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定量分析の試験室間共同試験の 設計と解析のポイント 目 次
食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 定量分析の試験室間共同試験の 設計と解析のポイント （独）食品総合研究所 内藤成弘 目 次 • ガイドラインの紹介 • AOAC Int. ガイドラインのポイント紹介 • 配付試料の均一性確認テスト • GMO定量分析法の妥当性確認で 実際に問題になった点 • 付録 2 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 試験室間共同試験のガイドライン Harmonized protocol -- AOAC Int., ISO, IUPAC 1)AOAC Int. (2003). Appendix D: Guidelines for Collaborative Study Procedures to Validate Characteristics of a Method of Analysis. In Official Methods of Analysis of AOAC Int. 17 ed. volume II, Gaithersburg, MD,USA. 2)ISO 5725-1∼5725-6 (6分冊): 1994 or 1998 年刊 5725-2： 1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. JIS Z 8402-1∼６：1999年刊 （ISO 5725に対応） 3)Horwitz, W. (1995). Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies. Pure & Appl. Chem., 67(2), 331-343. 3 定量分析法を用いた試験室間共同試験に関する国際的ガイドラインにはAOAC International, ISO, International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC, 国 際純正・応用化学連合)の三者が合意したHarmonized protocolがある。 三者の中でAOAC Internationalのガイドラインが最も新しいため、ここではこのガイド ラインを中心に紹介する。 AOAC InternationalのガイドラインにはHarmonized protocolではないことを明記した上で、定性分析法の試験室間共同試験についても部 分的に記載されている。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 試験室間共同試験の目的 • 数ある試験室の中の１試験室が１回分析したときの分析誤 差 S R2 = S L2 + S r2 の推定が主目的 • 参加試験室は多数の試験室の代表 • １試験室では室内変動（併行分析）の誤差しか求まらない 分析値＝真値＋室間変動＋室内変動 mが 推定値 m Sr SL 0 0 4 ある１カ所の試験室に試料の分析を依頼し、１回分析してもらったときの分析値の誤 差の代表的な値を知るために試験室間共同試験を行う。 試験室は一定の分析レベル以上の試験室の代表として参加するため、新しい分析法 については参加試験室の分析値のばらつきが一定の目標値以下になるように習熟した 後に試験室間共同試験を実施する。 化学分析値についての併行標準偏差Sr は室間再現標準偏差SRの1/2∼2/3程度と 言われている （Horwitz et al., 1980）。 参考文献 Horwitz, W., Kamps, L.R. and Boyer, K.W. (1980). Quality control. Quality assurance in the analysis of foods for trace constituents. J. AOAC, 63(6), 1344-1354. National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 設計上の必要最低条件 ｰ 定量分析 ｰ • 材料数 ：5以上 例外：３以上（１マトリックス１濃度） • 試験室数：８以上（外れ値として除去され 参加試験室数 の2/9以下 ない有効なラボ数） （付録１参照） 例外：5以上（高額機器、専門ラボ） • 各試験室の反復数：2 基本的に ・ Youdenペア（濃度差5%以内） ・乱数でコード化した 非明示の２反復試料 5 一つの材料(material)とは、一つのマトリックス（分析対象成分と共存する他の成分 ） における、ある一濃度の一成分のことである。 得られる情報の精度とコストのバランスを考えたときの最適試験室数は8∼10（valid data）であるが、これ以上の試験室数が認められない訳ではない。 一般的には１試験室１分析者である。試薬・検量線作成・カラムなどを独立に準備しな ければ、同じ試験室の２人の分析者を２試験室の代わりにすることは一般的にはできな い。同じ組織内の異なる試験室は、各々が分析機器、試薬などを所有して独立に運営 されているならば、別々の試験室として参加できる。 一般的には試験室内の反復誤差よりも試験室間の誤差の方が大きいため、各試験室 の反復数を３回以上にして試験室内の反復誤差の測定精度を高くするよりは、試験す る濃度および／またはマトリックスを増やす方が有効である。 試験室内の反復誤差は内部精度管理データで既知な場合などに、各試験室の反復 数を１回にして室間再現標準偏差SRのみを求める試験室間共同試験をHarmonized protocolでは認めている。 この場合には各試験室の分析値から計算した不偏標準偏差 が室間再現標準偏差SRに一致する。 反復測定する場合に用いる試料に関する試験室間共同試験のHarmonized protocol推奨順位は以下の通りである。 