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カラムの出口は、検出器には繋がず、廃液ボトルに入れるよう
MS メソッド開発時などの LC 洗浄方法 MS メソッド開発時などの LC 洗浄方法 MS メソッド開発時など、LC システムの洗浄を行う際の参考例をご紹介します。 (※こちらの資料は簡易版です。詳細な内容は 3 ページ目以降をご参照ください) <準備するもの 4 点> ・水/メタノール/アセトニトリル/イソプロパノール = 1:1:1:1 (2%ギ酸含有) 混合溶液 例) 500 mL・・・① ・2%アンモニア水 例) 500 mL・・・② ・100%メタノール溶液 例) 500 mL・・・③ ※溶媒液量は、洗浄時間と送液流速を考慮し、作成してください。 ※上記溶媒の種類は、参考例です。汚れが落ちる、溶出力の高い溶媒を選択することが重要です。 ※上記溶媒 3 種類を 2 mL バイアルにも取り分けておきます (例) 各 3 本)。 ・不要となったカラム (背圧をかける事が目的。分析に使用するカラムは使用しないでください) 1. ①の溶媒を LC システムにセットする。移動相ライン全て、ニードル洗浄、パージ溶媒、シールウォッシュ 溶媒などのライン全てをこの①溶媒ボトルに入れる。 2. 全てのラインを、日常よりも時間長めに、回数多めに、十分にプライム (溶媒置換) する。 3. サンプルシリンジのプライムを十分に行う (日常よりも回数多めに実行)。 4. 不要となったカラムを取り付ける。 ※カラムの出口は、検出器には繋がず、廃液ボトルに入れるようにして下さい。 5. 高圧ポンプの場合は A/B=1:1、低圧ポンプの場合は A/B/C/D=1:1:1:1 になるように LC メソッ ドを作成する。例えば流速は 0.3 mL/min、RunTime は 0.1 min。 UPLC や 2795 の場合は、注入方式はフルループとする。 ※流速は早い場合と遅い場合、両方行うと洗浄効果は高まります。カラムの耐圧、システム圧を見な がら LC 条件を設定してください。 設定例： Tips PM41MSD4600 MS メソッド開発時などの LC 洗浄方法 6. サンプルリストを作成する。 注入回数を設定する (例) 30 回)。 ※注入回数は多ければ多い程、洗浄効果は高まります。但し、バルブ内には消耗部品がありますので、 不用意には実行しないでください。 ダミーの MS メソッドを用意する (取り込み時間は 0.1 min) 5. で作成した LC メソッド 準備しておいたバイアルをセットしたウェル位置を入力 （送液溶媒の種類とバイアル内の溶媒種類を揃える） 現在使用しているサンプルループ容量を 入力 (フルループで注入) 7. カラム出口ラインは廃液ボトルへ繋げる (MS へは入れない)。 8. 1～7 までが整ったら、測定実行する。 9. 次に、溶媒を②に変更し、1.～8.までを実行する。 ※②の溶媒 (2%アンモニア水) を使用する際は、カラムは取り付けず、代わりにユニオンを付けてくだ さい。アンモニア水をカラムに流しても良いと判断される場合は、不要となったカラムを付けておいても構 いません。 10. 次に、溶媒を③に変更し、1.～8.までを実行する。 ※③の溶媒 (100%メタノール溶液) を使用する際は、不要となったカラムを取り付けます。 11. その後、分析条件の溶媒で、LC システムのラインを十分にプライム (溶媒置換) し、分析を再開す る。 Tips PM41MSD4600 Controlling Contamination In LC/MS System UltraPerformance LC/MSⓇ と HPLC/MS における コンタミネーション・コントロール 1 Controlling Contamination In LC/MS System 目次 1 コンタミネーション（汚染）を防ぐために 溶媒の選択と取り扱いについて ........................................................................................................................ 4 1.1 不純物を含まない溶媒の使用 .................................................................................................................. 4 1.2 超純水の使用 ......................................................................................................................................... 4 1.3 微生物の発生の防止 ............................................................................................................................... 5 1.4 溶媒のデガス（脱気）................................................................................................................................ 5 1.5 添加剤について ....................................................................................................................................... 5 1.6 混合可能な溶媒の使用............................................................................................................................ 6 1.7 クリーンな容器に移動相を保存する .......................................................................................................... 6 1.8 ガラス機器の洗浄.................................................................................................................................... 6 サンプルの調製と取り扱いについて .................................................................................................................. 