3E-P-07 - タカラバイオ株式会社

LC/MS/MS測定におけるキャリーオーバー微小なオートサンプラーの開発 −洗浄方法の改良−
3E-P-07
タカラバイオ株式会社1・エーエムアール株式会社2・CTC Analytics AG3
○渡辺 淳1・比毛 浩2・小暮 佳史1・Hansjoerg Cueni3・板東 泰彦2
INTRODUCTION
TEST CONDITION
高感度化するLC/MS/MS分析においてオートサンプラーの連続分析の際
のキャリーオーバーを低減させることは測定の信頼性の向上および測定の
ハイスループット化に大きく貢献する。今回、CTC社製オートサンプラー
HTC-PALの洗浄ポートその他に改良を行い、LC/MS/MS分析でのキャ
リーオーバー試験を行った。
RESEULTS AND DISCUSSION
HPLC & MASS Method
Results of Carry Over Test 1
以下の測定条件で検討を行った。
Sample Name: "Pre Blank" Sample ID: "" File: "Reserpine X S...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Mass Detector ：API 5000™ (Applied Biosystems/MDS Sciex)
：Agilent 1100 Binary Pump
Mode
：Isocratic
200
Sample Name: "100ng/ml" Sample ID: "" File: "Reserpine X S...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
4.0e6
4.5e5
10 ng/ml
4.0e5
100 ng/ml
3.5e6
3.0e6
3.5e4
3.5e5
3.0e4
Intensity, cps
250
2.5e4
2.0e4
2.5e6
3.0e5
2.5e5
2.0e5
150
1.5e4
1.5e5
100
1.0e4
1.0e5
50
5000.0
5.0e4
2.0e6
1.5e6
Sample Name: "1000ng/ml" Sample ID: "" File: "Ibuprofen.wiff"
Peak Name: "Ibprofen" Mass(es): "205.2/161.1 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Sample Index:
5
Sample Type:
Standard
2.9e6
Concentration:
1000.
ng/mL
Calculated Conc:
999.
ng/mL
2.8e6
Acq. Date:
2/7/2006
Acq. Time:
11:03:03 AM
2.7e6
1.0e6
Wash1 solvent ：ACN：IPA= 8：2
Wash2 solvent ：MP solvent
0
2
4
6
0.0
8
Time, min
Sample Name: "Blank1" Sample ID: "" File: "Reserpine X Syri...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Dilutor solvent ：ACN containing 1% Formic acid
2
4
6
0.0
8
Time, min
Sample Name: "Blank2" Sample ID: "" File: "Reserpine X Syri...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
1100
4
6
8
Time, min
Ibuprofen:
CTC New Wash & Side Port
Syringe with New Needle
450
900
600
Column Temperature：Ambient
500
Carry Over
0.0216%
300
1.7e6
1.6e6
Chlorhexidine
MS condition
Positive ESI
Q1/Q3=609/195
Negative ESI
Q1/Q3=205/161
Positive ESI
Q1/Q3=505/336
Sample Concentration
1, 10, 100 ng/ml
10, 100, 1000 ng/ml
5, 50, 500 ng/ml
250
200
Column
Cadenza C18 2x50mm
Unison C18 2x50mm
350
300
8.0e5
250
250
7.0e5
6.0e5
200
5.0e5
200
150
150
100
2.0e5
50
1.0e5
100
100
0.0
2
4
6
0
8
2
4
Time, min
50
2
4
6
0
8
2
4
Time, min
6
0
8
2
Time, min
4
6
Time, min
8
Figure 4. Representative chromatograms; Reserpine ( Standard Wash & X-type Syringe)
Table 4. Results of Carry Over Test 1
0.1% Formic Acid：ACN
= 85 ： 15
Wash System
Unison C18 2x100mm
Syringe
6
8
Time, min
50
Standard Wash
Dilutor Wash
Chlorhexidine:
CTC New Wash & Side Port
Syringe with New Needle
Sample Name: "500ng/ml" Sample ID: "" File: "C hlorhexidine.wiff"
Peak Name: "Chlorhexidine" Mass(es): "505.3/336.3 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Sample Index:
14
Sample Type:
Standard
1.10e6
Concentration:
0.00
ng/mL
Calculated Conc:
0.00
ng/mL
1.05e6
Acq. Date:
2/10/2006
Acq. Time:
11:41:52 AM
Sample Name: "Blank1" Sample ID: "" File: "Chlorhexidine.wiff"
Peak Name: "C hlorhexidine" Mass(es): "505.3/336.3 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Sample Index:
