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PrimeSTAR®シリーズ
◆PrimeSTAR ®シリーズおよび関連製品リスト 【PrimeSTAR ®シリーズ】 製品名 容量 製品コード PrimeSTAR ® GXL DNA Polymerase PrimeSTAR ® HS DNA Polymerase R045A ¥30,000 250 U R010A ¥30,000 R010B(A × 4) ¥96,000 R040A ¥22,000 100回(50 μl反応系) PrimeSTAR HS(Premix) ¥100,000 100回(50 μl反応系) 1,000 U ® ¥35,000 R050B(A × 4) 1,000 U PrimeSTAR ® Max DNA Polymerase 価格(税別) R050A 250 U 【関連製品】 製品名 概要 ® 容量 製品コード 50回 R023A ¥48,000 200回 R023B ¥160,000 価格(税別) 50回 R022A ¥44,000 200回 R022B ¥145,000 PrimeScript ® II High Fidelity RT-PCR Kit PCRにはPrimeSTAR GXLを使用 PrimeScript ® High Fidelity RT-PCR Kit PCRにはPrimeSTAR Maxを使用 Mighty Cloning Reagent Set( Blunt End) 平滑末端クローニング 20回 6027 ¥29,000 Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR ® 平滑末端産物にAを付加して TAクローニング 20回 6019 ¥32,000 PrimeSTAR ® Mutagenesis Basal Kit PrimeSTAR® Maxで迅速、確実に 変異導入 25回 R046A ¥19,000 10回 639633 ¥22,000 10回 639639 ¥24,000 10回 639648 ¥21,000 ® In-Fusion ® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer In-Fusion ® HD Cloning Kit w/NucleoSpin ® ® In-Fusion HD Cloning Kit ★1,3 ★1,2 In-Fusionクローニング用試薬 ★1 ★1:製品にコンピテントセルは含まれません (コンピテントセルを含む製品も別にご用意しています) 。 ★2:PCR産物がシングルバンドの場合に増幅産物をそのままIn-Fusion反応に使用するための前処理試薬、Cloning Enhancerが含まれています。 ★3:PCR産物が複数バンドの場合にゲル精製を行うスピンカラムが含まれています。 ※In-Fusion® HD Cloning Kitシリーズはクロンテック社の製品です。 ◆関連製品ピックアップ ® PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit 製品コード R023A/B アクセサリータンパク質を添加したPrimeScript ® II RTaseと、長鎖増幅やGCリッチターゲットに強いPrimeSTAR ® GXLを組み 合わせて、RT-PCRに至適化したキットです。正確性を必要とする長鎖ターゲットのRT-PCRに最適です。 非常に広い鋳型量許容範囲 【方法】HL60細胞由来のtotal RNA (100 pg∼6 μg) を鋳型として、 Oligo dT Primerを用いた逆転写反応(20 μl反応系) を行い、 その一部(5 μl) をPCR (50 μl反応系) に使用し、TFR 4 kbを増幅した。 【結果】本キットを用いたRT-PCRではRT時のtotal RNA量を6 μg/20 μ l反応 系まで増やしてもTFR 4 kbの良好な増幅が見られました。 PCRの鋳型量 ; 左からtotal RNA 25, 250 pg, 2.5, 25, 50, 125, 250, 500, 750 ng, 1, 1.25, 1.5 μg相当 Hot Start PCR : Licensed under U.S. Patent No. 5,338,671 and 5,587,287 and corresponding patents in other countries. その他のライセンス (最新のライセンス情報) に関しては弊社ウェブサイトにてご確認ください。 本パンフレットに記載されている商品名等は、特に記載はなくても各社の商標、 または登録商標です。 ・本パンフレットで紹介した製品はすべて研究用として販売しております。 ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。 また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。 ・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。 ・本パンフレット記載の価格は2012年2月1日現在の希望小売価格です。価格に消費税は含まれておりません。 取扱店 東日本販売課 西日本販売課 TEL 03-3271-8553 FAX 03-3271-7282 TEL 077-543-7297 FAX 077-543-7293 TaKaRa テクニカルサポートライン 製品の技術的なご質問に専門の係がお応えします。 TEL 077-543-6116 FAX 077-543-1977 タカラバイオウェブサイト クロンテックウェブサイト http://www.takara-bio.co.jp http://clontech.takara-bio.co.jp 高正確性PCR酵素 2012年2月作成32K PrimeSTAR®シリーズ (2012年2月改訂版) PrimeSTAR®シリーズのベーシック酵素 基礎知識 ∼PCR酵素の種類と特性∼ PCRに利用される耐熱性DNAポリメラーゼは、構造的に大きく、下記 の2つのタイプに分けられます。 ● Pol Ⅰ型 (family A) α型 (family B) DNA Polymeraseをはじめとする 好熱性真生細菌由来のPol Ⅰ型(family A)酵素 ● DNA Polymeraseに代表される 超好熱性古細菌由来のα型(family B)酵素 由来 Prokaryote Archaea 3 -5 exonuclease活性 × ○ 5 -3 exonuclease活性 ○ × dA付加 増幅産物の3'末端形状 一般的にPol Ⅰ型酵素は伸長活性は強いのですが、 3 →5 exonuclease 活性を持たず、TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase) 活性 によりPCR産物の3 -末端にdAが付加されます。 