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請求項1 - Questel
JP 3688290 B2 2005.8.24 (57)【 特 許 請 求 の 範 囲 】 【請求項１】 抗 HCV抗 体 の 存 在 に 関 し て 試 料 を イ ン ビ ト ロ 検 査 す る 方 法 で あ っ て 、 KPALVPDKEVLYQQYDEM 又 は ECSQAAPYIEQAQVIAHQFの ア ミ ノ 酸 配 列 か ら な る HCV-3型 特 異 的 NS-4抗 原 の 少 な く と も １ つと該試料を接触させて、得られた抗体−抗原複合体を検出する工程を含む前記方法。 【請求項２】 ２ つ 以 上 の HCV型 そ れ ぞ れ に つ い て 、 各 HCV型 に 由 来 す る 型 特 異 的 HCV NS-4抗 原 の 少 な く と も １ つ と 試 料 を 接 触 さ せ る 請 求 の 範 囲 第 １ 項 記 載 の 方 法 で あ っ て 、 該 抗 原 が 前 記 HCV-3型 特 異 的 NS-4抗 原 の 少 な く と も １ つ を 含 む 前 記 方 法 。 【請求項３】 10 試 料 を 前 記 HCV-3型 特 異 的 NS-4抗 原 の 少 な く と も １ つ を 含 む 一 連 の 型 特 異 的 HCV NS-4抗 原 の 各 抗 原 と 別 々 に 接 触 さ せ る 請 求 の 範 囲 第 １ 項 記 載 の 方 法 で あ っ て 、 一 連 の 型 特 異 的 HCV NS-4抗 原 の 各 抗 原 が 異 な る HCV型 由 来 で あ る 前 記 方 法 。 【請求項４】 さ ら に 、 試 料 を 阻 止 量 の 異 種 型 HCVオ リ ゴ ペ プ チ ド 抗 原 と 接 触 さ せ る 請 求 の 範 囲 第 １ 項 か ら第３項のいずれか一項記載の方法。 【請求項５】 型 特 異 的 HCV NS-4抗 原 が オ リ ゴ ペ プ チ ド KPA(V/I)IPDREVLYREFDEM、 RPAV(I/V)PDREVLYQEFD EM、 ECSQHLPYIEG(M/A)AEQFか ら 選 択 さ れ る 型 特 異 的 HCV-1 NS-4抗 原 で あ る 、 請 求 の 範 囲 第 ２項から第４項のいずれか一項記載の方法。 20 (2) JP 3688290 B2 2005.8.24 【請求項６】 型 特 異 的 HCV NS-4抗 原 が オ リ ゴ ペ プ チ ド R(A/V)V(V/I)(A/T)PDKE(I/V)LYEAFDEM、 ECAS(K/R )AALIEEGQR(M/I)AEMLか ら 選 択 さ れ る 型 特 異 的 HCV-2 NS-4抗 原 で あ る 、 請 求 の 範 囲 第 ２ 項 から第４項のいずれか一項記載の方法。 【請求項７】 試料を請求の範囲第５項又は第６項において定義されるのオリゴペプチドから選択される HCV-1、 HCV-2及 び HCV-3抗 原 と 接 触 さ せ る 請 求 の 範 囲 第 ２ 項 か ら 第 ４ 項 の い ず れ か 一 項 記 載の方法。 【請求項８】 各 HCV型 由 来 の 抗 原 を 共 通 の 固 体 基 質 に 固 定 す る 請 求 の 範 囲 第 ２ 項 又 は 第 ４ ∼ 第 ７ 項 の い 10 ずれか一項記載の方法。 【請求項９】 各 HCV型 由 来 の 抗 原 を 異 な る 固 体 基 質 に 、 又 は 共 通 の 固 体 基 質 の 異 な る 位 置 に 固 定 す る 請 求の範囲第３項又は第４項∼第７項のいずれか一項記載の方法。 【請求項１０】 試 料 を 、 型 特 異 的 HCV NS-4抗 原 に 加 え て １ つ 以 上 の そ の 他 の HCV抗 原 と 接 触 さ せ る 請 求 の 範囲第１項∼第９項のいずれか一項記載の方法。 【請求項１１】 そ の 他 の HCV抗 原 が 血 液 検 査 で 使 用 さ れ る 抗 原 で あ る 、 請 求 の 範 囲 第 10 項 記 載 の 方 法 。 【請求項１２】 20 検 査 試 料 に お け る HCV抗 原 を イ ン ビ ト ロ で 分 類 す る 方 法 で あ っ て 、 （ ａ ） 試 料 を 複 数 の HCV抗 原 と 接 触 さ せ る 工 程 で あ っ て 、 少 な く と も １ つ の 前 記 抗 原 が KPA LVPDKEVLYQQYDEM 又 は ECSQAAPYIEQAQVIAHQFの ア ミ ノ 酸 配 列 か ら な る HCV-3型 特 異 的 抗 原 で ある前記工程、 （ｂ）得られた抗原−抗体複合体を検出する工程、及び （ ｃ ） 検 査 試 料 に お け る HCV型 を 決 定 す る 工 程 を含む前記方法。 【請求項１３】 KPALVPDKEVLYQQYDEM 又 は ECSQAAPYIEQAQVIAHQFの ア ミ ノ 酸 配 列 か ら な る 単 離 し た 型 特 異 的 H CV-3 抗 原 。 30 【請求項１４】 請 求 の 範 囲 第 13 項 に 記 載 さ れ る 型 特 異 的 抗 原 の 少 な く と も １ つ を 固 定 し た 固 体 基 質 。 【請求項１５】 使 用 さ れ る す べ て の HCV型 由 来 の HCV抗 原 を 固 定 し た 請 求 の 範 囲 第 14 項 記 載 の 固 体 基 質 。 【請求項１６】 一 連 の 固 体 基 質 又 は 一 連 の 位 置 を 有 す る 固 体 基 質 で あ っ て 、 請 求 の 範 囲 第 13 項 に お い て 定 義される１つ以上の型特異的抗原を各基質又は各位置に固定し、各基体又は各位置に固定 さ れ る HCV NS-4抗 原 が 異 な る HCV型 由 来 で あ る 前 記 一 連 の 固 体 基 質 又 は 一 連 の 位 置 を 有 す る固体基質。 【請求項１７】 40 さ ら に 、 １ つ 以 上 の そ の 他 の HCV抗 原 が 固 定 さ れ た 、 請 求 の 範 囲 第 14 項 又 は 第 15 項 記 載 の 固体基質。 【請求項１８】 そ の 他 の HCV抗 原 が 血 液 検 査 で 使 用 さ れ る HCV抗 原 で あ る 、 請 求 の 範 囲 第 17 項 記 載 の 固 体 基 質。 【請求項１９】 請 求 の 範 囲 第 14 項 ∼ 第 18 項 の い ず れ か 一 項 記 載 の 固 体 基 質 又 は 一 連 の 固 体 基 質 と 一 連 の 阻 止溶液を含むキットであって、各阻止溶液が阻止量の異種型オリゴペプチド抗原を含む前 記キット。 【発明の詳細な説明】 50 (3) JP 3688290 B2 2005.8.24 技術分野 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス３型（ＨＣＶ−３）および４型（ＨＣＶ−４）と呼ばれる、 Ｃ型肝炎ウイルスの新型の発見に関する。特に、本発明はＣ型肝炎ウイルス３型および４ 型の病原体に関し、さらに、生物学的サンプル中のＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４を検出す るための免疫アッセーに有用なポリヌクレオチドおよび免疫反応性ポリペプチドに関し、 さらにまた、抗原性を有するＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４特異的ポリペプチドのワクチン における使用に関する。 発明の背景 急性ウイルス性肝炎は、慢性肝障害をもたらすことがある疾患である。該疾患は、患者が 示す、黄疸、肝痛覚、並びにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパルテートア 10 ミノトランスフェラーゼの血清レベルの増加を含む明瞭な一組の症状によって臨床的には 診断がつく。血清学的免疫アッセーは一般的には、ウイルス性病原体の個々の型を診断す るために行われる。歴史的には、肝炎症状を有するが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、エプスタイ ン−バーまたはサイトメガロウイルスには感染していない患者は、臨床的には非Ａ、非Ｂ 肝炎（ＮＡＮＢＨ）罹患と仕方無く診断されていた。 長い間、非Ａ、非Ｂ肝炎の病原体は定義が困難なままであった。現在、ＮＡＮＢＨの症例 の多くが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と呼ばれる別個のウイルスによって引き起こされ ることが分かった。欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ−０３１８２１６号は、ＨＣＶ由来ｃ ＤＮＡ配列、免疫アッセーにおけるポリヌクレオチドプローブおよびポリペプチドの使用 を開示している。欧州特許出願公開広報ＥＰ−Ａ−０３８８２３２号は、さらに進んだ情 20 報を提供している。 ＨＣＶゲノムは大きなポリプロテイン前駆体をコードするが、この前駆体は構造領域およ び非構造領域を含んでいる。この単一蛋白は、産生後に明らかに種々の蛋白に切断される 。現在、構造蛋白および非構造蛋白の多くは、組換え体（リコンビナント）蛋白としてイ ンビトロＲＮＡ翻訳および発現によって同定されている。ＣおよびＥ領域は、それぞれ、 ヌクレオカプシドの構造蛋白およびエンベロープの構造蛋白をコードする。その後に少な くとも５つの付加領域が続くが、これらは、その機能が未同定の非構造（ＮＳ）蛋白をコ ー ド す る 。 そ の 構 造 は 以 下 の よ う な も の で あ る と 考 え ら れ て い る （ A. Alberti, J. of He patology, 1991; 12; 279-282） ： 30 特定の免疫反応性蛋白が、リコンビナント蛋白、例えばＣ２２（コアー領域内）、Ｃ３３ （ＮＳ３領域内）、５−１−１およびＣ１００（ともにＮＳ４領域内）として記載されて いる。Ｃ型肝炎の診断は未だに、多くがＣ−１００クローンの生成物に対する抗体を検出 する方法に基づいている。このクローンは、ＮＳ３−ＮＳ４ゲノム領域部分に対応するよ り大きなウイルス抗原（Ｃ１００）を産生させるために部分的に共通するに連結された。 Ｃ１００をその後ヒトの超酸化物ディスミューターゼ（ＳＯＤ）遺伝子と融合させ、大型 のリコンビナント融合蛋白（Ｃ１００−３）として使用して発現させ、さらに、固相上で 用いて、放射能標識（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセー（ＥＬＩＳＡ）を起こさ 40 せる。 ＨＣＶのスクリーニングのために有用なポリヌクレオチドは、欧州特許出願公開公報ＥＰ −Ａ−０３９８７４８号に開示されている。欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ−０４１４４ ７５号は、培養細胞でのＨＣＶの増殖および診断で使用する抗原の製造を開示することを 目的としている。欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ−０４４５４２３号はＨＣＶ抗体検出用 の改良免疫アッセーを開示する。 英国の血液銀行は、最近、ＨＣＶ成分に対する抗体について血液供与者の常用検査を開始 した。１つのアッセーはＣ１００−３ポリペプチドに対するＨＣＶ抗体の検出を含む。Ｃ １００−３抗体は該ウイルスの非構造領域内の複合ポリプロテイン抗原を認識し、ＨＣＶ 感染の一貫したマーカーである。しかしながら、急性感染では、ウイルス曝露後の血清変 50 (4) JP 3688290 B2 2005.8.24 化が遅いので（典型的には２２週間）、この抗体は信頼できない。さらに、Ｃ１００−３ 抗体検査はＣ型肝炎ウイルスに対する特異性を欠いている。 第二世代抗体検査は、非構造抗原と同様、該ウイルスの高度に保存されたコアー領域の構 造抗原を表すリコンビナントまたは合成直線状ペプチドを用いる。しかし、第二世代ＥＬ ＩＳＡ検査のいくつかは偽陽性反応を生じる可能性があることが分かった。ＨＣＶゲノム の４種の抗原を取り入れたリコンビナント免疫ブロットアッセー（ＲＩＢＡ−２）は、本 物の抗ＨＣＶ反応性を識別する方法を提供する。しかしながら、その結果は“非確定的” である可能性がある。本発明者らは、ＨＣＶ陽性血液供与者の５−１−１、Ｃ１００、Ｃ ３ ３ Ｃ お よ び Ｃ ２ ２ 抗 原 に 対 す る 反 応 性 の 変 動 を 報 告 し （ Lancet， 338; 10月 19日 号 ； 199 1） 、 さ ら に 、 ポ リ メ ラ ー ゼ ・ チ ェ ー ン ・ リ ア ク シ ョ ン （ Ｐ Ｃ Ｒ ） を 用 い て Ｈ Ｃ Ｖ ポ リ ヌ 10 クレオチドを増幅させて、血液サンプル中に存在するＨＣＶＲＮＡを直接検出した結果と これらを比較した。しかし、この作業は、ＨＣＶ感染の明白な診断は未だ可能でないこと を明らかにした。 最近、Ｋ２と呼ばれるＨＣＶの第二の型が発見された（参考文献１、２）。これは、発表 された基本型（参考文献３）または第一の型のＫ１配列（参考文献４および５）とは非常 に配列が異なる。 発明の要旨 本発明は、以前は知られていなかったＨＣＶ３型および４型の変種の発見に基づいている 。これは、ＰＣＲで増幅させ、系統発生学的分析によって確認したＨＣＶゲノムの一定の 領域の配列を比較することによって発見された。したがって、本発明は、ＨＣＶ−３およ 20 びＨＣＶ−４に特異的なポリヌクレオチド配列およびポリペプチドを識別した。これらは 、ＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４感染を診断するために用いることができ、したがって、Ｈ ＣＶ感染について確定的ないずれの検査においても用いることができる。 本発明の一局面は、Ｃ型肝炎ウイルス３型および４型（ＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４）に 固有のポリヌクレオチド配列を提供する。該配列は、ＲＮＡ配列でもＤＮＡ配列でもよい 。第一に、非コード部分、コアー、Ｅ１、Ｅ２またはＮＳ１−５ゲノム領域のＨＣＶ−３ またはＨＣＶ−４に特異的ないずれのポリヌクレオチド配列もハイブリダイゼーションプ ローブとして用いることができる。