15
500
Sample Type:
Blank
500 ng/ml
Modified:
Yes
Proc. Algorithm: Analyst Classic
Bunching Factor:
25
Noise Threshold:
1.10
cps
Area Threshold:
5.49
cps
,Num. Smooths:
10
Sep. Width:
0.00
Sep. Height:
0.01
Exp. Peak Ratio:
5.00
Exp. Adj. Ratio:
4.00
Exp. Val. Ratio:
3.00
RT Window:
30.0
sec
Expected RT:
3.73
min
Use Relative RT:
No
1.00e6
Int. Type:
Base To Base
Retention Time:
3.68
min
Area:
10084250
counts
Height:
1116968 cps
Start Time:
3.27
min
End Time:
8.99
min
7.00e5
CTC New Wash
Blank1
Concentration:
0.00
ng/mL
Calculated Conc:
N/A
Acq. Date:
2/10/2006
Acq. Time:
11:52:36 AM
9.00e5
8.50e5
8.00e5
7.50e5
Int. Type:
Retention Time:
Area:
Height:
Start Time:
End Time:
6.50e5
6.00e5
5.50e5
5.00e5
X-type Syringe
Side Port Syringe
440
420
Carry Over
Not Detected!!
400
380
360
340
320
Base To Base
3.76
min
106
counts
16 cps
3.60
min
3.81
min
300
280
260
240
220
4.50e5
Normal Syringe
480
460
Modified:
No
Proc. Algorithm: Analyst Classic
Bunching Factor:
1
Noise Threshold:
1.10
cps
Area Threshold:
5.49
cps
,Num. Smooths:
10
Sep. Width:
0.20
Sep. Height:
0.01
Exp. Peak Ratio:
5.00
Exp. Adj. Ratio:
4.00
Exp. Val. Ratio:
3.00
RT Window:
30.0
sec
Expected RT:
3.73
min
Use Relative RT:
No
9.50e5
Intensity, cps
0.1% Formic Acid：ACN 10mM AcONH4：ACN
= 85 ： 15
=7：3
500
450
400
9.0e5
Intensity, cps
Sample’s solvent
0
550
1.0e6
300
150
200
Ibuprofen
600
1.3e6
3.0e5
100
Reserpine
700
1.5e6
1.4e6
1.2e6
300
Sample
800
750
Base To Base
1.85
min
222
counts
30 cps
1.72
min
1.91
min
4.0e5
400
Table 1. Test conditions of various compounds
850
650
Int. Type:
Retention Time:
Area:
Height:
Start Time:
End Time:
1.8e6
350
Intensity, cps
なお、質量分析装置には、定量分野において最高感度機種である三連四
重極型質量分析装置API 5000™を用いた。
700
Carry Over
Not Detected!!
1.1e6
Intensity, cps
また、シリンジ、ニードルについても以下のもので比較を行った。
１）スタンダードシリンジ（標準仕様／サイドポート仕様）
２）X-typeシリンジ；シリンジ内面、ニードル内外面を不活性処理するこ
とで、吸着を低減させるキャリーオーバー対策を施した。
３）New Needle；ニードル内容量を大きく（20ul）することでサンプル
の吸引をニードル部分までに抑え、ガラスに対する吸着をなくした。また、
ニードル内外面を研磨することで、ニードルに対する吸着を低減させる
キャリーオーバー対策を施した。
：10ul
Injection volume
350
800
2.1e6
2.0e6
1.9e6
Blank3
400
2.3e6
2.2e6
Int. Type:
Base To Base
Retention Time:
1.87
min
Area:
17908610
counts
Height:
2922097 cps
Start Time:
1.44
min
End Time:
5.01
min
900
Modified:
No
Proc. Algorithm: Analyst Classic
Bunching Factor:
2
Noise Threshold:
2.79
cps
Area Threshold:
13.94
cps
,Num. Smooths:
10
Sep. Width:
0.00
Sep. Height:
0.01
Exp. Peak Ratio:
5.00
Exp. Adj. Ratio:
4.00
Exp. Val. Ratio:
3.00
RT Window:
30.0
sec
Expected RT:
1.89
min
Use Relative RT:
No
2.5e6
2.4e6
Intensity, cps
Blank2
400
Blank1
2.6e6
Modified:
Yes
Proc. Algorithm: Analyst Classic
Bunching Factor:
17
Noise Threshold:
2.79
cps
Area Threshold:
13.94
cps
,Num. Smooths:
10
Sep. Width:
0.00
Sep. Height:
0.01
Exp. Peak Ratio:
5.00
Exp. Adj. Ratio:
4.00
Exp. Val. Ratio:
3.00
RT Window:
30.0
sec
Expected RT:
1.89
min
Use Relative RT:
No
Intensity, cps
Blank1
2
500
450
1000
0.0
2
Sample Name: "Blank1" Sample ID: "" File: "Ibuprofen.wiff"