これに対してα型酵素 はより耐熱性に優れ、強力な3 →5 exonuclease活性を示しますが、 伸長速度が遅く3 -末端は平滑末端になります。 酵素名 しかし、従来のα型酵素はその特性から、 ・反応に長時間かかる ・増幅効率が悪く、特に長鎖増幅やGCリッチ、ATリッチターゲットには不向き ・鋳型DNAの許容量の範囲が狭く、鋳型DNAを多量に加えた場合、 かえって PCR反応が阻害される ・反応条件がシビアで、手軽に使えない などの弱点がありました。 ・PrimeSTAR®シリーズ ・ など 間違った塩基の取り込み 5‐GATCTG 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA 3 ‒5 exonuclease による塩基の除去 G 5‐GATCT 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA 正しい塩基の取り込み A 5‐GATCT 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA PrimeSTAR シリーズと各種PCR酵素との正確性の比較 (15/484,429) (30/486,923) PrimeSTAR® HS と各社High Fidelity PCR酵素の増幅効率の比較 ヒトゲノムDNAを鋳型として、PrimeSTAR ® HSと各社高正確性PCR酵素、並びにr をそれぞれ推奨条件で用いて増幅効率を比較 しました。PrimeSTAR® HSは、他のHigh Fidelity PCR酵素と比べ、鋳型量が少ない場合でも効率よく増幅できました。 1 2 3 4 M N 1 2 3 B社酵素1 4 M N 1 2 3 C社酵素1 4 M N 1 2 3 D社酵素1 4 M N 1 2 3 E社酵素1 4 M N 1 2 3 r 4 M N 1 2 3 4 M 30サイクル 鋳型量 (50 μl反応系); レーンN:Negative Control (鋳型なし) 1 :100 pg 2 :1 ng 3 :10 ng 4 :100 ng M :λd III digest PrimeSTAR® HSを用いて様々な長さのターゲットを同一条件で増幅 PrimeSTAR® HSを用いて、同一PCR条件で様々な鎖長のターゲットの増幅を試みたところ、0.5∼8.5 kbのターゲットをいずれも効率よく 増幅できました。 (13/199,186) M1 M2 rTaq DNA Polymerase (64/159,994) 0 0.005 0.01 0.015 0.04 0.045 (%) エラー率の算出方法 : GCリッチで比較的変異の入りやすい HB8ゲノムDNAを鋳型として任意に選択した10種類 の領域をPCR増幅後、 それぞれベクターにクローニングし、各配列について複数クローンをピックアップしてシーケン シングを行い塩基配列を確認しました。 酵素 A社酵素1 PrimeSTAR ® HS M N (弊社比較データ) ★PrimeSTAR®シリーズの各PCR酵素は、増幅産物 約50万塩基をシーケンシングして、 エラーがわずか 10∼30塩基のレベルです。 High Fidelity PCR酵素の原点である DNA Polymeraseの正確性を上回ります! (12/542,580) ※プライミング効率とは・ ・ ・ DNAポリメラーゼはプライマーの3 末端で酵素/DNA複合体を形成し、鎖伸長を始めます。 これをプライミングと言います。 PrimeSTAR®シリーズの酵素はいずれも高いプライミング効率を有しているため、5∼15秒の短時間のアニーリング時間 設定で特異性の高い増幅結果が得られます。 PrimeSTAR HSのPCR条件: 98℃ 10秒 55℃ 5秒 72℃ 2分 ® Pfu DNA Polymerase 高いコストパフォーマンス 鋳型 ; ヒトゲノムDNA ターゲット ; DCLRE1A遺伝子 (2 kb) 反応液組成およびPCR条件 ; 各社試薬の推奨プロトコールによる PrimeSTAR®シリーズの基本的な特長 PrimeSTAR® GXL に勝る増幅効率 高いプライミング効率※ 伸長反応再開 5‐GATCTA 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA タカラバイオのPrimeSTAR®シリーズは、 「気軽に使える」 「反応効率も良い」高正確性酵素 をコンセプトに開発されました PrimeSTAR® HS 強力な3 -5 exonuclease活性 抜群の校正力 経済性 DNAポリメラーゼによりDNAは5 側から3 側へ向かって合成されますが、稀に 誤った塩基が取り込まれることがあります。 その際、3 -5 exonuclease活性をもつ α型酵素では誤って取り込まれた塩基が削り取られ、正しい塩基が取り込まれて 伸長反応が再開されます。この結果、DNA合成における正確性はPol Ⅰ型酵素 に比べ格段に高くなります。 製品コード R010A/B 平滑 ・ シリーズ ・EmeraldAmp® など いわゆる高正確性酵素といわれるPCR酵素はほとんどがα型酵素です。 PrimeSTAR® Max PrimeSTAR HS DNA Polymerase ® PCR酵素のタイプ GC or ATリッチ 配列の増幅 伸長スピード ダイナミックレンジ 増幅鎖長の目安 (ヒトゲノムDNA) PrimeSTAR® HS ★★★ ★★ ★★ ≦8.5 kb PrimeSTAR® Max ★★★ ★★★★★ * ★★★(★) ≦6 kb PrimeSTAR® GXL ★★★★★ ★★★★ ★★★★★ ≦30 kb PCR産物 末端形状 Hot Start 平滑 ○ (抗体を利用) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M2 M1 PCR条件: 98℃ 10秒 68℃ 8分 30サイクル 鋳型 ; ヒトゲノムDNA 100 ng/50 μl反応系 ターゲット ; レーン1:DCLRE1A 4 kb 2:β-globin 8.5 kb 3:β-globin 6 kb 4:DCLRE1A 1 kb 5:p53 0.5 kb 6:p53 4 kb 7:β-globin 7.5 kb 8:DCLRE1A 8 kb 9:DCLRE1A 2 kb 10:p53 6 kb M1:λd III digest M2:pHY Marker * 伸長時間を長めに設定する (1 min./kb) することで持ち込み可能な鋳型量を増やすことができます。 