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熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System
熊本大学学術リポジトリ Kumamoto University Repository System Title Short hairpin RNA 発現ベクターおよび siRNA 導入用キ ャリアとしてのデンドリマー/α-シクロデキストリン結 合体の有用性評価 Author(s) 堤, 利仁 Citation Issue date 2007-03-27 Type Thesis or Dissertation URL http://hdl.handle.net/2298/8731 Right 熊本大学学位論文 Short hairpin RNA 発現ベクターおよび siRNA 導入用キャリア としてのデンドリマー/α-シクロデキストリン結合体の有用性評価 2007 堤 利仁 Short hairpin RNA 発現ベクターおよび siRNA 導入用キャリア としてのデンドリマー/α-シクロデキストリン結合体の有用性評価 2007 堤 利仁 Evaluation of Dendrimer/α-Cyclodextrin Conjugate as a Novel Carrier of Short Hairpin RNA Expressing Plasmid Vectors and siRNAs Toshihito Tsutsumi Evaluation of Dendrimer/α-Cyclodextrin Conjugate as a Novel Carrier of Short Hairpin RNA-Expressing Plasmid Vectors and siRNAs Toshihito Tsutsumi RNA interference (RNAi) is a sequence-specific gene-silencing mechanism triggered by double-stranded RNA. Powerful tools for a gene function study and RNAi therapy are emerging as the most highly effective strategy. However, standard therapeutic use of RNAi in clinical settings in humans has been hampered by the lack of effective methods to deliver the short-hairpin RNA (shRNA) expressing plasmid vectors or small-interfering RNAs (siRNAs) into the diseased organs. We previously reported the potential use of starburst polyamidoamine dendrimer (dendrimer, generation 3, G3) conjugate with α-cyclodextrin (α-CyD) having an average degree of substitution of 2.4 (α-CDE) as a gene delivery carrier. In the present study, the potential of α-CDE as a novel carrier of shRNA expressing plasmid vectors and siRNAs in vitro and in vivo was evaluated and compared with those of commercial transfection reagents including Lipofectamine™2000 (L2), TransFast™ (TF), Lipofectin™ (LF), RNAiFect™ (RF) and polyethyleneimine (PEI). In the first chapter, to evaluate the RNAi effect most simply, I examined the RNAi effects of the ternary complex of pDNA/siRNA/α-CDE on the transient expression of GL3 and GL2 luciferase genes, and compared these effects to those of the complexes with commercial transfection reagents in vitro. In the second chapter, I examined the RNAi effect of the binary complex of shRNA expressing plasmid vector (pSilencer) against GL3 and GL2 luciferase genes with α-CDE using cells transiently and stably expressing GL3 or GL2 luciferase gene. In the third chapter, I investigated the RNAi effect of the binary complex of siRNA with α-CDE on expression of GL3 luciferase gene as well as endogenous genes such as lamin A/C and Fas in vitro and in vivo. To gain insight into the mechanism of the prominent RNAi effects of the ternary and binary complexes with α-CDE, cytotoxicity, physicochemical properties, cellular uptake and intracellular distribution of the complexes were investigated and compared with those with commercial transfection reagents. These results were summarized as follows: 1) When transfected into cells expressing the GL3 or GL2 luciferase gene, the ternary complex of pDNA/siRNA/α-CDE provided more potent and invariable RNAi effects than those of commercial transfection reagents. When the ternary complexes of pDNA/siRNA/carrier into NIH3T3 cells, the α-CDE complex had cytotoxicity much less than those with L2, TF and LF and allowed fluorescein isothiocyanate-labeled siRNA (FITC-siRNA) to exist in cytoplasm, although those of L2 and TF allowed it to localize in the nucleus. These findings suggest that the prominent RNAi effects of the ternary complex with α-CDE could be attributed to negligible cytotoxicity and cytoplasmic delivery of siRNA. 2) The α-CDE/pSilencer binary complex provided the moderate RNAi effects in cells transiently and stably expressing the GL3 and GL2 luciferase genes without the off-target effects and cytotoxicity. The RNAi effect was markedly enhanced by the addition of siRNA to the binary complex. Electrophoretic and spectroscopic studies demonstrated that α-CDE formed a stable and condensed complex with pSilencer and induced a conformational transition of pSilencer from the B-form to the C-form. In addition, α-CDE inhibited the enzymatic degradation of pSilencer. These results suggest that α-CDE may be a suitable carrier for shRNA expressing plasmid vectors when siRNAs are added to the binary complex of the vector with α-CDE. 3) α-CDE formed the nanoparticle complexes and suppressed the enzymatic degradation of siRNA in 50% FCS. The binary complex showed the potent RNAi effects on not only the luciferase gene but also endogenous genes such as Lamin A/C and Fas in vitro. It is noted that the RNAi effects of the siRNA complex with α-CDE were preferable to those of the complexes with L2, RF and PEI. In addition, the binary complex with α-CDE showed negligible cytotoxicity on NIH3T3 cells stably expressing luciferase gene (NIH3T3-luc cells) up to the charge ratio of 200/1, although the complex induced necrosis at much higher charge ratios. The confocal laser scanning microscopic study revealed that after transfection of the binary complex with α-CDE into NIH3T3-luc cell, FITC-siRNA was found to accumulate in the perinuclear region in which the RNAi effects are exerted. These results suggest that the siRNA complex with α-CDE can provide the preferable RNAi effect in vitro to those with commercial transfection reagents, probably resulting from the formation of nanoparticle complexes, the stabilizing effect of α-CDE on enzymatic degradation of siRNA, negligible cytotoxicity and the cytoplasmic localization of siRNA after transfection. Comparing luciferase activity after transfection, the RNAi effects of the siRNA/α-CDE complex were found to be higher than those of the shRNA/α-CDE complex. 4) When the solution containing the binary complex of siRNA with α-CDE was injected into tumor tissues of mice bearing Colon-26 cells stably expressing the GL3 luciferase gene, the sufficient RNAi effects were provided. Meanwhile, in the case of the complex of L2 with siRNA, the off-target effect, not the RNAi effect, was elicited. These results suggest that the siRNA complex with α-CDE can provide the RNAi effect in vivo. In conclusion, α-CDE was found to provide the sequence-specific gene silencing effect by the complexations with shRNA expressing plasmid vectors and siRNAs. From the viewpoint of the magnitude of the RNAi effect, α-CDE was shown to be particularly useful for a carrier of siRNAs rather than shRNA expressing plasmid vectors. It should be noted that the RNAi effects of the siRNA/α-CDE complexes were preferable to those with various commercial transfection reagents. These prominent RNAi effects of the siRNA complex with α-CDE could be ascribed, at least in part, to the formation of nanoparticle complexes, the stabilizing effect of α-CDE on enzymatic degradation of siRNA, negligible cytotoxicity and the cytoplasmic localization of siRNA. Thus, these findings may be useful for design and evaluation of carriers for shRNA expressing plasmid vectors and siRNAs. 本論文で使用した主な略語一覧表 Ampr Ampicilin resistant CDE Cyclodextrin/dendrimer conjugate CLSM Confocal laser scanning microscopy CyD Cyclodextrin DNase DNA nuclease DS Average degree of substitution EtBr Ethidium bromide FCS Fetal calf serum FITC Fluorescein isothiocyanate G Generation HBSS Hank’s balanced salt solution IFN Interferon LF Lipofectin™ Luc Luciferase L2 Lipofectamine™2000 PAMAM Polyamidoamine pDNA Plasmid DNA PEI Polyethyleneimine PI Propiodium Iodide RF RNAiFect™ RISC RNA induced silencing complex RNAi RNA interference RLU Relative light unit RNase RNA nuclease RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction shRNA short hairpin RNA siRNA small interfering RNA SDS Sodium dodecylsulfate TBE Tris-borate EDTA TEM Transmission electron microscope TF TransFast™ TNF Tumor necrosis factor TRITC Tetramethylrhodamine isothiocyanate 本論文は学術雑誌に搭載された次の論文を基礎とするものである. 1. Potential Use of Dendrimer/α-Cyclodextrin Conjugate as a Novel Carrier for Small Interfering RNA (siRNA) T. Tsutsumi, H. Arima, F. Hirayama and K. Uekama J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem., 56, 81-84 (2006). 2. Evaluation of Polyamidoamine Dendrimer/α-Cyclodextrin Conjugate as a Novel Carrier for Small Interfering RNA (siRNA) T. Tsutsumi, F. Hirayama, K. Uekama and H. Arima Submitted 3. Potential Use of Polyamidoamine Dendrimer/α-Cyclodextrin Conjugate (generation 3, G3) as a Novel Carrier for Short Hairpin RNA (shRNA)-expressing Plasmid DNA T. Tsutsumi, F. Hirayama, K. Uekama and H. Arima Submitted 4. In Vitro and In Vivo Evaluation of RNAi Effect of siRNA Dendrimer/α-Cyclodextrin Conjugate H. Arima, T. Tsutsumi, F. Hirayama and K. Uekama In preparation Complex with 目 次 緒言 1 第 1 章 デンドリマー/α-シクロデキストリン結合体 (α-CDE) による siRNA の遺伝子発現抑制効果の増大 : 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/α-CDE) による遺伝子発現抑制効果 11 第 1 節 序 11 第 2 節 α-CDE の RNAi 効果におよぼす置換度の影響 15 第 3 節 3 成分系複合体の物理化学的性質 19 第 1 項 アガロースゲル電気泳動 19 第 2 項 3 成分系複合体の粒子径および ζ-電位 22 第 4 節 3 成分系複合体によるルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果 22 第 1 項 siRNA 配列の影響 23 第 2 項 siRNA 濃度の影響 24 第 3 項 3 成分系複合体のチャージ比の影響 26 第 5 節 α-CDE と市販キャリアとの siRNA の遺伝子発現抑制効果 の比較 27 第 6 節 3 成分系複合体の細胞傷害性およびオフターゲット効果 31 第 7 節 3 成分系複合体における FITC-labeled siRNA の細胞内分布 33 第 1 項 FITC-labeled siRNA の細胞内取り込み 34 第 2 項 FITC-labeled siRNA の細胞内分布 35 第 8 節 考察 37 第 9 節 小括 41 第 2 章 shRNA 発現ベクター (pSilencer) 導入用キャリアとしての α-CDE の有用性評価 44 第 1 節 序 44 第 2 節 α-CDE と pSilencer との相互作用 46 第 1 項 アガロースゲル電気泳動 46 第 2 項 円二色性 (CD) および紫外吸収 (UV) スペクトル法 による検討 第 3 項 α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径および ζ-電位 47 48 第 4 項 透過型電子顕微鏡による観察 49 第 5 項 pSilencer のコンパクションに対する α-CDE の影響 50 第 6 項 pSilencer の酵素分解におよぼす α-CDE の影響 52 第 3 節 α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性 第 4 節 ルシフェラーゼ遺伝子発現に対する α-CDE/pSilencer 複合体 の抑制効果 55 57 第 1 項 ルシフェラーゼ遺伝子一過性発現細胞における検討 57 第 2 項 ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞における検討 58 第 5 節 3 成分系複合体による遺伝子発現抑制効果 60 第 6 節 考察 61 第 7 節 小括 66 第 3 章 siRNA 導入用キャリアとしての α-CDE の有用性評価 68 第 1 節 序 68 第 2 節 2 成分系複合体の物理化学的性質 70 第 1 項 2 成分系複合体形成 70 第 2 項 2 成分系複合体の粒子径ならびに ζ-電位 71 第 3 項 2 成分系複合体の安定性におよぼす血清の影響 73 第 3 節 2 成分系複合体の細胞傷害性 74 第 1 項 細胞生存率と溶血活性 74 第 2 項 2 成分系複合体の細胞傷害性機構 78 第 4 節 一過性遺伝子発現細胞における siRNA 複合体の 遺伝子発現抑制効果 81 第 1 項 α-CDE との複合体化の影響 81 第 2 項 α-CDE/siRNA 複合体のチャージ比の影響 82 第 5 節 ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞における 2 成分系複合体 の遺伝子発現抑制効果 第 6 節 83 α-CDE と市販キャリアとの siRNA の遺伝子発現抑制効果 の比較 85 第 7 節 内因性遺伝子発現に対する 2 成分系複合体の抑制効果 87 第 8 節 2 成分系複合体の細胞内分布 90 第 1 項 FITC-labeled siRNA の細胞内取り込み 90 第 2 項 FITC-labeled siRNA および TRITC-α-CDE の細胞内分布 93 第 3 項 2 成分系複合体の細胞内分布におよぼす細胞種の影響 95 第 4 項 α-CDE および市販キャリア/siRNA 複合体の細胞内挙動 の比較 第 9 節 2 成分系複合体の in vivo RNAi 効果 96 97 第 10 節 考察 99 第 11 節 小括 107 総括 110 謝辞 115 実験の部 116 参考文献 136 緒 言 核酸レベルで遺伝情報を負に調節する方法 1) は, アンチセンス核酸をはじめ, リボザイム, 2-4) DNA ザイム, 5, 6) デコイ核酸, 7, 8) アプタマー, 9, 10) ドミナントネガ ティブ発現ベクター 11, 12) などが知られている. これらの中で, アンチセンス核 酸を用いた遺伝子ノックダウン法は最も歴史が古く, 13-18) 遺伝子解析などの分野 で広く使用されてきた. アンチセンス核酸を用いたアンチセンス法は, 標的遺伝 子から転写される “センス” RNA に相補的に結合し, 翻訳レベルで遺伝情報をノ ックダウンする方法である. この方法を用いることにより画期的な新薬の創製 につながるものと期待されたが, 非特異的な遺伝子発現抑制効果や免疫応答の誘 導, 19, 20) 標的配列の選定の難しさ, 血中での安定性と体内へのデリバリー方法な ど種々の問題から, 医薬品として広く臨床応用するのは困難な状況にある. 実際, アンチセンス核酸医薬品として市販されたのは抗サイトメガロウイルス薬 (眼球 内注射剤 Vitravene™, ISIS Pharmaceuticals Inc.) のみであり, リボザイム, デコイ 核酸, アプタマーなどのアンチセンス法を利用した核酸医薬は続々と臨床試験入 りしているものの, まだ市販されるに至っていない. 1998 年, Fire らにより RNA 干渉 (RNA interference, RNAi) と呼ばれる二本鎖 RNA (double-strand RNA, dsRNA) が配列特異的に mRNA を分解し, 遺伝子発現を 調節する新しいメカニズムが発見された. 21) 現在, 提唱されている RNAi のメカニ ズムを Fig. 1 に示す. 細胞内に導入された dsRNA は, RNase ΙΙΙ ファミリーに属す る Dicer により, 3’ 末端に 2 塩基のオーバーハングをもつ 21 塩基の small interfering RNAs (siRNA) に プ ロ セ ッ シ ン グ さ れ る . そ の 後, siRNA は RISC (RNA-induced silencing complex) と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ, siRNA のアンチセンス鎖がガイドとなって配列特異的に mRNA を分解する. このような RNAi は, 線虫, 昆虫, ショウジョウバエ, 植物, 菌類など多くの生物で 確認されており, 生物種間で保存されている共通の核酸レベルでの防御システムであ ると考えられている. 22) 一方, 哺乳動物細胞では, 30 塩基対以上の長鎖 dsRNA が 細胞内に導入されると, インターフェロン応答として知られる二つの経路が活性化され, -1- 非特異的な翻訳の停止や mRNA の分解により, アポトーシスが誘導される. 23, 24) イ ンターフェロン応答は, 免疫応答の数時間から数日前に働く防御機構であり, ウイルス の侵入, 転写, 翻訳の開始など, ほぼ全てのウイルス増殖のステージに関与している. Fig. 1 に示すように, インターフェロンは dsRNA 依存的プロテインキナーゼ (PKR) と 2’-5’-オリゴアデニル酸合成酵素 (2’-5’AS) を誘導する. PKR は通常不活性型 であるが, dsRNA と結合して活性化され, 翻訳因子 eIF2α をリン酸化する. これによ り eIF2α は, 他の翻訳因子との不活性型複合体を形成し翻訳を阻害する. また, 2’-5’AS は dsRNA により活性化され, 短い 2’-5’AS を合成し, これが 2’-5’AS 依 存的に RNase L を活性化する. 活性化された RNase L は, 非特異的に全ての single strand RNA (ssRNA) を切断する. siRNA (ca. 21-27 mer) siRNA expressing vector dsRNA (30 mer<) Dicer Dicer Interferon Exp-56) PKR1) shRNA5) U6 +1 N21 loop N21 TTTTT elF2α3) siRNA Inhibition of translation Nucleus DNA 2’-5’ AS2) RISC7) RNaseL4) Non-specific degradation Apoptosis AAAAA mRNA AAAAA AAAAA AAAAA mRNA Degradation Cell 1) Protein Kinase R. 2) 2’-5’-Oligoadenylate Synthase. 3) Eukaryotic Initiation Factor 2α. 4) Ribonuclease L 5) short hairpin RNA. 6) Exportin 5. 7) RNA-Induced Silencing Complex. Fig. 1. RNA Interference Model -2- このような非特異的遺伝子発現の抑制効果により, 哺乳動物細胞において dsRNA を用いた RNAi による特異的遺伝子ノックダウンは観察されないものと考えられてい た. 25) しかしながら, 近年, 3’ オーバーハングをもつ 21 mer の化学合成 siRNAs を細胞内にマイクロインジェクションすることにより, インターフェロン応答を惹起するこ となく哺乳動物細胞でも RNAi を誘導することが報告された. 26, 27) その後, RNAi は 分化したヒトなどの哺乳動物細胞にも応用可能な技術として注目されており, ここ数年 RNAi を用いた論文が多数報告されている. さらに 2006 年, RNAi を発見した Fire と Mello はノーベル医学生理学賞を受賞し, 今後ますますこの分野の発展が期 待されている. RNAi による遺伝子発現抑制効果を誘導するには, siRNA そのものを用いる方法と short hairpin RNA (shRNA) 発現プラスミドベクターを用いる方法がある. 前者は, 上 述した機構により, 遺伝子サイレンシングを引き起こす. 一方, 後者は Fig. 1 に示す ように, shRNA 発現ベクターを細胞内にトランスフェクション後, 核内で転写された shRNA が Dicer によって切断され, 産生された siRNA が標的 mRNA を特異的に 切断する. siRNA および shRNA 発現ベクター分子自身は, それぞれ RNA およ び DNA であることから, その物理化学的性質, 酵素安定性および体内動態など多く の点で違いがあるが, shRNA 発現ベクターによる RNAi 機構は複雑であることから, siRNA の方がいち早く医薬品としての開発が進んでいる. siRNA は医薬品として理 想的な性質, すなわち 1) 細胞レベルでの有効濃度がナノモーラーレベルと非常に 低い, 2) 配列特異性が高く, 標的 mRNA だけに作用する, 3) 本来細胞に備わったメ カニズムを利用する, 4) 細胞内で速やかに代謝される (副作用が少ない) 性質を有し ている. このように, siRNA 分子は “低濃度で特異的に標的分子を不活性化し, その 後速やかに分解される” という, 医薬品として極めて望ましい性質を具備していると言 える. 実際, Sirna Therapeutics 社は加齢性黄班変性症を対象とした siRNA 医薬品 (sirna-027) の臨床試験を実施している. また, Alnylam pharmaceuticals 社は呼吸器 合胞体ウイルス (RS ウイルス) 感染の治療薬として噴霧吸入型 RNAi 製剤・ ALN-RSV01 の第 1 相試験を開始している. このように, RNAi が発見されて以 来, わずか十数年で臨床試験が実施されており, siRNA が核酸医薬として製品化 される期待が極めて大きいことが伺える. しかしながら, siRNA による RNAi 法 はその分子基盤が完全ではなく, いくつかの問題点を有している. 特に, 21 mer の -3- siRNA においても, 配列によってはインターフェロン応答やオフターゲット効果を誘導 してしまうこと 28) や siRNA のデリバリー法が確立されていないことは克服すべく最重 要課題である. 前者に関しては, siRNA の設計の際に効率のよいアルゴリズムの構 築 29-32) や siRNA の修飾 33) によって回避できることが報告されている. 後者に関 しては, 未だ解決されてない部分が多く, その原因として siRNA は水溶性の高分子 核酸ポリマーであり, 膜透過性が低いこと, 酵素安定性が極めて低いこと 34, 35) などが 挙げられる. 前述した臨床試験中の siRNA 製剤のほとんどは, 化学合成 siRNA あるいは修飾 siRNA であり, 投与量も多いことから, 副作用の発生が危惧される. し たがって, siRNA を医薬品へ応用するためには, 少ない投与量で効率のよい siRNA デリバリー技術の確立が必要となる. 核酸を細胞に導入するには, ウイルスベクター 法と非ウイルスベクター法が用いられているが, 前者は高い導入効率を示すが, 安全 性に問題がある. 36) そのため, 現在ではより安全性が高く, 汎用性に優れる非ウイル スベクターの応用が強く望まれている. 非ウイルスベクターとして siRNA デリバリーに使用されているものはカチオン性脂 質, 37) カチオン性ポリマー, 38-40) カチオン性ペプチド 41) やタンパク質 42, 43) などが報告 されている. Tables 1, 2 はそれぞれ in vitro および in vivo における siRNA デリバ リーに関する報告例をまとめたものである. 44) siRNA に応用されたキャリアのほとん どはリポプレックス (核酸/脂質キャリア複合体) であり, ポリプレックス (核酸/ポリマー 複合体) の利用は非常に少ない. この理由として, リポソームは構成脂質による機能 性の拡張が比較的容易であることや粒子径が調節しやすいことなどから, 生体内・細 胞内動態を制御可能なキャリアとしての要素を備えているためと考えられる. 45) こ れ ら の中でも Lipofectamine™2000 や Oligofectamine™ 46, 47) は最も汎用されているキャ リアである. 最近, 日本新薬のグループらは, CLZ-42 と Phosphatidylcholine を構成 成分とするカチオン性リポソーム (LIC-101) は, 細胞傷害性が低く, 効率よく siRNA を細胞内に導入できること, 肝臓に転移した癌に対して, siRNA と LIC-101 との複合 体を静脈内投与すると肝臓での増殖を抑制でき, in vivo での siRNA の抗腫瘍活性 の発現に極めて有用であることを報告している. 48) しかしながら, カチオン性脂質が 核酸と複合体を形成する場合, 脂質-核酸間相互作用に加えて, 脂質同士の相互作用 も重要な因子となるため, 特に核酸が高濃度の場合, 不均一な複合体を形成し, 安定 した導入効果が得られにくい, 全身投与系への応用において細胞傷害性や全身的な -4- 免疫反応を惹起する, 49) インターフェロン応答を増悪させる 50) などの欠点を有する. これらのことから, 最近ではリポフェクション法 (リポプレックスによるトランスフェクション 法) に代わって, 合成ポリマーを用いたポリフェクション法 (ポリプレックスによるトラン スフェクション法) が注目を集めている. ポリフェクション法はリポフェクション法に比べて, 1) 均一な複合体を形成する, 2) 遺 伝子導入効率に優れる, 3) 血清の影響を受けにくい, 4) 免疫原性が低いことなどの利 点を有し, 新規遺伝子・siRNA キャリアとしての期待が高まっている. 51-53) 例えば, Kjems らの研究グループはキトサン/siRNA ナノ粒子を調製し, Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) を発現するトランスジェニックマウスにこのナノ粒子を経鼻 投与したところ, 配列特異的な抑制効果が認められたことを報告している. 54, 55) また, Urban-Lkiein らは, Her2 に対する siRNA と Polyethylenimine (PEI) 複合体をマウス 腹腔内に投与すると, siRNA 単独では認められなかった抗腫瘍活性を示すことを報告 している. 56) この他にもタンパク質キャリアとして, 国立がんセンターのグループらは 仔牛の真皮から抽出した I 型コラーゲン中のテロペプチドをペプシンで消化切断した アテロコラーゲン (分子長 300 nm, 分子量 300 kDa) は抗原性が極めて低く, siRNA キャリアとして有用であることを報告している. 42, 43) しかしながら, これらの報告例にお いて, 高濃度のキャリアは細胞傷害性を惹起すること, siRNA の投与量が多いこと (2.5 mg/kg dose), ポリマー/siRNA 複合体は標的指向性を有さないことなどの問題点 を有するため, より安全性・機能性に優れる新規キャリアの開発が望まれている. 環状マルトオリゴ糖であるシクロデキストリン (CyD) は分子内に疎水性の空 洞を有し, 空洞径に応じて種々のゲスト分子を取り込んで包接複合体を形成する ナノキャリアである. 57, 58) また CyD は, 細胞膜上の主に脂質成分と相互作用し て膜構成成分を引き抜き, 高濃度条件下, 赤血球の溶血や粘膜, 皮膚からの難吸 収性薬物およびペプチド・タンパク質の透過性を向上させることが知られている. 59-61) このような超分子的機能を有する CyD を利用すると, ポリアニオン性高 分子である DNA の低い細胞膜透過性を改善可能なことが期待される. 一方, ポリアミドアミンスターバーストデンドリマー (以下, デンドリマーと略称) は, アンモニアあるいはエチレンジアミンをコア分子とし, そのアミノ基にマイケル 付加反応によりアクリル酸およびエチレンジアミンを付加し, この反応を繰り返 すこと (ジェネレーション, G) によって得られる高度に分岐した樹状構造を特徴 -5- とし, その末端に多数の 1 級アミノ基を有する新しいタイプの合成ポリマーで ある. 62, 63) これらデンドリマーは負に帯電した核酸と効率よく静電的相互作用す ることから, 遺伝子やアンチセンス核酸のキャリアとして注目を集めている.64, 65) 我々が開発した α-CyD とデンドリマーとの結合体, α-CDE (α-CyD/dendrimer conjugate) は α-CyD の膜成分との相互作用とデンドリマーのプロトンスポンジ 効果の共作用により, 効率的にエンドソーム膜を破壊可能な非ウイルスベクター である. Fig. 2 は遺伝子導入キャリアとしての α-CDE (G3, Degree of substitution of α-CyD, DS 2.4) の分子設計の最適化の流れをまとめたものである. まず初め に, デンドリマー (G2) に α, β または γ-CyD をそれぞれ 1 分子結合させた α-CDE , β-CDE, γ-CDE (DS 1.1) の遺伝子導入効率を検討したところ, α-CDE が 最も高い遺伝子導入効率を示した. その理由として, エンドサイトーシス経路で 取り込まれた後のエンドソームからの脱出を促進し, より多くのプラスミド DNA (pDNA) を細胞質中へ放出したものと推定された. 66) また, その効果は pDNA と CDE のチャージ比 (CDE/pDNA) 依存的に増大した. 次に, CyD を α-CyD に固定し, デンドリマーのジェネレーションを変えて (G2, G3, G4) その 遺伝子導入効果を検討したところ, G3 の遺伝子導入効率が最も高いことを明ら かにした. 67) さらに, デンドリマー (G3) に固定して α-CyD の置換度 (DS 1.2, 2.4, 5.4) の影響を検討したところ, DS 2.4 体の導入効率が特に優れており, 市販 の遺伝子導入試薬である TransFast™ よりも数倍高い効果を示したことを明らか にした. また, この α-CDE (G3, DS 2.4) による高い遺伝子発現機構の 1 つとし て, 多くの細胞への均一な遺伝子導入の関与が推定された. 68) さらに我々は α-CDE の遺伝子導入効率の増大および細胞特異的な遺伝子導入能の獲得を企図 して, α-CDE のデンドリマー側にマンノース分子を導入した Man-α-CDE を調 製し, 本結合体が核移行性を有し, α-CDE と比較して遺伝子導入効率を改善させ ることを明らかにした. 