せ るとアリ ユ
に お ける α ア ミラ ゼ 遺 伝 子 プ ロ モ タ の ジ ベ レリン に よる活 性 化 が 抑制 される こ とから
ジ ベ レリン 応 答 の A B A に よる 抑制制 御 へ の 関 与 が 示 され て い る( G o m e z C a d e n a s e t aI
1 9 9 9 2 0 0 1 ; J o h n s o n e t a[ 2 0 0 2 ; S h e n e t al 2 0 0 1 )
方 フ ォ ス フ ァ チ ジ ル イノシト ル
代 謝 の 研 究 からも高 浸透 圧 ス トレ ス 応 答 に S n R K 2 が関 与す る可 能性 が 指摘された M o n k s
ら( 2 0 0 1 ) は ダイズ の S e c 1 4 p 関 連フ ォス フ ァ チ ジ ル イノシト ル 転移タン パ ク 質( P IT P ) が 高
浸透 圧 に よ っ て 迅 速 に リン 酸 化される こ とを見 い だした そし て ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イ に より
S n R K 2 様 の 活 性 が こ の P IT P をリン 酸 化 する ことを 示 した 興 味 深 い こ とに ダイズ S n R K 2 プ
ABA
一
ー
､
ー
ー
ー
-
､
-
.
-
.
,
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,
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,
,
ー
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｡
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｡
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､
｡
ロ テ イン
キナ
､
内 で 発 現 さ せ るとこ れ らが 高 浸 透 圧 ス ト
ゼ S P K l ある い は S P K 2 を酵 母 細胞
るこ とともに 同 時に 発 現させ た PtT P が リン 酸 化され る ように なる こと
を報告 して い る S n R K 2 フ ァ ミリ の プ ロ テ イン キナ ゼ が 傷 浸透 圧 ス トレ ス 低温 エ リシ
エ チ レン A B A など様 々 な シ グナ ル 伝 達 経路 に 関 与 して い るフ ォ ス フ ァ チ ジン 酸( P A ) の
タ
ー
,
レ ス に よ っ て 活 性 化され
､
ー
ー
｡
､
ー
､
,
66
､
､
､
ゲ ッ トとな っ て い る可 能性も示 唆され て い る( T e s t e ri n k e t al 2 0 0 4 )
S n R K ( S n f l 帽I a t e d p r o t ei n ki n a s e) フ ァ ミリ は そ の 名 の ように 酵 母 の S n fl と類 似 性 を示
S n R K l S n R K 2 およぴ S n R K 3 に 分 類
す 群 の プ ロ テ イン キナ ゼ で 3 つ の サ ブフ ァ ミリ
H
柑
b
a
k
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t
a
l
2
0
0
3
しか
し
に
は
され る(
)
実際
系統樹 上 およ び機能 的 に は S n R K l が 酵母
タ
ー
.
｡
,
ー
.
一
ー
ー
､
.
｡
,
､
とより関 連性 が 高 い
､
､
､
は S n fl や 動物 の ホ モ ロ グ で あ る
A M P a c ti v a t e d p r ot ei n ki n a s e と同 様に 炭素 代 謝 や栄 養 シ グナ ル 応 答 に 関与 して い る
方
べ
S n R K 2 およぴ S n R K 3 は 植物 に 特有なサ ブフ ァ ミリ で あり 以 下 に 述 るように 環境 ス トレ
ス 応 答 に お ける シ グナリン グ に 特 化 したサ ブフ ァ ミリ で あると思 われ る また S n R K フ ァ ミリ
はカ ル シウ ム 依存 性 プ ロ テ イ ン キ ナ ゼ C D P K フ ァ ミリ とも 相 対 的 類 似 性 が 高く
の S n fl
S
｡
n
R Kl
サ ブフ
ァ ミリ
ー
､
一
-
､
｡
ー
､
､
ー
｡
ー
ー
､
ー
､
C DPK S
パ
と称され るこ ともある( H ra b a k e t al 2 0 0 3 )
イネ ゲノ ム に は 1 0 種 の S n R K 2 プロ テ イン キナ ゼが コ ドされ て い る 同 様 に シ ロ イヌ ナ ズ
ナ に も 1 0 個 の 遺伝 子 が 存在する( H ra b a k e t a l 2 0 0 3 ; K o b a y a s hi e t a l 2 0 0 4 ) 触 媒 ドメイ
ン の ア ミノ酸 配 列をもとに 系 統樹を書くと 大きくわ けて Ⅰ Ⅱ Ⅱ の 3 つ の サ ブクラス に 分 か れ
る サ ブクラス Ⅱ に は A A P K や O S T l/ S R K 2 E が 含 まれ る それ ぞれ の サ ブクラス に は シ ロ イ
ヌ ナ ズ ナとイネ で 同じ数 の メン バ
が 含 まれ るが サ ブクラ ス 内 で は 対 の オ ル ソ ロ グ関 係
は 成り立 た な い したが っ て サ ブクラス 内 で は 両 植物種 の 祖先 が 分 岐 した 後 それ ぞれ の メ
ンバ
が 生じたもの と思 わ れる
当研 究室 で は イネゲ ノム に コ ドされる 1 0 個 の S n R K 2 フ ァ ミリ メン バ ( S A P K l か ら
-
RK ス
n
ー
ー
フ ァ ミリ
ー
.
ー
.
,
ー
｡
.
.
,
､
､
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｡
｡
一
一
ー
､
｡
､
､
､
ー
｡
ー
ー
ー
､
と命名) を全 て ク ロ ン 化 し 機 能 解 析 を進め て きた こ れ ま で に こ れら全 て の メ ン
バ
が 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ て 速 や か に 活 性 化される こ と ならびに そ の うちサブクラス Ⅱ に
属す る 3 つ ( S A P K 8 9 およ ぴ1 0 ) は A B A に よ っ て も活 性 化され る こ となどを他 の 埴物由 来 の
S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ
ゼ に 先 駆 け て 明 らか に し た( K o b a y a s hi e t a I 2 0 0 4 ) さら に
ロ
S n R K 2 プ テ イン キナ ゼ の 活 性 化 はリン 酸 化 に よ っ て 制 御され て い るこ とや A B A シ グナ
ル が C 末 端領 域 に よ っ て 認 織される ことも同 時 に 報告 した( K o b a y a s hi e t al 2 0 0 4 ) 続 い て
シ ロ イヌ ナ ズ ナ に お い て も 1 0 個 の S n R K 2 フ ァ ミリ の プ ロ テ イン キナ ゼ の うち 9 個 が浸 透
S A P KIO
ー
､
｡
､
ー
､
､
ー
.
o
,
､
ー
､
一
.
ー
｡
,
､
ー
圧 ス トレ ス に よ っ て 活 性 化され そ の うち の サ ブクラス Ⅱ およ ぴ Ⅱ に 属 する 5 個 が A B A に より
活 性 化される こ と 低 温 で はどれ も活 性 化され な い ことが示され た( B o u d s o c q e t a l 2 0 0 4 )
S n R K 2 プ ロ テ イ ン キナ ゼ は 触媒ドメイン の C 末端側 に 制御 ドメイ ン と考 えられる 6 0 から
8 0 アミノ酸 からなる 領域 を持 つ 当研 究室 で は A B A に よる活 性 化を 受 ける S A P K 8 と受 けな
い S A P K 2 の 間 で ドメイン 交 換実験 により S A P K 2 の C 末 端ドメインを S A P K 8 の それ で 置 換
､
､
.
｡
,
ー
一
､
｡
､
-
､
キ メラプロ テ イ ン キナ ゼ は 弱 い ながら A B A に よる活 性 化 を受 けるように な
る ことを報告 した( K o b a y a s hi e t aJ 2 0 0 4 )
方 S A P K I O や シ ロ イヌ ナズナ O S T l / S R K 2 E
の C 末 端ドメイン の
部 欠 失 に よ っ て A B A に よる活 性 化 の み が 消失 する ことも示され て い る
( Y b s hid a e t al 2 0 0 6 ) また 大 腸菌で 発現さ せ た 組換 え O S T l /S R K 2 E の C 末 端領 域 の ド
メイン 2 および1 の
部 分を欠 失 するとリン 酸 化 活 性 が なくなる ことが 報告され て い る( B e li n e t
aJ
2 0 0 6 ) さら に O S T l / S R K 2 E C 末 端ドメイ ン に は プ ロ テ イ ン フ ォス ファ タ ゼ 2 C で ある
したとこ ろ
この
､
ー
､
一
.
｡
,
､
一
一
一
.
｡
,
､
一
ー
一
.
,
｡
､
､
が 結 合す る ことが 酵 母 t w o h y b rid ア ツ セ イ に よ っ て 示され て い る( Y o s h id a e t al 2 0 0 6 )
こ れら の こ とは C 末端 ドメイン が上 流 シ グナ ル の 受容 に 必 要 なドメイ ン で ある こ とを 示 して い
A B 11
-
.
,
-
､
る
リン 酸 化 に よる 制 御をう けるプ ロ テ イン キナ ゼ の 多くに つ
在 す るア クテ ィ ベ シ ョ ン ル プと呼 ばれる 領 域 の セ リン ス
｡
ー
ー
ー
､
67
そ の 触媒ドメイン 中 央 に 存
レ オ ニ ン あ る い は チ ロ シ ン の リン
いて
､
｡
酸 化 に よ っ て 活 性 化される こ とが知られ て い る( J o h n s o n e t a L 1 9 9 6 ; N ol e n e t al 2 0 0 4 ) ま
た こ れら の ア ミノ酸を酸性 ア ミノ 酸 で 置 換 する ことに より構成 的 活 性 型 に なる 場 合 も知られ て
い る( A s ai e t al 2 0 0 2 ; G o n g e t al 2 0 0 2 ) S n R K 2 の ア クテ ィ ベ
ション ル プ中に は 7 つ の
セリ ン およぴ ス レ オ ニ ン が 存 在 する が こ れ らの 幾 つ か ある い は そ の 組 み 合 わ せ に つ い て 酸
性ア ミノ 酸 へ の 置 換 に よる 構成 的 活 性 化 型 へ の 変換 が 試 み られ たが 明 瞭な 構成 的 活 性 型を
得る こと に は 成 功 して い な い ( K o b a y a s hi e t al 2 0 0 4 )
S n R K 2 プロ テ イ ン キナ ゼが 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ て 迅 速 に 活 性 化される ことは 高 浸 透
圧 ス トレ ス 応 答 の シ グナ ル 伝 達 に お ける中 心 的役 割を想像さ せ る し か し 高 浸 透 圧 シ グナリ
ン グに より活 性 化され た S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ ナ
ゼが 植物細 胞 内 で どの ようなタン パ ク質を
リン 酸化 して い る か に つ い て の 知 見 は極 め て 限 られ て い る
A B A に よる活 性 化を受 けた A A P K に よるリン 酸 化 標 的 の 候補として A KI P l と名 づ けられ た
R N A 結 合タン パ ク質 が 報告され て い る( Li et a l 2 0 0 2 ) A KIP l が 酵 母 t w o h y b rid ア ツ セ イ に
お い て A A P K と結 合 する こと 試 験管 内 に お い て A A P K は A KI P l をリン 酸 化 する こ と A KI P l
が A B A シ グナ リン グに よ っ て 核 ス ペ ッ ク ル とよばれる 核 内 の 特定 の 構造 に 局 在するように なる
ことな どが そ の 根拠 で ある
s rk 2 e 変 異 体を 用 い た実 験 から A B A に よ っ て 活 性 化を 受 ける S n R K 2 プ ロ テ イン キナ
ゼ
は気 孔 応 答 の み ならず A B A に よ る遺伝 子 発現 誘 導 に 至るシグナ ル 経路 に お い て も機 能 して
い ると考 えられ た( Y b s hid a e t a l 2 0 0 2 )
当 研 究 室 で は A B A に よる転 写 誘 導 を担う b Z I P 型
転 写 因 子 T R A B l を 同 定 し こ の 因 子 の 転写 活 性 化 能 がリン 酸化 に よ っ て 制御され て い るこ と
ならび に そ の リン 酸 化 部位 の 1 つ が S e rl O 2 で ある こと明 らか に した( K a g a y a e t a l 2 0 0 2 ) さ
らに A B A に より活 性 化され た S A P K 8 から 1 0 が こ の セリン を芸式験 管 内 で 効率よくリン 酸 化 す
るこ とや 培養細 胞 内 で 過 剰 発 現させ た S A P K I O と T R A B l が 免疫 沈 降 に より共 沈 降する こと
などを報告した( K o b a y a s hi e t a l 2 0 0 5 )
方 T R A B l ホ モ ロ グで あるイネや コ ム ギ の A B A 応 答 エ レメン ト( A 臣R E ) 結 合 因 子( そ れ ぞ
れ O R E B l お よび T a A B F ) と S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ の 特 異 的相 互 作用 も酵母 t w o h y b rid
.
,
.
,
､
ー
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.
,
ー
.
,
､
､
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､
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,
､
､
,
.
｡
,
､
,
,
.
｡
一
､
ー
-
ア ツ セ イ に よ っ て 示され て い る( C h
a e et aL
!
2 0 0 7; J o h n s o n et al
.
2 0 0 2)
,
こ れ らの ことか ら
｡
､
結 合 因 子 は A B A に よ っ て 活 性 化 を受 けた S n R K 2 プ ロ テ イ ン キナ ゼ に よ っ てリン 酸
化され そ の 転 写 活 性 化 能 が 増 加するものと考 えられ る T R A B l は S e r l O 2 に 加 え て S e r g 4
も S A P K I O に よ っ て リン 酸 化され る シ ロ イヌ ナ ズ ナ の A B R E 結 合 因 子 に つ い て も S n R K 2 に
よるリン 酸 化 が 報告 され た( F u rih a t a et a L 2 0 0 6 ) こ れ らリン 酸 化 部位 の 周 囲 の 配 列 から
A B R E
ー
､
､
｡
｡
｡
,
,
とい う共 通配 列 が浮 か びあ が っ てくる 興 味 深 い こと に こ の ような 標 的配 列 の コ ン セ
バ ラッ プして おり A B R E 結合タン パ ク質 の リン 酸 化 に
ン サ ス は C D P K の 認 識 配 列 ともオ
ロ
寄与す る プ テ イン キ ナ ゼ は S n R K 2 の み で はな い 可 能性 もある 実 際 シ ロ イヌ ナ ズナ
C D P K の 1 つ で ある A t C P K 4 と A B F 4 との 相互 作用 が 酵 母 t w o h y b rid ア ツ セ イ に よ っ て 示 さ
L
x
R
x x
S
｡
ー
､
ー
､
ー
｡
､
-
れ て い る( C h oi
以 上 の ように
e t al
.
,
2 0 0 5)
0
高浸透 圧 ス トレ ス および
A B A 応 答 に お ける シグナ ル 伝達 に お い て 中 心 的な役 割を果た して い る可 能性 を 示 す デ タ が
蓄積 して きて い る し か し こ れ ら の プ ロ テ イン キナ ゼを介 するシ グナ ル 伝 達経路 の 下 流 応
答 や活 性 化 に 関 わる 上 流 因子 に つ い て の 知 見 は 未 だ に 乏 しく 今 後 の 課 題とな っ て い る
そ こ で 本 研 究 で は 嵩浸透 圧 ス トレ ス や A B A シグナ ル が S n R K 2 プ ロ テ イ ン キナ ゼまで 伝
達され るメカ ニ ズ ム す なわ ち岡 プ ロ テ イ ン キナ ゼ の 上 流 因 子 に 関す る知 見を 深 め る こ とを
､
S
n
R K2
フ ァ ミリ
ー
に 属するプ ロ テ イ ン キナ
ゼが
ー
､
ー
ー
｡
､
､
｡
ー
､
-
､
68
目 指 した そ の ため まず 高 浸 透 圧 ス トレ ス や A B A シ グナ ル に よる S n R K 2 プ ロ テ イン キナ
ゼ の 活 性 化を 引き起 こ すリン 酸 化 の リン 酸 化 部位 の 同 定を行 っ たうえで こ れ に 関わ る 上 流プ
ロ テイン キナ
ゼ の 同 定を試 み た また 想定 しうる上 流 因 子として 3 主 体 G タン パ ク質 や フ ォ
ー
､
｡
､
ー
｡
酸の 関 与に
ス フ ァ チ ジン
結合能 が 確 認され たため
い て も検 討 した
､
つ い て 検 討を行 っ た ｡
､
フ ォス
また 研 究 の 過 程 で S A P K の フ ォ ス フ ァ チ ジン 酸
フ ァ チ ジン 酸と S A P K に お ける活 性 化 メカ ニ ズ ム の 関 係 に つ
､
｡
第 二 章 実験
1
プロ トプラス トを 用 い たトラン ジ ェ ン ト発現
.