1) Split level (Youdenペア)、2)試験の一部はYoudenペアの試料であり、他は非明示 の２反復試料、3)乱数でコード化した非明示の２反復試料 4)独立した材料、5)明示した反復、６)品質管理用の材料 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 実施上のポイント ｰ 定量分析 ｰ • 試料番号 ：乱数を使用 • 試験量：プロトコルに定めた必要量 余分な量は 配付しない 注）共同試験では１試料１回分析だが、 均一性の確認テストでは１試料２回分析 するだけの試料量が必要 • 配付試料の均一性確認 • 分析データ（生データ）、検量線データを報告してもらう 添加回収試験データあれば提出してもらう • プロトコルからの逸脱点は全て報告してもらう 6 試験室に配付する試料数を多く調製しておき、その中からランダムに10個以上の試料 を抜き取り、各試料を2回併行分析して均一性を確認する（スライド14参照）ため、配付 試料と均一性確認テストの試料は同一である。したがって、試験室への配付試料の量 は２回併行分析が可能な最小の量である（スライド18参照）。 プロトコルで定めた試料量の半分の量でも同程度の精度で定量可能な場合は、均一 性確認テストの試料量はプロトコルで定めた試料量の半分でも良い。 配付試料の均一性の確認テストの具体的な方法は、試験室間共同試験の Harmonized protocolに記載されていない。均一性確認テストの国際的ガイドラインとし ては、技能試験に関するHarmonized protocol又はAOAC Int.のガイドラインが参考に なる。 均一性テストの参考文献 Thompson, M.. and Wood, R. (1993). International Harmonized Protocol for Proficiency Testing of (Chemical) Analytical Laboratories. J. AOAC Int., 76(4), 926-940. Thompson, M.. and Wood, R. (1993). The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of (Chemical) Analytical Laboratories. Pure & Appl. Chem., 65(9), 2123-2144. AOAC Int. (2002). OMA Program Manual Appendix E. A Statistical Model to Evaluate Analyte Homogeneity for a Material. http://www.aoac.org/vmeth/Manual_App_E.pdf National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 解析するデータ構造 SL 試験室１ 試験室２ ・・・ 試験室Ｌ 測定値１ x11 x21 ・・・ xL1 測定値２ x12 x22 ・・・ xL 2 和 T1 T2 ・・・ TL 差 d1 d2 ・・・ dL Sr 和と差からSr とSRを計算 する方法を ガイドライン では説明 （付録２参照） 注）Youdenペアと非明示の２反復試料で計算式異なる 7 定量分析法の試験室間共同試験で各試験室から集まるデータは、列方向に試験室、 行方向に併行分析の測定値を配置すると、２回併行分析した場合には2行L列のデータ になる。 列方向の測定値の変動からSL（スライド4参照）を、行方向の測定値の変動からSrを求 め、室間再現標準偏差SRはSLの２乗とSrの2乗の和の平方根として求める。 試験室間共同試験のHarmonized protocolでは、測定値１と測定値2の和Tiと差diか らSRとSrを計算する方法を説明している。Youdenペアと非明示の2反復試料では測定 値の数は同じ２個だが、差diを用いてSrを計算する式が付録2に示すように異なる点は 注意が必要である。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 グラフによるデータチェック Youdenの２試料プロット 試料1の分析値 試料2の分析値 6 試料Yの 分析値 分析値 １２ １５ １０ 5 １ 4 3 2 総平均値 1 ４ ８ ５ １３ １４ ３ ９ ２ ７ １１ ６ 0 試料Xの 分析値 -1 -2 -3 3 13 9 14 8 7 4 11 2 10 5 15 6 12 1 試験室 8 データ解析の初めにグラフを作成して測定値の様子を視覚的に確認することは非常 に重要であり必須の作業である。例えば、相関係数だけで２変数の関連具合を判断す るのは危険であり、相関プロットによる確認が必要である。 試験室間共同試験のHarmonized protocolに記載されている2種類のデータチェック 用グラフについて説明する。 Youdenの2試料プロットは、 １個目の分析値の平均値と2個目の分析値の平均値を 原点に取り、各試験室の1個目の分析値と1個目の分析値の平均値との差を横軸に、2 個目の分析値と2個目の分析値の平均値との差を縦軸に取ったプロットである。分析値 が偶然誤差（室内誤差）を主要因にしてばらついていれば、プロットは原点周りにランダ ムに現れるため縦軸と横軸で区切られた４区分にはほぼ等しい数のプロットが存在する。 原点周りのプロットの範囲が狭ければ偶然誤差は小さいことを意味する。原点を通る右 斜め45度の直線に近いプロットは室内再現性が高い（室内誤差が小さい）ことを意味す るが、原点からの距離が遠いプロットはその試験室にバイアスが存在することを示す。 Youdenの2試料プロットにより外れ値になりそうな試験室の有無、偶然誤差のおおまか な大きさを簡単に把握することができる。 右側のグラフは、各試験室の分析値の平均値が小さい順に試験室を左側から並べ、 縦軸には各試験室の２個の分析値をプロットした折れ線グラフである。総平均値から大 きく離れた試験室の有無、２個の分析値の差が他の試験室と大きく異なる試験室の有 無を簡単に把握することができる。 