Bioanalyzer

BioanalyzerとqPCRを使用した
ライブラリの定性・定量評価
酒井名朋子
イルミナ株式会社
テクニカルサポート
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Libraryの定性・定量評価
ライブラリ調製
後の手順
定性評価
定量評価
ゲル泳動
qPCR
Agilent
Bioanalyzer
2
Library QCの手段:
Gel visualization
Libraryの10%を2%Agarose gelにロードする
確認項目：
– Libraryサイズが予想通りかどうか
– Adapter Ligation後の想定DNAサイズと同程度か
どうか
– 126bpに強いバンドが存在しないか（アダプ
ターダイマー）

3
存在する場合はGel Purificationのステップを繰り
返す
500bp
400bp
Library QCの手段:
Agilent 2100 Bioanalyzer
ターゲットサイズ・量によりチップを使い分け
Bioanalyzer トレースはサイズ分布を知る目的で利用、定量結果は不確か
トラブルシューティングの際に必要
Image from www.genomics.agilent.com
http://www.chem.agilent.com/Library/flyers/Public/5990-5056JAJP_NGS-BioA.pdf
4
Agilent Bioanalyzer 2100:
概要
5
Agilent Bioanalyzer Workflow
手順
ゲルと
Dyeを
混ぜる
*
チップを
準備する
*if first time using kit
6
サンプル
とラダー
をチップ
に乗せる
チップ
を
Voltex
する
Bioanalyzer
にチップを
セットし泳
動を開始す
る
Data評
価
Bioanalyzer用チップの準備
ゲルと
Dyeを混
ぜる*
チップを準
備する
4.
1.
2.
3.
– シリンジを押し込み60秒間ホール
ドする留め具をつける
– プランジャーをリリースし、5秒
間待つ
– Chip Priming Stationから外す
ゲルとDyeを混ぜ、30分室温に置
く
チップを用意し、Chip Priming
Stationに置く
9uLのゲルDye混合液を該当Well
におく
付属シリンジで圧をかけ,ゲルを
チップに注入する
5.
次のスロットにゲルDye混合物を
ロードする.
– 泡が入らないように注意すること
9uL gel-dye mix
7
9uL gel-dye mix
Loading Agilent chips
ゲルと
Dyeを混
ぜる*
チップを準
備する
サンプルと
ラダーを
チップに乗
せる
8.
6.
7.
5uLのマーカーをすべてのWellに
注入する
9.
必要のある場合はLibraryを希釈す
る
1uLのサンプルとDNAマーカーを
ロードする
該当箇所にDNAラダーを入れる
1uL sample or DNA ladder per well
1uL DNA ladder
8
チップを
Voltexす
る
Bioanalyzerに
チップをセット
し泳動を開始す
る
Bioanalyzerトレースを理解する
Data評価
理想的なBioanalyzer結果とは：
サンプル由来のピークが二つのマー
カー(35bpと10Kbp）のピークの間に存
在する
ベースラインが安定して低い
Upper Marker
Lower Marker
マーカーのIntensityがベースラインよ
り十分大きい
マーカーのピークがサンプルピークと
被っていないこと
9
Sample Peaks
Bioanalyzerレポートを理解する
チェック項目
• ピークは1本か
• Adapter Dimer、ビーズの持越しがな
いか
10
TruSeq DNA libraryの理想的なBioanalyzerトレース
Gel
Gel-free
11
Bioanalyzerの定量結果が正確でない理由
 サンプルをオーバーロードすると定量結果が不正確
1:5 希釈の場合16ng/uL と表示