ボ レ シ ョ ン 法 に よるトラ ン ジ ェ ント発 現 は イネ 培 養 細 胞 ( O c li n e) か ら調 製 した
プ ロトプラス トを用 い K a g a y a ら( 2 0 0 2 ) が 記 載 した方 法 に 従 っ た 共 発現 に 用 い た S A P K 発
現 プラ ス ミドは K o b a y a s hi ら( 2 0 0 4 2 0 0 5 ) が 記 載 し たプラ ス ミドある い は 当 研 究室 に お い て
小 林 に より作 製され たプラ ス ミド( 未発 表) を用 い た エ レ クトロ ボ レ シ ョン 後 の 細 胞 を 1 2 m I
の R 2 P 培 地 ( K y o z u k a a n d S hi m a m ot o 1 9 9 1) ( 細胞濃度 は おおよそ 1 x l O 6 c e []s / m l) を用
い て 3 0 ℃ で 1 2 か ら1 5 時間 培養した よく懸濁 した 1 m J の プ ロ トプラス ト培養液を 2 m l 遠 心
チュ
ブ( ア シ ス ト) に 移 し 終濃度 の 5 倍 の 濃度 の N a C l または A B A を含 む R 2 P 培 地を 1 / 4
容を加 え 1 5 分 間処 理 した
また 使 用 し た 薬剤 は 次 の ように プ ロ トプラ ス ト培養液 に 処 理 し た 滅菌水 に 溶 解 し た マ ス ト
バ ラン ( W a k o ) あ る い はメタノ ル に 溶解し た ス フ ィ ン ゴシ ン 1 リン 酸( Si g m a ) を 目 的 の 処 理 濃
度 に なるように R 2 P 培 地 4 0 0 m M N a C l ある い は 5 0 〟 M A B A を 含む R 2 P 培地 に 加 え 1 5
分 間 静置 処 理 した
リン 脂質 の 処 理 は次 の ように 行 っ た 3 s n フ ォ ス フ ァ チ ジ ン 酸 ( P A ; Si g m a) o l e o yJ L α リ
ゾ フ ォ ス フ ァ チ ジ ン 酸 ( L P A ; Sig m a ) L α フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン ( P C ; Si g m a ) ある い は
3 S ∩ フ ォス フ ァ チ ジ ル エ タノ
ル ア ミン ( P E ; S ig m a) は ク ロ ロ ホ ル ム に 溶解 した 使 用 前 に
ロ
ロ
ク
ホ ル ム を揮 発さ せ R 2 P 培 地 に 約 3 0 分 間 の 超 音 波 処 理( B R A N S O N Y A M ♪J O
B R A N S O N IC 1 5 1 0 ) に より完 全 に ミセ ル 化さ せ た 後 プ ロ トプラ ス ト培養液 に 加 え て 処 理 した
エ
レクトロ
ー
-
､
､
｡
､
,
ー
｡
､
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,
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ー
､
､
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､
､
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-
-
-
｡
-
-
､
-
-
,
ー
-
-
.
｡
､
,
､
2
二
.
2 1
-
.
｡
次 元 電 気 泳 動 とイム ノ ブ ロ ッ テ イン グ
目 的タ ン パ ク 質の 精 製
目 的タ ン パ ク質をトラン ジ ェ ン ト発 現させ たプロ トプラス トの 培養液 1 m l に 対 して 各 処 理 を行
い 1 0 0 0 0 rp m
室 温 で 3 分 間 遠 心 後 上 溝を除去 し 液体窒素 で 凍結 した 凍結 した 細 胞 に
b
抽 出 u q e r [ 2 0 m M T ri s H C ] ( p H 7 5) 2 m M E D T A 2 m M E G T A 5 0 m M β グリセ ロ リン 軌
.
.
,
､
､
｡
I
-
.
1 0 0 LL M N
m
M スクロ
a3 V
ス
ー
,
O4
m
M D TT 0 5
0 1 %
T
w e e
.
,
,
p l et e T M E D T A fr e e ( R o c h e ) 2 5 0
n 2 0 ] を2 0 0 LL l 加 えて ボ ル テ ッ クス し 1 5 0 0 0 r p m
4 ℃で 1 5
ツ ペ ン にとっ た こ れ に 2 0 0
ル( p H 8 0 ) を
〟l の T E 飽和 フ ェ ノ
2
,
,
.
m
M P M SF 1
,
x
C
o m
-
-
,
､
､
,
分 間遠 心 後 上 溝を新し い エ
加 えボ ル テ ッ クス し 1 5 0 0 0 r p m 4 ℃ で 1 5 分 間 遠 心 後 上 溝を 除去 した 5 0 m M T ri 告 H C t
( p H 7 5) を2 0 0 JL l 加 えボ ル テ ッ クス し 1 5 0 0 0 r p m 4 ℃ で 1 5 分 間 遠 心 後 上 溝を除 去 し
ー
,
｡
.
-
､
､
,
､
.
メタノ
､
ー
ル に 溶 解 した 1 0 0
m M
硫酸 ア ン モ
､
,
ニ
｡
ウ ム を1
69
､
､
ml
hE]
えて 混 合後
-
､
20
o
C で
一
晩保 存 し
た
分 間 遠心 し た後 上 清を除 去 し さらに メタノ ル に 溶 解 し
ニ
1
0
0
m
M
ン
モ
ム
1
m
] 加え て 混 合後 1 5 0 0 0 rp m 4 C で 1 5 分間 遠 心 し 上
た
硫酸ア
ウ を
溝を除去 した こ の 操 作を 2 回 繰り返 した 後 8 0 % ア セトン を 1 5 m l 加 え 1 5 0 0 0 r p m 4 C
で 1 5 分 間 遠 心 し 上 溝を除 去 した こ の 操作を 2 回繰り返 し た 後 サ ン プ ル を風 乾させ た
これを 1 5 0 0 0
.
rp m
,
o
4
､
C で15
ー
,
､
o
､
,
,
､
o
.
,
､
2 2
-
.
､
.
｡
､
,
､
｡
次元 電気泳 動
ニ
二 次 元 電 気 泳動 の
次 元 目 の 泳動 は Z O O M IP G R u n n e r シ ス テ ム () n vitr o g e n) を用 い
っ て 行 っ た
上 述 の ように 精 製 し た 風 乾 後 の サ ン プ ル に S a m pl e
b u 斤e r [7 7 M 尿 素 2 2 M チ オウ レ ア 4 % C H A P S 2 0 m M D T T 0 5 % Z O O M C a rri e r
A m p h oly t e s ( p H 4 7 ; l n vitr o g e n) 0 0 0 2 % ブ ロ モ フ ェ ノ
ル ブ ル ] 1 6 0 LL l を加 えて 溶解 し
1 5 0 0 0 rp m 4
C で 1 5 分 間 遠 心 後 上 溝を サ ン プ ル 溶 液とした Z O O M カセ ットを 平らな 実
験 台 上 に 置 き サ ン プ ル 溶液 1 5 5 JL l をサ ン プ ル ロ ディ ン グディ′( イ ス に 充 填し
次 元等
の
Z
O
O
M
ス
プ
H
4
7
l
n
v
i
t
r
o
e
n
セ
に
電点電 気泳 動 用
トリッ ゲ ル ( p
;
g
) をカ ット 挿 入 し そ の まま
添付 の
-
､
説明書にしたが
.
｡
､
.
,
,
,
,
.
,
ー
-
-
､
.
,
o
､
,
.
｡
ー
一
,
､
-
､
室 温 で 9 0 分 間 静置 して ス トリッ プゲ ル を膨 潤させ た
電極用 ろ紙 2 枚 に 蒸 留 水を浸 み 込 ませ ゲ ル の 両 端 に 置 き カ セ ッ トを Z O O M I P G R u n n e r
に セ ッ トして 電 気 泳 動 を開 始 した 通 電 条件 は 表 1 に 示 した 3 段 階で 限 界 電流値 及 び限 界 電
力 値 は そ れ ぞれ ス トリッ プゲ ル 1 本 当り 1 m A 2 W に 設 定した
次元 電 気 泳動 終 了 後 次 の ような S D S 平 衡化 処 理を行 っ た ス トリッ プ ゲ ル をカ セ ットか ら
取り出 し ゲ ル 1 本 当り5 m l の S D S 処理 溶液【1 x N u P A G E L D S S a m pl e B u ff e r (l n vjtr o g e n)
1 x N u P A G E S a m pl e R e d u ci n g A g e n t (l n vit r o g e n)] で 1 5 分 間 振遺 した さらに ゲ ル 1 本 当り
5 m l の S ア ル キ ル 化 溶 液[ 1 2 5 m M イミダゾ ル ( W a k o) 1 x N u P A G E L D S S a m p l e B u q e r
(l n vit ｢o g e n)] で 1 5 分 間 振 遺 した
N u P A G E 1 0 % ビ ス トリス ゲ ル 1 m m 1 w e ll (l n vit r o g e n) を 用 い て 次 の ように 二 次 元目 の
電 気 泳 動 を行 っ た S D S 平衡 化 処 理 し た 次 元 ス トリ ッ プ ゲ ル を 二 次 元 目 ゲ ル の ウ ェ ル に 乗
せ ゲ ル 同士 が 密着 するように ミク ロ ス パ テ ル で 軽く押 し 分 子量 マ カ
( P r e ci si o n PI u s
P r o t ei n A l = ∋J u e S t a n d a r d s ; Bi o R a d) 3 LL l を浸 み 込ま せ た小 片ろ紙を ス トリッ プゲ ル の 陽極
外 側 に 挿 入 した 二 次 元 目 の ゲ ル を泳動槽 に セ ットし 泳 動 b u 斤e r[ 1 x N u P A G E M E S S D S
R u n ni n g B u ff e r ([ n vit ro g e n) ] を注 ぎ 通 電条件 は 定電圧 2 0 0 V で 3 5 分 間 ゲ ル
枚あ たり
の 限界 電流値 及 び 限界 電 力値 はそれ ぞれ 1 2 0 m A 及 び 2 5 W に 設 定し 泳 動 した
､
｡
､
､
｡
､
､
｡
一
､
｡
､
,
｡
､
ー
-
,
｡
ー
､
一
｡
ー
ー
.
ー
,
-
.
.
一
､
､
,
2 3
-
.
イム
ノブ ロ ッ テ イン
グ
上 記 の 方 法 で 泳 動 し たゲ ル を Bl o tti n g b uff e r[ 4 8
グリシン
M
,
20
に より ニ トロ セ ル
メタノ
%
ロ
ー
ル
ー
0 13
.
,
m
M S D S]
M トリ ス ヒドロ キ シメチ ル ア ミノメタン 3 9
m
.
m
｡
.
,
を用 い てトラン ス プ ロ ッ ト S D
ス メン プ レ ン( T r a n s Bl o t T r a n s f e r M
-
e
diu
m;
Bi o R
a
-
セ ル( Bi o R
-
a d)
d) に 電 気 泳 動 的 に 転
写 し た 転 写 後 の メン プ レ ン をブ ロ ッ キ ン グ溶液I l % B S A 5 % ス キ ム ミ ル クを 含 む T B S
b u 斤e r [ 5 0 m M T ri s ( p H 7 8 ) 1 5 0 m M N a CI 1 m M M g C 12 6 H 2 0 ]I 中 で 3 7
C で 1 時間 穏 や
ベ
か に 振 蓋 し な が らイ ン キ ュ
卜し た そ の 後 1 /1 0 0 0 希 釈 の 抗 H A 抗 体( C o v a n c e
｡
,
o
･
.
,
,
ー
｡
Ri c h
,
E E N 2 0 を含 む T B S b u q
m
(
m o nd
を含 む ブ ロ ッ キ ン
C A)
H
o s e ra
d i s hi
P
e ro xi d a s e
e r( p
､
グ溶液中 で 3 7
,
,
o
C
､
1
時 間 振遺 した T T B S b u 肝e r[ 0 0 5 %
希 釈 の ペ ル オキシダ ゼ
｡
.
H 7 8 )] で 3 回 洗浄 した 後 1 /2 0 0 0
) 標 識した
ー
､
.
二
次 抗 体( E C L
70
A n ti
-
m o u s e
lg G
,
H
o r s e ra
di s h
) を含 む ブロ ッ キ ン グ 溶 液 中 で 3 7 ℃ 1 時
間 振遺 した そ の 後 T T B S b ufF e r で 3 回 T B S b u q e r で 3 回 洗浄 した 後 E C L P) u s W e s t e r n
Bl o tti n g D e t e c ti o n S y s t e m ( A m a e r s h a m ) を 用 い て 発 光 反 応 を 行 い X 線 フ イ ル ム
( H y p e rfi[ m E C L ; A m e rs h a m ) に 露光し た
P
e r o x id a s e li n k e d
h ol e
w
｡
a n tib o d y ;
A m e rs h
､
a m
,
,
､
,
､
｡
3 1
目 的タン パ ク質 の ア フ ィ ニ テ ィ
-
.
回収
ー
各 処 理を したプ ロ トプラ ス ト培養液 1 m l に 5 倍 濃縮 H i s 結 合 b u fF e r[ 1 0 0 m M リン 酸 緩衝 液
( p H 7 4) 5 0 m M イミダ ゾ ル 5 % T w e e n 2 0 2 5 0 m M β グリ セ ロ リ ン 酸 5 0 0 〃 M
N a 3 V O 4 2 5 m M P M S F 5 x C o m pJ et e T M E D 17 u r e e ] 2 5 5 LL I を加 え 液体窒素で 速 や か に
凍 結 し た 終濃度 0 5 M お よび 全 容 量 1 7 m H = なるように 5 M N a C ) およ び滅菌水をそれ ぞ
れ 加 え 融 解 した さらに 超 音 波処 理( B R A N S O N S O N I FI E R M O D E L 4 5 0 ; o u t p ut 1 3
d u ty c y cl e l O % ) 1 5 秒間を 2 回行 い 1 5 0 0 0 rp m 4 ℃ で 1 5 分 間 の 遠 心 に よ っ て 残達を 取り
除 い た こ の ように して 得た 細胞 抽 出 液を 3 0 日I の N j N T A ア ガ ロ ス レ ジン ( Q I A G E N ) と混
合し 4 C で 3 0 分 間 回 転 に より摸挿 した レ ジン を W a s h b u fF e r[ 2 0 m M リン 酸 緩 衝 液
( p H 7 4) 2 0 m M イミダゾ ル 5 0 0 m M N a CI 5 0 m M β グリセ ロ リン 艶 1 0 0 日M N a 3 V O 4
0 5 m M P M S F 1 x C o m pl e t e T M E D T A fr e e ] で 3 回 洗浄 し 次 に 1 x C o m pl e t e T M E D T A f r e e
を 含む 2 0 m M T ri s H C J ( p H 7 5) で 3 回 洗浄した 後 3 0 JL J の 2 x S a m pl e b ufF e r を加 えた
これ を 9 5 ℃ 5 分 間 処理 し 結合タン ′i ク 質を溶 出 して 1 5 0 0 0 r p m 1 分 間 の 遠 心 に よ っ て
レ ジ ン を取り除 い た
､
ー
-
.
,
,
,
,
-
.
,
,
.
,
.
,
.
｡
.
,
､
,
.
.
,
ー
-
｡
o
､
､
｡
ー
一
,
.
,
,
,
-
.
-
､
,
-
､
.
､
.
､
,
､
,
｡
3 2
-
.
Ph
o s
P h o s Ta g
-
T ag S D S P A G E
-
S D S PA G E
は
o s hit a
ら( 2 0
た P h o s Ta g
( N A R D ) の 終濃度 が 1 0 0 〟 M に なるように 作製し た 1 0 % S D S ポリア クリ ル ア ミドゲ ル に 上
記 の 溶 出 液をア プライ し S D S P A G E に より分 画 した 電気 泳 動 後 1 0 m M E D T A を含む
T o w bi n b u fF e r[ 2 5 m M トリス ヒドロ キ シ メチ ル ア ミノメタン 1 9 2 m M グリシ ン 1 0 % メタノ
ル] で ゲ ル を 1 0 分 間 振遺 し 再 度 E D T A を含 まな い T o w bi n b ufF e r で 1 0 分 間 振遺 して 上 記 の
方 法で イ ム ノブ ロ ッ テ イン グを行 っ た
-
-
K in
の 方 法 にしたが
0 6)
っ
て行
っ
-
｡
-
､
-
､
｡
､
ー
,
,
､
｡
4
変異 体 S A P K 2 リコ ン ビナ ン トタン パ ク質 の 調 製
.
4 1
-
.
コ ン ス トラクトの 作 製
p 3 5 S S h ム S A P K 2 K/A 7 S /N d H A H i s ( 小 林 未 発 表) の N s p V およぴ E c o 8 1 1 ( T a K a R a)
に よる部 分 消 化 に より得られ た S A P K 2 K/ A 7 S / N 断 片領 域を P E N T R /S D / D T O P O P r e S
S A P K 2 ( K 3 3 A ) ( 青 田 2 0 0 7 名 古屋 大 学 大 学院 生 命農学 研 究科修 士 論 文) を 同 制 限 酵素
I
ー
1
-
-
.
-
-
-
､
､
.
消 化 し て 得 られ た ベ クタ
側 断 片 に 組 み 込 み シ ク エ ン ス を 確 認 後 G at e w a y L R
C l o n a s e E n z y m e M i x (l n vit r o g e n) を 用 い た L R 反 応 に よ っ て 大 腸 菌 用 発 現 ベ クタ
P D E S T t n く( T s u n o d a e t a I 2 0 0 5) に 組 み 込 ん だ 発 現 ベ クタ の 模 式 図を 付 図 1 に 示 し た
S A P K 2 K/A の 調 製 に は 当 研 究室 に お い て 青 田 に より作製され た 発 現 ベ クタ ( 青 田 2 0 0 7
名 古 屋 大 学 大 学院 生 命農学 研 究科修士 論 文) を使 用 した
で
ー
ー
､
､
ー
､
ー
-
.
,
.
｡
ー
､
､
｡
71
,
4 2
培養
-
.
を E c o lj B L 2 1 ( D E 3) p Ly s S 株 に 導 入 した 得られ た形 質転換体 の
単 コ ロ ニ を L B 液体培 地 ( 5 0 〟 g / m l ア ン ピ シリン) に 植菌 し 3 7 ℃ で O D 6 0 0 が 0 6 か ら
0 8 に なるまで 振 畳 培養 し 終濃度 5 0 〃 M に なる ようにI P T G を 加えた さらに 3 7 ℃ で 3 時
間もしくは 1 8 ℃ で 晩培養した 後 3 0 0 0 x g で 2 0 分 間 遠 心 する こ とに より大 腸 菌を 回 収 し
ベ クタ
得られ た発 現
一
ー
,
｡
.
ー
､
.
.
.
｡
一
,
℃ で 保存 した
80
-
4 3
,
｡
精製
-
.
精製 の 過 程 に おける共 通 の 操 作 に つ い て 以 下 に 示 す
タン パ ク質濃度 は 2 8 0 n m に おける吸光 度と 次 構造 から得 たトリプトフ ァ ン 及 びチ ロ シ ン 残
基 の 数 に 基 づ い て 算 出 した E の 僅 か ら求 めた タン パ ク質 溶 液 の 濃縮 は 分 画 分 子 量 1 0 0 0 0
の C e n tri pl u s Y M 1 0 ( M ilJip o r e) および C e n t ri c o n Y M 1 0 ( M i"i p o r e) を用 い て 限外 ろ過 に よ
り行 っ た 遠 心 濃縮 は C e n trip l u s の 場 合 3 0 0 0 x g 4 C で C e n th c o n の 場 合 は 5 0 0 0 x g
4
C で 行 っ た S D S P A G E に は 1 2 5 % ポリア クリル ア ミドゲ ル を用 い クマ シ
プリリア ント
ブル
( C B B ) 染 色 ( Q ui c k C B B ; W a k o) に よりタン パ ク質 バ ン ドを検 出 し た 分 子 量 マ カ
とし て H ig h R a n g e R a in b o w M ol e c uJ a r W eig h t M a rk e rs ( G E H e a[th c a r e) を用 い た
､
｡
一
､
｡
､
1
,
-
o
.
