マウスvibrissaeを用いた毛包組織器官培養法の確立とその応用

ただいま、ページを読み込み中です。5秒以上、このメッセージが表示されている場合、Adobe®
Reader®（もしくはAcrobat®）のAcrobat® JavaScriptを有効にしてください。
日皮会誌:107
(6),
769―779,
1997 (平９）
Adobe® Reader®のメニュー：「編集」→「環境設定」→「JavaScript」で設定できます。
「Acrobat JavaScriptを使用」にチェックを入れてください。
マウスvibrissaeを用いた毛包組織器官培養法の確立とその応用
なお、Adobe® Reader®以外でのPDFビューアで閲覧されている場合もこのメッセージが表示され
ます。Adobe® Reader®で閲覧するようにしてください。
神 藤 敏 正
坪 井 良 治
要 旨
剤, growth factorを含むサイトカインなどを添加し
毛成長を定量的に解析するi.ｎ ｖitｒｏの評価系とし
た系で示された．
て，マウスvibrissaeを用いた毛包組織器宮培養法の
培養条件を検討し，次のような結果を得た.
緒 言
①3∼15日齢のマウスから採取した毛包の毛球部の
毛の成長横序を明らかにする研究は，種々の観点か
ＤＮＡ合成は一定であり，毛球部は12日齢マウスまで
ら精力的に行われているが，未だその全容を解明する
増大を続けた．②個々のvibrissaeの部位別の検討で
迄には到っていない．その理由として，①毛は単一の
は鼻側よりも眼側の左右２例の方がＤＮＡ合成が高
器官でありながら構成する細胞や構造が複雑であるこ
かった．③毛伸長および毛球部ＤＮＡ合成はともに培
と，②毛の毛母細胞は増殖と角化という２つの過程を
養96時間まで直線的に増加した．培養96時間後も毛球
経ながら成長すること，③毛には成長期，休止期およ
部の形態は正常であっ凪④培養条件は，通常（5％
び退行期があり周期的成長を遂げること，④毛を構成
CO,-95%
するそれぞれの細胞の培養系が確立していないこと，
air, 37で）のものよりも高酸素（5％Ｃ０２，
95％０,）かつ低温度（31で）の方が毛母細胞の変性が
などが挙げられる．
なく，毛球部の正常構築が保たれていた．⑤培養液へ
l質むii)ｎの毛成長評価には,
C3Hマウスをはじめい
の牛胎児血清の添加は無添加でも1∼20％添加しても
くつかの動物モデルが用いられてきた1).しかし，毛成
毛球部のＤＮＡ合成にほとんど影響を与えなかった．
長植序をさらに詳細に検討していくためには,加加加
これらの結果から，９日齢のB6C3Fiマウスの眼側
の適切な評価系の確立が望まれている．また，毛を構
縦２列vibrissaeを血清無添加，95％02-5％Ｃ０２で
成する細胞の中で，現在継代培養が可能なのは毛乳頭
3rC,
細胞と外毛根鞘細胞であり，毛母細胞の継代培養は必
72時間培養することは，毛包の器官培養系とし
て極めて有用であると考えられた．
ずしも確立しているとは言えない．そして，毛の複雑
そこで，本条件下に各種の抗癌剤あるいはサイトカ
な構造のため，上皮系あるいは間葉系の細胞を別々に
イン等の毛球部ＤＮＡ合成への影響を比較検討した．
培養しても毛成長の機序は解明されないであろうこと
その結果，抗癌剤ではcytosine
が推測されている．
mitomycin
C,
endoxan,
arabinoside,
methotrexateおよび
このような状況下において，毛包を一本一本そのま
adriacinなどで強いＤＮＡ合成抑制が，サイトカイン
ま培養する器官培養法は，毛を構成する種々の細胞の
ではtumor
総和として毛成長が観察できるin
necrosis
factor一乙interleukin-1αで
ＤＮＡ合成抑制作用が認められすこ．−方,
grow山factor/scatter
hepatocyte
factor は,調べた物質のなかで
として再評価されてきた2)
vivo 1こ近い評価系
14)しかしながら，従来の
毛包組織器官培養法は培養系に牛胎児血清を添加して
は唯一毛球部のＤＮＡ合成を促進させた．
いるものが多く2)
以上，マウスvibrissaeを用いた器官培養法は,①材
響を的確に評価するためには血清無添加での器官培養
料が容易に人手出来ること，再現性と定量性において
が望ましいことは明らかである．さらには，ヒトの正
優れること，②血清の影響を受けないこと，などの点
常毛包組織の入手は困難であることから，定量的実験
で毎毎加Ｏの評価系として優れていると考えられた．
には安定供給の可能な動物を用いた評価方法が必要と
そして，③この培養法は脱毛や発毛作用を有する物質
考えられた．
のスクリーニングなどに有用であることが各種抗癌
そこで，今回マウスvibrissaeを用いた毛包組織器
順天堂大学医学部皮膚科学教室（主任 小川秀興教授）
平成８年12月６日受付，平成９年２月21日掲載決定
8)毛成長に関わる種々の因子の影
官培養法の至適培養条件を検討し，併せて血清無添加
状態における最適条件を詳細に比較検討した．次いで
別刷請求先:（〒113)東京都文京区本郷２∼１−１
その培養法を用いて各種の抗癌剤やサイトカインなど
順天堂大学医学部皮膚科学教室 神藤 敏正
の毛成長に対する影響を比較検討したので，これらの
770
神藤 敏正 坪井 良治
結果もあわせて報告する．
毛球部をミクロホモジナイザー(Model
2000,
材料と方法
Wheaton,
1.毛包組織の分離
ＴＣＡを加え均質化した．毛球部の３Ｈ-ＴｄＲおよび
実験には,
B6C3Fi
(F,:Ｃ５７ＢＬＸＣ３Ｈ)マウス新主
Millville, NT, USA)に入れ,
200μ1の１０％
ＤＮＡ量15)の測定は服部の方渋川こ準じて行った.