69) さらに, ラクトース分子を導入した Lac-α-CDE を調 製し, 本結合体がアシアロ糖タンパク質レセプターを介して肝実質細胞特異的に 遺伝子導入できることを報告している. 70) これらの特徴をまとめると, α-CDE は 1) 多くの細胞に均一に遺伝子導入が可能である, 2) エンドソーム膜破壊によ り多くの遺伝子を細胞質中へ放出することができる, 3) 高チャージ比 (carrier /pDNA) においても細胞傷害性が極めて低い (安全性が高い), 4) 糖修飾すること -6- により核移行性や細胞特異性などの更なる機能を付与できるなどの特徴を有し, α-CDE が shRNA 発現ベクターならびに siRNA キャリアとして優れた性質を 有する可能性が考えられた. Table 1. In Vitro siRNA Delivery Systems Delivery system Targets Model Calcium phosphate Co-precipitation Interferon-induced protein kinase (PKR) 21 mer with 2 nt RNA 3’-ends HEK293T 40-200 ng in 2 μL Electroporation Sirtuin type 2 (SIRT2) histone deacetylase 6 (HDAC6) 19 mer HEK293T 3.2 μM Microinjection cdc42 21 mer with dTdT 3’-ends 3T3-L1 adipocytes 5 μM Lipofectamine (Invitrogen) pEGFP-C1 22 mer with 2nt RNA 3’-ends HeLa 40-200 ng in 2 μL Lipofectamine2000 (Invitrogen) Photinus luciferase reporter plasmid (pGL3control and pGL2-control) Renilla luciferase reporter plasmid (pRL-TK) 21 mer with dTdT 3’-ends (GL2, GL3 or RL) or with UU 3’-ends (uGL2) HEK293, NIH3T3, BHK-21, CHO-K1 25 nM Lipofectin (Invitrogen) Integrated-linked kinase (ILK), Calreticulin 23 mer with dTdT 3’-ends HEK-293 50 nM and 100 nM (vs. ILK) or 200 nM (vs. CRT) Dosper (Roche) Photinus luciferase reporter plasmid (pGL3-control) 21 mer with dTdT 3’-ends or with UU 3’-ends. DNA/RNA hybrids HeLa, NTera2D1 1 pM to 10 nM DMRIE-C (Invitrogen) Krupple-like factor 4 (KLF4) 23 mer Colon cancer (HCT116) 2 or 4 μg Oligofectamie (Invitrogen) UDP-galactosegalactose, 1,3-galactosyl transferase (GalTII) 21 mer with dTdT 3’-ends HeLa SS6 600 nM Lamin A/C, Lamin B1, Nuclear mitotic apparatus protein (NuMA), Vimentin 21 mer with dTdT 3’-endsd HeLa 0.84 μg/well TransIT TKO (Mirus) Lamin A/C death effector domain containing DNA binding protein (DEDD) Non specified HeLa 10 nM RNAifect (Qiagen) Complement regulatory protein (CD46) 21 mer with RNA 3’-ends HeLa 1 μg Polyfect (Qiagen) P120RasGAP p130Cas 21 mer with dTdT 3’-ends HeLa 60 nM Superfect (Qiagen) Erbin 21 mer with dTdT 3’-ends PC-2 600 nM Focal adhesion kinase (FAK) 21 mer with dTdT 3’-ends Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PANC1, MIAPaCa2, and BxPC3) 200 nM siPORT Amine Polyamine (Ambion) -7- Cell model Dose Table 2. In Vivo siRNA Delivery Systems Applications Targets Animal Carrier Route Oncology VEGF and VEGFR2 MCF-7 cell, xenograft tumor Polymer Intratumoral VEGF N2A, syngenic tumor Ligand-targeted nanoparticle I.v. injection VEGF PtdCho-3, xenograft tumor Atelocollagen Intratumoral injection Bcl-2 Mouse LIC-101 I.v. injection PLK-1 Liposome Transurethral Raf-1 Cationic cardiolipin liposome Systemic Cationic polymer containing I.v. injection EWS-FLI1 TC71 cell, xenograft tumor cyclodextrin VEGFR2 Mice (HSV induction) Ligand-targeted I.v. subconjunctival TGF-β RII Mice (wound induction) Polymer nanoparticle Subconjunctival Rheumatology TNF-α Mouse Saline, electroporation Intra-articular injection Infection Diseases Influenza A virus C57BL/6 mouse PEI I.v. injection Influenza A virus BALB/c mouse PBS, oligofectamine Intranasal SARS Rhesus monkey DSW Intranasal HBV BALB/c mouse PBS I.v. hydrodynamic injection HBV BALB/c mouse Liposome I.v. injection P2X3 Rat Saline Intrahecal injection GluR2, Cox-1 Mouse Saline, electroporation Intra-hippocampus TNF-α Mouse DOTAP I.p. injection GAPDH Mouse InfaSurf Intranasal administration ApoB C57BL/6 mouse Stabilized Chol-siRNA I v. injection Caspase-8, Caspase-3 C57BL/6 mouse 10% lipiodol High-volume portal vein injection Liposome I.v. injection JetSI + DOPE Intra-cerebroventricular Ophthalmology CNS Others V2R Luciferase Mouse Abbreviations : P2X3, P2X purinoceptor 3; ApoB, apolipoprotein B; PBS, phosphate buffered saline; DOTAP, dioleoyl trimethylammonium このような背景のもと, 本研究では α-CDE (G3, DS 2.4) の shRNA 発現ベク ターならびに siRNA キャリアとしての有用性を明らかにするため, 以下の検討 を行った. 第 1 章では, siRNA キャリアとしての α-CDE の有用性に関する基礎的 な情報を得ることを企図して, pDNA, siRNA, キャリアからなる 3 成分系複合体を用 いて, α-CDE および市販キャリア (Lipofectamine™2000 ; L2, TransFast™ ; TF, Lipofectin™ ; LF) における 3 成分系複合体の物理化学的性質について検討し, 3 成分系複合体のルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果およびその抑制効果に対する siRNA 濃度ならびに α-CDE/pDNA 複合体のチャージ比の影響について検討した. さらに, 各種細胞における α-CDE 複合体と市販のキャリア複合体との遺伝子発現抑 -8- 制効果を比較検討した. また, これら 3 成分系複合体の RNAi 機構の相違を明ら かにするため, 複合体の細胞内取り込みおよび細胞内挙動をフローサイトメトリーおよ び共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した. 第 2 章では, α-CDE が shRNA 発 現ベクター (pSilencer) 用キャリアとして有用か否かを明らかにするため, pSilencer と α-CDE との相互作用ならびにこの複合体の物理化学的性質につい て検討した. 次に, ルシフェラーゼ遺伝子一過性および安定発現細胞を用い, その 遺伝子発現に対する 2 成分系複合体 (α-CDE/pSilencer) の抑制効果について検討 した. さらに, 遺伝子発現抑制効果の増大を企図して pSilencer/siRNA/α-CDE から なる 3 成分系複合体を調製し, その遺伝子発現抑制効果について 2 成分系複合体 の場合と比較検討した. 第 3 章 では, α-CDE が化学合成された siRNA 用キャリ アとしての有用性を明らかにするため, siRNA との相互作用ならびにこれら複合体の 物理化学的性質について検討した. また 2 成分系複合体の遺伝子発現抑制効果を ルシフェラーゼ遺伝子一過性および安定発現細胞を用いて検討し, さらに内因性遺伝 子 (Lamin A/C および Fas) に対する遺伝子発現抑制効果を細胞にて検討した. 次 に, α-CDE からなる 2 成分系複合体の RNAi 効果の機構解明を企図して, 2 成分 系複合体の細胞内取り込みおよび細胞内挙動を解析した. また, 2 成分系複合体の 安全性に関する基礎的知見を得るため, これら複合体の細胞傷害性機構について検 討した. さらに, α-CDE からなる 2 成分系複合体の in vivo での RNAi 効果を検 討するため, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞を移植した担癌マウスを作成し, ル シフェラーゼ遺伝子発現に対する 2 成分系複合体の遺伝子発現抑制効果を検討し た. 以下に本研究で得られた知見を詳述する. なお本研究で対照とした市販の 核酸導入試薬の中で構造が既知の Lipofectin™, TransFast™ の構造式を Fig. 3 に 示す. -9- Cavity Size of CyD Generation of Dendrimer α-CDE/G2 Degree of Substitution of CyD α-CDE/G2 α-CDE (DS 1.1)/G3 β-CDE/G2 α-CDE/G3 α-CDE (DS 2.4)/G3 γ-CDE/G2 α-CDE/G4 α-CDE (DS 5.4)/G3 2 Fig. 2. Molecular Design of CyD/Dendrimer Conjugates as Gene Transfer Carrier O O + H3 N O O P O Dioleolyl phosphatidylethanolamine (DOPE) O O O O CH3 HO HO + O NI O H Cl N+(CH3)3 H H (N-[1-(2, 3-Dioleyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA) H (+)-N, N, [Bis (2-hydroxyethyl)-N-methyl-N-[2, 3-di (tetradecanoyloxy) propyl] ammonium iodide (Cationic lipid component of the TransFast™ reagent) O Lipofectin™ Reagent → DOTMA:DOPE=1:1 (Molar ratio) TransFast™ Reagent → Cationic lipid:DOPE=1:1 (Molar ratio) Fig. 3. Chemical Structures of Lipofectin™ and TransFast™ Used in the Present Study - 10 - 第 1 章 デンドリマー/α-シクロデキストリン結合体 (α-CDE) によ る siRNA の遺伝子発現抑制効果の増大 : 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/α-CDE) による遺伝子発現抑制効果 第 1 節 序 siRNA およびそのキャリアシステムの機能を簡便にかつ短時間に評価する方法 の一つとして, レポーター遺伝子を用いる方法がある. レポーター遺伝子として は酵素系タンパク質を産生するルシフェラーゼ遺伝子 (pGL3 および pGL2 control vector) や蛍光タンパク質を産生する Green Fluorescent Protein (GFP), Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (DsRed) などがあるが, 検出感度や定量性を考慮すると前者 の方が好ましい. このルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターを用いた siRNA およ び shRNA による RNAi 効果の評価に関する報告が多数されている. 例えば, Elbashier ら は , 2 種 類 の ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 (Photinus luciferase reporter plasmid/Renilla luciferase reporter plasmid) をコードする pDNA とPhotinus luciferase reporter plasmid に相補的な siRNA およびキャリアからなる 3 成分系複合体を細 胞内へ導入し, ルシフェラーゼ活性を測定することで RNAi 効果を評価した. 26) また, Smart らはルシフェラーゼ遺伝子の下流に Thymosin β4 (Tβ4) を組み込んだ pDNA を用いて, Tβ4 に対する shRNA の抑制効果をレポーターシステムにより 評価した. 71) 本法は, 誘導した遺伝子発現抑制効果, すなわち RNAi 効果を定量 的に表すことができるため, siRNA およびキャリアシステムの機能性評価の比較 に非常に優れた方法であると言える. そこで本研究では, siRNA キャリアとしての α-CDE の有用性に関する基礎的 知見を得るため, pDNA/siRNA/キャリアからなる 3 成分系複合体を調製し, その RNAi 効果について検討した. Fig. 4 に本実験で用いた 2 種類の pDNA ベク ターマップ (pGL3 control vector, pGL3; pGL2 control vector, pGL2) 並びに siRNA の配列を示す. siGL3 のターゲット部位は pGL3 の 153-174 番目であり, siGL2 のターゲット部位は pGL2 の 154-175 番目である. なお, これら siRNA の塩 基配列は 3 つのミスマッチを有しており, siGL3 および siGL2 による非特異的 な pGL2 および pGL3 の遺伝子発現抑制効果は低いことが知られている. - 11 - 26) Fig. 5 に 3 成分系複合体による遺伝子発現抑制効果の模式図を示す. 3 成分系 複合体を細胞へトランスフェクションすると, pDNA から mRNA が転写される. 一方, 共トランスフェクションされた siRNA は細胞質中に存在する RISC に取 り込まれ, siRNA のアンチセンス鎖がガイドとなり, 標的とする mRNA を分解 することで, ルシフェラーゼタンパク質の発現が抑制される. したがって, 3 成 分系複合体をトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性を指標に, RNAi 効 果の評価を行うことができる. 本章では, まずデンドリマー (G3) および α-CyD の置換度の異なる 3 種類 の α-CDE (DS 1.2, 2.4, 5.4) を用い, RNAi 効果におよぼす α-CDE の置換度の影 響をマウス繊維芽細胞由来細胞株である NIH3T3 細胞を用いて検討した. 次に, α-CDE および市販キャリア (L2, TF, LF) を用いて, 3 成分系複合体の物理化学的 性質について検討した. 次に, 3 成分系複合体のルシフェラーゼ遺伝子発現抑制 効果に対する siRNA 濃度ならびに α-CDE/pDNA 複合体のチャージ比の影響に ついてヒト肺上皮細胞由来細胞株である A549 細胞およびヒト肝癌細胞由来細 胞株である HepG2 細胞において検討し, さらに A549 細胞およびヒト白血球細 胞由来細胞株である K562 細胞における α-CDE 複合体と市販キャリア複合体 との遺伝子発現抑制効果を比較検討した. また, 各キャリア間の RNAi 効果誘 導の機構解明を企図して, 3 成分系複合体の細胞内取り込み, 細胞内挙動をフロ ーサイトメトリーおよび共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した. 以下に得ら れた結果を詳述する. - 12 - Ampr (A) Ampr f1 ori f1 ori ori ori SV40 Promoter SV40 Promoter SV40 Enhancer SV40 Enhancer Luc Luc Firefly Luciferase pGL3 control DNA (5.2 kbp) Firefly Luciferase pGL2 control DNA (6.0 kbp) (B) siRNA sequences siGL3 duplex (153 - 174) Sense, CUU ACG CUG AGU ACU UCG A dTdT Antisense, dTdT GAA UGC GAC UCA UGA AGC U siGL2 duplex (154 - 175) Sense, CGU ACG CGG AAU ACU UCG A dTdT Antisense, dTdT GCA UGC GCC UUA UGA AGC U Fig. 4. Vector Maps of pDNA (A), Sequences of Target mRNAs and siRNAs Duplex (B) The sense (top) and antisense (bottom) sequences of the siRNAs duplex targeting pGL3 and pGL2 luciferase are shown. The siGL2 and siGL3 duplexes differ by only three single-nucleotide substitutions (grey box). - 13 - H) 5 (O H) 5 (O (H (H O) 5 O) 5 : α-CDE H) 5 (O H) 5 (O O) 5 (H O) 5 O) 5 (H (H O) 5 (H (H O) 5 : pDNA H) 5 (O pDNA/siRNA/α-CDE ternary complex : siRNA Cell H) 5 (O (H O) 5 (H O) 5 H) 5 (O H) 5 (O O) 5 (H O) 5 H) 5 (O (H H) 5 (O O) 5 (H O) 5 Endosome (H O) 5 (H O) 5 (H O) 5 (H O) 5 (H O) 5 (H H) 5 (O (H O) 5 H) 5 (O (H (H O) 5 O) 5 H) 5 (O (H O) 5 (H O) (H O) 5 5 Nucleus RISC1) mRNA AAAAA AAAAA AAAAA Degradation Fig. 5. Proposed Scheme of RNAi Effect Induced by pDNA/siRNA/α-CDE Ternary Complex 1) RNA-induced silencing complex. - 14 - 第 2 節 α-CDE の RNAi 効果におよぼす置換度の影響 我々はこれまで 9 種類の CDEs の中で, α-CDE (G3) 系は安全性に優れ, 最も 高い遺伝子導入効果を有すること報告した. 66, 67) 特に α-CDE (G3, DS 2.4) はそ の効果が最も高く, NIH3T3 細胞において, 市販キャリアである TF よりも高い 遺伝子導入効果を有すること, また in vivo においても使用可能なキャリアであ ることを明らかにした. 68) そこでまず, G3 を基盤として, デンドリマー単独 (G3) および α-CyD の置換度が異なる 3 種類の α-CDE (DS 1.2, 2.4, 5.4) を用い て, それらの siRNA キャリアとしての有用性を 3 成分系複合体を用いて比較検 討した. Fig. 6 に示すように, NIH3T3 細胞に 3 成分系複合体 (pGL3/siRNA/キャリ ア) をトランスフェクション 24 時間後におけるルシフェラーゼ活性は, siGL3 を用いた場合, デンドリマー (G3), α-CDE (DS 1.2) および α-CDE (DS 2.4) 複合 体はコントロールの約 20-30 % まで抑制したが, siGL2 を用いた場合には活性値 の低下は見られなかった. また, siGL3 を用いた場合のルシフェラーゼ活性値は, 本実験で用いたキャリア間で有意差は認められなかった. 一方, α-CDE (DS 5.4) 複合体においては siGL3 による抑制効果は観察されたものの, siGL2 を用いた場 合にも活性値の低下が認められ, 配列特異性は見られなかった. 次に, FITC-labeled siRNA (FITC-siGL3) を用いて, 各種キャリアからなる 3 成分系複合 体中の siRNA の導入効率を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した (Fig. 7). その 結果, FITC-siGL3 の蛍光強度は α-CDE (DS 2.4) および α-CDE (DS 5.4) 複合体 で最も強く観察された. これらのことから, α-CDE (DS 2.4, 5.4) 複合体はより多 くの siRNA を細胞内に導入可能なことが示唆された. キャリア/核酸複合体の細胞傷害性は siRNA の配列特異的な RNAi 効果の発 現に多大な悪影響を与える. そこで次に, 各種キャリアからなる 3 成分系複合 体の細胞傷害性を簡便に予測可能な方法である WST-1 法により評価した. な お, WST-1 法は MTT アッセイ 72) における色素抽出操作の煩雑さを解消した改 良法である. 73) Fig. 8 に示すように, デンドリマー (G3), α-CDE (DS 1.2) および α-CDE (DS 2.4) 複合体では細胞傷害性は観察されなかったが, α-CDE (DS 5.4) 複 合体において若干ながら細胞傷害性が観察された. - 15 - これらの結果から, α-CDE (DS 5.4) で見られた非特異的な遺伝子発現抑制効果は細胞傷害性によるものと推 察された. 以上のことから, 4 種のキャリアの中で, α-CDE (DS 2.4) からなる 3 成分系複 合体は安全性に優れ, 高い遺伝子発現抑制効果を有し, 多くの siRNA を細胞内 に導入可能なキャリアであることが示唆された. したがって, 以下の実験では α-CDE (DS 2.4) を用いて検討した. なお, 以後 α-CDE (DS 2.4) を α-CDE と略 称する. - 16 - (A) 120 100 80 60 *† pG L3 /d er 120 100 80 60 0 pG L pG 3/s iG iG L3 L2 /de /de nd nd rim rim er er 100 80 60 *† 20 pG pG L3 L3 L3 /α / /si siG -C GL DE L2 3/α /α (D -C C S D DE 1.2 E (D (D ) S S 1. 2 1. 2 ) ) α-CDE (DS 5.4) (D) 120 40 *† 40 20 α-CDE (DS 2.4) (C) Luciferase activity (%) en dr im pG L3 /s Luciferase activity (%) 0 140 Luciferase activity (%) Luciferase activity (%) 140 40 20 α-CDE (DS 1.2) (B) dendrimer (G3) 120 100 0 80 60 40 * 20 0 pG L 3/α -C DE pG L3 /s (D S pG L iG pG 3/s iG L L2 3/α /α -C -C DE DE 2.4 (D (D ) S S 2.4 2. 4 ) ) pG pG L3 L3 L3 /α /si / s -C iG GL DE L2 3/α /α (D -C -C S DE DE 5.4 (D (D ) S S 5. 4 5.4 ) ) Fig. 6. Inhibitory Effects of Ternary Complexes of pGL3/siRNA/Carriers on Luciferase Activity in NIH3T3 Cells Luciferase activity in cell lysate was determined 24 h after transfection with ternary complexes. The charge ratio of carrier/pGL3 was 100/1. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. - 17 - α-CDE (G3) (A) dendrimer (G3) (B) DS 1.2 (C) DS 2.4 (D) DS 5.4 CLSM DIC X 400 Fig. 7. Comparison of Intracellular Distribution of FITC-siGL3 in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes of pGL3/FITC-siGL3/Carriers The cells were transfected with ternary complexes for 1 h. After washed twice with PBS, the cells were fixed with methanol for 5 min at 4˚C, and then were scanned with a CLSM. The charge ratio of carrier/pGL3 was 100/1. The amounts of pGL3 and FITC-siGL3 were 2 μg and 0.7 μg, respectively. These figures show representative data for three experiments. 120 Cell viability (%) 100 * 80 60 40 20 0 er rim nd 3) de (G l ro nt Co DS 1.2 DS 2.4 DS 5.4 α-CDE (G3) Fig. 8. Cytotoxicity of the Ternary Complexes of pDNA/siRNA/Carriers in NIH3T3 Cells The cells were transfected with ternary complexes for 24 h, and then washed with HBSS at twice. Cell viability was assayed by the WST-1 method. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratio of α-CDE/pGL3 was 100/1. Each points represents the mean ±S.E. of 6 experiments. *p<0.05, compared with control. - 18 - 第 3 節 3 成分系複合体の物理化学的性質 一般に遺伝子および siRNA 導入実験では, キャリア/核酸の 2 成分系複合体 が用いられる. しかしながら, 本実験ではキャリア, pDNA および siRNA から なる 3 成分系複合体を用いているため, キャリアと核酸との相互作用は 2 成分 系複合体と異なるものと予想される. そこで 3 成分系複合体の基礎的物性評価 として, これら複合体の物理化学的性質をアガロースゲル電気泳動, 粒子径およ び ζ-電位を測定することにより評価した. 第 1 項 アガロースゲル電気泳動 初めに, キャリアと核酸との相互作用をアガロースゲル電気泳動法にて検討し た. 実 験 は , pDNA お よ び siRNA の 混 合 溶 液 に , 種 々 の チ ャ ー ジ 比 (α-CDE/pDNA) の α-CDE を添加, 攪拌し, 室温で 15 分間インキュベートした サンプル溶液を EtBr 含有の 2% アガロースゲルにて電気泳動を行った. Fig. 9A に示すように, キャリアとして α-CDE を用いた場合, pDNA とのチャ ージ比 1/1 以上で pDNA および siRNA のバンドが消失した. このことから, α-CDE は pDNA および siRNA と静電的な相互作用により, 複合体を形成し, チャージ比 1/1 以上で電荷が正に傾くことが示唆された. Fig. 9B は, 市販キャリアと pDNA および siRNA との相互作用を α-CDE を 用いた場合と比較検討した結果を示す. 本実験では, 推奨プロトコールに準じて 調製したときの各種キャリアと pDNA のチャージ比および容量/質量比における 相互作用を想定し, チャージ比はそれぞれ, α-CDE/pDNA : 100/1, TF/pDNA : 1/1, LF/pDNA : 1/1 および容量/質量比 L2/pDNA : 1/1 で添加した. なお, L2 の試薬 組成は明らかでないため, チャージ比の算出は困難であり, 容量/質量比で表した. α-CDE を用いた場合, pDNA および siRNA に由来するバンドは消失した. 一 方, L2 および TF 系において, siRNA に由来するバンドは消失していたが, pDNA のバンドは観察された. LF においては, pDNA および siRNA の両バン ドが観察された. これらのことから, 3 成分混合系において α-CDE は pDNA および siRNA 両分子と複合体を形成することが示唆された. - 19 - siRNA は RNase や血清アルブミンと結合することにより速やかに分解するこ とが知られている. 34) そこで次に 3 成分系複合体中の siRNA の酵素安定性に ついて検討した (Fig. 9C). 50% FCS 存在下, チャージ比 1/1 (α-CDE/pDNA) に おいて siRNA 由来のバンドが消失したが, チャージ比が増大するにつれて, siRNA 由来のバンドの消失は抑制された. 一方, 市販のキャリアを Fig. 9B で 示した条件で複合体を形成した場合, siRNA 由来のバンドが消失した. これらの ことから, α-CDE は pDNA および siRNA と安定な複合体を形成し, 血清に存 在する RNase から siRNA の分解を抑制することが示唆された. - 20 - (A) Charge ratio (α-CDE/pDNA) 0.1 1.0 0.5 1.5 2.0 5.0 pDNA → siRNA → (B) ol ntr o C α -C DE L2 LF TF pDNA → siRNA → (C) o al si ne A RN D p N iR s + NA A Charge ratio (α-CDE/pDNA) 1 2 10 20 50 10 0 L2 TF LF Fig. 9. Agarose Gel Electrophoretic Analysis of Ternary Complexes of pGL3/siGL3/Carriers (A) Effects of Charge Ratio on the Electrophoretic Mobility of pGL3 and siGL3 (B) Effects of Carriers on Electrophoretic Mobility of pGL3 and siGL3 (C) Stability of siRNA in Ternary Complexes of pGL3/siGL3/Carriers after Treated with 50% FCS for 5 h at 37˚C The amounts of pGL3 and siRNA were 0.5 μg and 0.175 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. - 21 - 第 2 項 3 成分系複合体の粒子径および ζ-電位 前項において, α-CDE と市販キャリアの核酸 (pDNA および siRNA) に対す る相互作用様式は異なることが明らかとなった. したがって, 本項では相互作用 様式の違いによる 3 成分系複合体の粒子径ならびに ζ-電位を測定した (Table 3). 複合体の粒子径は L2<α-CDE<LF<TF の順に増大し, α-CDE 複合体は平均約 140 nm の粒子径を与えた. 一方, キャリア単独および α-CDE 複合体の ζ-電位 は正の値を示すものの, 市販のキャリア複合体の ζ-電位は負の値を示した. こ れらのことから, α-CDE 複合体の物理化学的性質は市販キャリア複合体の場合と 異なることが示唆された. Table 3. Particle Sizes and ζ-Potentials of Ternary Complexes of pGL3/siRNA/Carriers in Tris-HCl Buffer (10 mM, pH 7.4) ζ-potential (mV) Carrier Particle size (nm) Carrier alone Ternary system α-CDE 136 ± 4.6 27.7 ± 0.6 36.1 ± 0.5 L2 110 ± 1.7 36.9 ± 5.1 -40.9 ± 2.0* TF 428 ± 14.6* 32.7 ± 3.7 -61.1 ± 4.1* LF 210 ± 22.2* 27.0 ± 1.4 -54.3 ± 2.4* Particle size and ζ-potential of ternary complexes were measured by Zetasizer nano. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. Each value represents the mean ± S.E. of 3 experiments. *p<0.05, compared with α-CDE system. 第 4 節 3 成分系複合体によるルシフェラーゼ遺伝子発現抑制効果 前節までの検討において, pDNA および siRNA との相互作用様式は各キャリ アにより異なることが示された. そこで本節では, 3 成分系複合体をトランスフ ェクション後の RNAi 効果に及ぼす各種キャリアの影響を検討した. - 22 - 第 1 項 siRNA 配列の影響 まず初めに, pGL3 と pGL2, ならびにそれぞれに対応する 2 種類の siRNA (siGL3 および siGL2) を用いて, siRNA の RNAi 効果に及ぼす 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/α-CDE) の影響について検討した. なお, siGL3 と siGL2 の塩基 配列は 3 つのミスマッチを有しているため, これら siRNA はそれぞれ pGL3 および pGL2 に対してのみ RNAi 効果を示す. 26, 74) pGL3 control vector を用いた系において, siGL3 はコントロールに対して遺伝 子発現を約 16% まで抑制した (Fig. 10A). しかしながら, siGL2 による抑制効 果は観察されなかった. 同様に pGL2 control vector を用いた系においても, siGL2 のみで特異的な遺伝子発現抑制効果が観察された (Fig. 10B). これらの結 果から, α-CDE からなる 3 成分系複合体はそれぞれの標的 mRNA に対して siRNA の配列依存的な遺伝子発現抑制効果を誘導することが示唆された. (A) (B) X 105 2 Luciferase activity (RLU/μg protein) Luciferase activity (RLU/μg protein) X 107 3 2 1 *† 0 pG L 3/ α pG -C DE L3 /s iG L pG 2/ αC 1 0 L3 /s iG DE L3 /α -C DE *‡ pG L2 /α -C pG DE L2 /s iG pG L2 /α -C L2 /s iG L DE 3/ αC DE Fig. 10. Sequence-specific Gene-silencing Effect on Luciferase Activity in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes of pGL3/siRNA/α-CDE (A) and pGL2/siRNA/αCDE (B) Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratio of α-CDE/pGL3 was 100/1. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. ‡p<0.05, compared with siGL3. - 23 - 第 2 項 siRNA 濃度の影響 siRNA による遺伝子発現抑制効果は細胞内に存在している内在性機構を利用 しているため, その効果に濃度勾配依存性が見られる. 75) そこで, siRNA 濃度上 昇に伴う遺伝子発現抑制効果に対する α-CDE を含む 3 成分系複合体の影響に ついて検討した. Fig. 11 にその結果を示す. 低濃度 (0.05 ~ 0.2 μg) の siRNA の遺伝子発現抑制効果は低いものの, 濃度が上昇するにつれてその抑制効果は増 大し, 0.5 μg 以上でプラトーを示した. また, いずれの濃度においても siGL2 による抑制効果は観察されず, siGL3 の配列特異的な抑制効果のみが観察された. これらのことから, α-CDE 複合体は siRNA の濃度依存的な遺伝子発現抑制効果 を誘導することが示唆された. siRNA による RNAi 効果は細胞によって異なることが知られている. そこで 次に, α-CDE を含む 3 成分系複合体を用いて, A549 および HepG2 細胞を用い て, siRNA 濃度に対する抑制効果を検討した (Fig. 12). siRNA による遺伝子発 現抑制効果は, siRNA の高用量において抑制効果の頭打ちやバラツキを示すもの の siRNA 濃度依存的なことが示唆された. これらのことから, α-CDE 複合体は 種々の細胞において, siRNA 濃度依存的に遺伝子発現抑制効果を示すことが示唆 された. - 24 - Luciferase activity (%) 150 100 * * * * 50 * * * * * 0 0 0.5 1 Amount of siRNA (μg) Fig. 11. Effects of siRNA Concentration on RNAi Effects of Ternary Complexes of pGL3/siRNA/α-CDE in NIH3T3 Cells : pGL3/siGL3/α-CDE, : with pGL3/siGL2/α-CDE. Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amount of pGL3 was 2 μg. The charge ratio of α-CDE/pGL3 was 100/1. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with siGL2. (A) A549 (B) HepG2 100 Inhibitory effect of siGL3 (%) Inhibitory effect of siGL3 (%) 100 50 50 0 0 0 0.5 1.0 Amount of siGL3 (μg) 0 0.5 Amount of siGL3 (μg) 1.0 Fig. 12. Relationship Between siRNA Concentration and Inhibitory Effects of siGL3 in A549 (A) and HepG2 (B) Cells Transfected with Ternary Complexes of pGL3/siGL3/α-CDE Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amount of pGL3 was 2 μg. The charge ratio of α-CDE/pGL3 was 100/1. Each point represents the mean ± S.E. of 3-4 experiments. - 25 - 第 3 項 3 成分系複合体のチャージ比の影響 我 々 は 先 に , α-CDE の 遺 伝 子 導 入 効 果 は , pDNA と の チ ャ ー ジ 比 (α-CDE/pDNA) が上昇 (1/1 → 200/1) するにつれて増大し, その効果に pDNA と複合体を形成していない遊離の α-CDE が関与することを報告した. 66, 68) 本 実験で用いた 3 成分系複合体においても, 遺伝子・siRNA の導入効率は α-CDE の添加量によって変化することが予想される. そこで本項では, pDNA および siRNA 量は一定にし, α-CDE の添加量を変化させたときの遺伝子発現抑制効果 について検討した. なお, ここで用いたチャージ比とは pDNA に対する α-CDE のチャージ比であり, siRNA の添加量は 0.7 μg に固定した. Fig. 13A に示すように, 遺伝子発現量はチャージ比 (α-CDE/pGL3) が上昇する につれて増大し, それに伴い遺伝子発現抑制効果も増大した. 一方, 遺伝子発現 抑制効果は, 各チャージ比において, 遺伝子発現量が異なるため, ルシフェラー ゼ活性値から直接比較するのが困難であった. そこで, α-CDE/pGL3 複合体の遺 伝子発現量で 3 成分系複合体の遺伝子発現量を除した値を遺伝子発現抑制率と し比較検討した. Fig. 13B に示すようにチャージ比 10/1 の場合には約 25% の 抑制率であったが, チャージ比 50/1 から 100/1 では約 75% の抑制率を示し, それ以上のチャージ比では抑制率はわずかに低下した. これらのことから, siRNA による遺伝子発現抑制効果は pGL3 複合体のチャージ比に依存し, その 効果に至適値が存在することが示唆された. したがって, 以下の実験では, 遺 伝子・siRNA の導入効率が最適な α-CDE/pDNA のチャージ比 100/1 を用いた. - 26 - (A) (B) 100 x 107 1 * Inhibition (%) Luciferase activity (RLU/μg protein) 2 * * 75 50 25 * * * 0 0 50 100 0 150 0 200 Charge ratio (α-CDE/pGL3) 50 100 150 200 Charge ratio (α-CDE/pGL3) Fig. 13. Effects of Charge Ratio (α-CDE/pGL3) on Luciferase Activity in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes of pGL3/siGL3/α-CDE : pGL3/α-CDE , : pGL3/siGL3/α-CDE. Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amounts of pGL3 and siRNA were 2.0 μg and 0.7 μg, respectively. Each point represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. 第 5 節 α-CDE と市販キャリアとの siRNA の遺伝子発現抑制効果の比較 緒言でも述べたように, 現在使用されている siRNA キャリアの大部分はカチ オン性リポソームであり, 特に L2 はその導入効率の高さから最も汎用されてい る. 76) そこで本節では, α-CDE からなる 3 成分系複合体の遺伝子発現抑制効果 を市販キャリアである L2, TF 77) および LF の場合と比較検討した. なお, 市 販キャリア複合体のトランスフェクション条件は試薬メーカーの推奨プロトコー ルに準じて設定した. Figs. 14A-D に pGL3 control vector を用いた場合の結果を 示す. α-CDE では, siGL3 による特異的な抑制効果が観察された (Fig. 14A). それに対し L2 複合体では, siGL3 による抑制効果は高いものの, コントロール に用いた siGL2 でバラツキが大きく, 配列特異的な抑制効果は観察されなかっ た (Fig. 14B). TF 複合体では, siGL3 による抑制効果ならびに siGL2 による非 特異的な抑制効果が観察された (Fig. 14C). LF 複合体においては, コントロー - 27 - ルにおける遺伝子導入効果にバラツキが見られ, siRNA による配列特異的な抑制 効果は観察されなかった (Fig. 14D). ここで pGL3/キャリア複合体をトランス フェクション後のルシフェラーゼ遺伝子の発現量 (コントロール値) はキャリア の種類によって異なるため, ルシフェラーゼ活性の絶対値からキャリア間での RNAi 効果を比較するのは困難であった. そこで siGL3 複合体系のルシフェラ ーゼ活性の変動係数 CV (coefficient of variation) および siGL2 複合体系に対する siGL3 複合体系のルシフェラーゼ活性の比 (siGL3/siGL2) を算出し, それぞれキ ャリア間のバラツキおよび siRNA の配列特異性について比較した (Figs. 15, 16). α-CDE 複合体の場合, CV 値は最も小さく, siGL3/siGL2 比の値は最も高い値を 示したのに対し, 市販のキャリアでは, CV 値および siGL3/siGL2 比の値は α-CDE 複合体の場合に比べてそれぞれ大きな値および小さな値を示した. 一方, siRNA/キャリア複合体をトランスフェクション後の RNAi 効果は細胞種により 異なることが知られているが, 本検討で用いた A549 および K562 細胞におい ても α-CDE 複合体は優れた RNAi 効果が観察された (Fig. 17). これらのこと から, α-CDE 複合体は, 他のキャリア複合体に比べて siRNA 配列特異性に優れ, かつ安定な遺伝子発現抑制効果を示すことが示唆された. - 28 - α-CDE Luciferase activity (RLU/μg protein) Luciferase activity (RLU/μg protein) 2 1 *† L3 /α - pG C D (D) L3 pG /s E iG L2 L3 /s i G /α -C D L3 E /α -C D Luciferase activity (RLU/μg protein) † L3 /L pG 2 L3 pG /s iG L2 L3 † 5 *† 0 p G /s /L 2 iG L3 /L 2 L3 /T F pG L3 pG /s iG L2 L3 /s /T F iG L3 /T F E LF X 105 8 Fig. 14. Comparison of RNAi Effects Among Various 4 0 p G X 106 10 2.5 0 p G TF (C) X 106 5 X 107 3 0 p G L2 (B) Luciferase activity (RLU/μg protein) (A) L3 / pG LF pG L3 L3 /s /s iG iG L3 L2 /L /L F F Carriers in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes with pGL3/siGL3/Carriers Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. - 29 - α-CDE L2 TF * LF 0 10 20 30 40 50 60 70 Coefficient of variation (%) Fig. 15. Comparison of Variation of RNAi Effects of siGL3 Among Various Carriers in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes with pGL3/siGL3/Carriers Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. The coefficient of variation (CV) stands for the variability of the RNAi effect. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with α-CDE system. α-CDE * L2 * TF * LF 0 5 10 15 20 Ratio (siGL3/siGL2) Fig. 16. Comparison of Sequence-specific RNAi Effects of siGL3 Among Various Carriers in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes with pGL3/siGL3/Carriers Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. The inhibition ratio (siGL3/siGL2) stands for the inhibitory effect of the siGL3 system to that of the siGL2 system. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with α-CDE system. - 30 - * NIH3T3 * * * A549 * * * K562 * 0 5 10 15 20 Ratio (siGL3/siGL2) Fig. 17. Sequence-specific RNAi Effects of Ternary Complexes of pGL3/siRNA/Carriers on Luciferase Activity in Various Cells : α-CDE system, : L2 system, : TF system, : LF system. Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after incubation with ternary complexes. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with α-CDE system. 第 6 節 3 成分系複合体の細胞傷害性およびオフターゲット効果 第 2 節において述べたように, キャリア/核酸複合体による細胞傷害性は siRNA による配列特異的な RNAi 効果の発現に悪影響を与える. 特に, L2 は高 い遺伝子・siRNA 導入効率を有するものの, それに伴う細胞傷害性を惹起するこ とが報告されている. 78) さらに 3 成分系複合体の物理化学的性質はキャリア間 で異なることから, これら複合体の細胞傷害性に違いが生じることも考えられる. そこで本節では, 3 成分系複合体による細胞傷害性を WST-1 法により評価した. Fig. 18A から明らかなように, α-CDE からなる 3 成分系複合体は細胞傷害性 を全く示さなかった. 一方, 市販キャリアである TF 複合体を用いた場合, 推奨 プロトコールに準じてトランスフェクションを行ったにもかかわらず, 細胞傷害 性が観察され, L2 および LF 複合体でも有意差はないものの細胞生存率の低下 - 31 - が認められた (Fig. 18A). siRNA は微量で標的とする遺伝子の発現を抑制できるが, 緒言で述べたように 30 塩基対以上の長鎖の二本鎖 RNA がアポトーシス関連遺伝子や 2’-5’ AS を含 むインターフェロン応答に関連する遺伝子の発現を誘導し, 非特異的に mRNA の分解を惹起し, 結果としてアポトーシスを誘導することが報告されている. 23) 22, さらに近年 30 塩基対以下の siRNA においても配列特異的にインターフェ ロン応答を引き起こすことが報告されている. 28) 最近では, siRNA によるイン ターフェロン応答やオフターゲット効果は, 1) siRNA 濃度, と類似した配列, (UGUGU 84) 80-82) 3) センス鎖の RISC への取り込み, や UGGC 83) 79) 2) 標的 mRNA 4) 特定のモチーフ 85) ) 含む配列, 5) リポソーム系のキャリアを用いた場合な どが原因で誘導されることも報告されている. そこで次に, 3 成分系複合体をト ランスフェクション後のインターフェロン応答に関与するインターフェロン β (IFN-β) および腫瘍壊死因子-α (TNF-α) mRNA の発現誘導を RT-PCR にて検討 した. Fig. 18B に示すように各種キャリア複合体による IFN-β および TNF-α mRNA に由来するバンドは観察されなかったことから, これら複合体によるイ ンターフェロン応答は誘導されないことが確認された. 以上の結果から, α-CDE 複合体の細胞傷害性は市販キャリア複合体に比べて極めて低く, また市販キャリ ア複合体を用いた場合の細胞傷害性は, インターフェロン応答によるものではな くキャリア自身の毒性であることが示唆された. - 32 - (A) (B) LF * TF 80 αCD E Cell viability (%) 100 L2 120 IFN-β 60 40 TNF-α 20 β-actin 0 α-CDE L2 TF LF Fig. 18. (A) Cytotoxicity of Ternary Complexes of pGL3/siGL3/Carriers in NIH3T3 Cells Cells were transfected with ternary complexes for 24 h. The cell viability was assayed by the WST-1 method. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. Each point represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with α-CDE system. (B) Effects of Ternary Complexes of pGL3/siGL3/Carriers on IFN-β and TNF-α mRNA Levels in NIH3T3 Cells Cells were transfected with ternary complexes for 24 h. IFN-β and TNF-a mRNAs in the cells were determined by semiquantitative RT-PCR. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. These figures show representative data for three experiments. 第 7 節 3 成分系複合体における FITC-labeled siRNA の細胞内分布 これまでの検討から 3 成分系複合体において α-CDE を用いた場合, その RNAi 効果は市販のキャリアと比較して配列特異性に優れ, かつ安定した RNAi 効果を示すこと, また細胞傷害性も極めて小さいことを明らかにした. そこで次 にこれらキャリア間の RNAi 効果の相違を明らかにするために, FITC-labeled siRNA (FITC-siGL3) を用い, pGL3/FITC-siGL3/キャリアからなる 3 成分系複合体 を NIH3T3 細胞にトランスフェクション 1 時間後の FITC-siGL3 の細胞内取り 込みおよび細胞内挙動をそれぞれフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー顕 微鏡にて解析した. なお, FITC は siRNA の 5’ 末端センス鎖に修飾したもので あり, siRNA の RISC への取り込み, RNAi 効果に影響を与えないことが報告さ れている. 86) - 33 - 第 1 項 FITC-labeled siRNA の細胞内取り込み Fig. 19 は 3 成分系複合体を細胞へトランスフェクション 1 時間後の細胞内 取り込みをフローサイトメトリーにより解析した結果を示す. キャリア非添加 時の pGL3/FITC-siGL3 混合体では FITC-siGL3 の細胞内への取り込みは観察さ れなかったが, その系にキャリアを添加した 3 成分系複合体は FITC-siGL3 の 蛍光ピークが右へシフトしたことから, 細胞内への FITC-siGL3 の取り込みが確 認された. TF を含む 3 成分系複合体を用いた場合, FITC-siGL3 の蛍光ピーク が最も右へシフトしたことから, FITC-siGL3 の取り込み量が多いことが示唆され た. 一方, α-CDE 複合体を用いた場合, FITC-siGL3 の細胞内取り込み量は LF 複合体よりも多く L2 複合体とほぼ同等であった. : Cell alone : pGL3/FITC-siGL3 : pGL3/FITC-siGL3/α-CDE : pGL3/FITC-siGL3/L2 : pGL3/FITC-siGL3/TF : pGL3/FITC-siGL3/LF 150 Counts 100 50 0 100 101 102 103 104 FITC-siRNA Fig. 19. Cellular Uptake of Ternary Complexes of pGL3/FITC-siGL3/Carriers in NIH3T3 Cells after Transfection After transfection for 1 h, the cells were washed with PBS twice and immediately scraped with 1 mL of PBS. The cells were collected and filtered through nylon mesh. Data were collected for 1 x 104 cells on a FACSCalibur flow cytometer using CellQuest software. The amounts of pGL3 and siRNA were 2.0 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. These figures show representative data for three experiments. - 34 - 第 2 項 FITC-labeled siRNA の細胞内分布 siRNA の細胞内分布は, RNAi 効果の強さを左右する重要な因子である. Chiu らは膜透過ペプチドである Tat と siRNA の結合体を調製し, その細胞内 挙動を観察したところ, Tat-siRNA 結合体は核へ移行しないことを報告している. 87) しかしながら, 本研究で用いたキャリアを成分とする 3 成分系複合体をト ランスフェクション後の siRNA の細胞内挙動の違いの詳細は不明である. そ こで次に, pDNA/FITC-siGL3/TRITC-α-CDE からなる 3 成分系複合体の細胞内 挙動を共焦点レーザー顕微鏡にて観察するとともに, 各種キャリア間における FITF-siGL3 の細胞内挙動の違いを比較検討した. なお, TRITC-α-CDE は α-CDE 分子中のデンドリマー部分に 1 分子の TRITC を共有結合させた分子 である. 3 成分系複合体をトランスフェクション 1 時間後において, FITC-siGL3 およ び TRITC-α-CDE は細胞質に散在していた (Fig. 20A) . 次に, 市販のキャリア を用いた場合の FITC-siGL3 の細胞内挙動を比較検討したところ, FITC-siGL3 の蛍光強度は TF 複合体で最も強く観察され, これは先のフローサイトメトリ ー の 結 果 と よ く 一 致 し た (Fig. 19). α-CDE を 用 い た 場 合 , 細 胞 全 体 に FITC-siGL3 の分布が確認され, FITC-siGL3 は細胞質へ散在する傾向が観察され た (Fig. 20B). 一方, L2 および TF 複合体において, FITC-siGL3 は局所的に 強い蛍光 (ドット状) が核内および細胞質にて観察された (Fig. 20B). LF 複合 体においては, FITC-siGL3 の蛍光強度は弱く, siRNA の導入効率が低いものと 推察された (Fig. 20B). RNAi 効果の発現を担う RISC は細胞質に局在するこ とが報告されている. 88, 89) これらことから, α-CDE 複合体による優れた RNAi 効果は, siRNA の高い導入効率に加え, siRNA を細胞質に局在させ RISC への 取り込みを増大させたためと推察される. - 35 - (A) FITC-siRNA TRITC-α-CDE Merge DIC X 630 (B) α-CDE L2 TF LF X 630 Fig. 20. (A) Intracellular Distribution of FITC-siGL3 and TRITC-α-CDE in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes of pGL3/FITC-siGL3/TRITC-α-CDE The cells were transfected with ternary complexes for 1 h. After washed twice with PBS, the cells were fixed with methanol for 5 min at 4˚C, and then were scanned with a CLSM. The amounts of pGL3 and siRNA were 2 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratio of α-CDE/pGL3 was 100/1. (B) Comparison of Intracellular Distribution of FITC-siGL3 in NIH3T3 Cells Transfected with Ternary Complexes of pGL3/FITC-siGL3/Carriers The cells were transfected with ternary complexes for 1 h. After washed twice with PBS, the cells were fixed with methanol for 5 min at 4˚C, and then were scanned with a CLSM. The amount of pGL3 and siRNA were 2.0 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratios of α-CDE/pGL3, TF/pGL3 and LF/pGL3 were 100/1, 1/1 and 1/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/pGL3 was 1/1. These figures show representative data for three experiments. - 36 - 第 8 節 考察 本章では, siRNA キャリアとしての α-CDE の有用性に関する基礎的知見を得 るため, 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/carrier) を用いて RNAi 効果を評価し, さ らに市販のキャリア複合体と比較検討した. また, 各種キャリア複合体における RNAi 効果の相違を明らかにするため, これら 3 成分系複合体の物理化学的性 質ならびに細胞内挙動を検討した. まず, ルシフェラーゼ遺伝子をコードする pDNA (pGL3, pGL2) とそれに対応 する siRNA (siGL3, siGL2) 並びにキャリアからなる 3 成分系複合体を用いて評 価した. この方法は, 非常に簡便で短時間で解析できること, ルシフェラーゼ遺 伝子をレポーターに使用することにより誘導した RNAi 活性を数値化して表す ことができるため, 設計した siRNA のスクリーニングやキャリアシステムの評 価法として非常に優れた方法であり, 遺伝子発現抑制効果を評価する方法として 広範に使用されている. 26, 71, 90-92) そこで本研究では, この評価法を用いて, α-CDE および市販キャリアからなる 3 成分系複合体の遺伝子発現抑制効果を比較検討 した. 3 成分系複合体の遺伝子発現抑制効果はキャリア間で異なり, α-CDE 複合体は siGL3 を用いた場合, ルシフェラーゼ活性値のバラツキは小さく, 配列特異的な RNAi 効果を誘導した (Figs. 14-17). 一方, 市販キャリアである TF 複合体では, α-CDE 複合体よりも高い RNAi 効果を示したが, siGL2 による非特異的な抑制 効果も観察された. さらに L2 および LF 複合体では, ルシフェラーゼ活性値の バラツキが大きく, 配列特異的な遺伝子発現抑制効果は観察されなかった (Figs. 14-16). これらキャリア間による RNAi 効果の違いは, 1) α-CDE と市販キャリ アの核酸に対する相互作用様式, 2) 3 成分系複合体を細胞内に導入後の siRNA の細胞内分布, 3) 3 成分系複合体の細胞傷害性が関与するものと考えられた. そこでまず, α-CDE と市販キャリアの核酸 (pDNA および siRNA) に対する 相互作用様式の違いを明らかにするため, アガロースゲル電気泳動を行った. α-CDE はチャージ比 (pDNA/α-CDE) 1.5/1 以上で複合体の電荷が正に傾いた (Fig. 9A). このチャージ比 1.5/1 において α-CDE は理論上 pDNA 1 分子に対 して約 580 倍存在すると求められる. したがって, チャージ比 1.5/1 で核酸由 - 37 - 来のバンドが消失したのは, pDNA と相互作用していない遊離の α-CDE が 3 成分混合系中に存在する siRNA と相互作用したためと考えられる. 一方, 市販 キャリアにおける核酸との複合体の形成能は α-CDE に比べ弱く, チャージ比お よび容量/質量比 1/1 において複合体を形成していない遊離の pDNA および siRNA に由来するバンドが観察された (Fig. 9B). Elbashir らは脂質系キャリア を用いて pDNA および siRNA と複合体を形成する場合, これら核酸同士によ る競合阻害が起き, 脂質キャリアとの複合体がうまく形成されないことを報告し ている. 26) 加えて, 脂質系キャリアは核酸との相互作用に加えて, 脂質同士の相 互作用も複合体形成に影響することから, これら 3 成分混合系において, 不均一 な複合体が形成されたものと推察される. 実際, これら複合体の ζ-電位を測定 したところ, キャリア単独ならびに α-CDE 複合体の ζ-電位は正の値を示した のに対して, 市販キャリア複合体ではいずれも負の値を示した (Table 3). また, 3 成分系複合体の粒子径は, α-CDE および L2 複合体では約 110 ~ 140 nm の小 さな粒子を形成したのに対して, TF 複合体では最も大きな粒子径 (約 430 nm) が観察された. したがって, α-CDE と市販キャリアの核酸 (pDNA, siRNA) に対 する相互作用様式の違いがこれらのパラメーターに反映されたものと推察される. さらにこれらキャリアによる相互作用の違いは 3 成分系複合体中の siRNA の 安定性にも影響を与えた. すなわち 50% FCS 存在下において, α-CDE 複合体 は RNase による siRNA の分解を抑制したが, L2, TF および LF 複合体ではそ の抑制効果は観察されなかった (Fig. 9C). これらの結果から, α-CDE は pDNA および siRNA と安定な 3 成分系複合体を形成し, 酵素安定性を増大することが 明らかとなった. しかしながら, pDNA/siRNA/α-CDE からなる 3 成分系複合体 に お い て , そ れ ら の 複 合 体 の 形 成 様 式 (pDNA/siRNA/α-CDE あ る い は pDNA/α-CDE あるいは siRNA/α-CDE) の詳細は明らかではない. 今後, 更なる 検討が必要である. α-CDE か ら な る 3 成 分 系 複 合 体 の 優 れ た RNAi 効 果 の 一 つ と し て FITC-siRNA および TRITC-α-CDE の細胞質局在性が関与するものと推察された (Fig. 20A). 興味深いことに, 今回用いたキャリア間で FITC-siRNA の細胞内分 布は異なっていた (Fig. 20B). すなわち, α-CDE 複合体は siRNA を細胞質中に 散在させたが, 核内への局在は観察されなかった. 一方, L2 および TF 複合体 - 38 - を用いた場合, 多くの siRNA が核および細胞質で観察された (Fig. 20B). RNAi 効果の発現を担う RISC は細胞質に局在すること, 移行しにくいことが報告されており, 78, 87) 88, 89) また, siRNA は核内に さらに, 通常スプライシングが完了し ていない mRNA は核内にとどまることから, 93) RNAi 機構のほとんどが細胞質 で起きると考えられている. 94) これらのことを考慮すると, α-CDE を用いた場 合による優れた RNAi 効果は, siRNA を細胞質に局在させ, RISC への取り込み を増大させたためと推察される. また, 最近 Berezhna らは siRNA の細胞内挙 動は標的 mRNA の局在性に依存することを報告している. 95) 今回用いた pGL3 mRNA は細胞質局在型であることから, α-CDE を用いた場合に得られた siRNA の細胞質局在性は Berezhna らの結果を支持するものであった. 一方, L2 や TF 複合体で観察された非特異的な遺伝子発現抑制効果ならびに大きなバラツキは, 標的 mRNA が細胞質に存在するにも関わらず, siRNA を核内に送達したことに より RISC への取り込み量が減少したこともその一因であると考えられる. し かしながら, Robb らは HeLa 細胞において RISC は細胞質だけでなく核内にも 存在することを報告している. 96) RISC の局在性および RISC と siRNA との共 局在性は細胞種によって異なることが推察され, 今回用いた NIH3T3 細胞にお いてはまだ不明な点も多い. 今後, RISC の主要な構成成分である Argonaute protein 2 (Ago2) と siRNA ならびにキャリアの共局在性を解析することで, より 詳細な機構解明が可能と思われる. これらの結果から, RNAi 効果を左右する原 因の一つに, siRNA の局在性が用いたキャリアシステムによって異なることが考 えられることから, 標的 mRNA の局在性に応じた適切なキャリアを選択するこ とで, より効率的な RNAi 効果を誘導できるものと考えられる. さらに緒言で 述べたように, 我々は α-CDE のデンドリマー側にマンノース分子をつけた Man-α-CDE が核移行性を有することを報告している. 69) し た が っ て , Man-α-CDE は L2 や TF と同様に siRNA よりむしろ, RNAi 効果発現に核移 行性を必要とする shRNA キャリアとしての有効利用が期待される. 3 成分系複合体の細胞傷害性は siRNA による配列特異的な RNAi 効果を減 弱させる. 本実験で用いた脂質系キャリアはポリマー系キャリアに比べて細胞 傷害性が高く, 97-100) 特に L2 は遺伝子・siRNA の導入効率が高いが, それに伴 い細胞傷害性を惹起することが報告されている. - 39 - 78) 実際, 市販キャリアからなる 3 成分系複合体はいずれも細胞生存率を低下させた (Fig. 18A). また, その効果 は TF 複合体で強く観察された. この原因として, TF 複合体の粒子径が関与す ると思われる. Ross らは, in vitro においてリポプレックスの粒子径が大きいほ ど遺伝子導入効率が増大すると報告している. 101) TF 複合体の平均粒子径はこ れら脂質系キャリア複合体の中で最も大きく (Table 3), それに伴い TF 複合体 の細胞内取り込みはこれらキャリア複合体間の中で最も高かった (Fig. 19). こ れらの結果は, TF 複合体でみられた細胞傷害性の原因の一つに複合体の高い細 胞内取り込みが関与することを示唆するものである. 一方, α-CDE からなる 3 成分系複合体は細胞傷害性を全く示さなかった. Fischer らは, デンドリマー (G3) の細胞傷害性は, Polyethylenimine (PEI), Poly-L-lysine (PLL) などのカチオン 性ポリマーの中でも極めて低いと報告している. 102) また, 我々の以前の検討に おいて, α-CDE の物理化学的性質はデンドリマー単独と変わらないこと, α-CDE/pDNA 複合体の細胞傷害性はチャージ比 200/1 まで示さないことを明ら かにしている. 68) これらの知見は, α-CDE が極めて安全性の高いキャリアであ ることを示唆しており, 本キャリアが siRNA 用キャリアとして好ましい性質を 有することが示唆された. さらに siRNA による RNAi 効果を検討する際に, インターフェロン応答の有無は配列特異性を判断する上で重要なことである. Judge らは, siRNA 単独でインターフェロン応答しなくても, リポソームキャリ アとの複合体によりインターフェロン応答を惹起することを報告している. 84) そこで次に, 3 成分系複合体を細胞内へトランスフェクション後のインターフェ ロン応答に関与するサイトカイン (IFN-β および TNF-α mRNAs) の誘導を RT-PCR にて検討した. その結果, これらキャリア複合体による IFN-β および TNF-α mRNA の誘導は観察されなかった (Fig. 18B). これらのことから, 市販 キャリアで観察された RNAi 効果のバラツキならびに siGL2 による非特異的な 抑制効果に, キャリア複合体自身による細胞傷害性の関与が示唆された. 以上の結果から, α-CDE からなる 3 成分系複合体は配列特異性に優れ, バラ ツキの小さな RNAi 効果を誘導すること, またその要因としては, 核酸 (pDNA および siRNA) と安定な複合体を形成すること, 細胞傷害性が低いこと, siRNA を細胞質に効率よくデリバリーすることが示唆された. - 40 - 第 9 節 小括 本章では, α-CDE (G3, DS 2.4) の siRNA キャリアとしての有用性に関する基 礎的情報を得るため, RNAi 効果の評価が簡便かつ広範に行われている 3 成分系 複合体 (pDNA/siRNA/キャリア) を用いて, 複合体の遺伝子発現抑制効果につい て検討した. また, 細胞傷害性ならびに細胞内挙動を市販キャリア (L2, TF, LF) と比較検討するとともに, それらキャリア複合体間の RNAi 効果の相違の機構 解明のため, 複合体の物理化学的性質, 細胞傷害性ならびに細胞内分布について 検討した. 以下に主な知見を要約する. 1) デンドリマー (G3) および α-CyD の置換度が異なる 3 種類の α-CDE (DS 1.2, 2.4, 5.4) を用い, 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/α-CDE) にて評価した. その結果, α-CDE (DS 2.4) 複合体は細胞傷害性が低く, 高い遺伝子発現抑制効 果を示し, 多くの siRNA を細胞内に導入することが示唆された. 2) 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/キャリア) の物理化学的性質を検討した. α-CDE からなる 3 成分系複合体は粒子径約 140 nm で正の ζ-電位を与えた. 一方, 市販キャリアからなる 3 成分系複合体はいずれにおいても負の ζ-電 位を示し, α-CDE と比較して pDNA および siRNA との相互作用は弱いこと が示唆された. さらに, α-CDE 複合体は血清による siRNA の分解を抑制し たが, 市販キャリア複合体では siRNA の分解が観察された. これらのこと から, α-CDE は核酸と安定な複合体を形成することが示唆された. 3) 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/キャリア) の細胞傷害性を NIH3T3 細胞を用 いて検討した. その結果, α-CDE からなる 3 成分系複合体は細胞傷害性を 全く示さなかった. 一方, L2, TF および LF を用いた場合, 細胞傷害性が観 察された. 各種キャリアからなる 3 成分系複合体はインターフェロン応答 に関与する IFN-β および TNF-α mNRA を誘導しなかった. これらのことか ら, pDNA/siRNA/α-CDE 複合体は安全性に優れるキャリアであることが示唆 された. - 41 - 4) 3 成分系複合体 (pGL3/siRNA/α-CDE) において, siGL3 はコントロールに対 し遺伝子の発現を約 16% まで抑制した. しかしながら, siGL2 系による抑 制効果は全く観察されず, 配列特異的な遺伝子発現抑制効果が認められた. また pGL2 control vector 系においても α-CDE 複合体は siGL2 による配列 特異的な抑制効果を誘導した. 5) 3 成 分 系 複 合 体 (pGL3/siRNA/α-CDE) の 遺 伝 子 発 現 抑 制 効 果 に 対 す る siRNA 濃度の影響を検討した. その結果, NIH3T3 細胞において, siGL3 は高 濃度領域において頭打ちになるものの, 濃度依存的な遺伝子発現抑制効果を 示した. A549 および HepG2 細胞においても同様な結果が観察された. 