1 PrimeSTARシリーズ PrimeSTARシリーズ 2 PrimeSTAR®シリーズのベーシック酵素 基礎知識 ∼PCR酵素の種類と特性∼ PCRに利用される耐熱性DNAポリメラーゼは、構造的に大きく、下記 の2つのタイプに分けられます。 ● Pol Ⅰ型 (family A) α型 (family B) DNA Polymeraseをはじめとする 好熱性真生細菌由来のPol Ⅰ型(family A)酵素 ● DNA Polymeraseに代表される 超好熱性古細菌由来のα型(family B)酵素 由来 Prokaryote Archaea 3 -5 exonuclease活性 × ○ 5 -3 exonuclease活性 ○ × dA付加 増幅産物の3'末端形状 一般的にPol Ⅰ型酵素は伸長活性は強いのですが、 3 →5 exonuclease 活性を持たず、TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase) 活性 によりPCR産物の3 -末端にdAが付加されます。 これに対してα型酵素 はより耐熱性に優れ、強力な3 →5 exonuclease活性を示しますが、 伸長速度が遅く3 -末端は平滑末端になります。 酵素名 しかし、従来のα型酵素はその特性から、 ・反応に長時間かかる ・増幅効率が悪く、特に長鎖増幅やGCリッチ、ATリッチターゲットには不向き ・鋳型DNAの許容量の範囲が狭く、鋳型DNAを多量に加えた場合、 かえって PCR反応が阻害される ・反応条件がシビアで、手軽に使えない などの弱点がありました。 ・PrimeSTAR®シリーズ ・ など 間違った塩基の取り込み 5‐GATCTG 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA 3 ‒5 exonuclease による塩基の除去 G 5‐GATCT 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA 正しい塩基の取り込み A 5‐GATCT 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA PrimeSTAR シリーズと各種PCR酵素との正確性の比較 (15/484,429) (30/486,923) PrimeSTAR® HS と各社High Fidelity PCR酵素の増幅効率の比較 ヒトゲノムDNAを鋳型として、PrimeSTAR ® HSと各社高正確性PCR酵素、並びにr をそれぞれ推奨条件で用いて増幅効率を比較 しました。PrimeSTAR® HSは、他のHigh Fidelity PCR酵素と比べ、鋳型量が少ない場合でも効率よく増幅できました。 1 2 3 4 M N 1 2 3 B社酵素1 4 M N 1 2 3 C社酵素1 4 M N 1 2 3 D社酵素1 4 M N 1 2 3 E社酵素1 4 M N 1 2 3 r 4 M N 1 2 3 4 M 30サイクル 鋳型量 (50 μl反応系); レーンN:Negative Control (鋳型なし) 1 :100 pg 2 :1 ng 3 :10 ng 4 :100 ng M :λd III digest PrimeSTAR® HSを用いて様々な長さのターゲットを同一条件で増幅 PrimeSTAR® HSを用いて、同一PCR条件で様々な鎖長のターゲットの増幅を試みたところ、0.5∼8.5 kbのターゲットをいずれも効率よく 増幅できました。 (13/199,186) M1 M2 rTaq DNA Polymerase (64/159,994) 0 0.005 0.01 0.015 0.04 0.045 (%) エラー率の算出方法 : GCリッチで比較的変異の入りやすい HB8ゲノムDNAを鋳型として任意に選択した10種類 の領域をPCR増幅後、 それぞれベクターにクローニングし、各配列について複数クローンをピックアップしてシーケン シングを行い塩基配列を確認しました。 酵素 A社酵素1 PrimeSTAR ® HS M N (弊社比較データ) ★PrimeSTAR®シリーズの各PCR酵素は、増幅産物 約50万塩基をシーケンシングして、 エラーがわずか 10∼30塩基のレベルです。 High Fidelity PCR酵素の原点である DNA Polymeraseの正確性を上回ります! (12/542,580) ※プライミング効率とは・ ・ ・ DNAポリメラーゼはプライマーの3 末端で酵素/DNA複合体を形成し、鎖伸長を始めます。 これをプライミングと言います。 PrimeSTAR®シリーズの酵素はいずれも高いプライミング効率を有しているため、5∼15秒の短時間のアニーリング時間 設定で特異性の高い増幅結果が得られます。 PrimeSTAR HSのPCR条件: 98℃ 10秒 55℃ 5秒 72℃ 2分 ® Pfu DNA Polymerase 高いコストパフォーマンス 鋳型 ; ヒトゲノムDNA ターゲット ; DCLRE1A遺伝子 (2 kb) 反応液組成およびPCR条件 ; 各社試薬の推奨プロトコールによる PrimeSTAR®シリーズの基本的な特長 PrimeSTAR® GXL に勝る増幅効率 高いプライミング効率※ 伸長反応再開 5‐GATCTA 3‐CTAGATCGGAT・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 鋳型DNA タカラバイオのPrimeSTAR®シリーズは、 「気軽に使える」 「反応効率も良い」高正確性酵素 をコンセプトに開発されました PrimeSTAR® HS 強力な3 -5 exonuclease活性 抜群の校正力 経済性 DNAポリメラーゼによりDNAは5 側から3 側へ向かって合成されますが、稀に 誤った塩基が取り込まれることがあります。 その際、3 -5 exonuclease活性をもつ α型酵素では誤って取り込まれた塩基が削り取られ、正しい塩基が取り込まれて 伸長反応が再開されます。この結果、DNA合成における正確性はPol Ⅰ型酵素 に比べ格段に高くなります。 製品コード R010A/B 平滑 ・ シリーズ ・EmeraldAmp® など いわゆる高正確性酵素といわれるPCR酵素はほとんどがα型酵素です。 