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特 許 公 報 特許第5785947号
特 許 公 報（Ｂ２） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) 〔実 28 頁〕 (11)特許番号 特許第5785947号 (45)発行日 （Ｐ５７８５９４７） (24)登録日 平成27年7月31日(2015.7.31) 平成27年9月30日(2015.9.30) (51)Int.Cl. ＦＩ Ｃ１２Ｐ 1/04 (2006.01) Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 (2006.01) Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ０７Ｇ 99/00 (2009.01) Ｃ０７Ｇ 99/00 Ｃ Ａ０１Ｋ 67/027 (2006.01) Ａ０１Ｋ 67/027 Ａ６１Ｋ 39/02 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/02 請求項の数9 （全40頁） 最終頁に続く (21)出願番号 特願2012-527815(P2012-527815) (73)特許権者 515088902 (86)(22)出願日 平成22年8月26日(2010.8.26) ユンジン (65)公表番号 特表2013-503858(P2013-503858A) ッド (43)公表日 平成25年2月4日(2013.2.4) 大韓民国 (86)国際出願番号 PCT/KR2010/005721 ドン‐ク、チョンホ‐デロ、１０５７ (87)国際公開番号 WO2011/027990 (87)国際公開日 平成23年3月10日(2011.3.10) 審査請求日 平成24年6月14日(2012.6.14) ファーム．カンパニー、リミテ ソウル １３４‐７２１、カン (74)代理人 110000729 特許業務法人 ユニアス国際特許事務所 (72)発明者 コ、ヨン‐スン (31)優先権主張番号 10-2009-0083621 大韓民国 (32)優先日 平成21年9月4日(2009.9.4) ７５１、ポハン‐シ、ナム‐グ、ジゴク‐ ギョンサンブク‐ド ７９０‐ (33)優先権主張国 韓国(KR) ドン、プロフェッサーアパートメント、１ (31)優先権主張番号 PCT/KR2010/001787 ００３ホ (32)優先日 平成22年3月23日(2010.3.23) (33)優先権主張国 韓国(KR) ４‐ドン 前置審査 最終頁に続く (54)【発明の名称】グラム陽性細菌由来細胞外ベシクル及びその用途 1 2 (57)【特許請求の範囲】 ２に記載の疾病動物モデル。 【請求項１】 【請求項４】 細胞壁を有するグラム陽性細菌由来の細胞外ベシクルで 細胞壁を有するグラム陽性細菌由来の細胞外ベシクルを あって、 動物に投与することを含む疾病動物モデル（ただし、ヒ 前記グラム陽性細菌はスタフィロコッカスであり、 トを除く）の製造方法であって、 前記細胞外ベシクルは、動物の体内分泌物又はグラム陽 前記グラム陽性細菌はスタフィロコッカスであり、 性細菌培養液から分離される細胞外ベシクル。 前記投与は皮膚投与、鼻腔投与、気道吸入、口腔投与、 【請求項２】 皮下投与、腹腔投与、血管投与、及び肛門投与よりなる 細胞壁を有するグラム陽性細菌由来の細胞外ベシクルを 群から選ばれるものである疾病動物モデルの製造方法。 投与することによって得られた疾病動物モデル（ただし 10 【請求項５】 、ヒトを除く）であって、 細胞壁を有するグラム陽性細菌由来の細胞外ベシクルに 前記グラム陽性細菌はスタフィロコッカスであり、 起因する疾病の予防又は治療候補薬物探索方法であって 前記投与は皮膚投与、鼻腔投与、気道吸入、口腔投与、 、 皮下投与、腹腔投与、血管投与、及び肛門投与よりなる 前記グラム陽性細菌はスタフィロコッカスであり、 群から選ばれるものである疾病動物モデル。 前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで候補薬物の存在下又は 【請求項３】 非存在下で細胞に前記細胞外ベシクルを処理する段階と 前記疾病は皮膚疾患、呼吸器疾患、消化器疾患、生殖器 、 疾患、血管疾患、代謝疾患、肺疾患、骨関節疾患、及び 前記ベシクルによって誘導された炎症性サイトカインの 脳神経疾患よりなる群から選ばれるものである、請求項 水準を測定する段階とを含む前記疾病の予防又は治療候 ( 2 ) JP 3 5785947 B2 2015.9.30 4 補薬物探索方法。 れる細胞外ベシクルは細胞外膜（outer 【請求項６】 ら分泌するものと知られているが、グラム陽性細菌の場 グラム陽性細菌感染に対する予防又は治療用ワクチンで 合には細胞外膜がなく、細胞膜が細胞壁に取り囲まれて あって、 おり、現在まで細胞外ベシクルを分泌し或いはグラム陽 細胞壁を有するグラム陽性細菌由来の細胞外ベシクルを 性細菌に由来する細胞外ベシクルが疾病を引き起こすと 含み、前記グラム陽性細菌はスタフィロコッカスである いうことは知られていない。 、予防又は治療用ワクチン。 【先行技術文献】 【請求項７】 【非特許文献】 前記ワクチンは細菌を形質転換して使用するもの或いは 【０００５】 前記の細菌に化学物質を処理して使用するものである、 10 【非特許文献１】Kuehn, M. J., Kesty, N. C., Bacter 請求項６に記載のワクチン。 ial outer membrane vesicles and the host-pathogen 【請求項８】 interaction. Genes Dev. 2005, 19, 2645-2655 前記ワクチンは前記細胞外ベシクルに化学物質を処理し 【発明の概要】 て使用するものである、請求項６に記載のワクチン。 【発明が解決しようとする課題】 【請求項９】 【０００６】 前記ワクチンは効能を増加させるか副作用を減少させる 本発明の目的は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシクルを 目的で薬物を併用投与して使用するものである、請求項 提供することにある。 ６∼８のいずれかに記載のワクチン。 また、本発明の他の目的は、グラム陽性細から細胞外ベ 【発明の詳細な説明】 シクルを分離して製造する方法を提供することにある。 【技術分野】 20 membrane）か また、本発明の別の目的は、グラム陽性細菌由来細胞外 【０００１】 ベシクルを実験動物に投与して疾病動物モデルを提供す 本発明は、グラム陽性細菌に由来する細胞外ベシクル（ ることにある。 extracellular vesicle、ＥＶ）、及びこれを用いた疾 また、本発明の別の目的は、疾病動物モデル又は体外ス 病モデル、候補薬物探索方法、ワクチン、疾病の原因因 クリーニングシステムを介して疾病を予防又は治療する 子診断方法などに関する。 効果的な候補物質を選別する方法を提供することにある 【背景技術】 。 【０００２】 また、本発明の別の目的は、グラム陽性細菌由来細胞外 グラム陽性細菌は、グラム染色の際に紫色に染色される ベシクルを用いてグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルに 特徴を有し、グラム陰性細菌と比較して細胞外膜(outer よる疾病を予防又は治療することが可能なワクチンを提 membrane)のない特徴を有する細菌であって、系統分類 30 供することにある。 学的にファーミキューテス(Firmicutes)門（phylum）、 また、本発明の別の目的は、グラム陽性細菌由来細胞外 アクチノバクテリア(Actinobacteria)門、テネリクテス ベシクルを用いてグラム陽性細菌に対する感染を予防又 (Tenericutes)門がこれに該当する。ファーミキューテ は治療することが可能なワクチンを提供することにある ス門とアクチノバクテリア門は、両方とも細胞壁にペプ 。 チドグリカンが豊富であるが、前者は遺伝物質にＧ＋Ｃ また、本発明の別の目的は、分離された細胞外ベシクル 量が少なく、後者はＧ＋Ｃ量が多いことを特徴とする。 を用いてグラム陽性細菌が引き起こす疾病の原因因子を テネリクテス門は細胞壁がないことを特徴とする。 診断する方法を提供することにある。 【０００３】 本発明が解決しようとする技術的な課題は上述した課題 ヒトに疾病を引き起こす病原菌の大部分はグラム陽性細 に限定されず、上述していない別の課題は以下の記載か 菌と知られており、中でも、球状の細菌としてはストレ 40 ら当業者に明確に理解できるであろう。 プトコッカス(Streptococcus)とスタフィロコッカス(St 【課題を解決するための手段】 aphylococcus)が代表的な病原菌であり、棒状の細菌と 【０００７】 しては胞子(spore)を形成しないコリネバクテリウム(Co 本発明の第１側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク rynebacterium)とリステリア(Listeria)、胞子を形成す ルを提供する。 るバシラス (Bacillus)とクロストリジウム(Clostridiu 前記本発明の一具現例において、前記グラム陽性細菌は m)などが代表的な病原菌である。 ファーミキューテス(Firmicutes)門（phylum）をなす細 【０００４】 菌であるが、これに限定されるものではない。 一方、グラム陰性細菌が分泌する細胞外ベシクルとグラ 前記ファーミキューテス門は、スタフィロコッカス(Sta ム陰性細菌が引き起こす疾病との関連性が最近注目を浴 phylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、 びている（非特許文献１）。グラム陰性細菌から分泌さ 50 エンテロコッカス(Enterococcus)、バシラス(Bacillus) ( 3 ) JP 5785947 B2 2015.9.30 5 6 、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、ノカルジア( 本発明の第３側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク Norcarida)、クロストリジウム(Clostridium)、ラクト ルを用いた疾病動物モデルを提供する。 バシラス(Lactobacillus)、及びリステリア(Listeria) 前記本発明のグラム陽性細菌及び細胞外ベシクルは前述 を含むが、これに限定されるものではない。 と同じである。 前記本発明の他の具現例において、前記グラム陽性細菌 前記本発明の疾病は、局所疾患であって、アトピー皮膚 は、モリクテス(Mollicutes)綱(class)をなす細菌であ 炎などの皮膚疾患、鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、気管支 るが、これに限定されるものではない。 炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎、肺 前記モリクテス綱は、マイコプラズマ(Mycoplasma)を含 癌などの呼吸器疾患、口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌 むが、これに限定されるものではない。 、胃炎、胃癌、炎症性腸炎、大腸癌などの消化器疾患、 前記本発明の別の具現例において、前記グラム陽性細菌 10 膣炎、子宮頚部炎、子宮頚部癌などの生殖器疾患を含む は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブド が、これに限定されるものではない。 ウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、枯草菌(Bacillu また、前記本発明の疾病は、全身疾患であって、敗血症 s subtilis)などを含む。 、血栓／塞栓症、動脈硬化症、脳卒中、急性冠状動脈症 前記本発明の別の具現例において、前記グラム陽性細菌 候群、虚血性血管疾患などの血管疾患、糖尿病、肥満な 由来細胞外ベシクルは、動物の体内に生息するグラム陽 どの代謝疾患、肺気腫、急性呼吸不全症候群などの肺疾 性細菌が分泌するものを含むが、これに限定されるもの 患、関節炎、骨粗しょう症などの骨関節疾患、痴呆、退 ではない。 行性脳疾患、うつ症などの脳神経疾患などを含むが、こ 前記細胞外ベシクルは動物の体内分泌物から分離するこ れに限定されるものではない。 とができ、前記動物の体内分泌物は皮膚洗浄液、鼻水、 前記本発明の一具現例において、前記動物はマウスであ 喀痰、大便、血液、小便、関節液、脳脊髄液、胸水、及 20 りうるが、これに限定されるものではない。 び腹水などを含む。 【００１０】 前記本発明の別の具現例において、前記グラム陽性細菌 本発明の第４側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク 由来細胞外ベシクルは周辺環境に生息するグラム陽性細 ルを動物に投与することを特徴とする、疾病動物モデル 菌が分泌するものを含み、前記周辺環境は室内空気、室 の製造方法を提供する。 外空気、土壌、及び海などを含む。 前記本発明のグラム陽性細菌、細胞外ベシクル、及び疾 前記本発明の別の具現例において、前記グラム陽性細菌 病は前述と同じである。 由来細胞外ベシクルは、グラム陽性細菌培養液から分泌 前記本発明の投与は、皮膚投与、鼻腔投与、気道吸入、 されるものを含むが、これに限定されるものではない。 口腔投与、皮下投与、腹腔投与、血管投与、肛門投与な 前記本発明の別の具現例において、前記細胞外ベシクル どを含む。 は自然的に分泌されるもの、及び人工的に分泌されるも 30 【００１１】 のを含む。 本発明の第５側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク 【０００８】 ルによる疾病動物モデルを用いてバイオマーカーを発掘 本発明の第２側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク する方法を提供する。 ルの製造方法を提供する。 【００１２】 前記本発明の一具現例において、前記製造方法は、グラ 本発明の第６側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク ム陽性細菌培養液を遠心分離して上澄液を収得する段階 ルを用いた、疾病の予防又は治療に対する候補薬物の探 と、前記収得された上澄液を濾過する段階とを含む。 索方法を提供する。 前記本発明の他の具現例において、前記製造方法は、グ 前記本発明のグラム陽性細菌、細胞外ベシクル、及び疾 ラム陽性細菌培養液を遠心分離して上澄液を収得する段 病は前述と同じである。 階と、前記収得された上澄液を第１フィルターで濾過す 40 前記本発明の一具現例において、前記探索方法は、グラ る段階と、前記濾過物を第２フィルターで濾過する段階 ム陽性細菌由来細胞外ベシクルを細胞に処理する段階を と、収得された前記濾過物を超遠心分離して沈殿物を収 含むことができる。前記細胞は炎症細胞、上皮細胞、血 得する段階とを含む。 管内皮細胞、線維芽細胞、幹細胞などを含む。また、前 前記本発明の別の具現例において、第１フィルターで濾 記炎症細胞は単核球、好中球、好酸球、好塩球、及び単 過した後、その濾過物を濃縮する段階をさらに含むこと 核球が組織から分化した細胞などを含み、前記幹細胞は ができる。 骨髄組織又は脂肪組織に由来する細胞でありうるが、こ 前記本発明の別の具現例において、前記沈殿物を収得す れに限定されるものではない。 る段階に続いて、前記沈殿物を懸濁する段階をさらに含 前記本発明の他の具現例において、前記探索方法は、グ むことができる。 ラム陽性細菌由来細胞外ベシクルと共に候補物質を投与 【０００９】 50 した後、炎症関連媒介体の水準を測定し或いは炎症関連 ( 4 ) JP 5785947 B2 2015.9.30 7 8 シグナル伝達過程を評価する段階を含むことができる。 