Peak Name: "Ibprofen" Mass(es): "205.2/161.1 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Sample Index:
6
1000
Sample Type:
Blank
Concentration:
0.00
ng/mL
Calculated Conc:
N/A
950
Acq. Date:
2/7/2006
Acq. Time:
11:13:47 AM
1000 ng/ml
5.0e5
4
6
8
Time, min
Sample Name: "Blank3" Sample ID: "" File: "Reserpine X Syri...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
500
：Reserpine, Ibuprofen, Chlorhexidine
Sample
4.0e4
350
200 or 250 ul/min
5.0e5
1 ng/ml
Intensity, cps
Pump
300
Sample Name: "10ng/ml" Sample ID: "" File: "Reserpine X Syr...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
4.5e4
Pre Blank
Intensity, cps
：HTC-PAL (CTC Analytics)
Sample Name: "1ng/ml" Sample ID: "" File: "Reserpine X Syri...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
5.0e4
450
400
Autosampler
試験は以下の3方法を比較しておこなった。
１）従来通りの装置；2種類の洗浄液を用いてシリンジを上下させ洗浄を
行う方法
２）ダイリューター仕様；１）に加え、ダイリューターを用いて注入ポー
トにおいてシリンジ内部を洗浄する方法
３）新たにデザインされた洗浄用のポートと洗浄用ソレノイドバルブを注
入ポートに接続する方法
500
200
4.00e5
180
3.50e5
160
140
3.00e5
120
2.50e5
Mobile Phase
W1
0.1% Formic Acid：ACN 10mM AcONH4：ACN
=5：5
=5：5
W2
Reserpine
0.1% Formic Acid：ACN
=5：5
100
2.00e5
80
1.50e5
60
1.00e5
Blank1
0.0633%
0.0216%
0.0561%
0.0678%
40
5.00e4
0.00
20
2
4
6
8
0
2
4
Time, min
MP
HTC-PAL
Pump
Isocratic
HP1100
Flow:200uL/min
Injection Programs of HTC-PAL
HTC-PALでの注入は以下のプログラムにて行った。
Table 2. Injection programs of HTC PAL tested
CTC New Wash
Figure 1. HTC-PAL & API 5000™ LC/MS/MS System
2. Dilutor Wash
Injection &
Valve Wash
3. CTC New Wash
Standard
Wash Station
Dilutor
Wash Station
Standard Syringe Side Port Syringe
or
or
X-type Syringe
Side Port Syringe
with New Needle
1
Inside Syringe Wash
Syringe Aspiration W2
Syringe Aspiration W2
Syringe Aspiration W2
Syringe Aspiration W2
2
Sample Sandwich
Aspiration
Syringe Aspiration W2
+ Air + Sample + Air
Syringe Aspiration W2
+ Air + Sample + Air
Syringe Aspiration W2
+ Air + Sample + Air
Syringe Aspiration W2
+ Air + Sample + Air
3
Outside Needle Wash
Pump W1+ W2
Pump W1+ W2
Pump W1+ W2
(Valve & loop Clean)
Pump W1+ W2
(Valve & loop Clean)
4
Injection
Injection
Injection
Injection
Injection
5
Valve Wash
-----
-----
Pump W1
Pump W1
6
Syringe Wash 1
Syringe Aspiration
W1 + W2
Syringe Aspiration W1
Syringe Aspiration W1
Syringe Aspiration W1
7
Syringe Wash 2
-----
-----
-----
Pump W1 (Side Port)
8
Valve Wash 1
Syringe Aspiration
W1 + W2
Dilutor Wash
-----
Pump W1+ W2
(Side Port)
9
Valve Wash 2
-----
Syringe Aspiration W2
Pump W1+ W2
Pump W1+ W2
* W1: Wash1, W2: Wash2
Solenoi
d Valve
Injection port
Injection &
Valve Wash
Dilutor bottle
Waste
0.00314%
0.00882%
0.0123%
Blank1
0.0296%
0.207%
0.0311%
0.0214%
Blank2
0.00613%
0.0536%
0.00404%
0.00460%
Blank3
0.00280%
0.0280%
0.00298%
0.00371%
Reserpine
Ibuprofen
Chlorhexidine
Blank
0.000384%
0.00102%
0.000402%
Standard1
0.975%
1.07%
0.985%
Standard2
10.0%
10.0%
10.0%
Standard3
90.9%
78.9%
67.7%
Blank1
0.000568%
0.000978%
0.000714%
Pump W1
Standard Washで行う洗浄、注入を同じ注入
ポートで行う。
洗浄液はポンプで送液し、また、サイドポート
シリンジを使用し、シリンジ上部から洗浄液を
通液するため、洗浄効果が期待される。