該配列は組換え体（すなわち形質転換細胞で発現）で も合成でもよく、必要な場合にはより長い配列内に含ませてもよい。同様に、ポリヌクレ オチドが特異的プローブとしてなお機能しえる場合は、欠失、挿入または置換もまた許さ 30 れる。抗原蛋白をコードする、例えばコアー、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５のようなポリ ヌクレオチド配列が特に有用である。 また別の局面は、抗原性を有するＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリペプチド（特に コアー、ＮＳ３、ＮＳ４またはＮＳ５領域由来）（例えばＣ１００ポリペプチド、５−１ −１ポリペプチド、Ｃ３３ポリペプチドもしくはＣ２２ポリペプチドのＨＣＶ−３または ＨＣＶ−４対応物またはそれらのエピトープ）またはこれらの抗原を含むポリペプチドを 提供する。 本発明のまた別の局面は、免疫アッセーで使用する、抗原性を有する標識ＨＣＶ−３また はＨＣＶ−４特異的ポリペプチド（またはその混合物、特にコアーおよびＮＳ４領域由来 ）を提供する。 40 本発明のまた別の局面は、治療および診断に使用する、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異 的抗原に対する抗体、特に単クローン抗体を提供する。したがって、標識抗体はインビボ での診断に使用してもよい。細胞毒性物質を含む抗体は、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４感 染細胞を攻撃するために使用することができる。 本発明のまた別の局面は、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的免疫誘発ポリペプチドを含 むワクチンを提供する。 該ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリヌクレオチド配列は、ＨＣＶウイルス自体（通 常はＰＣＲによって増幅させる）をハイブリダイゼーション技術によって同定するために 用いることができる。 ＮＳ−４領域の種々の領域に該当するオリゴヌクレオチドは、型特異的ＰＣＲのために用 50 (5) JP 3688290 B2 2005.8.24 いることができる。アウターセンスおよびインナーセンスプライマーは、ＨＣＶ１型、２ 型、３型および４型の特異的検出方法のために、２種の保存アンチセンスプライマーと組 み合わせて用いることができる。 免疫反応性を有するＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリペプチド（特にコアーおよび ＮＳ４領域由来）は、生物学的サンプル中のＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４抗体を検出する ために用いることができ、さらにまたワクチンに含まれる免疫原の主成分を提供する。“ ペプチド”という用語は、本明細書では抗原性を有する最小数のアミノ酸残基を有するエ ピトープペプチド、オリゴペプチドから蛋白までを含んで用いられている。該ペプチドは 、形質転換細胞で発現されたリコンビナントペプチドでも、また化学的合成によって製造 された合成ペプチドでもよい。 10 特に、本発明は、通常のアッセーによる血液供与者のスクリーニングを第二の検査で補う ことを可能にする。この検査は、ＨＣＶ３型のＮＳ−４配列に見出される第一および第二 の 抗 原 領 域 に 対 応 す る ２ 種 の オ リ ゴ ペ プ チ ド （ １ ６ ９ １ か ら １ ７ ０ ８ 位 ま で ； 配 列 KPALVP DKEVLYQQYDEMお よ び １ ７ １ ０ か ら １ ７ ２ ８ 位 ま で ； 配 列 ECSQAAPYIEQAQVIAHQF） 、 並 び に ＨＣＶ２型の対応する領域に由来する２種、Ｒ（Ａ／Ｖ）Ｖ（Ｖ／Ｉ）（Ａ／Ｔ）ＰＤＫ Ｅ（Ｉ／Ｖ）ＬＹＥＡＦＤＥＭおよびＥＣＡＳ（Ｋ／Ｒ）ＡＡＬＩＥＥＧＱＲ（Ｍ／Ｉ） ＡＥＭＬを含んでいる。 実質的に１６９１から１７０８位および１７１０から１７２８位由来の対応するＨＣＶ− ４抗原は、ＨＣＶ−４検出に用いることができる。 したがって、本発明はまた対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を識別し、 20 これはＣ型肝炎２型ウイルス感染を同定するために用いることができる。 抗原抗体免疫複合体の生成および検出は、当該技術分野で現在知られているいずれの方法 によっても実施することができる。例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光、ルミネッセン スまたは化学ルミネッセンス標識のような標識が用いられ、通常抗原に結合させることが できる。標識抗−抗体系もまた用いることができる。リコンビナント抗原は、液相で用い ても、また固形基材に結合させてもいずれでもよい。 ３種のすべての主要型の抗原領域に該当するオリゴペプチドはまた、異なる型のＨＣＶに 感染した個々人を血清学的に区別するために別々に用いてもよい。そのようなアッセーは 、 Ｈ Ｃ Ｖ ４ 、 ３ お よ び ２ 型 の 主 要 な ２ 種 の 抗 原 領 域 の オ リ ゴ ペ プ チ ド 、 並 び に １ 型 （ KPA( V/I)IPDREVLYREFDEMお よ び RPAV(I/V)PDREVLYQEFDEMお よ び ECSQHLPYIEG(M/A)AEQF） で 被 覆 30 した数組のくぼみ（ウェル）またはビーズを用いる間接酵素免疫アッセー形式であっても よい。些細な程度の交差反応性が存在する場合には、それを阻止量の可溶性異種型オリゴ ペプチドを含む希釈液で被験血清を希釈して吸収し、型特異的な抗体反応性を有する抗体 のみが固相に結合していることを確認することができる。 ワクチン製剤で使用する免疫原は、当該技術分野で現在知られている技術にしたがって製 剤化することができる。これは、適切なアジュバントの使用および免疫刺激系を含む。 最後に、本発明はまた、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４抗原の少なくとも１つのエピトープ を含むポリペプチド（またはそれに対する抗体）を、必要な調製用試薬、洗浄用試薬、検 出試薬およびシグナル発生試薬と同様に含むアッセーキットも包含する。 図面の説明 40 本発明の実施例は、単なる一例としてこれから詳述する。 図１および１ａは、１８人の血液供与者のＨＣＶサンプルの５’非コード領域の領域−２ ５５から−６２のＰＣＲによる増幅、および以前に発表されたヌクレオチド配列（表２参 照）との比較によって得られたｃＤＮＡ配列を示している；配列の数字はプロトタイプの ＨＣＶ−１配列（参考文献４）に対応し、さらに１型または２型の以前の名称が示されて いる。 図２は系統発生学的分析であるが、最大公算アルゴリズムを用いた図１の５’ＮＣＲの結 果により、配列が３種の型（すなわちＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３）の集団 （根幹をもたない系統樹として示す）に分けられることを示している。白丸内の数字１∼ １８は、血液供与者配列Ｅ−ｂ１からＥ−ｂ１８に該当する。白丸内の数字１∼２６は、 50 (6) JP 3688290 B2 2005.8.24 表２で明らかにした先に発表された配列に該当する。 図３は、血液供与者（Ｅ−ｂ１、Ｅｂ２、Ｅ−ｂ３、Ｅ−ｂ７（３型）およびＥ−ｂ１２ （２型））のＮＳ−５領域の推定アミノ酸配列と以前に発表されたもの（表２）との比較 である。アミノ酸残基の数字はＨＣＶ−１ポリプロテインのそれ（４）に従い、１文字の アミノ酸コードを用いている。 図４は、最大公算アルゴリズムを用いた、ＮＳ−５領域の系統発生学的分析を根幹のない 系統樹として示している。記号は図２について説明した通りである。 図５は、血液供与者（Ｅ−ｂ１、Ｅｂ２、Ｅ−ｂ６、Ｅ−ｂ７（３型））のＮＳ−３領域 の推定アミノ酸配列と以前に発表されたもの（表２）との比較である。グループ１／１： ｆ１、ｆ３、ｆ４、ｆ５、ｈ２、ｈ３、ｈ４（１名）、ｉ２、ｉ３、ｉ４、ｐ１、ｐ２の 10 アミノ酸配列；グループ１／２：ｉ５のアミノ酸配列；グループ１／３：ｈ２、ｈ３、ｈ ４（１名）、ｈ５、ｆ２、ｐ３、ｉ１のアミノ酸配列；グループ１／４：ｈ１（１名）の アミノ酸配列；グループ１／５：ｈ１（１名）のアミノ酸配列。数字、記号および略字は 図３について説明した通りである。 図６は、最大公算アルゴリズムを用いた、ＮＳ−３領域の系統発生学的分析を根幹のない 系統樹として示している。図５に示した１型の配列の５グループの代表的ヌクレオチド配 列は、以下のように記号化されている：１９（黒丸）ｉ３；２０（黒丸）ｉ４；２１（黒 丸）ｈ５；２２（黒丸）ｈ３；２３（黒丸）ｈ１。記号は図２について説明した通りであ る。 図７は、血液供与者Ｅ−ｂ１（３型）のコアー領域の推定アミノ酸配列と以前に発表され 20 たもの（表２）との比較である。数字、記号および略字は図３について説明した通りであ る。 図８は、最大公算アルゴリズムを用いた、コアー領域の系統発生学的分析を根幹のない系 統樹として示している。記号は図２について説明した通りである。 図９ａおよび図９ｂは、ＨＣＶの推定ＮＳ−４領域で５人のスコットランド人血液供与者 （４０、３８、３６、２６および１７８７番）から増幅させた、ＨＣＶ３型変種のヌクレ オチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ示している（ヌクレオチドおよびアミノ酸残基 は ク ー ら （ Chooら 、 （ １ ９ ９ １ ） ） の よ う に 番 号 付 け さ れ て い る ） 。 ヌ ク レ オ チ ド コ ー ド ：Ｇ：グアニジン；Ｃ：シチジン；Ａ：アデニン；Ｕ：ウリジン。アミノ酸コード：Ａ： アラニン；Ｒ：アルギニン；Ｎ：アスパラギン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｃ：システイン； 30 Ｑ：グルタミン；Ｅ：グルタミン酸；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン ；Ｌ：ロイシン；Ｋ：リジン；Ｍ：メチオニン；Ｆ：フェニルアラニン；Ｐ：プロリン； Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：チロシン；Ｖ：バリン。“・” は未定の配列である。一致性から外れているものは肉太活字で示されている。 図１０（ａ）は、ＨＣＶの主要３変種の残基１６７９と１７６８との間のアミノ酸残基の 比 較 を 示 し て い る （ Chooら 、 1991） 。 Ｔ １ ６ 、 Ｔ ４ ２ 、 Ｔ ７ ７ 、 Ｔ １ ８ ０ １ 、 Ｔ １ ８ ２ ５ ：ＨＣＶ１型感染スコットランド人血液供与者：Ｔ３５１：ＨＣＶ２型感染スコットラン ド人血液供与者：Ｔ５９、Ｔ９４０、Ｔ８１０：ＨＣＶ２型感染スコットランド人血液供 与者：Ｔ４０、Ｔ３８、Ｔ３６、Ｔ２６、Ｔ１７８７：ＨＣＶ３型感染スコットランド人 血液供与者。図１０（ｂ）は、ＨＣＶ３、２および１型オリゴペプチド列の一致（コンセ 40 ンサス）配列の変動を示している。一致性から外されているものは肉太活字で示されてい る。アミノ酸コード：Ａ：アラニン；Ｒ：アルギニン；Ｎ：アスパラギン；Ｄ：アスパラ ギン酸；Ｃ：システイン；Ｑ：グルタミン；Ｅ：グルタミン酸；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒス チジン；Ｉ：イソロイシン；Ｌ：ロイシン；Ｋ：リジン；Ｍ：メチオニン；Ｆ：フェニル アラニン；Ｐ：プロリン；Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｗ：トリプトファン；Ｙ：チロ シン；Ｖ：バリン。“・”は未定である。 図１１（ａ）から１１（ｃ）は、ＨＣＶ３、２および１型のコンセンサス配列からそれぞ れ由来した、エピトープマッピングに用いた９−重合オリゴヌクレオチドのアミノ酸配列 を示している。アミノ酸コード：Ａ：アラニン；Ｒ：アルギニン；Ｎ：アスパラギン；Ｄ ：アスパラギン酸；Ｃ：システイン；Ｑ：グルタミン；Ｅ：グルタミン酸；Ｇ：グリシン 50 (7) JP 3688290 B2 2005.8.24 ；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｌ：ロイシン；Ｋ：リジン；Ｍ：メチオニン；Ｆ ：フェニルアラニン；Ｐ：プロリン；Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｗ：トリプトファン ；Ｙ：チロシン；Ｖ：バリン。 図１２ａ、１２ｂおよび１２ｃは、ＨＣＶ３型感染血液供与者の３種の血清の、ＮＳ−４ の抗原領域（図１１ａに示した配列１−８２）のＨＣＶ３型コードオリゴペプチドに対す る抗体反応性を示している。オリゴペプチド（ｘ軸）に対する抗体反応性は−０．１から ０．７５（および＞０．７５）の範囲で光学的濃度としてｙ軸に表されている。 図１３は、多様化ＨＣＶ配列と代表的１、２および３型との５’ＮＣＲの種々の領域にお ける比較である。−２５５から−２４６、−２１５から−１８６、−１１５から−１０２ および−６９から−６２の配列はプロトタイプの配列と同一である。“．”：ＨＣＶ−１ 10 との配列同一性；“．”：直線性を保持するために配列に導入されたギャップ：“−”： 未定配列。配列の由来：Ｅｇ−１−３３：エジプト；ＮＬ−２６：オランダ；ＨＫ−１− ４：香港；ＩＱ−４８：イラク；ＸＸ−９６：ｘｘｘｘｘ。（）内の数字は各々同一でな い配列の数字を表している。 図１４は、最大公算アルゴリズムを用いた、５’ＮＣＲ領域の系統発生学的分析で、根幹 をもたない系統樹として表されている。黒丸の配列１−１７は、図１３と同様に数字が付 けられている。先に発表された配列は（９９２）の表１と同様に数字が付けられている。 スコットランド人の血液供与者の配列Ｅｂ−１−Ｅｂ１２は、白丸の数字５１−６２であ る。