前記本発明のグラム陽性細菌及びグラム陽性細菌由来細 【００１３】 胞外ベシクルは前述と同じである。 本発明の第７側面は、グラム陽性細菌による感染を予防 前記本発明の一具現例によれば、前記疾病はグラム陽性 又は治療するために、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク 細菌由来細胞外ベシクルにより発生又は悪化する疾病を ルを含むワクチンを提供する。 含む。 前記本発明のグラム陽性細菌及びグラム陽性細菌由来細 前記本発明のグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルにより 胞外ベシクルは前述と同じである。 発生又は悪化する疾病は、アトピー皮膚炎などの皮膚疾 前記本発明の一具現例によれば、前記グラム陽性細菌に 患、鼻炎、副鼻腔炎、鼻咽頭癌、気管支炎、喘息、慢性 よる感染は皮膚感染、呼吸器感染、泌尿生殖器感染、骨 閉塞性肺疾患、気管支拡張症、肺炎、肺癌などの呼吸器 関節感染、中枢神経系感染、及び敗血症などでありうる 10 疾患、口腔炎、口腔癌、食道炎、食道癌、胃炎、胃癌、 が、これに限定されるものではない。 炎症性腸炎、大腸癌などの消化器疾患、膣炎、子宮頚部 前記本発明の他の具現例によれば、前記ワクチンは効能 炎、子宮頚部癌などの生殖器疾患を含む局所疾患である を増加させるか副作用を減少させる目的で変形して使用 が、これに限定されるものではない。 することができる。前記変形は細菌を形質転換すること 本発明のグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルにより発生 、細胞に化学物質を処理することなどを含み、前記化学 又は悪化する疾病は、敗血症、血栓／塞栓症、動脈硬化 物質は薬物を含む。 症、脳卒中、急性冠状動脈症候群、虚血性血管疾患など 前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクル の血管疾患、糖尿病、肥満などの代謝疾患、肺気腫、急 は効能を増加させるか副作用を減少させる目的で変形し 性呼吸不全症候群などの肺疾患、関節炎、骨粗しょう症 て使用することができ、前記変形は細胞外ベシクルに化 などの骨関節疾患、痴呆、退行性脳疾患、うつ症などの 学物質を処理することを含み、前記化学物質は薬物を含 20 脳神経疾患などを含む全身疾患であるが、これに限定さ む。 れるものではない。 前記本発明の別の具現例によれば、前記ワクチンは効能 前記本発明の他の具現例によれば、前記疾病はグラム陽 を増加させるか副作用を減少させる目的で薬物を併用投 性細菌による感染を含む。 与して使用し、或いは免疫補強剤を併用投与して使用す 前記本発明のグラム陽性細菌による感染は、皮膚感染、 ることができるが、これに限定されるものではない。 呼吸器感染、泌尿生殖器感染、骨関節感染、中枢神経系 【００１４】 感染、及び敗血症などでありうるが、これに限定される 本発明の第８側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク ものではない。 ルにより発生する疾病を予防又は治療するために、グラ 前記本発明の別の具現例によれば、前記投与は皮下注射 ム陽性細菌由来細胞外ベシクルを含むワクチンを提供す 、皮膚塗抹、静脈注射、鼻腔投与、舌下投与、気道吸入 る。 30 、経口服用、肛門投与などを含む。 前記本発明のグラム陽性細菌、細胞外ベシクル、疾病な 前記本発明の別の具現例によれば、前記細胞外ベシクル どは前述と同じである。 は効能を増加させるか副作用を減少させる目的で変形し 前記本発明の一具現例によれば、前記ワクチンは効能を て使用することができる。前記変形は細菌を形質転換す 増加させるか副作用を減少させる目的で変形して使用す ること、細菌に化学物質を処理すること、細胞外ベシク ることができる。前記変形は細菌を形質転換すること、 ルに化学物質を処理することなどを含み、前記化学物質 細菌に化学物質を処理することなどを含み、前記化学物 は薬物を含む。 質は薬物を含む。 前記本発明の別の具現例によれば、前記投与は、効能を 前記本発明の他の具現例によれば、前記細胞外ベシクル 増加させるか副作用を減少させる目的で、薬物を併用投 は効能を増加させるか副作用を減少させる目的で変形し 与し或いは免疫補強剤を併用投与することができるが、 て使用することができ、前記変形は細胞外ベシクルに化 40 これに限定されるものではない。 合物質を処理することを含み、前記化合物質は薬物を含 【００１６】 む。 本発明の第１０側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシ 前記本発明の別の具現例によれば、前記ワクチンは、効 クルを応用して疾病の原因因子を診断する方法を提供す 能を増加させるか副作用を減少させる目的で、薬物を併 る。 用投与して使用し或いは免疫補強剤を併用投与して使用 前記本発明のグラム陽性細菌及び細胞外ベシクルは前述 することができるが、これに限定されるものではない。 と同じである。 【００１５】 前記本発明の一具現例によれば、前記疾病はグラム陽性 本発明の第９側面は、グラム陽性細菌由来細胞外ベシク 細菌由来細胞外ベシクルにより発生又は悪化する疾病を ルを致死量未満で哺乳動物に投与する段階を含む、疾病 含む。グラム陽性細菌由来細胞外ベシクルにより発生又 に対する予防又は治療方法を提供する。 50 は悪化する疾病は前述と同じである。 ( 5 ) JP 9 5785947 B2 2015.9.30 10 前記本発明の他の具現例によれば、前記疾病はグラム陽 クチンの開発に応用可能である。また、グラム陽性細菌 性細菌による感染を含む。前記本発明のグラム陽性細菌 由来細胞外ベシクルを応用して、グラム陽性細菌の感染 による感染は、皮膚感染、呼吸器感染、泌尿生殖器感染 、又はグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルにより発生す 、骨関節感染、中枢神経系感染、及び敗血症などであり る疾病の原因因子を診断する技術の開発が可能である。 うるが、これに限定されるものではない。 【図面の簡単な説明】 前記本発明の別の具現例において、前記応用はグラム陽 【００１９】 性細菌由来細胞外ベシクルに含まれた遺伝物質の塩基配 【図１】黄色ブドウ球菌で細胞外ベシクルが形成され、 列を分析することであり、前記遺伝物質は１６Ｓ ｒＲ 分泌されることを示す透過電子顕微鏡イメージである。 ＮＡでありうるが、これに限定されるものではない。 【図２】黄色ブドウ球菌で細胞外ベシクルが形成され、 前記本発明の別の具現例によれば、前記応用は、グラム 10 分泌されることを示す走査電子顕微鏡イメージである。 陽性細菌由来細胞外ベシクルに含まれたタンパク質を測 【図３】黄色ブドウ球菌で精製された細胞外ベシクルの 定し、或いはグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルに対す 透過電子顕微鏡イメージ（ａ）と走査電子顕微鏡イメー る免疫反応を測定することでありうるが、これに限定さ ジ（ｂ）である。 れるものではない。前記免疫反応の測定は、グラム陽性 【図４】黄色ブドウ球菌で精製された細胞外ベシクルの 細菌由来細胞外ベシクルに対する抗体を測定することで 粒度分析分布図である。 ありうるが、これに限定されるものではない。 【図５】ブドウ球菌の全体細胞タンパク質（ＷＣ）、細 前記本発明の別の具現例によれば、前記診断は、血液、 胞壁タンパク質（ＣＷ）、膜タンパク質（ＭＰ）、細胞 喀痰、 鼻水、皮膚洗浄液、大便、小便、脳脊髄液、関 質タンパク質（ＣＹ）及び細胞外ベシクル（ＥＶ）タン 節液、胸水、又は腹水などに由来する試料を用いること パク質のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す写真 ができるが、これに限定されるものではない。 20 である。 【発明の効果】 【図６】表皮ブドウ球菌で細胞外ベシクルが形成され、 【００１７】 分泌されることを示す透過電子顕微鏡イメージである。 本発明は、体内で生息し或いは周辺環境に存在するグラ 【図７】表皮ブドウ球菌で細胞外ベシクルが形成され、 ム陽性細菌としてのブドウ球菌(Staphylococcus aureus 分泌されることを示す走査電子顕微鏡イメージである。 )が細胞外ベシクルを分泌し、ブドウ球菌由来細胞外ベ 【図８】表皮ブドウ球菌で精製された細胞外ベシクルの シクルが、皮膚及び粘膜の炎症を特徴とする局所疾患だ 透過電子顕微鏡イメージ（ａ）と走査電子顕微鏡イメー けでなく、 血液に吸収されて全身的な炎症反応を特徴 ジ（ｂ）である。 とする敗血症、血液凝固による血栓／塞栓症などの全身 【図９】表皮ブドウ球菌で精製された細胞外ベシクルの 疾患を誘発するという発見により、グラム陽性細菌由来 粒度分析分布図を示す結果である。 細胞外ベシクルを用いた疾病モデル、疾病を予防又は治 30 【図１０】枯草菌で細胞外ベシクルが形成され、分泌さ 療する候補薬物の探索技術、細胞外ベシクルを応用した れることを示す透過電子顕微鏡イメージである。 疾病の予防或いは治療用ワクチン技術、及び疾病の原因 【図１１】枯草菌で細胞外ベシクルが形成され、分泌さ 因子を診断する方法などを提供する。 れることを示す走査電子顕微鏡イメージである。 【００１８】 【図１２】枯草菌で精製された細胞外ベシクルの透過電 具体的にグラム陽性細菌に由来する細胞外ベシクルを分 子顕微鏡イメージ（a）と走査電子顕微鏡イメージ（ｂ 離し、これを細胞に投与したときには炎症媒介体が分泌 ）である。 され、局所的に投与したときには皮膚又は粘膜に炎症が 【図１３】枯草菌で精製された細胞外ベシクルの粒度分 発生し、腹腔に投与したときには細胞外ベシクルが血管 析分布図を示す結果である。 に流入して全身的な炎症反応を特徴とする敗血症と共に 【図１４】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルのプロテ 血液凝固による血栓／塞栓症などの疾病が発生するとい 40 オーム分析結果であって、イン−ゲル分解方法で４１個 う事実を用いて、疾病動物モデル及び候補薬物を効率よ 、イン−ソリューション分解方法で８４個、中でも３４ く選別する探索方法を提供することができる。また、腸 個が２つの方法のいずれでも観察され、合計９０個のタ 内共生細菌由来細胞外ベシクルを用いた疾病モデル又は ンパク質を同定したことを示すベンダイアグラムである 体外スクリーニングシステムを介して、グラム陽性細菌 。 由来細胞外ベシクルにより発生する疾患を予防又は治療 【図１５】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウス することが可能な薬物を効率よく発掘することができる マクロファージに処理したときに炎症性サイトカインと 。また、腸内共生細菌由来細胞外ベシクル自体或いはこ してのＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌量が増加することを れを変形して投与して免疫反応を調節することにより、 示す結果である。 グラム陽性細菌による感染又はグラム陽性細菌由来細胞 【図１６】マウスの皮膚から得た線維芽細胞に黄色ブド 外ベシクルによる疾病を効率よく予防或いは治療するワ 50 ウ球菌由来細胞外ベシクルを処理したとき、様々なサイ ( 6 ) JP 11 5785947 B2 2015.9.30 12 トカインを含む炎症性媒介体を生産する結果である。 コルである。 【図１７】マウスに黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル 【図３１】図３０で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル を処理し、アトピー性皮膚炎に類似した症状を引き起こ を処理した後、摘出した肺組織のＨ＆Ｅ染色結果である すようにする方法で週３回４週間処理し、４８時間後に 。 様々な指標を確認した。 【図３２】図３０で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル 【図１８】図１７によってマウスに黄色ブドウ球菌由来 を処理した後、血漿内Ｄ−ｄｉｍｅｒの増加を測定した 細胞外ベシクルを処理し、皮膚組織において表皮層の増 結果である。 殖（赤い円で表示された部分）と好酸球の浸潤（矢印の 【図３３】図３０で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル ヘッド）など、アトピー性皮膚炎に類似する症状が起こ ったことを示す結果である。 を処理した後、血漿内血小板数の減少を測定した結果で 10 ある。 【図１９】図１８に示した皮膚組織の症状を数値化した 【図３４】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを用いて 結果であって、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによ 薬物候補物質を発掘する方法に対する模式図である。 って表皮の厚さや、浸潤した肥満細胞、好酸球の数など 【図３５】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルとプロド が増加することを示す。 ラッグを同時にマウスマクロファージに処理し、培養液 【図２０】図１７によってマウスに黄色ブドウ球菌由来 に存在するＩＬ−６の量を細胞外ベシクルのみ単独で処 細胞外ベシクルを処理した後、処理した皮膚組織に存在 理した陽性対照群の測定値を基準として百分率で示すグ する炎症性サイトカインの量を測定した結果であって、 ラフである。 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを処理するにつれて 【図３６】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウス 増加することを示す。 の鼻腔に注入し、プロドラッグとしてのドキセピン(Dox 【図２１】患者の患部洗浄液を濃縮させた後、ＥＬＩＳ 20 epin)とハロペリドール(Haloperidol)を腹腔注入したと Ａ法で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルに存在する抗 きに気管支肺胞洗浄液内ＩＬ−６の分泌を測定した結果 原が存在することを示す結果である。 である。 【図２２】アトピー性皮膚炎を有する患者の血清におい 【図３７】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルがマウス て、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルに対するＩｇＥ の樹枝状細胞内にアップテイク(uptake)される蛍光顕微 の量が正常対照群に比べて非常に増加していることを示 鏡イメージである。 す結果である。 【図３８】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウス 【図２３】マウスの気道に黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ の樹枝状細胞に処理したときにＩＬ−１２ｐ４０サイト シクルを吸入させて先天免疫反応の様相を見るための方 カインの分泌が増加することを示す結果である。 法を図式化したものである。 【図３９】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウス 【図２４】図２３の方法で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ 30 の樹枝状細胞に処理したときに樹枝状細胞の表面のＣＤ シクルを吸入させたマウスの肺胞洗浄液に存在する炎症 ４０とＭＨＣＩＩの発現が増加することを示す結果であ 細胞の数と炎症性サイトカインＩＬ−６の量が対照群に る。 比べて増加したことを示す結果である。 