6 1.9 コールドとラップの使用 ............................................................................................................................ 6 1.10 クリーンなバイアル・キャップ・プレートの使用 .......................................................................................... 7 クリーンなフィッティングとチューブの使用 .......................................................................................................... 7 1.11 クリーンで不活性な部品を使用する ........................................................................................................ 7 手袋の着用 ...................................................................................................................................................... 7 1.12 パウダーフリー・ノンラテックスの手袋の使用 ....................................................................................... 7 クリーンなカラムの使用 .................................................................................................................................... 8 1.13 クリーンなカラムの使用 ...................................................................................................................... 8 1.14 カラムの洗浄 ......................................................................................................................................... 8 1.15 カラムの保存 ......................................................................................................................................... 8 実験室の環境について ..................................................................................................................................... 9 1.16 実験室の環境をクリーンに保つための注意事項 .................................................................................. 9 ２ コンタミネーションのトラブルシューティング 汚染されている箇所を特定する ...................................................................................................................... 10 2.1 汚染されている箇所を特定する ............................................................................................................ 10 LC システムのトラブルシューティング .............................................................................................................. 10 2.2 カラムを取り外す .............................................................................................................................. 10 2.3 移動相をチェックする ........................................................................................................................ 10 2.4 0μL 注入を行う ............................................................................................................................... 10 2.5 ソルベントマネージャーをチェックする ................................................................................................ 11 2.6 サンプルマネージャーをチェックする.................................................................................................. 11 2.7 カラムを再度接続する ...................................................................................................................... 12 2 Controlling Contamination In LC/MS System MS システムのトラブルシューティング.............................................................................................................. 12 2.8 ロックスプレーソース部分のチェック ...................................................................................................... 