PrimeSTAR® Max PrimeSTAR HS DNA Polymerase ® PCR酵素のタイプ GC or ATリッチ 配列の増幅 伸長スピード ダイナミックレンジ 増幅鎖長の目安 (ヒトゲノムDNA) PrimeSTAR® HS ★★★ ★★ ★★ ≦8.5 kb PrimeSTAR® Max ★★★ ★★★★★ * ★★★(★) ≦6 kb PrimeSTAR® GXL ★★★★★ ★★★★ ★★★★★ ≦30 kb PCR産物 末端形状 Hot Start 平滑 ○ (抗体を利用) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M2 M1 PCR条件: 98℃ 10秒 68℃ 8分 30サイクル 鋳型 ; ヒトゲノムDNA 100 ng/50 μl反応系 ターゲット ; レーン1:DCLRE1A 4 kb 2:β-globin 8.5 kb 3:β-globin 6 kb 4:DCLRE1A 1 kb 5:p53 0.5 kb 6:p53 4 kb 7:β-globin 7.5 kb 8:DCLRE1A 8 kb 9:DCLRE1A 2 kb 10:p53 6 kb M1:λd III digest M2:pHY Marker * 伸長時間を長めに設定する (1 min./kb) することで持ち込み可能な鋳型量を増やすことができます。 1 PrimeSTARシリーズ PrimeSTARシリーズ 2 汎用性の高いHigh Fidelity PCR酵素の新スタンダード GCリッチなターゲットに対する反応性(他社High Fidelity PCR酵素と比較) PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ® 製品コード R050A/B ターゲットとなる遺伝子がGCリッチな配列である場合、PCR増幅が困難になることがよくあります。 ここでは、各社PCR酵素に対して、増幅困難なGCリッチ配列に対する反応性を比較しました。 【方法】 ヒトゲノムDNAおよび HB8 ゲノムDNAを鋳型として、増幅領域のGC含量が70%前後の4種類のGCリッチな ターゲットについて、PrimeSTAR® GXLと他社High Fidelity PCR酵素で増幅を行い反応性を比較した。 反応液組成およびPCR条件は各酵素の推奨プロトコールに従った。 ® PrimeSTAR GXLはこうして誕生しました! ●変異型酵素で鋳型への非特異的結合を抑制 鋳型DNAに対してDNAポリメラーゼそのものが非特異的に結合することによって、 プライマーからの伸長反応が阻害 される現象が見られます。一般的にα型酵素はこの非特異的結合が起こりやすく、 そのためにPCR増幅が困難になる 面がありました。これを改善するため、PrimeSTAR ® HSに改良を加え、鋳型DNAへの過剰な結合を抑制することに 成功しました。 PrimeSTAR® GXL M 1 2 3 4 A社酵素1 M 1 2 3 B社酵素2 4 M 1 2 3 C社酵素2 4 M 1 2 3 D社酵素2 4 M 1 2 3 D社酵素3 4 M 1 2 3 4 改変型伸長因子 ●独自の伸長因子を採用 生体内では、DNAポリメラーゼは伸長因子と複合体を 形成してDNA複製を行っています。 改良型酵素と弊社独自の改変型伸長因子を組み合わせる ことで、 これまでのHigh Fidelity PCR酵素では見られない 優れた伸長性と汎用性を持つ酵素となりました。 M : pHY Marker 鋳型 ; ヒトゲノムDNA(100 ng/50 μl反応系) ターゲット ; レーン1:APOE 746 bp(GC含量 74%) 2:TGFβ1 2,005 bp(GC含量 69%) PrimeSTAR® HS変異体 鋳型 ; HB8 ゲノムDNA (10 ng/50 μl反応系) ターゲット ; レーン3:2,029 bp (GC含量 74%) 4:4,988 bp (GC含量 74%) 反応は各社推奨条件で実施 D社酵素3 : GCリッチ対応酵素 B社酵素2 : GCバッファー使用 【結果】PrimeSTAR® GXLは様々なGCリッチターゲットをもっとも効率よく増幅し、 かつ、高い反応特異性を示しました。 (弊社比較データ) 30 kb程度までの増幅が可能 長鎖増幅 増幅感度および鋳型量に対する許容性(他社酵素および2倍量プロトコールでの比較) 高い汎用性 GC or ATリッチなターゲット&高鋳型量にも対応 高速反応も 酵素を2倍量使用するオプションプロトコールで、 10秒/kbの高速反応も可能 長鎖ターゲットの増幅 PCR酵素の性能評価として、 どれだけ長鎖のDNAを増幅できるかは重要な項目です。 ここでは、PrimeSTAR® GXLの長鎖ターゲットに対する増幅性を確認しました。 PCRクローニングを行う場合、増幅の正確性が要求されるためHigh Fidelity PCR酵素がよく使用されます。 しかし、一般的にHigh Fidelity PCR酵素は反応液中の核酸量に影響を受けやすく、cDNAを鋳型とする増幅が比較的苦手 です。 そこで、各社High Fidelity酵素に関して、cDNAを鋳型にした場合の鋳型量の許容性について検討を行いました。 【方法】HL60細胞より抽出したtotal RNAから逆転写反応を行いcDNAを調製した。 このcDNAを鋳型に、TFR遺伝子4 kbに対してPCRを 行い、鋳型量の違いによる増幅反応への影響を確認した。反応液組成およびPCR条件は各酵素の推奨プロトコールに従った。 PrimeSTAR® GXL (標準プロトコール) PrimeSTAR® GXL (2倍量プロトコール) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M B社酵素1 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M D社酵素4 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 【方法】 ヒトゲノムDNA、 λDNAおよびcDNAを鋳型として、PrimeSTAR® GXLの推奨条件に従って、様々なターゲットを増幅した。 ヒトゲノムDNA (100 ng/50 μl 反応系) M 1 2 3 4 5 6 7 8 λDNA (1 ng/50 μl反応系) 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 cDNA (total RNA 250 ng 相当/50 μl反応系) 9 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 98℃ 10秒 60℃ 15秒 68℃ 4分 30サイクル 鋳型量 cDNA (total レーン1 : 25 pg 2 : 250 pg 3 : 2.5 ng 1:p53 2:DCLRE1A 3:DCLRE1A 4:DCLRE1A 5:β-globin 0.5 1 2 4 8.5 kb kb kb kb kb 6:β-globin 7:β-globin 8:β-globin 9:β-globin 10:β-globin M:λd III 15 kb 20 kb 24 kb 27 kb 30 kb digest 