【図４０】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが誘導す 【図２５】マウスの気道に黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ る免疫反応の指標としての抗体を測定するプロトコルで シクルを吸入させて後天免疫反応の様相を見るための方 ある。 法を図式化したものである。 【図４１】図４０の方法で得たマウス血清で細胞外ベシ 【図２６】図２５の方法で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ クル特異ＩｇＧ抗体が増加した結果を示す図である。 シクルを吸入させたマウスの肺胞洗浄液に存在する炎症 【図４２】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを予防ワ 細胞の数とＩＬ−１７の量が対照群に比べて増加するこ クチンとしてマウスに投与した後、免疫学的指標を測定 とにより、気道粘膜にＴｈ１７の後天免疫反応が誘導さ 40 するプロトコルである。 れたことを示す結果である。 【図４３】図４２の方法で得たマウス脾臓細胞でＩＦＮ 【図２７】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによるマ −γとＩＬ−１７のサイトカインが増加することを示す ウスの死亡誘導を確認する実験プロトコルである。 グラフである。 【図２８】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウス 【図４４】マウスの皮膚をテープストリッピングした後 に処理した後の生存率を示す結果である。 、週３回ずつ４週間パッチの方法で黄色ブドウ球菌由来 【図２９】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルにより誘 細胞外ベシクルを投与する方法を示す図である。 導される全身性炎症反応の指標の一つである低体温症を 【図４５】図４２の方法でベシクルを処理した後、抗体 示す図である。 の量を比較したとき、マウス血清内黄色ブドウ球菌由来 【図３０】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる播 細胞外ベシクルに対するＩｇＧ抗体(antibody)の量が対 種性血管内凝固症の動物モデルを確立するためのプロト 50 照群に比べて増加したことを示す。 ( 7 ) JP 13 5785947 B2 2015.9.30 14 【図４６】図４２の方法でベシクルを処理した後、脾臓 気管、気管支、細気管支、肺胞などの内腔及び表面を意 細胞を黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルで刺激したと 味し、「泌尿生殖器」とは腎臓、尿管、膀胱、尿道、膣 き、細胞外ベシクル特異的にＴｈ１とＴｈ１７のサイト 、子宮頚部、子宮などの内腔及び表面を意味するが、こ カインが増加したことを示す結果である。 れに限定されるものではない。 【図４７】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルとｐｏｌ 【００２２】 ｙＩ：Ｃを複合投与した後、ブドウ球菌細胞をチャレン 本発明において、「周辺環境」とは、前記の体内を除い ジし、免疫反応指標を評価するプロトコルである。 た自然界を意味し、例えば、動物の体内を除いた室内空 【図４８】図４７の方法で得たマウス血清で細胞外ベシ 気、室外空気、土壌、海などを含むが、これに限定され クル特異ＩｇＧ抗体が増加した結果を示す図である。 るものではない。 【図４９】図４７の方法で得たマウス脾臓細胞でＩＦＮ 10 【００２３】 −γとＩＬ−１７のサイトカインが増加することを示す 本発明において、「グラム陽性細菌由来細胞外ベシクル グラフである。 」とは、体内又は周辺環境に生息するグラム陽性細菌が 【図５０】マウスの咽喉に２つの用量の黄色ブドウ球菌 自然的又は人工的に分泌するベシクルを含み、サイズが を投与した後の生存率を示す。 元来の細胞より小さいことを特徴とするが、これに限定 【図５１】黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルとｐｏｌ されるものではない。 ｙＩ：Ｃとが組み合わせられたワクチンによって、ブド 【００２４】 ウ球菌由来肺炎モデルでマウスの生存率が増加すること グラム陽性細菌は、一般にグラム染色で紫色に染色され を示す。 る細菌であって、グラム陰性細菌と比較して細胞外膜が 【図５２】マウスに腸球菌由来細胞外ベシクルを投与し なく、細胞壁にペプチドグリカンの量が多いことを特徴 た後で得た血清でベシクル特異ＩｇＧ抗体が増加したこ 20 とする。 とを示すグラフである。 【００２５】 【図５３】マウスに腸球菌由来細胞外ベシクルを処理し 系統分類上、厚い細胞壁と遺伝物質にＧ＋Ｃ量が低いこ た後で得た脾臓細胞でＩＦＮ−γサイトカインが増加す とを特徴とするファーミキューテス門をなすグラム陽性 ることを示すグラフである。 細菌としては、球状(cocci)のスタフィロコッカス、ス 【図５４】細胞外ベシクル内の１６Ｓ ｒＲＮＡをＲＴ トレプトコッカス及びエンテロコッカスなどが代表的で −ＰＣＲで分析し、ＤＮＡをＰＣＲで分析した結果であ あり、棒状(rod)のバシラス(Bacillus)、コリネバクテ る。 リウム、ノカルジア、クロストリジウム、ラクトバシラ 【発明を実施するための形態】 ス及びリステリアなどが代表的である。 【００２０】 【００２６】 本発明において、「グラム陽性細菌」とは、細胞に外膜 30 細胞壁がないが、進化的にファーミキューテスに由来す がない且つ細胞壁が厚い特徴を有するファーミキューテ るモリクテス綱もグラム陽性細菌に含まれるが、中でも ス門（Phylum マイコプラズマが代表的な細菌である。 Phylum Firmicutes）とアクチノバクテリア門（ Actinobacteria）、細胞壁がないが、進化的に 【００２７】 ファーミキューテス門由来のモリクテス綱（Class Moll ヒトで感染を引き起こす病原菌は、大部分がグラム陽性 icutes）を含む意味であり、細胞壁のある細菌としてス 細菌であるが、例えばストレプトコッカス(Streptococc タフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトコッカ us)、スタフィロコッカス、コリネバクテリウム、リス ス(Streptococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus) テリア、バシラス、クロストリジウムなどが代表的な病 、バシラス(Bacillus)、コリネバクテリウム(Corynebac 原菌である。 terium)、ノカルジア(Norcarida)、クロストリジウム(C 【００２８】 lostridium)、ラクトバシラス(Lactobacillus)、アクチ 40 １９６０年代に、電子顕微鏡を介してグラム陰性細菌が ノバクテリア(Actinobacteria)、及びリステリア(Liste 細胞外ベシクルを分泌するという事実が報告された。グ ria)などを含み、細胞壁がない細菌としてはマイコプラ ラム陰性細菌由来細胞外ベシクルは、球状をし、リン脂 ズマ(Mycoplasma)などを含む。 質二重層からなっており、略２０∼２００ｎｍのサイズ 【００２１】 を有する。グラム陰性細菌由来細胞外ベシクルは、ＬＰ 本発明において、「体内」とは動物皮膚の表面、動物粘 Ｓだけでなく、様々な外膜タンパク質(outer membrane 膜の内腔及び表面を含む意味であり、ここで、「粘膜」 protein)を持っている。最近、本発明者らは、腸内共生 とは消化器、呼吸器、泌尿生殖器を含む意味であり、例 細菌としての大腸菌由来細胞外ベシクルが全身的に吸収 えば、「消化器」とは口腔、食道、胃、小腸、大腸、直 されたとき、敗血症、血液凝固、肺気腫などの全身疾患 腸、肛門、胆道、胆嚢、膵臓管などの内 を起こすという事実を解明した。 腔及び表面を 意味し、「呼吸器」とは結膜、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、 50 【００２９】 ( 8 ) JP 15 5785947 B2 2015.9.30 16 グラム陰性細菌が分泌する細胞外ベシクルが主に細胞外 脈の血栓（thrombosis）形成による急性冠状動脈症候群 膜に由来するという偏見に基づいて、グラム陽性細菌は (acute coronary syndrome)、脳卒中(stroke)、静脈の 、細胞外膜がなく、細胞膜が厚い細胞壁で取り囲まれて 血栓形成による深部静脈血栓症(deep-vein thrombosis) いるということから、グラム陽性細菌が細胞外ベシクル 、血栓が剥離しながら生ずる塞栓（thrombosis）により を分泌するという事実は知られていない。 発生する肺動脈塞栓症(pulmonary embolism)などの疾病 【００３０】 の病因に関与するタンパク質である。また、ＳｂＩ(S.a 本発明者らは、球状のグラム陽性細菌である黄色ブドウ ureus IgG-binding protein)も存在したが、これは宿主 球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphy 免疫細胞の食作用(phagocytosis)を抑制して細菌の免疫 lococcus epidermidis)が細胞外ベシクルを分泌するこ 回避機能を維持するうえ、上皮細胞(epidermal cell)に とを見出し、電子顕微鏡上で略球状の形状をし、動的光 10 おけるＩＬ−１８の発現を誘導し、血清（serum）内の 散乱法で略１０∼１００ｎＭのサイズを有することが分 Ｉ かった。 こすことに関与することができる。 【００３１】 【００３４】 また、本発明者らは、棒状のグラム陽性細菌としての枯 プロテオーム分析によって黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ 草菌(Bacillus subtilis)が細胞外ベシクルを分泌する シクルに多様な疾病を引き起こすタンパク質が含まれて ことを発見し、電子顕微鏡上で略球状の形状を有し、動 いるという事実に基づいて、体外で黄色ブドウ球菌由来 的光散乱法で略１０∼１００ｎＭのサイズを有すること 細胞外ベシクルをマウスマクロファージに投与して炎症 が分かった。 媒介体の分泌を評価した。その結果、黄色ブドウ球菌由 【００３２】 来細胞外ベシクルの濃度に比例して炎症媒介体としての 本発明者らは、イン−ゲル(in-gel)トリプシンタンパク 20 ＴＮＦ−αとインターロイキン−６（ＩＬ−６）の分泌 質分解(tryptic digestion)方法とイン−ソリューショ が誘導された。 ン(in-solution)トリプシンタンパク質分解方法によっ 【００３５】 て黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルのプロテオーム分 また、体外で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウ 析を行ったが、イン−ゲル分解方法で４１個のタンパク スの線維芽細胞に投与して炎症媒体体の分泌を評価した 質が、イン−ソリューション分解方法で８４個のタンパ とき、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによって炎症 ク質が同定された。イン−ゲル方法の結果のうち、３５ 媒介体としてのＴＮＦ(tumor necrosis factor)−α、 個のタンパク質がイン−ソリューション方法で同定した ＩＬ−６だけでなく、ＴＳＬＰ(thymic stromal lympho タンパク質と重なり合って合計９０個の黄色ブドウ球菌 poietin)、エオタキシン(eotaxin)、ＭＩＰ(macrophage 由来細胞外ベシクルのタンパク質を見つけ出した。 【００３３】 ｇＥ抗体を増加させて皮膚にアトピー皮膚炎を引き起 inflammatory protein)−１αなどの分泌が誘導された 30 。 前記の方法で同定された黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシ 【００３６】 クルには、疾病に関連した様々なタンパク質が存在した 黄色ブドウ球菌は、皮膚に生息するが、特にアトピー皮 。病原性(virulence)タンパク質として敗血症又は毒素 膚炎患者の皮膚にはほぼ１００％生息すると知られてい ショック症候群(toxic shock syndrome)を起こすスーパ る。前記の体外実験結果に基づいて、黄色ブドウ球菌由 ー抗原(superantigen)としてのブドウ球菌エンテロトキ 来細胞外ベシクルを皮膚に投与したとき、アトピー皮膚 シンＱ(staphylococcus enterotoxin Q)、ブドウ球菌分 炎などの局所炎症を誘導することができるかを評価した 泌抗原(staphylococcus secretory antigen)（ｓｓａＡ 。テープストリッピング(tape stripping)の後、黄色ブ １、ｓｓａＡ２)などが存在した。また、赤血球を破壊 ドウ球菌由来細胞外ベシクルを週３回４週間投与したと し且つヘモグロビンを溶かすα−溶血素(alpha-hemolys き、アトピー患者から見られる炎症所見が観察された。 in)とγ−溶血素(gamma-hemolysin)などの毒素も含まれ 40 また、アトピー皮膚炎患者の皮膚洗浄液から細胞外ベシ ていた。また、宿主組織内への細菌の浸潤と潜入に直接 クルを分離した後、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル 関与するプロテアーゼとしてのスタホパインＡ(staphop 特異抗体と反応させたとき、患者の洗浄液から分離した ain A)と細胞外ＥＣＭ及び血漿結合タンパク質(extrace 細胞外ベシクルに黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが llular ECM and plasma binding protein)が存在した。 存在することを確認した。また、アトピー皮膚炎患者の また、血液凝固関連タンパク質としてはスタフィロコア 血清を分離した後、血清内黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ グラーゼ(staphylocoagulase)やフォン・ヴィレブラン シクル特異ＩｇＥ抗体を測定したとき、正常人に比べて ド因子−結合タンパク質(von Willebrand factor-bindi ＩｇＥ抗体が有意に増加していた。前記結果より、黄色 ng proteins)などが存在したが、このようなタンパク質 ブドウ球菌由来細胞外ベシクルがアトピー皮膚炎の発生 は、血管内凝固を特徴とする敗血症、毒素ショック症候 又は悪化に重要な原因因子であることが自明である。 群(toxic shocks syndrome)などの発生だけでなく、動 50 【００３７】 ( 9 ) JP 17 5785947 B2 2015.9.30 18 黄色ブドウ球菌は、上気道粘膜などの体内だけでなく、 、前記の探索方法で１０２種のプロドラッグのうち、１ 空気中に生息するものと知られている。本発明者らは、 ９種の候補薬物を発掘し、上述の疾病動物モデルで効能 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが呼吸器粘膜に作用 を検証した。これは、本発明で開発した候補薬物探索方 して局所炎症を誘導するかを評価した。黄色ブドウ球菌 法を用いてグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルにより発 由来細胞外ベシクルを１回鼻腔投与したとき、濃度に比 生する疾病を予防又は治療するための薬物を非常に効果 例して気管支肺胞洗浄液に炎症細胞の数が増加し、Ｔｈ 的に発掘することができることを意味する。 １７（１７型ヘルパーＴ、type １７ 【００４１】 helper T）細 胞の分化に重要なＩＬ−６の分泌も増加した。また、黄 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルは、多様なタンパク 色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを週２回３週間鼻腔投 質と毒素（ブドウ球菌エンテロトキシンＱ、Ｋ（Staphy 与したとき、気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の総数 10 lococcal enterotoxin だけでなく、好中球の数が顕著に増加し、Ｔｈ１７細胞 ＴＡ(lipoteichoic acid)とペプチドグリカンなどの免 から分泌されるＩＬ−１７も有意に増加した。前記結果 疫アジュバント(immune adjuvant)を含んでいる。本発 は、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが粘膜に作用し 明者らは、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが細菌感 、ＩＬ−１７を媒介とする好中球性炎症の発生に重要な 染予防及び治療のためのワクチンとして応用可能なのか 原因因子であることを意味する。 を確認するためにマウス内の免疫学的指標を評価したと 【００３８】 ともに、細胞外ベシクルの効能を増加させるか副作用を 敗血症は、局所細菌感染の際に病原菌由来物質が血管に 減少させることが可能な方法を考案した。その結果、黄 流入して全身的な炎症反応を引き起こす特徴を有する疾 色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルと合成ｄｓＲＮＡとし 患である。本発明者らは、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ てのｐｏｌｙＩ：Ｃ(polyinosinic-polycytidylic acid シクルを静脈注射して敗血症が誘導されるかを評価した 20 )を共に皮下注射したとき、マウス血清内の抗体（Ｉｇ 。高用量の細胞外ベシクルを静脈注射したとき、約４０ Ｇ）が増加し、脾臓細胞が分泌するサイトカインとして ％のマウスが死亡した。また、敗血症の指標である低体 のＩＦＮ(interferon)−γとＩＬ−１７が増加した。こ 温症が、細胞外ベシクルを投与した場合に観察された。 れは、ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを皮下注射したと これは、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが血管に流 きに抗体反応を誘導するうえ、Ｔｈ１（１型ヘルパーＴ 入すると敗血症が発生することを意味する。 細胞、type １ 【００３９】 反応を効率よく誘導することができることを意味する。 上述したプロテオーム分析において、黄色ブドウ球菌由 【００４２】 来細胞外ベシクルに、血液凝固関連タンパク質が含まれ 黄色ブドウ球菌による肺炎の発生に黄色ブドウ球菌由来 ていた。本発明者らは黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシク 細胞外ベシクルワクチンの効能を評価した。その結果、 ルが血液凝固及びその結果として血栓が形成されるかを 30 ベシクルワクチンを投与していない場合には肺炎で６０ 評価した。その結果、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシク ％のマウスが死亡したが、ベシクルワクチンを投与した ルを静脈注射、皮下注射、又は鼻腔投与した場合、血管 場合には肺炎による死亡が観察されなかった。これは、 内血液凝固の指標であるＤ−ｄｉｍｅｒの濃度が血清内 ベシクルワクチンを予め投与した場合に効率よく細菌感 で増加しており、他の指標である血小板の数が抹消血液 染を予防することができることを意味する。 内で減少していた。ベシクルによる血栓形成に関連し、 【００４３】 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを静脈注射、皮下注 本発明によればブドウ球菌由来細胞外ベシクルにより各 射、又は鼻腔投与した場合、肺血管に血栓(thrombus)が 種疾病の発生が可能であることを前述した。これは、細 観察された。前記結果は、ブドウ球菌由来細胞外ベシク 胞外ベシクルが疾病の発生に重要な原因因子であること ルが血管に流入したとき、血管に血液凝固による血栓又 は塞栓を誘導することができることを意味する。 Q,K））などのタンパク質とＬ helper T cell）及びＴｈ１７免疫 を意味する。疾病の原因因子を診断する方法を提供する 40 ために、細菌由来細胞外ベシクルに遺伝物質が存在する 【００４０】 かを確認した結果、１６Ｓ ｒＲＮＡ及びＤＮＡが存在 疾病を予防又は治療する薬物を開発するため、正確な原 することをＰＣＲ技法で確認した。これは、感染部位又 因物質を把握することは非常に重要である。たとえば、 は患者の血液などから採取した細胞外ベシクルの遺伝物 原因物質を体外から細胞に投与する過程で候補薬物を処 質の分析によって疾病の原因因子を効率よく診断するこ 理して効能を検証することができ、上述した動物モデル とが可能な方法を提供する。 に候補薬物を投与して効能を検証することができる。本 【００４４】 発明者らは、グラム陽性細菌由来細胞外ベシクルによる 以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示 疾病を予防又は治療する薬物を開発するために、黄色ブ する。ところが、下記の実施例は、本発明をより容易に ドウ球菌細胞外ベシクルを用いた候補薬物を選別する探 理解するために提供されるもので、本発明の内容を限定 索方法を確立し、これにより薬物を発掘した。すなわち 50 するものではない。 ( 10 ) JP 19 5785947 B2 2015.9.30 20 【実施例】 た上澄液を、孔径０．４５μｍのメンブレインフィルタ 【００４５】 ー(membrane filter)を１回通過させた後、分子量１０ 実施例１．黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)細 ０ｋＤａ以下のタンパク質を除去することが可能なメン 胞の電子顕微鏡観察 ブレインを装着したＱｕｉｘｓｔａｎｄ ｓｙｓｔｅｍ 黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１４４５８）をニュートリエ を用いて２５倍濃縮した。濃縮液を孔径０．２２μｍの ントブロス(nutrient broth)で培養して吸光度（６００ メンブレインフィルターを１回通過させた後、容量７０ ｎｍ）値が１．０となるようにした後、培養液を１０， ｍＬの超遠心分離チューブ(ultracentrifuge tube)に入 ０００×ｇで２０分間遠心分離した。沈殿した黄色ブド れて４℃で１５０，０００×ｇで３時間超遠心分離（ul ウ球菌細胞を２．５％グルタルアルデヒド(glutaraldeh tracetrifugation）した。沈殿物をＰＢＳ(phosphate b yde)で２時間固定(fix)させ、１％四酸化オスミウム(os 10 uffered saline)で懸濁（resuspension）した後、黄色 mium tetroxide)で１時間後固定(post-fix)させた後、 ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを得た。 エタノール（ethanol）で段階的脱水過程を経てエポキ 【００４９】 シ樹脂ブロック（epoxy resin）を作り、７０ｎｍの厚 ［プロテオーム分析のための細胞外ベシクル分離方法］ さに超薄切片を作った。細胞切片をグロー放電炭素コー 前記一般的な細胞外ベシクル分離方法と同様の方法で得 ト銅グリッド(glow-discharged carbon-coated copper られた濃縮液を、孔径０．２２μｍのメンブレインフィ grid)に３分間吸着させた後、２％酢酸ウラニル（urany ルターを１回通過させた後、容量７０ｍＬの超遠心分離 lacetate）とクエン酸鉛で染色（staining）した。ＪＥ チューブに入れて４℃で１５０，０００×ｇにて３時間 Ｍ１０１（Ｊｅｏｌ、Ｊａｐａｎ）透過電子顕微鏡（tr 超遠心分離した。沈殿物を５０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ２． ansmission electron microscope、ＴＥＭ）で観察した ２ｍＬで懸濁した後、容量５ｍＬの超遠心分離チューブ 。図１の透過電子顕微鏡イメージに示すように、黄色ブ 20 の底部に入れ、４０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ２ｍＬと１０％ ドウ球菌細胞の表面外にサイズ２０∼１００ｎｍの細胞 Ｏｐｔｉｐｒｅｐ０．８ｍＬを順次入れた。その後、２ 外ベシクルが分泌されることを分かる。 ００，０００×ｇで２時間超遠心分離を行った。４０％ 【００４６】 Ｏｐｔｉｐｒｅｐと１０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐとの間の層 走査電子顕微鏡（scanning electron microscope、ＳＥ から細胞外ベシクルを得た。 Ｍ）観察のために、上記と同様に培養した黄色ブドウ球 【００５０】 菌を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して沈澱させ 実施例３．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの特性 た後、２．５％グルタルアルデヒドロで１時間固定させ 実施例２の方法によって黄色ブドウ球菌から分離した細 、１％四酸化オスミウムで１時間後固定させた後、エタ 胞外ベシクルをグロー放電炭素コート銅グリッドに３分 ノールで段階的脱水過程を経て、ＣＯ２ システム（ＨＣ 間吸着させた。グリッドを蒸留水で洗浄した後、２％酢 Ｐ−２臨界点乾燥器（ＨＣＰ−２ 酸ウラニルで染色した。ＪＥＭ１０１透過電子顕微鏡で critical point d 30 ryer）、ＨＩＴＡＣＨ、Ｊａｐａｎ）を用いて臨界点乾 観察した。 燥(critical point drying)を行った。細菌サンプルを 【００５１】 試料台(stub)にのせて白金（Ｐｔ）でコートした後、Ｊ 図３ａの透過電子顕微鏡イメージに示すように、黄色ブ ＳＭ−７４０１Ｆ（Ｊｅｏｌ、Ｊａｐａｎ）走査電子顕 ドウ球菌由来細胞外ベシクルは閉じた球状をしており、 微鏡で観察した。 ２０∼１００ｎｍのサイズを有することが分かる。分離 【００４７】 した細胞外ベシクルをカバーガラス(cover glass)に付 図２の走査電子顕微鏡イメージに示すように、黄色ブド けた後、２．５％グルタルアルデヒドで１時間固定させ ウ球菌細胞の表面外に細胞外ベシクルが分泌されること 、１％四酸化オスミウムで１時間後固定させた後、エタ が分かる。 【００４８】 ノールで段階的脱水過程を経て、ＣＯ２ システムを用い 40 て臨界点乾燥を行った。細胞外ベシクルの付いたカバー 実施例２．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの製造 グラスを試料台にのせて白金でコートした後、ＪＳＭ− ［一般的な細胞外ベシクル分離方法］ ７４０１Ｆ走査電子顕微鏡で観察した。 黄色ブドウ球菌を、３ｍＬのニュートリエントブロスが 【００５２】 入っている試験管に接種し、３７℃で６時間培養した後 図３ｂの走査電子顕微鏡イメージに示すように、比較的 、その５ｍＬを５００ｍＬのニュートリエントブロスが 均一なサイズ（２０∼１００ｎｍ）の円形の細胞外ベシ 入っている２Ｌの三角フラスコに移して３７℃で４時間 クルが観察された。 培養し、吸光度（６００ｎｍ）値が１．０となるように 【００５３】 した。培養液を容量５００ｍＬの高速遠心分離チューブ 実施例２の方法によって黄色ブドウ球菌から分離した細 (high speed centrifuge tube)に入れた後、４℃で１０ 胞外ベシクルを１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希 ，０００×ｇで２分間遠心分離を行った。細菌を除去し 50 釈した。細胞外ベシクルが入っているＰＢＳ１ｍＬをキ ( 11 ) JP 21 5785947 B2 2015.9.30 22 ュベット(cuvette)に入れて動的光散乱粒度分析器で分 【００５７】 析し、その結果を図４に示した。 実施例４．表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis) 【００５４】 細胞の電子顕微鏡観察 図４に示すように、細胞外ベシクルは、サイズが２０∼ 表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１２２２８）をニュートリエ １００ｎｍであり、平均サイズは２８．３ｎｍであった ントブロスで培養して吸光度（６００ｎｍ）値が１．０ 。 となるようにした後、培養液を１０，０００×ｇで２０ 【００５５】 分間遠心分離した。沈澱した表皮ブドウ球菌細胞を２． 全体細胞(whole cell)、細胞壁(cell wall)、膜(membra ５％グルタルアルデヒドで２時間固定させ、１％四酸化 ne)、細胞質(cytosol)のタンパク質は次の方法で得た。 オスミウムで１時間後固定させた後、エタノールで段階 黄色ブドウ球菌を３ｍＬのニュートリエントブロスで培 10 的脱水過程を経てエポキシ樹脂ブロックを作り、７０ｎ 養して吸光度（６００ｎｍ）値が１．０となるようにし ｍの厚さに超薄切片を作った。細胞切片をグロー放電炭 た後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞沈 素コート銅グリッドに３分間吸着させた後、２％酢酸ウ 殿物を得た。前記沈殿物に２０μｇ／ｍＬのリソスタフ ラニルとクエン酸鉛で染色した。 ィンバッファ (lysostaphin)（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）を ＪＥＭ１０１透過電子顕微鏡で観察した。図６の透過電 入れて３７℃で１５分間処理した。超音波分解(sonicat 子顕微鏡イメージから、表皮ブドウ球菌細胞の表面外に ion)方法で細胞を完全に粉砕させた後、８０００×ｇで サイズ２０∼１００ｎｍの細胞外ベシクルが分泌される １０分間遠心分離して不溶性物質(insoluble material) ことが分かる。 を除去し、上澄液を全体細胞タンパク質として使用した 【００５８】 。プロトプラスト(protoplast)を形成するように黄色ブ 走査電子顕微鏡観察のために、上記と同様に培養した表 ドウ球菌細胞沈殿物に２０μｇ／ｍＬのリソスタフィン 20 皮ブドウ球菌を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し バッファ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）と１．１Ｍのスクロー て沈澱させた後、２．５％グルタルアルデヒドで１時間 ス（sucrose）を入れて３７℃で１５分間処理した。１ 固定させ、１％四酸化オスミウムで１時間後固定させた ０，０００×ｇで２０分間遠心分離した後、上澄液を細 後、エタノールで段階的脱水過程を経て、ＣＯ２ システ 胞壁タンパク質として使用し、沈殿物は低張膨張液(hyp ムを用いて臨界点乾燥を行った。サンプルを試料台にの otonic buffer)に溶かした後、さらに４０，０００×ｇ せて白金でコートした後、ＪＳＭ−７４０１Ｆ走査顕微 で１時間超高速遠心分離した。