12 2.9 部品の取り外し・洗浄・交換・テスト ........................................................................................................ 12 汚染している部品の洗浄と交換 ...................................................................................................................... 12 2.10 部品の洗浄と交換............................................................................................................................ 12 ３ コンタミネーションを解消するための洗浄方法 LC システムの洗浄......................................................................................................................................... 13 3.1 一般的な洗浄ガイドライン................................................................................................................. 13 3.2 ソルベントマネージャーの洗浄 .......................................................................................................... 14 3.3 サンプルマネージャーの洗浄 ............................................................................................................ 14 3.4 カラムの洗浄 ................................................................................................................................... 14 MS システムの洗浄 ........................................................................................................................................ 15 3.5 部品の洗浄と交換............................................................................................................................ 15 3.6 フロントパネルインジェクター............................................................................................................. 16 3.7 API ソース........................................................................................................................................ 16 3.8 API プローブ .................................................................................................................................... 16 3.9 LC チューブ ..................................................................................................................................... 16 3.10 窒素ガスチューブ ............................................................................................................................. 16 3.11 窒素ガス発生装置 ........................................................................................................................... 16 ４ 主要なコンタミネーション 4.1 ポリエチレングリコール（PEG）または PEG に似たポリマー ................................................................. 17 4.2 金属イオン類 ................................................................................................................................... 18 4.3 フタル酸類（Phthalates）.................................................................................................................... 18 4.4 スリップ剤（アミド） ............................................................................................................................ 19 リファレンス 3 Controlling Contamination In LC/MS System 1 コンタミネーション（汚染）を防ぐために LC/MS システムのコンタミネーション(汚染)を最小限に抑えるには、以下の Good Laboratory Practice（GLP）に従いま す。 ・ 溶媒の選択と取り扱いについて ・ サンプルの調製と取り扱いについて ・ クリーンなフィッティングとチューブの使用 ・ 手袋の着用 ・ クリーンなカラムの使用 ・ 実験室環境 溶媒の選択と取り扱いについて コンタミネーションを防ぐには溶媒（移動相）を正しくする必要があります。Waters は溶媒使用に関して以下の手順を推 奨します。 Note：Waters の実験室での経験に基づく推奨事項です。