明快にするために、同一でない配列のみを系統樹に示す；例えば、配列１はサンプル Ｅｇ−１６およびＥｇ−２９などで見出されたものと一致する（図１）。白四角はすでに 20 発表されたザイールからの配列で；白い小円は南アフリカからの配列で；黒い小円は世界 のその他の地域で得られた配列である。 図１５Ａ／Ｂは、コアー領域のヌクレオチド（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）配列の比較であ る。記号は図１３と同様である。１文字のアミノ酸コードが使用されている。 図１６は、最大公算アルゴリズムを用いた、コアー領域の一部分の系統発生学的分析で根 幹をもたない系統樹として示されている。配列は図１４と同様に数字を付けられている； 配 列 ３ ０ は Ｈ Ｃ − Ｊ ８ の そ れ で あ る （ オ カ モ ト ら 、 Virology188:331-341） 。 図 １ ７ は 、 Ａ ） （ HaeIII/RsaI） お よ び 、 Ｂ ） （ ScrFI） に よ る ５ ’ Ｎ Ｃ Ｒ に お け る 切 断 パ ターンを示している。 Ｉ）Ｃ型肝炎ウイルスの分析並びに１、２および３型の系統発生的関係 30 序 英国の個々の感染者の血漿から増幅されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の５’非コード領 域の配列分析によって、ＨＣＶの３種の異なるグループ（ヌクレオチド配列において９− １４％の違い）の存在が明らかにされた。同定されたグループのうちの２種は、１型およ び２型と以前に呼ばれたＨＣＶの変種のそれと同じであったが、第三のグループは新規な ウイルス型を表しているようであった。続いて配列の比較が３種のウイルス型の間で該ウ イルスゲノムの他の領域において行われた。ＮＳ−５領域においては、ヌクレオチドおよ びアミノ酸配列の高度な多様性が認められ、この場合“３”型として分類したサンプルに ついては、再度１型および２型の変種とは系統発生的に異なる別個のグループを形成して いた。３型配列は、同じようにＮＳ−３およびコアー領域においてＨＣＶ１型配列から分 40 化していた。観察された１型配列の地理的に異なる変種への下位区分を含めて、ウイルス 型の名称を、本研究で得られた新規な配列のデータとの関連において考察する。 考察 ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によるヌクレオチド配列の複製は最近 確立された技術である。合成の相補的プライマー配列が、複写されるべきゲノム領域のい ずれかの側の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズされる。耐熱性ポリメラーゼの作用の下、第 二の鎖がプライマー間の領域で構築される。その後の加熱は二本鎖を分離させ、再び複製 過程が開始する。このＰＣＲ技術は、プライマー配列を合成するために十分な配列情報が 存在することを条件として、微量のポリヌクレオチドを増幅させることを可能にする。 ＰＣＲを用いて配列変動を調べるためにＰＣＲを使用することに付随する主要な問題は、 50 (8) JP 3688290 B2 2005.8.24 プライマーと変種の配列との間のミスマッチが増幅を阻害する可能性である。我々は、こ の問題を克服するために幾つかの戦略を用いた。第一のウイルス検出のためには、５’Ｎ ＣＲ内のプライマーを用いたが、これは１型変種間において（４、１１、１３、１６、２ ３、２４、２６、３３）、さらにＫ１およびＫ２の間で高度に保存されていることが報告 されている。血液供与者の配列分析は、すでに発表された配列データとの比較によって、 １型および２型の変種の同定を可能にした。この分析によって、２型と同様に１型と異な るようにみえるＨＣＶの第三の“型”の存在が明らかにされた（図１、２；表３）。我々 の初めて仮定的分類に基づいて、該ウイルスゲノムの他の（コード）領域およびより変動 しうる領域におけるわれわれの知見を確証することを試みた。 ＮＳ−５領域の分析（これは３種の型の各々のいくつかの配列を基にした）によって、３ 10 種の主要なグループが存在し、３型配列は１型および２型とは全く異なる比較的同質のグ ループを形成することが確認された。１型配列をＰＴおよびＫ１“亜型”に、２型配列を Ｋ２ａおよびＫ２ｂに分けることを提唱する区分は、この分析によって支持されるが、こ のとき、本研究で得られたただ１例の２型血液供与者配列はＫ２ｂに最も類似しているよ うである。ＨＣＶ１型配列の２つのグループへの分化は、コアー領域（図７）およびＮＳ −３領域（図５）においてもまた明瞭に示され、両方の事例において３型配列はその関係 が顕著に遠くなっているようである。 系統発生的に異なるグループの集合、単一の地理的領域におけるそれらの混合分布（１、 ７、２３、２７、３５）および個々の血友病患者が二重または三重感染しているという我 々自身の知見はすべて、ここに述べた３種の型は、単一のグループで高度に変化しうるが 20 一元論的なグループの地理的変種または疫学的集団の変種を単純に表しているというより はむしろ、異なるウイルスであることを強く主張している。 ５’ＮＣＲの我々自身の系統発生学的分析は、３種の異なるグループの存在を明らかにし た。これはコード領域の分析と対照的で、この場合は１型配列の２つの“亜型”への顕著 な分化が存在するようである。しかしながら、２型および３型変種と違って、この２つの “亜型”は地理的に異なっており、１つの亜型は専ら日本人の患者から得られた配列を含 み、他は専ら米国／欧州人の配列を含んでいる（表２）。実際、この地理的分類の唯一の 例外はＨＣ−Ｊ１配列（２６）で、明白な１つの例外（Ｐｔ−１）は、米国起源の輸入第 ＶＩＩＩ因子（これは他の亜型に対応するＨＣＶ変種を含んでいた可能性が大きい）の治 療を受けた日本人の血友病患者から得られた（７、２３）。提唱される２型の２つの亜型 30 、Ｋ２ａおよびＫ２ｂ（７、２３）が地理的に異なる変種を代表しているか否かを示すに は不十分な配列データしかない。 ＨＣＶのゲノム構成は、ポリプロテイン（これは続いて構造蛋白と非構造蛋白に切断され る）をコードする単一の解放型読み枠を有するフラビウイルスおよびペスチウイルスのそ れと一致する。弱い配列相同性が、正の方向のＲＮＡゲノムを有するいくつかの他のウイ ルス群について検出された（１９、２１）。１型、２型および３型間の配列の非類似性の 全体的な程度は、本研究で調べた小領域の比較によって測定できないけれども、蛋白コー ド領域における相違度の大雑把な評価は、部分的なコアー配列の相違を調べることによっ て与えられる。これは、ＨＣＶ１型および３型のコアー領域間の違い（ほぼ１０％のアミ ノ酸配列の相違）は、フラビウイルス（ダニ媒介脳炎ウイルス）の異なる血清型間に存在 40 する違い（１４％、参考文献１４）に匹敵するが、蚊が媒介するフラビウイルス（デング 熱ウイルスの血清型間の違い（３３％）および西ナイル（ＷＮ）亜群のそれ（２８−３４ ％相違）より低いことを示している。ＷＮ亜群の異なる構成種の５’ＮＣＲ配列はまた、 ＨＣＶの３種の型（＝５０％類似性；参考文献５）よりも多様性がより顕著である（とい ってもそれら構成種の各々、例えばマレーバレー脳炎ウイルス内では、５’ＮＣＲは極め て良好に保存されている（＞９５％類似性、参考文献５）。これらの類似性を基に、我々 は、ＨＣＶの主要な型は異なる“血清型”を表し、各々は、他のＨＣＶ型に対して装備さ れた免疫反応にもかかわらずヒトに感染することができると推測する。 方法 サンプル：１８人の異なる血液供与者（Ｅ−ｂ１からＥ−ｂ１８）の血漿（これらは、ア 50 (9) JP 3688290 B2 2005.8.24 ボット第二世代酵素免疫アッセー（ＥＩＡ）によるスクリーニングで繰り返し反応性を示 し、リコンビナント免疫ブロットアッセー（ＲＩＢＡ；オルト；参考文献１）によっては 確定的または非確定的であった）が、この研究で用いた主なサンプルであった。５人の抗 ＨＣＶ陽性ＩＶＤＵ（参考文献３１のｉ１−ｉ５のように省略）由来、非加熱処理血餅濃 縮物を与えられた５人の血友病患者で抗ＨＣＶ陽性でもあった血友病患者（ｈ１−ｈ５） 由来、１９８３年に収集された１０００人の献血をプールしたもの３種類（ｐ１−ｐ３） 由来、さらに市販の非加熱処理第ＶＩＩＩ因子の別々の５バッチ（ｆ１−ｆ５）由来ＮＳ −３領域の配列が先に記載されたもの（３１）に一致する。 プライマー：ｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）に用 い た プ ラ イ マ ー は 表 １ に 挙 げ る 。 そ れ ら は オ ズ エ ル Ｄ Ｎ Ａ サ ー ビ ス （ Oswel DNA Service 10 ）（化学科、エジンバラ大学）によって合成された。 ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ：０．２∼１．０ｍｌ容量の血漿中のＨＣＶウイルス粒子を１０ ００００ｇで２時間、４℃で超遠心して血漿から沈澱させた。先に述べたように（２、３ １）、沈殿物からＲＮＡを抽出した。第一の鎖のｃＤＮＡは、７単位のニワトリ骨髄芽球 症 ウ イ ル ス の 逆 転 写 酵 素 （ Promega） と と も に 、 ５ ０ ｍ Ｍ ト リ ス − 塩 酸 （ ｐ Ｈ ８ ． ０ ） 、 ５ｍＭのＭｇＣｌ2 、５ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭのＫＣｌ、０．０５μｇ／μ ｌのＢＳＡ、１５％ＤＭＳＯ、各々６００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴ Ｔ Ｐ 、 １ ． ５ μ Ｍ の プ ラ イ マ ー 並 び に １ ０ 単 位 の Ｒ Ｎ Ａ 合 成 酵 素 （ Promega） を 含 む ２ ０ μｌの緩衝液中で４２℃３０分間、３μｌのＲＮＡサンプルから合成された。 ＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡから出発して２５サイクルにわたって実施したが、各サイク 20 ルは９４℃２５秒、５０℃３５秒および６８℃２．５分から成る。最後のサイクルの伸長 時 間 は ９ ． ５ 分 ま で 延 長 し た 。 反 応 は 、 ０ ． ４ 単 位 の Ｔ ａ ｑ ポ リ メ ラ ー ゼ （ Northumbria Biologicals Ltd） を 用 い 、 １ ０ ｍ Ｍ ト リ ス − 塩 酸 （ ｐ Ｈ ８ ． ８ ） 、 ５ ０ ｍ Ｍ の Ｋ Ｃ ｌ 、 １．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１％のトリトンＸ−１００、各々３３μＭのｄＡＴＰ、ｄ Ｃ Ｔ Ｐ 、 ｄ Ｇ Ｔ Ｐ お よ び ｄ Ｔ Ｔ Ｐ 並 び に 各 々 ０ ． ５ μ Ｍ の 外 側 ネ ス ト （ nested） プ ラ イ マ ーを含む２０μｌの緩衝液中で実施した。続いて１μｌの反応混合物を、同じ液であるが ネストプライマーの内側対を含む第二の試験管に写し、さらに２５回の熱サイクルを同じ プログラムで実施した。ＰＣＲ生成物は、３％低融点アガロースゲル（ＩＢＩ）で電気泳 動し、フラグメントを臭化エチジウム染色およびＵＶ照射によって検出した。配列分析の ために、陽性および陰性結果のポアソン分布が得られる適切な制限希釈でｃＤＮＡの単一 30 分子を得た（３０）。 Ｐ Ｃ Ｒ 生 成 物 の 直 接 配 列 決 定 ： Ｐ Ｃ Ｒ 生 成 物 を ガ ラ ス − ミ ル ク 抽 出 （ “ GeneClean” ; Bio 101, Inc.） に よ っ て 精 製 し た 。 精 製 生 成 物 の １ ／ ４ を 、 Ｔ ７ Ｄ Ｎ Ａ ポ リ メ ラ ー ゼ （ Seque nase;United States Biologicals） と と も に 配 列 決 定 反 応 に 用 い た 。 反 応 を １ ０ ％ Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ中で実施し、鋳型ＤＮＡはプライマーアニーリング前に熱変性させるという点を除き、 製造元の指示に従い該反応を実施した。 系 統 発 生 学 的 方 法 ： 配 列 を ス タ ー デ ン （ Staden） プ ロ グ ラ ム の バ ー ジ ョ ン ２ ． ０ （ ３ ２ ） でコンパイルし、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループの配列分析パッケー ジ （ バ ー ジ ョ ン ７ ． ０ ） （ ６ ） で 分 析 し た 。 フ ェ ル ゼ ン シ ュ タ イ ン （ Felsenstein） の Ｐ ＨＹＬＩＰ（バージョン３、４ １９９１年６月；参考文献９）で利用可能な２種の異な 40 るプログラムを用いて、系統発生樹を推論した。プログラムＤＮＡＭＬは、分子の進化に ついて特定の確率的モデルとなる最も可能性の高い系統樹を見つけ、良好な模擬実験を実 施できることを示した（２８）。ここで実施した分析では、可能性のある全ての系統樹の うちより多くのものを検索できるので、グローバル（Ｇ）オプションを用いた。使用した 第二のプログラムはＮＥＩＧＨＢＯＲであったが、これは、プログラムＤＮＡＤＩＳＴ（ これ自体はＤオプションを用いてセットし、多数の置換の可能性について修正した相違の 評価を行うために、ＤＮＡＭＬの根底にあるのと同じ確率的モデルを用いた）を用いて先 に 評 価 を 行 っ た ヌ ク レ オ チ ド の 相 違 に 関 す る 行 列 の 集 合 を 形 成 す る （ Saitou & Nei（ 参 考 文 献 29） の ア ル ゴ リ ス ム に 従 う ） 。 す べ て の 事 例 で 、 最 も 可 能 性 が 高 い 工 程 お よ び 近 縁 種 を含むことができる工程は調和の取れた系統樹を作製し、したがって、前者のみをここで 50 (10) JP 3688290 B2 2005.8.24 は提示する。 ＨＣＶの主要な型の相互関係を確立するために、配列の可変性および進化上の拘束におい て異なるウイルスゲノムのいくつかの領域を別々に分析した。したがって、配列比較から 得られた結論は、特定の領域に影響を与える可能性がある擬似的な進化現象には左右され ない。