上澄液から細胞質タンパ 鏡で観察した。図７の走査電子顕微鏡イメージから、表 ク質を得、沈殿物はトリスバッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉ 皮ブドウ球菌細胞の表面外に細胞外ベシクルが分泌され ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁して膜タンパク質とし ることが分かる。 て使用した。分離された全体細胞、細胞壁、膜、細胞質 【００５９】 タンパク質と実施例２で分離された細胞外ベシクルタン 30 実施例５．表皮ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの製造 パク質をそれぞれ７μｇずつ用意した後、５×ローディ 表皮ブドウ球菌を３ｍＬのニュートリエントブロスが入 ング染色剤(loading dye)（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ っている試験管に接種し、３７℃で６時間培養した後、 ｌ、１０％ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー（ その中で５ｍＬを５００ｍＬのニュートリエントブロス bromophenol が入っている２Ｌの三角フラスコに移して３７℃で４時 blue）、５０％グリセロール（glycerol ））を１×となるように入れ、１００℃で１０分間高温 間培養し、吸光度（６００ｎｍ）値が１．０となるよう 処理した。１０％ポリアクリルアミドゲル（polyacryla にした。培養液を容量５００ｍＬの高速遠心分離チュー mide gel）を用意し、サンプルをロードした。８０Ｖ ブに入れた後、４℃、１０，０００×ｇで２０分間遠心 で２時間電気泳動した後、ゲル（gel）をクマシー（０ 分離した。細菌を除去した上澄液を、孔径０．４５μｍ ．２５％クマシーブリリアントブルー（Coomassie のメンブレインフィルターを１回通過させた後、分子量 lliant Bri Blue））で２時間染色する。染色済みのゲルを 40 １００ｋＤａ以下のタンパク質を除去することが可能な 脱染（destaining）溶液（メタノール：ＤＤＷ：酢酸＝ メンブレインを装着したＱｕｉｘｓｔａｎｄ ｓｙｓｔ ５：４：１）で６時間反応させた。 ｅｍを用いて２５倍濃縮した。濃縮液を孔径０．２２μ 【００５６】 ｍのメンブレインフィルターを１回通過させた後、容量 図５は黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルのタンパク質 ７０ｍＬの超遠心分離チューブに入れて４℃、１５０， パターンをクマシー染色法（Coomassie staining）によ ０００×ｇで３時間超遠心分離した。沈殿物をＰＢＳで って全体細胞タンパク質（ＷＣ）、細胞壁タンパク質（ 懸濁した後、表皮ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを得た ＣＷ）、膜タンパク質（ＭＰ）、細胞質タンパク質（Ｃ 。 Ｙ）のパターンと比較した結果であって、特定タンパク 【００６０】 質が細胞外ベシクル（ＥＶ）内に選別(sorting)される 実施例６．表皮ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの特性 ことが分かる。 50 実施例５の方法によって表皮ブドウ球菌から分離した細 ( 12 ) JP 23 5785947 B2 2015.9.30 24 胞外ベシクルをグロー放電炭素コート銅グリッドに３分 １％四酸化オスミニウムで１時間後固定させた後、エタ 間吸着させた。グリッドを蒸留水で洗浄した後、２％酢 ノールで段階的脱水過程を経て、ＣＯ２ システムを用い 酸ウラニルで染色し、ＪＥＭ１０１透過電子顕微鏡で観 て臨界点乾燥を行った。サンプルを試料台にのせて白金 察した。 でコートした後、ＪＳＭ−７４０１Ｆ走査電子顕微鏡で 【００６１】 観察した。図１１の走査電子顕微鏡イメージに示すよう 図８ａの透過電子顕微鏡イメージに示すように、表皮ブ に、枯草菌細胞の表面外に細胞外ベシクルが分泌される ドウ球菌由来細胞外ベシクルは閉じた球状をしており、 ことが分かる。 ２０∼１００ｎｍのサイズを有することが分かる。 【００６９】 【００６２】 実施例８．枯草菌由来細胞外ベシクルの製造 表皮ブドウ球菌から分離した細胞外ベシクルをカバーガ 10 枯草菌を３ｍＬのニュートリエントブロスが入っている ラスに付けた後、２．５％グルタルアルデヒドで１時間 試験管に接種し、３７℃で６時間培養した後、その中で 固定させ、１％四酸化オスミウムで１時間後固定させた ５ｍＬを５００ｍＬのニュートリエントブロスが入って 後、エタノールで段階的脱水過程を経て、ＣＯ２ システ いる２Ｌの三角フラスコに移して３７℃で４時間培養し ムを用いて臨界点乾燥を行った。細胞外ベシクルの付い て吸光度（６００ｎｍ）値が１．０となるようにした。 たカバーガラスを試料台にのせて白金でコートした後、 培養液を容量５００ｍＬの高速遠心分離チューブに入れ ＪＳＭ−７４０１Ｆ走査電子顕微鏡で観察した。 た後、４℃で６０００×ｇにて２０分間遠心分離を行っ 【００６３】 た。細菌を除去した上澄液を、孔径０．４５μｍのメン 図８ｂの走査電子顕微鏡イメージに示すように、比較的 ブレインフィルターを１回通過させた後、分子量１００ 均一なサイズ（２０∼１００ｎｍ）の円形の細胞外ベシ ｋＤａ以下のタンパク質を除去することが可能なメンブ クルが観察された。 20 レインを装着したＱｕｉｘｓｔａｎｄ ｓｙｓｔｅｍを 【００６４】 用いて２５倍濃縮した。濃縮液を孔径０．２２μｍのメ 実施例５の方法によって表皮ブドウ球菌から分離した細 ンブレインフィルターを通過させた後、容量７０ｍＬの 胞外ベシクルを１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希 超遠心分離チューブに入れて４℃で１５０，０００×ｇ 釈した。細胞外ベシクルが入っているＰＢＳ１ｍＬをキ にて３時間超遠心分離した。沈殿物をＰＢＳで懸濁した ュベットに入れて動的光散乱粒度分析器で分析し、その 後、枯草菌由来細胞外ベシクルを得た。 結果を図９に示した。 【００７０】 【００６５】 実施例９．枯草菌由来細胞外ベシクルの特性 図９に示すように、細胞外ベシクルはサイズが２０∼１ 実施例８の方法によって枯草菌から分離した細胞外ベシ ００ｎｍであり、平均サイズは３４ｎｍであった。 クルをグロー放電炭素コート銅グリッドに３分間吸着さ 【００６６】 30 せた。グリッドを蒸留水で洗浄した後、２％酢酸ウラニ 実施例７．枯草菌(Bacillus subtilis)細胞の電子顕微 ルで染色し、ＪＥＭ１０１透過電子顕微鏡で観察した。 鏡観察 【００７１】 枯草菌（ＫＣＴＣ３７２９）をニュートリエントブロス 図１２ａの透過電子顕微鏡イメージに示すように、枯草 で培養して吸光度（６００ｎｍ）値が１．０となるよう 菌由来細胞外ベシクルは閉じた球状をしており、２０∼ にした後、培養液を６０００×ｇで１５分間遠心分離し ２００ｎｍのサイズを有することが分かる。 た。沈澱した枯草菌細胞を２．５％グルタルアルデヒド 【００７２】 で２時間固定させ、１％四酸化オスミウムで１時間固定 枯草菌から分離した細胞外ベシクルをカバーガラスに付 させた後、エタノールで段階的脱水過程を経てエポキシ けた後、２．５％グルタルアルデヒドで１時間固定させ 樹脂ブロックを作り、７０ｎｍの厚さに超薄切片を作っ 、１％四酸化オスミウムで１時間後固定させた後、エタ た。細胞切片をグロー放電炭素コート銅グリッドに３分 40 ノールで段階的脱水過程を経て、ＣＯ２ システムを用い 間吸着させた後、２％酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色 て臨界点乾燥を行った。細胞外ベシクルの付いたカバー し、ＪＥＭ１０１透過電子顕微鏡で観察した。 ガラスを試料台にのせて白金でコートした後、ＪＳＭ− 【００６７】 ７４０１Ｆ走査電子顕微鏡で観察した。 図１０の透過電子顕微鏡イメージに示すように、枯草菌 【００７３】 細胞の表面外にサイズ２０∼１００ｎｍの細胞外ベシク 図１２ｂの走査電子顕微鏡イメージに示すように、比較 ルが分泌されることが分かる。 的均一なサイズ（２０∼２００ｎｍ）の円形の細胞外ベ 【００６８】 シクルが観察された。 走査電子顕微鏡観察のために、上記と同様に培養した枯 【００７４】 草菌を６，０００×ｇで１５分間遠心分離して沈澱させ 実施例８の方法によって枯草菌から分離した細胞外ベシ た後、２．５％グルタルアルデヒドで１時間固定させ、 50 クルを１μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希釈した。 ( 13 ) JP 25 5785947 B2 2015.9.30 26 細胞外ベシクルが入っているＰＢＳ１ｍＬをキュベット ウム（ammonium に入れて動的光散乱粒度分析器で分析し、その結果を図 Ｍのトリス（tris、２−カルボキシエチル（2-carbocye １３に示した。 thyl））ホスフィンヒドロクロライド（phosphine 【００７５】 rochloride）と常温で１時間還元させた。その後、サン 図１３に示すように、細胞外ベシクルはサイズが２０∼ プルに２５ｍＭのヨードアセトアミド（iodoacetamide １００ｎｍであり、平均サイズは３０ｎｍであった。 ）を入れて光を遮断した状態で常温で３０分間反応し、 【００７６】 タンパク質をアルキル化（alkylation）させた。最後に 前記例らは、グラム陽性細菌の代表的な菌株としての黄 、５ｎｇ／μＬのトリプシンを処理した後、３７℃で１ 色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、枯草菌などが生長過程 ６時間反応させた。分解されたペプチドはオフゲル分離 で自然的に細胞外ベシクルを分泌することを最初に解明 10 システム（OFFGEL fractionators system、Ａｇｉｌｅ したものであり、細胞外ベシクルを分離製造して多様な ｎｔ）を用いて分離した。まず、２４ｃｍのＩＰＧスト 特性を明らかにした実施例である。ところが、グラム陽 リップ（ＩＰＧ 性細菌に由来する細胞外ベシクルは、前記例で提示した 水和(IPG-rehydration)バッファで再水和反応(rehydrat 細菌にのみ限定されるのではなく、全てのガラム陽性細 e)させた。分解されたペプチドを２．８ｍＬのオフゲル 菌に該当する。分離された細胞外ベシクルを用いた疾病 （off-gel）バッファに溶かし、その中で１５０μＬを 動物モデルは、ヒトの疾病を引き起こす主要病原菌株と １レーン(lane)にロードした後、５０μＡ、８０００Ｖ しての黄色ブドウ球菌に焦点を合わせたが、これに限定 で４７時間電流を流してペプチドをそれぞれの等電点（ されるものではない。 ｐＩ）によって分離した。分離の後に得たサンプルはＣ 【００７７】 １８ ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱 実施例１０．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルのプロ 20 塩(desalting)した。 テオーム分析 【００７９】 ［イン−ゲル(in-gel)トリプシンタンパク質分解(trypt ［ナノイオン化質量分析（Ｎａｎｏ−ＬＣ−ＥＳＩ−Ｍ ic digestion)方法］ Ｓ／ＭＳ） 黄色ブドウ球菌から実施例２のプロテオーム分析のため イン−ゲル分解方法又はイン−ソリューション分解方法 の方法で分離した細胞外ベシクル５０μｇに５×ローデ で、用意した黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの分解 ィング染色剤を１×となるように仕込み、１００℃で１ ペプチドを、Ｃ１８レジン(resin)が充填された微細毛 ０分間高温処理した。４∼２０％ノベックストリス−グ 細管カラム(microcapillary column)（７５μｍ×１２ リシンゲル(Novex Tris-glycine gel)（Ｉｎｖｉｔｒｏ ｃｍ）にロードして次の方法で分離した：３∼３０％バ ｇｅｎ）を準備し、サンプルをロードした。９０Ｖで２ ッファＢ７０分；３０∼４０％バッファＢ５分；４０∼ 時間電気泳動した後、ゲルコード染色剤（ＧｅｌＣｏｄ 30 ９０％バッファＢ２０分；血流速度０．２μＬ／ｍｉｎ ｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｉｅｒｃ （バッファＡ組成：０．１％ギ酸（formic ｅ）で染色した。ゲルを１１個の同一サイズに切った後 bicarbonate））で懸濁した後、５ｍ strip、 hyd ｐＨ３∼１０）をＩＰＧ再 acid）ｉｎ Ｈ２ Ｏ、バッファＢ組成：０．１％ギ酸（formic aci 、１３ｎｇ／μＬのトリプシン（trypsin、Ｐｒｏｍｅ d）ｉｎ ＡＣＮ）。溶離した(eluted)ペプチドはＬＴＱ ｇａ）を３７℃で１６時間処理してタンパク質を分解さ −イオン−トラップ（ＬＴＱ-ion-trap）質量分析器(（ せた。 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を用いて分析した。 【００７８】 イオン化電気スプレイ(electrospray)の電圧は２．０ｋ ［イン−ソリューション(in-solution)トリプシンタン Ｖとし、３５％の規格化衝突エネルギー(normalized co パク質分解方法］ llision energy)条件で質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行っ 黄色ブドウ球菌から実施例２のプロテオーム分析のため た。全てのスペクトル（spectra）はデータ依存性スキ の方法で分離した細胞外ベシクル１００μｇにメタノー 40 ャン(data-dependent scan)で獲得した。ＬＴＱの媒介 ル（methanol）をサンプルの４倍体積で入れて混ぜた後 変数(parameter)はフルマススキャン(full MS scan)に 、９０００×ｇで１０秒間遠心分離した。その後、クロ おける５個の最大ピーク(most intense peak)を断片化( ロホルム（chloroform）を同量の体積で入れて混ぜた後 fragmentation)し、動的排除(dynamic exclusion)の繰 、さらに９０００×ｇで１０秒間遠心分離した。ＨＰＬ り返し回数(repeat count)を１で、繰り返し時間(repea Ｃ用の水をサンプルの３倍体積で入れて混ぜた後、１６ t duration)を３０秒、動的排除時間(dynamic exclusio ，０００×ｇで１分３０秒間遠心分離した。上澄液が２ n duration)を１８０秒、排除質量(exclusion mass)を 個の層からなると、上層のみを捨てた後、サンプル体積 ±１．５Ｄａ、動的排除のリストサイズ(list size)を ３倍のメタノールを入れて混ぜ、しかる後に、１６，０ ５０に設定した。 ００×ｇで３分間遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物を 【００８０】 分解溶液（６Ｍ尿素（urea）、４０ｍＭ重炭酸アンモニ 50 ［データ分析］ ( 14 ) JP 27 5785947 B2 2015.9.30 28 既存にアミノ酸塩基配列が構築された９個の黄色ブドウ 疫回避機能を維持するうえ、上皮細胞（epidermal 球菌データベースをｔａｒｇｅｔ（フォワード、forwar l）におけるＩＬ−１８の発現を誘導し、血清（serum） d）とｄｅｃｏｙ（リバースド、reversed）の塩基配列 内のＩｇＥ抗体を増加させてアトピー皮膚炎を引き起こ 組み合わせで一つのＮＣＢＩのデータベースを作った。 すことに関与することができる。 