あくまでも推奨の溶媒でありその使用に関しての責任は負い かねます。 1.1 不純物を含まない溶媒の使用 化学的な汚染がなく不純物を含まない溶媒や試薬を使用します。溶媒は製造工程において 0.2-μｍ（またはそれ 以下）のフィルターで精製されています。Waters では以下のブランドの溶媒かまたはそれと同等のものを推奨しま す。： ・J.T.BakerⓇ：LC/MS グレード ・Burdick&Jackson：B&J ブランドⓇ ・Fisher：OptimaⓇ LC/MS Grade NOTE：上記のブランド以外の溶媒を使用する場合は、それが事前に 0.2-μｍ（またはそれ以下）のフィルターで精 製されているかを確認します。 CAUTION:製造過程でフィルターろ過された溶媒をさらにろ過すると汚染される可能性があるためお勧めしませ ん。 1.2 超純水の使用 超純水（不純物を含まない、化学的汚染のない、18ＭΩcm の水）を使用します。超純水の使用により、長時間の 平衡化で水中の汚れがカラムに濃縮されるのを防ぎます。 超純水は UPLCTM/MS と HPLC/MS システムに悪影響を与える汚染物質を取り除いた水です。 精製プロセスは以下の通りです。 a.逆浸透膜(汚染物質の除去) b.イオン交換（イオンの除去） c.炭素の除去（有機物の除去） d.紫外線（UV）殺菌（微生物の殺菌） e.医薬品グレードの 0.2-μm メンブランフィルターによるろ過（微粒子の除去） 4 Controlling Contamination In LC/MS System CAUTION:精製装置をご使用の場合は、定期的なメンテナンスを実施して下さい。 24 時間以上装置をご使用になっていない場合は、装置のアウトレットに発生した細菌を除去するために 20 分間フ ラッシュ洗浄を行います。 微生物の発生を防ぐために精製した超純水は 24 時間以上保管しないで下さい。 NOTE：市販の超純水を使用する場合は、使用期限を確認し、期限を過ぎたものは廃棄します。 1.3 微生物の発生の防止 水系の移動相および水は微生物で汚染されやすく、グラジエント分析時のゴーストピークや、アイソクラティック分 析時のバックグラウンドの上昇の原因となります。微生物の発生は、フィルター、フリッツ、カラムの詰まりの原因 になると同時に、チェックバルブの故障にもつながります。このような問題から、カラム圧力とポンプの背圧が高く なり、最終的にカラム寿命を早めたり、システムの故障につながる場合もあります。 移動相中の微生物の発生を防ぐには、水系の移動相は日々調製するようにし、フィルター、デガスも行います。長 期にわたって使用しない（週末など）場合は、装置を水で完全に洗浄した後、最低でも 10％程度有機溶媒（アセト ニトリルやメタノールなど）を含む溶液で洗浄します。 CAUTION:90％以上水を含む溶液を満たして装置を保存しないで下さい。微生物による汚染の原因となります。 1.4 溶媒のデガス（脱気） 使用する移動相はすべてデガスします。脱気することによりベースラインが安定し、再現性のある分析結果が得ら れます。 NOTE：ご使用のシステムにインラインデガッサーが接続されている場合は、更なるデガスは必要ありません。 1.5 添加剤について a. バックグラウンドを小さくするため、移動相の添加剤の量は最低限（例：1.0％ではなく 0.1％蟻酸を使用する） に抑えます。 b. 高純度の添加剤を使用する。 c. 鉄等の金属イオン濃度が低い添加剤（例えば蟻酸）を使用する。酢酸は鉄や他のイオンを大量に含むため注 意が必要でうす。 d. 沈殿を防ぐため、有機溶媒比率の高い移動相での無機塩や添加物の使用は避けます。塩や添加剤はグラジ エントの最終過程の有機溶媒比率の高い条件下では沈殿します。 e. MS に使用できる揮発性の添加剤を使用します。 CAUTION:質量分析計をご使用の場合は、ナトリウム（Na+）、カリウム（K+）、またはリン酸（PO4-3）などの不揮発 性の添加剤はご使用になれません。 CAUTION:質量分析計にご使用いただける添加剤については、システムに付属しているドキュメントを参照して下 さい。 f. アンモニウム（NH4+）、酢酸塩、蟻酸塩、炭酸塩を含む添加剤を推奨します CAUTION:pH10 以 上 の 移 動 相 は シ リ カ を 溶 解 し ま す 。 シ ス テ ム に フ ュ ー ズ ド シ リ カ や ガ ラ ス 成 分 （ 例 ； NanoACQUITYTM UPLC システム）を含む場合、pH10 以上の移動相はご使用になれません。 g. 添加剤を含む移動相の使用後は、少なくともシステム容量の 5 倍量の水でウェットプライムを実施し、最低 10％以上有機溶媒（メタノールやアセトニトリル）を含む移動相で洗浄します。 5 Controlling Contamination In LC/MS System 1.6 混合可能な溶媒の使用 溶媒が混合可能かを確認します。40％以上有機溶媒を含む移動相の場合はタンパク質（細胞、血液、血清サンプ ル）の沈殿に注意します。沈殿したタンパク質はインジェクターやチューブの詰まり、装置への吸着などコンタミネ ーションの原因となります。 1.7 クリーンな容器に移動相を保存する a. 空気中からの汚染を避けるために蓋付き溶媒ビンに溶媒を保存します。 b. ホウ珪酸ガラスの瓶に溶媒を保存します。ホウ珪酸ガラスは type1、classA、または type3.3 を使用します。 水系の移動相は遮光の褐色ホウ珪酸ガラス容器に保存します。 可塑剤や汚染物質を含むプラスティック容器に溶媒を保存してはいけません。 c. アルミホイルを容器のカバーに用います。 CAUTION:パラフィルムや他のプラスティックフィルムをカバーに用いてはいけません。 d. 分析に適した（流速、分析時間に適した）できるだけ小さな容器を用います。 e. 溶媒は注ぎ足さず古いものは廃棄します。溶媒を取り替える場合は、使用する溶媒で容器とソルベントインレ ットフィルターを共洗いしてから溶媒を容器に注ぎます。その後、ウェットプライムを実施します。 1.8 ガラス機器の洗浄 a. 移動相を調製・保存するガラス容器は使用前に洗浄します。実験器具の洗浄は以下のように実施します。 ・有機溶媒で洗浄した後、水で共洗いする。 ・使用する溶媒で洗浄する。 ・より慎重な洗浄が必要な場合（容器の使用歴がわからない場合）、以下の手順を実行します。：10％蟻酸ま たは硝酸で超音波洗浄したのち、水、メタノールまたはアセトニトリル、その後再度水で洗浄します。これを もう 2 回繰り返します。 b. ガラス器具以外の容器はガラス容器とは別に洗浄します。 CAUTION:他のガラス器具と同時にガラスボトルを洗剤で洗ったり、洗浄設備で洗ったりすると、洗剤が残ることが あります。洗剤が残るとポリエチレングリコール（PEG）や他の汚れにより汚染されます。ビニルコートの容 器もコンタミネーションの原因となります。 c. 溶媒保存用のガラス器具は他のガラス器具とは別に保管します。 d. ガラス器具と溶媒ボトルが微生物で汚染された場合は、オートクレーブを使用します。汚染された場合、溶媒 ボトルと装置間にあるフィルターとチューブを外して交換します。最後にシステムをアセトニトリルまたはメタノ ールで一晩洗浄します。 