仔のvibrissae毛包組織を用いた．妊娠マウスを日本
3-3 組織学的観察 培養を終了した毛包組織は
ＳＬＣ(浜松)より購入し，当施設の動物室(温度:23±
Carnoy液(99.6%エタノール：クロロホルム：酢
2で，湿度:55±5％，照明:12/12時間)で実験に用い
酸こ６：３：１)で固定後，常法に従いパラフィン包埋し
るまで馴化した．
た．毛包組織は4.0μｍに薄切後ヘマトキシリン・エオ
エーテル麻酔下のマウスからvibrissaeを無菌的に
ジン染色を行い，組織学的に観察した.
摘出し培養に用いた．なお，日齢差の検討では3,
9,
6,
12, 15, 21および28日齢のマウスを用い，培養開
3-4 オートラジオグラフ 毛包組織は，
RPMI1640培養液で24時間前培養した後，2μCi/
｢の3
始時の毛球部の直径は実体顕微鏡下にマイクロメー
H−チミジン(３Ｈ-ＴｄＲ)を含むRPMI1640培地でさらに
ターを用いて計測した．また,
48時間培養した．培養終了後，常法に従いパラフィン
vibrissae毛包組織の部
位別の検討では眼側近位から左右各縦４列(Fig.
2)づ
包埋し,
4.0μｍの組織切片を作製した．脱パラフィン
つ採取した.
後，プレパラートを暗室にて原子核乳剤(NR-M2：コ
2.器官培養法
ニカ，東京)に被覆し，一20てで２週間露出しか．現像
得られた毛包組織はペニシリン(500単位/
GIBCO
Laboratory
・ Life Technology
およびストレプトマイシン(500μg/ml,
むHank's
balanced
｢，
および定着後，ヘマトキシリン・エオジン染色を行っ
Inc.,東京)
た.
GIBCO)を含
4.各種抗癌剤のＤＮＡ合成への影響
salt solution (HBSS,ニッスイ，
bleomycin
(日本化薬),
東京)培地にて20分間処理し，その後RPMI1640培地
endoxan(塩野義),
(ＧＩＢＣＯ)にて洗浄し，組織培養用プラスチックシャー
methotrexate
レ(Falcon
ル),
lin Lakes,
3037, Becton Dickinson
NJ,
Labware,
Frank-
mitomycin
Ｃ (協和醗酵)，
cytosine arabinoside (日本新薬)，
(日本レダリー),
cisplatin (ブリスト
adriacin (協和醗酵)を，それぞれＲＰＭｎ６４０培
養液で0.001∼100μg/mlに調製した.24時間前培養し
USA)で培養した．シャーレ中央の
穴の上にステンレス製メッシュとレンズペーパー(1×
た後，これらの各種抗癌剤溶液および３Ｈ-ＴｄＲを添加
1cm)をのせた．レンズペーパー上に１シャーレあたり
し，さらに48時間培養した．培養終了後それぞれの毛
６本の成長期毛包をのせ，液面が組織を覆うように
球部のＤＮＡ量あたりの３Ｈ-ＴｄＲ取り込み量を測定し
RPMI1640培地を加えた．通常は血清無添加としたが，
た.
血清濃度の影響を検討する場合はRPMI1640培地で
5.各種サイトカインのＤＮＡ合成への影響
の牛胎児血清(ＧＩＢＣＯ)の濃度が,
1,
3,
5,
10,
および20％になるようにした．
培養条件は，通常の培養条件(37°C,
塩基性腺維芽細胞増殖因子(basic
growth
95%
air-5%
atinocyte
いは高酸素･低温度条件(3ドＣ，95％02-5％Ｃ０２)の
(hepatocyte
いずれかに設定した.
SF)はDr.
J.S. Rubin
3.評価
Bethesda,
MD,
24, 48, 72およ
Inc.(Boulder,
Ｃ０，ＵＳＡ)から，ヶラチノサイト増殖因子(keｒ-
ＣＯふ高酸素の条件(37°Ｃ，95％Ｏｎ５％Ｃ０２)ある
3-1 毛伸長測定 培養開始直後,
fibroblast
factor :ｂＦＧＦ)は, Synergen,
growth
factor : KGF),肝細胞増殖因子
growth
factor/scatter
(National
factor : HGF/
Cancer
Institute,
USA)からそれぞれ供与されたもの
を使用した．
び96時間後に実体顕微鏡下に毛包をステンレス製メッ
酸性腺維芽細胞増殖因子(acidic
シュの升目とともに写真撮影し毛伸長を算出Iしか．
factor : aFGF,
３-２ ＤＮＡ合成の測定 RPMI1640培養液で24
USA),上皮成長因子(epidermal
時間前培養した後，2μCi/mlの３Ｈ-ＴｄＲを含む
EGF,湧水製薬)，トランスフォーミング成長因子-α
Ｒ＆D systems,
RPMI1640培地でさらに48時間培養し，毛包組織を水
(transforming
growth
冷]O％トリクロル酢酸(ＴＣＡ)にて３回洗浄しか．毛
Inc., Redmond,
WA,
球部のみ実体顕微鏡下でナイフにより分離し，６個の
成長因子･β(transforming
fibroblast growth
Minneapolis,
growth
factor-or:TGF-a',
MN,
factor :
Biotope
USA),トランスフォーミング
growth
factor-β:ＴＧＦ一β，
771
マウスvibrissae毛包器官培養
R＆Ｄ
systems),インスリン様成長因子」(insulin-
like growth
factor! : IGF I, Collaborative
(mm)
￡
ｊ
Research
ｌ
ｊ二
Inc., Walthara,
MA,
USΛ），インターロイキン」α
(interleukin-l(3':IL-la,
USA),インターロイキンー6
Genzyme
(interleukin-
Corp.),腫瘍壊死因子-a
necrosis factor-or: TNF-a,
R&D
(tumor
systems)は購入
m
ｌぶ
したものを使用した．毛包を24時間前培養した後に，
aｐｉ.-Ｈ
コ
これらサイトカインおよび３Ｈ-ＴｄＲを添加してさらに
０ ０ ０ ０ ０ ０
ｏ ８０ ６０ ４０ ２０
6:Iし6,
Corp., Cambrid (ＶＮＱＢＷ/ｕｉｄｐ)
ge, MA,
Genzyme
も
o
48時間培養した．培養終了後毛球部のＤＮＡ量あたり
の３Ｈ-ＴｄＲ取り込み量を測定した．
Fig. 1 Mice vibrissal hair bulbs obtained
from
結 果
mice at various ages (day
1. Vibrissae器官培養法の培養条件の検討
Diameter of mouse vibrissalhair bulbs at various
（1）マウスvibrissaeの日齢差の検討
ages measured
3,6,
DNA
9,12,15,21および28日齢のマウスvibrissae
0,-5%
under the stereomicroscope。Ｂ:
synthesis during 48h incubation period of
vibrissalhair bulbs at various ages. Bars repre-
の毛球部の直径を計測した．さらに，得られたvibrisｓａｅを31で, 95%
3 to dav 28). A:
sent the mean土SD.