6) 3 成分系複合体 (pGL3/siRNA/α-CDE) の遺伝子発現抑制効果に対する pDNA と α-CDE とのチャージ比 (α-CDE/pDNA) の影響を検討した. チャージ比 50/1 までは α-CDE の添加量に伴い, 遺伝子発現量ならびに siRNA による遺 伝子発現抑制効果は増大した. チャージ比 50/1 以上では抑制効果は頭打ち になり, さらに, チャージ比 150/1 以上でわずかに減少した. 7) 3 成分系複合体 (pGL3/siRNA/α-CDE) の遺伝子発現抑制効果を市販の核酸導 入試薬と比較した. pGL3 control vector 系において, α-CDE を用いた場合, 配列特異的な RNAi 効果が観察されたが, 市販のキャリア (L2, TF, LF) を用 いた場合, RNAi 効果のバラツキや非特異的な抑制効果が観察された. 8) 3 成分系複合体 (pGL3/FITC-labeled siRNA/TRITC-α-CDE) を細胞に添加 1 時間の細胞内取り込みをフローサイトメトリーにより解析した. α-CDE を 用いた場合, FITC-labeled siRNA の取り込み量は LF 複合体よりも多く, L2 複合体と同等の効果を示した. 9) 3 成分系複合体 (pGL3/FITC-labeled siRNA/TRITC-α-CDE) を細胞に添加 1 時間において, FITC-labeled siRNA および TRITC-α-CDE は細胞質に散在し た. 一方, L2 および TF を用いた場合, FITC-labeled siRNA は核内およびそ - 42 - の周辺で観察された. これらのことから, α-CDE による優れた RNAi 効果 は siRNA を細胞質へ局在させたためと推察された. 以上述べたように, α-CDE からなる 3 成分系複合体は市販キャリアに比べ配 列特異性に優れ, 安定した RNAi 効果を誘導することが示唆された. また, そ の理由として siRNA を細胞質中に局在化させ, RISC への取り込みを増大させる こと, pDNA および siRNA とナノサイズの安定な複合体を形成し, RNase など の酵素から siRNA の分解を抑制したためと推察された. これらの結果から, α-CDE は siRNA 用キャリアとして有用である可能性が示唆され, 次章から実際 応 用 を 企 図 し た 2 成 分 系 複 合 体 (α-CDE/shRNA 発 現 ベ ク タ ー ま た は α-CDE/siRNA) を用いて検討を行った. - 43 - 第 2 章 shRNA 発現ベクター (pSilencer) 導入用キャリアとして α-CDE の有用性評価 第 1 節 序 細胞内で RNAi 効果を発揮させるためには, 化学合成した siRNA を用いる方 法と siRNA を発現する pDNA を用いる方法がある. 前者はそのもの自身が活 性体であるため, 迅速な RNAi 効果が期待できるという長所を有するものの, 効 果が一過性であることや siRNA の酵素安定性が低いことなどの欠点がある. こ れらの欠点を解消するため, 細胞内で shRNA を発現させ, RNAi 効果を発現さ せる方法, すなわち shRNA 発現ベクターを用いる方法が報告されている. shRNA 発現ベクターには, タンデム型 103-105) とヘアピン型 92, 106-108) の 2 種類が 知られているが, 後者はより低濃度で RNAi 効果を発揮でき, かつベクター構築 が容易であることから, 現在ではヘアピン型が主流を占めている. また, shRNA 発現ベクターで用いられるプロモーターのほとんどは Pol III 系であり, 特に マ ウス U6 snRNA プロモーター 92, 105, 107, 108) およびヒト H1 プロモーター 106) が 汎用されている. Fig. 21 に shRNA 発現ベクターによる RNAi 誘導機構のモデルを示す. 細胞 内に導入された shRNA 発現ベクターは核内へ移行後, U6 プロモーターにより, ヘアピンループ構造を有する shRNA を産生する. shRNA は Exportin-5 を介し て細胞質へ移行し, その後 Dicer によって 21 mer の siRNA に切断される. siRNA は細胞質に存在する RISC に取り込まれ, アンチセンス鎖に相補的な mRNA を特異的に切断する. このように, shRNA 発現ベクターを用いる場合, 遺伝子導入の場合と同じく, 細胞内へ pDNA を導入後, 効率よく細胞質へリリ ースし, 核内へ到達させる必要がある. - 44 - pSilencer Dicer siRNA RISC Exp-5 U6 mRNA Degradation shRNA +1 N21 loop N21 AAAAA TTTTT AAAAA mRNA AAAAA DNA Fig. 21. Scheme for RNAi Effects Induced by shRNA-expressing Plasmid Vector (pSilencer) 緒言で述べたように, 我々はこれまでルシフェラーゼをコードする pGL3 control vector の遺伝子導入において, α-CDE (G3, DS 2.4) が高チャージ比 (α-CDE/pDNA, 200/1) においても細胞傷害性を惹起せずに, 高い遺伝子導入効率 を示すことを報告した. 68) このことは, pGL3 の代わりに shRNA 発現ベクター を用いた場合においても, 高い遺伝子導入効率を示すことが期待される. そこで 本章では, ヘアピン型 U6 プロモーター shRNA 発現ベクターの 1 つである pSilencer を用いて, shRNA 発現ベクター用キャリアとしての α-CDE の有用性 について検討した. Fig. 22 に pSilencer のベクターマップを示す. pSilencer を ApaI および EcoRI で切断し, pGL3 ルシフェラーゼ遺伝子に対する siGL3 を含 むリンカーを組み込むことにより, pSilencer siGL3 (shGL3) を調製した. なお, 調製したベクターは, Hind III 処理および T3 プライマーによる配列の確認を行 った (data not shown). ネガティブコントロールとして, siGL3 の配列に対して 3 つのミスマッチを有する siGL2 からなる pSilencer siGL2 (shGL2) を用いた. まず初めに, α-CDE と pSilencer の相互作用様式ならびにこれら複合体の物理化 学的性質について検討した. 次に, ルシフェラーゼ遺伝子一過性発現細胞, すな わち α-CDE/pGL3 複合体をトランスフェクション後の α-CDE/pSilencer 複合体 による抑制効果を検討した. また, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞株 - 45 - (NIH3T3-luc) を 構 築 し , そ の 遺 伝 子 発 現 に 対 す る 2 成 分 系 複 合 体 (α-CDE/pSilencer) の抑制効果について検討した. さらに, 遺伝子発現抑制効果 の増大を企図して, pSilencer/siRNA/α-CDE からなる 3 成分系複合体を調製し, その遺伝子発現抑制効果を 2 成分系複合体の場合と比較検討した. 以下に得ら Kpn I ApaⅠ XhoⅠ SalⅠ ClaⅠ Hind Ⅲ EcoR Ⅴ EcoRⅠ SacⅡ Bst Ⅺ SacⅠ れた知見を詳述する. T3 U6 Sense f1 ori Co/E1 ori Loop 5’-N (19) TTCAAGAGA 3’-CCGG N (19) AAGTTCTCT ApaⅠ Antisense N(19) TTTTTT-3’ (53 bases) N(19) AAAAAATTAA-5’ (61 bases) EcoRⅠ Ampr pSilencer 1.0-U6 (3.2 kb) Fig. 22. pSilencer Vector Map 第 2 節 α-CDE と pSilencer との相互作用 第 1 項 アガロースゲル電気泳動 本項では, α-CDE (G3, DS 2.4) と pSilencer との相互作用をそれら複合体の正 味の電荷を簡単に知ることができるアガロースゲル電気泳動法を用いて検討した. Fig. 23 は, 0.2 μg の pSilencer に α-CDE/pSilencer のチャージ比が 0.1 ~ 100 の 範囲になるように α-CDE を添加し, 攪拌後, 室温で 15 分間インキュベートし たサンプル溶液を EtBr 含有 1% アガロースゲルにて電気泳動した結果を示す. pSilencer に由来するバンド強度はチャージ比依存的に低下し, 1 付近にてほぼ完 全に消失した. これらのことから, ネットポジティブなチャージを持つ α-CDE (G3, DS 2.4) は pSilencer と静電的に相互作用し, チャージ比 1 以上で正味の電 荷が中性または正に傾くことが示唆された. - 46 - Charge ratio (α-CDE/pSilencer) 0 0. 1 0. 5 1 2 5 10 20 0 10 Fig. 23. Agarose Gel Electrophoretic Analysis of α-CDE/pSilencer Complexes The solutions containing the complexes of pSilencer/α-CDE conjugate were incubated for 15 min. The electrophoresis was performed at 100V for about 40 min. The amounts of pSilencer were 0.2 μg. 第 2 項 円二色性 (CD) および紫外吸収 (UV) スペクトル法による検討 CD スペクトル法はリガンド分子との相互作用によって引き起こされる DNA の二重鎖へリックス構造の変化の解析のための有用な方法である. そこで本項 では, 本手法を用いて, pSilencer の構造変化におよぼす α-CDE の影響について 検討した. なお本実験条件下, α-CDE 添加による pSilencer の微細な構造変化を 検出するため, pSilencer 1 分子に対する α-CDE モル比の変化にて検討した. こ こで, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 におけるモル比 (α-CDE/pSilencer) は 222/1 に相当する. pSilencer 単独において観察された 275 nm 付近での正のコットン効果および 245 nm 付近での負のコットン効果は B-form を形成していることを示す. α-CDE の添加量に依存して, これらのピークは減少するとともに, モル比 (α-CDE/pSilencer) 100/1 以上では 275 nm および 245 nm のピークが高波長側に シフトした (Fig. 24A). これは α-CDE の添加量が増加するに従い, DNA のへリ ックス構造が B-form から C-form に変化したことを示唆するものである. DNA とキャリアとの相互作用を検討する他のスペクトル法として UV 法があ る. デンドリマーは 260 nm 付近において吸収スペクトルをほとんど示さない - 47 - ことから, この波長における吸光度は溶液中の DNA 濃度の変化として表すこと ができる. 109) そこで次に, DNA の UV 吸収スペクトルにおよぼす α-CDE の 影響について検討した (Fig. 24B). 低モル比 (α-CDE/pSilencer; 1/1 ~20/1) で観察 された 260 nm における pSilencer の吸収スペクトルは低下し, CD スペクトル 法で得られた結果と一致した. モル比 40/1 では, pSilencer の吸収スペクトルは 増大し, さらにそれ以上 (> 100/1) になると長波長側にシフトした. ここでモル 比が約 200/1 の時, チャージ比は 1/1 に相当することから, α-CDE は pSilencer と相互作用し, チャージ比が中性に近づくにつれて DNA の構造変化を引き起こ すことが示唆された. (A) (B) Molar ratio (α-CDE/pSilencer) 5 pSilencer alone 1/1 2/1 10/1 20/1 100/1 200/1 400/1 200/1 100/1 40/1 pSilencer alone 1/1 2/1 10/1 20/1 3 Absorbance [θ] (x10-7deg·cm2/dmole) 10 Molar ratio (α-CDE/pSilencer) 4 0 2 1 -5 -10 200 0 250 300 350 200 250 300 350 Wavelength (nm) Wavelengh (nm) Fig. 24. Representative CD (A) and UV (B) Spectra of pSilencer and α-CDE/pSilencer Complexes at Various Molar Ratios in Tris-HCl Buffer (10 mM, pH 7.4) at 25°C The concentrations of pSilencer were 100 μg/mL and 40 μg/mL for CD and UV measurement, respectively. 第 3 項 α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径および ζ-電位 キャリア/pDNA 複合体の粒子径および ζ-電位は遺伝子導入に影響を与える重 要な因子である. 110) 例えば, Wagner らはヒト白血病由来 K562 細胞において, - 48 - 400 PLL/pDNA 複合体の粒子径が 80 ~ 100 nm のとき遺伝子発現効率が高いこと, 111) Grosse らは, キャリア/pDNA 複合体の粒子径は, 複合体の細胞内取り込み経路 および細胞内トラフィック過程に影響を及ぼすことを報告している. 112) また, 複合体の荷電状態は細胞への結合性や血清成分との非特異的な相互作用, さらに は粒子自体の水への溶解度にも影響を及ぼす. そこで本節では, α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径および ζ-電位について検討した. Fig. 25 に示すように, α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径はチャージ比 1/1 にお いて最も大きなサイズ (約 160 nm) を示し, その後チャージ比依存的に減少し, 10/1 以上でほぼ一定 (約 80 nm) となった. また, これら複合体の ζ-電位は, チ ャージ比 0.75/1 までは負の値を示し, 1/1 付近で中性になり, その後, α-CDE の 添加量に依存して正の ζ-電位を与えた. 40 ζ-Potential (mV) Particle size (nm) 200 150 100 50 20 0 -20 -40 0 0 20 40 60 80 100 0 Charge ratio (α-CDE/pSilencer) 20 40 60 80 100 Charge ratio (α-CDE/pSilencer) Fig. 25. Particle Size and ζ-Potential of α-CDE/pSilencer Complexes at Various Charge Ratios Each point represents the mean of ± S.E. of 3-6 experiments. 第 4 項 透過型電子顕微鏡による観察 キャリア/pDNA 複合体の形態は複合体粒子の安定性に影響を与える. 例えば, Abdelhady らは, デンドリマー (G4) と pDNA の複合体において, 粒子形態の違 - 49 - いにより, DNA 分解酵素に対する安定性が異なることを報告している. 113) そ こで次に, α-CDE/pSilencer 複合体の形態を透過型電子顕微鏡を用いて観察した. Fig. 26 に示すように, pSilencer 単独では, 1 ~数百 nm の粒子径を有する粒子 が観察された. 一方, α-CDE をチャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 で添加した とき, pSilencer 単独よりも大きな粒子径 (約 200 nm) を有する複合体を形成す ることが示唆された. 一方, チャージ比 10/1 では, 凝集体の形成は観察され ず, 球状の粒子が観察された. このチャージ比では複合体の ζ-電位は正の値 を示していることから, 複合体同士の静電的な反発により, 凝集体を形成しに くいことが示唆された. これらの結果から, α-CDE/pSilencer 複合体はチャー ジ比が増大するにつれて均一な複合体を形成することが示唆された. Charge ratio (α-CDE/pSilencer) pSilencer 1/1 10/1 : 50 nm Fig. 26. Transmission Electron Microscopy (TEM) Images of α-CDE/pSilencer Complexes at Various Charge Ratios pSilencer (2.5 μg) was added to Tris-HCl buffer solution (10 mM, pH 7.4) followed by addition of the α-CDE. The samples were incubated for 15 min. Drops of each solution were placed onto a copper grid for 5 min. Excess buffer was drawn away with filter paper. The sample was then stained with uranyl acetate (2% w/v) for 3 min. The grid was then washed in distilled water twice prior to air-drying. The samples were analyzed with TEM. 第 5 項 pSilencer のコンパクションに対する α-CDE の影響 キャリア/pDNA 複合体中における pDNA のコンパクション状態は核内へ移 - 50 - 行後の遺伝子発現に影響を与える因子の一つである. リポフェクション法およ びポリフェクション法による外来遺伝子の発現増大に pDNA のコンパクション は正に作用するとの報告 114) が多く, 特にポリプレックスのコンパクションの程 度はリポプレックスに比べて大きいことが知られている. また, shRNA 発現ベ クターが遺伝子発現抑制効果を発現するためには, 遺伝子発現ベクターと同様に 核への移行およびその後の転写過程が必須であり, ベクターのコンパクション状 態は RNAi 効果を左右する一つの重要な因子になりえる. そこで本項では, α-CDE/pSilencer 複合体中の pSilencer のコンパクション状態を明らかにするた め, α-CDE 非添加時の pSilencer にインターカレートされた Picogreen® の蛍光 強度を 100% とし, キャリア添加時の pSilencer のコンパクションにより減少し た Picogreen® の蛍光強度を測定した. Fig. 27 に示すように, pSilencer の蛍光強度はチャージ比 (α-CDE/pSilencer) の 増大に伴い低下し, チャージ比 1/1 における蛍光強度は約 50%, 10/1 以上にお いては約 90% 程度に低下した. これらのことから, α-CDE/pSilencer 複合体中 の pSilencer は α-CDE との複合体形成に伴い, 強くコンパクションを起こすこ とが示唆された. また前述したように, このチャージ比以上において α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径は約 100 nm であることから, このナノサイズ の複合体形成に pSilencer のコンパクションが関与することが示唆された. - 51 - Relative fluorescence intensity (%) 1) 125 100 75 50 25 0 0 100 200 300 400 Charge ratio (α-CDE/pSilencer) Fig. 27. pSilencer Compaction in α-CDE/pSilencer Complexes, Determined by Dye Displacement Assay 1) The fluorescence intensity of the pSilencer-picogreen® mixture in the absence of α-CDE indicates 100%. The α-CDE/pSilencer complexes solution was incubated for 15 mim, and then the fluorescence intensity was measured by a fluorescence spectrometer (λex = 495 nm, λem = 525 nm). Each point represents the mean ± S.E. of 3 experiments. 第 6 項 pSilencer の酵素分解におよぼす α-CDE の影響 目的とする細胞に外来遺伝子を導入・発現させるにためは, pDNA をインタク トな状態に保ちながら, 標的細胞内へ送達させる必要がある. 一般に, pDNA は 血清に存在する DNA 分解酵素 (DNase) により速やかに分解されることから, in vivo において shRNA 発現ベクターを用いて遺伝子発現抑制効果を得るために は, DNase に対するベクターの安定性が重要な因子となる. 110) また, 細胞内へ導 入された pDNA は細胞質に存在する DNase によっても分解を受ける. 例えば, HeLa 細胞や COS-1 細胞において, マイクロインジェクションにより細胞質に 導入された pDNA の半減期は約 50 ~ 90 分であること, 115) C2C12 細胞では約 4 時間であることが報告されている. 116) したがって, ベクターの酵素安定性も遺 伝子発現抑制効果に関与する重要な因子であると考えられる. そこで本項では, DNase に対する pSilencer の安定性に及ぼす α-CDE の影響について, アガロー スゲル電気泳動ならびに UV スペクトル法を用いて検討した. なお, 血清中の - 52 - DNase I 活性は, 個体差や種差により, ヒトでは 2 x 10-4 ~ 8.0 x 10-2 unit/μL と報 告されていることから, 今回は 1.25 x 10-2 ~ 1 x 10-1 unit/μL の DNase I を用いて 実験を行った. また, DNase I 処理後の α-CDE/pSilencer 複合体は, SDS を添加 して解離させた後, アガロースゲル電気泳動にて解析した. Fig. 28 に示すように, DNase I 未処理の場合, すべてのチャージ比において pSilencer 由来のバンドが観察された. 一方, DNase I 処理した場合, pSilencer 単 独ではバンドの消失が観察されたが, α-CDE を添加した場合, 検討に用いたいず れのチャージ比 (α-CDE/pSilencer) においてもバンドが観察された. これらのこ とから, α-CDE は pSilencer と複合体を形成することにより, DNase I による pSilencer の分解を抑制することが確認された. 次に, DNase I 処理後の α-CDE による pSilencer 分解抑制機構を UV スペクト ル法を用いて検討した. 一般に UV スペクトルはポリヌクレオチド中の塩基の スタッキング効果に敏感で DNA の核酸-塩基間の分子間力の低下に伴い, 吸光 度が増大することが知られている. そこで本研究では, DNase I 処理前後の 260 nm の吸光度の時間変化の差 (Δ260) を測定することで DNA 分解の有無を評価 した. なお本実験条件下, α-CDE 添加による pSilencer の微細な分解抑制効果を 検出するため, pSilencer 1 分子に対する α-CDE モル比の変化にて検討した. こ こで, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 におけるモル比 (α-CDE/pSilencer) は 222/1 に相当する. Fig. 29 に示すように pSilencer 単独では, 時間経過とともに, Δ260 値が増大し, DNA の分解が観察された. 一方, α-CDE/pSilencer 複合体では pSilencer 単独に 比べ, モル比 (α-CDE/pSilencer) 依存的に Δ260 値は低下したことから, α-CDE は DNase による pSilencer の分解を抑制することが示唆された. さらに, pSilencer 単独では DNase I を添加した直後から DNA の分解が観察されるのに 対して, α-CDE/pSilencer 複合体では分解速度を低下させた. Table 4 に pSilencer が完全に分解される前の直線部分から求めたみかけの一次分解速度定数を示す. 求められた分解速度定数は α-CDE/pSilencer 複合体のモル比依存的に増大した. これらのことから, α-CDE は低濃度においても pSilencer と安定な複合体を形成 し, DNase I からの分解を抑制することが示唆された. - 53 - Without DNase I 0 0.5 1 2 5 10 20 50 100 0 0.5 1 2 5 10 20 50 100 With DNase I Charge ratio (α-CDE/pSilencer) Fig. 28. Effect of α-CDE on Electrophoretic Mobility of pSilencer Treated with DNase I The pSilencer complexes with α-CDE were incubated for 2 h at 37˚C in the reaction buffer containing DNase I (1 x 10-1 unit/μL). 0.5 with α-CDE (molar ratio 1/1) pSilencer alone 0.4 Δ260 0.3 with α-CDE (molar ratio10/1) 0.2 with α-CDE (molar ratio 20/1) 0.1 0 0 300 600 900 1200 Time (sec) Fig. 29. Time Courses of Enzymatic Degradation Profiles of α-CDE/pSilencer Complexes at Various Molar Ratios in the Presence of DNase I (1.25 x 10-2 unit/μL) at 37°C DNase I solution (5 x 10-1 unit) was added to the solution containing α-CDE/pSilencer complexes, and a change in the absorbance at 260 nm was monitored. Each point represents the mean of 3 experiments. - 54 - Table 4. Enzymatic Degradation Rate Constants (k) of α-CDE/pSilencer Complexes at Various Molar Ratios after Treatment with DNase I (1.25 x 10-2 unit/μL) at 37°C System pSilencer alone Rate constant (k, sec-1) 7.83 x 10-3 Molar ratio of α-CDE/pSilencer 1/1 7.68 x 10-3 10/1 5.68 x 10-3 20/1 5.76 x 10-3 * * Each point represents the mean of 3 experiments. *p<0.05, compared with pSilencer alone. 第 3 節 α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性 キャリア/核酸複合体は安全でなければならず, 複合体の細胞傷害性は RNAi による遺伝子発現抑制効果を評価する際には特に重要な因子である. 従来, 非ウ イルスベクターは安全性が高いものと考えられてきたが, 高濃度においてカチオ ン性ポリマーはマクロファージや B 細胞にアポトーシスを誘導すること, 117) PEI やデンドリマーなどのカチオン性ポリマーと pDNA との複合体がマウス繊維芽 細胞にネクローシスを誘導することが報告されている. 118) そこで本項では, α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性を WST-1 法を用いて検討した. Fig. 30 に NIH3T3-luc 細胞における α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性の 結果を示す. NIH3T3-luc 細胞は, 遺伝子および siRNA の導入実験に汎用され ていることから, 本実験ではこの細胞を用いた. α-CDE の チ ャ ー ジ 比 (α-CDE/pSilencer) 100/1 までは細胞傷害性を示さなかった. しかしながら, それ 以上ではチャージ比依存的に細胞傷害性が観察された. 我々は以前, NIH3T3 細 - 55 - 胞において, α-CDE/pGL3 複合体のチャージ比が 100/1 のとき細胞傷害性を示さ ず最も高い遺伝子導入効率を示すことを報告した. また, 同細胞において, 市販 遺伝子導入試薬である, LF/pGL3 複合体はチャージ比 1/1 では細胞生存率約 50% を示し, 5/1 では 100% 細胞傷害性を示すことを明らかにしている. 119) こ れらの結果は, α-CDE 複合体が高チャージ比においても細胞傷害性が低く, 市販 遺伝子導入試薬よりも極めて安全性が高いキャリアであることを示唆するもので ある. これらの結果と一致して, Fig. 30 に示すように α-CDE/pSilencer 複合体 はチャージ比 100/1 まで何ら細胞傷害性を示さないことが明らかとなった. こ のように, α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性はトランスフェクション条件下, 極めて小さいことが示された. したがって, 以後の検討では, チャージ比 100/1 以下の複合体を用いた. 140 Cell viability (%) 120 100 80 60 40 20 0 0 200 400 600 800 1000 Charge ratio (α-CDE/pSilencer) Fig. 30. Cytotoxicity of α-CDE Complexes with pSilencer in NIH3T3-luc Cells Cells were transfected with α-CDE/pSilencer complexes for 24 h. Cell viability was assayed by the WST-1 method. The amount of pSilencer was 2.0 μg. Each point represents the mean ± S.E. of 5 experiments. - 56 - 第 4 節 ルシフェラーゼ遺伝子発現に対する α-CDE/pSilencer 複合体の 抑制効果 第 1 項 ルシフェラーゼ遺伝子一過性発現細胞における検討 これまでの検討より, α-CDE/pSilencer 複合体はナノサイズの球状粒子を形成す ること, 細胞傷害性が低いことを明らかにした. そこで次に, この複合体の RNAi 効果をルシフェラーゼアッセイ法により検討した. 初めに, ルシフェラーゼ遺伝子一過性発現細胞における α-CDE/pSilencer 複合 体の遺伝子発現抑制効果におよぼす pSilencer 添加量の影響について検討した. 実験は, A549 細胞に α-CDE/pGL3 複合体をトランスフェクション 1 時間後, α-CDE/pSilencer 複合体を添加 23 時間後のルシフェラーゼ活性を測定すること により行った. その結果, α-CDE/shGL3 複合体はコントロールに対して配列特 異的な遺伝子発現抑制効果を示し, その効果は shGL3 が 1.0 μg のとき最も高 かった. (Fig. 31) 一方, α-CDE/shGL2 複合体においては, いずれの shGL2 濃度 においても抑制効果は観察されなかった. これらのことから, α-CDE/pSilencer 複合体は一過的に発現する mRNA に対して遺伝子発現抑制効果を示すこと, ま た, その抑制効果の発現に際して pSilencer 量に至適値があることが示唆された. - 57 - Luciferase activity (%) 120 100 80 60 *† 40 *† *† 1.5 2 *† 20 0 0 0.5 1 Amount of pSilencer (μg) Fig. 31. Effects of Post-transfection of α-CDE/pSilencer Complexes on Luciferase Activity in A549 Cells Transiently Transfected with the α-CDE/pGL3 Complex : Control, : shGL2, : shGL3. Cells were transfected with α-CDE/pGL3 complexes for 1 h, and then washed with medium at twice. Thereafter the cells were secondary transfected with α-CDE/pSilencer complex and incubated for 22 h. The charge ratios of α-CDE/pSilencer and α-CDE/pGL3 were 20/1 and 100/1, respectively. The amount of pGL3 control vector was 2.0 μg. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with shGL2. 第 2 項 ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞における検討 次に, 内因性の遺伝子と同様に染色体からの遺伝子発現が行われるルシフェラ ーゼ遺伝子安定発現細胞 (NIH3T3-luc 細胞) を用いて, α-CDE/pSilencer 複合体 の遺伝子発現抑制効果を検討した. ここで NIH3T3-luc 細胞は, NIH3T3 にルシ フェラーゼ遺伝子をコードする pGL3 pDNA およびハイグロマイシン耐性遺伝 子を有する pCEP4 pDNA を共トランスフェクションし, その後ハイグロマイシ ン含有培地 (300 μg/mL) で培養して生存した細胞のみを選択することにより獲 得された. Fig. 32 に 示 す よ う に shGL3 の 遺 伝 子 発 現 抑 制 効 果 は , チ ャ ー ジ 比 (α-CDE/pSilencer) 依存的に増大し, チャージ比 20/1 において最も高い値を示し た. しかしながら, チャージ比 50/1 では抑制効果にバラツキが生じ, 配列特異 - 58 - 性は観察されなかった. 一方, いずれのチャージ比においても shGL2 による非 特異的な抑制効果は観察されなかった. これらのことから, α-CDE/pSilencer 複 合体は内因性遺伝子に対しても抑制効果を示すことが示唆された. 次に, チャー ジ比 20/1 における遺伝子発現抑制効果をデンドリマー単独と比較検討した (Fig. 33). その結果, α-CDE/pSilencer 複合体では, shGL3 による配列特異的な抑制効 果を示し, コントロールに対して遺伝子発現を約 50% まで抑制した. 一方, デ ンドリマー (G3) 系ではその複合体による遺伝子発現抑制効果は観察されなかっ た. 我々はこれまで, デンドリマーおよび α-CDE の遺伝子導入効率を NIH3T3 細胞にて比較検討した結果, α-CDE の導入効率はデンドリマー単独に比べ数百倍 高いことを報告している. 66-68) したがって, デンドリマーに比べて α-CDE で観察された優れた遺伝子発現抑制効果は pSilencer を効率よく細胞内に導入し たためと推察された. Luciferase activity (%) 140 120 100 80 *† 60 *† *† 40 20 0 0 10 20 30 40 50 Charge ratio (α-CDE/pSilencer) Fig. 32. Inhibitory Effect of Charge Ratio of α-CDE/pSilencer Complexes on Luciferase Activity in Cells Stably Expressing Luciferase Gene (NIH3T3-luc Cells) : Control, : shGL2, : shGL3. Cells were transfected with pSilencer complexes with α-CDE for 24 h. The amount of pSilencer was 2 μg. *p<0.01, compared with control. †p<0.01, compared with shGL2. - 59 - α-CDE (G3, DS 2.4) dendrimer (G3) 140 Luciferase activity (%) Luciferase activity (%) 120 100 80 60 *† 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0 Co ααCD CD nt r E/ E/ ol sh sh GL GL 2 3 Co n tro de l de n/s n/s hG hG L3 L2 Fig. 33. Inhibitory Effects of pSilencer Complexes with Carriers on Luciferase Activity in Cells Stably Expressing Luciferase Gene (NIH3T3-luc Cells) The cells were transfected with carrier/pSilencer complexes for 24 h. The amount of pSilencer was 2 μg. The charge ratio of carrier/pSilencer was 20/1. Each value represents the mean ±S.E. of 6-7 experiments. *p<0.01, compared with control. †p<0.01, compared with shGL2. 