サンプルの調製と取り扱いについて サンプルに不純物が含まれていてはいけません。同時に調製時にコンタミネーションが起こらないように取り扱い に十分注意します。 1.9 コールドとラップの使用 サンプルの濃縮、凍結乾燥、希釈を行う際は、コールドトラップを使用します。バキュームポンプのオイルは逆流し コンタミネーションの原因となるので注意します。 6 Controlling Contamination In LC/MS System 1.10 クリーンなバイアル・キャップ・プレートの使用 a. ウォーターズブランドのバイアル；汚染がないことを保障しています。他のメーカーのバイアルについては汚染 されていたり、キャップに接着剤などが使用されている場合があるので、サンプルマネージャーの汚染の原因 となります。 b. バイアルやキャップの包装に汚染がないこと（説明書を参照）； ・ 紙の包装を使っているバイアルやキャップは使用しないで下さい。紙が汚染の原因となります。 ・ サンプルマネージャーを汚染する可塑剤や接着剤を製造工程で使用していないセプタムをご使用下さい。 （PTFE セプタムのご使用をお勧めします。） c. ウォーターズブランドのウェルプレートをご使用下さい。他社ブランドのプレートでは可塑剤が浸潤している可 能性があります。（例えばフタル酸ジオクチル（diisooctylphthalates）） d. アルミホイルで覆われたプレートはアルミホイルが液面に接触しない限りは問題ありません。（液面に接触す ると反応する可能性があります。） クリーンなフィッティングとチューブの使用 1.11 クリーンで不活性な部品を使用する a. 溶媒やサンプルに接触する接続部品としてストッパー、O-リング、チェックバルブ、ソルベントインレットフィルタ ー（シンカー）があります。 b. ポリ塩化ビニル（polyvinylchloride）や PVC のようなポリマーのチューブを使用する場合は、可塑剤や他のコン タミ成分への注意が必要です。 手袋の着用 1.12 パウダーフリー・ノンラテックスの手袋の使用 以下のような場合ウォーターズの Sterile nitrile glove（表１参照）を使用します。 ・ 溶媒に触れる可能性のある HPLC 及び UPLC の部品を取り扱うとき ・ “Clitical Clean”の黄色いラベルのついた部品を交換するとき（図１参照） NOTE：指サックで代用しないで下さい。 表１：ニトリルグローブ Part Number 商品名 入数 700002964 Sterile nitrile glove 3 セット 700002965 Sterile nitrile glove 3 セット 図１－Critical Clean Label 7 Controlling Contamination In LC/MS System 図２－パッケージからグローブを取り出す 袖口は広げずに包装を開きます。 片方の袖に手を通します、袖は折り返したままにしておきます。もう一方の手も同様の操作を行います。最後に両方の 袖口を折り上げます。 CAUTION:手袋の指の部分に素手で触れないようにして手袋を着用します。手袋着用後は Critical‐Clean パーツの交 換など作業に必要な場所以外には触れないようにします。 クリーンなカラムの使用 1.13 クリーンなカラムの使用 UPLC 及び HPLC カラムでは不純物やタンパク質の沈殿物や有機物がカラムの入り口にトラップされます。これら の汚染物質により、カラム背圧が上昇し、選択性が変化し、カラム寿命が短くなります。更に、トラップされた汚染 物質がゆっくりと溶出しバックグラウンドノイズが大きくなります。 また、カラムは以下のような場合に移動相中の不純物を吸着します。 ・ C18 のような逆相カラムを水リッチな条件で長時間平衡化をした場合 ・ 有機溶媒の比率が低い溶媒条件でアイソクラティック分析をした場合 吸着された汚れはクロマトグラムにピークとして溶出する場合もあります。 1.14 カラムの洗浄 汚れを取り除き、カラムにダメージを与えない溶媒でカラムを洗浄します。定期的に 100%アセトニトリルのような有 機溶媒で洗浄します。カラムの洗浄方法については、各カラムの取り扱い説明書をご覧下さい。 WARNING：水酸化アンモニウムのような添加剤を含む pH8 を超えるアルカリ溶媒を洗浄に用いるとシリカゲルは 溶解してしまいます。もし pH8 を超える溶液を使用する場合は、高 pH に耐えられる、Waters ACQUITY UPLC BEH または XBridege のようなカラムを使用します。 WARNINGg：シリカカラムの洗浄方法については、各カラムの取り扱い説明書を参照します。 1.15 カラムの保存 カラムを保存する際は、出荷時の溶媒で充填します（例：100％アセトニトリル）。詳細は各カラムの取り扱い説明 書を参照して下さい。 8 Controlling Contamination In LC/MS System 実験室の環境について 1.16 実験室の環境をクリーンに保つための注意事項 実験室の環境が LC/MS のコンタミに影響する場合もあります。 ・ シロキサンは大気中に存在します。この物質は、防臭剤、化粧品に含まれており、ナノフロウのような条件下 ではコンタミネーションの原因となります。（図３を参照） 図 3－シロキサンがコンタミしている ESI+のスペクトル ・ フタル酸類も大気中に存在します。エアコンのフィルターから飛散し、空気と接触する溶媒や、試薬を汚染しま す。 9 Controlling Contamination In LC/MS System ２ コンタミネーションのトラブルシューティング 作業中に最大の注意を払ってもコンタミネーションを完全に防ぐことはできません。このセクションでは LC/MS システ ムにおける一般的なトラブルシューティングとコンタミネーションの洗浄方法をご紹介します。以下の手順はサンプルの 問題、LC 及び MS のハードウェアの問題に分けてご紹介します。 汚染されている箇所を特定する 2.1 汚染されている箇所を特定する a. ESI プローブを移動相以外のクリーンな溶媒でフラッシュ洗浄し、シリンジインフュージョンキットを直接 ESI プロ ーブに接続します。 b. MS システムに移動相を注入します。（例えば、0.3mL/min で A:B=50:50 の液を注入します。）HPLC とソルベン トマネージメントシステムは完全に切り離しておきます。 CAUTION:エレクトロスプレイ条件下で適切にイオン化させるために、100％の有機溶媒は注入しません。 ・ コンタミネーションレベルが小さくなれば、LC システムに汚染があると考えられますので、次のセクションの “LC システムのトラブルシューティング”を参照して下さい。 ・ コンタミネーションスペクトルの強度の減少が見られない場合は、MS システムに汚染があると考えられます。 “MS システムのトラブルシューティング”を参照します。（11 ページ） LC システムのトラブルシューティング 2.2 カラムを取り外す LC のトラブルシューティングを行うにはカラムを取り外します。カラムを取り外しユニオンを接続します。 NOTE：カラム内に汚れがトラップされ濃縮されるため、グラジエントの初期条件のような有機溶媒比率が低い溶媒 を長時間送液する際は注意が必要です。