1:0.5 2: 1 3: 2 4: 4 5:8.5 kb kb kb kb kb 6: 15 7: 20 8: 30 9: 40 M:λ- kb kb kb kb d III digest 1:Dystrophin 1 2:Dystrophin 2 3:CCND2 2.8 4:TFR 4 5:Dystrophin 6 kb kb kb kb kb 6:Dystrophin 8 kb 7:Dystrophin 12 kb 8:Dystrophin 13.5 kb M:λd III digest 98℃ 10秒 60℃ 15秒 30サイクル 68℃ 40秒 RNA相当量) /50 μl反応系 ; 4 : 25 ng 7 : 750 ng 5 : 250 ng 8 : 1 μg 6 : 500 ng 9 : 1.5 μg 98℃ 30秒 ↓ 98℃ 5秒 60℃ 10秒 72℃ 1分 ↓ 72℃ 5分 30サイクル 95℃ 1分 ↓ 95℃ 20秒 60℃ 20秒 72℃ 2分 ↓ 72℃ 3分 30サイクル 10 : 2 μg M : λd III digest 【結果】他社酵素に比べ、PrimeSTAR® GXLでは鋳型cDNAの広い濃度範囲において良好な増幅が見られました。 また、 PrimeSTAR® GXLの2倍量プロトコールでは、 さらに広い鋳型量許容性が確認できました。 (弊社比較データ) 【結果】 ヒトゲノムDNAを鋳型とした場合は30 kb、 λDNAでは40 kb、cDNAでは13.5 kbまでの増幅が確認でき、様々なターゲットに対して 非常に良好な伸長性を示しました。 3 PrimeSTARシリーズ PrimeSTARシリーズ 4 汎用性の高いHigh Fidelity PCR酵素の新スタンダード GCリッチなターゲットに対する反応性(他社High Fidelity PCR酵素と比較) PrimeSTAR GXL DNA Polymerase ® 製品コード R050A/B ターゲットとなる遺伝子がGCリッチな配列である場合、PCR増幅が困難になることがよくあります。 ここでは、各社PCR酵素に対して、増幅困難なGCリッチ配列に対する反応性を比較しました。 【方法】 ヒトゲノムDNAおよび HB8 ゲノムDNAを鋳型として、増幅領域のGC含量が70%前後の4種類のGCリッチな ターゲットについて、PrimeSTAR® GXLと他社High Fidelity PCR酵素で増幅を行い反応性を比較した。 反応液組成およびPCR条件は各酵素の推奨プロトコールに従った。 ® PrimeSTAR GXLはこうして誕生しました! ●変異型酵素で鋳型への非特異的結合を抑制 鋳型DNAに対してDNAポリメラーゼそのものが非特異的に結合することによって、 プライマーからの伸長反応が阻害 される現象が見られます。一般的にα型酵素はこの非特異的結合が起こりやすく、 そのためにPCR増幅が困難になる 面がありました。これを改善するため、PrimeSTAR ® HSに改良を加え、鋳型DNAへの過剰な結合を抑制することに 成功しました。 PrimeSTAR® GXL M 1 2 3 4 A社酵素1 M 1 2 3 B社酵素2 4 M 1 2 3 C社酵素2 4 M 1 2 3 D社酵素2 4 M 1 2 3 D社酵素3 4 M 1 2 3 4 改変型伸長因子 ●独自の伸長因子を採用 生体内では、DNAポリメラーゼは伸長因子と複合体を 形成してDNA複製を行っています。 改良型酵素と弊社独自の改変型伸長因子を組み合わせる ことで、 これまでのHigh Fidelity PCR酵素では見られない 優れた伸長性と汎用性を持つ酵素となりました。 M : pHY Marker 鋳型 ; ヒトゲノムDNA(100 ng/50 μl反応系) ターゲット ; レーン1:APOE 746 bp(GC含量 74%) 2:TGFβ1 2,005 bp(GC含量 69%) PrimeSTAR® HS変異体 鋳型 ; HB8 ゲノムDNA (10 ng/50 μl反応系) ターゲット ; レーン3:2,029 bp (GC含量 74%) 4:4,988 bp (GC含量 74%) 反応は各社推奨条件で実施 D社酵素3 : GCリッチ対応酵素 B社酵素2 : GCバッファー使用 【結果】PrimeSTAR® GXLは様々なGCリッチターゲットをもっとも効率よく増幅し、 かつ、高い反応特異性を示しました。 (弊社比較データ) 30 kb程度までの増幅が可能 長鎖増幅 増幅感度および鋳型量に対する許容性(他社酵素および2倍量プロトコールでの比較) 高い汎用性 GC or ATリッチなターゲット&高鋳型量にも対応 高速反応も 酵素を2倍量使用するオプションプロトコールで、 10秒/kbの高速反応も可能 長鎖ターゲットの増幅 PCR酵素の性能評価として、 どれだけ長鎖のDNAを増幅できるかは重要な項目です。 ここでは、PrimeSTAR® GXLの長鎖ターゲットに対する増幅性を確認しました。 PCRクローニングを行う場合、増幅の正確性が要求されるためHigh Fidelity PCR酵素がよく使用されます。 しかし、一般的にHigh Fidelity PCR酵素は反応液中の核酸量に影響を受けやすく、cDNAを鋳型とする増幅が比較的苦手 です。 そこで、各社High Fidelity酵素に関して、cDNAを鋳型にした場合の鋳型量の許容性について検討を行いました。 【方法】HL60細胞より抽出したtotal RNAから逆転写反応を行いcDNAを調製した。 このcDNAを鋳型に、TFR遺伝子4 kbに対してPCRを 行い、鋳型量の違いによる増幅反応への影響を確認した。反応液組成およびPCR条件は各酵素の推奨プロトコールに従った。 PrimeSTAR® GXL (標準プロトコール) PrimeSTAR® GXL (2倍量プロトコール) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M B社酵素1 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M D社酵素4 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 【方法】 ヒトゲノムDNA、 λDNAおよびcDNAを鋳型として、PrimeSTAR® GXLの推奨条件に従って、様々なターゲットを増幅した。 