これらのプロットを確認した上で外れ値検定を行えば、外れ値検定にミスがないかも判 断しやすくなる。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 外れ値なくなる まで繰り返し 食品総合研究所 2005年9月14日版 データ解析上のポイント • 外れ値検定 Cochran検定 （各試験室の分散等しいか検定） （付録１参照） Grubbs検定 （試験室毎の平均値の中の 外れ値検出） Single- and paired一元分散分析で計算可 • 併行標準偏差（repeatability standard deviation）Srの計算 • 室間再現標準偏差（reproducibility standard deviation）SR の計算 化学分析値のSRはSrの1.5倍∼２倍かチェックする （付録２参照） • 最終的な平均値および標準偏差は、計算機または コンピュータで直接計算する。計算途中で四捨五入、 切り上げ切り下げのような丸めを行わない。 9 データ解析手順 1)最初に異常値（プロトコルからの逸脱など明らかな理由のあるデータ）を取り除く。 2)次に外れ値検定により外れ値を検出する。外れ値検定の流れは付録１参照。 3)外れ値を除いた残りのデータで報告書に記載する精度指標を計算する。 併行標準偏差Srと室間再現標準偏差SRは付録2に示す計算式で計算できる。 また、Excelの一元分散分析でも同じ計算結果を得ることができる。 Sr =Excelの一元分散分析表の「グループ内分散」の平方根。 SR= Excelの一元分散分析表の ｛（「グループ間の分散」−「グループ内の分散」）/r＋ 「グループ内の分散」｝ の平方根。 ただし、 SR の上式中のrは１試験室当たりの併行分析回数である。 参考文献 Cochran, W.G. (1941). The distribution of the largest of a set of estimated variances as a fraction of their total. Annals of Eugenics, 11, 47-52. Grubbs, F.E. (1950). Sample criteria for testing outlying observations. Ann. Math. Statist. Assn., 21, 27-58. National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 データ解析上のポイントその２ • 化学分析値はHORRAT(Horwitz Ratio)の計算 RSDR ,% HORRAT = PRSDR ,% 室間再現相対標準偏差 （実験値） 濃度のみで決まる室間再現相対標準 偏差の経験則の値（Horwitzの式） 相対標準偏差（又は変動係数）=標準偏差／平均値×100 (%) （付録３参照） • Youdenペアは、試料Xと試料Yの分散が等しいか Pitman検定行ってから一元分散分析の計算する。 10 HORRATとは化学分析値について、試験室間共同試験データから求めた室間再現 相対標準偏差RSDR（Reproducibility Relative Standard Deviation）とHorwitzの式で 求めた室間再現相対標準偏差PRSDR（Predicted Reproducibility Relative Standard Deviation）の比である。AOAC Int.ではHORRATが0.5∼2を許容範囲と設定しており、 1.5以上については報告書の中で考察することを要求している。 つまり、過去の化学分析値の経験則から求めたPRSDRと比べて、実験で得られた RSDR が小さすぎても大きすぎても実験に何か問題がなかったか検討する方が良いこと を意味している。 相対標準偏差（変動係数ともいう）は分析値の精度指標として広く用いられている。 ・ HORRATの対象になる分析法 多くの化学分析法 ・ HORRATの対象外の分析法 1)物理特性値 粘度、屈折率、密度、pH、吸光度など 2)経験的分析法（empirical methods） 例えば、食物繊維、酵素、水分、またはポリマーのように分子量不定なものの分析法 3)品質測定（”Qualty” measurement、品質の善し悪しを判定する測定法） 例えば、固形物重量（drained weight） 参考文献 Pitman, E.J.G. (1939). A note on normal correlation. Biometrika, 31, 9-12. National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 Horwitzの式 50件以 上の共同 試験の結 果を解析 実際に はこの 式が用 られて いる 食品総合研究所 2005年9月14日版 J. AOAC, 63, 1344-1354 (1980) 1−0.5log10 C RSDR ,% = 2 濃度 C : a(%)のとき C =a×10-2 a(ppm)のとき C =a×10-6 Horwitzの式の近似式 RSDR , % = 2C −0.15 RSDR ,% = σ R C ×100 σ R = 0.02C 0.8495 11 Horwitzの近似式から変形して求めたσRの式は、配付試料の均一性の確認で利用さ れる場合がある（スライド16及び17のσpとしてσRを利用）。 