､
､
,
.
､
,
o
ー
-
｡
､
､
.
ー
ー
｡
ー
-
.
4 4
発現の確認
-
.
冷凍した 菌体 を S o ni c a ti o n b u 斤e r [2 0 m M T h s H C l ( p H 7 5) 5 0 0 m M N a C I 5 m M イミダ
ゾ ル] に 懸濁 し 氷 上 で 超 音 波 処理 ( T O M Y; U D 2 0 1 ; o u t p u t 2 5 d u ty c y cl e 1 0 0 % ) 2 5
分 間を 2 回 行 っ た 得られ た破砕液 を 1 5 0 0 0 rp m で 1 5 分 間 遠 心 し 可 溶性 画 分と不 溶 性 画
分 に 分 離 し た 目 的 融 合タン パ ク 質 の 発現 およ び 可 溶 化 の 確 認 は S D S P A G E に より行 っ
-
.
,
,
ー
-
.
､
.
｡
,
､
,
-
o
た
､
｡
4 5
S A P K 2 K /A お よ ぴ S A P K 2 K / A
-
.
S A P K 2 K /A お よび S A P K 2 K/A
o
18
C で
一
晩培養 した大 腸 菌を用
-
7 S/ N の
1
大量 精製
7 S/ N の 大量 精製 に は
いた
冷凍した 菌体を S
.
LL M の IP T G で 誘 導 し
終濃度 5 0
､
o n i c a ti o n
.
b u fF e r に 懸濁 し 氷 上 で 超
､
d u ty c y cl e 5 0 % ) 2 5 分 間を 8 から 1 2 回行 っ た 得 られ た 破砕液を
p
4 0 0 0 0 x g で 1 時 間 遠 心 し 可 溶性タン パ ク 質を回収 した 得られ た可 溶性融合タン パ ク質を
C h el a ti n g S e p h a r o s e F a s t Fl o w レジン ( G E H e alth c a r e) 2 0 m l を充填 し N i イオ ン をキ レ ト
させ たカラム ( 以 下 2 0 m l N i c h el a ti n g カラム な どと記 す) に 吸 着 させ 1 6 0 m l の S o ni c a ti o n
音波 処理 ( o
ut
u
t 4 5
.
｡
.
,
｡
､
,
､
ー
､
b
u 肝e r
で 洗浄後 イミダゾ
､
-
ル 濃度を 5
m
M から 3 0 0
m
M まで 1 5
.
濃度勾 配 をか け
Y M 1 0 に よる濃縮後 ゲ ル
m
M/ m l の
融 合タン パ ク質を含むカ ラム 溶 出 画 分 は C e nt ri pl u s
ろ過 b u q e r [2 0 m M T ri s H Cl ( p H 7 5) 1 5 0 m M N a C l] で 平 衡 化 し た H iL o a d 2 6/6 0 S u p e r d e x
7 5 p g ( G E H e alth c a 帽) を 用 い て ゲ ル ろ過 した こ れ らの 精製融合タ ン パ ク 質 の
部 に 終濃
度 0 5 m M に なるように D T T を加 え 1 m g タン パ ク 質あたり 1 7 から 2 0 U の P r e S ci s s i o n
P r o t e a s e ( G E H e alt h c a r e) で 4 ℃ で S A P K 2 K/ A の 場 合 は 2 日 間 S A P K 2 K J A 7 S / N の
て 溶 出 した
-
､
｡
､
-
.
,
一
｡
.
､
-
,
,
72
場 合 は 3 日 間 処 理 し チ オ レドキ シ ン ( T r x) H i s 6 タグを切 断 した プ ロ テ ア ゼ 処 理 の 後 の 反
応 液 を 5 m l N i c h el ati n g カラム に か け て T r x Hi s 6 タグおよ び未 消 化 融合タン / i ク質 を吸 着
させ 非 吸 着 画 分 に 目 的タン パ ク 質を 回収 した 得られ た非 吸 着 画分 をそ の まま C e n t rip l u s
Y M 1 0 に より濃縮 し H iL o a d 2 6 / 6 0 S u p e rd e x 7 5 p g を用 い た ゲ ル ろ過 精製 に 供し た さら に
終 濃度 0 5 m M に なるように D T T を加え C e n th p l u s Y M 1 0 およ び C e n tri c o n Y M 1 0 を用 い
て 目 的タン パ ク質を濃縮 した
ー
-
､
o
-
､
､
､
｡
-
､
｡
-
.
-
､
｡
5
.
ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イ
5 1
イネ 培養細胞 か らの 細胞抽 出 液の 調 製
-
.
植 え継 ぎ後 3 日 目 の イネ培養細胞 ( O c 株) の 培地 を除 き 0 4 M N a Cl を含 む R 2 S 培地 ま
たは N a Cl を含まな い R 2 S 培 地 で 1 0 分 間処 理 した 後 処 理 培地 を 吸 引 に より抜き取り 液体
窒素 で 速 や か に 凍結 した 液体 窒素 温 度 で こ れ を乳 鉢 乳 棒を 用 い て パ ウダ 状 に 破砕 し 3
倍容 の E x t ra c tj o n b ufF e r[ 5 0 m M T ris H Cl ( p H 7 5) 2 m M E D T A 2 m M E G T A 5 0 m M β
グリセ ロ リン 酸 1 0 0 LL M N a 3 V O 4 2 m M D T T 0 5 m M P M S F 1 x C o m pl e t e T M E D r A f re e
2 5 0 m M スクロ
ス 0 1 % T w e e n 2 0 ] に 懸濁 した 懸濁後 1 0 0 0 rp m
4 ℃ で 5 分 間 遠心し
て 得 た細胞 抽 出 液を あらかじめ K in a s e b u q e r [2 5 m M T ris H C [ ( p H 8 0) 1 0 m M M g C12 5 0
m M
β グリセ ロリン 酸 1 0 0 JL M N a 3 V O 4 1 x C o m pl e t e T M E D T A f r e e 5 % グリセ ロ ル]
で 平 衡化 したゲ ル 漉 過カラム ( エ コ ノバ ッ ク 1 0 D G カラム ; Bi o R a d) に よ っ て ′くッ フ ァ 置 換を
行うとともに 低 分 子 成分 を除 去 した その 後 1 5 0 0 0 r p m 4 ℃ で 1 5 分 間 遠 心 し 上 溝 画分 を
ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イ の サ ン プル とした
､
.
､
.
ー
｡
､
､
-
-
.
,
,
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.
,
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,
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,
,
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-
｡
､
､
,
､
｡
5 2
ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イ
-
.
基質タン ′i ク質を終濃度 0 2 m g / m l に なるように 加 え て 作 製した 1 0 % ポリア クリ ル ア ミドゲ
ル を用 い て S D S P A G E を行 っ た 電 気 泳動後 ゲ ル をプロ パ ノ ル 液【5 0 m M T h s H C l ( p H
8 0) 2 0 % 2 プ ロ パ ノ
ル] 中 で 3 0 分 間 振 遺 する 操 作を 2 回 行 っ た そ の 後 A 液【5 0 m M
T rj s H C J ( p H 8 0) 0 5 % ( v/ v) 2 メル カプトエ タノ ル 0 2 m M E D T A ] 続 い て 変性液【5 0
m M T ri s H C l ( p H 8 0) 0 5 % ( v / v) 2 メル カプトエ タノ
ル 0 2 m M E D T A 6 M グア ニ ジ ン】で
それ ぞ れ 3 0 分 間 を 2 回 ず つ 振畳 処理 した あらか じめ 4 C で 冷 や して お い た再 生 液[ 5 0
m M T ri s H C l ( p H 8 0) 0 5 % ( v f v) 2 メ ル カプトエ タノ
ル 0 2 m M E DTA 0 04 % T w e en
4 0 ] で 4 ℃ 3 0 分 間 の 振畳 処理 を 2 回 4 ℃ で 晩 の 処 理 を 1 回 さらに もう 度 再 生 液で
4 ℃ 3 0 分 間 の 振畳 処 理を行 っ た 次 に B 液[1 0 m M T h s H C l ( p H 7 5) 0 1 m M E G T A 2
m M D T T 1 5 m M M g C 12 ] に 置 換して 3 0 分 間 振 遺 し さら に 1 0 m f の B 液 に 交換した 後 1 0 0
JL M A T P を 2 LL [ と 5 0 LL M Ci/ m )[ γ 3 2 P ] A T P ( 比 放射能 3 0 0 0 C U m m ol) を 5 JL l また
場合 に よ っ て は 目 的 の 処理 濃 度 に なるように ス タウ ロ ス ポリン ( W a k o ) を 加え 3 7 ℃ で 1 時
間反 応した そ の 後 洗 浄液 ( 5 % T C A 1 % N a 4 P 2 0 7 1 0 H 2 0 ) で 3 0 分 間 8 回 洗 い ゲ ル
を 乾 燥 さ せ た 後 [P プ レ ト ( M o l e c ul a r D y n a m i c s) に 露 光 し T y p h o o n 9 2 0 0 ( G E
h e a 肘1 C a r e) を 用 い て 検 出し た
.
ー
-
-
｡
､
ー
-
.
,
｡
､
ー
I
-
.
.
,
､
.
,
ー
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-
.
.
,
.
,
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o
｡
､
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.
.
.
,
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.
.
一
.
一
､
.
-
､
｡
.
.
,
.
,
,
,
､
一
､
､
､
､
･
｡
,
,
､
ー
､
､
｡
73
､
6
試験管 内リン 酸 化 ア ツ セ イ
.
Ki n a s e b u ff e r [ 2 0 m M T rj s H CI ( p H 7 5) 1 m M D T T
-
.
ng
ng
およぴ 2 0 0
,
n
C暮
2] 4
JL l に
､
酵素として
-
､
M AT P I
-
､
､
で 分 画 した
分 子量 マ カ は
( Bi o R a d) を用 い た 電 気 泳 動 後 洗浄液 ( 5
の 洗浄を 2 回行 い C B B 染 色 ( Si m ply BI u e T
乾 燥 後 の ゲ ル を I P プ レ ト ( M o l e c ul a r
-
ー
ー
.
-
.
,
,
ー
) を用
い て 検 出 した
e alth c a r e
抗 S A P K リン 酸 化 S
-
.
M
I
､
LL
｡
S D S PA G E
7
10 m M
o
量を 2 0
h
,
基質として T rx S A P K 2 K/ A T r x S A P K 2 KJA 7 S / N ある い は M B P を
JL I ならび に 2 JJ C i の[ γ 3 2 P ] A T P を 加 え 滅菌水で 総容
C で 反 応 後 1 0 あるい は 1 5 %
ポリ ア クリ ル ア ミドゲ ル を 用 い た
LL l に し た 3 0
S A P K 2 W T を2 0 0
20 0
,
-
e r1 5 8
P re ci si o n
%
T CA
P一u s
1 %
,
P
N
a
ro t e i n
a
S ta n d
e
a rd s
4 P 2 0 7 1 0 H 2 0 ) で 1 5 分間
) を 行 っ た 後乾 燥した
m i c s)
に 露 光 し Ty p h o o n 92 0 0 ( G E
M S a f e S t ai n ; l n vit r o g
Dyn
A " Bl u
･
e n
｡
､
｡
ペ プチ ド抗体を用 い
たリコ ン ビナ ン ト S A P
リン 酸化 活 性 の 検
K2
出
Ki n a s
b
e
[2
u fF e r
0
M T ri s H C l ( p H 7 5) 1
m
,
.
M D TT
m
-
10
,
m M
M
n
C J 2 ] に 酵素 として 2 0 0
n
g
基 質として 2 0 0 n g の S A P K 2 K/A ある い は S A P K 2 K/ A 7 S /N 2 0 0 JJ M の
A T P を 1 JL l 加 え 総容 量 を 2 0 fL l に し た 3 0 ℃ で 6 0 分 間 の 反 応 後 6 x S a m pl e b u q e r
を 4 〟l 加 え イ ム ノブ ロ ッ テ イ ン グ に 供 した 抗 S A P K リン 酸 化 抗体 を用 い たイム ノブ ロ ッ テ イ
ン グ は 上 記 の 方 法 に 幾 つ か の 変 更を加 えた メン プ レン に は P V D F メン プ レ ン ( H y b o n d P ;
A m e r s h a m ) を 用 い た ブ ロ ッ キ ン グ は ブ ロ ッ キ ン グ溶 液【2 % B S A 1 0 %
ス キ ム ミ ル クを含
む T T B S b ufF e r] を用 い て 室 温 で 1 晩 穏 やか に 振遺 しながらイン キ ュ ベ 卜する こ とに より行
った
次 抗体 処 理 は 1 / 2 0 希 釈 の 抗 S A P K リ ン 酸 化 抗体を含 む ブ ロ ッ キ ン グ溶液 中 で
3 7 ℃ で 1 時 間 振 遺 する ことに より行 っ た 二 次 抗体処 理 は 1 / 2 0 0 0 希釈 の ペ ル オキ シダ
ゼ
の S A P K2 W T
-
,
､
,
.
､
-
､
｡
-
｡
｡
､
,
ー
､
一
-
｡
､
､
ー
｡
( H
P
o s e ra
di s hi
P
Ji n k
e r o xid a s e
e
e r o x id a s e
d
w
h
ole
間 振遺 す る ことに より行
っ
) 標 識 した
a n tib o
た
,
d y; A
二
m e rs
次 抗 体 ( E C L A n ti r a b bit lg G
h a m ) を含 むブ ロ ッ キ ン グ溶液中 で
H
-
,
､
37
o r s e ra
dis h
℃ で1
時
｡
第三 章 結果
1
.
S A P K 2 リン
酸化部位 の 同 定
を介す る高 浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル 伝 達 特 に S A P K 分 子 に 情報を伝 える上 流プロ
テ イン キナ ゼ を 明らか に するため に は 嵩 浸 透 圧 ス トレス に 応 答 して リン 酸 化され るア ミノ酸
残 基を 同 定 す る ことが 必 須 で ある そ こ で 園1 に 示 した S A P K 2 ア クテ ィ ベ シ ョン ル プ中 の
セリ ン およ ぴス レ オ ニ ン 残 基 に 変異 を導 入 した 発現 プラス ミドを作 製 し 高浸 透 圧 ス トレ ス に 応
答 したリン 酸 化 に 変 化 が ある か どうかを 調 べ る こ とに よりリン 酸 化 部位 の 同 定を 試 み た こ れ
まで の 研 究 で は S A P K 分 子 の リン 酸 化 状 態 の 変 化 は S D S P A G E 上 の 移 動 度シ フトに より
観察して きた が そ の 解像度 は 高くなく 複数 の リン 酸 化 部位 が 存在 す る場 合 の リン 酸 化 状態
を 区別 する こ とに は 限界 が あ っ た そこ で こ こ で はリン 酸 化 状態 の 変 化 を 二 次 元 電気 泳 動 上
の p I シ フト すなわちリン 酸 基 の 付 加 に よ るス ポッ トの 酸性側 へ の 移 行 として 検 出 した
d H A Hi s タグを付 加 した S A P K 2 ( S A P K 2 d H A Hi s) をプ ロ トプラ ス トで
過 的 に 発 現さ せ
SA PK
､
ー
､
ー
ー
｡
､
､
｡
-
､
､
､
,
｡
､
､
.