しかしながら、ここに提示する分析についての１つの問題は、グループから外すた めに必要な、ＨＣＶとの関係において十分に相違しているウイルス配列が存在しなかった ということである。したがって、ＨＣＶの異なる配列変種の相互関係を記載するが、どの 配列がその他のものに対して先祖となっているかを決定する手段を現在もっていないこと は強調されるべきであろう。したがって、このことを示すために、該系統樹はあまり周知 ではない根幹をもたない形で描かれている。 10 結果 １）５’非コード領域の分析：サンプルは１８人の血液供与者から得られたが、これらは 、アボットの第二世代酵素免疫アッセーで繰り返し反応性を示し、さらに、キロンの４− ＲＩＢＡでは確定的または非確定的であった（Ｅ−ｂ１∼Ｅ−ｂ１８、参考文献１０）。 各供与者からの保存血漿サンプル中に存在するＨＣＶ配列は、全ての既知のＨＣＶ１型お よび２型変種間でよく保存されている（４、１１、１３、１６、２３、２４、２６、３３ ）５’ＮＣＲ内の部位に該当するプライマーを用いて増幅された（１２、２５）。増幅前 にｃＤＮＡの単一分子を分離するために制限希釈を行った後でのＰＣＲの生成物の配列決 定は、該領域の中央のほぼ１９０塩基対と既に発表された配列との比較を可能にした（図 １）。配列内で、可変領域と同様に定常領域が見出された。Ｅ−ｂ１３∼Ｅ−ｂ１８の供 20 与者からの６配列は以前に１型として記載されたもの（４、１１、１３、１６、２３、２ ４、２６、３３）と密接に類似し、他の２型（２３）配列と類似していた（Ｅ−ｂ９∼Ｅ −ｂ１２）。しかしながら、８配列（Ｅ−ｂ１∼Ｅ−ｂ８）は両型とは異なっており、暫 定的に３型と命名した。これら配列の３つの型への分離は、最大公算アルゴリスム（図２ ）および近縁合流アルゴリスム（データは示さず）を用いた、これら血液供与者の配列と 先に報告された配列（表２で識別）との正規の系統発生分析によって支持される。３つの グループ内での配列変動性は、各々の事例において、型を分離する変動性より遙かに小さ い。この３つの型の間の中間形の配列は認められなかった。この系統樹は、先に同定され た３型グループは、２型と同様、１型とは異なることを示している。ＤＮＡＭＬモデルを 用いて、各型内の配列間の修正相違は、各事例において３％未満であった。グループ間で 30 はそれらは９％（１型および３型間、並びに１型および２型間）から１４％（２型および ３型間）の範囲であった（表３）。 ２）ＮＳ−５領域の分析：ＮＳ−５領域のヌクレオチド配列は、先に記載されたＨＣＶの Ｋ１およびＫ２変種間で顕著に変動することが見出された（７）。５’ＮＣＲの場合と同 様にこの領域において３型配列が同じように他の２つの型と相違するか否かを調べるため に、４人の３型血液供与者（Ｅ−ｂ１、Ｅ−ｂ２、Ｅ−ｂ３およびＥ−ｂ７）および１人 の２型供与者（Ｅ−ｂ１２）からの配列を先に報告された配列と比較した（図３；図４； 表３）。 顕著な変動がこの領域において３つの型の配列間で認められた。また、３型配列は、この 領域において１型および２型とは別のグループを形成する。しかしながら、５’ＮＣＲと 40 異なり、１型および２型のグループ内の亜区分が存在するように見える。１型配列は、日 本人感染者で発見されたもの（例えばＨＣＶ−Ｊ；ＨＣＶ−ＢＫ；表２の配列番号は１２ 、１３、１６−２０）および米国由来のもの（ＨＣＶ−１、Ｐｔ−１、Ｈ７７、Ｈ９０； 配列番号１∼４；図４）の間で分割される。２型配列の間でも（先にＫ２ａ（７）と命名 されたものに該当し、Ｋ２ｂ型配列とは異なるようにみえるもの、およびスコットランド 人の血液供与者、Ｅ−ｂ１２に対応するもの）分割についてのいくつかの証拠が存在する 。 表３は、ＨＣＶ１型配列の２つのグループ間の平均的ヌクレオチド相違は２５％（ここで は１ａ型〔米国〕および１ｂ型〔日本人〕と記載）で、各グループ内ではわずかに４∼７ ％の変動があるということを示している。２つの１型グループ内のヌクレオチド配列の多 50 (11) JP 3688290 B2 2005.8.24 様性は、Ｋ２ａおよびＫ２ｂ間に存在するものと類似している（表３）。しかしながら、 これらの相違は両方とも、１型および２型配列間（５２∼６２％）、１型および３型配列 間（４８∼４９％）に存在するもの、並びに２型および３型配列間（５３∼６０％）相違 より遙かに少ない。 ３）ＮＳ−３領域の分析：増幅反応は、先に報告されたＮＳ−３領域のプライマー配列（ ３７）および実験的に得られた１対の内側プライマー（３１）を用いて実施した。これら のプライマーは、高い比率の血友病患者由来抗Ｃ−１００陽性血清（３１）の大部分から ＨＣＶ配列を増幅させたが、ＩＶＤＵ由来血清（３１）および血液供与者サンプル（調べ た１５例のうち３例が陽性；データは示さず）については、それらは効果はより少なかっ た。増幅フラグメント内の２つの保存部位を血友病患者およびＩＶＤＵ患者からのＮＳ− 10 ３領域の配列分析によって同定し、さらにこれらに該当する２つの新規なプライマーを特 定した（２０７、２０８；表１）。２８８−２０８（第一ラウンド）プライマーおよび２ ９０−２０７（第二ラウンド）プライマーの組み合わせは、ＨＣＶ３型に感染した４人の 供与者（Ｅ−ｂ１、Ｅ−ｂ２、Ｅ−ｂ６およびＥ−ｂ７）からのサンプルを上手く増幅さ せたが、ＨＣＶ２型に感染したもののいずれも増幅させなかった。このことは、この新規 な型と我々自身の１型配列（３１）および先に報告された１型配列との比較を可能にした （図５、６；表３）。明快にするために、本研究で得られた１型配列の７例（Ｅ−ｂ１６ 、Ｅ−ｂ１７、ｉ３、ｉ３、ｈ５、ｈ３およびｈ１）のみを系統樹に示す。これらの配列 は、英国で感染した患者においてこの領域で発見された変動の範囲の代表的なものである ；先に報告された系統樹（３１）と図６との比較は、前者は、日本人の１型および３型配 20 列が加えられた後で得られた全体的な系統樹の非常に小さな構成部分を形成しているとい うことを示している。 最大公算系統樹は、１型および３型は各々から顕著に多様化したことを示している。ＮＳ −５領域で発見されたように、１型配列の亜型がＮＳ−３において発見された。また、日 本人由来の配列（ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫおよびＪＨ）は、原型（ＰＴ）配列、並びに スコットランド人血液供与者（Ｅ−ｂ１６、Ｅ−ｂ１７、ｐ１−３）、ＩＶＤＵ（ｉ１− ５）および血友病患者（ｈ１−５）で発見されたもの（これらは全て原型配列に該当する ）とは異なっている（図５）。しかし平均的な亜型の相違（２３％）は、４種の３型配列 とＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２との間に存在するもの（３７∼４３％）より小さい。以前 に報告されたように、１型配列間に存在するヌクレオチド置換の大半は活動していない（ 30 サイレントである）（すなわちコードされるアミノ酸配列に影響を与えない）が、一方、 多数のアミノ酸置換が１型および３型配列間に存在する（図５）。ＮＳ−３領域の分析は 、ＮＡＢＡ肝炎罹患日本人患者から得られたクローンＡの配列（３５）を含むが、これは 現存するＨＣＶ１型配列とは異なることが報告されている。図６では、この配列は、修正 配列相違がそれぞれ３３∼４３％および３６％であるＨＣＶ１型とも３型とも異なるよう である。この段階ではこの配列をいずれかの既知のグループに分類することはできないが 、これらの相違は、それが２型配列または同様に異なる新規なＨＣＶ型を代表するという 仮説とは矛盾しない。 ４）ＨＣＶの推定コアー領域の部分的配列：推定コアー蛋白をコードする領域は、既知の １型変種間でそのヌクレオチド配列において比較的よく保存されている。これは、ヌクレ 40 オチドおよびアミノ酸配列の類似性がそれぞれ９０∼９８％および９８∼９９％であるこ とによって示されている（１１、２４）。血液供与者Ｅ−ｂ１（この者はコアー領域以外 の他の分析領域では３型配列を有する）からのコアー領域の一部分をプライマー４１０お よび４０６で増幅し、先に報告された１型配列と比較した（図７、８；表３）。この分析 は、３型配列は１型のものと異なっており、また、１型配列の日本人型配列（ＨＣＶ−Ｊ 、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ４、ＪＨおよびＪ７）および米国／欧州型配列（ＨＣＶ−１、 Ｈ７７、Ｈ９０、ＧＭ１、ＧＭ２）への主要な下位区分が存在したということを確認した 。ＮＳ−３で発見されたように、非常に小さなアミノ酸配列の変化が１型配列のコアー領 域で発見され；２つのグループ間の殆ど全てのヌクレオチドの違いは“サイレント”部位 に存在する。対照的に、３型配列は、１型配列と比較したとき７∼８個のアミノ酸置換を 50 (12) JP 3688290 B2 2005.8.24 示す。 10 20 30 (13) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 (14) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 (15) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 40 ＩＩ）Ｃ型肝炎ウイルスの３種の異なる型に感染した血液供与者の血清反応性 血液供与者、血友病患者および静脈内薬物乱用者からのＨＣＶ配列が、５’非コード領域 （５’ＮＣＲ）、コアー、ＮＳ−３およびＮＳ−５領域において増幅された。 アボット第二世代酵素免疫アッセー（ＥＩＡ）によるスクリーニングに際して繰り返し反 応し、さらに、オルトリコンビナント免疫ブロットアッセー（ＲＩＢＡ）では陽性または 不確定反応を示す献血血液が、５’ＮＣＲにおいてプライマーによって増幅された（参考 文献１０）。最初の１４例のＰＣＲ陽性献血血液（この場合、ＰＣＲは増幅のため、した がって血液中に存在するＨＣＶＲＮＡを検出するために用いられた）は、続いて、該増幅 50 (16) JP 3688290 B2 2005.8.24 領域の配列分析によって型分けされ、一続きの構造ペプチドおよび非構造ペプチドに対す るそれらの血清学的反応性を、２種の第一世代ＥＩＡ（オルトＨＣＶＥＬＩＳＡ；アボッ トＨＣＶＥＩＡ）および２種のＲＩＢＡアッセー（オルトＲＩＢＡおよびイノジネティク ス （ Innnogenetics） Ｌ Ｉ Ａ ； 表 ４ ） で 比 較 し た 。 Ｈ Ｃ Ｖ １ 型 配 列 を 含 む ５ 例 の 献 血 血 液 が、両方のＥＬＩＳＡで陽性で、オルトＲＩＢＡアッセーですべての抗原と反応し、さら に、ＬＩＡでは広く反応した。しかしながら、２型および３型感染の供与者からの２例の 血清を除いて全てが抗Ｃ−１００ＥＩＡスクリーニングで完全に陰性で、５−１−１、Ｃ １００（ＲＩＢＡ）およびＮＳ４（ＬＩＡ）と反応しなかった。 さらに、ＨＣＶ３型変種のキャリアーの幾人かはオルトＲＩＢＡでＣ３３（ＮＳ−３）ペ プチドとわずかしか反応せず、２例の“非確定的”な結果を生じた（供与者番号１１およ 10 び１３）。 したがって、オルトＲＩＢＡおよび（より少ない程度に）イノジネティクスＬＩＡテスト を用いる現在のテストでは、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３遺伝子型の信頼に足る検出は可 能ではない。すべてのＨＣＶ型の信頼に足る検査のために、ＨＣＶの３種の型の各々につ いての５−１−１、Ｃ１００およびＮＳ４からの抗原が好ましくは抗原パネルに含まれる べきである。 20 30 40 ＩＩＩ．ＮＳ−４内の抗原決定基のマッピング 序 血清学的なスクリーニングアッセーを改良するという全体的な目的で、２型および３型の Ｃ１００−３に該当する領域の抗原領域の配列データを得た。この情報を該領域のエピト ープのマッピングのため、さらに、抗ＨＣＶの血清学的アッセーの改良に使用しうるまた 別の免疫反応性ペプチドの同定のために用いた。 方法 50 (17) JP 3688290 B2 2005.8.24 ＰＣＲおよび配列決定：スコットランド人の血液供与者の血漿サンプル（これは、第二世 代抗ＨＣＶスクリーニング（アボットまたはオルト）で繰り返し反応し、さらにＲＩＢＡ （キロン）による確認検査では確定的または非確定的であった）は、スコットランド国立 輸 血 サ ー ビ ス 微 生 物 学 委 託 研 究 室 （ Scottish National Blood Transfusion Service Micr obiology Reference Laboratory） か ら 医 学 微 生 物 学 部 門 に 委 託 さ れ た 。 該 血 漿 サ ン プ ル 中 の Ｈ Ｃ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ を 抽 出 し 、 先 に 記 載 さ れ た よ う に （ Chanら 、 1992） ５ ’ Ｎ Ｃ Ｒ 内 の プ ラ イ マ ー で 増 幅 さ せ た 。 Ｈ Ｃ Ｖ は 、 先 に 記 載 さ れ た よ う に （ Simmondsら 、 1990） 増 幅 Ｄ Ｎ Ａ の配列分析およびＲＦＬＰ分析によって型分けした。 ＨＣＶ３型に感染した別々の供与者からの５例のサンプル（４０、３８、３６、２６およ び１７８７番）、２型感染の４例（３５１、５９、９４０および８１０番）および１型感 10 染の５例（１６、４２、７７、１８０１および１８２５番）を、ＮＳ−４の抗原領域に広 がる、正方向および反方向の配列に該当するプライマーで増幅させた。増幅させたＤＮＡ から得たヌクレオチド配列を比較し、各ＨＣＶ型のコンセンサス配列の範囲を限定するた めに用いた。このヌクレオチド配列の枠内翻訳によって、連続したコンセンサスアミノ酸 配列が得られ、これは、エピトープマッピングのために、一連の共通オリゴヌクレオチド の範囲を特定するために用いられた。 エピトープマッピングおよび抗体特異性の決定：合成共通ペプチドをケンブリッジリサー チバイオケミカル社から市販されているキットを用いてポリプロピレンピン上で合成した 。 こ の 付 加 反 応 の 原 理 は 参 考 文 献 に 記 載 さ れ て い る （ Geysenら 、 1984; Geysenら 、 1985） 。