参考文献 Horwitz, W., Kamps, L.R. and Boyer, K.W. (1980). Quality control. Quality assurance in the analysis foods for trace constituents. J. AOAC, 63, 13441354. Horwitz, W., Albert, R., Deutsch, M.J. and Thompson, J.N. (1990). Precision parameters of methods of analysis required for nutrition labeling. part I. J. AOAC, 73, 661-680. Horwitz, W. and Albert, R. (1996). Reliability of the determinations of polychlorinated contaminants (biphenyls, dioxins, furans), J. AOAC, Int., 79, 589-621. Thompson, M. (2000). Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, 125, 385-386. McClure, F.D. and Lee, J-K (2003). Computation of HORRAT Values. J. AOAC Int., 86, 1056-1058. Horwitz, W. and Albert, R. (2004). Letters to the editor. J. AOAC Int., 87(2), 34A. McClure, F.D. and Lee, J-K (2004). Letters to the editor. J. AOAC Int., 87(2), 35A-40A. National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 報告書作成時のポイント • 標準偏差の有効数字は２桁にする。 • 参加試験室はブランクの値を含め、事前説明がない限り、平 均をとるなどの加工をしない生データを報告する。 • ブランクの値が試料の値より大きい場合は、ゼロではなく負 の値を報告する。 • 「トレース（trace）」、「未満(less than)」の表現は共同試験実 施責任者の指示に従う。 ただし、言葉を用いた報告は統計処理で扱えないため避ける べきである。 • 例え定量下限以下の場合でも実際に得られた値を報告する。 12 計算に関する注意点 1)参加試験室の分析値を用いて報告のための最終的な平均値および標準偏差を 計算するときは、計算途中で四捨五入、切り上げ切り下げのような丸めを行わず、 計算機またはコンピュータで直接計算する。 2)1)で得られた標準偏差の有効数字は２桁にする。 3)平均値は標準偏差の表示に合わせる。 例えば、SR=0.012ならば平均濃度は0.147、RSDR=0.012/0.147×100=8.2（%）と報 告する。平均濃度を0.1473あるいは0.15としてはならない。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 報告書に記載すべき事項 1)材料（濃度の昇順に記載） 10)室間再現標準偏差（sR ） 2)外れ値検定の後に残った試験室数 11)室間再現相対標準偏差（RSDR ） 3)外れ値検定で除外された試験室数 12)HORRAT（化学分析値の場合） 4)平均値（単位） 13)室間再現許容差（R=2.8sR ） 5)既知ならば真値または設定値 14)報告可能なら回収率（% Rec） 6)併行標準偏差 （repeatability standard deviation, sr ） 7)併行相対標準偏差（RSDr ） 8)併行許容差（r=2.8sr ） 統計用語の有意差と同じ Fisherの最小有意差 l.s.d = t (α; df ) 2Ve n = t (α; df ) 2 × s 9)srが有効でないときのオプション：総室内標準偏差（se ） 2 2 = 2.8 ∵t≈2 13 許容差は、統計用語の有意差と同じ意味であり、この値以上の平均値の差は両側の 危険率5%で有意差ありと判定される。 室内の２個の分析値の差を検定するときは併行許容差を、異なる試験室の２個の分 析値の差を検定するときは室間再現許容差を用いる。 統計用語の有意差では母集団平均値の推定値（サンプルの平均値）間の差を検定す るために、サンプル平均値の変動指標として標準誤差を用いるが、SrおよびSRは不偏 標準偏差なので母集団の標準偏差の推定値である。よって、許容差は比較する２個の 分析値の差は平均が0、標準偏差が2の平方根×Srまたは2の平方根×SRの正規分布 に従うと仮定している。許容差の係数2.8は、両側の危険率5%のときの正規分布の棄却 限界値1.96×（2の平方根）を計算した値である。分散がS2の確率変数２個の差の分散 は期待値の公式より2S2になるため、その標準偏差は2の平方根×Sになる。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 配付試料の均一性確認テスト AOAC Int. Manual (2002)はm=8、r=3 を提案（付録４参照） 均一性を確認したい材料 Harmonized protocol for proficiency Test (1993) m個サンプリング m=10以上、r=2が目安 分析用試料 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 分析用試料 サンプリング誤差 S sam 分析試料 分析試料 分析試料 分析誤差 S an 分析試料 r回併行分析 14 均一性を確認したい材料からm個の分析用試料をランダムに抜き取り、各分析用試料 からサンプリング誤差が最小になるように分析試料ｒ個を取り出し、m×r個の分析試料を ランダムな順番に１回ずつ分析する。分析試料間の分析値の変動から分析誤差Sanの 推定値を求め、分析用試料の分析値（上図ではr=２個の分析試料の分析値の平均値） の変動からサンプリング誤差の推定値Ssamを求める。具体的計算式は付録５を参照。 技能試験のHarmonized protocol (1993)とAOAC Int.のマニュアル（2002）では、推奨 するmとrの値が異なるが、どちらかを参考に決めると良い。 