質量分析から出た全てのスペクトル（ＭＳ／ＭＳスペク 【００８３】 トル）を前記データベース及びＳＥＱＵＥＳＴエンジン （表１） ツール（ＳＥＱＵＥＳＴ 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルのプロテオーム engine tool）を用いて探索 した。同定したペプチドの仮陽性率(false-positive ra te)は１％以下にし、最小唯一(unique)ペプチドが２つ 以上マッチ（match）されたタンパク質のみを選別した 10 。 【００８１】 ［結果］ プロテオーム分析の結果、図１４に示すように、イン− ゲル分解方法で４１個のタンパク質が、イン−ソリュー ション分解方法で８４個のタンパクシツが同定された。 イン−ゲル方法の結果のうち、３５個のタンパク質がイ ン−ソリューション方法で同定したタンパク質と重なり 合って合計９０個の黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル のタンパク質を見つけ出した。同定された９０個のタン 20 パク質は表１に示した。 【００８２】 同定された細胞外ベシクルタンパク質の中には、疾病に 関連した多様なタンパク質が存在した。病原性(virulen ce)タンパク質として、敗血症又は毒素ショック症候群( toxic shock syndrome)を起こすスーパー抗原(superant igen)であるブドウ球菌エンテロトキシンＱ(staphyloco ccus enterotoxin Q)、ブドウ球菌分泌抗原(staphyloco ccus secretory antigen)ｓｓａＡ１とｓｓａＡ２が存 在した。また、赤血球を破壊し且つヘモグロビンを溶か 30 すα−溶血素(alpha-hemolysin)とγ−溶血素(gamma-he molysin)などの毒素が観察された。また、宿主組織内へ の細菌の浸潤と潜入に直接関与するプロテアーゼ(prote ase)としてのスタホパインＡ(staphopain A)と細胞外Ｅ ＣＭ及び血漿結合タンパク質(extracellularECM and pl asma binding protein)が存在した。また、血液凝固関 連タンパク質としてはスタフィロコアグラーゼ(staphyl ocoagulase)やフォン・ヴィレブランド因子−結合タン パク質(von Willebrand factor-binding proteins)など が存在したが、このようなタンパク質は、播種性血管内 40 凝固を特徴とする敗血症、毒素ショック症候群（toxic shock syndrome）などの発生だけでなく、動脈の血栓 （thrombosis）形成による急性冠状動脈症候群(acute c oronary syndrome)、脳卒中(stroke)、静脈の血栓形成 による深部静脈血栓症(deep-vein thrombosis)、血栓が 剥離しながら生ずる塞栓（embolism）により発生する肺 動脈塞栓症(pulmonary embolism)などの様々な血管の塞 栓症の病因に関与する。また、ＩｇＧ−結合タンパク質 (IgG-binding protein)の一つであるＳｂＩの場合、宿 主免疫細胞の食作用(phagocytosis)を抑制して細菌の免 50 cel ( 15 ) JP 29 5785947 B2 2015.9.30 30 【００８４】 実施例１１．体外における黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ シクルによるマクロファージの先天免疫反応 マウスマクロファージ（ＲＡＷ ２６４．７）を１×１ 10 ５ ０ となるように２４ウェルプレートに接種した後、２ ４時間培養した。ＰＢＳで１回洗浄した後、１０％ Ｆ ＢＳ／ＲＰＭＩ培地５００μＬを仕込み、それぞれ１、 １０、１００、１０００、１００００ｎｇ／ｍＬの濃度 で実施例２の方法によって分離した黄色ブドウ球菌由来 細胞外ベシクルを処理した後、１５時間培養した。培養 液を集めて４℃で５００×ｇにて１０分間遠心分離し、 上澄液を取った後、さらに３０００×ｇで２０分間遠心 分離し、上澄液を取った。分離された上澄液に入ってい るサイトカインの量をＥＬＩＳＡ(enzyme linked immun 20 osorbant assay)法によって測定した。 【００８５】 図１５はサイトカインの量を示す結果であって、細胞外 ベシクルの量に比例して炎症性サイトカインとしてのＴ ＮＦ−αとＩＬ−６が増加することが分かる。これは黄 色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルがマクロファージに作 用して先天免疫反応によって宿主内で炎症を誘発するこ とができることを意味する。 【００８６】 実施例１２．体外における黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ 30 シクルによる皮膚線維芽細胞の先天免疫反応 マウスの皮膚組織を採取して表皮を剥がした後、真皮部 分を細かく切り、ここにトリプシンを処理してそれぞれ の細胞に分離して皮膚線維芽細胞を得た。こうして得た 線維芽細胞を２４ウェルプレートに１×１０ ４ 個の細胞 を接種した後、２４時間培養した。培養された細胞のＤ ＭＥＭ培地に１、１０μｇ／ｍＬの黄色ブドウ球菌由来 細胞外ベシクルを処理した後、２４時間培養した。２４ 時間の後、培養液を集めて細胞を遠心分離した後、上澄 液を得、ＥＬＩＳＡ法で、上澄液に存在する炎症性サイ 40 トカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）と後天免疫の分化に 影響を与えるサイトカイン（ＴＳＬＰ）、ケモカイン（ ＭＩＰ−１α、エオタキシン（Eotaxin））の量を測定 して図１６に示した。 【００８７】 図１６は免疫及び炎症関連サイトカインの量が黄色ブド ウ球菌由来細胞外ベシクルによって増加することを示す 。これは、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが皮膚の 線維芽細胞に作用して炎症性サイトカインを発生させ、 免疫反応に作用する様々な免疫細胞を取り入れて炎症を 50 引き起こすことができることを意味する。 ( 16 ) JP 31 5785947 B2 2015.9.30 32 【００８８】 レートにコートした後、１％ＢＳＡ(Bovine Serum Albu 実施例１３．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを用い min)でブロッキング（blocking）し、得られた部分を２ たアトピー皮膚炎(atopic dermatitis)の動物モデル 時間反応させた。２時間の後、Ｔｗｅｅｎ２０が含有さ マウス（ＳＫＨ−ＨＲ１種、雌）の背にＤｕｒａｐｏｒ れたＰＢＳを用いてウェルをよく洗浄し、ビオチン基を ｅ（３Ｍ）テープを４∼６回取り付けたり取り外したり 持っている黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル抗原に特 することを繰り返し行った。その後、２ｃｍ×２ｃｍ程 異的な抗体を２時間処理した。その後、ストレプトアビ 度のガーゼをマウスの背にのせた後、１００μＬのＰＢ ジンに連結されたＨＲＰ(Horseradish peroxidase)を処 Ｓに溶けている０．１μｇ、５μｇ、１０μｇの黄色ブ 理し、ＨＲＰと反応して光を発生させる基質(substrate ドウ球菌由来細胞外ベシクルをガーゼに処理した後、Ｔ )としてのＢＭ−ＰＯＤを処理した後、発生する光の量 ｅｇａｄｅｒｍ（３Ｍ）を用いてガーゼが離れないよう 10 を測定してＲＬＵ値で表示した。 にマウスの背に固定した。これを週３回４週間繰り返し 【００９０】 行った。最終処理２４時間後にマウスを安楽死させ、皮 図２１は患者から得たｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄにおけ 膚組織を摘出した（図１７参照）。組織学的分析の結果 る黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルに存在する抗原が 、テープストリッピングの後に黄色ブドウ球菌由来細胞 存在することを示す。また、ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ 外ベシクルを投与した場合、アトピー皮膚炎患者の皮膚 から別にＥＶ ｆｒａｃｔｉｏｎのみを分離した結果よ 組織から見られる特徴としての表皮層が厚くなっており り、アトピー皮膚炎患者の患部に黄色ブドウ球菌由来細 、真皮層に浸潤した炎症細胞の中で好酸球と肥満細胞の 胞外ベシクルに存在する抗原が存在することを再び確認 浸潤を定量化したとき、生理食塩水を投与した場合に比 することができる。 べて細胞外ベシクルを投与した場合に上皮細胞層の肥厚 【００９１】 (epidermal thickness)と好酸球(eosinophils)と肥満細 20 実施例１５．アトピー皮膚炎患者の血清内における黄色 胞(mast cells)の浸潤が確然に増加した（図１８及び図 ブドウ球菌由来細胞外ベシクルに対する特異抗体（Ｉｇ １９参照）。また、皮膚組織におけるアトピー皮膚炎の Ｅ）の増加 特徴的な免疫学的異常所見である２型ヘルパーＴ細胞（ ０∼１０才のアトピー皮膚炎患者群２０名と多様な同年 type 2 helper T cell、Ｔｈ２細胞）免疫反応の発現様 齢帯の正常対照群２０名から血液を採取し、４℃で３５ 相を評価したとき、Ｔｈ２細胞から分泌されるサイトカ ００×ｇにて１０分間遠心分離した後、上澄液としての インとしてのＩＬ−４とＩＬ−５の濃度が細胞外ベシク 血清を取った。 ルを投与した場合に増加し、これらのサイトカインによ 【００９２】 って誘導されるケモカイン（chemokine）としてのエオ 図２２は細胞外ベシクルに対するＩｇＧ１とＩｇＥ抗体 タキシン（eotaxin）の濃度も細胞外ベシクルを投与し をＥＬＩＳＡ法で測定した結果であって、正常対照群に た場合に増加していた（図２０参照）。 30 比べてアトピー皮膚炎患者群において、黄色ブドウ球菌 【００８９】 由来細胞外ベシクルに特異的なＩｇＥ抗体が血清内に確 実施例１４．アトピー皮膚炎患者の皮膚洗浄液における 然に増加していた。 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの測定 【００９３】 アトピー皮膚炎患者の患部を滅菌食塩水で多数回洗浄し 実施例１６．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる 、４０ｍＬの洗浄液を集めた。洗浄液に存在する異物と 気道粘膜のＴｈ１７炎症 細菌を除去するために、５０００ｇ、１０，０００ｇで マウスをケタミンとランプン(Rampun)の投与によって麻 遠心分離した後、上澄液を集めて０．４５μｍ、０．２ 酔した後、１μｇ、１０μｇの黄色ブドウ球菌由来細胞 ２μｍのフィルターで濾過した。濾過した洗浄液を１０ 外ベシクルを３０μＬの生理食塩水に混ぜてマウスの鼻 ０ｋＤサイズの物質のみ濾過する道具（ｃｅｎｔｒｉｐ を介して吸入させた。先天免疫反応に対する黄色ブドウ ｒｅｐ）を用いて１ｍＬに濃縮させた。濃縮液（ｌａｖ 40 球菌由来細胞外ベシクルの影響を調べるために、２４時 ａｇｅ ｆｌｕｉｄ）の一部を保管し、残りは同体積の 間後に１ｍＬの生理食塩水を用いてマウスの気管支肺胞 滅菌食塩水を添加して１５０，０００ｇで超遠心分離し 洗浄液を収得し、炎症の度合いを確認した（図２３参照 て細胞外ベシクル（ＥＶ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。 ）。炎症細胞の数とＴｈ１７の分化を誘導する炎症性サ 得られたｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄとＥＶ ｆｒａｃｔｉ イトカインとしてのＩＬ−６の量を測定した結果、黄色 ｏｎに黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル（ＳＡ＿ＥＶ ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの量に比例して、気管支 ）が存在するかを確認するために、黄色ブドウ球菌由来 肺胞洗浄液に存在する炎症細胞（特に、好中球）の数と 細胞外ベシクルに特異的な抗体を用いてＥＬＩＳＡ法で ＩＬ−６の量が増加した（図２４参照）。これは黄色ブ 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル特異タンパク質が存 ドウ球菌細胞外ベシクルが気道粘膜にＴｈ１７関連炎症 在するかを評価した。具体的に、まず黄色ブドウ球菌由 を誘導することができることを意味する。 来細胞外ベシクルの抗原に特異的な抗体を９６ウェルプ 50 【００９４】 ( 17 ) JP 33 5785947 B2 2015.9.30 34 黄色ブドウ球菌細胞外ベシクルによる後天免疫反応を調 水（ＰＢＳ）をマウスの尾に血管注射（Intravenous、 べるために、週２回３週間マウスの鼻を介して１μｇの Ｉ．Ｖ．）して陰性対照群として使用した。摘出した肺 黄色ブドウ球菌細胞外ベシクルを吸入させ、最終吸入２ は細胞の核をヘマトキシリン(hematoxylin)で染色し（ ４時間後に気管支肺胞洗浄液を得て炎症反応を確認した 青色）、細胞質をエオシン(eosin)で染色する（赤色） （図２５参照）。 Ｈ＆Ｅ(Hematoxylin-Eosin)方法で染色した。 【００９５】 【０１０１】 図２６から分かるように、気管支肺胞洗浄液に存在する 図３１はＨ＆Ｅ染色結果を示すもので、細胞外ベシクル 炎症細胞が黄色ブドウ球菌細胞外ベシクルを吸入させた をマウスの尾に血管注射(intravenous、Ｉ．Ｖ．)した グループで大きく増加し、主に好中球が浸潤することを 場合には静脈に血栓が生じ、皮下注射（subcutatneous 確認した（図２６ａ参照）。また、気管支肺胞洗浄液に 10 、Ｓ．Ｃ．）した場合には血管周辺に炎症細胞の浸潤が 存在するサイトカインの量から気道粘膜の免疫反応を確 観察され、鼻腔投与（intranasal、Ｉ．Ｎ．）した場合 認した結果、Ｔｈ１７細胞から分泌されるサイトカイン には肺血管に血栓が観察された。 としてのＩＬ−１７の量が黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ 【０１０２】 シクルを吸入させたグループで大きく増加したことを確 マウス血液内の播種性血管内凝固症の指標を測定するた 認した（図２６ｂ参照）。 めに、マウスの心臓から採取した血液を抗凝固剤として 【００９６】 のクエン酸ナトリウム（sodium 前記結果は、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルが反復 比率となるように混ぜて血漿（plasma）にした。図３２ 的に気道を介して吸入されたとき、気道粘膜にＴｈ１７ は播種性血管内凝固症の指標であるＤ−ｄｉｍｅｒをＤ 免疫反応による好中球性炎症が発生することを意味する −ｄｉｍｅｒ診断用キットを用いて測定した結果であっ 。 20 citrate）と９：１の て、全ての投与経路において対照群に比べて血漿内Ｄ− 【００９７】 ｄｉｍｅｒの量が増加し、特に血管注射（Ｉ．Ｖ．）と 実施例１７．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる 皮下注射（Ｓ．Ｃ．）の際に血漿内Ｄ−ｄｉｍｅｒの増 敗血症 加量が高いことが分かった。また、播種性血管内凝固症 実施例２の方法で分離した黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ の別の指標である血小板の減少を測定するために、血漿 シクルを１５、２５、５０μｇの量でそれぞれマウス（ １μＬを１９９μＬの１％シュウ酸アンモニウム（ammo Ｃ５７Ｂ６種、雄）３匹に血管注射(intervenous)して nium １２時間ごとに死亡マウスの数を確認した（図２７参照 た後、血球計算器(hemacytometer)に１０μＬを入れ、 ）。 