抗体反応は、超音波処理（３０分）で破壊したピン上で、１％ドデシル硫酸ナトリウム 20 、０．１％２−メルカプトエタノール、０．１Ｍオルト燐酸二水素ナトリウム中で実施し た。ピンは燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％卵白アルブミン、１％ウシ血清アルブミン 、０．１％トゥイーン−２０で、室温で１時間予め被覆した。血清または血漿を、ＰＢＳ ＋０．１％トゥイーン−２０（ＰＢＳＴ）中で１．４０希釈し、ブロックしたピンと４℃ で１８時間インキュベートした。ＰＢＳＴを４回交換して洗浄（攪拌しながら室温で１０ 分）した後、結合抗体を、アフィニティー分離抗ヒトＩｇＧ、ペルオキシダーゼ結合物（ シグマ）の１／２００００希釈液中で室温で１時間インキュベートして検出した。洗浄（ ＰＢＳＴで４回交換）した後、０．０３％過酸化水素含有０．１Ｍ燐酸ナトリウム／クエ ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中のアジノ−ジ−３−エチル−ベンズチアゾジンス ルホネートの０．０５％溶液で、ピンを２０分インキュベートした。光学濃度を４１０ｎ 30 ｍで読み取った。 結果 ＨＣＶ３型に感染（５’ＮＣＲの配列分析による）した５人の供与者の血漿サンプル中の ＨＣＶＲＮＡを、表１に挙げたプライマーを用いてＮＳ−４で増幅させた。この領域の高 い配列変動性のために、異なるＨＣＶ型の増幅には別個の方向のプライマーを用いること が必要であった。しかしながら、反方向プライマーは高度に保存された領域にあり、３種 の全ての型の増幅に用いることができる。配列分析は先に記載されたように実施した。こ れ は ４ ９ １ １ か ら ５ ２ ７ １ 位 （ Chooら （ 1991） の 記 載 に し た が っ て 番 号 付 け さ れ て い る ） の連続配列を生じた（図５ａ）。この領域においては、４人の異なる供与者間で配列変動 性は殆ど認められなかった。 40 ヌクレオチド配列はコードされたペプチドの配列を推定するために用いた（図５ｂ）。こ の推定蛋白は主に親水性残基を含むが、Ｎ−結合糖付加反応のための潜在的能力を有する 部位は含まない。ＨＣＶ３型のアミノ酸配列の変動性は５残基のみに制限されていた（図 ５ｂ）。しかしながら、この領域は、ＨＣＶ１型および２型感染の他の血液供与者のアミ ノ酸配列とは顕著に異なっていた（Ｔ１６、４２、７７、１８０１、１８２５、３５１、 ９４０および８１０；図６ａ）。主要なＨＣＶ型の残基１６７９から１７６９の間の配列 比較によって、アミノ酸配列の顕著な変動性を有する３領域が明らかにされた。型間で認 められた違いの殆どは、非同義的アミノ酸置換、特に親水性領域における酸性および塩基 性残基の変更を含む。これらの変化は、蛋白の全体的な構成、およびその抗原性を大きく 変化させると考えられる。 50 (18) JP 3688290 B2 2005.8.24 １型∼３型のこの領域におけるコンセンサスアミノ酸配列（図６ｂ）を、３種のシリーズ の８２個の９アミノ酸重合オリゴペプチド（９残基のうち８個が共通）を該シリーズ内の 前後のものを用いて明らかにするために使用した（図７ａ−ｃ）。これらは１２×８アレ ーのポリプロピレンのピン上で方法の項で記載したように合成された。ピン上に固定され た抗原に対する抗体反応性は、４℃で一晩１／４０希釈の被験血清でインキュベートし、 洗浄後、抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合物および適切な基質で検出（方法の項参照 ）して、間接ＥＬＩＳＡによって求めた。 ＨＣＶ感染について既知の危険因子をもたない、抗ＨＣＶ陰性でＰＣＲ陰性供与者の３種 のペプチドシリーズに対する反応性を調べた。ＨＣＶコードオリゴペプチドのいずれに対 しても顕著な反応性は示されなかった。３人のＨＣＶ３型感染供与者の血清のこれらオリ 10 ゴペプチドの各々に対する反応性は図９ａ−９ｃに示した。３例の血清の全てが、１３番 （ 配 列 KPALVPDKE;図 ７ ） か ら ２ ２ 番 （ 配 列 VLYQQYDEM） の 範 囲 の ペ プ チ ド と 第 一 の 抗 原 領 域において反応した。しかし認識された正確なペプチドは個々人の間で僅かに変動してい た 。 ３ 例 の 血 清 は 全 て 、 オ リ ゴ ペ プ チ ド ３ ２ か ら ４ ２ （ ECSQAAPYIか ら QAQVIAHWQの 配 列 ） の範囲にある第二の抗原領域と程度は異なるが反応した。より弱くさらにより変動性のあ る反応性がペプチド４８から５３で認められた。最後に、顕著な反応性が、単一のオリゴ ヌクレオチド２（３サンプルのうち２サンプル）、６１（３例のうち２例）、６６（３例 のうち３例）、７３（３例のうち３例）および８０（３例のうち２例）に対してもまた認 められた。 ＨＣＶ３型の主要な抗原領域の配列は、１型または２型変種のいずれかによってコードさ 20 れたものとは顕著に異なる。ペプチド１３から２２が結合する領域は、ＨＣＶ２型変種と は５０％、１型とは６７％の平均相同性を示す。ペプチド３２から４２の間では、２型と は３９％、１型変種とは５８％の相同性が存在する。したがって、各ＮＳ−４配列の同様 な領域が抗原性を有するが、実際のエピトープはＨＣＶの型間で顕著に異なる。 考察 ＨＣＶ３型のＮＳ−４領域はＨＣＶの他の変種とは顕著な配列多様性を示し、この多様性 は 、 以 前 に 分 析 さ れ た （ Chanら 、 1992） コ ア ー 、 Ｎ Ｓ − ３ ま た は Ｎ Ｓ − ５ 領 域 で 認 め ら れ たそれを越える。ＨＣＶゲノムのこの領域によってコードされる蛋白の機能は未知で、さ らにウイルス増殖および病原性におけるこの変動性の結果は未知である。フラビウイルス およびペスチウイルスにおけるＮＳ−４領域の機能もまた殆ど明らかにされていない。 30 アミノ酸配列変動性の程度およびアミノ酸置換の性質は、抗体反応の主要部位はまた抗原 変動のそれでもあるということを示している。このことは、疑いもなくＨＣＶ１型ＮＳ− ４がコードする抗原の、異なるＨＣＶ型に感染した患者の血清との制限された交差反応を 生じる。現在、感染の血清学的診断は、完全にＨＣＶ１型から由来したリコンビナントま た は 合 成 オ リ ゴ ペ プ チ ド 配 列 を 基 に し て い る （ Chooら 、 1991） 。 感 染 に 対 す る 血 清 反 応 は 、スクリーニングに用いたリコンビナント抗原のうちのただ一つに対する抗体について、 その最初の段階で極めてしばしば制限される。このことは、２種のＨＣＶコード抗原に対 する反応性が確認に必要な補充抗体検査における困難性をもたらすだけでなく、ＨＣＶ２ 型および３型による初期感染の検出の失敗の可能性を増大させる。 表７は、ＰＣＲにより決定したＨＣＶ型決定と型特異的抗原（ＴＳＡ）を用いて得た結果 とを関連付け、ＨＣＶ３型との相関性を示している。 40 (19) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 (20) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 40 ＩＶ．ＨＣＶ４型の同定 序 世界各地の様々な場所から得たＨＣＶサンプルの５’非コード領域（５’ＮＣＲ）（図１ ３）およびコアー領域（図１５Ａおよび１５Ｂ）の配列変動について調査を行った（図１ 50 (21) JP 3688290 B2 2005.8.24 ３）。系統発生学的分析（図１４および１６）は、ここでＨＣＶ−４と呼ぶ、別個の新規 なＨＣＶ型を明らかにした。 方法 サンプル：ＨＣＶ用第二世代スクリーニングアッセーで繰り返し反応し、さらに確定的（ キ ロ ン リ コ ン ビ ナ ン ト 免 疫 ブ ロ ッ ト ア ッ セ ー （ Chiron Corporation, エ メ リ ー ビ ル 、 カ リ フォルニア、米国）で２種以上の抗原と顕著に反応する）であるか、または非確定的（た だ１種の抗原とのみ反応する）である、血液供与者およびＮＡＮＢＨの患者から得た血漿 サンプルからＲＮＡを抽出した。既知のＨＣＶ型とは実質的に異なる配列を含むサンプル の殆どはエジプトからのサンプル（ＥＧ１∼３３）であった。他のものはオランダ（ＮＬ −２６）、香港（ＨＫ１∼４）、イラク（ＩＱ−４８）およびＸＸ（ｘｘ−６）からのも 10 のであった。 配列決定：ＨＣＶ配列を逆転写し、先に報告されたように（１）５’ＮＣＲの保存領域と 適合するプライマーで増幅した。コアー領域の分析には、配列ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ（Ａ／ Ｇ）ＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣ（５’塩基：ｘｘｘ、（２０）のように番号付け）の プライマーを用いて、ＲＮＡを逆転写した。このプライマーおよび配列ＡＣＴＧＣＣＴＧ ＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧ（５’塩基：−５４）の５’ＮＣＲのプライマーを用 いて、ｃＤＮＡを増幅した。第二のＰＣＲは、配列ＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧ ＣＡＴＣＡＴＧ（５’塩基：−２１）およびＴＴＧＣＧ（Ｇ／Ｔ／Ｃ）ＧＡＣＣＴ（Ａ／ Ｔ）ＣＧＣＣＧＧＧＧＧＧＴＣ（５’塩基：ｘｘｘ）のプライマーを用いた。両領域で増 幅されたＤＮＡを先に報告されたように（参考文献１ａ）直接配列決定した。 20 配列分析：配列は、ウィスコンシン大学ＧＣＧパッケージのＣＬＵＳＴＡＬプログラムを 用いて直線に並べた（参考文献６）。系統樹は、フェルゼンシュタインのＰＨＹＬＩＰパ ッケージのＤＮＡＭＬプログラム（バージョン３．４、１９９１年６月（参考文献９）） により、グローバルオプションを用いて構築した。４種の代表的ＨＣＶ変種（参考文献） の５’ＮＣＲのＲＮＡ二次構造はプログラムＦＯＬＤを用いて予測された。広範囲の可能 な相互反応を許容するために、ヌクレオチド−３４１から−１、−３４１から＋３００お よび−３４１から＋９００の間の各配列から３種の予想が行われた。異なる長さにわたる 、各配列についての予想構造の比較によって、比較的小さな規模の特徴（例えば結果の項 で分析した幹／ループ）は完全に保存されていることが示された（データは示さず）。こ の 章 で 報 告 し た 全 て の 配 列 は ジ ー ン バ ン ク （ GenBank） に 寄 託 し た 。 30 結果 ５’ＮＣＲ配列の多様性：サウジアラビア、オランダおよび香港の血液供与者並びにイラ クおよびｘｘｘのＮＡＮＢＨ患者のサンプルで検出された５’ＮＣＲのいくつかの配列は 、スコットランド人の血液供与者で認められたものおよび他の場所で報告されたものとは 実質的に異なっていた（図１３）。ＨＣＶ１、２および３型を互いに区別する、十分に特 徴が明らかにされたヌクレオチド置換を示す代わりに、配列相違の新規な組み合わせが、 新しい変種で発見され、このことは、現在のシステムのウイルス分類の枠外にそれらを置 くように思われた。これは、該配列の系統発生を再構築し、さらに進化系統樹として結果 を提示することによってより簡単に表すことができる（図１４）。この分析は、配列１∼ １０は以前に１、２および３型として型分けされた変種と別な集団を作ることを確認する 40 。便宜的に、この新規なグループの配列をＨＣＶ４型と呼ぶ。４型内並びに４型および他 のＨＣＶ型間の５’ＮＣＲにおける平均的相違は、先に１∼３型について記載されたもの に匹敵した。４型内の配列は比較的緊密なグループを作り、配列１１、１２および１３は 、既知の型のいずれとも顕著に異なっている。 この系統発生樹を用いて、先に報告された５’ＮＣＲの大半は、１、２および３型として 容易に区別することができることを知ることができる。さらに、ザイールの配列の殆ど全 て（白四角として示されている）は４型内で緊密な集団を作り、このことは、アフリカで のより広範囲な分布を提唱している。しかしながら、さらに複雑なことは、南アフリカの 患者から得た３例の同一な配列は１型および４型グループの両方と異なっているようで、 さらに、また別のＨＣＶ型を表しているかもしれないということである。 50 (22) JP 3688290 B2 2005.8.24 ３例の代表的４型変種（Ｅｇ２９、３３、２１；１∼３番の５’ＮＣＲに該当）からのＲ ＮＡは、ＨＣＶポリプロテインのコアー領域のプライマーを用いて増幅された。３例の全 ての配列は、ＨＣＶ１型から３型のヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方で顕著に異 なっていた（図１５Ａ／Ｂ）。これらの配列および以前に分析された系統発生分析は、そ れらは、他の型とは異なる別個の、比較的同質のグループを形成することを示した（図１ ６）。４型と１∼３型との間の再構成したヌクレオチドの相違は、ＨＣＶの３種の既知の ＨＣＶ型の間に存在するものに匹敵していた。ヌクレオチド配列の相違の殆どはサイレン トであったけれども、新規な変種と他の型との間には４および９個のアミノ酸の相違が存 在した。 Ｖ．ＨＣＶ型分け 10 序 ＨＣＶ１、２、３および４型の間の配列変動の見地から、制限酵素切断部位における相違 が存在し、これはエンドヌクレアーゼ切断パターンの相違をもたらす。この技術を、世界 各地の種々の起源の血液サンプル中のＨＣＶ遺伝子を同定するために用いた。 （Ａ）ＨＣＶ１∼３の型分け 方法 血清サンプル：６か国（スコットランド、フィンランド、オランダ、香港、オーストラリ アおよび日本）の血液供与者のサンプルが、常用第二世代抗ＨＣＶＥＬＩＳＡスクリーニ ング（オルトまたはアボット）から利用可能であった。上記の検査で繰り返し反応した供 与者サンプルを、さらに補足的検査（オルトＲＩＢＡ：フィンランド、オランダ、オース 20 トラリア、エジプト、アボットマトリックス：香港）を用いて調べ、または抗ＨＣＶにつ いてＥＬＩＳＡでサンプル（日本）の力価を測定した。ＲＩＢＡ検査で陽性（２種以上の ＨＣＶ抗原と顕著な反応（１＋から４＋）もしくはまたは非確定的（１種の抗原とのみ反 応）であるか、またはＥＬＩＳＡで＞×４０９６（日本のみ）の力価を有するサンプルを ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によってウイルスＲＮＡについて検査 した。 