参考文献 Thompson, M.. and Wood, R. (1993). International Harmonized Protocol for Proficiency Testing of (Chemical) Analytical Laboratories. J. AOAC Int., 76(4), 926-940. Thompson, M.. and Wood, R. (1993). The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of (Chemical) Analytical Laboratories. Pure & Appl. Chem., 65(9),2123-2144. AOAC Int.のOMA Program Manual Appendix E (2002). A Statistical Model to Evaluate Analyte Homogeneity for a Material. http://www.aoac.org/vmeth/Manual_App_E.pdf National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 均一性テストのデータ構造 反復回数 分析用試料 1 分析用試料 2・・・分析用試料 m １ ・ ・ ・ ｒ x11 ・ ・ ・ x1r x21 ・ ・ ・ x2r 平均 x1. x2. ・・・ ・・・ xm1 ・ ・ ・ xmr xm. Sanの推定 x.. (総平均) （付録５参照） S samの推定 2 2 2 分析試料の分析値の分散 S x = S an + S sam 目安：サンプリング誤差 S sam が分析誤差 S an と同程度以下なら均一 15 データ構造は試験室間共同試験のデータ構造と同じになる。試験室と分析用試料が 対応する。分析試料１個を１回分析したときの分析値のばらつきを示す分散は分析誤 差の分散とサンプリング誤差の分散の和で表される。 各分析用試料を併行分析した分析値の変動から分析誤差Sanの推定値を求め、分析 用試料の分析値（上図ではr個の分析試料の分析値の平均値）の変動からSsamの推定 値を求める。具体的な計算方法は付録５を参照。 均一な材料とはサンプリング誤差が分析誤差と同程度以下の材料で、サンプリング誤 差が分析誤差よりも大きな材料は不均一とみなされる。そのため、均一性の判断基準に なる分析誤差が妥当な大きさであるかどうかを確認しておく必要がある。分析誤差が大 きければサンプリング誤差が大きくても均一と判定されるので注意すべきである。化学 分析値の場合はHorwitzの式から求まる室間再現相対標準偏差を目安にして分析誤 差の相対標準偏差が大きすぎないか判断することができる。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 均一性判定方法 １）一元分散分析のF値が有意でなければ均一と判定する。 F= 2 S an2 + rS sam < F (α, df1 , df 2 ) S an2 α ：危険率 df1 ：分子の自由度 df 2 ：分母の自由度 ２）F値が有意（p<0.05）な場合、 σ p 既知ならば Harmonized protocol for Proficiency Test (1993) の判定式で判定する。 SsamによるSRの増加が 判定式： S sam < 0.3σ p 5%以下になる条件 σ p ：共同試験の S R 、もしくはHorwitzの式の σ R （化学分析値のみ有効） 例：サンプル濃度の設定値（又は平均値）が1ppmの場合、 σ R = 0.02× (1×10−6 ) 0.8495 = 1.6×10−7 = 0.16 ( ppm) S sam < 0.3× 0.16 = 0.048( ppm) なら均一と判定する。 16 スライド15で説明したデータ構造をもつ均一性確認データから均一性を判定する最も 基本的な判定方法は一元分散分析を用いる方法である。計算上の注意としては、分散 分析の前提条件である各分析用試料の分散（r個の分析値の分散）がほぼ等しいと言え るかCochranの検定で確認した後に一元分散分析をする手順をAOAC Int.の均一性確 認テストのガイドライン（付録４参照）及びFAPASの技能試験のプロトコル内の均一性確 認テスト（付録６参照）は採用している。技能試験のHarmonized protocol (1993)では外 れ値を除外してから一元分散分析を行うと記述しているが、外れ値検定の方法を具体 的には指定していない。 AOAC Int.の均一性確認テストのガイドライン（付録４参照）によると一元分散分析のF 値が1未満の場合にはランダム化の失敗、一元分散分析モデルの仮定が適切でない等 の理由が考えられ、F<1のときに均一と判定するのは適切でない。 再現性の高い分析法を採用した場合、分析誤差が非常に小さくなり、一元分散分析 の検定統計量であるF値が有意(p<0.05)になることがある。この場合、分析対象とマトリッ クス、成分が同じ室間再現標準偏差SRの報告値がある、又はHorwitzの式が利用でき る化学分析値の場合には、技能試験のHarmonized protocol (1993)の均一性判定条 件式で均一と判定される場合がある。その理由は報告されているSRやHorwitzの式で 求めたSRが均一性を確認するために用いている分析法のSRよりも大きい値のことがあ るためである。 技能試験のHarmonized protocol (1993) の均一性判定式 Ssam < 0.3σpの右辺の 0.3は、サンプリング誤差SsamがSRの0.3倍の場合、SRは5%大きく推定されるが、5%程度 の誤差は許容できるので、これ以下のサンプリング誤差ならばSRの推定値の大きさに 影響はないことを意味している。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 均一性判定方法その２ 3) S sam < 0.3σ p でなかった場合、 σ が既知ならば FAPAS protocol 6th ed. (2002)の判定式で判定する（付録６参照）。 