Injection Cycle
最初にBlankを測定し、ピークが出ないことを確認し、次に、３濃度の
サンプルを低濃度から測定し、最高濃度サンプルの次にBlank（=Blank1）
を測定する。
Calculation of Carry Over (%)
Blank1のピーク面積の、最高濃度サンプルのピーク面積に対する比率を
Carry Over（%）として算出した。
Sample Name: "1ng/ml" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff"
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Pre Blank
Figure 3. HTC-PAL syringes and needles tested
Injection #
Sample
Area
Carry Over (%)
0
Pre Blank
---
---
1
1 ng/ml
a
---
2
10 ng/ml
b
---
3
100 ng/ml
c
---
4
Blank1
B1
(B1／c)×100
5
Blank2
B2
(B2／c)×100
6
Blank3
B3
(B3／c)×100
Ibuprofen、Chlorhexidineにつ
いても同様で、最高濃度サンプ
ルでは検出上限（ダイナミック
レンジ）以上であったため、同
様に算出した。
0.000176%
0.000349%
0.000906%
0.000528%
Standard1, 2, 3: 1ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml (Reserpine)
10ng/ml, 100ng/ml, 1000ng/ml (Ibuprofen)
5ng/ml, 50ng/ml, 500ng/ml (Chlorhexidine)
Sample Name: "100ng/ml" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
3.5e6
4.0e5
1 ng/ml
3.5e4
350
10 ng/ml
3.5e5
3.0e4
3.0e5
2.5e4
2.5e5
250
200
2.0e4
100 ng/ml
3.0e6
2.5e6
2.0e5
1.5e4
1.5e5
1.0e4
1.0e5
5000.0
5.0e4
150
2.0e6
1.5e6
1.0e6
100
50
0
2
4
6
0.0
8
Time, min
Sample Name: "Blank1" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff"
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
2
4
6
0.0
8
Time, min
Sample Name: "Blank2" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff"
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
500
500
450
Carry Over
Not Detected!!
250
200
350
300
300
250
200
150
150
100
100
50
50
6
Time, min
8
0
6
8
Time, min
2
4
6
8
CONCLUSION
200
50
4
4
250
100
2
2
Blank3
400
350
150
0
0.0
450
Blank2
400
300
2
#4 Wash SystemにCTC New Wash、SyringeにNew NeedleのSide Port
Syringeを使用して測定した結果、Reserpine、Ibuprofen、Chlorhexidine
いずれの結果においても、Blank1で0.001%以下のキャリーオーバー率を
達成した。
#5 これらのキャリーオーバー率は、Pre Blankの数値と比較し、同等の数
値であることから、実質、キャリーオーバーがなかった、検出下限以下で
あった、と判断できる。
#6 ニードルの変更によりキャリーオーバーが激減したことから、キャ
リーオーバーの原因が、1)シリンジガラス面への吸着、2)ニードルへの吸
着、であったと推測される。
500
450
Blank1
400
5.0e5
4
6
8
Time, min
Sample Name: "Blank3" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff"
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Intensity, cps
Side Port
Syringe
Table 3. Calculation of Carry Over (%)
Example for Reserpine
0.000476%
0.000465%
* Wash System: CTC New Wash
Syringe: Side Port Syringe & New Needle
4.5e5
Intensity, cps
【シリンジ】
標準のシリンジ（Standard Syringe）に対して、
X-typeシリンジは、形状は同じであるが、シリ
ンジ内面の不活性化処理、ニードル内外面の研
磨、不活性化処理などを施している。サイド
ポートシリンジは、シリンジ上部に２箇所注入
ポートがあり、ここから洗浄液の送液が可能。
【ニードル】
標準のニードル（Standard Needle）に対して、
New Needleは、ニードルの径を大きくするこ
とでニードルにボリュームを持たせ（約20ul）、
また、ニードル内外面の研磨を施した。
Standard
New
Needle Needle
Sample Name: "10ng/ml" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff"
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
4.0e4
350
実際には、100ng/mlは、API
5000では濃度の検出上限（ダイ
ナミックレンジ）以上であった
ため、10ng/mlの面積値の10倍
のピーク面積が出ていると想定
し、その値に対してCarry Over
（%）を算出した。つまり、
(B1／b×10)×100により算出し
た。
Blank2
Blank3
Results of Carry Over Test 2
Sample Name: "Pre Blank" Sample ID: "" File: "Reserpine.wiff...