n = 5.
CO,の条体で24時間前培養
し，その後48時間の３Ｈ-ＴｄＲの取り込みを調べた(Fig.
1）.毛球部の大きさ（直径）は，３力ゝら12回廊にかけ
mm/dayであった.
て増大するが，それ以後の28日齢まではほぼ一定の大
長を具体的に示しか．培養中に延びるのは主として毛
Table
2に，96時間培養時の毛伸
きさで変化がなかった．またＤＮＡ合成に関しては３
幹の部分であった．この期間の3H-ＴｄＲの取り込みを
から15日齢までほぼ同程度のＤＮＡ合成が認められ
Table
た．しかし2!.目齢と28日齢のマウスから得られた毛包
線的に増加することが判明した．また組織学的観察に
2 4こ示しか.24時間の前培養後，72時間まで直
のＤＮＡ合成は，15日齢までのものに比較すると低下
より培養96時間まで毛球部構成細胞はほぼ正常構築を
していた．これらのことから，実験系としては９日齢
保持していた.以後の実験では前培養24時間,
のものを使用するのが妥当と考え，以下の実験では９
との反応は48時間に設定した.
日齢のものを使用した.
(4)培養温度と酸素濃度の検討
②Vibrissaeの採取部位の検討
培養72時間後の毛球部構成細胞の311-Ｔｄｋの取り込
Fig. 2に示す,
みはにiTC,
vibrissaeのどの部位の毛包組織が最
も実験に適しているかを調べた.
Vibrissaeの各部位
95%
air-5%
■■'H-TdR
CO2の培養条件で7,008dpm/
μｇＤＮＡと最も高く，37で，95％02-5％Ｃ０２で4,092
から毛包を分離し，31で，95％Ｏｙ5％Ｃ０２の条件で72
dpm/μｇ DNA,
時間培養し，毛球部構成細胞のＤＮＡ合成を比較検討
μｇ DNA
した. Fig. 3に示すように,3H-ＴｄＲの取り込み量によ
(Ｆｉｇ.5).３Ｈ-ＴｄＲ標識後の才−トラジオグラフ(Fig.
り求めたＤＮＡ合成の程度は，眼側１列目が932dpm/
μgDNAと最も高く，２列目が802dpm/μgDNA,
6)では37で,
3
3ドＣ，95％ＯＥ５％Ｃ０,で1,365dpm/
と，培養条件の違いで異なった値を示しか
95%air-5%CO,培養条件で毛母細胞の
変性および毛球部の萎縮が軽度認められ，さらに3沁
列目が379dpm/μgDNA,鼻側の４列目が269dpm/μｇ
ＴｄＲに一致する穎粒の分布は毛母細胞,外毛根鞘細胞
ＤＮΛと最も低い値を示した．以上の結果から，眼側縦
および外毛根鞘周囲の結合組織内のそれぞれの細胞核
２列のvibrissaeを使用することが妥当と判断し，以
に認められた(Fig.
下の実験では１匹のマウスから左右の眼側縦２列の
Ｃ０２の培養条件でも同様に毛母細胞の変性および毛球
vibrissae.計18本を使用することにした.
部の萎縮が軽度認められたが，その程度は37で,
95%
（3）培養時間の検討
aiｒ-5％Ｃ０２のものよりも軽度であった(Fig.
6, Panel
９日齢マウスの毛包組織の伸長は,培養24時間で０．４
mm,
48時間で0.8mm,
ｍｍであった(Table
72時間で1.0mm,
ｎ.
96時間で１．３
毛伸長の平均は約0.3∼0.4
6, Panel
1). 37で，95％02-5％
２)ｊＨ-ＴｄＲの穎粒の分布は毛母細胞,外毛根鞘細胞お
よび外毛根鞘周囲の結合組織内に認められた.31で，
95％02-5％Ｃ０,の培養条件では,培養72時間後の毛母
㈲敏正舛計
772
●
●●●●
●●●●．．
●●゜゜７
●
●
≪/lｕｄｐ)
●
●●●●
(ＶＮＱ ６
●
ＶＺＵ ｕi<ij￨Ｅ￨uiiｕｐｘ-Ｈ.