汚れは、グラジエント分析の際にはカラムから溶出されます。LC システムのトラブルシューティング、及びカラム洗浄後にコンタミネーションが起こるようであれば、カラムを 接続して 2.4 から 2.6g の手順（注入ステップは省く）を繰り返します。 2.3 移動相をチェックする 移動相 A と B を１mＬずつクリーンなバイアルに入れて混合します。この混合液を質量分析計に注入します。 ・ コンタミネーションピークが検出された場合、移動相か溶媒ボトルが汚染されていると考えられます。この場合、 1 章の“コンタミネーションを防ぐために”の“クリーンな溶媒と容器の使用”の項を参照します。 ・ 注入によってコンタミネーションピークが検出されない場合は、クリーンなプローブから質量分析計へ A:B=50:50 の混合溶媒を送液します。もしコンタミネーションピークが検出される場合は、原因はソルベントマネ ージャーまたはサンプルマネージャー（またはその両方）にあると考えられます。どのモジュールが汚染されて いるかは 2.4 の手順で特定します。 2.4 0μL 注入を行う 注入量を 0 で注入動作を行い、コンタミネーションピークが検出された場合は、ソルベントマネージャーに原因があ ります。2.5 の手順を実施します。コンタミネーションピークが確認されない場合は、サンプルマネージャーに原因 がありますので、2.6 の手順を実施します。 10 Controlling Contamination In LC/MS System 2.5 ソルベントマネージャーをチェックする サンプルマネージャーの接続を外して、ソルベントマネージャーと質量分析計を接続し、直接質量分析計に送液し ます。コンタミネーションピークが検出された場合は、ソルベントマネージャーに汚染があると考えられます。サンプ ルマネージャーを再度接続し、セクション 3.1 から 3.3 の手順を実施します。コンタミネーションピークが検出されな い場合は、サンプルマネージャーに原因があると考えられます。ステップ 2.6 の手順を実施します。 2.6 サンプルマネージャーをチェックする Table2 の洗浄液をサンプルマネージャーに送液し、廃液します。同じ溶媒をニードルウォッシュラインにも送液しま す。また、洗浄溶媒を大容量（例：3x オーバーフィルでフルループで注入）注入します。その後、移動相に戻し十分 にフラッシュします。コンタミネーションピークが検出された場合は、サンプル、希釈溶液、注入部、サンプル容器の いずれに原因があるかを特定します。 a. 希釈溶液として使用している有機溶媒、水、酸をチェックします。 水とアセトニトリルまたはメタノールを同比率で混合した溶媒に0.1%のギ酸を添加します。この溶液が汚染されて いるかどうかを確認するためにMS 検出器にシリンジポンプで注入します。このブランク溶液でコンタミネーショ ンピークが検出されない場合は、分析対象のサンプルに汚染があると考えられます。コンタミネーションピークが 検出された場合は、次のステップbへ進みます。 b. シリンジポンプまたはサンプル瓶をチェックします。 各々のコンポーネントをクリーニングするか取り替えます。それから、注入テストを繰り返してください。コンタミネ ーションピークが検出されず、シリンジポンプとサンプル瓶がクリーンならば、ステップｄへ進みます。 c. 注入量を変更してみます サンプル希釈液を取り替えても問題が解決しなければ、注入量を2倍かそれ以上に変更します。コンタミネーショ ンピークが注入量の変化に比例して増減するならば、サンプルが汚染されている可能性があるので、新しいサ ンプルを準備するか、または更なるサンプルのクリーンアップが必要かもしれません。 注入量の変化がコンタミネーションピークの大きさに影響しないならば、3章の“コンタミネーションの洗浄”に進 みます。 d. ニードルウォッシュ液をチェックします。 適切なニードル洗浄液が選択されているかを確認します。もし適切でないならば、正しい洗浄溶液を選択します。 更に注入を行い、コンタミネーションピークが検出されるようならば、ステップeの手順に進みます。 e. インジェクターのチューブ、フィッティング、特にインジェクターとカラムの出口の接続部品をチェックします。 デッドボリュームがある場合、コンタミネーション成分がそれらのスペースにたまる可能性があります。チューブ やフィッティングを交換してから注入を行いコンタミネーションピークが検出されるかどうかを確認します。もしコン タミネーションが検出されるのでしたら、ステップｆの手順に進みます。 f. ニードルを交換します。 交換後に注入を行い、コンタミネーションピークが検出された場合はステップgの手順に進みます。 g. インジェクターの部品を交換する。（例：ニードル洗浄ポート、インジェクターポートなど） オペレーターズガイドを参照し、交換可能な部品を確認します。移動相でシステムをフラッシュ洗浄し、もう一度 インジェクションを行います。 h. コンタミネーションが解消されないならば、“MSシステムのトラブルシューティング”の手順に進みます。 i. コンタミネーションが解消された場合は、ステップ2.7に進みます。 11 Controlling Contamination In LC/MS System 2.7 カラムを再度接続する カラムを接続し、コンタミネーションの有無を確認します。コンタミネーションピークが検出された場合は、カラムを 接続した状態で2.4～2.6gの手順を実施します。（シリンジポンプによる注入は省く） NOTE：カラムを接続し、LCシステムトラブルシューティングを行う場合は、2.6a～2.6bの手順は必要ありません。 MSシステムのトラブルシューティング LSシステムのトラブルシューティングで汚染されている箇所を特定できない場合は、MSシステム側に汚染があると考 えられます。 CAUTION:バックグラウンドノイズの原因特定と完全除去に時間を費やすのはお勧めしません。MSシステムはあ る程度のバックグラウンドを持ち、その程度はシステムの感度に応じて異なります。例えば、高感度な装 置ではより高いバックグラウンドが確認されます。 2.8 ロックスプレーソース部分のチェック MSのコンタミネーションはロックスプレーソース部分に一番見られます。 ・ ESIプローブ（プローブチップ、キャピラリー、ユニオン） ・ サンプルコーン ・ ロックスプレイバッフェル ・ イオンソースブロック ・ ソースエンクロージャー ・ APIソースとカラム出口のPEEKチューブ ・ 分岐部品やインジェクションバルブ（接続されている場合） ・ スロットルバルブ（接続されている場合） ・ PEEKサポートブロック ・ ファーストイオンガイド（またはhex） ・ LCのチューブ ・ 窒素ガスチューブ ・ 窒素ガス発生装置（例：ジェネレーター） 2.9 部品の取り外し・洗浄・交換・テスト 部品を取り外し、洗浄、交換、テストします。コンタミネーションが解消しない場合は、洗浄後に再度コンタミネーシ ョンが起こったと考えられます。この問題を避けるにはコンタミネーションの原因と考えられる部品をすべて同時に 洗浄し交換します。 