血小板（platelet）の個数を測定してその結果を図３３ 【００９８】 に示した。 その結果、図２８の生存（survival）グラフから分かる 30 【０１０３】 ように、２５μｇと５０μｇの細胞外ベシクルをマウス 図３３に示すように、全ての投与経路において、細胞外 に注入したときに生存率が６６．６％に減少し、一定量 ベシクルを処理した群は対照群に比べて血小板の数が減 以上の細胞外ベシクルによってマウスの死亡が誘導され 少する血小板減少症(thrombocytopenia)現象が観察され ることが分かる。 た。 【００９９】 【０１０４】 図２９はマウス（Ｃ５７Ｂ６種、雄）に黄色ブドウ球菌 実施例１９．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる 細胞外ベシクルを注射した後、１２時間マウスの体温を 疾病に対する予防又は治療候補薬物ｉｎ ｖｉｔｒｏス 測定した結果である。体温測定のために直腸体温計をマ クリーニングシステムの確立 ウスの肛門に注入して体温計のデジタル画面に表示され 前記実施例らに基づいて黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシ た数値を２時間ごとに記録した。その結果、１５、２５ 40 クルにより誘導される炎症性サトカインが各種疾病に大 、５０μｇの細胞外ベシクルによって全身性炎症反応（ きく関与することを確認した。これに基づいて炎症性サ systemic inflammatory response syndrome、ＳＩＲＳ イトカインの分泌を抑制する物質を発掘することが可能 ）の指標である体温が減少する低体温症が観察された。 なｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングシステムを開発した 【０１００】 。図３４は黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる炎 実施例１８．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる 症性サイトカインの分泌を抑制する物質を発掘するため 血管内血液凝固及び血栓形成 の模式図であって、実施例２の方法で製造した黄色ブド マウス（Ｃ５７Ｂ６種、雄）に実施例２の方法で分離し ウ球菌由来細胞外ベシクル（１μｇ／ｍＬ）を単独で或 た黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル５μｇを多様な経 いは薬物候補物質（１０μＭ）と共に実施例１１の方法 路を介して８時間間隔で３回投与し、６時間後にマウス で準備したマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７） を安楽させ、肺を摘出した（図３０参照）。 に処理した後、３７℃のインキュベータで１５時間培養 生理食塩 50 oxalate）で希釈し、湿潤板で１０分間反応させ ( 18 ) JP 35 5785947 B2 2015.9.30 36 した。１５時間後に上澄液を取った後、４℃、５００× ロフェン(Ketoprofen)、ケトロラックトリス塩(Ketorol ｇで１０分間遠心分離し、しかる後に、４℃で３０００ ac tris salt)、塩酸マプロチリン(Maprotiline HCl)、 ×ｇにて２０分間遠心分離を行った。分離された上澄液 メクロフェナム酸(Meclofenamic acid)、メラトニン(Me に入っている炎症性サイトカインとしてのＩＬ−６の量 latonin)、メトホルミン(Metformin)、塩酸メタピリレ をＥＬＩＳＡ法によって測定した。これはｉｎ ｖｉｔ ン(Methapyrilene HCl)、メチマゾール(Methimazole)、 ｒｏで黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルにより誘導さ メトカルバモール(Methocarbamol)、塩酸メトクロプラ れるＩＬ−６の分泌を抑制する候補物質をスクリーニン ミド(Metoclopramide HCl)、メトロニダゾール(Metroni グする方法を確立したもので、これにより黄色ブドウ球 dazole)、ナブメトン(Nabumetone)、ナプロキセン(Napr 菌由来細胞外ベシクルによる疾病に対する予防又は治療 候補薬物を提供することができる。 oxen)、臭化ネオスチグミン(Neostigmine Br)、ナイア 10 シン(Niacin)、塩酸ニカルジピン(Nicardipine HCl)、 【０１０５】 ニフェジピン(Nifedipine)、ニトロフラントイン (Nitr 実施例２０．Ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングシステム ofurantoin)、ニザチジン(Nizatidine)、ノルエチンド で発掘したプロドラッグの体内効能検証 ロン(Norethindrone)、ノルトリプチリン(Nortriptylin 図３５は実施例１９の方法で１０２種のプロドラッグ［ e)、塩酸オルフェナドリン(Orphenadrine HCl)、オキシ アセトアミノフェン(Acetaminophen)、アセチルシステ プチニン(Oxybutynin)、塩酸フェンフォルミン(Phenfor イン(Acetylcysteine)、アロプリノール(Allopurinol) min HCl)、フェニルブダゾン(Phenylbutazone)、フェニ 、塩酸アルプレノロール(Alprenolol HCl)、塩酸アミト トイン(Phenytoin)、ピロキシカム(Piroxicam)、プレド リプチリン(Amitriptyline HCl)、アトロピン(Atropine ニゾン(Prednisone)、プロベネシド(Probenecid)、塩酸 )、ブレチリウムトシレート(Bretylium tosylate)、ブ プロプラノロール(Propranolol HCl)、臭化ピリドスチ ロモフェニラミン(Bromopheniramine)、ブデソニド(Bud 20 グミン(Pyridostigmine Br)、塩酸ラニチジン(Ranitidi esonide)、塩酸ブスピロン(Buspirone HCl)、セフロキ ne HCl)、スピロノラクトン(Spironolactone)、スルフ シム(Cefuroxime)、 抱水クロラール(Chloral hydrate) ァメト(Sulfameth)、スルピリド(Sulpiride)、テノキシ 、塩酸クロルプロマジン(Chlorpromazine HCl)、シメチ カム(Tenoxicam)、テルフェナジン(Terfenadine)、テオ ジン(Cimetidine)、塩酸クロミプラミン(Clomipramine フィリン(Theophylline)、塩酸チクロピジン(Ticlopidi HCl)、 クロトリマゾール(Clotrimazole)、シクロベン ne HCl)、トラザミド(Tolazamide)、トラゾリン(Tolazo ザプリン(Cyclobenzaprine)、塩酸デシプラミン(Desipr line)、トルブタミド（Tolbutamide）、トルフェナム酸 amine HCl)、ジクロフェナク(Diclofenac)、ジフルニサ (Tolfenamic acid)、塩酸トラマドール(Tramadol HCl) ル(Diflunisal)、ジルチアゼム(Diltiazem)、塩酸ジフ 、トラニルシプロミン(Tranylcypromine)、塩酸トラゾ ェンヒドラミン(Diphenhydramine HCl)、ジソピラミド( ドン(Trazodone HCl)、トリアムテレン(Triamterene)、 Disopyramide)、ジスルフィラム(Disulfiram)、Ｄ−マ 30 トリクロルメチアジド(Trichlormethiazide)、塩酸トリ ンニトール(D-Mannitol)、ドキセピン(Doxepin)、ドキ ペレナミン(Tripelennamine HCl)、ベラパミル(Verapam シサイクリン水和物(Doxycycline hydrate)、コハク酸 il)、ワルファリン(Warfarin)］を処理してＩＬ−６の ドキシラミン(Doxylamine succinate)、塩化エドロホニ 量を陽性対照群に対して５０％未満に減少させる薬物候 ウム(Edrophonium chloride)、マレイン酸エナラプリル 補物質１９種［アセトアミノフェン(Acetaminophen)、 (Enalapril maleate)、ファモチジン(Famotidine)、フ 塩酸アミトリプチリン(Amitriptyline HCl)、アトロピ ェンブフェン(Fenbufen)、フェノフィブラート(Fenofib ン(Atropine)、ブレチリウムトシレート(Bretylium tos rate)、フェノプロフェンカルシウム塩水和物(Fenoprof ylate)、ブロモフェニラミン(Bromopheniramine)、塩酸 en calcium salt hydrate)、フルナリジン二塩酸塩(Flu クロルプロマジン(Chlorpromazine HCl)、塩酸クロミプ narizine dihydrochloride)、フルフェナジン二塩化物( ラミン(Clomipramine HCl)、シクロベンザプリン(Cyclo Fluphenazine dichloride)、フルルビプロフェン(Flurb 40 benzaprine)、塩酸デシプラミン(Desipramine HCl)、ジ iprofen)、フロセミド(Furosemide)、ゲムフィブロジル スルフィラム(Disulfiram)、ドキセピン(Doxepin)、ド (Gemfibrozil)、グリクラジド(Gliclazide)、グリピジ キシサイクリン水和物(Doxycycline hydrate)、コハク ド(Glipizide)、ハロペリドール(Haloperidol)、ヒドロ 酸ドキシラミン(Doxylamine succinate)、ハロペリドー クロロチアジド(Hydrochlorothiazide)、ヒドロフルメ ル(Haloperidol)、塩酸イミプラミン(Imipramine HCl) チアジド(Hydroflumethiazide)、塩酸ヒドロキシジン(H 、塩酸ニカルジピン(Nicardipine HCl)、ノルトリプチ ydroxyzine HCl)、イブプロフェン(Ibuprofen)、塩酸イ リン(Nortriptyline)、塩酸プロプラノロール(Proprano ミプラミン(Imipramine HCl) lol HCl)、テノキシカム(Tenoxicam)］を発掘した結果 、インダパミド(Indapamide)、インドール−２カルボン である。 酸(Indole-2-carboxylic acid)、インドメタジン(Indom 【０１０６】 ethacin)、イプラトロピウム（Ipratropium）、ケトプ 50 図３６は黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをＣ５７Ｂ ( 19 ) JP 37 5785947 B2 2015.9.30 38 Ｌ／６マウス（雄、６週、グループ当たり４匹）に鼻腔 外ベシクル１、５、２０μｇを１週間隔で３回皮下注射 で１μｇ注射して免疫反応を誘導したマウスモデルから によって投与し、１週目、２週目、３週目にマウスの目 、前記発掘したプロドラッグ（１０ｍｇ／ｋｇ）を共に の血管から血液を一部採取した（図４０参照）。採取し 腹腔注射して１２時間後に気管支肺胞洗浄液を得、気管 た血液を常温で３０分間凝固させ、４℃、３，５００× 支肺胞洗浄液内でＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡ法によって ｇで１０分間遠心分離した後、上澄液としての血清を取 定量した結果である。 った。 Ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングシステムを介して発掘 【０１１１】 したドキセピン（Doxepin）がブドウ球菌由来細胞外ベ 図４１は血清における細胞外ベシクルに対する免疫反応 シクルによる気管支肺胞洗浄液ＩＬ−６の増加を抑制す る効果があることを確認した。また、これをｉｎ ｖｉ の指標としてのＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した結 10 果であって、２回投与後から用量に依存的にベシクルタ ｔｒｏスクリーニングを介して発掘した他の薬物候補物 ンパク質に対する特異抗体形成が増加することを示す。 質としてのハロペリドール（Haloperidol）と共に注射 これは細胞外ベシクルを２回以上皮下注射したとき、黄 したとき、ＩＬ−６を減少させる効果が増大することを 色ブドウ球菌又は菌由来の細胞外ベシクルに含有された 確認した。 タンパク質に対する特異抗体が形成されることを意味す 【０１０７】 る。 これにより実施例１９で記述した黄色ブドウ球菌由来細 【０１１２】 胞外ベシクルを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物スクリーニ ブドウ球菌由来ベシクルの３回投与によってベシクル特 ングシステムが有効であることを確認し、細胞外ベシク 異Ｔ細胞免疫反応を評価するために、マウス（Ｃ５７Ｂ ルにより誘導される各種疾病に有効な薬物を提示した。 ６種、雄）に黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル２、５ 【０１０８】 20 、１０μｇを５日間隔で３回皮下注射によって投与し、 実施例２１．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルによる 最終接種２４時間後、脾臓細胞から免疫反応を測定した ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応 (図４２参照）。 実施例１１で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルをマウ 【０１１３】 スマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）に処理したとき 図４３は細胞外ベシクルの投与によるＴ細胞免疫反応を 、Ｔｈ１７細胞への分化を誘導するＩＬ−６の分泌が誘 測定するために、脾臓から免疫細胞を分離し、７２時間 導されることにより、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシク 体外で培養した後、培養上澄液におけるサイトカインを ルが炎症細胞と作用して宿主内で免疫反応を誘発するこ 測定した結果であって、Ｔｈ１細胞から分泌されるＩＦ とができることが分かった。マウスの骨髄由来樹枝状細 Ｎ−γとＴｈ１７細胞から分泌されるＩＬ−１７の分泌 胞（Bone marrow-derived dendritic cell、ＢＭＤＣ） が細胞外ベシクル（１０μｇ）を投与した群で有意に増 にＤｉＩ(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylind 30 加した。 ocarbocyanine perchlorate)染色剤で標識した黄色ブド 【０１１４】 ウ球菌由来細胞外ベシクルを処理し、６時間後に蛍光顕 前記結果は、黄色ブドウ球菌細胞外ベシクルを予防ワク 微鏡で観察したときに樹枝状細胞がベシクルを細胞内に チンとして投与したとき、体液性免疫反応であるＩｇＧ 獲得することを確認した（図３７参照）。 抗体の増加だけでなく、細菌に対する防御に重要なＴ細 【０１０９】 胞免疫反応からＴｈ１及びＴｈ１７免疫反応が誘導され また、細胞外ベシクルを樹枝状細胞に２４時間処理した 、黄色ブドウ球菌による感染と菌由来の細胞外ベシクル 後、樹脂状細胞の培養液を集めてＥＬＩＳＡ法でサイト による疾病を効率よく予防することができることを意味 カインを測定した結果、Ｔｈ１誘導サイトカインとして する。 