一
-
-
-
､
74
コ ントロ
ル 処 理 ある い は 高 浸 透 圧 ス トレ ス 処 理( 4 0 0
M
N
C l) を行
た 後 二 次元 電気 泳
を抗 H A 抗体 を用 い たイ ム ノブ ロ ット解析 に より
検 出 した コ ン トロ ル 処 理 を施し た細胞 の S A P K 2 は 1 つ の メジ ャ ス ポッ トと それ より酸性
側 の 1 つ の マ イナ ス ポットとして 検 出され た( 園 2 ) メジ ャ ス ポッ トを基底状態として 考 える
と コ ントロ ル 処 理 に お い て も 部 の 分 子 がリ ン 酸 化 を受 け て い るもの と思 わ れ た ま た 高
浸 透 圧 ス トレ ス 処 理 を行うと 基底状態より酸性側 に 4 つ の ス ポッ トが 出現 した( 園 2 ) した が
って
S A P K 2 は 高浸透圧 ス トレス に 応 答 して 少 なくとも 4 カ所 でリン 酸 化され ると考 えられ た
また ア クテ ィ ベ ショ ン ル プ前半 の 4 つ の セリン をア ス パ ラギ ン に 置 換し た A N S l で は 基底
ー
m
a
っ
､
動 に よりタン パ ク 質を分 離 S A P K 2 d H A H i s
-
-
､
ー
ー
｡
､
ー
ー
｡
ー
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状態より酸性 側 に 移 行した 2 つ の ス ポットが 確 認 され た( 園 2 ) ア クテ ィ ベ ショ ン ル プ後半
の 3 つ の セリン およ ぴス レオ ニ ン をア ス パ ラギ ン に 置 換 した A N S 2 で は 基底状態 より酸性側 に
移行 した 3 つ の ス ポ ットが ア クテ ィ ベ シ ョ ン ル プ 中 の 7 つ 全 て の セ リン お よび ス レ オ ニ ン を
ア ス パ ラギン に 置 換し た A N S 3 で は 酸性側 に 移 行 した 1 つ の ス ポッ トが 出現 した( 園 2 ) A N S 3
でも p l シ フトが み られ た ことより S A P K 2 はア クテ ィ ベ ショ ン ル プ外 の 領 域 に 少なくとも 1
ケ 所リン 酸化 部位 が 存在すると考 えられる また A N S l および A N S 2 変 異 で の ス ポッ トの 減
少 から S A P K 2 の ア クテ ィ ベ シ ョ ン ル プ前半 に は 少 なくとも 2 ケ 所 ア クテ ィ ベ シ ョン ル
プ 後半に は 少 なくとも 1 ケ 所リン 酸 化 部位 が 存在す ると思 わ れ た A N S l ある い は A N S 2 に さ
らに 1 ア ミノ酸 の 変 異 を加 えたコ ン ストラクトを用 い て 細 かく調 べ て み ると コ ン ス トラクト 1 4 7
1 4 9 1 5 0 およぴ 1 5 4 を 用 い た 場 合 に お い て 1 4 7 およぴ 1 4 9 で は 基底状態より酸性側 に 移 行
した ス ポ ッ トが共 に 3 つ で あ っ た の に 対 し 1 5 0 およ ぴ 1 5 4 で は 酸性側 に 移 行 した ス ポ ットが 2
つ で あ っ た( 園 2 )
こ こ で A N S 2 で 酸性側 に 移 行 した ス ポッ トの 数 は 2 つ に もみ えたが 1 4 7
およぴ 1 4 9 で は 共 に 酸性側 移 行 ス ポットが 3 つ で あ っ た こ とから A N S 2 で み られ た酸性側移
行 ス ポッ トも 3 つ で あると考 えた また コ ン ス トラクト1 5 8 1 5 9 およ ぴ 1 6 2 を 用 い た場 合 1 5 9
お よび 1 6 2 で は 酸性 側 に 移 行 した ス ポッ トが 2 つ で あ っ た の に 対 し 1 5 8 で は 酸性側 に 移行 し
た ス ポッ トが 1 つ で あ っ た( 園 2 ) こ れらの 結 果 およぴア クテ ィ ベ シ ョ ン ル プ 外 の 領 域 に 1
ケ 所リン 酸 化 部位 が 存 在する ことか ら S A P K 2 は 高浸透 圧 ス トレ ス に 応 答 して 少なくともア クテ
ィベ
シ ョン ル プ内 S e r1 5 0 S e r 1 5 4 S e r1 5 8 がリン 酸 化されると考 えられ た
研 究 の 途中 で P h o s T a g と い うリン 酸基 に 親和性をも つ 化 合物をポリア クリ ル アミドに 結 合
させ たゲ ル を用 い て S D S P A G E を行うことに よりタン ′( ク 質の リン 酸 化を 明 瞭な移 動 度 シ フト
とし て 検 出 で きる 技 術 が あるこ とが わ か っ た そ こ で こ の 手 法を 用 い て 上 記 の S A P K 2 変異
体 の 幾 つ か に つ い て 高浸透 圧 ス トレ ス に 応 答 したリン 酸 化状 態の 変 化を 調 べ た
S A P K 2 ( W T) およ び変異 体 A N S l A N S 2 およぴ A N S 3 を P h o s T a g S D S P A G E に 供 した
こ
と ろ Ⅵ什 で は コ ン トロ ル 処 理 し た場合 に 基底状態と思 われ る バ ン ドが 1 つ 高 浸 透 圧 ス ト
レ ス 処 理 した 場合 に 高度 にリン 酸 化されたと思 わ れ る バ ン ドが 1 つ 出 現 した( 園 3 ) また A N S l
で は 高 浸 透 圧 ス トレ ス 処理 した 場合 に 3 つ の バ ン ド A N S 2 で は 5 つ の バ ン ド A N S 3 で は 2
つ の 明 確 な バ ン ドが 確 認され た( 図 3 ) 各 レ
ン の 1 番 下 に 現 れ た バ ン ドを基底状態とす ると
ベ
まず A N S 3 の 結果 から S A P K 2 アクテ ィ
シ ョン ル プ外 の 領 域 に は 少なくとも1 ケ 所リン 酸
化 部位 が 存在す ると考 えられ た こ の ことから S A P K 2 ア クテ ィ ベ ショ ン ル プ 領域 前 半 に
は 少 なくとも3 ケ 所 後半 に は 少 なくとも1 ケ 所 つ まりア クテ ィ ベ ショ ン ル プ全 体 で は 少 なく
とも 4 ケ 所 が 高浸透 圧 ス トレ ス に 応 答してリン 酸 化され ると思 わ れ た
こ の 結 果と上 述 した 二 次 元 電 気 泳動の 結 果を比 較 す ると S A P K 2 ア クテ ィ ベ
ショ ン ル プ
ベ
後 半 およ ぴア クテ ィ
ション ル プ 外 の 領域 に 存 在する と推 測 され たリン 酸 化 部位 の 数 は
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75
致 し た ア クテ ィ ベ
プ 前 半 に お い て 推 測 され るリン 酸 化 部 位 の 数 が p h o s T a g
ニ 次 元 電 気 泳 動で 調 べ た 場合よりも 1 つ 多くな っ たが S e r1 5 0
P K 2 リン 酸化 部位 で あると い う結 果 に 対し て は 問題な い と思 われ
シ ョン ル
ー
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S D S P A G E で調 べ た場合
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S
5 4 およ ぴ S
e r1
e r1
､
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58 がS A
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た とこ ろが P h o s T a g S D S P A G E はタン / i ク質 の リン 酸 化 の 程度 に 準 じた 移 動 度 シフ トを
生じさせ る ことを考慮すると A N S 2 で 現れ た下 か ら 2 番 目 の バ ン ドが 示 す S A P K 2 リン 酸 化状
態と下 か ら 3 番 目 の バ ン ドが 示 す S A P K 2 リン 酸化 状態 の 間 に は 1 つ ある い は 2 つ の 別 の
S A P K 2 リン 酸 化 状態 が 存在する可 能性 が 残され た が 他 の コ ン ス トラクトを用 い て 確 認する に
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は至らなか っ た
2
抗S
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AP K
上記の
ィべ
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リン 酸化 S
結果か ら S
､
シ ョン ル
作製
活 性 化 に 関わる 上 流 プ ロ テ イン キナ ゼ は S e r 1 5 8 を含 むア クテ
か の セ リン ス レ オ ニ ン を効 率よくリン 酸 化す る プ ロ テ イン キナ
A P K の
プ中 の 幾
ー
ペ プチ ド抗体の
e r1 5 8
つ
ー
ー
･
ゼ で ある こ とが 期待され る こ れらセ リン の リン 酸 化 を特異 的 に 認 識す る抗体 が 得 られ れ ば こ
の 様 な 活 性を 持 つ プ ロ テ イン キ ナ ゼ の 検出 同 定を試 み るため の 有 力 な ツ ル に なる また
j n v i v o で の S A P K の リン 酸 化 状 態 活 性 化 状態をモ ニ タ す るこ ともで きる そ こ で こ の リン
酸 化 S e r1 5 8 と周 辺配 列 を含 む 9 ア ミノ酸 の ペ プチ ドに カッ プリン グ用 の シ ス テ イ ン を加 えた
Q P K ( p S ) T V G T P C を合 成 し ウサ ギ に 免疫 した( M B L 社 に 外 注) こ の ペ プチ ド配 列 の 選 択に
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当た っ て は 抗 原 性と S A P K フ ァ ミリ の 複数 の メン バ を 認 識 で きる こ との 2 点を考慮 に 入 れ
た 得 られ た血 清 か ら リン 酸 化 ペ プチ ドを用 い たア フ ィ ニ テ ィ 精製 と対 応 す る非 リン 酸 化 ペ
プ チ ドに よる吸 収 に より抗 S A P K リン 酸 化 S e r1 5 8 ペ プチ ド抗体( 抗 S A P K リン 酸化 抗体) を得
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ー
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た
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大 腸菌で 発現 させ 精製 したチ オ レ ドキシン( T r x) 融合 S A P K 2 ( T n く S A P K 2 V V T ) そ の 活
性 部 位 の リジ ン を ア ラ ニ ン に 置 換 す る こ と に より酵 素 活 性をもた なくな っ た 改 変 S A P K 2
( T rx S A P K 2 ru A ) さら に ア クテ ィ ベ シ ョ ン ル プ中 の 全 て の セリン およ ぴス レ オ ニ ン をア ス
パ ラギ ン に 置 換 し た 改変 S A P K 2 ( T r x S A P K 2 KJ A 7 S / N ) それ ぞれ 1 0 か ら 1 0 0 0 n g を
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-
希釈 の 抗 S A P K リン 酸 化 抗体 およ ぴ1/2 0 0 0 希釈 の ペ ル オ
キ シ ダ ゼ( H o s e r a di s hi P e r o x id a s e ) 標識し た 二 次抗体( 抗 ウサ ギ Ig G ) を用 い て イム ノブ ロ
ッ ト解析を行 っ た そ の 結 果 1 0 0 n g 以 上 の T rx S A P K 2 W T に つ い て の み 抗 S A P K 2 リン 酸
化 抗体 に よる シ グナ ル が 検 出された( 図 4 ) T r y S A P K 2 V V T は大 腸 菌内 で す で に 自 己リン 酸
化 を受 け て い る の に 対し て T rx S A P K 2 K/A はリン 酸 化され て い な い ことが 明ら か に され て い
る( 青 田 2 0 0 7 名 古 屋 大 学 大 学院 生 命農学 研 究 科 修 士 論 文) し た が っ て こ の 抗体 は
S e r1 5 8 の リン 酸 化 を特 異 的 に 認 識 で きる抗体で あると考えられ た ただ し 1 /2 0 希 釈という高
い 濃度を 用 い て も1 0 0 n g 以 上 の T r x S A P K 2 W T しか 検 出 で きな か っ た ことから こ の 抗体を
用 い て i n vi v o で の S A P K の リン 酸 化 状態 や 活 性 化 状態を モ ニ タ す る に は 力価 は 不 十分 で
あると予 想され た ただ し T r x S A P K 2 VV T の どの 程度の 割合の 分 子 の S e r1 5 8 がリン 酸 化さ
れ て い るか は 不 明 で ある こ とか ら 実際 の 検 出 感度 はも っ と高 い 可 能性もあ る
S D S P A G E に よ っ て 分 画 し 1 /2 0
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I
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3
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イネ 培 養 細胞 抽 出 液 に よる S A P K 2 リン 酸 化活 性
酸 化 活 性 をも つ プ ロ テ イン キナ ゼを探索 する目 的 で 高 浸 透 圧 ス トレ ス 処 理
あ る い は コ ン トロ
ル 処 理 を し たイ ネ 培養細 胞 抽 出 液を 用 い て S A P K 2 リ ン 酸 化 活 性を
S A P K リン
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76
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ある い は S A P K 2 K / A 7 S / N ( 園 5 A ) を 基 質としたゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イに よ っ
べ
て 調 た 高浸透 圧 ス トレ ス シ グナ ル が S A P K に 伝 達される 経路 に お い て C a 2 + が 働 い て い る
こ とが 当 研 究 室 で 明 らか にされ て い る そ こ で ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イは C a 2 + 存在 下 およ び
非 存 在 下 の 両 方 で 行 っ た そ の 結果 5 5 k D 付 近 に C a 2 + 存在 下 の み に お い て 検 出され る
S A P K 2 リン 酸 化 活 性 / くンドが 確認 された( 園 5 B ) また こ の 活 性′くン ドの 移 動 度 は S A P K 2
K /A を基 質とした 場 合 の ほうが S A P K 2 K / A 7 S 爪 を基質 に した 場合 よりも遅 か っ た( 図 5 B )
こ れ に は 基 質 の 違 い に より異 なるプ ロ テイ ン キナ
ゼを検 出 して い る可 能性 と ア クテ ィ ベ
ニ
シ ョ ン ル プ 中 の セ リン ス レ オ ン との 親和性 の 違 い に より移 動 度 が 変 化 して い る可 能性 の 2
つ が 考 えられ た 前者 で あるとすれ ば S A P K 2 K 仏 で み られ たリン 酸化 活 性 は ア クテ ィ ベ
シ
ョン ル
プ内 の リン 酸化 で あり高浸透 圧 ス トレ ス シ グナ ル を S A P K 2 に 伝達 する 上 流 プロ テ イ ン
キ ナ ゼ に よるもの かもしれな い また 後者 で ある 場合 に お い ても ア クティ ベ シ ョン ル プ
中 の ア ミノ 酸配 列 の 違 い に 起 因する ことか ら S A P K の リン 酸 化 に 関 わ るプ ロ テ イン キナ ゼ
で ある ことを否 定す るもの で はな い
また 特 異 性 の 低 い プ ロ テ イ ン キナ ゼ 阻 害剤 で ある ス タウ ロ ス ポリン は S n R K 2 プ ロ テ イ ン
キ ナ ゼ の 活 性を強く阻 害するが 高 浸 透 圧 ス トレ ス お よ ぴ A B A 処 理 に よる i n vi v o で の
S n R K 2 メン バ
の 活 性 化 は ス タウ ロ ス ポリ ン に よる 阻 害 を 受 けな い こ とが 報 告され て い る
( B o u d s o c q e t al 2 0 0 7 ) また 当研 究室 に お い て も ス タウ ロ ス ポリン は 高 い 濃度 に お い て
の み S A P K 2 の 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よる活 性 化 を阻 害 す る こ とが 示 され て い る し たが っ て
S A P K の 上 流 プ ロ テ イン キナ ゼ は ス タウ ロ ス ポリン に 対 す る感 受 性 が 低 い ことが 期待され
る そ こ で 上 記 の ゲ ル 内リン 酸 化 反応を種 々 の 濃度 の ス タウ ロ ス ポリ ン 存 在 下 で 行 っ て み た
ス タウ ロ ス ポリン 0 1 口 M 存 在 下 で は 7 5 k D 付近 の プ ロ テ イン キナ
ゼ 活 性 を強く阻 害 した の
に 対 し 上 述 の 5 5 k D 付近 の C a 2 + 依存性 活 性 は 阻 害 しな か っ た( 園 5 C ) さらに 高 い 1 □ M
で は こ の 活 性 は 完 全 に 阻 害された
方 こ れ より低 い 分 子量 の プ ロ テ イン キナ ゼ活 性 は こ
い
の 濃度 に お て も阻 害されな か っ た( 図 5 C ) し たが っ て S A P K をリン 酸 化 する 5 5 k D 付 近
の C a 2 + 依 存 性プ ロ テイン キナ ゼ はス タウ ロ ス ポリン に よ っ て 阻 害され るもの の そ の 感 受 性
は 高くな い もの と思 われ た しか し こ の C a 2 + 依 存 性 プ ロ テ イン キナ ゼ が S A P K の 上 流キナ
ゼ で ある か 否 か に つ い て は さらに 詳細 な 検 討 が 必 要 で ある
S A P K2
K /A
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1
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一
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4
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3 量 体 G タ ン パ ク 質の S A P K I O 活 性 化 に 与 える影響
種 々 の 阻 害 剤を用 い た 研 究 に より 高 浸透 圧 ス トレ ス に 応 答 し た S A P K の 活 性 化 に は
C a 2 + シ グナ ル が 関 与 する こ とが こ れま で に 示 され て い る 本 研 究 で は 文 献情 報をもとに さ
らに 別 の 上 流 因子 に 関す る探索を試 み た S A P K メ ン バ の うち S A P K 8 から1 0 は 高 浸 透 圧
ス トレ ス の み ならず A B A に よる活 性 化も受 ける そ こ で A B A シ グナ ル に よ る活 性 化も含 め
S A P K I O の 活 性 化 に 影響を及 ぼす 因子を探索する こ とに し た
気 孔 の A B A 応 答 に は 3 主 体 G タン / i ク質 の 関 与 が 示され て おり さら に こ の 応 答 に は A B A
活 性 化 型 の S n R K 2 プロ テ イ ン キナ ゼ が 働 い て い る そ こ で 動 物 で 3 主体 G タン パ ク質 の
活 性 化 割 として 働くこ とが知られ て い る マ ス トパ ラン や 3 主 体 G タン パ ク賞 α サブ ユ ニ ットおよ
ぴそ の 構成 的 活 性 型 の 共 発現 に よる S A P K I O 活 性 化 に 対 する 影響を 調 べ た
d H A H i s タグを 付 加 した S A P K I O を 過 的 に 発 現させ たプ ロ トプラス トに 対し 終濃度 0 か
ら 2 5 〟 M の マ ス トパ ラン 存 在 下 で コ ン トロ
ル 処 理 ある い は 高 浸 透 圧 ス トレ ス 処 理( 4 0 0
m M N a C t) あ る い は A B A 処 理( 5 0
〟 M ) を 1 5 分 間 処 理 した 後 M B P を基 質 としたゲ ル 内リ
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一
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77
酸 化 ア ツ セ イ に より発 現 した S A P K I O 活 性 を 検 出 し た 高 浸 透 圧 ス ト レ ス 処 理 に よる