汚染している部品の洗浄と交換 2.10 部品の洗浄と交換 洗浄後にバックグラウンドノイズが大きくなった場合は、最後に接続した部品を洗浄・交換します。LC/MSシステム の洗浄の具体的手順については3章の“コンタミネーションを解消するための洗浄方法”を参照します。 12 Controlling Contamination In LC/MS System ３ コンタミネーションを解消するための洗浄方法 LC/MSシステムの洗浄が必要な場合は、コンタミネーション成分とその原因の理解が非常に重要です。4章の“主要な コンタミネーション”を参照して下さい。 NOTE： ・ 洗浄の手順は実験室ですでに確立されている手順に基づきます。 ・ これらの手順は逆相のLC/MSシステムに適用されます。 LCシステムの洗浄 3.1 一般的な洗浄ガイドライン LCシステムの汚染物質を洗浄するには、高純度の有機溶媒を使用します。（セクション1.1を参照）汚染物質の成 分が分かっている場合は、それがよく溶ける溶媒を洗浄に使用します。次のページの表2にはLCの洗浄に最適な 溶媒が記載されています。100％アセトニトリルのような有機溶媒でシステムをフラッシュ洗浄し、コンタミネーショ ンチェックを行います。この手順をバックグラウンドノイズが許容範囲内になるまで繰り返します。 洗浄後、洗浄液を50％アセトニトリルまたは移動相で置換します。Mixture4を使用した場合は、pHが中性（pH=7付 近）になるまで超純水（セクション1.2参照）を送液します。 WARNING：溶媒を取り扱う場合は、Good Laboratory Practice（実験室安全基準）に従います。各溶媒の物理的性 質については、Material Safety Data Sheet（MSDS）を参照します。 WARNING：事故を避けるため溶媒や洗浄液を取り扱う際は、保護めがねと手袋を着用します。 CAUTION:洗浄前にシステムから検出器とカラムを切り離します。 CAUTION:UPLC、HPLCの洗浄には高純度の溶媒をご使用下さい。 NOTE：更なる溶媒への注意事項については、オペレーターズガイド(Waters’ Acquity UPLC System Operator's Guide(PN 71500082502))を参照します。 13 Controlling Contamination In LC/MS System 表2：LC洗浄のための推奨溶媒 a LC Mixture2a LC Mixture3a 一般的な洗浄溶媒 バックグラウンドが高 PEG とアミドの汚染物質の除 nanoACQUITY または高 い場合の一般的な洗浄 去 pH 条件のアプリケーシ 溶媒 LC Mixture1 目的 LC Mixture4a 強酸での洗浄 ョンには適しません。 注意事項 溶媒組成 ・pH10 以上の高 pH の洗浄液 ･最終手段として使用します はシリカを溶解してしまい ・有機溶媒と一緒に Mixture4 を ます。フューズドシリカや他 使用してはいけません。 のガラス成分のカラムを用 ・シールウォッシュ洗浄ライン いている nanoACQUITY のよう に Mixture4 を使用してはいけま なシステムの場合は せん。 Mixture3 を使用してはいけ ・燐酸洗浄の前に HASTELLOY（ハ ません。 ロステロイ）シンカーは外しま ・酸やアルカリでの洗浄後は す。 検出器を接続する前に、pH ・酸やアルカリでの洗浄後は検 が中性（7 付近）になるまで 出器を接続する前に、pH が中性 超純水でフラッシュ洗浄し （7 付近）になるまで超純水でフ ます。 ラッシュ洗浄します。 ・25% アセトニトリル ・50% アセトニトリル ・30% 燐酸 ル（イソプロピルアル ・25% メタノール ・49% 水 ・70% コール、IPA） ・25% 2-プロパノール ・1%水酸化アンモニウム ・100％ 2-プロパノー 水 ・25% 水 ・0.2% 蟻酸 a CAUTION:いずれの溶媒もMSシステム、カラムに送液しないよう注意します。 3.2 ソルベントマネージャーの洗浄 ソルベントマネージャー（またはソルベントマネージャーとサンプルマネージャーの両方）に洗浄溶媒を送液して洗 浄します。その後、移動相でフラッシュ洗浄し、完全に置換します。 3.3 サンプルマネージャーの洗浄 洗浄溶媒をサンプルマネージャーに送液します。同じ溶媒をニードルウォッシュ洗浄ラインに送液します。また、洗 浄溶媒を大容量（フルループで）注入します。その後、移動相を送液し完全に洗浄液を取り除きます。 3.4 カラムの洗浄 セクション1.14の“カラムの洗浄”を参照 14 Controlling Contamination In LC/MS System MSシステムの洗浄 3.5 部品の洗浄と交換 汚染の可能性のあるMSシステムの部品を取り外し、洗浄、交換します。洗浄には高純度の溶媒を使用し、MS部 品表面の汚れを取り除きます。新しい部品や洗浄後の部品が再度汚染されないように、正しい手順に従って作業 を進めます。多くの場合、流路に沿って部品を交換します。場合によっては汚染の可能性のある全ての部品を同 時に洗浄する方がよい場合もあります。高純度の溶媒とクリーンなガラス器具を用いるようにしてください。（1章の “コンタミネーションを防ぐために”を参照） a. クリーンな綿棒や起毛のない柔らかい布で部品を拭きます。 CAUTION:毒性物質に触れないように注意します。手袋や保護めがねを必ず着用します。 b. 部品を溶媒に浸して15分～1時間 超音波洗浄します。MS洗浄の推奨溶媒は表3を参照して下さい。 表3：MSシステム洗浄のための推奨溶媒 a 目的 MS Mixture1 MS Mixture2a MS Mixture3a MS Mixture4a MS Mixture5a 水溶性の汚染物質 非水性の汚染物質 さまざまな汚染物 金属製の部品のみに適 金属製の部品のみに適用、 の洗浄 の洗浄 質の洗浄 用、さまざまな汚染物質の 炭化水素系、オイル、グリス 洗浄 からの汚れの洗浄に用い最 終的にメタノールで超音波洗 浄 注意 ・PEEK 製の部品や T-wave ・PEEK 製の部品や T-wave 事項 アッセンブリは Mixture4 で アッセンブリは Mixture5 で超 超音波洗浄してはいけま 音波洗浄してはいけません。 せん。 ・Mixture5 での超音波洗浄 ・Mixture4 での超音波洗浄 後は適切な順序で洗浄し、 後は Mixture3 で超音波洗 最終的には水と混合可能な 浄します。 溶媒で超音波洗浄します。 溶媒 ・水 組成 ・アセトニトリル、メ ・50% 有機溶媒 ・45% アセトニトリルまたは ･塩素系の溶媒、ヘキサン、 タノール、2-プロパ ・50% 水 メタノール またはアセトン ノールのような有 ・45% 水 機溶媒 ･10% 蟻酸 a MS部品の具体的な洗浄手順はオペレーターズガイドを参照してください。 NOTE:汚染物質を取り除くには、複数のステップが必要です。各ステップではクリーンな溶媒を使用します。 c. コンタミネーションのレベルが小さくならない場合は、以下の溶媒の順序で部品を超音波洗浄します。 ・ ジクロロメタン ・ アセトン ・ 2-プロパノール 各過程で15分～1時間超音波洗浄をします。汚染の程度や超音波洗浄機の能力に応じて、洗浄時間は調節しま す。 