第 5 節 3 成分系複合体による遺伝子発現抑制効果 これまでの検討において, α-CDE/pSilencer 複合体は配列特異的に遺伝子発現を 抑制することを明らかにした. しかしながら, これら複合体の遺伝子発現抑制効 果は約 50% 前後と低く, その抑制効果の増大には何らかの工夫が必要であると 考えられる. そこで本節では, さらなる抑制効果の増大を企図して, pSilencer の 系に siRNA oligo (siRNA) を添加した 3 成分系複合体 (pSilencer/siRNA/α-CDE) を構築し, その遺伝子発現抑制効果を検討した. Fig. 34 から明らかなように, 3 成分系複合体中の siRNA 濃度が上昇するにつ れて抑制効果は増大し, 100 nM においてはコントロールに対して遺伝子発現を 約 20 % まで抑制した. しかしながら, 高濃度の siRNA 添加系の場合, siGL2 による非特異的な抑制効果が観察された. これらのことから, α-CDE/pSilencer 複合体に低濃度の siRNA を添加した 3 成分系複合体は, 2 成分系複合体 (α-CDE/pSilencer) の効果を増大させることが示唆された. - 60 - Luciferase activity (%) 120 100 * * 80 *† 60 *† *† 40 *† 20 0 2 2 2 2 2 0 20 40 60 80 2 pSilencer (μg) 100 Concn. of siRNA (nM) Fig. 34. Inhibitory Effects of Ternary Complexes of pSilencer/siRNA/α-CDE on Luciferase Activity in Cells Stably Expressing Luciferase Gene (NIH3T3-luc Cells) : pSilencer (Empty), : shGL2 + siGL2, : shGL3 + siGL3. Cells were transfected with binary complexes of α-CDE/pSilencer or ternary complexes of α-CDE/ pSilencer/siRNA for 24 h. The charge ratio of α-CDE/pSilencer was 20/1. Each point represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with pSilencer (Empty). †p<0.05, compared with shGL2 + siGL2. 第 6 節 考察 本章では, shRNA 発現ベクター用キャリアとしての α-CDE の有用性を評価す るため, α-CDE と pSilencer との相互作用様式, それら複合体の物理化学的性質 および α-CDE/pSilencer 複合体による遺伝子発現抑制効果をルシフェラーゼ遺 伝子一過性および安定発現細胞を用いて検討した. まず, α-CDE と pSilencer との相互作用をアガロースゲル電気泳動法にて検討 した. α-CDE のチャージ比が上昇するにつれて pSilencer に由来するバンド強 度は薄くなり, 1/1 付近でほぼ完全に消失した. (Fig. 23) 我々は以前, デンドリマ ー末端の第 1 級アミノ基の pKa は 6.9 であり, それに α-CyD を導入した α-CDE の物理化学的性質はデンドリマー単独と変わらないことを報告した. 68) したがって, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 付近でバンドが消失した理由は, pH 8.0 の溶液中では, α-CDE はネットポジティブな状態なため, ネガティブチャ - 61 - ージを有する pSilencer と静電的相互作用により複合体を形成し, チャージ比 1/1 付近において複合体の電荷が中性または正に傾いたためと推察される. そ こで, これら複合体の粒子径ならびに ζ- 電位を測定した. 予想どおり , α-CDE/pSilencer 複合体はチャージ比依存的に ζ-電位は増大し, 1/1 においてほ ぼ中性, それ以上では正の値を示し (Fig. 25), 先のアガロースゲル電気泳動法に て得られた結果とよく一致する結果が得られた. 一方, α-CDE/pSilencer 複合体 の粒子径は, チャージ比 1/1 において約 160 nm であったが, α-CDE の添加量 に依存して小さくなり, 平均 80 nm の粒子を与えた. Pouton らは複合体の電荷 が中和されると, 複合体自体の凝集作用により粒子径が増大することを報告して いる. 120) したがって, チャージ比 1/1 で得られた大きな粒子径は, 複合体同士 の静電気的な反発が起こらずに凝集体を形成したためと推察された. 実際, 透過 型電子顕微鏡にて複合体の形態を観察したところ, 約 200 nm の粒子径を有する 凝集体の形成が観察された (Fig. 26). 一方, チャージ比 10/1 では, 1/1 で観察 された凝集体は見られず, 球状の粒子が分散していた. これは, チャージ比 10/1 では正の ζ-電位を有し, 静電的反発により複合体同士が安定に存在したためと 推察された. しかしながら, DLS および透過型電子顕微鏡で得られた粒子径の サイズに違いがみられた (Figs. 25, 26). 起因するものと考えられる. 121) これは, 測定する際のサンプル調製に すなわち, DLS は溶液中で複合体の動的光散乱 を測定するのに対して, 透過型電子顕微鏡では溶液中で調製したサンプルを一度 乾燥し, 金属 (酢酸ウラニル) で染色しているため, 画像解析の際に染色の影響 が生じやすいことや乾燥したサンプルでは複合体の水和層が除かれているなどの 理由により DLS で得られた値と異なったものと推察される. したがって, 今後 溶液中でのサンプル測定が可能な原子間力顕微鏡を用いることにより, より詳細 な形態の観察を試みる予定である. 次に, pSilencer の構造変化に及ぼす α-CDE の影響を CD および UV スペク トル法を用いて検討した. pDNA 自身は 260 nm 付近に特性吸収帯を有するた め, らせん⇔コイル転移などのへリックス構造のコンフォメーション変化を調べ ることができる. 122, 123) DNA の二重らせんには構造多形があることが知られて おり, 液体中では B-form をとる. 124) B-form family に属する C-form は, B-form と比べてらせん一巻きあたりの塩基数 (10 bp) が 9.33 bp と少ないため, - 62 - よりコンパクトな構造をとっている. 125) 本研究において pSilencer 単独では, 275 nm 付近で正のコットン効果および 245 nm 付近で負のコットン効果が観察 され, B-form を形成していることが示唆された (Fig. 24A). また, α-CDE の添加 により CD バンドは減少し, さらにモル比 (α-CDE/pSilencer) 100/1 以上になる と 285 nm 付近で正のコットン効果および 251 nm 付近で負のコットン効果が 観察され, C-form への構造変化が示唆された (Fig. 24A). UV スペクトル法にお いても同様に, 低モル比では 260 nm における DNA の吸収スペクトルの減少し, 高モル比では長波長側にシフトする結果が得られ, CD スペクトル法で得られた 結果と一致した (Fig. 24B). Zhang らは, didodecyldimethylammonium bromide (DDAB) からなるカチオン性脂質は DNA と相互作用するとき, B-form から C-form へ構造変化を引き起こし, 二重鎖の安定性を向上させることを報告して いる. 125) 本研究において, 構造変化を起こした α-CDE と pSilencer のモル比 (100/1 ~ 200/1) をチャージ比に換算すると約 0.5/1 ~ 1/1 となり, このチャージ比 付近において ζ-電位はほぼ中性付近になっている. したがって, α-CDE におい て観察された pSilencer の構造変化に複合体の ζ-電位も関与することが示唆さ れた. これらのことから, α-CDE は pSilencer の構造を B-form から C-form に 変化させ, より安定な複合体を形成するものと推察された. DNase I に対する α-CDE/pSilencer 複合体中の安定性を調べたところ, すべて のチャージ比 (0.5/1 ~ 100/1) において, pSilencer は安定に存在していた (Fig. 28). さらに, UV スペクトル法による検討から, α-CDE はモル比 (α-CDE/pSilencer) 10/1 ~ 20/1 (チャージ比 0.05/1 ~ 0.1/1 に相当) においても, pSilencer の分解を抑 制し, そのときのみかけの一次分解速度定数の値は, α-CDE 添加により上昇した (Table 4). このように, α-CDE/pSilencer 複合体が低チャージ比においても高い酵 素安定性を示したのは, pSilencer の構造変化, 複合体粒子の形態および複合体中 の pSilencer のコンパクション状態が関与したものと考えられる. すなわち, DNase I は B-form DNA の minor groove に結合することが報告されているが, 126-128) 上述したように, α-CDE は pSilencer のへリックス構造を B-form から C-form に変化させた. このことから, α-CDE との複合体形成による pSilencer の酵素安定性の増大効果に複合体形成に伴う DNA の構造変化の寄与が示唆さ れた. さらに, Murphy らは, カチオン性リポソームと DNA の複合体において - 63 - pDNA のコンパクションが強いとき, DNA 分解酵素からの分解が抑制されるこ と, 129) 加えて, Abdelhady らは デンドリマー (G4) と pDNA の複合体において, 球状の粒子が形成されたとき, pDNA のコンパクションが起こり, DNA 分解酵素 に対して高い抵抗性を示すことを報告している. 113) 本研究においても, α-CDE/pSilencer 複合体はチャージ比の増加に伴い, 球状粒子の形成や pSilencer の強いコンパクションが観察され (Figs. 26, 27), これらの報告を支持する結果が 得られた. 以上のことから, α-CDE による pSilencer の酵素安定性は, pSilencer の構造変化に伴い, 安定した粒子が形成されたためと推察された. α-CDE/pSilencer 複合体はチャージ比 100/1 まで細胞傷害性を示さなかったが, 200/1 以上では細胞傷害性が観察された. しかしながらこの結果は, 以前我々が 明らかにした α-CDE/pCMV-luc pDNA 複合体の NIH3T3 細胞における細胞傷害 性はチャージ比 200/1 においても認められないという結果 119) と一致しなかっ た. この原因として, α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径の違いが考えられる. 一般 に非ウイルスベクター/pDNA 複合体の粒子径が 80 ~ 200 nm において遺伝子導入 効率が高いことが報告されている. 粒子径は約 480 nm に対し, 119) 110, 111) 一方, α-CDE/pCMV-luc pDNA 複合体の α-CDE/pSilencer 複合体の粒子径は約 80 nm であ った (Fig. 25). このことから, 本実験条件で認められた α-CDE/pSilencer 複合体 による比較的高い細胞傷害性は, 小さな粒子径に起因する可能性が示唆された. α-CDE/pSilencer 複合体の遺伝子発現抑制効果をルシフェラーゼ遺伝子一過性お よび安定発現細胞株を用いて評価した. これらの細胞において, α-CDE/pSilencer 複合体は siGL2 系による非特異的な抑制効果は観察されず, siGL3 系でのみ配列 特異的な遺伝子発現抑制効果が観察された (Figs. 31-33). 一方, トランスフェクシ ョン実験を行った条件では, この複合体による細胞傷害性は観察されなかったこ とから, α-CDE/pSilencer 複合体は RNAi 効果を誘導していることが示唆された (Fig. 30). しかしながら, コントロールに対するルシフェラーゼ遺伝子の抑制率は 低く, 一過性発現細胞においては約 40%, 安定発現細胞においては約 50% 前後で あった. この不十分な遺伝子発現抑制効果の原因の 1 つとして α-CDE と pSilencer との強い相互作用が考えられる. 通常, 非ウイルスベクターによる pDNA のコンパクションは遺伝子発現を増大させることが報告されている. 130) 一方, Bielinska らはカチオン性ポリマーと pDNA との強固な複合体形成は逆に遺 - 64 - 伝子発現を低下させることを報告している. 123, 131) α-CDE/pSilencer 複合体におい て, α-CDE は添加量依存的に pSilencer のコンパクションを誘起し, 粒子径約 80 nm のナノサイズの複合体を形成した (Figs. 25-27). したがって, α-CDE/pSilencer 複合体の不十分な遺伝子発現抑制効果は, 複合体中の pSilencer を強くコンパクシ ョンさせることにより, 核移行後のキャリアと pDNA との解離が抑制され, siRNA の転写効率を低下させたためと推察された. さらに, 我々は以前, α-CDE/pDNA 複合体を A549 細胞にトランスフェクション後, それら複合体の核移行性は低い ことを明らかにした. 119) 前述の通り, pSilencer による RNAi 効果発現には核移行 性が必要であることから, α-CDE/pSilencer 複合体の不十分な遺伝子発現抑制効果 のもう 1 つの要因として α-CDE の核移行性の欠如も関与することが推察された. α-CDE/pSilencer 複 合 体 に さ ら に siRNA を 添 加 し た 3 成 分 系 複 合 体 (pDNA/siRNA/α-CDE) を用いることで遺伝子発現抑制効果の増大が観察された (Fig. 34). 前述のとおり, pSilencer による RNAi 効果発現には核移行が必要となる が, それ自身が活性体である siRNA は作用部位が細胞質であるため, その必要が ない. さらに, Fig. 20 の結果から, α-CDE および siRNA は細胞質に局在するこ とから, α-CDE による遺伝子発現抑制効果増大にそれら複合体の細胞内動態が関 与することものと考えられる. しかしながら, siRNA 濃度 50 nM 以上では非特異 的な遺伝子発現抑制効果が観察された (Fig. 34). Sledz らは高濃度の siRNA は インターフェロン応答に関連するタンパク質の発現レベルを上げることを報告し ている. 28) したがって, 50 nM 以上の siRNA 濃度で認められた非特異的な遺伝子 発現抑制効果は, pSilencer から転写された siRNA に加え, 別に添加した siRNA による細胞内での急激な濃度上昇により, インターフェロン応答が誘導された可 能性が考えられるが, 今後詳細な検討が必要である. これらのことから, 3 成分系 複合体系においてより優れた遺伝子発現抑制効果を発現させるためには, siRNA 濃 度の適切な調節が必要であることが示唆された. 以上のことから, α-CDE は pSilencer の構造変化を誘導し, ナノサイズの安定な 複合体を形成すること, 配列特異性な遺伝子発現抑制効果を示すこと, さらにその 効果は siRNA を添加した 3 成分系複合体により増大することが明らかとなった. - 65 - 第 7 節 小括 本章では, shRNA 発現ベクター (pSilencer) を用いて, α-CDE と pSilencer との 相互作用, α-CDE/pSilencer 複合体の物理化学的性質ならびに遺伝子発現抑制効 果について検討した. 以下に得られた主な知見を要約する. 1) α-CDE と pSilencer との相互作用をアガロースゲル電気泳動法により検討し た結果, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 において pSilencer に由来するバン ドの消失が観察された. このことから, チャージ比 1/1 付近で複合体の電荷 が中性または正に傾くことが示唆された. 2) α-CDE/pSilencer 複合体はチャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 で約 160 nm の粒 子径を与えたが, それ以上のチャージ比では 80 nm サイズの安定した粒子の 形成が確認された. また, 複合体の ζ-電位はチャージ比 1/1 付近で中性を示 し, それ以上で正の値を示した. 3) α-CDE と pSilencer との相互作用を CD スペクトル法にて検討した結果, pSilencer 単独では B-form を形成したが, α-CDE の添加量に依存して C-form への構造変化が確認された. また, UV スペクトル変化から α-CDE と pSilencer 複合体中の pSilencer 由来の吸光度は α-CDE の添加量の増加に伴い 低下した. 4) α-CDE/pSilencer 複合体の形態変化を透過型電子顕微鏡にて観察した結果, チ ャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 において, 凝集体の形成が観察されたが, 10/1 では溶液中に分散した球状粒子を形成することが示唆された. 5) α-CDE/pSilencer 複合体中の pSilencer のコンパクション状態を蛍光法により 検討した結果, α-CDE の添加量に依存して pSilencer のコンパクションが観察 された. - 66 - 6) α-CDE/pSilencer 複合体の DNase I に対する安定性をアガロースゲル電気泳動 にて検討した結果, いずれのチャージ比においても α-CDE/pSilencer 複合体は DNase I による分解を抑制した. また, UV 法にて DNase I に対する α-CDE の抑制効果を検討したところ, α-CDE/pSilencer 複合体は DNase I による分解 速度を低下させることが示唆された. 7) NIH3T3-luc 細胞における α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性を WST-1 法 を用いて検討したところ, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 100/1 まで細胞傷害 性が観察されなかった. 8) ルシフェラーゼ遺伝子一過性細胞において α-CDE/pSilencer 複合体は 配列特 異的な遺伝子発現抑制効果を示した. 同様に, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現 細胞においても, この複合体は配列特異的な RNAi 効果を誘導した. 9) NIH3T3-luc 細胞における α-CDE/pSilencer 複合体の遺伝子発現抑制効果は, siRNA を添加した 3 成分系複合体 (pSilencer/siRNA/α-CDE) により増大した. しかしながら, siRNA 濃度 50 nM 以上では非特異的な抑制効果が観察された. このことから, 3 成分系複合体においてより優れた遺伝子発現抑制効果を発現さ せるためには, siRNA 濃度の適切な調節が必要であることが示唆された. 以上述べたように, α-CDE は pSilencer とナノサイズの安定な複合体を形成し, 配列特異的な抑制効果を示すこと, その効果は siRNA を添加した 3 成分系複合 体においてさらに増大することが明らかとなった. しかしながら, α-CDE/pSilencer 複合体による効果的な抑制効果には pSilencer の核移行性が重要であり, α-CDE の 特性から, 細胞質で作用させる siRNA を用いた場合の方が, 高い抑制効果が期待 できる. そこで, 次章では, siRNA キャリアとしての α-CDE の有用性について検 討した. - 67 - 第 3 章 siRNA 導入用キャリアとしての α-CDE の有用性評価 第 1 節 序 前章までの検討より, α-CDE は shRNA 発現ベクターと安定な複合体を形成し, 配列特異的な遺伝子発現抑制効果を有することが明らかとなった. しかしなが ら, α-CDE は細胞質に局在するという特徴を有することから, 核移行性が必要な shRNA ベクターよりも, 細胞質で直接 RNAi 効果を発現する siRNA を用いた 方が高い抑制効果が期待できるものと考えられる. siRNA の細胞へのデリバリーは, 遺伝子および shRNA と同様に, 多くのバリ アを突破・回避していく必要がある. Fig. 35 に考えられるその代表的なバリア を示す. 中でも, siRNA による RNAi 効果は細胞質中に存在する RISC へ取り 込まれることにより発現するため, siRNA デリバリーでは細胞質に siRNA を長 時間安定に局在させることが重要である. 加えて, 細胞傷害性, インターフェロ ン応答, オフ・ターゲット効果を低く抑えつつ, より多くの siRNA を細胞に導入 することがより効果的な遺伝子発現抑制効果を発現するために必要と考えられ る. siRNA デリバリーに用いられるキャリアとしては, ペプチド, ン性リポソーム 37) やカチオン性ポリマー 38-40) 42, 132, 133) カチオ 42, 43) との複 ならびにタンパク質 合体などが報告されている. 緒言でも述べたように, これらの中でもカチオン性 リポソームを使用した報告例は多く, L2 や Oligofectamine™ れ て い る キ ャ リ ア で あ り , HuSiDa 46, 47) (Human は最も汎用さ siRNA Database (http://itb.biologie.hu-berlin.de/~nebulus/sirna/v2/)) によるデータベースによると L2 および Oligofectamine™ を siRNA へ応用した例として, それぞれ約 180 件およ び約 470 件登録されている. しかしながら, カチオン性リポソームをマウスに 投与した場合, 細胞傷害性や全身的な免疫反応を惹起することや, 49) siRNA 単独 では起こさなかったインターフェロン応答をカチオン性リポソームとの複合体形 成により誘導することが報告されている. 84) 一方, カチオン性ポリマーを用い た siRNA デリバリーに関する報告はカチオン性リポソームに比べると極めて少 ないが, 前者は細胞傷害性が低く全身投与系においても免疫反応を惹起しないた - 68 - め, より安全性の高いキャリアとして期待されている. 例えば, Hu-Lieskovan ら はユーイング肉腫を移植したマウスに β-CyD を含むカチオン性ポリマーと siRNA の複合体を静脈内投与したところ, インターフェロン応答を起こすこと なく, 腫瘍の成長を抑制することを報告している. 134) 一方, 我々が開発した α-CDE はチャージ比 (α-CDE/pDNA) 200/1 以下まで細胞傷害性を示さないこと, 68, 119) α-CDE/pDNA 複合体 (pDNA 20 μg, チャージ比 20/1) をマウスに尾静注 した血液生化学的パラメーター (AST, ALT, BUN, CRE, LDH) はコントロール群 と変わらないことが示されている. 135) さらに, カチオン性ポリマーの中でも PAMAM デンドリマーの細胞傷害性は極めて低いことが報告されている. 102) こ れらの知見は, α-CDE が in vivo での応用可能なキャリアであることを示唆する ものである. 一方, 前述したように, siRNA キャリアに関する報告は数多くされているもの の, それぞれ異なるキャリアを用いた場合の RNAi 効果を比較した報告例は少 ない. 78) そこで本章では, siRNA 用キャリアとしての α-CDE の有用性を汎用性 の高い L2, RNAi 用キャリアとして市販されている RNAiFect™ (RF) およびカ チオン性ポリマーの中で最も汎用されている PEI の場合と in vitro および in vivo において比較した. まず, α-CDE と siRNA の相互作用ならびにその複合 体の物理化学的性質について検討した. また, これら複合体の安全性に関する知 見を得るため, 2 成分系複合体の細胞傷害性, 溶血活性ならびに細胞傷害性機構 について検討した. 次に, ルシフェラーゼ遺伝子一過性および安定発現細胞を用 いて, キャリアと siRNA からなる 2 成分系複合体のルシフェラーゼ遺伝子発現 抑制効果について検討し, 市販キャリア複合体の場合と比較した. また, 内因性 遺伝子として RNAi 研究において汎用される Lamin A/C および Fas に対する siRNA を用い, 2 成分系複合体の遺伝子発現抑制効果について検討した. 次に, α-CDE 複合体と市販キャリア複合体の RNAi 効果発現の違いを, FITC-siRNA を用いて, その細胞内取り込みおよび細胞内分布を比較した. さらにルシフェラ ーゼ遺伝子安定発現細胞を移植した担癌マウスを用いて, 2 成分系複合体の in vivo RNAi 効果について検討した. 以下に得られた結果を詳述する. - 69 - siRNA (ca. 21-27 mer) 1) siRNA stability 2) Cellular binding Cell 3) Cellular uptake Nucleus DNA 4) Endosomal escape mRNA Transcription 5) Dissociation from carrier complex 6) Incorporation into RISC AAAAA RISC AAAAA 7) Interaction with target mRNA AAAAA 8) Cleave target mRNA Gene silencing AAAAA mRNA Degradation Fig. 35. Biopharmaceutical Requirements for the Cellular Delivery and Activity of siRNA 第 2 節 2 成分系複合体の物理化学的性質 キャリア/siRNA 複合体の物理化学的性質は siRNA の導入効率に影響を与え る重要な因子である. 例えば, Grayson らは, PEI/siRNA 複合体における siRNA の導入効率は, 粒子径, ζ-電位, siRNA との親和性に左右されることを報告してい る. 136) そこで本節では, α-CDE/siRNA 複合体の基礎的物性を検討した. 第 1 項 2 成分系複合体形成 本項では, キャリアと siRNA との相互作用をアガロースゲル電気泳動法にて 検討した. Fig. 36 は, siRNA にチャージ比 (α-CDE/siRNA), 容量比 (L2/siRNA, RF/siRNA) が 0.1/1 ~ 10/1 になるように各種キャリアを添加後, 室温で 15 分間 - 70 - インキュベートしたサンプルを EtBr 含有 2% アガロースゲルにて電気泳動を 行った結果を示す. α-CDE を用いた場合, チャージ比依存的に siRNA のバン ドは薄くなり, チャージ比 1.5/1 以上で完全に消失した. PEI, L2 および RF に おいてはチャージ比および容量比がそれぞれ, 2/1 以上で siRNA のバンドが消 失した. これらのことから, α-CDE および市販キャリアは siRNA と相互作用し, 複合体を形成することが示唆された. 0.1 Charge ratio of α-CDE/siRNA 0.5 1.0 1.5 2.0 5.0 α-CDE Charge ratio of PEI/siRNA 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 10 PEI 0.1 Volume ratio of L2/siRNA 0.5 1.0 2.0 5.0 10 0.1 Volume ratio of RF/siRNA 0.5 1.0 2.0 5.0 10 L2 RF Fig. 36. Effects of Carriers on Electrophoretic Mobility of siRNA The amount of siRNA was 0.5 μg. Twenty micro molar of siRNA solution was used. These figures show representative data for three experiments. 第 2 項 2 成分系複合体の粒子径ならびに ζ-電位 次に, キャリア/siRNA 複合体の粒子径ならびに ζ-電位について検討した. α-CDE/siRNA 複合体の粒子径は, チャージ比 (α-CDE/siRNA) が増大してもほと - 71 - んど変わらず, 平均約 220 nm の値を示した (Fig. 37A). また, この複合体の ζ電位はチャージ比の増加に伴い増大し, 培養細胞にトランスフェクションする時 の条件であるチャージ比 20/1 においては正の ζ-電位を示した (Fig. 37B). 一方, 市販キャリアにおいては, 推奨プロトコールに準じて調製したにもかかわらず, L2 および RF 複合体では, 容量/質量比 (L2/siRNA, RF/siRNA) がそれぞれ 3.75/1 および 3/1 のとき, それぞれ粒子径約 350 nm および 690 nm と α-CDE 複合体よりも大きな値を示した (Table 5). また, それら複合体の ζ-電位は負の 値を示した. 通常, 哺乳類の細胞形質膜表面にはヘパラン硫酸プロテオグリカン が広範に存在し, 細胞表面は負に帯電しているため, 137, 138) 複合体の電荷が負の 場合, 細胞膜との相互作用は弱いことが予想される. しかしながら, L2 および RF 複合体の容量/質量比がそれぞれ 7.5/1 および 6/1 では, 200 nm 以下の粒子 径を示し, ζ-電位もそれぞれ中性および正の値を示した (Table 5). これらのこと から, 2 成分系複合体形成能はほとんど変わらないにもかかわらず (Fig. 36), こ れら複合体の物理化学的性質はキャリア間で大きく異なることが示唆された. (B) 300 20 250 15 ζ-Potential (mV) Particle size (nm) (A) 200 150 100 10 5 0 -5 50 -10 0 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 Charge ratio (α-CDE/siRNA) Charge ratio (α-CDE/siRNA) Fig. 37. Particle Sizes (A) and ζ-Potentials (B) of Binary Complexes of α-CDE/siRNA in Tris-HCl Buffer (10 mM, pH 7.4) Particle size and ζ-potential of binary complexes were measured by Zetasizer nano. The siRNA concentration was 100 nM. Each point represents the mean ± S.E. of 3 experiments. - 72 - Table 5. Particle Sizes and ζ-Potentials of Binary Complexes of Carriers/siRNA in Tris-HCl Buffer (10 mM, pH 7.4) Binary complex Particle size (nm) ζ-Potential (mV) α-CDE/siRNA (1/1) 219 ± 21.6 -6.4 ± 0.9 α-CDE/siRNA (20/1) 232 ± 42.6 13.0 ± 2.3 L2/siRNA (3.75/1) 355 ± 15.0 *† L2/siRNA (7.5/1) 162 ± 7.0 RF/siRNA (3/1) 692 ± 26.1 *† RF/siRNA (6/1) 189 ± 22.5 -17.0 ± 4.1 2.2 ± 3.9 -11.5 ± 1.7 27.1 ± 2.3 Particle size and ζ-potential of binary complexes were measured by Zetasizer nano. The siRNA concentration was 100 nM. Each value represents the mean ± S.E. of 3 experiments. The number in parenthesis stands for the charge ratio of α-CDE/siRNA and the volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA. *p<0.05, compared with α-CDE system (charge ratio of 1/1). †p<0.05, compared with α-CDE system (charge ratio of 20/1). 第 3 項 2 成分系複合体の安定性におよぼす血清の影響 次に, α-CDE/siRNA からなる 2 成分系複合体の安定性におよぼす FCS の影 響について検討した. Fig. 38 から明らかなように, α-CDE 複合体の場合, チャ ージ比 (α-CDE/siRNA) が増大するに伴い, siRNA 由来のバンドが観察され, 特 にチャージ比 20 以上で強いバンドが観察された. このことから, α-CDE/siRNA 複合体は, 血清存在下, 安定に存在することが示唆された. - 73 - on e RN A si Ma rk er al Charge ratio (α-CDE/siRNA) 1 2 5 10 20 50 Fig. 38. Stability of siRNA in Binary Complexes of α-CDE/siRNA after Treated with 50% FCS for 5 h at 37˚C The amount of siRNA was 0.5 μg. These figures show representative data for three experiments. 第 3 節 2 成分系複合体の細胞傷害性 第 1 項 細胞生存率と溶血活性 第 2 章において述べたように, キャリア/siRNA 複合体の細胞傷害性は siRNA による配列特異的な遺伝子発現抑制効果の発現に悪影響を与える. L2 においては, その複合体だけでなく, L2 単独でも高い細胞傷害性を惹起すること が報告されている. 78) さらに, 第 2 節で示したように, 本実験で用いたキャリア /siRNA からなる 2 成分系複合体の物性はキャリアの種類により異なるため, 2 成分系複合体の細胞傷害性は複合体で異なることが考えられる. そこで本節で は, 2 成分系複合体の細胞傷害性を WST-1 法により評価した. Fig. 39 は NIH3T3 および NIH3T3-luc 細胞に siRNA の濃度を一定にし, チ ャージ比の異なる α-CDE/siRNA 複合体をトランスフェクション 24 時間後の細 胞生存率を算出した結果を示す. 両細胞において, α-CDE/siRNA 複合体のチャ ージ比 (α-CDE/siRNA) 100/1 まで細胞生存率は 100% を示した (Figs. 39A, B). しかしながら, それ以上ではチャージ比依存的な細胞生存率の低下が観察され, これら複合体による細胞傷害性が推察された. PEI/siRNA 複合体は, チャージ比 10/1 までは細胞傷害性を示さなかったが, それ以上では細胞生存率を低下させ た (Figs. 39A, B). 一方, L2/siRNA 複合体では容量/質量比 (L2/siRNA) 3.75/1 で - 74 - 細胞傷害性は示さなかったものの, 7.5/1 以上では細胞生存率が低下した (Figs. 39C, D). RF においては容量/質量比 (RF/siRNA) 6/1 までは細胞傷害性を示さな かったが, それ以上では細胞傷害性が観察された (Figs. 39C, D). 次に, 2 成分系複合体の細胞傷害性をウサギ赤血球を用いた溶血活性を指標に 検討した. 本測定法は, キャリアと細胞膜との相互作用により惹起される細胞傷 害性を赤血球中に存在するヘモグロビンの漏出量により定量的に測定することが できる. 139) また, 本法では, 細胞系とは異なり, 高濃度領域における細胞傷害性 が測定可能なため, 高投与量が予想される in vivo 条件での細胞傷害性を間接的 に評価することができる. そこで, 2 成分系複合体の細胞傷害性を本法により 評価した. 実験は, 各種キャリアからなる 2 成分系複合体溶液にウサギ赤血球 溶液を添加し, 37˚C で 30 分間インキュベート後, 漏出したヘモグロビンの吸光 度を測定した. Fig. 40A に示すように, α-CDE 複合体は α-CDE の添加量を増 大させても, 全く溶血活性を示さなかった. 一方, PEI および L2 複合体では低 濃度および低容量/質量比から溶血活性が見られた (Figs. 40A, B). Fig. 40C は in vivo における投与量 (Fig. 57 参照), すなわち siRNA 10 μg に対して, α-CDE, PEI のチャージ比 (carrier/siRNA) および L2 の容量/質量比 (L2/siRNA) が 20/1, 5/1 および 3.75/1 になるように添加した際の結果を示す. ポリマー系キャリア である α-CDE および PEI 複合体は溶血活性を示さなかったが, L2/siRNA 複合 体では約 30% の溶血活性を示した. これらのことから, 脂質系キャリアに比べ てポリマー系キャリアの安全性は高く, 特に α-CDE からなる 2 成分系複合体 の細胞傷害性は極めて低いことが示唆された. Fig. 41 は 2 成分系複合体をトランスフェクション後のインターフェロン応答 に関与する IFN-β および TNF-α mRNA の発現を RT-PCR にて検討した結果 を示す. いずれのキャリアを用いても, IFN-β および TNF-α mRNA の誘導は観 察されなかった (Fig. 41). これらの結果から, α-CDE/siRNA 複合体の細胞傷害性は市販キャリアに比べて 極めて低いこと, またこれら複合体は本実験条件下, インターフェロン応答を惹 起しないことが示された. したがって以下の実験では, これら複合体が細胞傷害 性を惹起しないチャージ比 (α-CDE/siRNA : 20/1, PEI/siRNA : 5/1), 容量/質量比 (L2/siRNA : 3.75/1, RF/siRNA : 6/1) を用いて検討した. - 75 - (A) NIH3T3 (B) NIH3T3-luc 140 120 Cell viability (%) Cell viability (%) 140 : α-CDE/siRNA 100 : PEI/siRNA 80 60 40 120 : α-CDE/siRNA 100 20 : PEI/siRNA 80 60 40 20 0 0 0 200 400 600 800 0 Charge ratio of Carrier/siRNA 200 140 140 120 120 100 100 Cell viability (%) (D) NIH3T3-luc Cell viability (%) 600 800 Charge ratio of Carrier/siRNA (C) NIH3T3 80 60 80 60 40 40 20 20 0 0 Volume to amount Volume to amount ratio of L2/siRNA ratio of RF/siRNA /1 40 /1 20 /1 10 1 6/ 1 3/ /1 75 /1 .5 37 /1 .5 18 1 5/ 7. /1 75 3. 1 0/ 20 1 0/ 10 /1 50 /1 20 /1 10 1 1/ /1 40 /1 20 /1 10 1 6/ 1 3/ /1 75 /1 .5 37 /1 .5 18 1 5/ 7. /1 75 3. 