４ｐ
１ ２ ３ ４
／ 12
Fig. 2 Schematic
The
diagrams
3 4
Fig. 3 DNA
of mouse
vibrissal hair follicleswere
synthesis
lated from
vibrissae.
cultured
divided verti-
fO 1- 72h. The
ｃＯ
rresponds
callv into ４ groups.
hair follicles were
number
tO the hair f0 Hide
in Fig. 2. Bars
p<0.01
of vibrissal hair bulbs ISO-
different sites. The
represent
(vs l and
of each
group
column
illustrated
the mean土SD.
n = 3バ
2).
細胞に明らかな変性は無く，ほぽ正常構築が保たれ，
３Ｈ-ＴｄＲの穎粒の分布は，主にAuber's臨界線以下の
培養が妥当と思われた．
毛母細胞の核に局在していた(Fig.
以上に示したいくつかの実験からvibrissaeを用い
6, Panel
3).
(5)培養液中の牛胎児血清の影響
た器官培養法では９日齢のマウスの眼側縦２列，血清
培養液中の血清濃度の影響を，毛球部のＤＮＡ合成
無添加，培養条件31で，95％Ｏｙ5％Ｃ０，が培養条件と
を測定することによって検討した．培養は９日齢のマ
して最適と判断した．この培養条件を基に，マウス
ウスvibrissaeを用いて，31で，95％Ｏｙ5％ＣＯズ)培
vibrissaeに対する各種抗癌剤とサイトカインの影響
養条件で72時間行った．その結果K
3,
5, 10およ
を調べた.
び20％の牛胎児血清を添加した群は血清無添加群とほ
2.各種抗癌剤の影響
ぼ同等の３Ｈ-ＴｄＲの取り込みを示し，血清濃度による
各種抗癌剤の毛球部のＤＮＡ合成への影響をFig.
影響はほとんど認められなかった(Fig.
に示した．無添加群と比較してcytosine
7).図には示
さないが，毛の伸長および太さに対する作用にも差は
およびmethotrexateでは1μg/mlから,
認められなかった．以上の結果からvibrissaeの器官
C,endoxanおよびadriacinでは10μg/ml以上の濃度
培養には血清は必須ではなく，血清中に含まれる微量
で明らかなＤＮＡ合成抑制がみられ，その抑制効果は
な諸因子の影響を取り除くためにも血清無添加による
cytosine arabinoside で最も強かっか（1μg/mlで76％
Table ｌ Elongation of mouse
Incubation period
(h)
ご1
vibrissalhair folliclescultured for 96 h
48
72
96
0.81士0.02
1.01土0.10
i.:m土0.22
EIOngati(nO f
O.ll士0.12
vibrissalhair
follicles
{mm}
Results、､･ereｃ χpressed as the mean上SI){n:-㈲
Table
２ Time
course
Incubation period
(h)
'II-TdR uptake
(dpnソμμＤＮＡ)
of DNA
synthesis in cultured
36
48
3(出土47
438上;惚
The hair follic】es
were cultured in serum-free medium
The
assay was
were expressed
vibrissal hair bulbs
72
96
664上61
i1195%
739土135
O-, 5% CO, at 31で.
carried out in trip]icateusing 6 hair bulbs as ( nc gr( up. Results
as the mean上sn.
8
arabinoside
mitomycin
マウスvibrissae毛包器官培養
773
１
２ ３
４ ５
Fig. 4 Morphok
gy of mouse
vibrissa】hair follicles during 96h incubation
The increase in hair follicle length
was
mainly
due tO theelongation
shaft.1 : Oh, 2: 24h, 3 : 48h, 4 : 72h, 5 : 96h. Magnification
抑制)．一方,
bleomycin,
cisplatinはＤＮＡ合成を軽
period.
of the hair
x 16.
−
１
度しか抑制しなかった.
１
3.各種サイトカインの影響
Fig. 9に示しか．無添加群と比較してTGF-α,
β, KGF,
a>￨Ｅｊａｎ ｄＰｌ-Ｈｃ
各種サイトカインの毛球部のＤＮＡ合成への影響を
TGF-
IGF-I, IL-1α，ＴＮＦ-αなどで，ほぼ用量に
相関したＤＮＡ合成の抑制がみられ，特にＴＮＦ-αで
lOng/ml力ヽら, IL-1αでlng/mlから著明なＤＮＡ合成
抑制が認められた(それぞれ66%,
5( ％抑制)．一方，
゜1 2 3
Fig. 5 Comparison
synthesis
of the culture conditions.
of vibrissal hair
ＨＧＦ/SFは調べたサイトカインの中では唯一DNA
during
合成を有意に増加させた(lOng/mlで46％増加)．図に
medium.
Bars
は示さないがHGF/SFは30
37で95%
air-5%
ng/mlの濃度でもlOng/
72h
incubation
represent
bulbs
period
was
in
the mean土SD.
DNA
measured
serum-free
nこ3.1:
CO,､2:37で９５％Ｏｙ５％Ｃ０２､３：
３ドC95％02-5％Ｃ０２.
mlとほぽ同等のＤＮＡ合成を示しかことなどから
HGF/SFの本培養条件における至適濃度は約lOng/
mlと判断した．
ることを報告した．しかし，これらの実験ではヒト毛
包組織の入手に限界があり，この方法を種々の物質の
考 按
スクリーニング法として使うには，勤物の材料を使用
毛の成長機序を研究するために，従来種々の実験方
した安定供給が可能なiｗ ｖitｒｏ ０)評価系の確立が望ま
法が考案されてきた.
れた．
の評価系として37で,
∼５日間,
1990年, Philpottら8)は, in vitro
95%
Kondoら9)は，36で,
air-5%
95%
CO,の条件で４
そこで今回，マウスのvibrissaeを用いて，まず種々
0,-5%
の培養条件の比較検討を行った.