CAUTION：PEEK部品やT-WAVEアッセンブリは塩素系溶媒、ヘキサン、アセトン、酸で洗浄してはいけません。こ れらの溶媒を使用すると部品にダメージを与えます。 15 Controlling Contamination In LC/MS System d. 洗浄前には、洗浄に使用する溶媒でガラス器具を共洗いします。 e. 洗浄が終了したら、部品から洗浄溶媒を取り除きます。クリーンな窒素ガスで部品を乾燥させます。 CAUTION：溶媒の跡を残さないように素早く乾燥させます。溶媒の跡が残るとMSのパフォーマンスに影響します。 3.6 フロントパネルインジェクター その他の配管の洗浄を行うには、正しい取り扱い手順に従ってフロントパネルを外し洗浄します。円形の溝にはめ 込まれているローターシールは汚染される可能性が高い部分なので十分に注意を払います。必要ならばシール の交換をします。 3.7 APIソース 通常の分析時にはAPIソースは大量のサンプルにさらされるため、MSシステムのコンタミネーション箇所としてはと ても可能性の高い部分といえます。一般的なメンテナンス手順に従って、ソース部分を取り外し、洗浄を行います。 APIの部品を15分～1時間超音波洗浄します。 CAUTION：溶媒の品質とガラス器具の洗浄についてのガイドラインを参照します。 NOTE：イオン源とその奥はコンタミネーションが起こりにくい箇所です。 3.8 APIプローブ APIプローブに洗浄溶媒を送液して洗浄し、洗浄溶媒はクリーンな廃液ボトルに排出します。以下のサブアッセン ブリを交換します： 3.9 ・ APCI（大気圧化学イオン化法）とESI（エレクトロスプレイイオン化法）のプローブキャピラリー ・ APCIフィルター ・ APCIヒーター ・ ESIプローブチップ ・ ESIプローブの後ろのLCユニオン LCチューブ 汚染されたチューブは洗浄するよりも、交換することをお勧めします。 3.10 窒素ガスチューブ 窒素ガスチューブが移動相やソースに溜まった溶媒により汚染された場合、全てのチューブとフィッティングを交換 します。 3.11 窒素ガス発生装置 窒素ガス発生装置やそのフィルターの老朽化が、コンタミネーションの原因となることがあります。一時的に窒素 ボンベに取り替えて確認します。窒素ボンベに取り替えてコンタミネーションが確認されなければ、窒素発生装置 のカートリッジが汚染されていると考えられます。 16 Controlling Contamination In LC/MS System ４ 主要なコンタミネーション ここでは、LC/MSシステムの主要な汚染物質をその原因とスペクトルと共にご紹介します。 4.1 ポリエチレングリコール（PEG）またはPEGに似たポリマー PEGは分子量分布をもつ合成ポリマーです。以下はPEG汚染の原因と考えられます。 a. 有機溶媒 ・ メタノール ・ 2-プロパノール ・ アセトニトリル ・ 水 b. MSのキャリブレーション試薬 c. ハンドクリーム d. 洗剤 ・ Triton X-100 等 ・ ガラス器具洗剤 e. Cutting Solution f. カラム 図4はPEGのスペクトルで、44Da毎の連続的なピークが検出されます。 図4 PEG汚染のスペクトル 17 Controlling Contamination In LC/MS System 4.2 金属イオン類 リチウム（Li）、ナトリウム（Na）、カリウム（K）、銅（Cu）、プラチナ（Pt）、鉄（Fe3+）のような金属イオンもコンタミネー ションの原因と考えられます。例えば鉄は酢酸や酢酸バッファーの酢酸イオンと付加イオンを生成します。以下の 原因によりLC/MSシステムは鉄に汚染されます。 ・ 水やアセトニトリルのような溶媒 ・ 酢酸（蟻酸よりも可能性は低い） ・ 蟻酸 ・ ステンレススチール部品 ・ 金属工具で組み立てられたチタンや不活性金属の部品 図5 Feと酢酸の付加イオンのスペクトル 基準イオン（ベースピークイオン、またはBPI）が検出される位置は、酢酸の結合数により異なります。一番上のス ペクトルはMassLynxアイソトープモデルに基づいて表示しています。 4.3 フタル酸類（Phthalates） フタル酸類は可塑剤として用いられる物質で、コンタミネーションの原因となります。水やその他の溶媒、実験室の 環境、チューブや水の保存容器のようなプラスティック器具、など幅広い箇所から汚染されます。フタル酸類には フタル酸ジエチルヘキシル（DEHP）、フタル酸ジイソデシル（DIDP）、フタル酸ジイソノニル（DINP）、フタル酸ジオク チル（DIOP）が含まれます。 フタル酸ジイソオクチルは以下の付加イオンを生成します。 ・ [M+H]+＝391 ・ [M+Na]+ ＝413 ・ [M+K]+ ＝429 ・ [2M+NH4]+ ＝798 ・ [2M+Na]+ ＝803 18 Controlling Contamination In LC/MS System 4.4 スリップ剤（アミド） スリップ剤やアミドを含むプラスティック製の袋は使用しないで下さい。3種類のアミドが一般的に使用されていま す。 ・ オレアミド（[M+H]+＝282） ・ ステルアミド（[M+H]+＝284） ・ エルカミド（[M+H]+＝338） 図6はアミドのスペクトルです。 図6：ジッパー付袋のオレアミドとエルカミドのコンタミネーションスペクトル 19 Controlling Contamination In LC/MS System リファレンス ¾ ASTM International. “Standard Specification for Glasses in Laboratory Apparatus.” E438 – 92. ¾ Ende, Manfred, and Spiteller, erhard. „Ccontaminants in mass spectromety.“ Mass Spectrometry Reviews 1982, 1, 29-62. ¾ ISO 3585: 1998 E. “Borosilicate glass 3.3 – properties,” 1998. ¾ Schlosser, Andreas, and Volkmer-Engert, Rudolf. „Volatile polydimethylcyclosiloxanes in the ambient laboratory air identified as source of extreme background signals in nanoelectrozpray mass spectrometry.” Journal of Mass Spectrometry, 2003, 38, 523525. ¾ Waters® LC/MS Certified Sample Vials, 720001517EN, Waters Corporation, Milford, 2006. ¾ Williams, Stuart. “Ghost peaks in reversed-phase gradient HPLC: a review and update”. Journal of Chromatography A, 2004, 1052, 1-11. 20