ヒトゲノムDNA (100 ng/50 μl 反応系) M 1 2 3 4 5 6 7 8 λDNA (1 ng/50 μl反応系) 9 10 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 cDNA (total RNA 250 ng 相当/50 μl反応系) 9 M M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 98℃ 10秒 60℃ 15秒 68℃ 4分 30サイクル 鋳型量 cDNA (total レーン1 : 25 pg 2 : 250 pg 3 : 2.5 ng 1:p53 2:DCLRE1A 3:DCLRE1A 4:DCLRE1A 5:β-globin 0.5 1 2 4 8.5 kb kb kb kb kb 6:β-globin 7:β-globin 8:β-globin 9:β-globin 10:β-globin M:λd III 15 kb 20 kb 24 kb 27 kb 30 kb digest 1:0.5 2: 1 3: 2 4: 4 5:8.5 kb kb kb kb kb 6: 15 7: 20 8: 30 9: 40 M:λ- kb kb kb kb d III digest 1:Dystrophin 1 2:Dystrophin 2 3:CCND2 2.8 4:TFR 4 5:Dystrophin 6 kb kb kb kb kb 6:Dystrophin 8 kb 7:Dystrophin 12 kb 8:Dystrophin 13.5 kb M:λd III digest 98℃ 10秒 60℃ 15秒 30サイクル 68℃ 40秒 RNA相当量) /50 μl反応系 ; 4 : 25 ng 7 : 750 ng 5 : 250 ng 8 : 1 μg 6 : 500 ng 9 : 1.5 μg 98℃ 30秒 ↓ 98℃ 5秒 60℃ 10秒 72℃ 1分 ↓ 72℃ 5分 30サイクル 95℃ 1分 ↓ 95℃ 20秒 60℃ 20秒 72℃ 2分 ↓ 72℃ 3分 30サイクル 10 : 2 μg M : λd III digest 【結果】他社酵素に比べ、PrimeSTAR® GXLでは鋳型cDNAの広い濃度範囲において良好な増幅が見られました。 また、 PrimeSTAR® GXLの2倍量プロトコールでは、 さらに広い鋳型量許容性が確認できました。 (弊社比較データ) 【結果】 ヒトゲノムDNAを鋳型とした場合は30 kb、 λDNAでは40 kb、cDNAでは13.5 kbまでの増幅が確認でき、様々なターゲットに対して 非常に良好な伸長性を示しました。 3 PrimeSTARシリーズ PrimeSTARシリーズ 4 高い正確性と優れた増幅効率を兼ね備えたPrimeSTAR®シリーズと ® In-Fusion を組合わせてパワフルクローニング! 最高レベルの正確性を提供 PrimeSTAR Max DNA Polymerase ® 製品コード R045A In-Fusion HD Cloning Kit ® 改変型伸長因子 独自の伸長因子を採用 生体内では、DNAポリメラーゼは伸長因子と複合体を形成してDNA 複製を行っています。 PrimeSTAR ® Maxは、PrimeSTAR ® HSと弊社独自の改変型伸長 因子を組み合わせることで、生体内でのDNA複製と同様の極めて高い 正確性と高速性を実現しています。 PCR ® PrimeSTAR HS 線状化 ベクター ® 5 × In-Fusion HD Enzyme Premix & dH2O 複数フラグメントの同時クローニングもOK In-Fusion酵素が末端の相同な15塩基を結合 2×プレミックスタイプで ハイスループットにも対応 操作簡便 In-Fusion反応 そのまま 形質転換に使用 高速反応における増幅効率 各社High Fidelity PCR酵素を用いて、高速反応における増幅効率を比較しました。 ヒトゲノムDNAを鋳型に高速反応 (伸長時間10秒) で増幅を行い、0.5∼7.5 kbでの増幅を比較した結果、PrimeSTAR® Maxは他社酵素 に比べて優れた増幅性を示し、4 kbまで良好な増幅が確認できました。 (50℃ 15分) 他社PCR酵素 × 従来のクローニングキット PrimeSTAR® Max PCR増幅 PCR増幅 PrimeSTAR Max 4 5 6 7 B社酵素2 M M 1 2 3 4 5 D社酵素4 6 7 M M 1 2 3 4 5 6 7 増幅サイズ ; レーン1: 0.5 2: 1 3: 2 4: 3 5: 4 6: 6 7: 7.5 M:λ ‐ M 4 kb kb kb kb kb kb kb kb d III digest 1日目 In‐Fusion 反応 制限酵素消化・精製 トランスフォーメーション ベクターの脱リン酸化 インサート確認 1日目 2日目 2日目 ライゲーション反応 少ステップで 約1日短縮! 3日目 インサート確認 線状化ベクター 目的クローン ® 増幅確認 増幅産物精製 トランスフォーメーション 鋳型 ; ヒトゲノムDNA100 ng/50 μl 反応系 PCR条件:3ステップ、伸長時間 10秒、30 cycles リコンビナント ベクター In-Fusion® HD 増幅確認 ® 3 Fragment 2 Fragment 3 Fragment 1 In-Fusionクローニングに最適(次ページ参照) 最高の正確性 2 ●どんなベクターのどんな位置にも ディレクショナルにクローニング ●反応はわずか15分 ●簡単で確実、 しかも高効率 目的遺伝子 5∼10秒/kbの高速反応を実現 最速 M 1 製品コード 639648 ほか 実験時間はおよその目安です。 5秒/kbの伸長能をもつPrimeSTAR Max DNA Polymeraseは、5 kbのPCR増幅が 約60分 ※1で完了します。目的DNA断片の 増幅はもちろん、PCR増幅によるベクターの 線状化にもおススメです。 また、In-Fusion酵素によるディレクショナル クローニングでは、 目的DNA断片の制限酵素 処理が不要なため、PCR増幅した目的DNA 断片とベクターとを混合し、In-Fusion反応 (15分)を行うだけでベクターへの挿入が 完了し、大腸菌へのトランスフォーメーション に進めます。※2 ※ 1:鋳型によっては1分/kbの伸長反応が必要です。 詳しくは添付の説明書をご確認ください。 ※2:ベクターの線状化は制限酵素処理でも可能です。 脱リン酸化は不要です。 (弊社比較データ) 複数のDNA断片(1 kb, 2 kb, 3 kb)の同時クローニング 様々な鋳型に対する増幅可能なサイズ(高速反応) λDNA、大腸菌ゲノムDNA、 ヒトゲノムDNAおよびcDNAを鋳型として、アニーリング時間5秒もしくは15秒、伸長時間5秒/kb( cDNA の場合は10秒/kb) の設定で増幅可能なサイズを確認しました。 λDNA M 1 2 4 6 8 10 12 15 M(kb) 大腸菌ゲノムDNA M 2 4 6 8 10 M(kb) ヒトゲノムDNA M 0.5 1 2 3 4 【方法】1 kb、2 kb、3 kbの3つのインサートDNA断片および2.7 kbのベクター全長をそれぞれPrimeSTAR ® MaxでPCR増幅し、 In-Fusion ® HDを用いてディレクショナルクローニングを行った。