CO,の条
件で６日間それぞれヒト毛包組織が培養可能であるこ
とを報告した．さらに,
Imaiら12)13)はヒト毛包の組織
Philpott'"はマウス
の体毛を用いた毛包組織器官培養について報告してい
るが，体毛では毛包組織が小さすぎて，毛包の外科的
器官培養の培養条件として，3ドＣ,95％Ｏｙ5％Ｃ０,の
摘出が困難であることを指摘している．一方，マウス
条件が組織の変性が少なく培養の条件として最適であ
のvibrissaeは体毛に比較すると毛包が大きく取り扱
神藤 敏正 坪井 良治
774
千
賢
１
２
ごリ≒︷ｙｊぢＩで々
轍付
守
’
い∼ｙ４しア
ノヘ いうじ
球↓
･ｆ
●●．
￥ﾉ‘べ
じ/
疹
炉
４ 卜
１。
二
湘｡
参●
挙
４
齢疹・
∼∼
︱ ゛タり
ぐ Ｉア／？
●●
淋
亀
吋
卜 ⇔
知
∼ダｙ
ｗｊ
参。’
φ
.･.-i°･.･
ご
’）’万万t
=､71
３
４
/．/に,jダt“ｊ ，ぐ
ブ√年心叉ﾚ:t
し .･･
Fig. 6 Autoradiograph
ed
with
''H-thymidine
of vibrissal hair follicle. The
for 48h in a serum-free
･･／..ダ･･･學･ 4s.･w， ゝ･
hair follicles were
mediumフIl-thymidine
tion into the hair follicle was
visualized
400 ｡1:37で95%
2:37で９５％Ｏｙ５％Ｃ０。３：３１で95%
air-5%
CO,,
by autoradiography.
incubat-
incorpora-
Magnificatic
O,
n
X
5％ＣＯ。
775
マウスvibrissae毛包器官培養
(ｖｎｑＳ
組織を用いた報告16)もあるが，全てのvibrissaeの毛
ｎｉＥｕhijaJ￨ii4ｕｎ ＵＭＪ.-Ｍ
周期が同調していなかったことから醜第一期の成長
期毛で実験することが望ましいと考えられた.
Vibrissae毛包組織の部位差による毛球部のDNA
合成は眼側縦２列で高いＤＮＡ合成が観察された
(Fig. 3).マウス17)およびラット18)のvibrissaeの各部
位による毛伸長の程度は，眼側で大きいと報告されて
Fig. 7 Effect
medium
The
of fetal bovine
on DNA
serum
らのことから，９日齢のマウスvibrissae左右各眼側
in the culture
縦２列の各９本のvibrissaeを実験材料に採取するの
synthesis in vibrissal hair bulbs.
hair follicles were
-5％C02
おり，今回の実験結果と一致する所見であった．これ
(勾
at 3rc.
Bars
cultured
for 72h, 95％02
represent
the mean土SD.
が妥当と考えられた．
Buhlら6)は，72時間の培養で毛伸長は観察されたも
n = 3.
のの，正常な組織構築は保持できなかったと報告して
いる．今回の培養時間の検討では，毛伸長は96時間後
いやすく，今回の実験において検討した結果，９日齢
まで経時的に一定の割合で増加した(Table
のマウスvibrissaeが器官培養系としては適切である
スの加毎回での生理的なvibrissaeの毛伸長は約
ことが判明した(Fig.
0.6∼0. 8mm/dayと報告されており17)，本培養方法で
1).マウスのvibrissae
(よ，15力ゝ
ら28日齢の間で第一期の休止期にあり，さらに第二期
は，その約1/2程度であった(Table
の成長期に移行する.28日齢のマウスvibrissae毛包
培養時間に比例して一定の割合で増加した(Table
T
T
ｽj
1). DNA合成も
・
ILJ
ij
１
″JPトーエの
0 0
lo' 10'210'1 1 10
1
･(μg/ml)
10
10‘ 10' 1 10
10(μ9/ぶ)0 10゛ 10'2 10'' 1 10
10祐9/ml}
Cisplatin
jiiiiii
a. u
ｉ↓
Adriacin
１５０
(ｌｏｎｕｏｏ
JO ％)
３>￨ｅ￨ｄｎｙｐｉ-Ｈc
１００
50
0
Fig. 8 Ｅ斤ect of various
bulbs. The
ａｎしneoplastic
expressed
mean土SD.
anti-neoplastic
hair follicles were
agents
for
as percentages
n = 3、*p<0.01.
agents on DNA
cultured in serum-free
72h
in 95％02-5％Ｃ０２
of those
synthesis in vibrissal hair
medium
with
at 31で.
of the ｎｏｎ､treated group.
the indicated
All
Bars
data
1).マウ
were
represent
776
神藤 敏正
iｉ
坪井 良治
＆
』
ＴＧＦ･ぼ ＴＧＦ･β HGF/SF ゛‘
150 150 150
100 10ひ 1 5
で
o o｡5 1 5 1o
0D
で
20 (ng/ml) o e.5 1 5 10
0 0.5 1 5 10
幽
で
20
20 *ng/所 o 0.5 1 5 1o 20
*ng/叫 0 0.5 1 5 10 20
(ng/ml) o a,5 1 5 10
(ng/ml) 0 0,5 1 5 10
20<19''nl】
20(n*川
aFGF bFGF KGF TNF-a
O Q 0.5 ？ ５ 10
20 fng/ml) o o 0.5 1 s 10
iiiij
i;jjJ
IGF-I IL･1α ￨し6
20 (ig'rni) o 0.5 1 5 102Q(n9/ml) o o 0.5 1 5 10
iiii
20 (嶮川
150 150150
1L
0， 100 100
0 Q 0 0.5 1 5 10 20(ng/ml)
Fig.
9 Effect
vibrissal
hair
the
O
0 0.5 1 5 10
of
indicated
f
the
various
bulbs.