活 性 化 は マ ス トパ ラン に よ っ て 影響され なか っ たが A B A に よる S A P K I O の 活 性
化 は マ ス トパ ラン 濃度 に 依 存 して 少 な い なが ら低 下 した( 囲 6 A ) こ の こ とは 3 量 体 G タン
パ ク 貢が A B A に よる S A P K I O の 活 性 化を負 に 制御し て い る可 能性を 示 唆 する
また 3 主 体 G タン パ ク質 α サ ブ ユ ニ ッ ト( G cr ) またはそ の 構 成 的 活 性 型 変異 体( G α ) を共
発 現させ たとき S A P K I O の 活 性 化 に 影 響する か 否 かを調 べ た そ の 結果 G α およぴ G α
は 高 浸 透 圧 ス トレ ス 処 理を施 したときの S A P K I O の 活 性を促 進 する ように み えた( 園 6 B )
そ こ で それ ぞれ の 発 現 プラス ミドの 組 み 合わ せ に よる遺伝 子 導入( エ レクトロ ボレ ショ ン) を
3 反 復行 い イ ム ノブ ロ ッ トで 検 出 した S A P K I O シ グナ ル で 標 準 化 S A P K 活 性を定量 化 した
そ の 結 果 G α および G α は S A P K I O の 活 性 化 を促 進 す る傾 向を 示 したが そ の 効 果 は あ
っ て もわず か で あると思 わ れ た( 国 6 C )
動 物で は ス フ ィ ン ゴシ ン は 細胞 内 メッ セン ジャ として また ス フ ィン ゴシ ン 受容体フ ァ ミリ
の G タン パ ク 質 共役 型 受 容体 に 対 す る細胞 外リガ ン ドとして 機 能し 細 胞 分 裂 か らア ポト シ
ス に 至る多 様 な生 命現 象 を調 節し て い る 植物 で は ス フ ィン ゴ シン が A B A に よる孔 辺 細 胞 膨
圧 の 調 節 に 関 与 す る 3 量 体 G タン パ ク 質の 上 流 因 子 で ある ことが 報告され て い る( C o u ｢ s o l e t
a l 2 0 0 3)
そ こ で ス フ ィン ゴ シ ン 1 リン 酸 の S A P K I O 活 性 化 に 対する 影響 を調 べ た が 濃度
1 か ら 2 5 〟 M の 範 囲 で は 顕 著な効 果 は観察され な か っ た( デ タは 示 さず)
ン
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S A P K IO の
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5
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フ ォス フ ァ チ ジ ン 酸 の S A P K
活 性 化 に 対する効 果
ホ ス ホリ パ
ゼ D ( P L D ) や こ の 酵 素 反 応 産物 で あ るフ ォ ス フ ァ チ ジン 酸( P A ) が
A B A シ グナ ル 伝 達 や 高 浸透 圧 ス トレ ス 応 答 シグナ ル 伝 達 に お い て 重 要 な 働 きをし て い る こ と
が 報告され て い る( M u s tilJi e t aI 2 0 0 2 ) また 細 胞 外 からミセ ル 状 で 与 え た P A もシ グナ ル 分
子 として 機能 する こ とが 幾 つ か の 研 究 で 報告され て い る( K o m i s e t a I 2 0 0 6 ; Z h a n g e t a l
2 0 0 3) そ こ で S A P K 2 ある い は S A P K I O を
過 的 に 発 現さ せ た プ ロ トプラ ス トに P A を添 加 し
こ れ まで
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一
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を活 性 化 するか 否 か ある い は 高浸 透圧 ス トレ ス や A B A に よる活 性 化 に 対 して 影響 が
ある か 否 か を調 べ た しか し 5 0 から 1 0 0 0 〟 M の 範囲 で P A が S A P K 2 を活 性 化す る こと
は な か っ た( 図 7 A )
方 P h o s T a g ゲ ル に よるイ ム ノブ ロ ッ ト解析 に よ っ て 発現 した S A P K 2
を検 出す ると 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よるリン 酸 化 活 性 化 に 伴 っ て 移 動 度 シ フトし た バ ン ドよりさ
らに 泳 動 度 が 遅 い バ ン ドが 観 察され た( 図 7 A ) S A P K I O に つ い て も同 様 な 結果 が 得 られた
( 園 7 B ) こ の ような結 果 か ら S A P K 2 およぴ S A P K I O は P A 処 理 に よ っ て 活 性化とは 無 関
係 に 高 い レ ベ ル の リン 酸 化 を受 ける ように 思 えた
次 に 細胞 に 与 えた P A が 高 浸 透 圧 ス トレス や A B A に よる S A P K の 活 性 化 に 影響する か 否
か を調 べ た d H A Hi s タグを付 加 した S A P K I O を 5 0 0 JL M P A 存在 下 ある い は 非存在 下 に お
い て 4 0 0 m M N a Cl ある い は 5 0 〃 M A B A で 処理 し タイ ム コ
ス をとっ て S A P K I O 活 性を 測
定するとともに P h o s T a g S D S P A G E に よりリン 酸 化 状 態 を調 べ た そ の 結 果 処 理 5 分 から
6 0 分 の 間 に お い て P A は 高 浸 透 圧 ス トレ ス およぴ A B A 処 理 に よる S A P K I O の 活 性 化 に 対
して 影響を及 ぼさな い ことが わか っ た( 図 8)
方 P h o s T a g S D S P A G E 後 の イ ム ノブ ロ ット
解析 で は 処 理 時 間 に か か わ らず P A 処 理 に よる大きな 移 動 度 シフトが 観察され た( 図 8 )
SAPK
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一
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一
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0
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6
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S A P K の P A 結合 活 性
78
5 分 と い う短 い P A 処 理 で 定常 レ ベ ル の 大きな移 動 度 シ フ トが 起 きた こ とから こ の 移 動 度 シ
､
フトが 本
昇 を現 して い る の か 否 か に
を 添 加 直後 に プロトプラ ス ト培養液
たとこ ろ 同様 の 移 動 度 シフトが 観 察され
当 に R A シ グナ ル を 受け て の S A P K の リン 酸 化 レ ベ ル の 上
つ い て 疑 念をも っ
た
そこで
｡
処理 時 間 0
,
分
す な わち P A
､
､
を液体 窒素 で 凍ら せ P h o s T a g S D S P A G E を行 っ
た( 園 9 ) また プロ トプラス トを未 処理 の まま液体窒素 で 凍結 し ソ ニ ケ ショ ン に よる細胞破
砕後 P A を添 加 し P h o s T a g S D S P A G E を行 っ た 場 合 に お い て も同 様 に 移動度 シ フトが 観察
され た したが っ て こ の P h o s T a g 上 で の S A P K の 大 きな 移 動 度シフ トは P A に よ っ て 誘起 さ
れ たリン 酸 化 に よるもの で はな い と考えた P A がリン 酸 基をもつ こ と およ ぴこ の プロトプラ ス ト
を用 い た実験 系 で は 細胞を培 地 ごと抽 出 して おり 抽 出 液中 にも P A が 高 い 濃度で 含 まれ て い
る こ とから考え て こ の 大きな移 動 度シフトは リン 酸 化 で はなく S A P K 分 子 に R A が 強 固 に 結
合し そ の P A に 含まれるリン 酸 基 が P h o s T a g に 強 い 親 和 性を 示 した 結 果 に よるもの で あろう
と考 えた 蛍 光ある い は R l 模轍 P A を用 い た 実 験 で の 確 罷 が 必 要 で はあ るが シ ロ イヌ ナ ズ ナ
中 の P A 結合タン パ ク質を P A ア ガ ロ ス を 用 い て 網 羅 的 に 解析し た 研 究 に お い て S n R K 2 プ
ロ テ イン キナ
ゼ の つ が P A 結合タン パ ク質として 報告され て い た( T e s t e n k e t a l 2 0 0 4) こと
か ら考 えて も こ の 結輸 は間 違 い な い もの と思 わ れ る
上 記 の ような S A P K の P A 結 合 能 が生 物学 的 に 意味 の あるもの か 否か を検 討 するため に
他 の リン 脂質 で も同 様 な移動度 シフトが 起 きる か 否 かを確 か め た す な わち S A P K 2 ある い
は S A P K I O を 発現 するプ ロ トプラス トの 抽 出 液 に P A の ほ か リゾフ ォ ス フ ァ チ ジ ン 酸 ( L P A)
フ ォ ス フ ァ チ ジ ル コ リン( P C ) ある い は フ ォ ス フ ァ チ ジ ル エ タノ
ル ア ミン ( P E ) を 添 加 し
P h o s T a g S D S P A G E を行 っ た そ の 結果 P A 添 加 時の み に 明 瞭 な大きな 移動 度 シ フトが 観
察され た( 囲 1 0 B ) また こ の 実験 で S A P K I O の 方 が S A P K 2 より P A 結 合 能 が 高 い ように
み えた P C およぴ p E に 含 まれるリン 酸基 は グリセ ロ
ル 骨 格との エ ス テ ル 結 合 に 加 え て コ リ
ン ある い は エ タノ
ル アミン 残基とも結合して い る点 で P A とは異 なり P h o s T a g と の 相互 作用
が な い か 弱 い ため に 移 動 度 シ フ トが 敢察され な か っ た 可 能性 も否 定 で きな い しか し L P A の
つ 少 な い だ けで あ る こ の こ とから
リン 酸基 は P A と同 等 の 状態 に あり 構造 上 もア シ ル 基 が
考 え て P A の S A P K に 対する結合 は 特異 性 の 高 い もの で あ ると思 わ れ た
P A 添加 に よる 移動度 シフトが S A P K に 特 異 的なもの で は なく サ ン プ ル に 残存 す る P A に
よりタン パ ク質 の 種類 に 限らず p h o s T a g S D S P A G E 上 で 移動度 シ フ トを引 き起 こ す と い う
可 能性 に つ い て も検 討 した 当 研 究 室で こ れ まで 使 用 して きた d n a J 様タン / くク質 s e c 1 4 様タ
ン パ ク 質 H S P 9 0 およぴ α t u b uli n の d H A H i s タグ 付 きタ ン パ ク賞 発 現プラ ス ミドを用 い て 同
様 に P A に よる P h o s T a g S D S P A G E 上 で の 移 動 シ フトを調 べ た こ れ 以 降 の 実験 で は リン
脂質を添 加 直後 に プ ロ トプラス ト培養液を液体窒素 で 凍結 し タン パ ク茸を抽 出 した そ の 結果
d n a J 様タン / くク貰 およぴ s e c 1 4 様タン パ ク賞 に 関 して は P A 添 加 に よる明 瞭な移 動 度 シ フト
は 見られ なか っ た( 園 1 1 )
方 H S P 9 0 およぴ α t u b uli n は P A 添加 に より非常 に 明 確な 移
動度 シフトを 示 し た( 園 11 ) 偶 然 の 致で は ある が H S P 9 0 およ ぴ α t u b uli n は 先 に 述 べ た
P A 結合タン / i ク 質 の 網羅 的 解析 の なか で P A 結合性 が 示され て い た( T e st e rik e t al 2 0 0 4)
したが っ て こ れ らの 結 果 は P h o s T a g S D S P A G E に お ける 移動度シ フトで み た P A 結 合 性
は タ ン / くク質 に 関して 特異 性 が あることを 示 して い る
さら に 結合 の 特異 性 お よぴ S A P K 中 の P A 結合部位 に 関 する情報を得 るため に S A P K I O
の C 末 端 欠 失タ ン パ ク 質 の 発 現 プラ ス ミドを 用 い て P A 結 合 能を 比 較 し た そ の 結 果
S A P K I O の C 末端側 ア ミノ 酸配 列 のうち 酸性 ア ミノ 酸 に 富 む 特徴 的な領域 の 欠 失 に より P A
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o
I
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一
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一
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79
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結 合 能 が 上 昇す る ことが わ か っ た( 園 1 2 B ) こ れ は こ の 領 域 が S A P K と P A の 結 合 に 対 し
て 阻 害 的 に 働 い て い るも の と考 えられ た また S A P K l に つ い て も 同 様 の 傾 向 が 観 察され た
( デ タは 示 さず)
以 上 の 結 果 は P A が 浸 透 圧 ス トレ ス や A B A シグナリン グに お い て 情報 分 子 とし て 働 い て い
るとい う報告を考 え 合わ せ ると P A と S A P K の 結 合 は シ グナ ル 伝 達 に お い て 何 らか の 意味 が
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ある ことを期待さ せ る
7
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P A の 結合 が S A P K 2
活 性 に 与 える 影 響
S A PK とPA の
特 異 的 結 合 の 生 理的 意義 に つ い てさらに 検 討する ため に P A の S A P K 酵
素 活 性 に 対 する影響を調 べ た 大 腸菌 で 発 現さ せ 精製 した S A P K 2 を用 い M B P を 基 質とし
た試 験管 内リン 酸 化 反 応 に P A を 添加 した また 同 時 に 基 質を加 えな い 反 応 も行 い S A P K 2
の 自 己 リン 酸 化 反 応 に 対す る P A の 効 果も調 べ た その 結 果 P A 添加( 1 0 0 〃 M ) は M B P リ
ン 酸 化活 性 お よび 同 時 に 起 きる S A P K 2 自 己リン 酸 化活 性 に は大 きな影響を及 ぼさな い ことが
わ か っ た( 園 1 3 A )
方 基 質を加 えな い で 反応させ た場 合 の S A P K 2 自 己 リン 酸 化 活 性 は
P A 添 加 に より顕 著 に 促 進される こ とが わ か っ た( 囲 1 3 A ) そ こ で P A の 自 己 リン 酸 化 反 応 促
進 効 果 に つ い て さら に 検 討を 加 えた
S n R K 2 は C a 2 + 依 存 的なプ ロ テ イン キ ナ ゼ で はな い が C a 2 + に よ っ て そ の 活 性 が 若 干 促
進される ことが 報告され て い る また 高 浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル が S A P K に 伝 達され る経路
に お い て C a 2 + が 働 い て い るこ とも当研 究室 で 明らか に され て い る そこ で C a 2 + 存 在 下 および
非存在 下 の 両 方 に お い て P A の S A P K 2 自 己リン 酸 化 に 対 する影 響をタイ ム コ ス をと っ て 調
べ た そ の 結 果 反応 時間 1 5 分 で は 明 確 で なか っ たもの の 反 応 時 間 6 0 およ ぴ1 2 0 分 に お
い て S A P K 2 の 自 己 リン 酸 化 活 性 が C a 2 + の 有 無 に かか わ らず P A に よ っ て 促 進され る こと
が 確 認 で きた( 園 1 3 B )
次 に こ の S A P K 2 自 己 リン 酸 化 促 進 作 用 が P A 特異 的なもの で ある の か を 調 べ るた め に
L P A P C およぴ p E の 効 果 を調 べ たとこ ろ 何れ の リン 脂 質も自 己 リン 酸 化 を促 進す るこ とが
わ か っ た( 園 1 4 ) したが っ て P A の 自 己リン 酸 化 促 進 作用 は そ の S A P K へ の 特 異 的 結 合 と
は 関 連しな い 可 能性 が 高 い と思 わ れ た
S A P K の 自 己 リン 酸 化とそ の P A に よる 促進 作用 は S A P K の 活 性制御 に お い て 何らか の
意義 が ある の だろうか ? そ の 可 能性を探る目 的 で こ の 自 己リン 酸 化 に よ っ て ア クテ ィ べ シ ョ
ンル
プ中 の セリン およぴ ス レオ ニ ン がリン 酸 化され るかどうかを調 べ た S A P K 2 の 分子 間 自
己リン 酸 化 は 野 生 型 組 換 え S A P K 2 ( S A P K 2 W T ) を酵素とし 活 性部位 の リジ ン をア ラ ニ ン
に 置 換しか つ N 末端 に T R X タ グを 付 した 酵素 活 性を持 たな い 改変 S A P K 2 ( T r x S A P K 2 K JA )
を基質 に 用 い て 活 性を測 定 し ア クテ ィ べ ショ ン ル プ中 の セ リン およ びス レ オ ニ ン を全 て ア
ス パ ラ ギン に 置 換 し た T Ⅸ S A P K 2 K 仏 7 S / N を基 質に 用 い た 場 合と比 較 し た そ の 結 果
T r y S A P K 2 K /A 7 S / N を基 質 に 用 い た場合 T r x S A P K 2 K /A に 比 べ て そ の リン 酸化 レ ベ ル は
低 下 し た( 図 1 5 ) こ の こ と は 分 子 間 自 己リン 酸 化 の 部 は ア クテ ィ ベ ショ ン ル プ 中 に
起 こ っ て い る こ とを示 し て い る また S A P K 2 に よる T n く S A P K 2 K/A の リン 酸 化 も P A に より
促進される こ とが わ か っ た( 図 1 5 ) こ の こ とは P A の 活 性促進 作用 が( 分 子 間) 自 己 リン 酸 化
に 特有の 現 象 で ある こ とを 示 す もの で ある
さらに こ の ア クテ ィ ベ シ ョン ル プ中 に 起 こる S A P K 2 の 分 子 間 自 己 リン 酸 化 が こ の 研
究で 明ら か に した活 性 制 御 に 重 要 で あるリン 酸 化 部 位 S e r1 5 8 に 起 こ っ て い るかどうかを 上 述
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一
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80
リン 酸 化 抗体を用 い て 調 べ た こ の 抗体 の 力価 が 高くな い ことを考慮 して 酵素
S A P K 2 VV T と基質 T r x S A P K 2 K/A ある い は T r x S A P K 2 KJ A 7 S / N の 濃度を標 準 より 5 倍高
の
抗 S
A P K
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い 濃度 に し
非模織 A T P を用 い た 試験管 内リン 酸 化 反 応を行 っ た 反応 産物を抗 S A P K リン
酸 化 抗体を用 い たイム ノブ ロ ッ ト解 析 で 調 べ たとこ ろ T Ⅸ S A P K 2 K 仏 ある い は T Ⅸ S A P K 2
K 仏 7 S / N は 抗体と反 応 しな い ことが わか っ た( 園 1 6 ) した が っ て S A P K 2 の 自 己 リン 酸化 で
は S e r 1 5 8 はリン 酸 化され な い かある い はされ ても極低 レ ベ ル で あるもの と考 えられ た
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第 四 章 考察
1
高 浸 透 圧 ス トレ ス シグナ ル に おける S A P K 2 の リン 酸 化 部位
.