ＲＮＡＰＣＲ：ＨＣＶＲＮＡの検出のためにＰＣＲをチャンら（参考文献１ａ）が記載し たように、ネストＰＣＲにおいて５’非コード領域（５’ＮＣＲ）を用いて、第一および 第二の反応でそれぞれプライマー２０９／９３９および２１１／９４０（５）で実施した 。 30 ＨＣＶ型分け：異なるＨＣＶ型に特徴的な、５’ＮＣＲに比較的保存された置換パターン の存在は、ＨＣＶ遺伝子型の同定に有用なシグナチャー配列を提供する。多数の異なるＨ ＣＶ１、２および３型の配列を比較することによって、我々は、増幅ＤＮＡの制限エンド ヌクレアーゼ切断でＨＣＶ１∼３型を区別する方法を開発した。しかしながら、１９例の ４型配列は１型のようであり（電気泳動による型はＡａおよびＡｂ）、一致する研究のた めには、新規なＨＣＶ型を同定するための条件を修飾する必要があった。すべての４型配 列は、全ての１型（および２型）配列に存在しない、新規なＨｉｎｆＩ部位をもたらす、 −１６７位のＴ−−＞Ｃの変化を示した。ＳｃｒＦＩ（およびＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩ） との比較では、それは、中東および他の地域の多くの国々における新規な型の信頼に足る 同定を可能にすることを証明した。 結果 ＨＣＶ１、２および３型についての結果は表８に要約した。エジプトのサンプルは、単一 のＳｃｒＦＩ消化で異常な制限パターンを生じ、４型として同定された。 40 (23) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 （Ｂ）臨床標本におけるＨＣＶ４型感染検出のためのＰＣＲに基づく型分けアッセーの修 飾 方法 ＲＮＡの抽出：ＲＮＡは、非Ａ、非Ｂ患者の血漿の部分標本１００μｌから、１ｍｌのＲ ＮＡゾル溶液（２Ｍグアニジンチオシアネート、１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）、０．２５％ｗ／ｖのＮ−ラウロイルサルコシン、０．０５Ｍ２−メルカプトエ タノール、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５０％ｗ／ｖ水飽和フェノール） を 加 え る こ と に よ っ て 、 先 に 報 告 さ れ た よ う に （ Chomczynskiら 、 1987） 抽 出 し 、 沈 殿 物 30 が溶解するまで混合した。１００μｌのクロロホルムを添加した後、各サンプルを１４０ ００×ｇで５分間遠心し、水相を０．５ｍｌクロロホルムで再抽出した。ＲＮＡを等量の イソプロパノールを添加し、少なくとも１時間−２０℃に置いて沈澱させた。ＲＮＡ沈殿 物を１４０００×ｇで１５分４℃で遠心して生成し、１ｍｌの７０％冷エタノール溶液で 洗浄し、乾燥させ、さらにジエチルピロカーボネート処理蒸留水２０μｌに再懸濁させた 。１００例の直接抽出したサンプルのうち、総数１９例がＰＣＲ陰性であった（下記参照 ）。陰性サンプル２ｍｌ容量を２０００００×ｇで２時間超遠心し、沈殿物を上記のよう に再抽出した。より大容量の血漿からの抽出によってさらに３例の陽性サンプル（６６、 ８０、８５番）を得た。 ＰＣＲおよび型分け：ＲＮＡをプライマー９４０で逆転写し、ｃＤＮＡを２段階のネスト 40 ＰＣＲ反応でプライマー９４０／９３９、続いて２０９／２１１で先に報告されたように （ Chanら 、 1992） 増 幅 し た 。 Ｐ Ｃ Ｒ 生 成 物 を 〔 35 Ｓ〕−ｄＡＴＰで放射能標識し制限エン ド ヌ ク レ ア ー ゼ 切 断 に よ っ て （ McOmishら 、 Transfusion, 32: 11号 1992） 分 析 し た 。 サ ンプルを、ＳｃｒＦＩおよびＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩの組み合わせで２つの別々の反応で 切断し、ＨＣＶ１／４、２、３型を同定した。図１７はエンドヌクレアーゼ切断パターン を示す。ＨＣＶ１および４型はＨｉｎｆＩによる三番目の反応によって区別された（結果 を参照）。２例のサンプルは、ＨＣＶの４種の既知の型のそれと異なる制限パターンを生 じ 、 こ れ を 増 殖 Ｄ Ｎ Ａ の 直 接 配 列 分 析 （ Chanら 、 1992） に よ っ て 分 析 し た 。 こ れ ら ２ 例 の サンプルは既知のＨＣＶ型と異なる５’ＮＣＲを含み、現在未分類のままである。 結果 50 (24) JP 3688290 B2 2005.8.24 ＨＣＶ４型を同定するためのＲＦＬＰ方法の修飾：エジプト人の血液供与者の血漿から増 幅したＨＣＶの５’ＮＣＲにおける予備的配列分析によって、５’ＮＣＲおよびコアー領 域の両方において比較的同質のグループの新規な配列変種が明らかにされた。これは、Ｈ ＣＶ１、２および３型が互いに異なる程度に、これら１、２、３型と異なっていた（先の 文献参照）。この新規なグループはＨＣＶ４型と命名された。４型配列の切断パターンと 先に同定された４型配列のＲＦＬＰ型分析のそれとの比較は、ＨＣＶ１型のそれと類似の ＳｃｒＦＩおよびＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩによる電気泳動タイプの区分を生じた（表９） 。１型配列は、ａＡ／Ｂの９パターン、ｂＡ／Ｂおよび１ｂｃの３５パターンを生じた。 これらの酵素のみでは、４型配列はしたがって１型とは区別できない（１４ａＡ／Ｂ、４ ｂＡ／Ｂ）。しかしながら、１型および４型配列は、ＨｉｎｆＩ部位の数が常に異なって 10 いる。１８例の４型配列の全ては、１つまたは２つの潜在的切断部位を含むが（バンドｃ のパターンを生じる；表５）、一方分析した４５例の１型配列のいずれにおいても何も認 められない（パターンａ）。４型配列の１例は、ＲｓａＩに対する制限部位の消失によっ て１型および他のＨＣＶ型とはさらに異なり、ｈと命名された新規なバンドパターンをも たらした（４４、１７２、９、２６；表９の１段目）。最後に、ただ１つの配列、ＥＧ− ２８は２つの部位を失っており、２１６、９および２６塩基対のバンド（パターンｉ；表 ９）を生じた。この配列は既知のＨＣＶ型のいずれ（４型も含めて）のそれとも異なって おり、表のＵ（未分類）と標識した段に示してある。 調査物の型分け：ＮＡＢＡ肝炎の患者のサンプル１００例からＲＮＡを抽出し、５’ＮＣ Ｒ内のプライマーで増幅した。これらのうち、８４例がＰＣＲ陽性で、ＲＦＬＰによって 20 ＨＣＶ型分けを実施することができた。これはまずＨａｅＩＩＩ／ＳｃｒＦ１で実施し、 １０例の２型および１０例の３型変種の同定が可能であった（表１０）。電気泳動パター ンａＡ／ＢまたはｂＡ／Ｂをさらに、ｈｉｎｆＩによる切断でさらに分析し、パターンａ をもつサンプル３８例（したがって１型と同定される）、パターンｂをもつ２２例および パターンｃをもつ２例（両方とも４型と同定される）を得た。最後に、２例のサンプルは 、ＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩで通常とは異なる切断パターンｈおよびｉを、さらにＨｉｎｆ Ｉでパターンｂを示したので直接配列決定を行った。これら２つの配列は互いに類似して いたが、既知のＨＣＶ型のいずれとも異なっており、ＥＧ−２８（ＨａｅＩＩＩ／Ｒｓａ Ｉでパターンｉを示した別の配列）とも異なっていた（表１０）。それらは現時点では分 類できないので、それらをＵ型と呼ぶ。 30 (25) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 a 既 に 記 載 さ れ た よ う に （ Mcomishら 、 1992） Ｈ ａ ｅ Ｉ Ｉ Ｉ ／ Ｒ ｓ ａ Ｉ お よ び Ｓ ｃ ｒ Ｆ Ｉ に ついて指摘された切断パターン。 b 未分類型のＨＣＶ変種の切断パターン c パターンａ：ＨｉｎｆＩよって切断されない。 d パターンｂ：ＤＮＡが切断され、サイズ１０７および１４２塩基対（５’→３’）の２ つのフラグメントを生じる。 e パターンｃ：ＤＮＡが切断され、５６、５１および１４２塩基対の３つのフラグメント を生じる。 f ｈと呼ぶＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩによる新規な切断パターン（４４、１７２、９、２６ 塩基対）。 g ｉと呼ぶＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩによる新規な切断パターン（２１６、９、２６塩基対 ）。 40 (26) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 a ２サンプルが通常と異なるＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩ（ｈ，ｉ）による制限パターンを生 じた。５’ＮＣＲの配列分析では、それらは現在のＨＣＶ分類の枠外に置かれた（サンプ 30 ルＩＱ−４８、ＥＧ−９６）。 ＶＩ．発現および分析などの技術 本発明はまた、本明細書で定義された通りのＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供するが 、このベクターは、適切な宿主中で該ＤＮＡ配列を発現し、本明細書で定義された通りの ペプチドを産生することができる。 該発現ベクターは、普通には、適切な宿主中で該ＤＮＡ配列の発現を達成するＤＮＡの制 御要素を含む。これら要素は宿主に応じて変えることができるが、通常は、プロモーター 、リボソーム結合部位、翻訳開始および停止部位、並びに転写終了部位を含む。そのよう なベクターの例は、プラスミドおよびウイルスを含む。本発明の発現ベクターは、染色体 外 ベ ク タ ー お よ び 宿 主 細 胞 染 色 体 に 組 み 込 ま れ る ベ ク タ ー の 両 方 を 含 む 。 大 腸 菌 （ E. col 40 i） で 使 用 す る 場 合 、 該 発 現 ベ ク タ ー は 、 場 合 に よ っ て 例 え ば β − ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ を コ ードするＤＮＡ配列の５’もしくは３’末端に、または例えばｔｒｐＥ遺伝子をコードす るＤＮＡ配列の３’末端に結合させた融合物として本発明のＤＮＡ配列を含むことができ る。昆虫のバキュロウイルス（ＡｃＮＶＰ）系で使用する場合は、該ＤＮＡ配列は場合に よってポリヒドリンをコードする配列に融合される。 本発明はまた、本明細書で定義されたような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提 供する。本発明で使用する宿主細胞の例は、原核細胞および真核細胞、例えば細菌、酵母 、哺乳類および昆虫の細胞を含む。そのような細胞の具体例は、大腸菌、ビール酵母菌（ S. cerevisiae） 、 Ｐ ． パ ス ト リ ス （ P. pastoris） 、 チ ャ イ ニ ー ズ ハ ム ス タ ー 卵 巣 細 胞 お よ び マ ウ ス 細 胞 、 並 び に ス ポ ド プ テ ラ ＝ フ ル ギ ペ ル ダ （ Spodoptera frugiperda） お よ び 50 (27) JP 3688290 B2 2005.8.24 ト リ コ プ ル シ ア ＝ ニ ー （ Tricoplusia ni ） で あ る 。 宿 主 細 胞 の 選 択 は 多 数 の 因 子 に よ っ て 左右されるが、ＨＣＶウイルスペプチドの翻訳後修飾が重要な場合は、真核細胞宿主が好 ましい。 本発明はまた、ここで定義されたようなペプチドを製造する工程を提供し、これは、ここ で定義したＤＮＡ配列のＨＣＶゲノムからの分離、またはここで定義したペプチドをコー ドするＤＮＡ配列の合成、または該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の作製、該ＤＮＡ配 列を適切な宿主中で発現させることができる発現ベクターへの該ＤＮＡ配列の挿入、該発 現ベクターによる宿主細胞の形質転換、該形質転換宿主細胞の培養および該ペプチドの分 離を含む。 こ の ペ プ チ ド を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ 配 列 は 標 準 的 な 方 法 （ Gait, オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド 合 成 ： 10 実 践 入 門 （ Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach） ， 1984オ ッ ク ス フ ォ ー ド 、 IRLプ レ ス ） で 合 成 で き る 。 上記のように得られた所望のＤＮＡ配列は、既知の標準的な技術を用いて発現ベクターに 挿入することができる。発現ベクターは通常は制限酵素を用いて切断し、ＤＮＡ配列は平 滑端または粘着端結合を用いて挿入される。切断は通常、発現ベクター内の好都合な部位 （これは、一旦挿入されると、該ＤＮＡ配列がその発現を達成するＤＮＡの機能的要素の 制御下に置かれるような部位である）で制限酵素で行われる。 宿主細胞の形質転換は、標準的技術を用いて実施できる。いくつかの表現型マーカーが通 常用いられ、上手く発現ベクターを取り込んだ形質転換細胞とそうでないものとが区別さ れる。形質転換宿主細胞の培養および所望のペプチドの分離もまた、標準的な技術を用い 20 て実施できる。 本発明のペプチドは、合成手段またはリコンビナントＤＮＡ技術によっても製造できる。 該ペプチドは好ましくは自動合成装置を用いて合成できる。 本発明のペプチドに特異的な抗体を該ペプチドを用いて作製することができる。該抗体は 多クローン性でも単クローン性でもよい。該抗体は、該ペプチドのバッチの品質管理検査 に；ペプチドまたはウイルス溶解物の精製に；エピトープマッピングに；抗体検出のため に標識された場合は競合型アッセーにおける結合物として；さらに抗原検出アッセーに用 いることができる。 