p GMOのようにHorwitzの式が使えない場合は、 Proficiency testの報告書の S R 、共同試験の 論文の S R が使えないか検討する。 17 技能試験のHarmonized protocol (1993)の均一性判定式でも均一と判定されなかっ た場合には、σpが既知ならばFAPASのプロトコル (2002)内の均一性確認テスト が採 用している均一性判定式（付録６参照）の利用を検討する。 均一性を判定するために、データから一元分散分析を用いて計算したサンプリング誤 差Ssamは真のサンプリング誤差（均一性確認テストを多数回実施して得られるサンプリ ング誤差の値の分布の代表値）の推定値である。計算されたSsamはデータから考えて 最も確からしい（その値を取る確率が最も高い）真のSsamの推定値なのであるが、真の Ssamがもっと小さい値になる可能性は存在する。そこで、 Ssam の95%信頼区間の下限 値を真のSsam の推定値とみなせば、一元分散分析で計算したSsamよりも小さな値にな り、技能試験のHarmonized protocol （１９９３）の判定式の左辺が小さくなり、均一と判 定される可能性が高くなる。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 実際に問題になった点− GMO定量分析法 − • サンプル量：均一性を確認できる量 （２回併行分析可能な量） • PCRのプレート上のサンプル配置 反復試料が同一プレートか別プレートかで分析誤差が 変わる • 均一性確認テスト サンプル配置の工夫 PCR装置の安定性 分析誤差が小さすぎてサンプリング誤差が有意になる FAPASの判定式採用 誤差伝搬の法則により有効数字検討 比率の95%信頼区間 粒混合サンプルの均一性 p ±1.96 p (1− p ) （正規分布近似） p = 0.05, n = 100 のとき 0.05 ± 0.04 GMO5%のロットから100粒抜き取ったときのGMO混入率の95%信頼区間 n Clopper and Pearson (1934)の信頼区間の方が正確 18 分析用試料から１回の分析に必要な量を１回サンプリングして抽出し、抽出液を２個に分注し て各々１回分析しても均一性確認に必要な２個の併行分析値が得られる。しかし、この場合には 分析試料の分析誤差は抽出後の誤差になるため非常に小さくなり、均一性を確認したい材料か らのサンプリング誤差には分析用試料から分析試料をサンプリングする誤差も含まれるため、分 析用試料から分析試料を２個サンプリングして各々抽出する本来の均一性確認テストの方法と は一元分散分析で検定する内容が変わってしまうので注意が必要である。分析用試料から分析 試料を２個サンプリングして各々分析した方が試験室間共同試験の分析誤差に近い値で均一 性を確認することになる。 同一プレート上に検量線用の標準試料と定量したい未知試料を配置して、PCR装置の定量目 的には不安定な要素を改善する工夫をGMO定量法では採用しているが、それでも2個の未知 試料を同一プレートに配置した場合と異なるプレートに配置した場合では分析誤差が変わるの でプロトコルで未知試料の配置を規定しておく必要がある。 加工食品のGMO定量分析法に関する試験において、加工原料のトウモロコシ又は大豆の GMO混入率を粒混合で調整することを検討した。粒混合の難しさの原因は、GMOが100%として 入手した試料のGMO比率が97%程度、GMOでない試料のGMOでない比率が99.9%程度のため、 100%同士の試料を重量混合したときのように設定した混入率に一致するとは限らず、一定の範 囲の混入率の試料が確率的に得られることである。例えばGMO混入率5%の試料1kgを上記の 加工原料の粒混合により調製した場合、混入率の95%信頼区間は4.7∼5.2%になる。比率の信頼 区間の計算には正規分布近似式がよく紹介されているが、近似精度が悪いためClopper and Pearsonの信頼区間を利用した方が良い。 Clopper and Pearsonの信頼区間の参考文献 竹内啓、藤野和建 (1981). 2項分布とポアソン分布. 東京大学出版会, 東京, pp.158-164. National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 付録１ 外れ値検出 有効（Valid）でない ﾃﾞｰﾀのｽｸﾘｰﾆﾝｸﾞ 異常値の 除去 精度指標の計算ﾙｰﾌﾟ開始 Cochranの 検定有意 N 外れ値 1個のGrubbs 検定有意 Y 除外する試験室ﾞ数が 参加試験室ﾞ数の 2/9以内なら削除 Y Y このﾙｰﾌﾟで除外 した試験室有り N 終了 最初及び最終の 精度指標報告 外れ値になる試験室数の比率が上限(2/9）を 超える場合は、上限を超える前に外れ値検定 を終了する。 この場合には、外れ値を全く除かず全データ を用いて精度指標を計算するか、分析法を疑 うべきである。 除外する試験室ﾞ数が 参加試験室ﾞ数の 2/9以内なら削除 N 外れ値 2個のGrubbs 検定有意 N 食品総合研究所 2005年9月14日版 Y 除外する試験室ﾞ数が 参加試験室ﾞ数の 2/9以内なら削除 最終的にある値を外れ値として除くべきかどう かの決定は統計的に決める性質のものでは ない。 共同試験責任者が、外れ値検定により示され た外れ値である確率および関連情報に基づ いて判断しなければならない。 ただし、外れ値について独自の判断をしたとし ても、他の共同試験結果との調和を保つため、 ここでの外れ値検出手順に従った結果は報 告すべきである。 19 プロトコルに従わなかった等理由が明らかな異常値を除外した後に、外れ値検定の流 れ図に従って外れ値を検出・除外する。 外れ値を除去した後のデータ解析に有効な試験室は、解析で得られる精度に関する 統計量の信頼区間の精度を確保するため最低8試験室は必要と定められている。 試験室数が多い共同試験の場合には棄却率上限の2/9はもっと低い方が適している。