1 0/ 20 1 0/ 10 /1 50 /1 20 /1 10 1 1/ Charge ratio of α-CDE/siRNA 400 Charge ratio of α-CDE/siRNA Volume to amount Volume to amount ratio of L2/siRNA ratio of RF/siRNA Fig. 39. Cytotoxicity of Binary Complexes of Carriers/siRNA in NIH3T3 and NIH3T3-luc Cells Cells were transfected with binary complexes for 24 h. The cell viability was assayed by the WST-1 method. The siRNA concentration was 100 nM. Each point represents the mean ± S.E. of 4 experiments. - 76 - (B) 120 100 100 80 Hemolysis (%) Hemolysis (%) (A) 80 60 : α-CDE/siRNA 40 : PEI/siRNA 20 60 40 20 0 0 0 5 10 15 20 25 0 30 200 400 600 800 Volume to amount ratio of L2/siRNA (μL/μg) Carrier (μg/μL) (C) Hemolysis (%) 100 75 50 * 25 L2 NA iR NA si R A RN I/s /s i PE E/ CD α- S PB 0 Fig. 40. (A, B) Hemolytic Activity of Binary Complexes of Carriers/siRNA on Rabbit Erythrocytes in Isotonic Phosphate Buffer (pH 7.4) at 37˚C The rabbit erythrocyte suspension (50 μL) was added to the buffer solution (250 μL) containing binary complexes of carriers/siRNA at various concentrations. The mixture was incubated for 30 min at 37˚C, and then centrifuged at 1,000 x g for 5 min. The release of hemoglobin from the cell was measured spectrophotometrically at 540 nm. Results were expressed as percentages of the total efflux of hemoglobin obtained when water was used instead of the buffer solution. Each point represents the mean ± S.E. of 3-6 experiments. (C) Hemolytic Activity of Binary Complexes of Carriers/siRNA Under In Vivo Experimental Conditions on Rabbit Erythrocytes in Isotonic Phosphate Buffer (pH 7.4) at 37˚C The amout of siRNA was 10 μg. The charge ratios of α-CDE/siRNA and PEI/siRNA were 20/1 and 5/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/siRNA was 3.75/1. Each value represents the mean ± S.E. of 4-5 experiments. *p<0.05, compared with PBS. - 77 - L2 RF I PE CD E α- I: C Po ly IFN-β (312 bp) TNF-α (325 bp) β-actin (630 bp) Fig. 41. Effects of Various Carriers on Expression of IFN-β and TNF-α mRNA in NIH3T3-luc Cells after Transfection of Binary Complexes Cells were transfected with binary complexes of carriers/siRNA for 24 h. After that, the total RNA ectracted from cells was subjected to RT-PCR. The concentration of siRNA was 100 nM. The charge ratios of α-CDE/siRNA and PEI/siRNA was 20/1 and 5/1, respectively. The volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA were 3.75/1 and 6/1, respectively. The cycle number of PCR was 25. These figures show representative data for three experiments. 第 2 項 2 成分系複合体の細胞傷害性機構 キャリア/核酸複合体によって誘導される細胞死を解明することは, 核酸デリ バリーにおいて生体適合性に優れるキャリアの設計に有益な情報をもたらす. 一般に, PEI や PAMAM デンドリマーなどのカチオン性ポリマーと pDNA との 複合体による細胞死はネクローシス, 118) カチオン性リポソームによる細胞死は アポトーシスであることが報告されている. 117) このように, キャリア/pDNA 複 合体による細胞傷害性機構は明らかになってきているものの, siRNA 複合体によ る細胞傷害性機構については未だ不明な点が多い. そこで本節では, キャリアと siRNA からなる 2 成分系複合体のキャリアの違いによる細胞死の機構解明を企 図して以下の検討を行った. キャリア/siRNA 複合体による細胞死がアポトーシスか否かを DNA の断片化 を指標に検討した. Fig. 42 は各キャリアからなる 2 成分系複合体をトランス フェクション 24 時間後の NIH3T3-luc 細胞をヨウ化プロピジウム (PI) で染色 後, DNA 含量をフローサイトメトリーで解析した結果を示す. PI は膜構造が保 - 78 - たれている場合には細胞膜を通過できないが, エタノール処理等で膜透過性を上 昇させると細胞内に浸透後, 核内へ移行し DNA の二重らせんに intercalate して 蛍光を発するため, 蛍光強度から DNA 含量をフローサイトメトリーで捉えるこ とができる. また, アポトーシスが誘導され DNA が断片化した細胞をエタノ ール処理などで膜透過性を上昇させると, 断片化された DNA は細胞膜から漏出 するため, DNA 含量が低下した細胞をアポトーシス細胞と見なすことができる. 本実験では, 細胞死の機構を明らかにするため, 細胞傷害性が惹起されるチャー ジ比 (α-CDE/siRNA ; 800/1, PEI/siRNA ; 500/1), 容量/質量比 (L2/siRNA ; 37.5/1, RF/siRNA ; 20/1) を用いて行なった. ポリマー系のキャリアである α-CDE およ び PEI 複合体で処理した場合, 蛍光強度の割合および G0 あるいは G1 期にお ける DNA 含量は未処理コントロールのものと変わらなかった (Figs. 42A, B). 一方, 脂質系キャリアである L2 および RF 複合体においては, 未処理コントロ ールのものと比較して DNA 含量の低下が認められた (Figs. 42A, B). アポトーシス細胞から DNA を抽出しアガロースゲル電気泳動を行うと, DNA 断片化に伴いオリゴヌクレオソーム単位 (約 180 塩基対) の整数倍の DNA ladder のバンドが検出されることが知られている. 140) Fig. 43 は 2 成分系複合 体をトランスフェクション 24 時間後の NIH3T3-luc 細胞を可溶化後, RNase お よび Proteinase 処理し, アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す. α-CDE および PEI 複合体をトランスフェクションした場合, 未処理コントロールの場 合と同様に DNA ladder は検出されなかった (Fig. 43). 一方, L2 および RF 複 合体で処理した場合, DNA ladder が検出され, DNA の断片化が起こっていること が確認された (Fig. 43). これらのことから, ポリマー系キャリアおよび脂質系キ ャリアによる細胞死はそれぞれ, ネクローシスおよびアポトーシスであることが 示唆された. - 79 - (A) α-CDE Control PEI L2 RF (B) Hypodiploid nuclei (%) = R2/R1 X 100 Hypodiploid nuclei (%) 50 * 40 * 30 20 10 0 C o tr on α- C D E PE I L2 R F Fig. 42. (A) Flow Cytometric Analysis of DNA Content in NIH3T3-luc Cells (B) Effects of Binary Complexes of Carriers/ siRNA on Apoptosis of NIH3T3-luc Cells NIH3T3-luc cells were treated with binary complexes of carriers/siRNA. After incubation for 24 h, cells were stained by PI, and the percentage of cells showing DNA degradation was quantified by flow cytometry. The charge ratios of αCDE/siRNA and PEI (MW 10,000)/siRNA were 800/1 and 500/1, respectively. The volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA were 37.5/1 and 20/1, respectively. *p<0.05, compared with control. These figures show representative data for three experiments. l - 80 - RF L2 I PE αCD E ll Ce Ma rk er Fig. 43. Agarose Gel Electrophoresis of DNA Extracted from NIH3T3-luc Cells Treated with Binary Complexes of Carriers/siRNA NIH3T3-Luc cells were treated with binary complexes of carriers/siRNA. After incubation for 24 h, cells were lysed, and then analyzed DNA fragmentation by gel electrophoresis. The charge ratios of α-CDE/siRNA and PEI (MW 10,000)/siRNA were 800/1 and 500/1, respectively. The volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA were 37.5/1and 20/1, respectively. These figures show representative data for three experiments. 第 4 節 一過性遺伝子発現細胞における siRNA 複合体の遺伝子発現抑制効果 第 1 項 α-CDE との複合体化の影響 siRNA は遺伝子と同様に, 水溶性の高分子ポリマーであり細胞膜透過性が低い ことから, RNAi 効果発現にはキャリアを用いる必要がある. 本項では, α-CDE/siRNA 複合体による遺伝子発現抑制効果をルシフェラーゼ遺伝子一過性 発現細胞において検討した. 実験は, α-CDE/pGL3 複合体を細胞にトランスフェクション 1 時間後に siRNA 単独あるいは α-CDE/siRNA 複合体を添加 23 時間後のルシフェラーゼ 活性を測定することにより行った. Fig. 44 に示すように, siRNA 単独で NIH3T3 細胞にトランスフェクションしても遺伝子発現抑制効果を示さなかった が, α-CDE/siRNA 複合体では, siGL3 による配列特異的な遺伝子発現抑制が観察 された. これらのことから, α-CDE は siRNA による RNAi を誘導できること - 81 - が示された. Luciferase activity (RLU/μg protein) X 106 5 2.5 *† 0 Co nt ro si G l L2 si G L3 Fig. 44. Inhibitory Effects of Post-transfection of Binary Complexes of α-CDE/siGL3 on Luciferase Activity in NIH3T3 Cells Transiently Expressing Luciferase Gene : α-CDE/siRNA complex. : siRNA, Cells were transfected with α-CDE/pGL3 complexes for 1 h, and then washed with medium at twice. Thereafter, the cells were secondary transfected with siRNA or binary complexes of αCDE/siRNA and incubated for 23 h. The charge ratios of α-CDE/pGL3 and α-CDE/siRNA were 100/1 and 20/1, respectively. The concentration of siRNA was 100 nM. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. 第 2 項 α-CDE/siRNA 複合体のチャージ比の影響 前項において, α-CDE は siRNA との 2 成分系複合体においても RNAi 効 果を発現することが確かめられた. 我々は以前の検討において, α-CDE/核酸複合 体の遺伝子導入効率はチャージ比の増加に伴い増大することを明らかにした. 68) 67, そこで本項では, 遺伝子発現抑制効果におよぼす α-CDE/siRNA 複合体のチ ャージ比の影響について検討した. α-CDE/siRNA 複合体はチャージ比 (α-CDE/siRNA) 1/1 においても遺伝子発 現抑制効果を示し, 20/1 において約 75% の抑制率を示した (Fig. 45). しかしな がら, それ以上のチャージ比 (> 50/1) においては, 抑制効果は減少した. これら のことから, α-CDE/siRNA 複合体による遺伝子発現抑制効果に至適チャージ比が 存在することが示唆された. - 82 - Luciferase activity (%) 100 75 * 50 * * 50 100 * *† 25 0 l ro nt Co 1 10 20 Charge ratio (α-CDE/siRNA) Fig. 45. Effects of Charge Ratio of Binary Complexes of α-CDE/siGL3 on Luciferase Activity in NIH3T3 Cells Pre-transfected with the α-CDE/pDNA Complexes Cells were transfected with α-CDE/pGL3 complexes for 1 h, and then washed with medium at twice. Thereafter, the cells were secondary transfected with binary complexes of α-CDE/siRNA and incubated for 23 h. The amounts of pDNA and siRNAs were 2.0 μg and 0.7 μg, respectively. The charge ratio of α-CDE/pGL3 was 100/1. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with other charge ratios. 第 5 節 ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞における 2 成分系複合体の遺伝子 発現抑制効果 内因性遺伝子は染色体からの発現により行われることから, レポーター遺伝子 を用いて 2 成分系複合体の RNAi 効果を実際の条件に近づけて評価するために は, レポーター遺伝子安定発現系を用いる必要がある. そこで本節では, ルシ フェラーゼ遺伝子安定発現細胞 (NIH3T3-luc 細胞および Colon26-luc 細胞) を 用いて, その 2 成分系複合体の RNAi 効果を検討した. 第 2 章第 4 節と同様の方法で構築した. Colon26-luc 細胞は, α-CDE/siRNA 複合体は NIH3T3-luc および Colon26-luc 両細胞において siGL3 による配列特異的な遺伝子発現抑制 効果を示した (Figs. 46A, B). また, その抑制効果はチャージ比 (α-CDE/siRNA) 依存的に増大し, 20/1 において最も高い値を示した (Fig. 47). しかしながら, そ - 83 - れ以上のチャージ比 (>20/1) においては siGL2 による非特異的な抑制効果が観 察された. これらのことから, 2 成分系複合体はルシフェラーゼ遺伝子安定発現 系に対しても配列特異的な遺伝子発現抑制効果を示し, さらに一過性発現系と同 様に効果的な遺伝子発現抑制効果に複合体の至適チャージ比が存在することが示 唆された. (B) Colon26-luc (A) NIH3T3-luc 120 Luciferase activity (%) Luciferase activity (%) 150 125 100 75 *† 50 25 0 C αon CD α-CD tro E/ siG E/siG l L2 L3 100 80 *† 60 40 20 0 C ααC C on tro DE/ DE/ siG si l L2 GL3 Fig. 46. Inhibitory Effects of Binary Complexes of α-CDE/siRNA on Luciferase Activity in Cells Stably Expressing Luciferase Gene (NIH3T3-luc (A) and Colon26-luc Cells (B)) Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after transfection with binary complex. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. The siRNA concentration was 100 nM. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. - 84 - Luciferase activity (%) 120 100 * * * 80 *† * * 60 40 20 0 0 1 10 20 50 Charge ratio (α-CDE/siRNA) 100 Fig. 47. Effects of Charge Ratio of α-CDE/siGL3 Complexes on Luciferase Activity in NIH3T3-luc Cells : α-CDE/siGL3. : α-CDE/siGL2, Luciferase activity in cell lysates was determined 24 h after transfection with binary complex. The siRNA concentration was 100 nM. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with charge ratio of 0. †p<0.05, compared with α-CDE/siGl2. 第 6 節 α-CDE と市販キャリアとの siRNA の遺伝子発現抑制効果の比較 次に, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞における 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) の遺伝子発現抑制効果を市販キャリアである L2 および RF, さ らにカチオン性ポリマーである直鎖型 PEI (L-PEI, MW 10,000) を用いた場合と 比較検討した. 前述したように, L2 は遺伝子および siRNA キャリアとして汎 用されている試薬である. 一方, RF は QIAGEN より発売されているカチオン 性リポソームの siRNA キャリアである. また, PEI はカチオン性ポリマーの中 で遺伝子および siRNA キャリアとして汎用されている. 37, 39, 56, 136) 通常, 分子 量の大きな PEI は細胞傷害性を示す 102, 141) ことから, 本実験では, L-PEI を用い た. Fig. 45 は NIH3T3-luc 細胞に各種キャリアからなる 2 成分系複合体をトラ ンスフェクション 24 時間後のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す. α-CDE/siRNA および RF/siRNA 複合体の場合, siGL3 による配列特異的な遺伝 子発現抑制効果が観察された (Fig. 48A, C). また, 有意差は認められないものの - 85 - 配列特異性を表す siGL3/siGL2 の比は α-CDE 複合体 (ratio : 1.95) が RF 複合 体 (ratio : 1.86) よりも大きな値を示した (data not shown). 一方, L2/siRNA 複合 体では, α-CDE 複合体よりも高い遺伝子発現抑制効果を示したが, 本実験条件下, 細胞傷害性がないにもかかわらず, siGL2 による非特異的な抑制効果が観察され た (Fig. 48B). さらに, PEI/siRNA 複合体において, 遺伝子発現抑制効果は観察 されなかった (Fig. 48D). これらの結果から, α-CDE/siRNA 複合体は市販キャリ ア複合体よりも優れた RNAi 効果を誘導することが明らかとなった. (B) 120 150 125 100 75 *† 50 25 0 C ααon CD CD tro E/ E/ l si si G GL L3 2 Luciferase activity (%) (D) (C) L2 100 * 80 60 40 *† 20 0 L2 L2 Co /s /s nt iG i ro G L3 L2 l Luciferase activity (%) α-CDE Luciferase activity (%) Luciferase activity (%) (A) RF 150 125 100 75 50 *† 25 0 C RF RF on /s /s tro iG iG L3 L2 l PEI 150 125 100 75 50 25 0 C P PE on I/s E I/s tro i iG l L2 G L3 Fig. 48. Inhibitory Effects of Binary Complexes of Carriers/siRNA on Luciferase Activity in Cells Stably Expressing Luciferase Gene (NIH3T3-luc Cells) Cells were transfected with binary complexes for 24 h. The charge ratios of α-CDE/siRNA and PEI/siRNA were 20/1 and 5/1, respectively. The volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA were 3.75/1 and 6/1, respectively. The concentration of siRNA was 100 nM. Each value represents the mean ± S.E. of 4 experiments. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. - 86 - 第 7 節 内因性遺伝子発現に対する 2 成分系複合体の抑制効果 これまでの検討では, レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの活性を指標に 検討を行ってきた. そこで本節では, 治療薬としての siRNA 複合体の可能性を 評価するため, 内因性遺伝子である Lamin A/C を標的として 2 成分系複合体の 遺伝子発現抑制効果を評価した. Lamin A/C は核膜を構成する中間フィラメン トであり, 核膜構造の構築ならびに維持に必須のタンパク質である. Lamin A/C の発現異常は種々の疾患を誘導することが知られている. 例えば, 早老病の一つ である Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) は Lamin A 前駆体の遺伝子 座のエクソン 11 におけるサイレント変異で, 通常は生じないスプライシングが この部位で生じ, エクソン 11 の 50 アミノ酸が欠失した変異型 Lamin A (progerin) が発現することによって引き起こされる. 142) また, Lamin A/C は RNAi 研究において汎用されており, キャリア間での内因性遺伝子発現に対する 抑制効果を評価するのに適している. そこで本節では, α-CDE および Lamin A/C 発現に対する siRNA 分子である siLamin からなる 2 成分系複合体の遺伝 子発現抑制効果を検討した. Fig. 49 はチャージ比 (α-CDE/siLamin) 20/1 に保ち, 種々の siLamin 濃度から なる 2 成分系複合体を Colon26-luc 細胞にトランスフェクション 24 時間後の Lamin A/C のタンパク質発現をウエスタンブロットにより検出した結果を示す. なお, 本実験は, siLamin 未処理の Lamin A/C の発現量をハウスキーピング遺伝 子の 1 つである actin の発現量で除した値をコントロールとして用い, siLamin 処理した Lamin A/C の発現量を actin の発現量で標準化してコントロールで除 したものを relative expression (%) とした (Fig. 49C). Lamin A/C 発現は siLamin の濃度依存的に抑制され, その遺伝子発現抑制効果は siLamin 濃度 100 nM 以上でプラトーを示した (Figs. 49A, C). 一方, ネガティブコントロールで 用いた siGL2 複合体をトランスフェクションしても Lamin A/C の発現に影響を 与えなかったことから, α-CDE/siLamin 複合体による Lamin A/C の発現抑制効果 は配列特異的であることが示唆された (Fig. 49B). 次に, 市販キャリアである PEI, L2 および RF を用いて, Lamin A/C 発現に対する抑制効果を α-CDE 複合 体と比較検討した (Fig. 50). α-CDE/siLamin および L2/siLamin 複合体は Lamin - 87 - A/C の 発 現 を コ ン ト ロ ー ル に 対 し て 約 60% 抑 制 し た (Figs. 50A, B). RF/siLamin 複合体を用いた場合の Lamin A/C 発現抑制効果は α-CDE 複合体よ りも弱いものの, コントロールに対して約 20% 抑制した (Fig. 50B). 一方, PEI/siLamin 複合体では Lamin A/C の発現抑制効果は観察されなかった. 次に, アポトーシス誘導に関与する Fas に対する siRNA (siFas) を用いて, そ の遺伝子発現抑制効果を検討した (Fig. 51). 実験は, α-CDE/siFas 複合体を NIH3T3-luc 細胞にトランスフェクションし, 48 時間後に, FITC-labeled Fas モ ノクローナル抗体 (FITC-Fas mAb) で細胞表面に発現している Fas をラベル化 後, フローサイトメトリーにより解析した. siFas 複合体未処理の細胞では, FITC-Fas mAb でラベル化した Fas の蛍光ピークは右へシフトしたことから, Fas の発現が確認された. (Figs. 51A, B) α-CDE/siFas 複合体で処理した場合, Fas の 蛍光ピークは左にシフトしたことから, Fas の発現抑制効果が示唆された (Fig. 51A). 一方, siFas の配列をランダムに並べ変えた siFas scramble 複合体をトラ ンスフェクションしても, Fas の発現は変化しなかった (Fig. 51A). また, α-CDE 複合体による Fas の発現抑制効果は siFas の濃度依存性を示した (Fig. 51B). これらのことから, α-CDE/siFas 複合体は配列および濃度依存的的に Fas の発現 を抑制することが示唆された. これらの結果から，α-CDE からなる 2 成分系複合体は内因性遺伝子発現に対 して配列および濃度依存的に RNAi 効果を誘導できることが示唆された. - 88 - (C) 120 Relative expression (%) 40 0 20 0 10 0 α-CDE/siLamin 50 Co nt ro l 20 (A) Concn. of siRNA (nM) Lamin A/C Actin 0 Concn. of siRNA (nM) Actin 0 40 40 0 20 0 20 20 0 * * * 40 0 10 10 0 60 50 50 α-CDE/siGL2 80 20 l ro nt Co Lamin A/C Co nt ro l 20 (B) 100 Concn. of siRNA (nM) α-CDE/siLamin Fig. 49. Inhibitory Effects of Binary Complexes of α-CDE/siLamin on Lamin A/C Expression in Colon26-luc Cells Colon26-luc cells were transfected with binary complexes of α-CDE/siRNA for 24 h. The cells were washed with 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 5 mM EDTA, 140 mM NaCl and 25 μM βmercaptoethanol and treated with the same buffer containing 1% Triton X-100 and protease inhibitors for 5 min at room temperature. After that, the sample was homogenized with 26G needle at ten times and centrifuged at 16,000 rpm for 10 min. Lamin A/C expression was assayed by Western blot after adjusting the total protein content (50 μg/lane). The charge ratio of α-CDE/siLamin was 20/1. *p<0.05, compared with control. Each value represents the mean ± S.E. of 3-5 experiments. (A) (B) Lamin A/C Actin Relative expression (%) Co nt ro l αC DE /s iL am PE in I/s iL am in L2 /s iL am R in F/ si La m in 120 100 80 * 60 * 40 * 20 0 Co αP ntr CDE EI/s L2/si RF/s iL /siL iLa La ol am min min amin in Fig. 50. Inhibitory Effects of Binary Complexes of Carriers/siLamin on Lamin A/C Expression in Colon26-luc Cells Colon26-luc cells were transfected with binary complexes of carriers/siLamin for 24 h. Lamin A/C expression was assayed by Western blot after adjusting the total protein content (50 μg/lane). The charge ratios of α-CDE/siLamin and PEI/siLamin were 20/1 and 5/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/siLamin was 3.75/1. The siRNA concentration was 100 nM. *p<0.05, compared with control. Each value represents the mean ± S.E. of 3-5 experiments. - 89 - (A) (B) Cell alone 100 100 Cell alone FITC-Fas mAb siFas scramble 60 siFas 40 FITC-Fas mAb 80 20 Counts Counts 80 siFas : 10 nM : 100 nM : 200 nM 60 40 20 0 0 100 101 102 103 104 100 FITC-Fas mAb 101 102 103 FITC-Fas mAb 104 Fig. 51. Flow Cytometric Analysis of Fas Expression in NIH3T3-luc Cells after Transfected with Binary Complexes of α-CDE/siFas NIH3T3-luc cells were transfected with binary complexes of α-CDE/siRNA for 48 h. The cells were washed with PBS at twice and incubated with FITC-conjugate anti-Fas mAb at 4˚C for 30 min. After a wash, the stained cells were resuspended in PBS and quantified using flow cytometer. The siRNA concentration was 100 nM. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. These figures show representative data for three experiments. 第 8 節 2 成分系複合体の細胞内分布 第 1 章において, α-CDE からなる 3 成分系複合体の優れた RNAi 効果に, siRNA の細胞質局在が関与することを明らかにした. そこで本節では, 2 成分系 複合体の細胞内取り込みおよび細胞内分布を FITC-labeled siRNA (FITC-siGL3) および TRITC-labeled α-CDE (TRITC-α-CDE) を用いて検討し, さらに siRNA の 細胞内分布を市販キャリア複合体の場合と比較検討した. 第 1 項 FITC-labeled siRNA の細胞内取り込み Fig. 52 は FITC-siGL3 および TRITC-α-CDE からなる 2 成分系複合体を細 胞へトランスフェクション 1 時間後の細胞内取り込みをフローサイトメトリー により解析した結果を示す. FITC-siGL3 の 蛍 光 ピ ー ク は チ ャ ー ジ 比 (α-CDE/siRNA) 依存的に右へシフトしたが, チャージ比 20/1 以上では変わらな - 90 - かった (Fig. 52A). 一方, TRITC-α-CDE の蛍光ピークは右へシフトし, チャージ 比依存的な細胞内への取り込みが観察された (Fig. 52B). このことから, Fig. 47 で観察されたチャージ比 20/1 における優れた遺伝子発現抑制効果は, siRNA が 細胞内に十分取り込まれたためと推察された. 次 に , FITC-siGL3 と TRITC-α-CDE の細胞内取り込みを Dot plot にて解析した. FITC-siGL3 のみを 細胞へトランスフェクションした場合, 細胞内への取り込みは全く観察されなか った (Fig. 52D). 一方, TRITC-α-CDE/FITC-siGL3 複合体では, 細胞内への取り 込みが観察され, 図中の円に示すような 2 つの取り込み分布を示した (Fig. 52E). 複合体のチャージ比 20/1 において, siRNA と複合体を形成していない遊離の TRITC-α-CDE が 多 く 存 在 す る こ と か ら , こ こ で 得 ら れ た 2 つの分布は , TRITC-α-CDE/FITC-siGL3 複合体と遊離型 TRITC-α-CDE であることが推察さ れた. 次に, α-CDE/FITC-siGL3 複合体の細胞内取り込み量を市販キャリアである L2 および RF を用いて比較検討した (Fig. 53). FITC-siGL3 の蛍光ピークのシフト 変化は各キャリア間で差がなかった. これらのことから, 各キャリア間による siRNA の細胞内取り込み量は変わらないことが推察された. - 91 - : Cell alone : FITC-siGL3 Charge ratio (α-CDE/FITC-siGL3), :1 : 100 : 20 (B) 90 90 60 60 Counts Counts (A) : 10 30 0 30 0 100 101 102 103 104 FITC-siGL3 (C) 100 101 102 103 104 TRITC-α-CDE (D) (E) Fig. 52. Cellular Uptake of Binary Complexes of TRITC-α-CDE/FITC-siGL3 in NIH3T3-luc Cells after Transfection (A, B) Effects of Charge Ratio on Cellular Uptake of Binary Complexes Cellular uptake of FITC-siGL3 was determined 1 h after transfection with binary complexes. The siRNA concentration was 100 nM. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. These figures show representative data for three experiments. (C-E) Dot Plot Analysis of FITC-siGL3 and TRITC-α-CDE in NIH3T3-luc Cells after Transfection with Binary Complexes Cellular uptake of FITC-siGL3 and TRITC-α-CDE was determined 1 h after transfection with binary complexes. The siRNA concentration was 100 nM. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. These figures show representative data for three experiments. - 92 - Counts 90 : Cell alone : α-CDE/FITC-siGL3 : L2/FITC-siGL3 : RF/FITC-siGL3 60 30 0 100 101 102 103 104 FITC-siGL3 Fig. 53. Comparison of Cellular Uptake of FITC-siGL3 Among Various Carriers in NIH3T3-luc Cells Cellular uptake of FITC-siGL3 was determined 1 h after transfection with binary complexes. The siRNA concentration was 100 nM. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. The volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA were 3.75/1 and 6/1, respectively. These figures show representative data for three experiments. 第 2 項 FITC-labeled siRNA および TRITC-α-CDE の細胞内分布 これまでの検討から, α-CDE/siRNA 複合体はチャージ比 (α-CDE/siRNA) 20/1 において, siRNA の細胞内取り込みが最も高く, 遺伝子発現抑制効果も優れるこ とを明らかにした. そこで本項では, チャージ比 20/1 における α-CDE/siRNA 複合体の細胞内分布を明らかにするため, FITC-siGL3 および TRITC-α-CDE の 細胞内分布を解析した. すなわち, TRITC-α-CDE/FITC-siGL3 複合体を細胞にト ランスフェクション後の各時間 (1, 6, 12, 24 h) における TRITC-α-CDE および FITC-siGL3 の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡で観察した. その結果を Fig. 54 に 示す. TRITC-α-CDE/FITC-siGL3 複合体をトランスフェクション 1 時間後において, TRITC-α-CDE および FITC-siGL3 は細胞質全体に散在していた. 6 時間後では 細胞質全体で観察されたこれら複合体の蛍光が核周辺で観察され, 12, 24 時間と 時間経過に伴い, 核周辺への集積が顕著に見られた. しかしながら, 本実験条件 において, FITC-siGL3 および TRITC-α-CDE の核移行は観察されなかった. こ - 93 - れらのことから, TRITC-α-CDE は FITC-siGL3 を細胞質中に長時間局在化させ ることが示唆された. 本実験で得られた結果は, RNAi 効果の発現が主に細胞質 で起こるということを考慮すると, siRNA キャリアとして極めて好ましい性質を 有することを示唆するものである. FITC-siGL3 TRITC-α-CDE Merge 1h 6h 12 h 24 h Fig. 54. Time Courses of Intracellular Distribution of FITC-siGL3 and TRITC-αCDE in NIH3T3-luc Cells Transfected with Binary Complexes Cells were transfected with binary complexes of FITC-siRNA with TRITC-α-CDE for 1, 6, 12 and 24 h. After washed twice with PBS, the cells were fixed with methanol for 5 min at 4˚C, and then the cells were scanned with a CLSM. The siRNA concentration was 100 nM. The charge ratio of TRITC-α-CDE/FITC-siGL3 was 20/1. These figures show representative data for three experiments. - 94 - 第 3 項 2 成分系複合体の細胞内分布におよぼす細胞種の影響 siRNA/キャリア複合体をトランスフェクション後の RNAi 効果は細胞種によ り異なることが知られている. 実際, 細胞種により 3 成分系複合体の RNAi 効 果は異なることが確かめられた (第 1 章参照). そこで本項では, 5 種類の異な る細胞 (NIH3T3, NIH3T3-luc, RAW264.7, HeLa-luc, A549) を用いて, 2 成分系複合 体 を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 1 時 間 後 に お け る FITC-siGL3 お よ び TRITC-α-CDE の細胞内挙動を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した. NIH3T3, NIH3T3-luc, RAW264.7 および HeLa-luc 細胞において, FITC-siGL3 お よ び TRITC-α-CDE は 細 胞 質 全 体 に 散 在 し た (Figs. 55A-D). さらに FITC-siGL3 および TRITC-α-CDE の蛍光は一致していたことから, これら複合 体の共局在が示唆された. 一方, A549 細胞において, TRITC-α-CDE は細胞質に 局 在 し た も の の , FITC-siGL3 は 核 内 で 観 察 さ れ た . これらの結果から, α-CDE/siRNA 複合体の細胞内分布は細胞種により異なることが示唆された. - 95 - (A) NIH3T3 (B) NIH3T3-luc (C) RAW264.7 (D) HeLa-luc (E) A549 FITC-siGL3 TRITC-α-CDE Merge DIC Fig. 55. Intracellular Distribution of Binary Complexes of FlTC-siGL3/TRITC-α-CDE into Various Cells Cells were transfected with binary complexes of siRNA/α-CDE for 1 h. After two times washed with PBS, the cells were fixed with 100% MeOH for 5 min at 4˚C. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. The concentration of siRNA was 100 nM. These figures show representative data for three experiments. 第 4 項 α-CDE および市販キャリア/siRNA 複合体の細胞内挙動の比較 siRNA の細胞内動態については, 徐々に明らかになってきているが, 87) キャリ ア/siRNA 複合体による siRNA の細胞内動態の違いに関する報告は少ない. こ れまでに, Spagnou らは L2/FITC-siRNA 複合体をヒト卵巣癌由来 IGROV-1 細 胞にトランスフェクション後の FITC-siRNA は細胞質に局在すること, 78) また Chen らは, L2/siRNA/量子ドットをマウス胎児由来繊維芽細胞である 3T3-J2 細 胞にトランスフェクション後の siRNA は, 細胞質に局在することを報告してい る. 143) ている. RF/siRNA 複合体においても同様に, siRNA の細胞質局在性が報告され 144) 一方, 前項において, α-CDE/siRNA 複合体は, 細胞種の違いにより siRNA の細胞内分布が異なることが示唆された. したがって, 用いるキャリア - 96 - の違いにより, siRNA の細胞内分布は異なることが予想される. そこで本項では, L2 および RF と siRNA との 2 成分系複合体を NIH3T3-luc 細胞にトランス フェクション 1 時間後における FITC-siGL3 の細胞内分布を α-CDE 複合体と 比較検討した. α-CDE および RF/FITC-siGL3 複合体において, FITC-siGL3 の蛍光は細胞質で 観察された (Figs. 56A, C). さらに, RF 複合体における FITC-siGL3 の蛍光は点 状に観察され, 細胞質への局在性が推察された (Fig. 56C). 一方, L2/FITC-siGL3 複合体を用いた場合, FITC-siGL3 の蛍光は核内および細胞質の両方にて点状に観 察された (Fig. 56B). これらのことから, α-CDE/siRNA 複合体と市販キャリア複 合体における siRNA の細胞内挙動は異なることが示唆された. (A) α-CDE (B) L2 (C) RF Fig. 56. Cellular Uptake of FlTC-siGL3 Complexes with Various Carriers into NIH3T3-luc Cells Cells were transfected with binary complexes of carriers/siRNA for 1 h. After two times washed with PBS, the cells were fixed with 100% MeOH for 5 min at 4˚C. The charge ratio of α-CDE/siRNA was 20/1. The volume to amount ratios of L2/siRNA and RF/siRNA were 3.75/1 and 6/1, respectively. The concentration of siRNA was 100 nM. These figures show representative data for three experiments. 第 9 節 2 成分系複合体の in vivo RNAi 効果 前節までに, α-CDE と siRNA からなる 2 成分系複合体はルシフェラーゼ遺 伝子一過性および安定発現細胞において, 配列特異的な遺伝子発現抑制効果を示 - 97 - すこと, さらに内因性遺伝子 (Lamin A/C および Fas) に対しても RNAi 効果 を誘導することが明らかになった. そこで次に, α-CDE/siRNA 複合体の in vivo における RNAi 効果について検討した. 実験は, Colon26-luc を足裏に移植した 担癌マウス (BALB/c, 雄性) を用い, 腫瘍の大きさが 10 mm に達したマウスの 腫瘍内に直接 2 成分系複合体を投与 24 時間後のルシフェラーゼ活性を測定し た. α-CDE/siGL3 複合体は, 未処理コントロールに対して約 75% まで遺伝子発現 を抑制したが, siGL2 複合体による抑制効果は観察されなかった (Fig. 57A). PEI/siGL3 複合体においても, 未処理コントロールに対して約 50% の遺伝子発 現抑制効果が観察されたが, 有意差は認められなかった (Fig. 57B). 一方, L2/siRNA 複合体においては, siGL2 による非特異的な抑制効果が観察された (Fig. 57C). これらの結果から, α-CDE/siRNA 複合体は in vivo においても配列 特異的な RNAi 効果を誘導できることが示唆された. (A) α-CDE n=6 150 100 n=9 50 *† 25 125 n=6 100 n=6 75 * 50 25 n=8 125 100 75 50 n=6 * n=6 * 25 0 3 GL si l tro L2 iG /s n Co 3 GL L2 iG i I/s I/s PE PE 3 GL 2 GL si i /s l tro E CD α- l tro E/ CD α- n Co n Co 0 0 n=4 / L2 Luciferase activity (%) 125 Luciferase activity (%) 150 n=6 75 (C) L2 L2 Luciferase activity (%) 150 (B) PEI Fig. 57. Inhibitory Effects of Binary Complexes of Carriers/siGL3 on Luciferase Activity in BALB/c Mice Bearing Tumor Cells Stably Expressing Luciferase Gene Binary complexes of carriers/siRNA (100 μL) were directly injected to tumor of mice. After 24 h, luciferase activity was determined. The charge ratios of α-CDE/siRNA and PEI/siRNA were 20/1 and 5/1, respectively. The volume to amount ratio of L2/siRNA was 3.75/1. The amount of siRNA was 10 μg. *p<0.05, compared with control. †p<0.05, compared with siGL2. - 98 - 第 10 節 考察 本章では, α-CDE の siRNA 用キャリアとしての有用性を in vitro および in vivo にて評価した. まず, 遺伝子発現抑制効果におよぼす α-CDE/siRNA 複合体のチャージ比の影 響を in vitro において検討した. NIH3T3-luc 細胞において, α-CDE/siRNA 複合 体のチャージ比 (α-CDE/siRNA) 20/1 で最も高い遺伝子発現抑制効果を示し, 2 成分系複合体による遺伝子発現抑制効果に至適チャージ比が存在することが示唆 された (Fig. 47). 我々は以前, α-CDE/pDNA 複合体の遺伝子導入効率は, チャー ジ比の増大に伴い増加することを明らかにした. 66, 67) 本研究においても, siRNA の細胞内取り込み量は, チャージ比の増大に伴い増加し, 20/1 における siRNA の取り込み量は最も高く, 過去の知見を支持する結果が得られた (Fig. 52A). し かしながら, チャージ比 50/1 以上では, 非特異的な遺伝子発現抑制効果が観察 された (Fig. 47). 一方, NIH3T3-luc 細胞において, チャージ比 100/1 までこれ ら複合体による細胞傷害性は観察されなかった (Fig. 39B). したがって, チャー ジ比 50/1 以上で観察された非特異的な遺伝子発現抑制効果は, 細胞傷害性以外 の要因による可能性が高い. 我々はその要因の一つに, 遊離の α-CDE の関与, すなわち, チャージ比の増加に伴い, siRNA と結合していない遊離の α-CDE が siRNA の細胞内動態を変化させたものと推察している. 実際, α-CDE/siRNA 複 合体における TRITC-α-CDE の細胞内取り込み量は, チャージ比の増大に伴い増 加した (Fig. 52B). 一方, チャージ比 100/1 において, α-CDE は理論上 siRNA 1 分子に対して約 150 倍存在すると求められる. したがって, 高チャージ比領域 では, 複合体を形成していない過剰の遊離型 α-CDE が存在するため, 複合体か らの siRNA の解離や siRNA の細胞内トラフィッキングが変化する可能性が推 察された. これらのことから, α-CDE による配列特異的な遺伝子発現抑制効果 に, 複合体の至適チャージ比が存在し, α-CDE/siRNA 複合体と適切な量の遊離型 α-CDE が RNAi 効果に影響を与える可能性が示唆された. 次に, カチオン性ポリマーである PEI (MW 10,000), カチオン性リポソームで ある L2 および RF を用いて, 遺伝子発現抑制効果におよぼす α-CDE および 市販キャリア複合体の影響を比較検討した. - 99 - ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細 胞および内因性遺伝子発現に対する抑制効果はキャリア間で異なっていた (Figs. 48, 50). Tsuchiya らは, siRNA による RNAi 効果発現を左右する原因の一つに, 用いるキャリアによる siRNA の導入効率の違いがあることを報告している. 145) また, Grayson らは, PEI/siRNA 複合体を用いて, siRNA の導入効率を調べたとこ ろ, 複合体のチャージ比, 粒子径, ζ-電位および siRNA との親和性が大きく関与 することを報告している. 136) しかしながら, 本研究において得られた結果はこ れらの報告を支持するものではなかった. すなわち, α-CDE, LF および RF の これらキャリア間による siRNA との相互作用様式はほとんど変わらなかったが (Fig. 36), これら複合体の物理化学的性質は大きく異なっていた (Table 5). それ にもかかわらず, これらキャリア複合体間の siRNA 導入効率はほとんど変わら なかった (Fig. 53). したがって, α-CDE および市販キャリア複合体間による遺 伝子発現抑制効果の違いは, これら複合体の物理化学的性質および siRNA の導 入効率以外の原因が考えられる. その要因の 1 つとして, キャリア/siRNA 複合 体の細胞傷害性およびインターフェロン応答の関与が推察される. 一般に, siRNA による RNAi 効果を評価する際にキャリア単独あるいはキャリア/siRNA 複合体の細胞傷害性がある場合の配列特異的な遺伝子発現抑制効果を比較するの は困難である. 78) しかしながら, 本研究において, トランスフェクションの実験 条件におけるキャリア/siRNA 複合体の細胞傷害性はいずれも観察されなかった (Fig. 39). 一方, リポソーム単独あるいは siRNA 単独ではインターフェロン応 答を誘導しないが, これら複合体では IFN-γ や TNF-α などの炎症性サイトカイ ンが誘導されることが報告されている. 84) また, 分子量 750 kDa の PEI から なる polyplex はインターフェロン応答を誘導することが報告されている. 146) し かしながら, 本研究で用いたいずれのキャリア複合体において, IFN-β や TNF-α mRNA の誘導は観察されなかった (Fig. 41). これらのことから, キャリア種類 の違いによる遺伝子発現抑制効果の差異に細胞傷害性およびインターフェロン応 答の関与は関与しないことが示唆された. そこで, FITC-siRNA を用いて, NIH3T3-luc 細胞におけるキャリア複合体の細 胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡で観察した. 配列特異的な遺伝子発現抑制効 果を示した α-CDE および RF 複合体では, FITC-siRNA の蛍光が細胞質で観察 された (Figs. 56A, C). 一方, L2 複合体においては, 核内および細胞質の両方で - 100 - FITC-siRNA の蛍光が観察された (Fig. 56B). 前章で述べたように, RISC および標的 mRNA 95) 90, 91, 96) の細胞質局在性を考慮すると, L2/siRNA 複合体で観察さ れた非特異的な遺伝子発現抑制効果に siRNA の核移行性の関与が推察された. 一方, L2 および RF 複合体の細胞内取り込み 1 時間後において, FITC-siRNA の蛍光は点状に観察されたが, α-CDE 複合体を用いた場合, FITC-siRNA は細胞 質全体に散在した (Fig. 56). これは, α-CDE 複合体が細胞内に導入後, エンドソ ームから効率よく siRNA をリリースを促進したためと推察される. 68) 一方, 細 胞内に取り込まれた核酸は細胞質に存在する核酸分解酵素によっても影響を受け ることが報告されている. 115, 116) α-CDE 複合体は血清に存在する核酸分解酵素 に対して, 高い酵素安定性を示した (Fig. 38). これらのことから, キャリアの種 類による RNAi 効果発現の違いは, キャリア/siRNA 複合体の物理化学的性質お よび siRNA の導入効率よりもむしろ, siRNA の細胞内動態および細胞質中での 安定性に起因する可能性が示唆された. 一方, Spagnou らや Chen らは L2 複合体を用いた場合, 蛍光 labeled-siRNA は, 細胞質に局在することを報告しており, 78) 本研究で得られた結果と一致しな かった. これらの原因の一つとして, 複合体の細胞内取り込み経路の関与の可能 性が考えられる. すなわち, サイズの小さな lipoplex (200 nm 以下) ではクラス リン依存的な経路で, 一方, サイズの大きな lipoplex (500 nm) ではクラスリン非 依存的な経路でエンドサイトーシスされることが報告されている. 147) 上述した 2 つの報告における lipoplex のサイズは不明であるが, 本研究で用い た L2/siRNA 複合体の粒子径は, 容量/質量比により劇的に異なることから (Table 5), これら複合体をトランスフェクション後の siRNA の細胞内動態が異なる可能性 が考えられる. また, polyplex の取り込みに関しても興味深い報告がされている. すなわち, 細胞膜表面に存在する GPI アンカー型タンパク質であるグリピカン は, polyplex と結合後, 細胞膜表面でアセンブリーし, カベオラを介して細胞内に 取り込まれ, グリピカン分子中に存在する核移行シグナル (KRRR[G/A]K) の働 きにより polyplex とともに核内に移行することが報告されている. 148, 149) さら に我々は以前, α-CDE/pDNA 複合体はクラスリンおよびラフト依存性エンドサイ トーシスであることを明らかにした. 135) 本研究において, キャリア/siRNA 複 合体における細胞内取り込み経路についての検討は行っていないが, これらのこ - 101 - とは RNAi 効果発現の強さを左右する一つの要因になるものと考えられる. し たがって, 今後これら複合体の細胞内取り込み経路をより詳細に調べる必要が ある. siRNA による RNAi 効果は細胞種によって異なることが知られている. この 原因の一つに RISC の細胞内局在性の関与が考えられる. すなわち, RISC の構 成成分である Argonaute2 タンパク質 (Ago2) は processing bodies (p-bodies) と呼 ばれる細胞質の細胞小器官に共局在することが報告されており, RISC の細胞質 局在性を示唆している. 88) 一方, Robb らは, HeLa 細胞において, RISC は細胞質 だけでなく核内にも存在することを報告している. 96) これらの報告は RNAi 効 果の発現場所が細胞種によって異なることを示唆する. 一方, 我々の検討におい て , 4 種 類 の 細 胞 (NIH3T3, NIH3T3-luc, RAW264.7, HeLa-luc) に TRITC-α-CDE/FITC-siRNA 複合体をトランスフェクション後の FITC-siRNA は 細胞質に局在したが, A549 細胞では核局在性が観察された (Fig. 55). これらの 結果は細胞種により, siRNA の局在性が異なることを支持するものである. 今後, 2 成分系複合体の RNAi 効果が細胞種により異なる原因を α-CDE/siRNA 複合 体と Ago2 との共局在性を調べることにより明らかにする必要がある. キャリア/siRNA 複合体により誘導される細胞死を解明することは, 核酸デリ バリーにおいて生体適合性に優れるキャリアの設計に有益な情報をもたらすこと に繋がる. 一般に, 非ウイルスベクター/核酸複合体の細胞傷害性は, 分子量や濃 度に依存する. 102) 本研究においても, α-CDE/siRNA 複合体および市販キャリア 複合体は高チャージ比領域 (> 200/1) および高容量/質量比で細胞傷害性を惹起 した (Fig. 39). そこで, これら複合体による細胞死の機構解明を企図して, DNA 含量の測定ならびに DNA ladder を検出した. カチオン性ポリマーの α-CDE および PEI からなる 2 成分系複合体において, DNA 含量の低下および DNA ladder は観察されなかった (Figs. 42, 43). 一方, カチオン性リポソームの L2 および RF 複合体においては, DNA 含量の低下および DNA ladder が検出さ れ, アポトーシスを誘導していることが示唆された (Figs. 42, 43). Fischer らは カチオン性ポリマーである PEI 単独および PEI/pDNA 複合体による細胞死はネ クローシスであること, 102) また, Iwaoka らはカチオン性リポソームによる細胞 死はアポトーシスであり, p38 MAP kinase および Caspase-8-Bid 経路を介して行 - 102 - われることを報告した. 150) これらの報告は我々の結果を支持するものであり, NIH3T3-luc 細胞において, カチオン性ポリマー/siRNA 複合体およびカチオン性 リポソーム/siRNA 複合体による細胞死は, それぞれネクローシスおよびアポト ーシスであることが示唆された. 一方, Kuo らは RAW264.7 細胞において, カ チオン性デンドリマーはアポトーシスにより細胞傷害性を示すが, NIH3T3 細胞 や BNL CL-2 細胞ではアポトーシスは起こらないことを報告した. 151) これら の知見は, 細胞の種類によりキャリア/核酸複合体による細胞死の機構が異なる ことを示すものであり, キャリア/siNRA 複合体の安全性は適用される組織等に よって大きく異なることを示唆するものである. 今後, キャリア/siRNA 複合体 の細胞死機構について更なる検討が必要である. ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞を足裏に移植した担癌マウスを用いて, α-CDE/siRNA 複合体の in vivo RNAi 効果を検討した. 本研究で用いた α-CDE, PEI および L2 からなる 2 成分系複合体の粒子径はいずれも 200 nm 以上であ ることから, 静脈内投与した場合, 細網内皮系 (Reticuloendothelial system : RES) の発達している肝臓や脾臓に取り込まれてしまうことが予想される. 152, 153) した がって, 腫瘍組織中への直接投与を行った. α-CDE/siRNA 複合体を腫瘍内に投 与した場合, siGL3 による配列特異的な遺伝子発現抑制効果が観察された (Fig. 57A). この理由として, ウサギ赤血球における溶血活性実験において, in vivo 実 験条件における 2 成分系複合体の溶血活性は認められなかったこと (Fig. 40C), α-CDE/siRNA 複合体の RNase 分解酵素に対する安定性は高いこと (Fig. 38), さ らに, α-CDE 複合体は siRNA を長時間細胞質に局在させること (Fig. 54), など の要因の関与が推察された. Hu-Lieskovan らは, ユーイング肉腫を移植したマ ウスに β-CyD を含むカチオン性ポリマーと siRNA の複合体を静脈内投与した ところ, 腫瘍の成長を抑制し, その理由としてこれら複合体の酵素抵抗性が関与 することを報告している. 134) 前述したように, α-CDE/siRNA 複合体は siRNA の酵素分解を抑制することから, 複合体の粒子径を適切に調節できれば, 静脈内 投与後も RNAi 効果を誘導することが期待される. 一方, L2 複合体では, siGL2 による非特異的な抑制効果が観察された. Judge らは siRNA 単独ではインター フェロン応答起こさないが, カチオン性リポソーム複合体において IFN-γ や TNF-α などの炎症性サイトカインを誘導することを報告している. - 103 - 84) さらに, Ma らは, siRNA (50 μg) とカチオン性リポソームからなる複合体をマウスに投与 した場合, インターフェロン応答を惹起することを報告している. 50) これらの 報告は, L2 複合体投与後の配列非特異的な遺伝子発現抑制効果の原因として, イ ンターフェロン応答の関与を示唆するものである. 加えて, in vivo 実験条件 (siRNA 10 μg を含む) における L2/siRNA 複合体の溶血活性は約 30% であった ことから, L2 複合体の in vivo への応用は困難であることが示唆された. さら に, PEI 複合体を用いた場合, siGL3 による遺伝子発現抑制効果は観察されたもの の, siGL2 系との有意差は認められなかったことから, PEI は siRNA に対する in vivo 用キャリアとして適当でないことが示唆された. 今後, in vivo 条件におけ る siRNA の投与量やチャージ比の至適条件の設定なども含めてより詳細な検討 を行う必要がある. Fig. 58 は本章で得られた知見に基づいて推察された配列特異的な RNAi 効果 発現機構の模式図を示す. 要約すると, ① 調製した α-CDE/siRNA 複合体は, 正の ζ-電位を有し, ナノサイズの粒子 (約 220 nm) を形成する, ② α-CDE 複合 体は高チャージ比 (α-CDE/siRNA, >200/1) においても細胞傷害性が極めて低い, ③ α-CDE/siRNA 複合体のチャージ比依存的に細胞内へ取り込まれる, ④ α-CDE のエンドソーム膜破壊効果により, siRNA を効率よく細胞質中へリリー スする, ⑤ siRNA を細胞質中に長時間局在させる, これらの要因が総合的に関 与して, 結果として ⑥ 配列特異的な遺伝子発現抑制効果を示すことが示された. このように, α-CDE 複合体は市販キャリア複合体に比べて, 安全性が高く, in vitro および in vivo において配列特異的な RNAi 効果を誘導可能なことが示唆 された. さらに, α-CDE 複合体を細胞にトランスフェクション後, siRNA や pSilencer は細胞質に局在し, 核内に移行しないことから, α-CDE は shRNA 発現 ベクターよりも siRNA 用キャリアとしての有用性が高いことが示唆された. し かしながら, α-CDE を用いた場合の遺伝子発現抑制効果は, shRNA および siRNA の両者においてもまだ充分でないことから, 今後, α-CDE 分子中のデンド リマーのジェネレーションを変えたり, 他の機能素子分子 (糖やペプチド) を導 入することで更なる siRNA キャリアの分子設計が必要であると考えられる. さ らに, α-CDE/siRNA 複合体を用いて種々の疾患に対する治療効果について検討す る必要がある. 現在, 敗血症において重要な遺伝子産物である TNF-α に対する - 104 - siRNA (siTNF-α) を用いて, α-CDE/siTNF-α 複合体の遺伝子発現抑制効果につい て検討中であるが, まだ十分な知見が得られておらず, 今後の課題としたい. - 105 - α-CDE systems Commercial Transfection Reagents systems ①physicochemical properties > << ②Cytotoxicity ③Cellular uptake = ④Endosomal escape Endosome Endosome > Cytoplasm ⑤Incorporation into RISC RISC > AAAAA mRNA mRNA AAAAA ⑥Sequence specific RNAi effect > DNA AAAAA DNA Nucleus Nucleus Fig. 58. Proposed Scheme for Enhancement of Sequence-specific RNAi Effects by Binary Complexes of α-CDE/siRNA - 106 - 第 11 節 小括 本章では α-CDE の siRNA 用キャリアとしての有用性評価を行った. まず, α-CDE と siRNA からなる 2 成分系複合体の物理化学的性質ならびにルシフ ェラーゼ遺伝子および内因性遺伝子発現に対する RNAi 効果を市販キャリア複 合体と比較検討した. さらに, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞を移植した 担癌マウスを作成し, 2 成分系複合体の in vivo RNAi 効果について検討した. 以下に得られた知見を要約する. 1) 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) は, 粒子径約 220 nm の粒子を有し, その チャージ比 (α-CDE/siRNA) が増大にするにつれて, ζ-電位は正に傾いた. また, 2 成分系複合体は, チャージ比 20/1 以上で高い酵素安定性を示した. 2) ルシフェラーゼ遺伝子一過性および安定発現細胞において, 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) はチャージ比依存的な遺伝子発現抑制効果を示し, チャー ジ比 20/1 において最も優れた効果が観察された. しかしながら, チャージ 比 50/1 以上では, 非特異的な抑制効果が観察された. 一方, α-CDE 複合体 はチャージ比 100/1 まで細胞傷害性を示さなかった. これらのことから, α-CDE/siRNA 複合体の遺伝子発現抑制効果に至適チャージ比が存在するこ とが示唆された. 3) 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) の遺伝子発現抑制効果を市販キャリア複合 体と比較検討した. その結果, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞におい て, α-CDE/siRNA 複合体および RF/siRNA 複合体は配列特異的な RNAi 効 果を示したが, L2/siRNA 複合体では非特異的な抑制効果が観察された. PEI 複合体では遺伝子発現抑制効果は観察されなかった. 一方, トランスフェ クション時の実験条件下, これら複合体の細胞傷害性は観察されなかった. これらのことから, α-CDE 複合体は, 市販キャリアよりも優れた RNAi 効 果を誘導可能なことが示唆された. - 107 - 4) 内因性遺伝子である Lamin A/C および Fas に対する 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) の遺伝子発現抑制効果を検討した. 2 成分系複合体は siRNA の濃度依存的に Lamin A/C および Fas の発現を抑制した. 一方, 異なる配列を有する siRNA 複合体をトランスフェクションした場合, これ ら遺伝子の発現に対して非特異的な抑制効果は観察されなかった. これら の結果から, 2 成分系複合体は内因性遺伝子の発現に対しても抑制効果を示 すことが示唆された. 5) FITC-siRNA および TRITC-α-CDE を用いて, 2 成分系複合体を細胞にトラ ンスフェクション 1 時間後の細胞内取り込みをフローサイトメトリーにて 解析した. その結果, FITC-siRNA の細胞内取り込みは, TRITC-α-CDE の添 加量に依存して増大したが, チャージ比 20/1 以上では変わらなかった. 一 方, TRITC-α-CDE の取り込みはチャージ比に依存した. また, α-CDE/siRNA 複合体の細胞内取り込み量は市販キャリア複合体とほとんど変わらなかっ た. 6) FITC-siRNA および TRITC-α-CDE を用いて, 2 成分系複合体の細胞内挙動 を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した. 2 成分系複合体を細胞にトランス フェクション 1 時間後において, FITC-siRNA および TRITC-α-CDE は細胞 質に散在した. 一方, 市販キャリアである L2 および RF 複合体では FITC-siRNA の蛍光はドット状に観察された. さらに, L2 複合体を用いた 場合, FITC-siRNA は, 核および細胞質の両方に局在していた. これらの結 果から, キャリアの種類の違いによる siRNA の細胞内動態の差異が示唆さ れた. 7) α-CDE/siRNA および 市販キャリア/siRNA 複合体の細胞死の機構解明を企 図して, DNA 含量および DNA ladder の検出を行った. その結果, ポリマ ー系キャリアである α-CDE および PEI 複合体はネクローシス, 脂質系キ ャリアである L2 および RF 複合体はアポトーシスを誘導することが示唆 された. - 108 - 8) ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞を移植した担癌マウスにおいて, 2 成分 系複合体 (α-CDE/siRNA) は配列特異的な遺伝子発現抑制効果を示した. 一方, PEI/siRNA 複合体では遺伝子発現抑制効果は弱く, L2/siRNA 複合体に おいては, 非特異的な抑制効果が観察された. これらのことから, α-CDE/siRNA 複合体は in vivo においても RNAi 効果を誘導可能なことが 示唆された. 以上のことから, α-CDE は 1) siRNA とナノサイズの安定な複合体を形成する こと, 2) 細胞傷害性が極めて低いこと, 3) siRNA を細胞質に長時間局在させるこ となどの特徴を有し, これらの要因が総合的に関与して優れた RNAi 効果を誘 導することが示され, α-CDE の siRNA 用キャリアとして有用性が示唆された. - 109 - 総 括 本研究では, shRNA 発現ベクターおよび siRNA 用キャリアとしての α-CDE の有用性評価を企図して以下の検討を行った. まず, siRNA キャリアとしての α-CDE の有用性に関する基礎的知見を得るため, RNAi 効果を簡便に評価できる 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/carrier) を調製し, その RNAi 効果をルシフェラ ーゼ遺伝子の発現に対する抑制効果を指標に検討し，市販キャリア (L2, TF, LF) 複合体の場合と比較した. 次に, shRNA 発現ベクター用キャリアとしての α-CDE の有用性を評価するため, α-CDE/pSilencer 複合体による遺伝子発現抑制 効果をルシフェラーゼ遺伝子一過性および安定発現細胞を用いて検討した. さ らに, siRNA/α-CDE 複合体のルシフェラーゼ遺伝子および内因性遺伝子の発現 に対する抑制効果を in vitro および in vivo において検討し，市販キャリア (L2, RF, PEI) 複合体の場合と比較した. さらに, α-CDE からなる 3 成分系複合体お よび 2 成分系複合体の優れた RNAi 効果の機構解明を企図して, それら複合体 の細胞毒性，物理化学的性質，細胞内取り込みおよび細胞内挙動を市販キャリア と比較した. 以下に本研究で得られた知見を総括する. 1) 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/キャリア) の物理化学的性質を検討した. α-CDE からなる 3 成分系複合体は平均粒子径約 140 nm で正の ζ-電位を与 えた. 