本発明のペプチドに対する多クローン性抗体は、ペプチドを（場合によって免疫応答を促 進するために担体に結合させる）哺乳類宿主（例えばマウス、ラット、ヒツジまたはウサ 30 ギ）に注射し、その結果産生された抗体を回収することによって得ることができる。該ペ プチドは一般には注射が可能な製剤形で投与されるが、その場合、ペプチドは生理的に許 容できる希釈剤と混合されている。アジュバント（例えばフロイントの完全アジュバント （ＦＣＡ）またはフロイントの不完全アジュバント（ＦＩＡ））を該製剤に含ませてもよ い。製剤は通常は、適切な期間にわたって宿主に注射され、血漿サンプルを適切な間隔で 抗ＨＣＶウイルス抗体についてのアッセーのために採取する。適切な水準の抗体が得られ たとき、宿主を失血させる。続いて、例えばプロテインＡまたはイオン交換クロマトグラ フィーによる標準的な方法を用いて血漿から、抗体を抽出、精製する。 本発明のペプチドに対する単クローン性抗体は、無限増殖細胞株の細胞を、該ウイルスま たは局所構造的に関係を有するペプチドに対する抗体を産生する細胞と融合させ、該融合 40 無限増殖細胞株を培養することによって得ることができる。典型的には、非ヒト哺乳類宿 主、例えばマウスまたはラットに該ペプチド接種する。宿主が抗体反応を惹起するために 十分な期間が経過した後、抗体産生細胞（例えば脾細胞）を取り出す。無限増殖細胞株（ 例えば、マウスまたはラットミエローマ細胞株）の細胞を該抗体産生細胞と融合させ、生 じた融合物を所望の単クローン性抗体を分泌する細胞株（例えばハイブリドーマ）を識別 するためにスクリーニングする。融合細胞株を培養し、単クローン性抗体を多クローン性 抗体の精製と同じ態様で培養液から精製することができる。 本発明に基づく診断アッセーを、ＨＣＶ感染の有無を決定するために用いることができる 。それらはまた、そうした感染の治療をモニターするために、例えばインターフェロン療 法において使用することもできる。 50 (28) JP 3688290 B2 2005.8.24 ウイルス感染の診断用アッセーでは、基本的には利用可能な３種類の異なる方法があるが 、これは、ウイルス核酸、ウイルス抗原またはウイルス抗体の検出を含む。ウイルス核酸 は一般には、ウイルス自体の存在の最良のインジケーターと考えられ、材料がおそらく感 染性があることを示すことができるであろう。しかし、核酸の検出は、通常は抗原または 抗体の検出ほど容易ではない。なぜならば、標的のレベルが非常に低いことがあるからで ある。ウイルス抗原は、ウイルスの存在のマーカーとして、さらに感染性のインジケータ ーとして用いられる。ウイルスによってはサンプル中に存在する抗原の量は非常に低く、 検出が困難な場合がある。抗体検出は比較的容易である。なぜならば、事実、宿主免疫系 は、大量の循環抗体を産生することによって感染に対する反応を増幅させるからである。 抗体応答の性状は臨床的にしばしば有用である。例えば、ＩｇＧよりむしろＩｇＭクラス 10 の抗体は感染が最近であることを示し、また、特定のウイルス抗原に対する応答は、その ウイルスの除去を伴う。したがって、ウイルス感染の診断に用いることができる正確な方 法は、特定の環境および求められている情報に左右される。ＨＣＶの場合には、診断アッ セーはこれら３種の方法のいずれでも具体化できる。 ウイルス核酸の検出を含むＨＣＶの診断用アッセーでは、該方法は、検査サンプル中に存 在するウイルスＲＮＡ、またはそのようなウイルスＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、本 発明のヌクレオチド配列に該当するＤＮＡ配列、または本発明のペプチドをコードするＤ ＮＡ配列とハイブリダイズさせ、生じた核酸ハイブリッドをスクリーニングして、いずれ のＨＣＶウイルス核酸かを同定することを含む。この方法の応用は、通常、ウイルスＲＮ Ａが高いレベルでおそらく存在する、適切な組織の検査サンプル（例えば肝生検）に限ら 20 れる。本発明の核酸配列に該当するか、または本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列 は、オリゴヌクレオチドまたは、場合によってはプラスミッド内に含まれるｃＤＮＡ配列 の形を取ることができる。該核酸ハイブリッドのスクリーニングは、好ましくは、標識Ｄ ＮＡ配列を用いることによって実施される。好ましくは、本発明のペプチドは、ウイルス 核酸への該ペプチドの結合が標識が結合部位に近すぎるために干渉されることがないよう 、該標識がペプチドから十分な距離にあるオリゴヌクレオチドの部分である。一種または 別の種類のスクリーニングをさらに１回または２回以上行って、該ハイブリッドの特性を 調べて、いずれのＨＣＶウイルス核酸かを同定する。ハイブリダイゼーションおよびスク リーニング工程は、当該技術分野で既知の方法にしたがって実施する。 本発明はまた、ＨＣＶウイルス核酸検出用キットを提供するが、これは、 30 ｉ）本発明のＤＮＡ配列または本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む標識オリ ゴヌクレオチド；および ｉｉ）洗浄溶液、反応緩衝液および、標識が酵素の場合、基質を含む。 有利には、検査キットはまた、ウイルス核酸の同定を促進するために陽性コントロールサ ンプルを含む。 ウイルス抗原または抗体の検出を含むＨＣＶ診断用アッセーでは、該方法は、検査サンプ ルを本発明のペプチドまたは該ペプチドに対する多クローン性もしくは単クローン性抗体 と接触させ、さらに、検査サンプル内に含まれる何らかの抗原抗体結合の存在の有無を決 定することを含む。この目的のために、検査キットは、ここに定義されたペプチドまたは それに対する多クローン性もしくは単クローン性抗体、および検査サンプル中に含まれる 40 抗体もしくは抗体のそれぞれとの結合が存在するか否かを決定するための手段を含んで提 供される。該検査サンプルは、ウイルス核酸の検出について上記に述べた、いずれの適切 な組織および生理的液体から採取してもよい。生理的液体を得た場合には、場合によって 、存在するいずれのウイルス抗原または抗体のためにも濃縮することができる。 多様なアッセー形式を用いることができる。該ペプチドは溶液中のＨＣＶに対する抗体を 選択的に捕捉するために、または既に捕捉した抗体を選択的に標識するために、または該 抗体を捕捉し標識するために用いることができる。さらに、該ペプチドは、種々の均質ア ッセー形式で用いることができ、この場合、ペプチドと反応する抗体は相を分離すること なく溶液中で検出される。 溶液から抗体を捕捉するためにペプチドが用いられるタイプのアッセーは、固形表面上に 50 (29) JP 3688290 B2 2005.8.24 ペプチドを固定することを含む。この表面は何らかの方法で洗浄することができるべきで ある。適切な表面の例は、種々のタイプ（マイクロタイターのくぼみに流し込んで固めた もの；ビーズ；種々のタイプのディップスティック；吸引チップ；電極；および光学装置 ）のポリマー、通常の粒子のサイズが０．０２から５ミクロンの粒子（例えばラテックス ；固定赤血球細胞；細菌もしくは黴細胞；芽胞；金もしくは他の金属性もしくは金属含有 ゾル；および蛋白性コロイド）、膜（例えば、ニトロセルロース；紙；酢酸セルロース； および有機または無機材料の多孔性／高表面積膜）を含む。 該表面へのペプチドの付着は、至適組成（界面活性剤、溶媒、塩および／またはカオトロ ー プ （ chaotrope） を 含 む こ と が で き る ） の 溶 液 か ら の 受 動 的 吸 着 、 ま た は 能 動 的 化 学 結 合によることができる。能動的結合は、該表面に露出させることが可能な、種々の反応性 10 または励起可能官能基（例えば縮合剤；活性酸エステル、ハロゲン化物および酸無水物； アミノ、ヒドロキシル、またはカルボキシル基；スルヒドリル基；カルボニル基；ジアゾ 基；または不飽和基）を介して行われてもよい。場合によって、能動結合は、蛋白（それ 自体表面に受動的に、または能動的な結合を介して結合されている）、例えばアルブミン またはカゼインを介して行うことができ、それに対してウイルスペプチドを、種々のいず れの方法によっても化学的に結合させることができる。この方法での蛋白の使用は、等電 点、電荷、親水性または他の物理化学的特性のために有利であろう。ウイルスペプチドは また、反応混合物の電気泳動的分離、例えば免疫沈澱反応に続いて、該表面（通常は膜で あるが、必ずしもその必要はない）に結合させることができる。 ペプチドが付着している表面を検査サンプルと接触（反応）させ、反応の時間を与え、必 20 要な場合には種々の手段（例えば洗浄、遠心、ろ過、磁力または毛細管作用）のいずれか で過剰なサンプルを除いた後、該捕捉抗体を検出可能な信号を生じるいずれかの手段によ って検出する。例えば、これは、上記で述べたような捕捉抗体と反応する標識分子または 粒子（例えば、蛋白Ａまたは蛋白Ｇなど；抗種もしくは抗免疫グロブリン亜型；類リュー マチ因子；または競合的態様もしくはブロッキングの態様で用いられる該ペプチドに対す る抗体）、または該ペプチドに含まれるエピトープを含む一切の分子を使用することによ って達成することができる。 検出可能な信号は光学的または放射能活性または物理化学的なものが可能で、例えば色素 、放射能標識、電気的活性種、磁気共鳴種またはフルオロフォアによって該分子または粒 子を標識することによって直接的に、またはいずれかの種類の測定可能な変化を発生させ 30 ることができる酵素自体で分子または粒子を標識することによって間接的に提供すること ができる。また別に検出可能な信号は、例えば凝集反応を用いて、または、表面が粒子の 形状の場合は回折もしくは複屈折効果によって得ることができる。 ペプチド自体が既に捕捉された抗体を標識するために用いられるアッセーは、ペプチドが 検出されることを可能にする、ペプチド標識のある種の形を必要とする。該標識は、例え ば放射能標識、磁気共鳴種、ペプチドへの粒子もしくは酵素標識を化学的にもしくは受動 的に結合させることによって直接、または、それ自体ペプチドと反応する分子に何らかの 形の標識を結合させることによって間接的に行うことができる。ペプチドへ標識を結合さ せるための反応は、ペプチドに既に存在する分子部分（例えばアミノ基）を介して、また は中間体分子部分（例えばマレイミド基）を介して直接的であってもよい。抗体の捕捉は 40 、既に述べたいずれかの表面上で、特異的な抗体または免疫複合体の結合を生じる受動的 または能動的吸着を含むいずれかの試薬によって行われる。特に、抗体の捕捉は、抗種も しくは抗免疫グロブリン亜型によって、類リューマチ因子、蛋白Ａ、Ｇなどによって、ま たは該ペプチド中に含まれるエピトープを含むいずれかの分子によって行われる。 標識ペプチドは競合的な結合態様で用いることができ、この場合、上記で例示したいずれ かの表面上でのいずれかの特異的分子へのその結合は、サンプル中の抗原によって阻害さ れる。また別に、それは非競合的態様で用いることができるが、この場合、サンプル中の 抗原は上記のいずれかの表面に特異的または非特異的に結合し、さらにまた、標識ペプチ ドを捕捉するために用いられる特異的な二価または多価分子（例えば抗体）と残存する価 標で結合する。 50 (30) JP 3688290 B2 2005.8.24 均質アッセーではしばしば、ペプチドおよび抗体は別々に標識され、それによって、抗体 が拘束されずに溶液中のリコンビナントペプチドと反応するとき、この二種の標識は相互 反応によって、例えば、１つの標識によって捕捉されたエネルギーの他の標識への非放射 性転移（励起された第二の標識または消去された第一の標識が適切に検出される（例えば フルオリメトリー、磁気共鳴または酵素測定）を可能にする。サンプルにウイルスペプチ ドまたは抗体を添加することによって、標識ペアーの相互反応が制限され、したがって、 検出体において異なるレベルの信号が生じる。 ＨＣＶ抗体検出の適切な形式は、直接サンドイッチ酵素免疫アッセー（ＥＩＡ）形式であ る。ペプチドはマイクロタイターのくぼみに被覆される。検査サンプルおよび酵素結合ペ プチドを同時に加える。検査サンプル中に存在する一切のＨＣＶ抗体は、くぼみを被覆し 10 ているペプチドおよび酵素結合ペプチドの両方に結合する。典型的には、同じペプチドが サンドイッチの両側に用いられる。洗浄後、結合酵素は、色の変化を伴う特異的な基質を 用いて検出される。そのようなＥＩＡで使用する検査キットは下記の（１）∼（４）を含 む： （１）酵素で標識された、ここで定義されたペプチド； （２）該酵素のための基質； （３）ペプチドが固定される表面を提供する手段； （４）場合によって、洗浄溶液および／または緩衝液。 ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡもまた用いることができる。この場合、抗ヒト抗体が マイクロタイターのくぼみに被覆され、検査サンプルが該くぼみに添加される。検査サン 20 プル中に存在する一切のＩｇＧまたはＩｇＭ抗体は続いて抗ヒト抗体に結合する。本発明 のペプチド（これは標識されている）が該くぼみに添加され、ペプチドは、ＨＣＶ感染に より生じた一切のＩｇＧまたはＩｇＭに結合するであろう。ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体はペ プチド上の標識によって視覚化できる。 したがって、本発明のペプチドは、古典的ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、膜結合ＥＩＡお よび免疫沈澱反応を含むアッセーにおいて、多くの形式（換言すれば遊離ペプチドとして ）でＨＣＶ感染の検出に使用できることが理解されよう。ペプチド結合物は増幅アッセー およびＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡにおいて用いることができる。 本発明のアッセーは、例えば献血血液のスクリーニングまたは臨床的な目的のため、例え ばＨＣＶ感染の検出およびモニターに用いることができる。スクリーニングの目的のため 30 には、好ましいアッセー形式は、自動化できるもの、特にマイクロタイター形式およびビ ーズ形式である。臨床的な目的のためには、そのような形式に加え、小規模用または単回 使用用（例えばラテックスアッセー）もまた使用できる。