12
1:20 希釈の場合36ng/ulと表示
定量にはQubitやqPCRをご使用ください。
Library QC:
Summary
Gel Images ゲル電気泳動結果
Libraryが期待したサイズであること
Adapter dimerが存在しないこと
Agilent BioAnalyzer 2100
Libraryが期待したサイズであること
Adapter dimerが存在しないこと
ピークが1本であること
– ビーズの持越し
– PCRでのOveramplification由来の産物
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qPCRを使用したLibraryの定量
14
最適クラスター数はデータ量を増やす
Optimized flow cell clustering determines
data quality and overall data yield
20pM
10pM
Over clusterになってしまうと・・
• Quality とYieldが下がる
• Focusが合わなくなる
• Runの失敗
15
5pM
1pM
Cluster 数が少ないと・・
• Data量が少ない
• サンプルが無駄になる
• Focusが合わなくなる
• Runの失敗
最適クラスター数
Sequencing Platform
Raw Cluster Density in Kcluster/mm2
GAII and GAIIx
700,000 to 800,000
HiSeq v3
750,000 to 850,000
MiSeq v1
750,000 to 850,000
MiSeq v2
～1500,000
1000000
Cluster Density
900000
800000
700000
600000
500000
Clusters
400000
線形 (Clusters)
300000
200000
100000
0
0
5
10
15
pM
16
20
25
MultiplexでサンプルをPoolする際には特に注意！
ライブラリの一つが10倍高く濃度が
見積もられていた場合
17
Sample
Expected
Output
Actual
Output
1
16%
20%
2
16%
20%
3
16%
20%
4
16%
20%
5
16%
20%
6
16%
2%
Sample
Expected
Output
Actual
Output
1
16%
66%
2
16%
6%
3
16%
6%
4
16%
6%
5
16%
6%
6
16%
6%
ライブライの一つが10倍低く見
積もられていた場合
Flow Cell のTitration
Flow Cell Titration
どの程度のLibrary 濃
度でどの程度のクラ
スター数が出るか
FCの3-4レーンを
使用
Libraryによっては
データを使用可能
>=Q30 (%)
100
95
90
85
20pM
10pM
5pM
20pM 10pM 5pM 1pM
Cluster Density
18
Q30 Score
1pM
Flow Cell Titrationにおける注意事項
使用するqPCR装置、Sequence装置、試薬のバージョンは一定にする
Titration結果に影響を及ぼすParameter
–
–
–
–
19
Sequencer（GA、HiSeq、MiSeq）
クラスター形成装置（Cluster Station、cBot、MiSeq）
Denatureの方法
Library 長とGC含量
Libraryの定量方法
UV- 吸光 Nanodrop
Bioanalyzer 2100
蛍光ベースの
ds-DNA assay
Qubit or PicoGreen
qPCR
20
• 核酸以外の物質も検出
• Contaminants が値を左右する
• Sample prepのInputやvalidationには使用不可
• 希釈とサンプルのHandlingにより
Accuracyが変わる
• Qualityのチェックにのみ使用
• ds DNAを特定的に検出
• 不完全なLibraryも検出
• 完全なLibraryのみを検出
• 検出限界が低い
qPCRの原理
1. Sybr GreenがPCR Mixに
含まれる
2. PCR Primerがアニーリ
ングし、
21
3. 伸長反応が起こると
Sybr Greenが取り込
まれる
4. 取り込まれたSybr
Greenが発光する
5. 蛍光を検出
6. その後のサイクルで
は1-4を繰り返す
qPCR Amplification Curve
検量線
Threshold
Cq
22
:Thresholdに達した際のサイクル数、
立ち上がりサイクル、quantifictaion cycle
qPCR Overview
qPCRではクラスター形成可能な
Liraryのみを検出
– FC上のオリゴP5 とP7 配列の一
部に該当するPCR Primerを使用
– Adapterが両端についたLibraryの
みを検出
23
qPCRでの定量の準備
Step 1
検量線用のDNAを準備
Step 2
検量線用DNAの希釈
Step 3
Libraryの希釈
Step 4
qPCR試薬の準備、装置の運転
Step 5
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qPCRデータの解析
1.検量線用のDNAを準備
検量線にふさわしいDNA
–
–
–
–
–
P5 P7配列を両端に持ったIlluminaシーケンサー用Library
サンプルと同様の長さ、GC含量のもの
サンプルと同様の種類のLibrary（gDNA, RNA, small RNA)
分注して保存されているもの
2-20pMの範囲でCluster 数が適正に検出されるもの
qPCR 用キット
– KAPA Library Quantification Kit
– http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4332
– KK4824、4835、4844、4854
25
2.検量線用DNAの希釈
2nM程度のLibrary原液から調製
– 20pM まで100倍希釈 （0.1% Tween 20もしくはMilliQ水）
2倍希釈を 0.1% Tween 20で行う
しっかりVoltexしたのち分注する
1
2
3
4
5
6
7
20pM
10pM
5pM
2.5pM
1.25pM
0.625pM
0.3125pM
Final Concentrations
26
3.サンプルの希釈
 サンプルの希釈
 Bioanalzyerトレースより大まかな濃度の予想


~2nM のQiagen EB Bufferに保持したサンプルより開始
500倍希釈し、~ 4pM程度に調製する
– 2倍希釈をTriplicate になるように調製する
– しっかりVoltexしたのち分注する
2µL unknown
+
998µL 0.1% Tween 20
2nM
27
4pM
4.qPCR Runの開始
PCRMixはキットに沿って調製
– Primerは10uMになるように調製する
Thermal cycling conditions の例
28
4.qPCR Runのレイアウト（例）
検量線
– 7点
– 2-fold dilution factor
サンプル
– 8 samples
– Technical triplicates
Negative control
– 1点
Unknown
Standard
Non-Template Control
SBS Library Quantification Template
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5.結果の評価
検量線の評価:
– Efficiency（増幅効率）は +/- 10% from 100%

Efficiency= 10^(-1/Slop)
– Slope ：-3.60 to -3.10

検量線の傾き
– R2 > 0.99
– Outlierをはずす(replicate でCq の違いが 0.5以上あるもの)
サンプルが検量線の中に入っているかどうか
– Outlierをはずす(replicate でCq の違いが 0.5以上あるもの)
Slope -3.278
R2 0.997
Efficiency 101.86%
30
5.結果の評価
検量線の濃度計算
– DNA定量値（ng/uL)より、DNAの平均分子量、検量線サンプルの長さより濃度(nM)
を計算
– 希釈倍率を考慮に入れる
Bioanalyzer、Qubitと比較してqPCRの定量結果と大幅にずれる場合
– 一つの方法からの結果を採用する
– qPCRが最も正確
定量されたサンプルを希釈し、Cluster Generation進んでください。
31
ご清聴ありがとうございました。
32