The
reagents
non-treated
20 (ng/ml) 0 0,5 1 5 10 20
cytokines
hair
for
ｇｒO up.
and
follicles
72h.
All
Bars
data
represent
growth
were
cultured
were
(nS'Tll}
factors
on
in
expressed
mean士SD.
DNA
serumイree
as
n
=
3,
synthesis
medium
percentages
in
with
of
those
*pく0.01.
2).また，蛋白合成，特に毛包構成成分として重要な
た8)9)
システインの取り込みは,
ヒトの頭部手術材料から毛包を人手する場合は部位
DNA合成と同じようなパ
ターンを示しか19)
が必ずしも一定でなく，ホルモンの感受性23)も異なる
培養条件の検討では，酸素濃度が高いことおよび培
ことから，それぞれの実験結果の比較が困難となる．
養温度が低いことが形態保持・ＤＮＡ合成の維持に適
今回マウスvibrissaeを用いることで，常に均質な毛
しているものと判断された(Fig.
6).その理由として
包組織が得られるという利点が考えられ，また実験結
37で，95％air-5％Ｃ０２では毛母細胞の分裂が盛んで，
果もヒト頭部毛包を使用した場合の結果と類似してい
初期には３Ｈ-ＴｄＲの取り込みが著明に認められるが，
た9)
毛包組織が生体から分離された状態では毛母細胞に余
料が容易に人手出来ること，②再現性および定量性に
力が無くなり，変性してしまうものと考えた.
Ikeda
14)マウスvibrissaeを用いた器官培養法は,①材
おいて優れ,③血清の影響を受けない,など加言匯）の
ら尚は皮膚器官培養法において温度を31°Ｃに低下さ
評価系として優れていることが示された．更に，本法
せ，Ｋｏｎｄｏ２２)は酸素濃度を95％に高めることで表皮細
を用いることで，脱毛や発毛作用を有する物質のスク
胞の変性が抑制されることをすでに報告している．
リーニングなどに有用であり，また今後の毛成長機構
毛包組織の器官培養では培地に血清を添加する必要
解明にも有効な手法であることが示唆された．
は無いと報告されているが8)19)今回の実験でも同様
そこで，この器官培養法を用いて各種の抗癌剤やサ
の結果が得られた(Fig.
7).器官培養系に血清を必要
イトカインなどの影響を比較検討した(Fig.
としない理由の一つとして毛特有の複雑な構造が考え
回の実験結果ではcytosine
られる．一つの器官として毛乳頭細胞や毛母細胞から
よりもＤＮＡ合成を強く抑制した(Fig.
自己分泌，傍分泌的に種々の成長因子が継続的に分泌
ら２４)も,
a driacinとcytosine
されているからである8)9)また,毛伸長あるいはDNA
投与した実験で,
8, 9).今
arabinosideはadriacin
8). Hussein
arabinoside をラットヘ
cytosine arabinoside がadriacinよ
合成を抑制することが知られているＴＧＦ-βが血清中
り全身的な脱毛を強く示すと報告している．一方,
に含まれていることも原因の一つとして考えられ
platinおよびbleomycinは，毛球部構成細胞のDNA
CIS-
777
マウスvibrissae毛包器官培養
合成の抑制は明らかでなかった(Fig.
異が何に起因するのかは現時点では明らかでなく，今
8).このことは
cisplatinおよびbleomycinがＳ期∼S期後期および
後さらなる解析が必要と考えられた．
G2前期までの細胞周期にある細胞に対して影響が少
一方，今回の実験では,
ないことに起因するのかもしれない25)抗癌剤の脱毛
のＤＮＡ合成を促進させることがさらに確認された
は一般的に，代表的な副作用として認識されていなが
(Fig. 9). 1994年,
ら，その対応は十分とはいえず，副作用による精神的
が既に報告したが36),培養ヒト毛乳頭細胞がHGF/SF
苦痛に悩むことが多い26)毛母細胞は生体内でも細胞
のｍＲＮＡを発現していること39)，ＨＧＦ/SFがヒト毛
増殖の特に活発な細胞と言われ2へ抗癌剤の生体細胞
包や毛球部出来のケラチノサイトのＤＮＡ合成を有意
HGF/SF力1毛球部構成細胞
HGF/SFの毛成長促進作用は我々
への感受性を確認する上で本法を用いることは有効な
に増大させること39)40)についても我々が既に報告して
方法の一つと思われた．
おり,
サイトカインの中ではＴＧＦ-α，ＴＧＦ-β,
I, IL-la,
KGE,
IGF-
HGF/SFは細胞の増殖・遊走・形態形成など多
彩な機能を持つことも報告されている41)今後は
HGF/SFの活性化機構を更に詳細に明らかにするこ
TNF-aで毛球部構成細胞のＤＮＡ合成の抑
制がみられ，その程度は特にＴＮＦ-αおよびIしｈで
とが重要と考えられ，我々はこれらについては現在研
著しかった(Fig.
究を続行中である．
9).毛成長とサイトカインの関係に
稿を終えるにあたり，終始研究の御指導および論文の御
関する研究では，毛包組織にＥＧＦレセプター28)
bFGF29)3o)，ＴＧＦ-β31)などが局在し,
TGF･
･２)や
小川秀興博士に深甚なる感謝の意を表します．また,研究実
ＫＧＦ３３)の遺伝子欠損マウスで毛包形成異常が生じた
施上適切な御助言を頂いた順天堂大学浦安病院皮膚科教授
ことなどが知られている．しかしながら，加z虜抑の毛
包組織器官培養法や泌が回の実験ではEGF,
α, TGF-β,bFGFおよびIL1α8)34)
校閲を賜りました順天堂大学医学部皮膚科学講座主任教授
TGF-
高森建二博士およびいまい皮膚科クリニック今井龍介博士
に感謝します．
37)が予想に反して
毛成長を抑制することが報告されている．これらの差
献
文
!)