スクリーニング工程における確 認アッセーのためには、抗原はウェスタンブロッティングまたは他の免疫ブロッティング 検査での使用に適した小片上で与えられる。 上記に示したように、検査サンプル中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するために（特に献血 血液のスクリーニングにおいて）現在用いられているアッセーは、ＨＩＶ１型のみから得 られた抗原性ペプチドを利用しており、本明細書で明らかにしたように、そのような抗原 は他のＨＣＶ遺伝子型の信頼に足る検出を行うことができない。したがって、ＨＩＶ−１ のための検査を他の全ての遺伝子型、例えば２、３および４型、並びに発見されうるさら 40 に別の遺伝子型のための検査で補充することが明らかに望ましい。 遺伝子型スペクトルを検査するために、一連のアッセー手段を提供することができる。こ れは、各々、ＨＣＶの１遺伝子型からの１つまたは２つ以上の抗原性ペプチド、例えばマ イクロタイタープレートの一連のくぼみ、またはビーズ形式を用いた同等のシリーズを含 む。そのようなアッセー形式は、サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型を決定するため に用いることができる。また別に、または付け加えるに、アッセー手段は、１遺伝子型以 上の抗原性ペプチドを含んでいてもよく、例えば、マイクロウェルまたはビーズは１遺伝 子型以上のペプチドで被覆することができる。 検査には１つ以上のＨＣＶ抗原、特に遺伝子の構造領域由来の少なくとも１つの抗原性ペ プチドおよび非構造領域由来の少なくとも１つの抗原性ペプチドの組み合わせ、特にコア 50 (31) JP 3688290 B2 2005.8.24 ー抗原およびＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５領域から選ばれる少なくとも１つの抗原の組み 合わせを用いることが有利であることが分かった。くぼみおよびビーズは、別々に抗原で 被覆することができる。しかし、２つまたは２つ以上の抗原性ペプチドを単一のポリペプ チドとして、好ましくはリコンビナント融合ポリペプチドとして融合させることが有利で あることが分かった。そのような方法の利点は、個々の抗原は一定の、予め定めた比率（ 通常は等モル）で組み合わせることができ、さらにただ１つのポリペプチドの製造、精製 および特性検査が必要とされるということである。１つまたは２つ以上のそのような融合 ポリペプチドは、所望の場合には１つまたは２つ以上の非融合ペプチドに加えて用いるこ とができる。融合ペプチドには多くの可能な抗原組み合わせが有るということは理解しえ よう。例えば、融合ポリペプチドは、ただ１種の血清型由来の所望の範囲の抗原を含むこ 10 とができ、または１つ以上の血清型由来の抗原を含むこともできる。血清型２、３および ４型の抗原性ペプチドは、好ましくは本明細書に記載したようなものである。 複数のペプチドを含むポリペプチドを得るためには、個々のコーディング配列を単一の開 放型読み枠に融合させることが好ましい。もちろんこの融合は、各成分ペプチドの抗原活 性がもう１つのペプチドとの位置関係によって顕著に損なわれないように実施されるべき である。特別の関心は、もちろんペプチド間の実際の接合点の配列に払われるべきである 。一般には得られたコーディング配列は、例えば上記のようにリコンビナントペプチドと して発現される。そのような融合ペプチド得る方法は、当該技術分野において既知であり 、ＨＣＶ１型株の複数の抗原を含むリコンビナント融合ポリペプチドの製造は、英国特許 出願公開公報ＧＢ−Ａ２２３９２４５号免疫沈澱反応に開示されている。ペプチド結合物 20 は増幅アッセーおよびＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡにおいて用いることができる。 本発明のペプチドは、ヒトにＨＣＶに対する免疫を誘発するためのワクチン製剤に包含さ せることができる。この目的のために、該ペプチドは医薬的に許容できる担体とともに提 供することができる。 ワ ク チ ン 製 剤 で の 使 用 に は 、 該 ペ プ チ ド は 、 Ｂ 型 肝 炎 コ ア ー 部 分 の 融 合 粒 子 と し て （ Clar kら 、 Nature , 1987, 330, 381-384） ま た は ポ リ リ ジ ン 基 剤 ポ リ マ ー と し て （ Tam, PNAS , 1988, 85 , 5409-5413） 提 供 す る こ と が で き る 。 ま た 別 に 、 該 ペ プ チ ド は 場 合 に よ っ て 、 特定の構造（例えばリポゾームまたはＩＳＣＯＭＳ）に結合させてもよい。 医薬的に許容できる担体は、該ペプチド患者に導入するための賦形剤としての使用に適し た流動性媒体を含む。そのような流動性媒体の例は食塩溶液である。ペプチドは該担体中 30 に溶解されるか、または固形物として懸濁される。 ワクチン製剤はまた、免疫反応を刺激し、それによってワクチンの効果を増強させるため にアジュバントを含むことができる。アジュバントの例は、水酸化アルミニウムおよび燐 酸アルミニウムである。 ワクチン製剤は、０．０１から５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０３から２ｍｇ／ｍｌの範 囲の最終濃度のペプチドを含むことができる。ワクチン製剤は滅菌容器に入れることがで きる。これは、続いて密封され、低温（例えば４℃）で保存、または凍結乾燥してもよい 。 ＨＣＶに対する免疫をヒトに誘発させるために、１用量または２用量以上のワクチン製剤 を投与することができる。各用量は、０．１から２ｍｌ、好ましくは０．２から１ｍｌで ある。ヒトにＨＣＶに対する免疫を誘導する方法は、前記に規定したように有効量のワク チン製剤を投与することを含む。 本発明はまた、ヒトにＨＣＶに対する免疫を誘発するために使用するワクチンの調製にお ける、本明細書で定義したペプチドの使用を提供する。 本発明のワクチンは、ワクチン投与のためにいずれの手頃な方法によっても投与できる。 この方法は、経口および非経口（例えば、静脈内、皮下または筋肉内）注射を含む。この 処置は、単一用量ワクチンまたは一定期間の間の複数用量から成る。 40 (32) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 40 (33) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 40 (34) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 40 (35) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 30 40 (36) JP 3688290 B2 2005.8.24 10 20 配列表（図１および図１ａ） 配列識別番号：１ 配列の種類 ：ヌクレオチドｃＤＮＡ配列 配列の長さ ：１９４塩基対 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶ１∼３型のゲノムＤＮＡ 30 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 ＨＣＶ１∼３型間でｃＤＮＡ配列の変動を示す５’非コード領域の塩基−２５５から−６ ２。 配列表（図３） 配列識別番号：２ 配列の種類 ：推定ペプチド配列 40 配列の長さ ：８５アミノ酸 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶペプチド 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 ＨＣＶ１∼３型間でペプチド配列の変動を示すＮＳ−５領域のアミノ酸２６４８から２７ 50 (37) JP 3688290 B2 2005.8.24 ３２。 配列表（図５） 配列識別番号：３ 配列の種類 ：推定ペプチド配列 配列の長さ ：５７アミノ酸 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶペプチド 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 10 使用目的 ： 寄託 ： 特色 ＨＣＶ１∼３型間でペプチド配列の変動を示すＮＳ−３領域のアミノ酸１５７７から１６ ３３。 配列表（図７） 配列識別番号：４ 配列の種類 ：推定ペプチド配列 配列の長さ ：１２４アミノ酸 鎖の形状 ：一本鎖 20 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶペプチド 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 ＨＣＶ１∼３型間でペプチド配列の変動を示すコアー領域のアミノ酸５から１２８。 配列表（図９ａ） 配列識別番号：５ 30 配列の種類 ：ヌクレオチド配列 配列の長さ ：３６７塩基対 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶゲノムＤＮＡ 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 40 個々の変動および共通配列を示すＮＳ−４領域の塩基４９１１から５２７７。 配列表（図９ｂ） 配列識別番号：６ 配列の種類 ：推定ペプチド配列 配列の長さ ：１２８アミノ酸 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶゲノムＤＮＡ 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 50 (38) JP 3688290 B2 2005.8.24 使用目的 ： 寄託 ： 特色 個々の変動および共通配列を示すＨＣＶ−３のＮＳ−４領域のアミノ酸１６３８から１７ ６５。 配列表（図１０ａおよび１０ｂ） 配列識別番号：７ 配列の種類 ：ペプチド配列 配列の長さ ：９０アミノ酸 鎖の形状 ：一本鎖 10 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶペプチド 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 個々の変動および共通配列を示すＨＣＶ１−３のＮＳ−４領域のアミノ酸１６７９から１ ７６８。 配列表（図１１ａおよび１１ｃ） 20 配列識別番号：８ 配列の種類 ：９−重合ペプチド配列 配列の長さ ：各々９アミノ酸 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：９−重合ＨＣＶペプチド 由来 由来組織 ：合成 使用目的 ：エピトープマッピング 寄託 ： 30 特色 エピトープマッピングに使用したＨＣＶ１−３のＮＳ４領域に該当する９−重合ペプチド 。 配列表（図１３） 配列識別番号：９ 配列の種類 ：ヌクレオチドｃＤＮＡ配列 配列の長さ ：３０、７０および３２塩基対 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ＨＣＶ１型から４型のゲノムＤＮＡ 40 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 ＨＣＶ１型∼４型の５’ＮＣＲ領域の塩基−２４５から−２１６；−１８５から−１１６ ；−１０１から−７０。 配列表（図１５Ａおよび１５Ｂ） 配列識別番号：１０ 配列の種類 ：得られた蛋白配列をもつヌクレオチド 50 (39) JP 3688290 B2 2005.8.24 配列の長さ ：２４０塩基対酸 鎖の形状 ：一本鎖 形態 ：直線状 分子の種類 ：ゲノムＤＮＡ 由来 由来組織 ：ヒト血液サンプル 使用目的 ： 寄託 ： 特色 ＨＣＶ１型∼４型のコアー領域の塩基対２３から２６２およびアミノ酸５から８９。 【図１】 【図１ａ】 10 (40) 【図２】 【図３】 【図４】 【図５】 JP 3688290 B2 2005.8.24 (41) 【図６】 【図７】 【図８】 【図９ａ】 JP 3688290 B2 2005.8.24 (42) 【図９ｂ】 【図１０ａ】 【図１０ｂ】 【図１１ａ】 JP 3688290 B2 2005.8.24 (43) 【図１１ｂ】 【図１１ｃ】 【図１２ａ】 【図１２ｂ】 JP 3688290 B2 2005.8.24 (44) 【図１２ｃ】 【図１３】 【図１４】 【図１５ａ】 JP 3688290 B2 2005.8.24 (45) 【図１５ｂ】 【図１７】 【図１６】 JP 3688290 B2 2005.8.24 (46) JP 3688290 B2 2005.8.24 フロントページの続き (74)代理人 100084009 弁理士 小川 信夫 (74)代理人 100082821 弁理士 村社 厚夫 (74)代理人 100084663 弁理士 箱田 篤 (72)発明者 シモンズ ピーター イギリス エディンバラ イーエイチ３ ９エルエル グレンガイル テラス １ (72)発明者 チャン シュイ ワン イギリス エディンバラ キルモールス ロード １０ (72)発明者 ヤップ ペン リー イギリス エディンバラ イーエイチ９ １ジェイゼット メドー プレイス ５ 審査官 高堀 栄二 (56)参考文献 国際公開第９１／０１４７７９（ＷＯ，Ａ１） 国際公開第９１／０１５５７４（ＷＯ，Ａ１） 英国特許出願公開第０２２３９２４５（ＧＢ，Ａ） 国際公開第９０／０１１０８９（ＷＯ，Ａ１） 欧州特許出願公開第００４４５８０１（ＥＰ，Ａ１） 特開平０３−１９０８９８（ＪＰ，Ａ） 欧州特許出願公開第００４４５４２３（ＥＰ，Ａ１） 特開平０４−１５９２９８（ＪＰ，Ａ） 特開平０５−２２２０９４（ＪＰ，Ａ） 特開平０４−３３００９８（ＪＰ，Ａ） 7 (58)調査した分野(Int.Cl. ，ＤＢ名) CA(STN) REGISTRY(STN) SwissProt/PIR/GeneSeq GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq BIOSIS/WPI(DIALOG) PubMed