が 高浸 透 圧 ス トレ ス に 応 答して リン 酸 化され るア ミノ酸 残 基を 同 定する こ と
プロ テ イン キナ ゼ の 活 性 化 メカ ニ ズ ム の 理 解 だ けで はなく S n R r Q プ ロ テ イン キ
ナ ゼ に シ グナ ル を 伝 える 上 流プ ロ テ イン キナ ゼを 明 らか に し そ の シ グナ ル 伝 達機 構を解
明 す るため の 有 力 な 情報 となる そこ で 本実験 で は イネゲノ ム に コ ドされ た 1 0 個 の S A P K
の うち 当研 究室 に お い て 大 腸菌 に よる大 量 発 現 系 が 構 築され て い るな ど 最 も機能解析 が
進 められ て い る S A P K 2 に 焦点をあ て て 実 鼓を行 っ た
二 次 元 電 気泳 動 を用 い た 解析 で は S A P K 2 は 高浸 透 圧 ス トレ ス 処 理( 4 0 0 m M N a C l) に よ
りア クテ ィ ベ ショ ン ル プ内 の S e r1 5 0 S e r1 5 4 S e r1 5 8 お よぴア クテ ィ ベ ショ ン ル プ 外
に 1 ケ 所 の 計 4 ケ 所 がリン 酸化されることが 推定され た( 園 2 ) こ の 解析 で 調 べ た全 て の ア ミノ
酸 置 換変 異 体 に お い て 二 次 元 電気 泳 動 上 で 示 す ス ポ ッ ト数 とそれ ぞれ が 示 す 予 想され るリ
ン 酸 化 部位 の 数 の 間 に 矛 盾 が 生じな か っ た こ とか ら 信 頼 性 の 高 い 結論 で あ るとい える また
研 究 過 程 に お い て B u r z a ら( 2 0 0 6 ) に より 培養細胞 か ら精製 したタ バ コ S n R K 2 プ ロ テ イ ン キ
S
n
は S
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R K2
メン バ
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R K2
n
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ゼ N t O S A K の ア クテ ィ ベ ション ル プ内 の S e r1 5 4 と S e r 1 5 8 ( S A P K 2 に お い ても 同 じ
残 基 に 相 当) が 高 浸 透 圧 ス トレ ス に 応 答して リン 酸 化され ると報告 され て おり 本 研 究 の 結 論
を支持 するも の で ある し か し ア クテ ィ べ シ ョ ン ル プ外 の リン 酸 化 は こ れ まで 指摘され て
おらず 新奇 の 発 見 で ある
方 P h o s T a g S D S P A G E を用 い た解析 か らは S A P K 2 は 少 な
くとも 5 ケ 所リン 酸 化され るとい う可 能性 が 示 され そ の うち 1 つ は S e r1 4 7 ある い は S e r 1 4 9
で あると思わ れ た( 園 3 ) しか し アクテ ィ べ
ショ ン ル プ後半 に 存 在 する 2 つ の セ リン ス レ
ナ
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一
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オ ニ ン を全 て 置 換 し ても 野 生 型と同じ高 い レ ベ ル の リン 酸 化 に 相 当 す る バ ン ドが 検 出され た
こ との 説 明 は つ い て い な い コ ン トロ
ル 処理 に お い ても 部 の 分 子 が リン 酸 化を 受 け て い る
こ とから S A P K 2 の 活 性 化 に 必 要な 複数 の リン 酸 化 部位 の うち 活 性を得 る に は至らな い がと
て もリン 酸 化 され や す い リン 酸 化 部位が 存在すると思 わ れ ま た S A P K 2 は段 階 的なリン 酸 化
を経 て 迅 速 に 活 性 化されると予 想される 各変 異 体 に つ い て ゲ ル 内リン 酸 化 ア ツ セ イ で それら
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の 活 性を 調 べ る こ とは して い な い が
プロ テイン キナ ゼ の ア クテ ィ ベ ショ ン
ニ
ル プ 中 の 幾 つ か の セ リン ス レ オ ン に つ い て ア ミノ 酸置 換 が 試され て おり 何 れ の 場合も活
性を失うこ とが 報 告され て い る し か し 全 て に つ い て 解析 が 行 わ れ て い るわ けで はな い ことか
ら さら に 徹底 した 解析 が 必要 で あろう また こ れ ま で 同領 域 の セ リン ス レオ ニ ン を酸性 ア
ミノ酸 に 置 換す るこ とに よりリン 酸 化を模倣 し 構 成 的 活 性 化 型 の 変異 体を得 る試 み が 複数 の
研 究室 で 行 わ れ て きたが 何 れ に お い て も成 功して おらず 全 て の 場 合 に お い て 活 性 が 失 わ
れ ると いう結 果 に な っ て い る こ の ような 点 に お い て 今 回 明 らか に な っ た ア クテ ィ ベ シ ョ ン ル
プ 外 の リン 酸 化 は 興味 深 い 今 後 こ の リン 酸 化 部 位 を 同 定す る こ とに より S A P K 2 を 含 む
､
こ れ まで S n R K 2
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81
ゼ の 活 性化 制 御 の 仕 組 み がより詳細 に 解 明される ことが 期待され
また 構成 的活 性 型 変異 体 の 作 製 に も つ な が るか もしれ な い
また S A P K 8 S A P K 9 およ ぴ S A P K I O は A B A と高浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ て 相 乗 的 に 活 性
化され るこ とが 示 され て い る( 山 本 2 0 0 4 三 重大 学 大 学院 生 物 資源 学 研 究科修 士 論 文) こ
の A B A に よる活 性 化 は迅 速 で A B A の 合 成蓄積を介するもの とは 考 えられな い S A P K メン
バ
に よ っ て A B A に よる活 性 化 を 受 けるもの と受 けな い もの が あるこ と およ び C 末端制御 ド
S
R K2
n
プ ロ テ イン キナ
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一
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部分 欠 失 に よ っ て A B A に よる活 性化 の み が 消 失する こ とは 高 浸 透 圧 ス トレ ス シグナ
シグナ ル が 独 立 に A B A 活 性 化 型 S n R K 2 プ ロ テ イン キ ナ ゼ に 伝 達され る ことを意
味する こ の こ とか ら A B A シ グナ ル に よるリン 酸 化 が 高浸 透 圧 ス トレ ス に よる それとは 異 なる
部位 で 起 こ る可 能性 も考 えられ る つ まり 同じ部 位 がリン 酸 化されるなら ば 高 浸 透 圧 ス トレ
ス に よりそれ 以 上 活 性 化されな い 状態 に A B A を同 時に 処理 して も 活 性 化 に 対する付 加 的な
効果 は 見 られな い は ず で ある こうした 意味 に お い て A B A シ グナ ル に よる S A P K の リン 酸 化
部位 に つ い ても調 べ る こと は とても興 味 深 い 最 近 B o u d s o c q ら( 2 0 0 7 ) は シ ロ イヌ ナ ズ ナ
の S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ の 活 性 化 に おけるリン 酸 化 の 程 度 が メン バ ごとに 違うこ と ま
た A B A に よる活 性 化 を受 けるメ ン バ で は 高浸 透 圧 ス トレ ス に よる活 性 化 と A B A に よる活
性 化 で はリン 酸 化 の レ ベ ル が 異 なる ことを 主 張 して い る また S A P K 2 と同じサ ブクラ ス Ⅱ に
属 し 高 浸 透 圧 ストレ ス の み に よ っ て 活 性 化 され る S A P K 3 で は S A P K 2 の S e r 1 5 0 に 相 当す
るア ミノ酸残基 は セ リン で は なくア ラ ニ ン で あるこ とから 少 なくとも同 定 したリン 酸 化 ア ミノ酸部
位 は S A P K メン バ 全 て に 共通 で はな い とい える これ は B o u d s o c q の 結 果 と 致 して い る
S A P K 2 の 高浸透 圧 ス トレ ス に よるリン 酸化 は 通 常 の S D S P A G E で も長 時間 の 泳 動 に より
移 動 度 シ フトとして 観 察 で きる しか し メン バ に よ っ て は活 性 化 に 伴う移 動度 シ フトを検 出 で
きな い もの もあり こ れもメン バ 間 で の リン 酸化 レ ベ ル の 違 い を反 映し て い るもの と思 わ れ る
S A P K 2 の S e r 1 5 4 お よぴ S e r1 5 8 に つ い て はイネ S n R K 2 メン バ
全 て に 保 存 され て い る こ と
を考 えると それ らの リン 酸 化 がイネ S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ の 活 性 化 メカ ニ ズ ム に 基 本 的
に 重 要 な働 きを し て い ると推定 される また P h o s T a g S D S P A G E を用 い た 解析 に お い て
S e r1 4 7 ある い は S e r1 4 9 がリン 酸化 部位 である可 能性 が 示 唆され たが こ れ らの ア ミノ酸残基
もメン バ 全 て に 保 存され て い る こ の ことを考 え ると メ ン バ 間 で 活 性 化 に 伴うリン 酸 化 の
レ ベ ル が 異 なる こ とは 対 応 す るリン 酸 化 部位 が ある か な い か の 違 い の み に よるもの で はな い
メイン の
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ル とA B A
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もの と思 われ る
2
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イネ S
n
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R K 2 メン バ
を活 性 化 す る 上 流 因子 の 探索
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依 存 的 に 活 性化される こ とが 知 られ て い るプ ロ テ イン キナ ゼ は
c a暮m o d uli n d e p e n d e n t p r o t ei n ki n a s e ( C a M K )
カ ル モ ジ ュ リ ン 様 ドメイ ン を 分 子 内 に も つ
C a 2 + d e p e n d e n t p ro t e i n ki n a s e ( C D P K ) お よぴ c al ci n e u ri n 様 カ ル シ ウ ム 結合タン パ ク 質
( C B L ) と結 合する C B L i n t e r a c ti n g p o n ei n ki n a s e ( C I P K ) で ある ただし C a M K は 幾 つ か
の 植物で は 報告 が あるもの の シ ロ イヌ ナ ズ ナ ゲノ ム に は コ ドされ て い な い C D P K フ ァ ミリ
の 幾 つ か の メン バ
や C I P K およ ぴ C B L フ ァ ミリ の 特定メン バ の 嵩 浸 透 圧 を含 む ス トレ ス
応 答 へ の 関 与 が 知られ て い る 特 に C D P K は C a 2 + に 加え て シ グナ ル 依 存 的なリン 酸 化 に
よる活 性 を 受 ける 場 合 や( R o m e is e t al 2 0 0 1 ) 自 己 リ ン 酸 化 に よ る活 性 化 受 け る 場 合
高等植物 に お い て C a 2
+
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(C h
e ng
e t al
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2 0 0 2)
が 知られ て い る
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82
当研 究 室 に お い ても高 浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル が S A P K に 伝達され る経 路 に
お い て C a 2 + が 働 い て い る ことが 明らか に され て い る そ こ で イネ 培 養 細胞 抽 出 液 中 に 存 在
する未 知 の 上 流プ ロ テ イン キナ ゼを探索する 目 的 で S A P K 2 リン 酸 化 活 性をゲ ル 内リン 酸
化 ア ツ セ イに より調 べ たとこ ろ 5 5 k D 付近 に 確 か に C a 2 + 依存 的 で あるリン 酸 化 活 性 が 検 出さ
れ た( 園 5 B ) また こ の 活 性/ くン ドの 移動度 は S A P K 2 K/A を基 質とし た 場 合と S A P K 2
こ れ まで に
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1
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を基質 に した 場合 で 異 な っ て い た もし こ の 違 い が S A P K 2 K JA およ ぴ S A P K 2
K/ A 7 S / N 両 基質 の ア クテ ィ ベ ショ ン ル プに お けるア ミノ酸 配 列 の 違 い を認 鞍 した 異 なるプ
ロ テ イ ン キナ
ゼ に よるリン 酸 化 の 結果 で あるとすると S A P K 2 K /A で み られ たリン 酸 化 活 性
ベ
は ア クティ
シ ョン ル プ内 のリン 酸 化 で あり S A P K 2 K 仏 をリン 酸 化 した プロ テイン キナ
ゼ が 高浸 透 圧 ス トレ ス シ グナ ル を S A P K 2 に 伝達する 上 流 プ ロ テ イン キナ ゼ で ある可 能 性も
含 まれる
方 こ れ らが 同じプロ テ イン キ ナ ゼ で あるとす るならば そ の ア クテ ィ ベ
ション
ル
プ中 の セリ ン ス レ オ ニ ン ヘ の 親和性 の 違 い に 起 因 して 移 動 度 の 違 い( 遅 れ) が 観察され
たもの と考 えられ こ の 蛾含も S A P K 2 の 活 性 化と何らか の 関 係 が ある可 能性 が あ る
方 B o u d s o c q ら(2 0 0 7 ) は i n vi v o で の 高浸透 圧 ス トレス およぴ A B A シグナ ル に よる
S n R K 2 メン バ
の 活 性 化 は ス タウ ロ ス ポリン に よ っ て 阻 害され な い ことを報告 した ス タウ ロ ス
ポリン が 上 述 の S A P K 2 リン 酸 化 活 性 に ど の ような 影響を及 ぼす の か に つ い て 同 様 に ゲ ル 内リ
ン 酸 化 ア ツ セ イ に よ っ て 調 べ たとこ ろ C a 2 + 依存 的な 5 5 k D 付 近 の プロ テ イン キ ナ
ゼ 活 性は
1 〟 M の スタウ ロ ス ポリン で 処理 した場 合 ほ とん ど 活 性 が 阻 害され たもの の 7 5 k D 付 近 の
プ ロ テ イン キ ナ ゼ 活 性 に 比 べ ス タウ ロ ス ポリン に よる阻 害感 受 性 は 低 か っ た( 園 5 C ) た
だ こ の C a 2 + 依 存 的活 性 より低 い 分 子量 の C a 2 + 非依 存 的プ ロ テ イン キ ナ ゼ 活 性 は 1 〟
M ス タウ ロ ス ポリン 処 理 に お い ても阻 害され なか っ た 今 回 の 実験 で B o u d s o c q ら( 2 0 0 7 ) が
報 告 したよう に ス タウ ロ ス ポリン の 活 性阻 害を受 けな い あ る い は 阻 害感 受 性 の 低 い プ ロ テ イ
ン キナ
ゼ 活 性 が 複数観察され たが S A P K の 上 流 プロ テ イン キナ ゼ で あるとい う明 確 な情
報 は 得 られ な か っ たため さらに 検証する必 要 が ある
気 孔 の A B A 応 答 に は 3 主 体 G タン パ ク 賞 P L D およぴ p A の 関与 が 示 され て おり( W a n g
2 0 0 2 ; W a n g et a I 2 0 αS) さら に こ の 応 答 に は A B A 活 性 化型 の S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ
が 働 い て い るこ とが 分 か っ て い る( M u s tilli e t a l 2 0 0 2 ; Y o s hid a e t al 2 0 0 2 ) また 3 量 体 G
タ ン パ ク 質 は 細 胞 膜 の 細胞 質 側 表 層 に 存 在 す る 受 容 体 G p r o t e i n { o u p l e d re c e p t o r
( G P C R ) で 受 け 取 られ た 情報 を 細 胞 内 に 伝 達 す る 役割を果 す こ と が 明 ら か とな っ て い る
( P i e r c e e t a L 2 0 0 2 ) 最 近 シ ロ イヌ ナ ズ ナ G P C R 様タン パ ク 質 が 細胞膜 に お ける A B A 受容
体 で ある こ とが 報告され た( Li u e t a I 2 0 0 7 ) ただ こ の 報告 に 対 する否 定 的な見 解 も発 表さ
れ て い る こ の ような 背景 に 基づ き 高浸 透 圧 ス トレ ス および A B A シ グナ ル に より活 性 化され
る S A P K I O を用 い て 動物 で は 3 主 体 G タン パ ク賞 の 活 性 化 剤として 働くマ ストパ ラン や P L D
の 活 性 化 剤 で ある ス フィン ゴシ ン に よる薬剤 処 理 あ る い は 3 主体 G タン パ ク賞 α サ ブ ユ ニ ッ
トおよ ぴそ の 構 成 的活 性 型 の 共発 現 に よる S A P K I O の 活 性 化 に 対す る影響を調 べ た そ の 結
果 ス フィ ン ゴ シン に よる S A P K I O 活 性化 へ の 影響 は 見られ な か っ た が S A P K I O を 過 的 に
発 現 さ せ た プ ロ トプラス ト培養液を A B A およ ぴ マ ス ト パ ラン で 処 理 したとこ ろ A B A に よる
S A P K I O の 活 性 化 が 阻 害され た( 園 6 A )
方 3 主 体 G タン パ ク質 α サブ ユ ニ ットまたはそ
の 構成 的 活 性 型 変 異 体を 共発 現させ たとき 高浸透 圧 ス トレス に 応 じて S A P K I O の 活 性 化 を
促進する傾 向を 示したが そ の 効果 は 顕著 で はなか っ た( 図 6 B C ) また プ ロ トプラス ト培
養液 に P A を処 理 した 何れ の 場合 に お い て も S A P K 2 およ ぴ S A P K I O 活 性 化 へ の 影響 は 観
K/ A 7 S / N
-
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-
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､
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､
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一
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一
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､
､
一
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､
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､
83
｡
､
察され な か っ た( 園 7 8 ) 残念 な ことに 今回 の 実 験 か らは S A P K の 活 性 化 に 関 与す ると 思わ
れ る 上 流 因子 の 決 定 的 な手 掛 かりを得る に は至らず また 植物 に お ける マ ス トパ ラン の 効 果
に は 疑 問も投 げか けられ て い るが 3 量 体 G タン パ ク質 は A B A に よる S A P K I O の 活 性 化を
負 に 制御すると い う可 能性を残 した 何 らか の 有効 な手 掛 か りとなる ことを期 待 した い
｡
,
,
,
､
､
｡
3
｡
フ ォ ス フ ァ チ ジ ン 酸 の 特定タン パ ク質
.
へ
の
特異 的 結合
上 述 の ように P A の 効果を 調 べ る過 程 で S A P K の リン 酸 化 状 態 を P h
､
に よる バ ン ドの 移 動 度 シ フトとして 観察 しようとし たとこ ろ P A
､
o s
-
T ag
S D S PA G E
-
処 理 に よるリン 酸 化 とも思 える移
し か し シ フトし た ( ン ドの 移 動 度 は 高浸透 圧 ス トレ ス およ ぴ A B A
動 度 の 遅 延 が 観察され た
処 理 したとき の 活 性 化 状 態を示 す それ よりも大きく そ の うえ S A P K の 活 性 化 に 伴うもの で は
な か っ た( 園 7 8 ) こ の 移動度シ フトは 始め リン 酸 化 に よるもの と考 えたが 詳 しく調 べ て み
ると こ の 現 象 が P A シ グナ ル を受け て の S A P K の リン 酸 化 に 起 因するもの で はなく P A が
S A P K 分子 に 強 固 に 結 合 し P A に 含まれるリン 酸 基 が P h o s T a g に 強 い 親 和 性を 示 した結 果
で あると考 えられ た ただ し 蛍 光ある い は R ] 標識 P A を用 い て P A の S A P K 結合 能を確 認 す
るまで に は至 っ て い な い また こ の 結 合 に よる バ ン ドシフトは P A と 同 様 の 状態 の リン 酸基を
も つ L P A を はじめ 種 々 の リン 脂 質処 理 に お い て 観察され な か っ た こ とか ら P A 特 異 的なもの
｡
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で ある こ とが 確 認され た( 園 1 0 )
さらに H S P 9 0 および α t u bli n に お い て は P A との 結 合 能
( 移 動 度 シ フト) を 示 した の に 対 し d n a J 様タン パ ク質 およ ぴ s e c 1 4 様タン パ ク質 で は P A との
結 合 能を 示 さな か っ た( 園 11 ) こ の 結 果 を 裏 付 けるも の と し て T e s t e rik ら( 2 0 0 4 ) が
P A S e p h a r o s e を用 い て 行 っ たシ ロ イヌ ナ ズ ナ中 の P A 結合タン パ ク 質 の 網羅 的 解析 が 挙 げら
れる T e s t e rik らはそ の 中 で P A 結合タン パ ク 質の 候補として S n R K 2 プ ロ テ イン キナ ゼ
H S P 9 0 およ ぴ α t u bli n が 含 まれ るこ とを 示 して い る 本実験 で P A 結 合 性を言式したタン パ ク質
-
｡
､
､
.