Hattori
of
enzyme
2)
M， Ogawa
hair growth
Ｈ: ＢｉＯchemical
from
the aspects
activities,/ Ｄｅｒｍａtol, １０
: 45-54,
Kollar
ET ； An
vibrissae
in
vitro
development
in
study
of
Frater
post
-81,
4)
Ｒ， Whitmore
embryonic
PG : In
and
1983.
hair
embryonic
skin,J InｖｅｓtＩＤｃｒｍａtol, 46
: 254-262,
3)
analysis
of aging
and
mouse
vitro growth
of
hair, / Inｖｅｎt
Ｄｅｒｍａtol,ら1
: 72
Ｄ : Regional
appendages
Hattori
M
mouse
specification
in mammals,
: Ａ new
hair
method
follicle
purification
growth
and
of
Ｗy決丿脚
Ｄｅｒｍａtol, 58
: 539-546,
6)
AE,
Kcles
in organ
315-320,
7)
Sci,
DJ,
hair
TT,
mouse
Holland
vibrissae 如1-
and
MP,
vitro丿Ｃｅｌｌ
Ｓ，Hozumi
scalp
and
Kondo
of
Green
in
MR,
Kealey
Ｔ : Studies
morphology
maintained
rat hair follicles,Ｊ Ｃｅｌｌ
1989.
Green
MR,
on
of freshly
14)
Imai
K，
Ｔ : Human
Ｄｅｒ
derived
from
/ Ｄｅｒｍａtol. 19: 348
MR,
Kealey
Ｔ : Rat
hair
Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａtol, １２７ ･.
Ｙ， Mochida
K,
K.
Ｈ : Organ
hair
Jindo
T， Ｔａ･
culture
condi-
follic＼ｅｓ, JＤｅｒｍａtol Ｓｃｉ,
1992.
Ｒ， Jindo
T，
Ogawa
follicles
in
Ｒ， Jindo
Takamori
Miura
Ｙ， Mochida
Ｈ : Organ
serum-free
T,
agents
in hair
1993.
culture
medium,
Mochida
K， Ogawa
anti-cancer
73-80,
A冗ｈ
Ｎ， ＡＳＯ: Organ
follicles
vitro,
Ogawa
(3f human
synthesis
Kealey
growth,
of
testoster-
1992.
Ｒ， Miura
kamori
hair
hair
culture
of
1990.
of the body,
MP,
: 163-171,
Imai
hair
Ｙ， Sato
human
growth
kamori
13)
: effect
1992
600-607,
tions
on
ｍａｌｏｌ Ｔｉｅｓ,284
: 466一一471,
and
Ｓｃｉ,97 : 463-471,
Ｋ : Organ
: 442-445,
areas
Philpott
Imai
Aso
follicles
Ｓ， Hozumi
-352,
11)
Y,
hair
oestrogen
culture
3
1988.
Kawabe
stimulates
Green
93:409-418,
PhilpoU
of
culture, f Inｖｅｓt
Ｄｅｒｍａｉｏｌ. ５２".
biochemistry
isolated
10)
12)
1989.
Philpott MP,
the
8)
Waldon
: Minoχidil
of
and partial
factor in fetal calf serum,
J卸Ｊ
JM
Kondo
human
follicle
for cultivation
tissue
characterization
stimulating
Buhl
9)
different
Dhouailly
in
ｍボol Ｒｅｓ,282
ＲｏＭｘ'sＡ冗h Ｄｅｖ Biol. 181:3-10, 1977.
5)
growth
1990.
one
1966.
1973.
cutaneous
hair
and
ＡｒｃｈＤ叩
1993.
Ｋ， Shimaoka
Ｈ: Ｅ汀ect
bulb
Ｋ， Taof human
cocarcinogen
S，
of cytokines,
on
DNA
cellｓ,J Ｄｅｒｍａtol Ｓｃｉ, 5:
神藤 敏正 坪井 良治
778
15）ＫiSsaｎe
sｕreｍｃｎt
tiＳＳｕｅＳ
nervouS
JＭ,
of
ｗiｔｈ
Ｒｏｂiｎs
Ｅ
: Ｔｈe
ｄｅｏｘｙriｂｏｎｕｃlｅic
Uｕｏrｏｍetric
aｃid
ＳｐｅＣiａJ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ tｏ
SySteｍ,ｙ召ん／Ｃ加肌２33
in
tｈｅ
:
ｍｅa−
a雨ｍａl
ｃｅｎｔｒａ]
184−189,
Distribution
the
of basic fibroblast growth
18-day
ment
rat fetus : localization
membranes
110
: 753,
1９５８.
30) Ueki
16）宇塚 誠，榛沢千加：マウスのヒゲ毛包の器官培
Ｈ
1990.
R, Imai
R, Takamori
: Immunohistochemical
fibroblasl growth
JpnJ
Ｄｅｒｍａtolユ01: 1177-1181,
UI, Munoz
LR, Lam
Sporn
embryo,
the
32) Mann
GB,
mutation
often
wavy
: Mice
gene
corneal
Moore
GPM,
1983.
Ｅ : Keratinocyte
BA,
factor
Panaretto
BA,
and
infused
･Ｄｅ市latol,84
DL
with
the development
cs,
human
Nevins
Ｔ， Tsubo
Ogawa
cycling
and
Ｒ，Imai
of mur-
in organ
39) Shimaoka
1993.
inhibits
hair fiber pro-
1993.
Ｒ, Takamori
Ｈ ； Hepatocyte
: 3069-3069,
1985.
factor
cultures,Ｌｙｍtihofeine ａｎｄ
factor stimulates
vibrissae
K， Rubin
growth
hair growth
culture, /
factor/
of mouse
/れｖｅｓt
Ｄｅｒｍａｆｏｌ,
1994.