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 付録２ Sr， SRの計算 各試験室が２個の分析値を報告した場合 Youdenペアの場合 非明示の２反復試料の場合 L L Sr = ∑d 2 i ∑ (d − d ) 2 i Sr = i =1 2L i =1 2 ( L −1) 非明示の２反復試料、Youdenペアに共通 L S +S SR = 2 2 d 2 r ∑ (T − T ) 2 i S d2 = i =1 2 ( L −1) Excelの一元分散分析の出力の「グループ内の分散」は S r2 、 「グループ間の分散」は S d2 に等しい。 20 試験室間共同試験のHarmonized protocolには、併行標準偏差Srと室間再現標準偏 差SRを各試験室の２個の分析値の和Tiと差diから計算するための式が掲載されている。 非明示の２反復試料の場合は、２個の分析値の差の期待値はゼロであり、L個のdiは 自由な値をとることが可能なためL個のdi２乗の和を自由度Lで割って不偏分散を計算 する。１個ずつの分析値はSrの２乗を分散にもつ分布に従うため、２個の分析値の差di の分散はSrの２乗の２倍になる。そこで、Srは先に計算した不偏分散を２で割った平方 根になる。 Youdenペアの２個の分析値は5%以内の差があるように試料を調製してあるため、 di はゼロにならず、その真の値はdiの平均値で推測することになる。 Srはdiとdiの平均値と の差の２乗をL個足し、それを自由度L-1で割って不偏分散を計算し、その不偏分散を２ で割った後の平方根になる。自由度がL-1になる理由は、diの平均値を用いるためL番 目のdiは自由な値を取れず自由な値を取れるdiはL-1個しかないからである。分母の２ の意味は、非明示の２反復試料の場合と同じである。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 付録３ Horwitzの式の修正案 Thompson, M. (2000). Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, 125, 385-386. 室間再現 標準偏差 の経験則 の値 ⎧ ⎪ 0.22C ⎪ ⎪ ⎪ σ R = ⎪⎨0.02C 0.8495 ⎪ ⎪ ⎪ 0.01C 0.5 ⎪ ⎪ ⎪ ⎩ (C < 1.2×10−7 ) (1.2×10−7 ≤ C ≤ 0.138) (C > 0.138) マイコトキシンに関する研究報告９件の 47材料のデータから計算 ・FAPAS protocol 6th ed. (2002)は採用 ・AOAC Int.は今のところ未採用 データ蓄積待ちか 21 化学分析値の濃度が1.2×10-7未満の場合と、0.138より高い場合にHorwitzの式を修 正した式が2000年に提案された。FAPASの技能試験に関するプロトコル (2002)ではこ の修正式を採用しているが、AOAC Int.では2005年7月現在では採用していない。 AOAC Int.の試験室間共同試験に関するガイドラインでは、高濃度側（100%付近）と低 濃度側(10-8以下)でのHORRATの有効性については疑問があるため、これらの濃度域 でのHORRATの利用はレフリーの判断にゆだねている。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 付録４ 均一性確認テストのガイドライン F.D.MｃClure著 AOAC Official Methods AOAC Int.のOMA Program Manual Appendix E (2002) http://www.aoac.org/vmeth/Manual_App_E.pdf 判定手順 1)Cochran test （等分散の検定、危険率：上側5%） 2)Intra-class correlation analysis （一元分散分析の S2 F検定の変形、 ρ = 2 sam 2 S an + S sam 危険率：上側5%） 1 3) S sam < S an 3 2 10 ⎛S ⎞ 2 S x = S an2 + S sam San = 1.054 San = San2 + ⎜⎜ an ⎟⎟ = ⎝ 3⎠ 9 S x ：分析試料の分析値の標準偏差 サンプリング誤差による影響が5%以下 22 Cochran testでは均一性を確認したい材料からサンプリングしたm個の分析用試料 毎の分散（r個の分析値の分散）が等しいかどうか検定する。これは分散分析の前提条 件である等分散性をデータが満たしているかを確認するためである。 次に一元分散分析を行い、 intra-class correlationを計算し、その値が棄却限界値よ り小さいことを確認する。これは一元分散分析のF検定の結果が有意でないことに相当 する。 intra-class correlationの計算に必要なSsamとSanの計算方法は付録５参照。 intra-class correlationの棄却限界値はAOAC Int.のOMA Program Manual Appendix E (2002)内の数表を参照する。 サンプリング誤差の標準偏差Ssamが分析誤差の標準偏差Sanの1/3よりも小さいという 均一性の判定条件は、技能試験のHarmoized protocol (1993)内の均一性判定式の SRよりもSan（= Sr）の方が一般的に小さいので、より厳しい条件である。 判定式Ssam < 1/3×Sanの右辺の1/3という値は、分析値の誤差を表す標準偏差Sxが サンプリング誤差により大きくなるのは５％まで許容することを意味している。