､
-
ー
｡
､
､
-
.
は 何 れも当 研 究 室 で S A P K の 標 的基 質 の 探 索する 上 で そ の 候補として 発 現 ベ クタ を構 築 し
たもの で 酵 母t w o h y b rid ス クリ ニ ン グで 選 抜され たもや 高 浸 透 圧 ス トレ ス に よ っ て 迅 速 に
リ ン 酸 化され ると考 えられ るタン パ ク 質 で ある H S P 9 0 およ び α t u b ti n の P A へ の 結 合 と
S A P K へ の P A の 結 合 は 単なる偶 然 の
致で は なく 何らか の 生 物学 的 意味 が 含まれ て い
ー
ー
-
,
.
-
｡
一
､
る の か もしれな い
4
.
｡
フ ォス ファ チ ジン 酸の S A P K
結合能と S A P K 2 自 己リン 酸化 促 進 作用 の 関 連
結合するとこ に よる生 物学 的 意 味を見 い だ す ため に 言式験管 内 で P A が
S A P K 活 性 に 影響を与 える か 否 か に つ い て 大 腸菌 で 発 現さ せ 精製 した S A P K 2 を 用 い
M B P を基 質とした試 験管 内リン 酸 化 ア ツ セ イに よ っ て 調 べ たが M B P の リン 酸 化 活 性 に は大
きな 影響 は 見られ なか っ た( 図 1 3 A ) し かし 基 質を加 えな い で 反 応させ た 場 合 の S A P K 2 の
自 己 リン 酸 化 活 性 が P A 添 加 に より促 進 する ことが わ か っ た( 囲 1 3 B ) ただ し こ の S A P K 2
自 己 リン 酸 化 活 性 の 促進 は L P A P C お よぴ p E 何れ の リン 脂質を 添加 した 場 合 に お い ても観
察され た( 囲 1 4 ) ことから P A の S A P K へ の 特異 的結 合とは関 連 しな い 広 い 範 囲 の リン 脂 質
に よる 作 用 で ある ことが わ か っ た
こ れ らの 結果を受 け S A P K の 活 性制 御 に おける P A (リン 脂質) の 意義 を S A P K 2 の 分 子
間 自 己 リン 酸 化 活 性を 調 べ る ことで 検 討 した S A P K 2 W T を酵素とし N 末端 に T R X タグを 付
p A
が SA P K
､
へ
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､
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､
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､
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､
84
した 酵素 活 性 を持 たな い T r x S A P K 2 K JA を基質 に 用 い て 活 性 を測 定 し ア クテ ィ べ
ション ル
-
-
､
プ 中 の セ リン お よ びス
を基質
プ中 に
に用
シ ョン ル
起 こり そ の リン 酸 化 も P A ( リン 脂質) に よ っ て 促進され る( 園 1 5 ) ことから P A の 活 性促進作
用 は( 分 子 間) 自 己 リン 酸 化 に 特有 の 現 象 で ある ことが 示 唆され た また 抗 S A P K 2 リン 酸化
抗体を用 い たイ ム ノブ ロ ッ ト解析 に より S A P K 2 の 自 己リン 酸 化 に お い て は S e r1 5 8 はリン 酸
化され な い か 検 出 で きな い レ ベ ル で あると思 わ れ た( 図 1 6 )
こ れらの 結果より P A の S A P K 結 合 能と P A (リン 脂質) に よる S A P K 2 の 自 己 リン 酸化 促 進
作 用 は とりあ えずわ け て 考 える必 要 があろう P A と S A P K の 結合性 は 特異 的 で は ある が
高浸透 圧 ス トレ ス およぴ A B A シグナ ル に よる S A P K の 活 性 化 に は 影響 しな い こ とか ら別 の 作
用 を考 える必 要 が ある A BIl は A B A シ グナ ル 伝 達 の 負 の 調 節 因子 で プ ロ テ イン フ ォ ス フ ァ タ
つ で あるが Z h a n g ら(2 0 0 4 ) は A B1 1 も P A と特異 的 に 結 合 し A B A シ グナ ル
ゼ2C の
に よ っ て P A 依存 的 に 細胞膜 へ 局 在するように なる ことを報告 して い る P A とS A P K の 結合も
膜との 相互 作 用 や そ の 調 節 に 働 い て い る の か もしれ な い ま た α t u bli n は P L D を介 し て細
胞膜と相互 作 用 して い ると い う報告もある P L D そ の 酵素 反 応 産物 で ある P A 基質で ある膜
の リン 脂質と α t u bli n の 関係 が どの ように な っ て い る か は分 か っ て い な い ただ 当研 究室 で
は α t u b li n と浸透 圧 ス トレス 応 答 の 関 係 が 解 き 明 か され つ つ あり( 伴 私 信) P A が 高 浸 透 圧
ス トレ ス 応 答 の シ グナ ル 分 子 で ある可 能性を考 えると S A P K の P A 結 合 能と関 連させ て 考 え
る こ とも興 味 深 い
P A (リン 脂 質) に よる S A P K 2 の 自 己リン 酸 化 活 性 の 促進 は 複数 の S A P K 2 分 子 がミセ ル
状 の P A ( リン 脂 質) に 結 合する ことで S A P K 2 の 分 子 間距 離 が 縮 まり 自 己 リン 酸 化 を引 き起
こ し やすくな っ たとも考 えられる 青 田( 2 0 0 7 ) は S A P K 2 の 分 子 間 自 己 リン 酸 化 が 基 質 M B P
の 添加 に よ っ て 競 合 に より阻 害されるどこ ろか 逆 に 促進され る ことを観 察 して い る また 他
の 植物 の S n R K プ ロ テイ ン キ ナ ゼ に 関 し ても 同 様 の 報 告 が ある さらに 青 田( 2 0 0 7 ) は こ の
基質 に よる 自 己 リン 酸 化 の 促 進 が C 末端ドメイ ン の 欠 失 に より顕 著 に 低 下 する こ とを 示 し て
い る 彼 女 は こ れ ら の 結 果 か ら 外 部基質 M B P と酵素 S A P K 2 の 結合 に より S A P K 2 の 構造
が 変化 し 分 子 間 自 己リン 酸 化 の 基 質とし て の S A P K 2 との リン 酸 化 部 位 や 相 互 作用 部 位 が
露 出する こ とに より 基 質 S A P K 2 の リン 酸 化 が 促 進されると い うモ デ ル を議論して い る 同 様
の ことが P A ( リン 脂 質) の 自 己 リン 酸 化 促 進 作 用 の 場 合 に も当 て はまるか もしれ な い こ の 自
己 リン 酸 化 に お い て は ア クテ ィ ベ
シ ョ ン ル プ 内 の セリ ン およ ぴ/ あ る い は ス レ オ ニ ン もリン
酸 化され る が S e r1 5 8 は ほとんどリン 酸 化され な い こ とから 直接 の 活 性 化 とは結び つ か な い
と思 わ れ る い ず れ に せ よ こ れ らの ことが S A P K の 細 胞 内 で の 働 きと何 らか の 関 係 が あ るか
否 か に つ い て は 今後 の 課 題 で ある
最 後 に P h o s T a g S D S P A G E に よりタン パ ク 質の 特 異 的な P A へ の 結 合 を検 出 で きる こと
が わ か っ た ことは 予 期 せ ぬ 成果で あ っ た 今 後 高 浸 透 圧 ス トレ ス や A B A シ グナリン グの み な
らず P A が 関 与 するシ グナ ル 伝達 の 分 子 メカ ニ ズ ム を研 究するうえ で 有効 な ツ ル となるこ と
が 期待され る
ー
レオ
ニ
ン を全 て ア ス パ ラギン に 置 換 した T rx S A P K 2 K / A 7 S /N
-
い た 場合と比 較 し たとこ ろ
分 子 間 自 己リ ン 酸 化 の
､
一
-
部 は ア クテ ィ ベ
､
ー
ー
､
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｡
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85
表
二
次 元 電気 泳動 の 通 電条件
電
時
1
2
3
86
(分
( A)
( B)
M l
126 6
L3 3 9
SA P K2
(C )
1 4 7 1 4 9 1 50 1 5 4 1 5 8 1 5 9 1 6 2
14 7 149 150 154 158 159 162
薮隙 繁
E]E] 4 中O E[ 4
襲
A N Sl
吻吻吻吻付什
PI
E1 8 E[E[ 8 窃窃
A N $2
EIE]E]El 窃詔窃
F I物付物吻物
付
A N S3
襲
てトド阿 秘 抄
≡
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桝
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担捜≦
吻吻吻吻物
F I{
T
…軸 淵
閲
｢
窃珍窃窃E[E] 8
162
図1
s
リン 酸 化 部 位 同 定 の ため に 用 い た S A P K 2 変 異 体 コ ン ス トラクト
( A ) 発 現 ベ クタ
ー
の 概 要 を示 す 模 式 図
｡
( ら) S A P K 2 アクテ ィ ベ シ ョン ル プ の アミノ酸 配 列
セリン また は ス レオ ニ ン 残 基 は 書 字 で 示 した
ー
ー
｡
キナ
ー
ゼドメイ ン を緑 C 末 端ドメイ ン を黄 色 で 示 した
､
｡
｡
( c ) 図 2 以 降 の 乗馬剣こ 用 い た S A P K 2 変 異 体 の アクテ ィベ シ ョン ル プ中 の アミノ酸 置 換を表 す 模 式 臥 セリ
ン また は ス レ オ ニ ン をア ス パ ラギン に 置 換 した 残 基を赤 い 斜 線 で 示 した
-
-
｡
87
VV T
1 47 1 4
AN$2
ANSl
A N S3
9 1 50 1 5 4 1 5 8 1 5 9 1 6 2
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≡: 二 ニコ
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一
二=
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+
二
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ア クテ ィ べ
図 2
リン 酸化
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二 ≡二 二
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⊂: =
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⊂:二ニ コ
ション ル
∵
■
=
二ニ
S
r ニコ
⊂:二 1
= 二二二ニ コ
■■■
-
プ 中 の ア ミノ 酸置換 に よる 高 浸 透 圧 ス トレ ス に 応 答 し た S A P K 2
影響
ある い は そ の 変 異 体( 園l ) を プロ トプラス トで 発 現させ 未 処 理 とし て R 2 P 培地 高 浸 透 圧 ス
トレ ス 処 理 として 4 0 0 m M N a Cl を含 む 培 地 で 1 5 分 間 処 理 した 柵 製したそれ ぞ れ の タン パ ク質を高 浸 透 圧 ス
トレ ス 処 理 β) およ び未 処 理 ( C)
両 サ ン プ ル を 混 合 した もの ( ら+ C ) とし 二 次 元 電 気泳 動 で 展 開 抗 H A 抗
い
ム
ノ
ロ
っ
体 を用 たイ
ブ ッ ト解 析を行 た 上 段 に ア ミノ酸 置 換 部 位 下 段 にイ ム ノブ ロ ッ トの 結 果を 示 す
s A P K 2 d H A H is
-
-
､
､
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88
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g S D S P A G E ( = よる S A P K 2 リン
の ア ミノ酸置換 の 影響
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･
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ショ ン ル
ー
ー
プ中
ある い は そ の 変異 体( 園 1) を プロ トプラ ス トで 発 現させ 高 浸 透 圧 ス トレス 処 理として 4 0 0
C ほ 含 む 培 地 で 1 5 分 間 処 理 した ( S) コ ン トロ
ル 処 理 ( C ) は N a C l を 含 まない 培 地 を加 える ことに よ
り行 っ た 処 理 後 発 現タン パ ク質を N i N T A ア ガE ) ス レ ジン で ア フ ィ ニ テ ィ 回収 し P h o s T a g S D S P A G E
に 供 した 後 抗 H A 抗 体 を用 い たイム ノブ ロ ッ ト解 析 に より検 出 した リン 酸 化 に よる移 動 鹿 シ フ トを ★ で 示 した
s A P K 2 d H A His
-
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抗 S A P K 2 リン 酸 化 S
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-
5 8 ペ プチ ド抗体(
e r1
37
-
抗リン 酸 化 S A P K 抗 体) の 特 異 性
か ら 1 0 0 0 n g の リコ ン ビナ ン トT r x 融 合 S A P K 2 W T (T r x W T) T r y S A P K 2 K IA 汀r x 灯 A ) お よぴ T rx
s A P K 2 K IA 7 S / N ( T r y 7 S / N ) を S D S P A G E に よ っ て 分 画 した後 1 /2 0 希 釈 の 抗 S A P K リン 酸 化抗 休お よ ぴ
1 /2 0 0 0 希 釈 の ペ ル オ キシ ダ ゼ頼 経 した 二 次 抗 体( 抗 ウサ ギ Ig G ) を用 い て イム ノブ ロ ット解 析 を行 っ た 抗
S A P K リン 酸 化 抗 体 で 検 出され た T n ト S A P K 2 W T を ★ で 示 す
10
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イネ 培 養 細胞 抽 出 液中 の S A P K 2 リン 酸 化活 性
( A ) 基 質 に 用 い たリコ ン ビナ ン ト S
I
染 色 像 M は 分 子Jt マ カ
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｡
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( K/A ) お よぴ S A P K 2 K / A 7 S 爪 U S/ N ) の
P K 2 K / A お よぴ S A P K 2 K I A 7 S / N を示 す
A P K 2 K/A
-
は SA
S D S PA G E の C B B
-
-
1
｡
( KIA ) ある い は S A P K 2 K IA 7 S/ N (7 S 刑) を基 質として 混 ぜ たポ リアクリル ア ぴ ゲ ル を用 い て
コ ン トロ
ル 処 理 ( C) あるい は 4 0 0 m M N a C l 処 理 (S ) したイネ 培 養細 胞 抽 出 液を S D S P A G E で 分 画し ゲ
ル 内リン 酸 化 ア ツ セイを 行 っ た リン 酸 化 反 応 は C a 2 ' 存 在 下 ( + ) ある い は 非 存 在 下 ( ) で3 0 ℃
1 時間行 つ
た C a 2 存 在 下 の み に おい て 検 出され た S A P K 2 リン 酸 化 活性 を ★ で 示 した
( a)
S A P K 2 KI A
-
ー
･
､
-
､
｡
'
｡
( C)
75
-
｡
0 から1 p M
の スタウ ロ ス ポ リン 存 在 下 で P ) と同 様 の ゲ ル 内 リン 酸 化 ア ツ セ イを行 っ た
91
｡
.
( A)
C
M
a ざ1 o
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a r a r[
(p M )
o nt r o
1
-
5
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1
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( B)
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-
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J E=
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'
㌔
園 6
マ ス トパ ラ ン 処 理 およぴ 3
;
㌔㌔
t 体 G タン パ ク 質 の 共発 現 が S A P K I O の 活 性 化 に 与 える
影響
( A ) S A P K I O d H A H i s をプE) トブラス トで 発現 させ 高 浸 透 圧 ス トレス 処 理として 4 0 0 m M N a C l を含 む 培地
( s a K) A B A 処 理 として 5 0 L A M A B A を 含む 培 地 ( A B A ) に 各 汲 鹿 の マ ス トパ ラン を加 え 1 5 分 間 処 理 した コ ン
トロ
ル ( C o n t r ol) は 何も 含 まない 培 地 で 処 理 した 発 現タン パ ク質を N i N T A ア ガ ロ
ス レ ジン を用 い て ア フ ィ
ニ ティ
回 収 した後 M B P を基 質とした ゲ ル 内リン 酸 化ア ツ セ イ (I n G el) お よぴ イム ノブ ロ ッ ト解析 ( A n ti H A )
に 供した
-
-
､
｡
､
､
-
-
ー
｡
ー
-
-
､
､
｡
お よ ぴ こ れとともに 3 A 体 G タン パ ク質 α サ ブ ユ ニ ット( G α ;
ある い はそ の 構 成 的 活性 型 ( G α こ S A P K I O + G α ) をプロ トプラス トで 発 現させ 高 浸透 圧 ス ト
レ ス 処 理 として4 0 0 m M N a C I を 含 む 培 地 で 1 5 分 間 処 理 した( S ari) コ ン トロ
ル ( C o n t r ol) は N a C l を含 まな
い 培 地 で 処 理 した 処 理 後 ( A ) と同 様 の 解 析を 行 っ た
(B )
S A P K I O d H A H i s の み( S A P K I O)
S A P KI O
-
+
-
､
●
G α)
★
､
ー
.
｡
,
( c ) ( B) の 実 験を 3 反 復し ( S
性 化 レベ ル を定 土 化した
｡
a
m ) み)
.