Peak Name: "Reserpine" Mass(es): "609.3/195.2 amu"
Comment: "" Annotation: ""
Intensity, cps
W1 Bottle
Injection Cycle & Calculation of Carry Over (%)
Figure 2. HTC-PAL wash systems tested
X-type
Syringe
8
Table 5. Results of Carry Over Test 2
#2 Dilutor WashとCTC New Washで大きな差が見られなかった。このこ
とから、CTC New Washの洗浄効果はDilutor Washと同等であると考えら
れる。また、Standard WashとDilutor Washについても差があまりなかっ
た。このことから、Reserpine、Ibuprofenについては、Dilutor液の洗浄に
よる効果があまりなかったと考えられる。
Intensity, cps
Pump W2
W2 Bottle
Standard
Syringe
6
Time, min
Figure 5. Results of Ibuprofen and Chlorhexidine
with CTC New Wash & Side Port Syringe with New Needle
300
W1 Bottle
Standard Washで行う洗浄に加え、
Dilutorからの洗浄を行う。
サイドポートシリンジを使用し、
シリンジ上部から洗浄液を通液す
ることで洗浄効果が期待される。
0.0101%
450
Injection
Valve
Injection
Valve
W2 Bottle
Wash Station 1, 2の洗浄
液を用いて、シリンジの
洗浄、注入ポート（バル
ブ）の洗浄を行う。
Blank3
500
Wash Port
Waste
W1 Bottle
W2 Bottle
0.0257%
Intensity, cps
F Wash station
0.0179%
#1 Reserpineにおいては、X-type Syringeを使用することで、通常のシリ
ンジと比べ、1/3のキャリーオーバー低減効果が得られた。しかし、
Ibuprofenでは、X-type Syringeにおいて通常のシリンジより6倍程度キャ
リーオーバー率が大きくなった。この結果から、X-type Syringeは化合物
の特性にキャリーオーバー効果が左右されると考えられる。
400
Injection
Valve
F Wash station
0.00586%
New Wash Station
API5000™
1. Standard Wash
0.0208%
Ibuprofen
Column
Dilutor Wash
Blank2
0
2
Time, min
4
6
Time, min
8
Figure 5. Results of Reserpine with CTC New Wash & Side Port Syringe with New Needle
#3 Wash SystemにCTC New Wash、SyringeにNew NeedleのSide Port
Syringeを使用して測定した結果、Reserpineにおいて、Blank1で0.001%
以下のキャリーオーバー率を達成した。実質ピークが検出されておらず、
キャリーオーバーが検出下限以下であったと考えられる。
他の化合物についても同様に測定を行った。
・ CTC社により開発された新しいWash方式（CTC New Wash）は、従来
のDilutor Washと同等の洗浄効果が得られた。
・ CTC New Washは注入ポートとWashポートが隣接していることから、
複雑な洗浄工程を実行する場合にも、注入までの動作時間を１分程度
に抑えることが可能であった。
・ シリンジニードルに対して、ニードル内容量を大きく（20ul）する、シ
リンジ内外面を研磨する、という改良を施すことで、定量の最高感度
機種API5000においてもキャリーオーバーを検出限界以下に抑えること
ができた。
・ シリンジニードルの改良によりキャリーオーバーを解消することがで
きたことから、従来のキャリーオーバーの原因がシリンジ部分（ニー
ドルまたはガラス内面）であったことが分かった。