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 付録５ San, Ssamの計算 m S an2 = r ∑∑ ( xij − xi. ) 2 i =1 j =1 m ∑(x m ( r −1) i. − xi .. ) 2 i =1 m −1 Excelの一元分散分析の出 力の「グループ内の分散」に 等しい 2 2 = San + rS sam Excelの一元分散分析 の出力の「グループ間の 分散」に等しい S an = グループ内の分散 S sam = グループ間の分散−グループ内の分散 r Excelの一元分散分析：「ツール」の中の「分析ツール」 の中の「分散分析：一元配置」 23 配付する材料の均一性確認テストで、m個の分析用試料（test sample）をサンプリン グし、各分析用試料からr個の分析試料 (test portion)を分析した場合、サンプリング誤 差Ssamと分析誤差Sanは一元分散分析を用いて計算することができる。 Sanは各分析用試料の分析値と分析試料の分析値の差の２乗をr個足し、それをm個 の分析用試料分足したものを自由度m（r-1）で割った不偏分散の平方根になる。ここで、 分析用試料 の分析値はr個の分析試料の分析値の平均値である。 m×r個の全分析値の平均値と分析用試料の分析値の差の２乗をm個足したものを自 由度m-1で割った不偏分散は、分析誤差の分散とサンプリング誤差の分散のr倍の和に 等しい。よって、この分散から分析誤差の分散を引き、rで割るとサンプリング誤差の分 散が得られ、その平方根がSsamになる。 Excelの一元分散分析で出力される分散分析表では、「グループ内分散」と「グループ 間分散」という２種類の分散を用いてSsamとSanを計算することができる。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 付録６ 均一性確認テストのガイドラインその２ FAPASのprotocol 6th ed. (2002) T.Fearn and M. Thompson (2001) 1)Cochran test （等分散の検定、危険率：上側5%） 2)判定式： 2 S sam ≤ χm2 −1,0.95 m −1 2 σ all + Fm−1,m ,0.95 −1 2 2 S an2 = F1σall + F2 S an2 S sam < σall = 0.3σ p の条件緩和した判定式 σ all ：Allowable sample SD σ p ：target SD 右辺第２項は一元分散分析のF検定と同値 1993年のProficiency Testの Harmonized protocolの判定式 2 S R2 + S sam = S R2 + (0.3S R ) 2 = 1.09 S R = 1.04S R S sam < σall = 0.3σ p 十分に均一な条件“sufficient homogeneity” σ p ：共同試験のSR、もしくはHorwitzの式 の σ R （化学分析値のみ有効） サンプリング誤差による影響が5%以下 24 FAPASの均一性確認テストの手順 Cochran testでは均一性を確認したい材料からサンプリングしたm個の分析用試料 毎の分散（r個の分析値の分散）が等しいかどうか検定する。これは分散分析の前提条 件である等分散性をデータが満たしているかを確認するためである。 一元分散分析から求めたSsamはデータから考えて最も確からしい（その値を取る確率 が最も高い）真のSsamの推定値なのであるが、真のSsamはもっと小さい値になる可能性 は存在する。そこで、 Ssam の95%信頼区間の下限値を真のSsam の推定値とみなせば、 一元分散分析で計算したSsamよりも小さな値になり、技能試験のHarmonized protocol （１９９３）の判定式 Ssam < 0.3σpの左辺が小さくなり、均一と判定される可能性が高くな る。 技能試験のHarmonized protocol （１９９３）の判定式 Ssam < 0.3σpの左辺にSsamの 95%信頼区間下限値を代入し変形するとFAPASの均一性判定式が導出できる。 FAPASの均一性判定式の右辺第１項がもしなければ一元分散分析のF検定と同じに なるので、右辺第１項の分だけサンプリング誤差の分散は大きくても均一と判定されるこ とになる。 技能試験のHarmonized protocol （１９９３）の均一性判定式を満たす材料は「十分に 均一」な材料という。 National Food Research Institute, Japan 食品の機能性及び安全性に関する総合研究 「分析の妥当性確認」 勉強会資料 2005年6月3日 食品総合研究所 2005年9月14日版 付録７ 変数変換 比率や百分率データをそのまま用いて一元分散分析などの 検定をしてはならないと指摘された場合への対応 １）比率 p ：0∼１の範囲の値しかとらない ⎛ p ⎞⎟ ⎟ ロジット変換 y = ln ⎜⎜⎜ ⎝1− p ⎠⎟⎟ 正規分布、ｔ分布などに従う変量の範囲 -∞から+∞に変換された値 y で検定する ２）比率 p ：比率の平均と分散は独立でない 逆正弦変換 y = sin −1 正規分布、ｔ分布などが仮定している 平均と分散が独立な値 yで検定する p p =30∼70%では 逆正弦変換必要なし 25 比率データや百分率データは統計の検定で仮定している前提条件を満たさないので、 そのままのデータを検定してはならないと指摘されることがある。そのような場合には検 定の前提条件を満たすように変数変換したデータを用いて検定することを検討する。こ の場合の変数変換にはロジット変換または逆正弦変換がよく用いられる。 比率データや百分率データ以外のデータへの変数変換利用の目安 ・頻度分布が右に裾の長い非対称分布のときに左右対称分布に近づけたい場合 は対数変換の利用を検討する。 例：FAPASのGMOサンプルの技能試験ではGMO混入率の報告値の頻度分布 が右に裾の長い分布をするため、GMO混入率(%)を対数変換した後に平均 値、標準偏差を計算している。 ・平均値と分散に正の相関があるときに平均値と分散を独立にしたい場合は対数 変換を検討する。 変数変換前のデータの信頼区間を求めたい場合は、変数変換した値で求めた平均 値、信頼区間下限値、信頼区間上限値を各々逆変換する。逆変換で得られた信頼区 間は平均値の両側に対称ではなくなるが、これで良い。 National Food Research Institute, Japan