のＩＬ−１２が増加し(図３８参照）、樹枝状細胞の活 【０１１５】 性化標識であるＣＤ４０とＭＨＣＩＩの発現が増加した 40 実施例２３．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル皮膚塗 （図３９参照）。以上の結果は、ブドウ球菌由来細胞外 抹（パッチ、patch）投与によるベシクル特異抗体及び ベシクルが抗原提示細胞に作用して後天免疫反応を増加 Ｔ細胞免疫反応 させるうえ、Ｔ細胞のＴｈ１及びＴｈ１７細胞への分化 実施例１３の方法で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル を誘導することを示唆する。 ５μｇを４週間皮膚にパッチ（patch）投与して免疫反 【０１１０】 応を評価した（図４４参照）。図４５は黄色ブドウ球菌 実施例２２．岐路ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの皮下 由来細胞外ベシクルの皮膚塗抹投与によるＩｇＧ抗体形 注射によるベシクル特異抗体及びＴ細胞免疫反応 成を示すもので、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル特 黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルワクチンによる抗体 異ＩｇＧ抗体が、生理食塩水を投与した場合に比べて細 免疫反応を測定するために、マウス（Ｃ５７Ｂ６種、雄 胞外ベシクルを投与した場合に大きく増加した。 ）に実施例２の方法で分離した黄色ブドウ球菌由来細胞 50 【０１１６】 ( 20 ) JP 39 5785947 B2 2015.9.30 40 細胞外ベシクルの投与によるＴ細胞免疫反応を測定する 【０１２２】 ために、脾臓から免疫細胞を分離し、２４時間黄色ブド 前記結果は、黄色ブドウ球菌細胞外ベシクルをｐｏｌｙ ウ球菌由来細胞外ベシクル０．１μｇ／ｍＬで体外で培 Ｉ：Ｃなどの免疫アジュバントと併合投与したとき、ベ 養した後、培養上澄液におけるサイトカインの濃度を測 シクルワクチン単独で投与する場合に比べて、体液性免 定して図４６に示した。 疫反応であるＩｇＧ抗体生成だけでなく、細菌に対する 【０１１７】 防御に重要なＴｈ１及びＴｈ１７免疫反応を効率よく誘 図４６に示すように、Ｔｈ１細胞から分泌されるＩＦＮ 導し、黄色ブドウ球菌による感染と菌由来の細胞外ベシ −γとＴｈ１７細胞から分泌されるＩＬ−１７の分泌が クルによる疾病を効率よく予防することができることを 、生理食塩水を投与した群に比べて黄色ブドウ球菌由来 細胞外ベシクルを投与した群で大きく増加した。 意味する。 10 【０１２３】 【０１１８】 実施例２５．黄色ブドウ球菌による肺炎モデルにおける 前記結果は、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルの投与 黄色ブドウ球菌由ベシクルワクチンとｐｏｌｙＩ：Ｃの によって黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル特異的なＴ 併合投与の効能 ｈ１及びＴｈ１７細胞免疫反応が誘導されたものであっ 黄色ブドウ球菌による肺炎モデルを確立するために、４ て、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルを皮膚塗抹投与 ×１０ したとき、黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル特異タン の咽喉内に投与し、吸入させた後、生存率を確認した。 パク質に対する抗体形成だけでなく、Ｔ細胞免疫反応を その結果、２４時間内に４×１０ ８ ＣＦＵを投与したマ 誘導することにより、黄色ブドウ球菌による感染と菌由 ウスは全て死亡したが、２×１０ ８ ＣＦＵを投与したマ 来の細胞外ベシクルによる疾病を効率よく予防又は治療 ウスの場合は４０％の生存率を示した（図５０参照）。 することができることを意味する。 20 ８ ８ 、２×１０ ＣＦＵの黄色ブドウ球菌をマウス 【０１２４】 【０１１９】 上述した黄色ブドウ球菌による肺炎モデルにおけるベシ 実施例２４．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクルと免疫 クルワクチンの効果を確認するために、実施例２３の方 アジュバント（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）の併合投与によるベシ 法で黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル５μｇとｐｏｌ クル特異抗体及びＴ細胞免疫反応 ｙＩ：Ｃ２０μｇを腹腔で３回投与した後、２×１０ マウス（Ｃ５７Ｂ６種、雄）に実施例２の方法で分離し ＣＦＵの黄色ブドウ球菌を咽喉内に投与して吸入させ、 た黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル５μｇを単独で或 生存率を確認した。その結果、ワクチンを投与したグル いは合成ｄｓＲＮＡとしてのｐｏｌｙＩ：Ｃ(polyinosi ープのマウスは２４時間が経っても１００％の生存率を ne-polycytidylic acid)２０μｇと組み合わせて１週間 示したが、ワクチンを投与していないマウスは４０％の 隔で３回腹腔注射で投与し、最終ワクチン注射後から７ 生存率を示した（図５１参照）。 日目と９日目に黄色ブドウ球菌（２．４×１０ ８ 個）を 30 ８ 【０１２５】 マウスに腹腔注射して感染させた（図４７参照）。採取 前記結果は、黄色ブドウ球菌による肺炎の発生及びこれ した血液を常温で３０分間凝固させ、４℃で３５００× による死亡をベシクルワクチンが非常に効率よく予防す ｇにて１０分間遠心分離した後、上澄液としての血清を ることができることを意味する。 取った。 【０１２６】 【０１２０】 実施例２６．腸球菌(Enterococcus faecalis)由来細胞 図４８は血清における細胞外ベシクルに対する免疫反応 外ベシクルの腹腔注射によるベシクル特異抗体及びＴ細 の指標としてのＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した結 胞免疫反応 果であって、細胞外ベシクルとｐｏｌｙＩ：Ｃを腹腔で マウス（Ｃ５７Ｂ６種、雄）に実施例２の方法と同様に 注射したとき、黄色ブドウ球菌又は菌由来の細胞外ベシ 腸球菌から細胞外ベシクルを分離した。実施例２２のよ クルに含有されたタンパク質に対する特異抗体が有意に 40 うに黄色ブドウ球菌の代わりに腸球菌由来細胞外ベシク 形成されることを示す。 ルによる体内免疫反応を評価するために、腸球菌由来ベ 【０１２１】 シクル５、１０μｇを１週間隔で２回腹腔注射で投与し また、黄色ブドウ球菌由来ベシクルとｐｏｌｙＩ：Ｃの 、最終投与７２時間後に免疫反応を評価した。 投与によってベシクル特異Ｔ細胞免疫反応を評価するた 【０１２７】 めに、マウスの脾臓から免疫細胞を分離した後、７２時 抗体を測定するために採取した血液を常温で３０分間凝 間体外で培養し、しかる後に、培養上澄液におけるサイ 固させ、４℃で３５００×ｇにて１０分間遠心分離した トカインを測定した。その結果、Ｔｈ１細胞から分泌さ 後、上澄液としての血清を取った。図５２は血清におけ れるＩＦＮ−γとＴｈ１７細胞から分泌されるＩＬ−１ る細胞外ベシクルに対する免疫反応の指標としてのＩｇ ７の分泌が細胞外ベシクルとｐｏｌｙＩ：Ｃを投与した Ｇ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した結果であって、これは 群において顕著に増加した（図４９参照）。 50 細胞外ベシクルを２回以上腹腔投与したときに、腸球菌 ( 21 ) JP 41 由来細胞外ベシクルに含有されたタンパク質に対する特 異抗体が形成されることを示す。 5785947 B2 2015.9.30 42 .coli)細胞を対照陰性群として用いた。逆転写(reverse transcription)ＰＣＲとＰＣＲの結果を２％アガロー 【０１２８】 ス（agarose）ゲルにかけて確認した結果を図５４に示 また、腸球菌由来細胞外ベシクルを投与した後、Ｔ細胞 した。 免疫反応を測定するために脾臓から免疫細胞を分離し、 【０１３２】 ７２時間体外で培養した後、培養上澄液におけるサイト 図５４に示すように、１２０塩基対（base カインを測定し、その結果を図５３に示した。 バンドを確認した。これは黄色ブドウ球菌由来細胞外ベ 【０１２９】 シクルにＲＮＡ及びＤＮＡが存在することを意味する。 図５３に示すように、Ｔｈ１細胞から分泌されるＩＦＮ 【０１３３】 −γの分泌が細胞外ベシクル（１０μｇ）を投与した群 10 前述した本発明の説明は例示のためのものである。本発 で有意に増加した。 明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、 【０１３０】 本発明の技術的思想又は必須的な特徴を変更することな 前記結果は、腸球菌細胞外ベシクルを予防ワクチンとし く、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理 て投与したとき、体液性免疫反応であるＩｇＧ抗体の増 解することができるであろう。よって、上述した実施例 加だけでなく、細菌に対する防御に重要なＴ細胞免疫反 は全ての面で例示的なもので、限定的なものではないと 応からＴｈ１免疫反応が誘導され、黄色腸球菌による感 理解すべきである 染と菌由来の細胞外ベシクルによる疾病を効率よく予防 【産業上の利用可能性】 することができることを意味する。 【０１３４】 【０１３１】 本発明のグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルを用いて疾 実施例２７．黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル内の１ 20 病動物モデルを構築し、これを用いて、グラム陽性細菌 ６Ｓ ｒＲＮＡ及びＤＮＡに対する遺伝型の分析 由来細胞外ベシクルにより発生する疾患を予防又は治療 黄色ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌由来細胞外ベシクル することが可能な薬物を効率よく発掘することができる （０．２、０．５、１．０μｇ）に対して黄色ブドウ球 。また、腸内共生細菌由来細胞外ベシクル自体又はこれ 菌特異１６Ｓ ｒＲＮＡのプライマー（フォワード（for を変形して投与して免疫反応を調節することにより、グ ward）：ＡＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡ、 ラム陽性細菌による感染又はグラム陽性細菌由来細胞外 リバース（reverse）：ＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＧＡＡＣ ベシクルによる疾病を効率よく予防又は治療するワクチ ＣＡＴＧＣＧ）を用いて遺伝子の存在有無をＰＣＲ(Pol ンの開発が可能であり、ひいてはグラム陽性細菌感染又 ymerase Chain Reaction)技術で確認した［９５℃５分 はグラム陽性細菌由来細胞外ベシクルにより発生する疾 −（９４℃３０秒、４６℃３０秒、７２℃２０秒）×３ 病の原因因子を診断する技術の開発が可能である。 ５サイクル−７２℃７分−４℃］。同一条件で大腸菌(E 30 【図１】 【図３】 【図２】 【図４】 pair）から ( 22 ) 【図５】 JP 【図９】 【図１０】 【図６】 【図１１】 【図１２】 【図７】 【図１３】 【図８】 5785947 B2 2015.9.30 ( 23 ) 【図１４】 JP 【図１８】 【図１５】 【図１９】 【図１６】 【図２０】 【図１７】 【図２１】 5785947 B2 2015.9.30 ( 24 ) JP 【図２２】 【図２９】 【図２３】 【図３０】 【図２４】 【図３１】 【図２５】 【図３２】 【図２６】 【図３３】 【図２７】 【図２８】 5785947 B2 2015.9.30 ( 25 ) 【図３４】 JP 【図３７】 【図３８】 【図３９】 【図３５】 【図４０】 【図４１】 【図３６】 【図４２】 5785947 B2 2015.9.30 ( 26 ) 【図４３】 JP 【図５０】 【図４４】 【図５１】 【図４５】 【図５２】 【図４６】 【図５３】 【図４７】 【図４８】 【図４９】 5785947 B2 2015.9.30 ( 27 ) JP 5785947 B2 2015.9.30 【図５４】 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩ Ａ６１Ｐ 31/04 (2006.01) Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｋ 39/085 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/085 Ａ６１Ｋ 39/09 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/09 Ａ６１Ｋ 39/05 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/05 Ａ６１Ｋ 39/07 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/07 Ａ６１Ｋ 39/08 (2006.01) Ａ６１Ｋ 39/08 (72)発明者 キム、ユン‐グン 大韓民国 ギョンサンブク‐ド ジ、ポステック (72)発明者 ギョンサンブク‐ド カンウォン‐ド ト、２０６ホ ７３ ベンジ ２１７‐７５３、ソクチョ−シ、キョ‐ドン、デーウ アパートメン １０６‐ドン ギョンサンブク‐ド ７５０‐９０１、ヨンジュ−シ、カフン１−ドン、１３８１−２ チェ、セン‐ジン ギョンサンブク‐ド ジ、ポステック (56)参考文献 ７９０‐８６３、ナム‐グ、ヘド２‐ドン、１０６−６ ベンジ 大韓民国 審査官 センター、２０８ホ キム、ジ‐ヒョン 大韓民国 (72)発明者 ベン ホン、ソン‐ウク 大韓民国 (72)発明者 ３１ リ、ウン‐ヨン 大韓民国 (72)発明者 バイオテック ７９０‐７８４、ナム‐グ、ヒョジャ‐ドン、サン 荒木 バイオテック ７９０‐７８４、ナム‐グ、ヒョジャ‐ドン、サン センター、３８０ホ 英則 特開平０９−１６３８９６（ＪＰ，Ａ） ３１ ベン ( 28 ) JP 5785947 B2 2015.9.30 EDA, T., et al.，Journal of General Microbiology，１９７７年，103，pp.1889-191 DORWARD, D.W., et al.，Appl. Environ. Microbiol.，１９９０年，56(6)，pp.1960-1962 KUEHN, M.J., et al.，Genes Dev.，２００５年，19，pp.2645-2655 MARSOLLIER, L., et al.，PLoS Pathog，２００７年，3(5)，e62，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/ 10.1371/journal.ppat.0030062 (58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名) Ｃ０７Ｇ １／００−９９／００ Ａ０１Ｋ ６７／００−６７／０２７ Ｃ１２Ｐ Ｃ１２Ｑ １／００− １／０４ １／００− １／０２ Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／３９ Ａ６１Ｐ １／００−４３／００ ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ） ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）