コンピテントセルには高い形質転換能力を持つ HST08 Premium Competent Cells( 製品コード 9128) を使用し、青/白選択した。 ベクターと3種類のインサート 5×In-Fusion ® HD Enzyme Premix cDNA 6 7.5 M(kb) M 1 2 4 6 8 M(kb) 1 kb ※ 2 kb ※ ※ 3 kb ※ ※:15塩基の相同配列 M:λ ‐ 5 sec./kbの高速反応で15 kbまでの 増幅を確認 5 PrimeSTARシリーズ 5 sec./kbの高速反応で 10 kbまでの良好な増幅を確認 5 sec./kbの高速反応で6 kbまでの 良好な増幅を確認 d III digest 10 sec./kbの高速反応で 6 kbまでの良好な増幅を確認 【結果】 3つのDNA断片 (1 kb, 2 kb, 3 kb) を同時にクローニングし、 ランダムにピックアップした10クローンについて、 コロニーPCR を行いインサートを確認したところ、 7クローンで 1 kb + 2 kb + 3 kbの正しい挿入が確認できました。 Cloning Enhancer処理 or ゲルから回収 (NucleoSpin®) インサートサイズ(kb) 形質転換コロニー数 (1/5量塗布) 正しい形質 転換体の割合 1 kb + 2 kb + 3 kb 192 7/10 PrimeSTARシリーズ 6 高い正確性と優れた増幅効率を兼ね備えたPrimeSTAR®シリーズと ® In-Fusion を組合わせてパワフルクローニング! 最高レベルの正確性を提供 PrimeSTAR Max DNA Polymerase ® 製品コード R045A In-Fusion HD Cloning Kit ® 改変型伸長因子 独自の伸長因子を採用 生体内では、DNAポリメラーゼは伸長因子と複合体を形成してDNA 複製を行っています。 PrimeSTAR ® Maxは、PrimeSTAR ® HSと弊社独自の改変型伸長 因子を組み合わせることで、生体内でのDNA複製と同様の極めて高い 正確性と高速性を実現しています。 PCR ® PrimeSTAR HS 線状化 ベクター ® 5 × In-Fusion HD Enzyme Premix & dH2O 複数フラグメントの同時クローニングもOK In-Fusion酵素が末端の相同な15塩基を結合 2×プレミックスタイプで ハイスループットにも対応 操作簡便 In-Fusion反応 そのまま 形質転換に使用 高速反応における増幅効率 各社High Fidelity PCR酵素を用いて、高速反応における増幅効率を比較しました。 ヒトゲノムDNAを鋳型に高速反応 (伸長時間10秒) で増幅を行い、0.5∼7.5 kbでの増幅を比較した結果、PrimeSTAR® Maxは他社酵素 に比べて優れた増幅性を示し、4 kbまで良好な増幅が確認できました。 (50℃ 15分) 他社PCR酵素 × 従来のクローニングキット PrimeSTAR® Max PCR増幅 PCR増幅 PrimeSTAR Max 4 5 6 7 B社酵素2 M M 1 2 3 4 5 D社酵素4 6 7 M M 1 2 3 4 5 6 7 増幅サイズ ; レーン1: 0.5 2: 1 3: 2 4: 3 5: 4 6: 6 7: 7.5 M:λ ‐ M 4 kb kb kb kb kb kb kb kb d III digest 1日目 In‐Fusion 反応 制限酵素消化・精製 トランスフォーメーション ベクターの脱リン酸化 インサート確認 1日目 2日目 2日目 ライゲーション反応 少ステップで 約1日短縮! 3日目 インサート確認 線状化ベクター 目的クローン ® 増幅確認 増幅産物精製 トランスフォーメーション 鋳型 ; ヒトゲノムDNA100 ng/50 μl 反応系 PCR条件:3ステップ、伸長時間 10秒、30 cycles リコンビナント ベクター In-Fusion® HD 増幅確認 ® 3 Fragment 2 Fragment 3 Fragment 1 In-Fusionクローニングに最適(次ページ参照) 最高の正確性 2 ●どんなベクターのどんな位置にも ディレクショナルにクローニング ●反応はわずか15分 ●簡単で確実、 しかも高効率 目的遺伝子 5∼10秒/kbの高速反応を実現 最速 M 1 製品コード 639648 ほか 実験時間はおよその目安です。 5秒/kbの伸長能をもつPrimeSTAR Max DNA Polymeraseは、5 kbのPCR増幅が 約60分 ※1で完了します。目的DNA断片の 増幅はもちろん、PCR増幅によるベクターの 線状化にもおススメです。 また、In-Fusion酵素によるディレクショナル クローニングでは、 目的DNA断片の制限酵素 処理が不要なため、PCR増幅した目的DNA 断片とベクターとを混合し、In-Fusion反応 (15分)を行うだけでベクターへの挿入が 完了し、大腸菌へのトランスフォーメーション に進めます。※2 ※ 1:鋳型によっては1分/kbの伸長反応が必要です。 詳しくは添付の説明書をご確認ください。 ※2:ベクターの線状化は制限酵素処理でも可能です。 脱リン酸化は不要です。 (弊社比較データ) 複数のDNA断片(1 kb, 2 kb, 3 kb)の同時クローニング 様々な鋳型に対する増幅可能なサイズ(高速反応) λDNA、大腸菌ゲノムDNA、 ヒトゲノムDNAおよびcDNAを鋳型として、アニーリング時間5秒もしくは15秒、伸長時間5秒/kb( cDNA の場合は10秒/kb) の設定で増幅可能なサイズを確認しました。 λDNA M 1 2 4 6 8 10 12 15 M(kb) 大腸菌ゲノムDNA M 2 4 6 8 10 M(kb) ヒトゲノムDNA M 0.5 1 2 3 4 【方法】1 kb、2 kb、3 kbの3つのインサートDNA断片および2.7 kbのベクター全長をそれぞれPrimeSTAR ® MaxでPCR増幅し、 In-Fusion ® HDを用いてディレクショナルクローニングを行った。コンピテントセルには高い形質転換能力を持つ HST08 Premium Competent Cells( 製品コード 9128) を使用し、青/白選択した。 