S， Tsuboi
R， Jindo
kamori
K， Rubin
growth
factor/scatter
licular
papilla
growth
in vitro, /
JS, Ogawa
T， Imai
Ｒ， Ta-
Ｈ : Hepatocyte-
factor expressed
cells stimulates
in fol'
human
hair
CellｕlaｒＰｈｖｓiol,
165 : 333-
1995.
40) Jindo T, Tsuboi
JS,
growth
ＴＤ: Iしla
hair follicle growth
in whole-organ
scatter
338,
growth
: 172-175,
and
Ｃ丿ｏ回心 Ｒｅｓ，12: 197-203,
103
epidermal
: Fibroblasl
ＮＢ:
follicle regres-
hair follicleｓ,
Ｄｅt) BioL 1^6
: 444-453,
Harmon
Ｄ:
develop-
Carter
wool
factoｒ, J Inｖ
influences
the
and hair follicles of mice
hyperplasia
DuCros
Robertson
delays
si on in sheep
38）ﾕindo
and
C召//,73 :
of the石rst coat, Ａｎａｔ Ｒｅｃ.205
:
GPM,
Epidermal
tein
skin
for hair development
Panaretto
of the epidermis
Moore
JS,
abnormal
healing, Ｇｅｎｅｓ,
Ｄｅむｄｏか･ment.
growth
47-55,
37)
EC,
ａ null
1996.
growth
ine
with
have
Ｌ，Fuchs
not for wound
: 165-175,
during
36)
A， Nice
in日ammation,
factor is required
ment
mouse
1987.
1993.
Epidermal
35)
the
hair, and curly whiskers
Ｌ，Degenstein
growth
34)
Gabriel
AR
AB,
growth
of
KJ,
of the TGF<i
249-261,
10
development
Dunn
develop
but
Roberts
of transforming
Fowler
architecture,
33) Guo
Ellingswor-
NL,
J Cell Biol.105 : 2861-2876,
べA^illiams RL,
of
skin,
1991.
KC,
Thompson
ＭＢ： Role
factor-βin
factor in mouse
EF, Flanders
HYP,
K, Ogawa
localization
basic
th
base-
of diverse tissues,r Cell Biol.
R, Tsuboi
31) Heine
factor in
治山ｅ
Ogawa
R, Imai
Ｈ : The
Ｒ, Takamori
effect
of
K, Rubin
hepatocyte
779
マウスvibrissae毛包器宮培養
growth
factor/scatter factor on human
folliclegrow出丿Ｄの■matol Sべ10
factor/scatter
hair
prol-onc(
: 229-232,
1155：357-371,
1995.
41) Rubin
JS, Bottaro ＤＰ: Hepatocyte
Organ
Culture
Department
of Mouse
Vibrissal
The
and
period were
measured.
were similar throughout
mouse
Its Application
School of Medicine
vibrissal hair follicleswere
The diameters
incorporation
and then
in terms of maintaining
The presence of up t0 20%
synthesis. These
morphology
fetal bovine serum
during the 96 h
CO2-95%
air at 37で
medium
did not have any significant effect
culture are to incubate
of vibrissae closest to the eye in serum
free-
then analyzed the effects of various anti-neoplasitc agents
and cytokines on DNA
synthesis in vibrissal hair bulbs. Among
mitomycin
methotrexate,
adriacin, tumor
synthesis. In contrast, only hepatocyte
1y stimulated the DNA
of vibrissae
synthesis level of 山e hair bulb-consisting cells.
in the growth
the 2 rows
manner
superior to that in 5%
results suggest that the optimal conditions for organ
in 95％02石％Ｃ０２ at 31ｲＣfor 72 h. We
the 2 rows
synthesis than those from the other vibrissae. The length
and the DNA
hair folliclesisolated from
Ｃ，endoxan,
Hair
of the vibrissal hair bulbs isolated from ３−to !2-day-old
period. Hair folliclesobtained from
higher levels of DNA
normal
1640 medium.
during the last 48 h of the 72 h
synthesis of the isolated hair folliclesincreased in ａ time-dependent
is ａ useful method
determined
synthesis levels of hair bulbs isolated from ３一一
to 15-day-old mice
incubation period. The culture in 95％02-5％Ｃ０２ at 31でwas
inhibited DNA
21，1997)
were micro-dissected and cultured in RPMI
the 48 h incubation
closest to the eye showed
9一dav-old mouse
the c-met
1993.
for publication February
culture of mouse
mice were proportional to age. The DNA
on DNA
its receptor,
Tsuboi
University
folliclelength at specific time intervals and 'H-thymidine
and DNA
and
product, ＢｉｏｃｋtＴＯＢｉｏｆ)ｈｙｓﾉVctａ,
the effect of various anti-neoplastic agents and cytokines on hair growth. Individual
vibrissal hair folliclesfrom B6C3Fi
incubation
Follicles and
Ryoji
Juntendo
6，1996, accepted
optimal conditions for organ
utilized to examine
Hair
Jindo
of Dermatology,
(Received December
factor
growth
Toshimasa
medium
gene
the tested reagents, cytosine arabinoside,
necrosis factor-α,and interleukin-1αsignificantly
growth
factor/scatter factor (HGF/SF)
significant-
synthesis of hair follicles.
I n conclusion, organ culture using vibrissal hair follicles
by which
to ｅχamine the effect of various reagents
on hair follicles.The
required
materials are readily available, and the results are quantitative and not affected by any contaminants
the serum.
(Jpn Ｊ Dermatoに07:
Key
words: hair
growth,
7卵∼779パ997)
mouse
vibrissal, organ
culture, cytokines, anti-neoplastic agents
in