主体
S A P KI O と 3
｡
92
G
タン ′( ク質を共 発 現 させ たときの
S A PKIO の
活
( A)
l n G el
S A P K2
Ph
-
S
C
p A
(p M)
C
一
誌
･
T
a
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C
書
き
害
-
o s
●
g
C
i
;
-
-
●一
‥
-
■
●
-
■_
Ph
S
C
I
￠l
-
S A P KI O
S DS P A G E
■■■■
-
ln G
( B)
i
-
I
C
o s
･
T
a
S
C
g
C
F<
p A (p M )
…
-
●
.
d
■■■
●
P A 処 理 に よる P h
o s
一
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……
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●
*
払
■■
● ● ●
園7
L
一
-
■ ■ ■
-
志
: こ二
冨
S D S
-
FA G E
丁a g 上 で の S A P K 2 の 移 動 度シ フ ト
をプロ トプラス トで 発 現させ ミセ ル 化した P A を 種 々 の 漉 鹿 に なるように 加 え た 培地 で
3 0 分 間 処 理 した さらに 有 漢 透 圧 ス トレス 処 理 ( S) として 4 0 0 m M N a C l で1 5 分nJl 処 理 した 後 発現 タン / ( ク
貫を N i N T A ア ガ ロ ス レジ ン に よ っ て ア フ ィ ニ ティ 回 収 し M B P を 基 質としたゲ ル 内 IJ ン 酎 ヒア ツ セ イ O n G el)
お よぴ イム ノブ ロ ッ ト解 析 を行 っ た S A P K 2 の 活性 化 を示 すシ グナル を ー で示 した 発 現 回収 したタン ′i ク
P h o s T ag S D S P A G E
箕 のJt お よ ぴリン 酸 化 状 態を確 認 する 目 的 で 通 常 の S D S P A G E ( S D S P A G E)
( P h o s T a g) を行 い イ ム ノブ ロ ッ ト解 析 に 供 した P A 処 理 に よる 高 い レ ベ ル の 移 動度 シ フ トを . で 示 した
(A )
SA P K2 d HA
-
-
Hi s
｡
､
.
､
ー
-
-
-
､
.
｡
｡
-
-
､
-
-
､
I
｡
した
を用 い て ( A ) と同 様 の 実 験を行 っ た S A P K I O
また P A 処 理 に よ る 高 い レベ ル の 移 動 度 シ フ トを で 示 した
S A PKIO dH A
(a )
｡
-
-
Hi s
｡
★
｡
｡
､
93
の
活性 化を 示 す シ グナ ル を
→
で示
C
( m i n)
o nt
o
r o[
C o n t r ol
60
S
15
+
PA
60
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S a ft
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15
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60
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+
30
S
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/i
■■ ●■ ■ ●
●
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I
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*
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f
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S
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-
●
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+
PA
30
● ●
.
● ★
+
-
60
■n J 3 e l
r
*
● t ■ ●■★
Ph
∼
*
l …
園 8
A B A
A B A
PA
T ag
b J -JI l 一
高浸透 圧 ス トレ ス およ び A B A に よる S A P K I O の 活 性 化 に 対 す る影響
PA の
をプロ トプラス トで 発 現させ 4 0 0 m M N a C l を含 む培 地 ( S alt) それ に 終 濃 度 5 0 0 LJ M P A
を含 む 培 地 ( S alt + P A ) 5 0 LJ M A B A を含 む 培 地 ( A B A ) ある い は それ に終 濃 度 5 0 0 L A M P A を含 む 培 地
( A 8 A + P A ) で 繰 時 的 に プ ロ トプラス ト培 養 液r = 処 理 した コ ン トロ ル ( C o n t r ol) は何も含 まない 培 地 で 処 理 した
処 理 後 発 現タン J ( ク貫を Ni N T A ア ガ ロ ス レジ ン に よ っ て ア フ ィ ニ ティ 回 収した 後 M B P を基 質としたゲ ル
内リン 酸 化 ア ツ セ イ(l n G el) P h o s T a g S D S P A G E ( P h o s T a g ) およ び発 現 したタン パ ク 貫 の 丘を確 認 す る た
め の イ ム ノブ ロ ッ ト解 析 ( S D S P A G E) を行 っ た P A 処 理 に よる移 動 度 シ フ トを ★ で 示 した
S A P K I O d H A H is
-
-
､
､
､
-
｡
｡
ー
-
-
､
､
-
-
I
･
､
-
｡
｡
94
o 与
-
1
園9
S A P K の PA
結 合 に よる P h
o s
一
2
丁a g S D S P A G E 上 の 移動 度シ フト
-
H i s をプ ロ トプラス トで 発 現 させ 終 漉 康 が 5 0 0 L A M f = なるようにミセ ル 化した P A を含 む培 地を
加 え 1 5 分 後 ( L a n e 1) ある い は 直 後 ( L a n e 2) l = 液体 窒 素 で 凍結 した 凍 結 細 胞 培 養 液 か ら発 現 タン ′i ク
耳を N i N T A ア ガE ) ス レジ ン に よ っ て ア フ ィ ニ チ イ 回収 した後 P h o s T a g S D S P A G E を行 っ た S A P K I 0
と P A の 結 合 に よる移 動 度 シ フトを ● で 示 した
SAP KI0 dH A
-
I
､
､
,
｡
-
一
-
-
.
｡
95
-
｡
( A)
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Ph
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( P A)
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-
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1
p h at e
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1.J
A
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㌔
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T ag
S DS P A G E
.
S A P K の リン 脂 質結 合 特 異 性
園10
( A)
(H
SA P K
との 結 合ア ツ セ イ( = 用 い たリン 脂 質 の 名 称と構 造
｡
( B ) S A P K 2 d H A H is ある い は S A P K I 0 d H A Hi s をプロ トプラ ス トで 発 現 させ 培養 液 を未 処 理 の まま液 体 窒
素 で 凍 結させ た後 タン / くク 質を抽 出 し 終 濃 度 が 5 0 0 L J M に なるようにミセ ル 化した P A ある い は そ の 他 の リン
脂 質 を加 え 1 5 分nZI 氷上 で イ ン キ ュ ベ 卜した コ ン トロ ル ( C ) は リン 脂 質を加 え ない イ ン キ ュ ベ シ ョ ン イン
キ ュ ベ シ ョン 後 発 現タン パ ク質 を N i N T A ア ガ ロ ス レジ ン に よ っ て ア フィ ニ チ イ 回 収 し 通 常 の S D S
P A G E ( S D S P A G E) およぴ P h o s T a g S D S P A G E ( P h o s T a g) ( = か けイム ノブ ロ ッ ト解 析を 行 っ た P A 処理
( = よる 移 動 度 シ フトを ★ で 示 した
-
-
-
I
,
,
､
ー
ー
-
｡
ー
｡
ー
一
-
-
､
､
-
-
-
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｡
.
96
♂ ㌔
㌔
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園 11
Ph
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I
ー
■■ ●
+
SD S PA G E
-
■
T a g S D S P A G E 上 の 移動 度シ フトで み た P A
-
-
-
結合 の タン パ ク質特 異 性
タグを付 加 した各 発 現 プラ スミドを エ レクトE) ボ レ シ ョン に よりプロ トプラス トに 導 入し 終3t
,
度が 50 D
+
い
い
で
LJ M に なるようにミセ ル 化 した P A を含 む ( ) ある は 含 まな ( ) 培 地を加 え た後 すぐに 液 体 窒 素 凍 結 した
発 現タン / くク苦を N i N T A ア ガ ロ ス レジン に よ っ て ア フ ィ ニ テ ィ 回 収した 後 P h o s T a g S D S P A G E ( P h o s
T a g) およ び 発 現 したタン パ ク箕 を確認 する ため の イム ノブE) ツ ト解 析 ( S D S P A G E) を 行 っ た P A 処 理 に よ っ て
移 動 度 がシ フ トしたバ ン ドを * で 示 した
d H A His
L
-
-
,
-
､
ー
-
-
-
･
,
-
｡
｡
97
-
｡
( A)
A2 8 5
3 17
M 36 2
32 1
3 62
35 7
I PAL
( B)
C ol
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-
+
+
-
●
-
●
-
*
■ヽ
■■■l l ■
Pho
S D S
園12
S A P KI O C
( A) C 末 端 欠 失
s
-
I
T ag
PA G E
末 端側酸 性 アミノ 酸領 域 欠失 の P A 結合 へ の 影響
S A P KI O ( C D l ) の C
末 端 側 アミノ酸 配 列
｡
( B) d H A H i s タグを付 加した S A P K I O ある い は C D l をプ ロ トプラス トで 発 現 させ 終 濃 度 が 5 0 0 LJ M に な るよ
うに ミセ ル 化した P A を含 む( +) ある い は 含 まない (う R 2 P 培地 を加 え た後 すぐに 液 体 窒 素 で 凍 結し た 発 現
タン ′i ク貫 を N i N T A ア ガ ロ ス レジン に よっ て ア フ ィ ニ ティ 回 収 した後 通常 の S D S P A G E ( S D S P A G E )
お よぴ P h o s T a g S D S P A G E ( P h o s T a g) に か けイ ム ノブ ロ ッ ト解 析 を行 っ た P A 処 矧 こ よ っ て 移 動 度 がシ フ
トした バ ン ドを ● で 示 した
I
,
､
-
｡
ー
-
-
､
-
-
-
｡
｡
98
-
( A)
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-
SA P K2
+
e a
( m 舌n )
c ti o n ti m e
+
+
PA
R
+
･
+
ー
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-
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16
-
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ー
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⊂ =
-
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C B B d al n
■
■
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( B)
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1 20
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18
A
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1 20
JL P
･p ･ m
･
C ab
園13
P A に よる S A P K 2
st a in
自 己 リン 酸 化 活 性 の 促進
( A ) 終 漉度 が 1 0 0 LJ M に なる ようにミセ ル 化 した P A を含 む ( +) Kj n a s e b u fF e r あるい
b u fF e r 中で S A P K 2 W T お よぴ M B P をそれ ぞれ 2 0 0 n g 加 え γ 3 2 p A T P と共 に 3 0
1 2 0 分 間 イン キ ュ ベ 卜した 反 応 後 S D S P A G E で 分 画し C B B 染 色 を行 っ た後
基 質 を含 まず に 同 様 の 処 理 をした 自 己 リン 酸 化 反 応も行 っ た 上 に I P 僚 (l P i m a g e)
ー
I
st ai n) を示 した
は S A P K2 W T
は M B P の 位 置を示 す
は 含 手な い ( ) Kj n a s e
℃ で 1 5 分 Ⅶある い は
IP プレ トに 露 光 した
-
-
､
-
ー
-
｡
e
ag
,
,
,
｡
｡
染 色健( C
下に C B B
､
BB
-
｡
､
｡
存 在 下 ( + ) あるい は 非 存 在 下 ( ) か つ 1 0 0 p M P A 存 在 下 ( + ) ある い は 非 存 在 下 ( ) で 2 0 0
n 9 の S A P K 2 W T を r 32 p A T P と共 に 3 O ℃ で 1 5
6 0 ある い は 1 2 0 分 間イ ン キ ュ ベ
卜した 反 応 後 ( A ) と
同 様 の 操 作 を行 っ た 上 に I P 偉 (I P i m a g e) 下l = C B B ( C B B st ai n) 染色 像 を示 した
( B)
1 m M C a2
'
-
-
､
ー
-
｡
I
｡
｡
､
99
C
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2
+
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Z
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一
A
2
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■ ■ ■■■■ ■■ ■ ■ ･
q
萱
J b
2
巴
■
.
叫
･p im a g e
C B B st ai n
園14
S A P K2
自 己リン 酸 化 促 進 作 用 は P A 特 異 的 で は な い
存 在 下 ( + ) ある い は 非 存 在 下 ( ) に お い て 終 濃 度 が 1 0 0 LJ M になるようにミセ ル 化した 各リン 脂
32
質 を含 む Ki n a s e b u fr e r あるい は リン 脂 箕を含 まな い Kj n a s e b u ff e r に 2 0 0 n g の S A P K 2 W T を加 え r p
A T P と共 に 3 0 ℃ で 1 時 間 イン キ ュ ベ
卜した 反 応 後 図 1 4 ( A ) と同 様 の 解 析を 行 っ た 上 に I P 偉 (l P
i m a g e)
下 に C B B 染 色 像 ( C B B s t a 机) を示 した
1
m
M C
a
2
'
-
.
､
ー
｡
､
､
｡
100
｡
-
C
s u
a
2
'
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b s tr a t e
T
rx
K/A
PA
T
rx
T
rx
rx
_
･
+
●
･
K/A
7 SJN
+
-
+
_
■
= = 二 二ニコ⊂ニコ
7 S/N
+
_
二
_
=
■ ■
●
-
ー
lP
h
ag e
C B B st ai n
こ =
自 己リン 酸 化 は ア クテ ィ ぺ
よ っ て 促進され る
園 15
S A P K2
-
ショ ン ル
プ内 で も起き そ の リン 酸 化 は P A に
ー
､
存 在 下 ( + ) ある い は 非 存 在 下 ( ) に お い て 終 浪度 が 1 0 0 p M に なる ようにミセ ル 化 した P A を含
Kj
n
a
s
e b ufr e r あ るい は P A を含 まない ( ) Kj n a s e b u ff e r 中に 酵 素として S A P K 2 0 N T)
む( )
基 質として
32
I
r
J
A
い
r
S
A
P
K
2
KIA
7
S
/
N
T
I
T
7
S
/
N
2
0
0
n
p A TP
T r x S A P K 2 K A 汀 x K ) ある は T x
(
) をそ れ ぞれ
g 加え r
ベ
3
0
℃
1
ュ
1
4
A
の
っ
上
に
IP
lP
i
m
a g e)
と共 に
で
時 間 イン キ
卜した 反 応 後 園
健(
( ) と同 様 解 析 を行 た
■
■
C
t
a
n
S
A
P
K
2
W
T
一
T
r
T
r
x
7
S
/
N
下 に C B B 染 色 像 ( B B s i ) を示 した
は
は
x K IA また は
の 位置を
1 m M
C
a
2
+
-
､
+
-
､
-
-
-
-
-
I
､
ー
､
｡
.
｡
-
-
･
｡
示す
､
｡
101
s u
T
b s tr at e
SA PK2
rx
+
･
rx
-
7 SIN
+
+
P4
T
KI A
I
+
-
-
+
+
-
+
+
-
( k D)
A n ti S A P K
-
-
75
C B B
-
ー
■ ■ 1 ■■
■ ■■
■
■■l
S A P K 2 ア クテ ィ ぺ
-
ショ ン ル
プ内 の S
ー
e r1
37
■ ■■
_
図 16
st a i n
25
5 8 は 自 己 リン 酸 化 され な い
終 濃 度 が 1 0 0 p M に なるようにミセ ル 化した P A を含 む( + ) Ki n a s e b u ff e r あるい は 含 まな い ( ) K i n a s e b u ff e r
中 に 酵素 として S A P K 2 W T 基 質として T I7( S A P K 2 K IA 汀r x K IA ) ある い は T r x S A P K 2 K /A 7 S/ N ( T r x
7 S I N ) をそれ ぞれ 1 p g 加 え 非 凍 識 A T P と共 に 3 0 ℃ で 1 時 間 イン キ ュ ベ
卜し た 反 応 後 S D S P A G E で
分 画し 抗 S A P K リン 酸 化 抗 体 を用 い たイ ム ノ ブロ ッ ト解 析を 行 っ た ( A n ti S A P 杓 また 同 様 に S D S P A G E を
■
-I
は S A P K2 W T
行 い C B B 染 色 した 上 に イム ノブ ロ ッ ト解 析 の 結 果 下 に C B B 染 色 像を示 した
は T Ⅸ K 仇 また は T ∝ 7 S / N を示 す
-
-
-
-
-
-
､
ー
I
,
｡
-
-
-
､
｡
-
｡
､
o
-
･
｡
10 2
､
( B)
A
T P bt r[d h
8
S 托e
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+
S A P K 2 VV T
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d
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r m
i
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a
n al
h
K33A
+
S A P K 2 K/ A
C te
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S A P K 2 JU A 7 SIN
1 43
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革わ
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7 S/ N
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-
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もの S A P K 2 K /A 7 S 爪 はさら にア クテ ィ ベ ショ ン ル プ 中の 全 て の セリン お よぴ ス レ オ ニ ン をア ス パ ラギ ン[ =
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要約
p ro t ei n ki n a s e 2 ( S n R K 2 ) フ ァ ミリ の プ ロ テ イン キナ ゼ 群 に 属 するプ ロ テ
イン キ ナ ゼ は 植物 に お い て 高浸 透 圧 ス トレ ス や ス トレ ス ホ ル モ ン として 知られ て い るア ブ
シ ジン 酸( A B A ) に より活 性 化される こ れらの プ ロ テ イン キ ナ ゼが 高浸透 圧 ス トレ ス や A B A
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応 答 に お けるシ グナ ル 伝 達 に お い て 中 心 的な 役割を果た し て い る こ とを 示 唆する報 告 が 相 次
い で い る し か し こ れら の プ ロ テ イ ン キナ
ゼを介するシ グナ ル 伝 達経路 の 下 流 応 答 や活 性
に
上
に
つ
い
の
だ
に
化 関 わる 流 因 子
て 知 見 は未
乏 し い 本研 究 で は イネ S n R K 2 プロ テ イン キ
ナ ゼ の 上 流 因 子 に 関 する知 見を 深める ことを目 的とし まず S A P K 2 の リン 酸 化 部位 の 同 定
を行 い S e r 1 5 0 S e r1 5 4 およ ぴS e r1 5 8 が 高浸 透圧 ス トレス に よ っ てリン 酸 化され る ことを示 し
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た 上 流 因子 の 探索 に お い て は ス タウ ロ ス ポリン の 感 受 性 が 低く C a 2 + 依 存 的な S A P K 2 を
リン 酸化 するプロ テ イ ン キナ ゼ の 存在を見 い だ し 3 量 体 G タン パ ク 質が A B A に よる S A P K
の 活 性を負 に 制 御 して い る可 能性を 示 唆し た さらに フ ォ ス フ ァ チ ジン 酸 は S A P K の 活 性 に
は 直接 関 与 しな い 特 異 的 な 結合をし そ の 結合 が 生 物学 的 意味を有して い る可 能性を 示 した
ゼ の リ ン 酸 化 状 態を 検 出 す る た め の 技 術 で あ る P h o s T a g
また プ ロ テ イン キ ナ
S D S P A G E は タン パ ク質 の 特異 的 なフ ォ ス フ ァ チ ジ ン 酸 へ の 結 合を検 出 するため の 新 たな
手 法 となる ことが 期待され た
｡
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