ベクターと3種類のインサート 5×In-Fusion ® HD Enzyme Premix cDNA 6 7.5 M(kb) M 1 2 4 6 8 M(kb) 1 kb ※ 2 kb ※ ※ 3 kb ※ ※:15塩基の相同配列 M:λ ‐ 5 sec./kbの高速反応で15 kbまでの 増幅を確認 5 PrimeSTARシリーズ 5 sec./kbの高速反応で 10 kbまでの良好な増幅を確認 5 sec./kbの高速反応で6 kbまでの 良好な増幅を確認 d III digest 10 sec./kbの高速反応で 6 kbまでの良好な増幅を確認 【結果】 3つのDNA断片 (1 kb, 2 kb, 3 kb) を同時にクローニングし、 ランダムにピックアップした10クローンについて、 コロニーPCR を行いインサートを確認したところ、 7クローンで 1 kb + 2 kb + 3 kbの正しい挿入が確認できました。 Cloning Enhancer処理 or ゲルから回収 (NucleoSpin®) インサートサイズ(kb) 形質転換コロニー数 (1/5量塗布) 正しい形質 転換体の割合 1 kb + 2 kb + 3 kb 192 7/10 PrimeSTARシリーズ 6 ◆PrimeSTAR ®シリーズおよび関連製品リスト 【PrimeSTAR ®シリーズ】 製品名 容量 製品コード PrimeSTAR ® GXL DNA Polymerase PrimeSTAR ® HS DNA Polymerase R045A ¥30,000 250 U R010A ¥30,000 R010B(A × 4) ¥96,000 R040A ¥22,000 100回(50 μl反応系) PrimeSTAR HS(Premix) ¥100,000 100回(50 μl反応系) 1,000 U ® ¥35,000 R050B(A × 4) 1,000 U PrimeSTAR ® Max DNA Polymerase 価格(税別) R050A 250 U 【関連製品】 製品名 概要 ® 容量 製品コード 50回 R023A ¥48,000 200回 R023B ¥160,000 価格(税別) 50回 R022A ¥44,000 200回 R022B ¥145,000 PrimeScript ® II High Fidelity RT-PCR Kit PCRにはPrimeSTAR GXLを使用 PrimeScript ® High Fidelity RT-PCR Kit PCRにはPrimeSTAR Maxを使用 Mighty Cloning Reagent Set( Blunt End) 平滑末端クローニング 20回 6027 ¥29,000 Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR ® 平滑末端産物にAを付加して TAクローニング 20回 6019 ¥32,000 PrimeSTAR ® Mutagenesis Basal Kit PrimeSTAR® Maxで迅速、確実に 変異導入 25回 R046A ¥19,000 10回 639633 ¥22,000 10回 639639 ¥24,000 10回 639648 ¥21,000 ® In-Fusion ® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer In-Fusion ® HD Cloning Kit w/NucleoSpin ® ® In-Fusion HD Cloning Kit ★1,2 ★1,3 In-Fusionクローニング用試薬 ★1 ★1:製品にコンピテントセルは含まれません (コンピテントセルを含む製品も別にご用意しています) 。 ★2:PCR産物がシングルバンドの場合に増幅産物をそのままIn-Fusion反応に使用するための前処理試薬、Cloning Enhancerが含まれています。 ★3:PCR産物が複数バンドの場合にゲル精製を行うスピンカラムが含まれています。 ※In-Fusion® HD Cloning Kitシリーズはクロンテック社の製品です。 ◆関連製品ピックアップ ® PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit 製品コード R023A/B アクセサリータンパク質を添加したPrimeScript ® II RTaseと、長鎖増幅やGCリッチターゲットに強いPrimeSTAR ® GXLを組み 合わせて、RT-PCRに至適化したキットです。正確性を必要とする長鎖ターゲットのRT-PCRに最適です。 非常に広い鋳型量許容範囲 【方法】HL60細胞由来のtotal RNA (100 pg∼6 μg) を鋳型として、 Oligo dT Primerを用いた逆転写反応(20 μl反応系) を行い、 その一部(5 μl) をPCR (50 μl反応系) に使用し、TFR 4 kbを増幅した。 【結果】本キットを用いたRT-PCRではRT時のtotal RNA量を6 μg/20 μ l反応 系まで増やしてもTFR 4 kbの良好な増幅が見られました。 PCRの鋳型量 ; 左からtotal RNA 25, 250 pg, 2.5, 25, 50, 125, 250, 500, 750 ng, 1, 1.25, 1.5 μg相当 Hot Start PCR : Licensed under U.S. Patent No. 5,338,671 and 5,587,287 and corresponding patents in other countries. その他のライセンス (最新のライセンス情報) に関しては弊社ウェブサイトにてご確認ください。 本パンフレットに記載されている商品名等は、特に記載はなくても各社の商標、 または登録商標です。 ・本パンフレットで紹介した製品はすべて研究用として販売しております。 ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用しないようご注意ください。 また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。 ・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の製造に使用することは禁止されています。 ・本パンフレット記載の価格は2012年2月1日現在の希望小売価格です。価格に消費税は含まれておりません。 取扱店 東日本販売課 西日本販売課 TEL 03-3271-8553 FAX 03-3271-7282 TEL 077-565-6969 FAX 077-565-6995 テクニカルサポートライン 製品の技術的なご質問に専門の係がお応えします。 TEL 077-565-6999 FAX 077-565-6995 タカラバイオウェブサイト クロンテックウェブサイト http://www.takara-bio.co.jp http://clontech.takara-bio.co.jp 高正確性PCR酵素 2012年2月作成32K PrimeSTAR®シリーズ (2012年2月改訂版)