一方, 市販キャリア (L2, TF, LF) からなる 3 成分系複合体は平均粒 子径 110 ~ 430 nm ならびに負の ζ-電位を示し, α-CDE と比較して pDNA お よび siRNA との相互作用は弱いことが示唆された. さらに, α-CDE 複合体 は市販キャリア複合体に比べて，血清による siRNA の分解を強く抑制した. これらのことから, α-CDE は核酸と安定な複合体を形成し，siRNA の酵素分 解を抑制することが示唆された. 2) 3 成分系複合体 (pDNA/siRNA/キャリア) の細胞傷害性を NIH3T3 細胞を用 いて検討した. その結果, α-CDE からなる 3 成分系複合体は，市販キャリア (L2, TF, LF) 複合体の場合とは異なり，細胞傷害性を全く示さなかった. 各種 - 110 - キャリアからなる 3 成分系複合体はインターフェロン応答に関与する IFN-β お よ び TNF-α mNRA を 誘 導 し な か っ た . これらのことから, pDNA/siRNA/α-CDE 複合体は安全性に優れるキャリアであることが示唆さ れた. 3) 3 成分系複合体 (pGL3/siRNA/α-CDE) のルシフェラーゼ遺伝子発現に対する 抑制効果を市販キャリア複合体と比較した結果, pGL3 control vector 系におい て, α-CDE を用いた場合, 配列特異的な RNAi 効果が観察されたが, 市販の キャリア (L2, TF, LF) を用いた場合, RNAi 効果のバラツキや非特異的な抑制 効果が観察された. 4) 3 成分系複合体 (pGL3/FITC-siRNA/TRITC-α-CDE) を細胞に添加 1 時間後 において, FITC-siRNA および TRITC-α-CDE は細胞質に散在した. 一方, L2 および TF を用いた場合, FITC-siRNA は核内およびその周辺で観察された. これらのことから, α-CDE による優れた RNAi 効果は siRNA を細胞質へ局 在させたためと推察された. 5) α-CDE と pSilencer との相互作用をアガロースゲル電気泳動, CD スペクト ル法にて検討した. α-CDE/pSilencer 複合体はチャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 付近で複合体の電荷が中性または正に傾き, そのチャージ比付近で, pSilencer のへリックス構造は B-form から C-form へ変化した. さらに, α-CDE/pSilencer 複合体中の pSilencer のコンパクション状態を蛍光法により 検討した結果, α-CDE の添加量に依存して pSilencer のコンパクションが観 察された. 6) α-CDE/pSilencer 複合体の物理化学的性質を検討した. α-CDE/pSilencer 複合 体は, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1 で約 160 nm の平均粒子径を有し, それ以上のチャージ比では，平均粒子径 80 nm の安定した粒子を形成した. また, 複合体の ζ-電位はチャージ比 1/1 付近で中性を示し, それ以上で正の 値を示した. 一方, これら複合体の DNase I に対する安定性をアガロースゲ - 111 - ル電気泳動にて検討した結果, いずれのチャージ比においても α-CDE/pSilencer 複合体は DNase I による分解を抑制することが示された. 7) NIH3T3-luc 細胞における α-CDE/pSilencer 複合体の細胞傷害性を WST-1 法 を用いて検討したところ, チャージ比 (α-CDE/pSilencer) 100/1 まで細胞傷 害性は観察されなかった. 8) ルシフェラーゼ遺伝子一過性および安定発現細胞において α-CDE/pSilencer 複合体は配列特異的な遺伝子発現抑制効果を示した. 一方, トランスフェク ション時の実験条件下, これら複合体の細胞傷害性は観察されなかった. ま た, α-CDE/pSilencer 複合体の遺伝子発現抑制効果は, siRNA を添加した 3 成 分系複合体 (pSilencer/siRNA/α-CDE) により増大した. しかしながら, siRNA 濃度 50 nM 以上では非特異的な抑制効果が観察された. これらのことから, 3 成分系複合体においてより優れた遺伝子発現抑制効果を発現させるために は, siRNA 濃度の適切な調節が必要であることが示唆された. 9) 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) の遺伝子発現抑制効果を市販キャリア複合 体と比較検討した. その結果, ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞において, α-CDE/siRNA 複合体および RF/siRNA 複合体は配列特異的な RNAi 効果を 示した. 一方, L2/siRNA 複合体では非特異的な抑制効果が認められ, また, PEI 複合体では遺伝子発現抑制効果は観察されなかった. 一方, 本実験条件 下, これら複合体の細胞傷害性は観察されなかった. これらのことから, α-CDE 複合体は, 市販キャリアよりも優れた RNAi 効果を誘導可能なこと が示唆された. 10) 内因性遺伝子である Lamin A/C および Fas に対する 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA) の遺伝子発現抑制効果を検討した. 2 成分系複合体は siRNA の濃度および配列依存的に Lamin A/C および Fas の発現を抑制した. これらの結果から, 2 成分系複合体は内因性遺伝子の発現に対しても抑制効 果を示すことが示唆された. - 112 - 11) 2 成分系複合体 (キャリア/FITC-siRNA) を細胞に添加 1 時間後の細胞内取 り込みは各種キャリア間で差異は認められなかった. しかしながら, 2 成分 系 複 合 体 の 細 胞 内 分 布は キ ャ リ ア 間 で 異 な り, α-CDE を 用 い た 場 合, FITC-siRNA は細胞質に散在したが, L2 および RF 複合体では FITC-siRNA の蛍光はドット状に観察された. さ ら に , L2 複 合 体 を 用 い た 場 合 , FITC-siRNA は, 核および細胞質の両方に局在した. これらの結果から, キ ャリアの種類の違いにより siRNA の細胞内動態に差異が生じることが示唆 された. 12) α-CDE/siRNA および 市販キャリア/siRNA 複合体の細胞死の機構解明を企 図して, DNA 含量および DNA ladder の検出を行った. その結果, ポリマー 系キャリアである α-CDE および PEI 複合体はネクローシス, 脂質系キャリ アである L2 および RF 複合体はアポトーシスを誘導することが示唆された. 13) ルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞を移植した担癌マウスにおいて, 2 成分 系複合体 (α-CDE/siRNA) は配列特異的な遺伝子発現抑制効果を示した. 一 方, PEI/siRNA 複合体では遺伝子発現抑制効果は弱く, L2/siRNA 複合体にお いては, 非特異的な抑制効果が観察された. これらのことから, α-CDE/siRNA 複合体は in vivo においても RNAi 効果を誘導可能なことが示唆された. 以上述べたように, α-CDE は 1) 核酸と安定な複合体を形成すること, 2) 細胞 傷害性が極めて低いこと, 3) siRNA を細胞質に長時間局在させることなどの要因 が総合的に関与して, 結果として in vitro および in vivo にて優れた RNAi 効果 を誘導することが示唆された. さらに α-CDE 自身も細胞質に局在化すること から, RNAi 効果発現の際に核移行性を必要とする shRNA 用キャリアとしてよ りもむしろ, 細胞質で直接作用する siRNA 用キャリアとしての有効利用が期待 される. 今後, α-CDE 分子中のデンドリマーのジェネレーションを変えたり, 他 の機能性素子 (糖・ペプチド・抗体など) を導入することにより, さらなる RNAi 効果の増大ならびに組織・細胞選択的な RNAi 効果の発現が期待される. これ - 113 - らの知見は, shRNA 発現ベクターおよび siNRA 用キャリアの構築に際し, 有用 な基礎資料になるものと考えられる. - 114 - 謝 辞 本研究を行うに際して終始御懇篤なる御指導と御鞭撻を賜りました熊本大学 大学院医学薬学研究部製剤設計学分野 有馬英俊 助教授に深甚なる感謝の意を表 します. 本研究を行うに際して御懇篤なる御指導と御助言を賜りました崇城大学薬学 部製剤学研究室 上釜兼人 教授ならびに 平山文俊 教授に深く感謝の意を表しま す. 本論文作成にあたり有益なる御助言と御校閲を賜りました熊本大学大学院医 学薬学研究部 大塚雅巳 教授ならびに 甲斐広文 教授に深く感謝の意を表しま す. 透過型電子顕微鏡測定にあたりご便宜とご協力を賜りました熊本大学大学院 自然科学研究科 伊原博隆 教授ならびに 佐藤 崇雄 氏に深く感謝の意を表しま す. 本研究に行うに際して有益なるご助言とご便宜を賜りました第一三共株式会 社 木原史博 氏 ならびに日本食品化工株式会社 和田幸樹 氏に深く感謝の意を 表します. 本研究を行うに際して有益なるご助言とご協力を賜りましたスミトラー・タウ ォラウィパス 氏に深く感謝の意を表します. 本研究にご協力いただいた 李 貫 学士ならびに当研究室の諸氏に深く感謝致 します. 本研究の遂行にあたり, ご支援御協力くださいました財団法人日本科学協会 (笹川科学研究助成金) に感謝致します. 最後に, 私の学生生活および研究活動を温かく見守って頂いた家族および友 人にこの場を借りて感謝致します. - 115 - 実験の部 1. 試料および溶媒等 本研究で用いた試料および溶媒等は以下の通りであり， それ以外はすべて市 販特級試薬を用いた． 【試薬】 α-CyD 日本食品化工 Starburst® (PAMAM) Dendrimer, Generation 3 Sigma-Aldrich Chemical Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 日水製薬 Modified Eagle’s Medium (MEM) 日水製薬 RPMI-1640 Medium 日水製薬 7% 炭酸水素ナトリウム注射液 大塚製薬 L-Glutamine 大塚製薬 β-メルカプトエタノール Sigma 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] Sigma ethanesulfonic acid (HEPES) 注射用硫酸ストレプトマイシン (力価:1 g) 明治製菓 注射用ベンジルペニシリンカリウム (20 万単位) 明治製菓 注射用ビクシリン® (力価:1 g) 明治製菓 Hygromycin B CALBIO Chem. Fetal Calf Serum (FCS) ニチレイ Trypsin 250 Difco Laboratories Polyethylenimine (MW 10,000) 和光純薬工業 Proteinase K 和光純薬工業 Complete® Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche pGL3 Control Vector Promega pGL2 Control Vector Promega - 116 - TransFast™ Transfection Reagent Promega Firefly Luciferase Assay System Promega Recombinant Firefly Luciferase Promega Reporter Lysis Buffer, 5X Promega Taq DNA Polymerase Promega LB Broth Base Invitrogen Lipofectin™ Reagent Invitrogen Lipofectamine™2000 Reagent Invitrogen pCEP4 Vector Invitrogen Picogreen® Invitrogen Propiodium Iodide Invitrogen TRITC, Isomer 5 フナコシ pSilencer1.0-U6 フナコシ RNAiFect™ Reagent QIAGEN DNase I TOYOBO ReverTra Ace TOYOBO siGL2 B-Bridge International siGL3 B-Bridge International siLamin B-Bridge International siFas B-Bridge International siFas Scramble B-Bridge International FITC-labeled siGL3 B-Bridge International 【抗体】 Mouse anti-lamin A/C monoclonal antibody Santa Cruz Biothechnology Rabbit anti-actin polyclonal antibody Santa Cruz Biothechnology Horseradish peroxidase-conjugate Santa Cruz Biothechnology goat anti-mouse IgG antibody Horseradish peroxidase-conjugate Amersham pharmacia Biotech donkey anti-rabbit IgG antibody - 117 - FITC-conjugate hamster anti-mouse CD95 (Fas) BD Bioscience monoclonal antibody (FITC anti-Fas mAb) 【測定キット】 Cell Counting Kit™ 和光純薬工業 ECL™ Kit Amersham pharmacia Biotech BCA™ Protein Assay Kit Pierce RNeasy Mini Kit™ Qiagen Plasmid Purification Kit MAXI™ Qiagen 【細胞】 NIH3T3 cells American Type Culture Collection NIH3T3-luc cells 熊本大学 A549 cells American Type Culture Collection HepG2 cells 理化学研究所 K562 cells 東北大学加齢医学研究所 Colon26-luc cells 熊本大学 【動物】 BALB/c マウス (雄性, 4 週齢) 日本 SLC 日本白色ウサギ 九動 【機器】 電子天秤 (ER-180A) IKA Works pH メーター (F-12) HORIBA マイクロプレートリーダー (Model 550) BIO-RAD 遠心機 (KC-70) クボタ 電気泳動槽 (AE6200) アトー 転写装置 (KS-8441) マリソル 泳動用 Power supply (AE-8400) アトー - 118 - 転写用 Power supply (MP-75B) マリソル 振盪恒温槽 (BW200/BF500) ヤマト科学 PCR Thermal Cycler (TP2000) タカラバイオ 蛍光分光光度計 (F-4500) 日立製作所 分光光度計 (U-2000A) 日立製作所 円二色性分散計 (J-720) 日本分光 CO2 インキュベーター (APC-38) アステック ミニゲル泳動槽 (Mupid-21) コスモバイオ FACSCalibur™ Becton Dickinson トランスイルミネーター(NLMS-20E) UVP LAS-3000 mini FujiFilm 光学顕微鏡 (CK30) OLYMPUS 共焦点レーザー顕微鏡 (LSM410) Carl Zeiss 透過型電子顕微鏡 (JEOL 2000FX) JEOL ルミノメーター (LB9507) EG&G BERHTOLD 分光光度計 Nanodrop (ND-1000) NanoDrop Zetasizer Nano Sysmex ホモジナイザー (ULTRA-TURRAX® T-25) IKA 細胞培養関連実験用の溶媒としての水はミリ Q 水 (ミリ Q 超純粋製造装置 (ミリポア) により製造した比抵抗値 18.3 MΩ・cm 以上の純粋) を使用し, それ 以外はイオン交換精製水を 2 回蒸留して用いた. また, Tris-EDTA 溶液 (TE 溶 液) および Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) は, それぞれ pH 8.0 および 7.4 のものを使用した. 2. デンドリマー/シクロデキストリン結合体の調製 2-1. トシル化 α-CyD の調製: Melton らの方法に準じて合成した. 154) ベン ゼンで水分を共沸除去した乾燥 α-シクロデキストリン (α-CyD) 8 g を無水ピ リジン 500 mL に溶解後, 5˚C 以下に冷却, 攪拌しながら p-トルエンスルホ ニルクロライド 6 g を加え, 室温で 2 時間攪拌した. 反応溶液に水 (約 100 - 119 - mL) を加え, 反応を停止させた後, 減圧濃縮し, アセトン 100 mL を添加して 析出した沈殿物を濾取した. 沈殿物は吸着クロマトグラフィーを用いて分離, 精製した. (多孔性ポリスチレン樹脂 (DIAION® HP-20); 溶離液:メタノール/水 =0:100 v/v → 100:0 v/v; 2.3 g, 収率 29%). FAB-Mass [M-H]- m/z 1125. 2-2. デンドリマー/α-シクロデキストリン (G3) 結合体 (置換度 2.4) の合成: デンドリマー 0.5 mL (1.45 x 10-5 mol) を試験管エバポレーターに加えて減圧 下メタノールを完全に留去した. その後, トシル化 α-CyD 100 mg (1.08 x 10-5 mol) を加えて, 軽く混合し, 試験管内を窒素置換後, 油浴中, 60˚C で 24 時間攪拌した. 反応物を TOSOH TSKGel HW-40S (5.3 cm2 x 70 cm, 溶出緩 衝液: 0.1 M 炭酸水素アンモニウム) を用いてゲルろ過した. 結合体を含む フラクション画分を濃縮後, 濃縮液を 0.5 mL の水に再溶解し, メタノール 3 mL を加えて十分に白濁するまで混和した. 沈殿物を含む溶液を 1,500 rpm, 15 分間遠心分離後, 上清を取り除き, 再びメタノール 3 mL を添加し てよく混合した. 同様に遠心分離後, 上清を取り除き, 残渣中のメタノール を試験管エバポレーターにより完全に留去した (収量 18%). (1H-NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm from TMS) 4.94 (H1, α-CyD), 3.86-3.74 (H3, H5, H6, α-CyD), 3.53-3.47 (H2, H4, α-CyD), 3.27-3.13 (dendrimer methylene), 3.05-2.81 (dendrimer methylene), 2.72-2.51 (dendrimer methylene), 2.36-2.31 (dendrimer methylene). 3. プラスミドの増幅と精製 3-1. pGL3 control vector, pGL2 control vector の増幅: 各 pDNA を導入した 大腸菌株 JM109 を 100 μg/mL のアンピシリンを含む LB 培地 (BACTO TRYPTONE 10 g, BACTO YEAST EXTRACT 5 g, NaCl 5 g/1000 mL) 3 mL 中, 37˚C で一晩前培養し, その 100 μL を新たな LB 培地 250 mL に加え, 37˚C で 16 ~ 24 時間旋回培養した. 3-2. pSilencer の増幅: pSilencer を導入した大腸菌株 DH5α を 100 μg/mL のアンピシリンを含む LB 培地 (BACTO TRYPTONE 10 g, BACTO YEAST - 120 - EXTRACT 5 g, NaCl 5 g/1000 mL) 3 mL 中, 37˚C で一晩前培養し, その 100 μL を新たな LB 培地 250 mL に加え, 37˚C で 16 ~ 24 時間旋回培養した. 3-3. プラスミド DNA の精製: Plasmid Purification Kit MAXI® を用いて行っ た. 精製操作はマニュアルに準じて行い, 精製後, TE 溶液に溶解し, 溶解中 の DNA 濃度は, 分光光度計 (U-2000A) を用い, 1OD260 = 50 μg DNA/mL とし て算出した. また, OD260/OD280 の値から, タンパク質混入の有無を判定し, OD260/OD280 = 1.8 以上のものを実験に使用した. 4. キャリア/核酸複合体の調製 4-1. pDNA/siRNA/α-CDE からなる 3 成分系複合体の調製: 1.5 mL エッペン ドルフチューブに各種培地を添加し, TE 溶液に溶解した pGL3 control vector あるいは pGL2 control vector (1 μg/μL) 2 μL と RNase-free water に溶解した siGL3 あるいは siGL2 (20 μM) 0.18 ~ 3.76 μL (0.05 ~ 1.0 μg) を添加し，穏やか に攪拌した. その後, HBSS に溶解した種々濃度の α-CDE (1 ~ 100 mg/mL) を 添加し, 10 秒間攪拌後, 15 分間室温でインキュベートした. この試料を, pDNA/siRNA/α-CDE からなる 3 成分系複合体溶液として用いた. なお, pDNA (1 μg/μL) 2 μL に対する α-CDE の各チャージ比 (α-CDE/pDNA; 1/1, 10/1, 20/1, 50/1, 100/1, 200/1) における添加量はそれぞれ 1.89, 18.9, 37.8, 94.5, 189, 378 μg である. L2, TF および LF は pDNA 2 μL (1 μg/μL) に対してそ れぞれ 2 μL, 6 μL および 5 μL 添加した. 4-2. α-CDE/pSilencer からなる 2 成分系複合体の調製: 1.5 mL エッペンド ルフチューブに各種培地を添加し,TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 2 μL を添加し, 10 秒間攪拌した. その後, HBSS に溶解した種々濃度の α-CDE (1 ~ 100 mg/mL) を添加し, 10 秒間撹拌後, 15 分間室温でインキュベ ートした. この試料を, α-CDE/pSilencer 複合体溶液として用いた. なお, pSilencer (1 μg/μL) 2 μL に対する α-CDE の各チャージ比 (α-CDE/pDNA; 1/1, 10/1, 20/1, 50/1, 100/1, 200/1) における添加量はそれぞれ 1.89, 18.9, 37.8, 94.5, 189, 378 μg である. - 121 - 4-3. α-CDE/siRNA からなる 2 成分系複合体の調製: 1.5 mL エッペンドル フチューブに各種培地を添加し, HBSS に溶解した種々濃度の α-CDE (1 ~ 10 mg/mL) を添加し, 10 秒間撹拌した. そこへ RNase-free water に溶解した siRNA (20 μM) を添加し，穏やかに攪拌した. この試料を, α-CDE/siRNA 複合体 溶液として用いた. なお, siRNA (20 μM) 1.5 μL に対する α-CDE の各チャージ 比 (α-CDE/siRNA; 1/1, 10/1, 20/1, 50/1, 100/1) における添加量はそれぞれ 0.393, 3.93, 7.85, 19.7, 39.3 μg である. 5. キャリア/核酸複合体の物理化学的性質 5-1. アガロースゲル電気泳動によるキャリア/核酸複合体の相互作用 ① 3 成分系複合体; TE 溶液に溶解した pGL3 0.5 μL (1 μg/μL) および RNase-free water に溶解した siRNA (20 μM) 0.175 μL に, HBSS に溶解した 種々濃度の α-CDE (1 ~ 100 mg/mL) 10 μL を添加し, 軽く混和後, 15 分間 室温でインキュベートした. 本反応液に重層用試薬 (60% (v/v) グリセロ ール, 1 mM EDTA, 0.004% (w/v) ブロモフェノールブルー, 0.004% (w/v) キ シレンシアノール) 2 μL を添加し, 泳動用緩衝液 (Tris-borate EDTA: TBE; 45 mM Tris, 45 mM ホウ酸, 1 mM EDTA) で調製した EtBr (0.01 μg/mL) 含 有 2% アガロースゲルを用い, 100 V の低圧条件下で約 40 分間泳動した. その後, pDNA および siRNA のバンドをトランスイルミネーターを用いて 検出した. L2, TF および LF は pDNA (1 μg/μL) 0.5 μL に対してそれぞれ 0.5 μL, 1.5 μL および 1.25 μL 添加した. ② shRNA 発現ベクター; TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 0.5 μL に HBSS に溶解した種々濃度の α-CDE (1 ~ 100 mg/mL) 10 μL を添加し, 10 秒間攪拌後, 15 分間室温でインキュベートした. 本反応液に重層用試薬 (60% (v/v) グリセロール, 1 mM EDTA, 0.004% (w/v) ブロモフェノールブル ー, 0.004% (w/v) キシレンシアノール) 2 μL を添加し, 泳動用緩衝液 (Tris-borate EDTA: TBE; 45 mM Tris, 45 mM ホウ酸, 1 mM EDTA) で調製し た EtBr (0.01 μg/mL) 含有 1% アガロースゲルを用い, 100 V の低圧条件下 で約 30 分間泳動した. その後, pSilencer のバンドをトランスイルミネー - 122 - ターを用いて検出した. ③ 2 成分系複合体; RNase-free water に溶解した siRNA (20 μM) 1 μL に, 種々 のチャージ比になるように HBSS に溶解した α-CDE (0.1 ~ 10 mg/mL) 10 μL を添加し, 軽く混和後, 15 分間室温でインキュベートした. 本反応液 に重層用試薬 (60% (v/v) グリセロール, 1 mM EDTA, 0.004% (w/v) ブロモ フェノールブルー, 0.004% (w/v) キシレンシアノール) 2 μL を添加し, 泳動 用緩衝液 (Tris-borate EDTA: TBE; 45 mM Tris, 45 mM ホウ酸, 1 mM EDTA) で調製した EtBr (0.01 μg/mL) 含有 2 % アガロースゲルを用い, 100 V の 低圧条件下で約 30 分間泳動した. その後, siRNA のバンドをトランスイ ルミネーターを用いて検出した. 5-2. pSilencer の酵素分解に対する α-CDE の影響 ① 電気泳動法; TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 2 μL に HBSS に溶解 した種々濃度の α-CDE (1 ~ 100 mg/mL) 5 μL を添加し, 10 秒間攪拌後, 15 分間室温でインキュベートした. 本反応液に BSA (2 mg/mL) 1 μL, DNase I (1 unit/mL) 1 μL, 反応バッファー (40 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 6 mM MgCl2, 2 mM DTT) 1 μL 添加し, 37˚C で 2 時間インキュベー トした. 70˚C で 10 分間インキュベート後, 0.5 M EDTA 1 μL, 8% w/v SDS 10 μL を添加し, さらに 37˚C で 1 時間インキュベートした. 本反応液 に重層用試薬 4 μL を添加し, 泳動用緩衝液で調製した EtBr (0.01 μg/mL) 含有 1% アガロースゲルを用い, 100 V の低圧条件下で約 40 分間泳動し た. pSilencer のバンドは, トランスイルミネーターを用いて検出した. ② UV 法; TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 20 μL に HBSS に溶解した α-CDE (0.1, 1 mg/mL) をモル比 (α-CDE/pSilencer) 1/1, 10/1 および 20/1 に なるようにそれぞれ 0.865 μL (0,1 mg/mL), 0.865 μL (1 mg/mL) および 1.73 μL (1 mg/mL) を Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4) に添加し, 全量を 400 μL として 10 秒間攪拌後, 15 分間室温でインキュベートした. 本反応液に DNase I (1 unit/μL) 5 μL を添加し, 直後に 260 nm における吸光度を分光光 - 123 - 度計 (U-2000A) を用いて 10 秒間間隔で 20 分間測定した. ③ FCS 中におけるキャリア/核酸複合体の安定性; 4-1, 4-3 で調製した 3 成分 系および 2 成分系複合体溶液 30 μL を 50% FCS 存在下, 37˚C で 5 時間 インキュベートした. 等量のフェノールを添加し, 氷上で 10 分間インキ ュベートした. 遠心分離 (16,000 rpm, 4˚C, 10 分間) 後, 水層を分取し, 等 量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1) を加え, 氷 上で 10 分間インキュベートした. 遠心分離後, 水層を分取し, エタノール 添加により siRNA を沈殿させた. RNase-fee water を加え siRNA を溶解さ せた後, 全量を EtBr (0.01 μg/mL) 含有 3.5% アガロースゲルを用いて電気 泳動した. siRNA のバンドは, トランスイルミネーターを用いて検出した. 5-3. キャリア/核酸複合体の粒子径および ζ-電位の測定 ① 3 成分系複合体; TE 溶液に溶解した pDNA (1 μg/μL) 2 μL, siRNA (20 μM) 2.63 μL および α-CDE 溶液 (100 mg/mL) 1.89 μL を Tris-HCl buffer (10 mM, pH7.4) に添加し, 全量を 800 μL として, 15 分間室温でインキュベートし たものを試料とした. なお, L2, TF および LF は pDNA 溶液 (1 μg/μL) 2 μL に対してそれぞれ 2 μL, 6 μL および 5 μL 添加した. ② shRNA 発現ベクター; TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 2 μL に α-CDE のチャージ比が 0.5/1, 1/1, 2/1, 5/1, 10/1, 20/1, 50/1, 100/1 になるよう にそれぞれ 0.945, 1.89, 3.78, 9.45, 18.9, 37.8, 94.5, 189 μg に相当する α-CDE 溶液 (1 ~ 100 mg/mL) を Tris-HCl buffer (10 mM, pH7.4) に添加し, 全量を 800 μL として, 15 分間室温でインキュベートしたものを試料とした. ③ 2 成分系複合体; RNase-free-water に溶解した siRNA (20 μM) 1.5 μL に対し 種々のチャージ比 (1/1, 2/1, 5/1, 10/1, 20/1) になるように HBSS に溶解し た α-CDE 溶液をそれぞれ 0.393, 0.785, 1.97, 3.93, 7.85 μg 添加し, 全量を 800 μL として, 15 分間室温でインキュベートしたものを試料とした. な お, L2 および RF は siRNA (20 μM) 1.5 μL に対してそれぞれ 1.5 μL およ - 124 - び 2.4 μL 添加した. ① ~ ③ で得られた試料を Zetasizer nano により複合体の粒子径および ζ電位を測定した. CD および UV 法 5-4. ① CD 法; Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4) 中に TE 溶液に溶解した pSilencer 溶液 (1 μg/μL) 40 μL と種々のモル比になるように α-CDE 溶液 (0.1 ~ 10 mg/mL) を添加し, 全量を 400 μL とした. 10 秒間攪拌し, 15 分間室温で インキュベートした後, 円二色性分散計 (J-720) を用いて, 25˚C で測定し た. ② UV 法; Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4) 中に TE 溶液に溶解した pSilencer 溶液 (1 μg/μL) 20 μL と種々のモル比になるように α-CDE 溶液 (0.1 ~ 10 mg/mL) を添加し, 全量を 500 μL とした. 10 秒間攪拌し, 15 分間室温で インキュベートした後, 溶液の吸光度を分光光度計 (U-2000A) を用いて, 25˚C で測定した. 5-5. shRNA 発現ベクターのコンパクションに対する α-CDE の影響: Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4) 350 μL に TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 1 μL, Tris-HCl buffer で 200 倍希釈した Picogreen® 溶液 350 μL およ び種々のチャージ比に相当する HBSS に溶解した α-CDE 溶液 (1 ~ 100 mg/mL) を加え, 10 秒間攪拌後, 15 分間室温でインキュベートした. 得られ た試料を蛍光分光光度計 (F-4500) により蛍光強度 (λex = 495 nm, λex = 525 nm) を測定した. 5-6. 透過型電子顕微鏡による α-CDE/pSilencer 複合体の観察: Tris-HCl buffer (10 mM, pH 7.4) 中に TE 溶液に溶解した pSilencer (1 μg/μL) 2.5 μL とチャージ比 (α-CDE/pSilencer) 1/1, 10/1 になるように HBSS に溶解 した α-CDE 溶液 (1 mg/mL, 10 mg/mL) をそれぞれ 2.37 μL ずつ添加し, 全 - 125 - 量を 250 μL とした. 10 秒間攪拌後, 15 分間室温でインキュベートしたも のを試料とした. 得られた試料を 200 Å メッシュの銅プレートに滴下し, 5 分間インキュベートした. その後, ろ紙で余分な水分をふき取り, 10 分間静 置し, 充分に乾燥させた. 酢酸ウラニル溶液 (2% w/v) を添加し, 3 分間イン キュベートして染色後, ろ紙で余分な酢酸ウラニル溶液を除去した. その後, 室温で乾燥させ透過型電子顕微鏡 (JEOL 2000FX) にて観察した. なお, 測 定は熊本大学大学院自然科学研究科物質生命化学専攻伊原博隆教授に依頼し た. 6. 各種細胞の培養 6-1. NIH3T3, NIH3T3-luc, A549 細胞の培養: マウス繊維芽細胞由来の株化 細胞である NIH3T3 細胞, そのルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞株である NIH3T3-luc 細胞, ヒト II 型肺上皮細胞癌由来の株化細胞である A549 細胞を 8 x 105 cells を 10% FCS 含有 DMEM 培地 20 mL に懸濁し, 旭テクノグラ ス (株) 製組織培養ディッシュ (150 mm) に播種して, CO2 インキュベーター 中, 37˚C, 5% CO2 下で培養した. セミコンフルエントに達した細胞をトリプ シン-EDTA 法によりディッシュから剥離し, 3,000 rpm で 3 分間遠心分離後, 上清をすべて取り除き, 得られたペレットを 10% FCS 含有 DMEM 培地 に 1 x 105 cells/mL の密度で分散させた. この細胞懸濁液を旭テクノグラス (株) 製組織培養ディッシュ (24 well microplate) に 5 x 104 cells/500 μL になるよう に播種し, 24 時間培養した細胞をトランスフェクション実験に用いた. 6-2. HepG2, MDCK 細胞の培養: ヒト肝芽細胞癌由来の株化細胞である HepG2 細胞 8 x 105 cells を 10% FCS 含有 MEM 培地 10 mL に懸濁し, 旭 テクノグラス (株) 製組織培養ディッシュ (100 mm) に播種して CO2 インキ ュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で培養した. セミコンフルエントに達した細 胞をトリプシン-EDTA 法によりディッシュから剥離し, 3,000 rpm で 3 分間 遠心分離後, 上清をすべて取り除き, 得られたペレットを 10% FCS 含有 DMEM 培地に 1 x 105 cells/mL の密度で分散させた. この細胞懸濁液を旭テ - 126 - クノグラス (株) 製組織培養ディッシュ (24 well microplate) に 5 x 104 cells/500 μL になるように播種し, 24 時間培養した細胞をトランスフェクショ ン実験に用いた. 6-3. Colon26, Colon26-luc 細胞の培養: マウス結腸癌細胞由来の株化細胞で ある Colon26 細胞およびそのルシフェラーゼ遺伝子安定発現細胞株である Colon26-luc 細胞を 8 x 105 cells を 10% FCS 含有 RPMI 培地 20 mL に懸濁 し, 旭テクノグラス (株) 製組織培養ディッシュ (150 mm) に播種して CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で培養した. セミコンフルエントに達 した細胞をトリプシン-EDTA 法によりディッシュから剥離し, 3,000 rpm で 3 分間遠心分離後, 上清をすべて取り除き, 得られたペレットを 10% FCS 含有 RPMI 培地に 1 x 105 cells/mL の密度で分散させた. この細胞懸濁液を旭テク ノグラス (株) 製組織培養ディッシュ (24 well microplate) に 5 x 104 cells/500 μL になるように播種し, 24 時間培養した細胞をトランスフェクション実験に 用いた. 7. トランスフェクション 7-1. 3 成分系複合体; 細胞を 10% FCS を含む培地で 24 時間前培養した. 培地を取り除き, pDNA/siRNA/キャリアからなる 3 成分系複合体溶液 (pDNA 2 μg, siRNA 0.7 μg 含有) 200 μL を添加し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 1 時間インキュベートした. その後, さらに FCS 22.2 μL を添加 (最終濃度 10% FCS) し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 23 時 間インキュベートした. 7-2. 2 成分系複合体; 細胞を 10% FCS を含む培地で 24 時間前培養した. 培地を取り除き, キャリア/siRNA からなる 2 成分系複合体溶液 270 μL (siRNA の最終濃度 100 nM) を添加し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 1 時間インキュベートした. その後, さらに FCS 30 μL を添加 (最終濃 度 10% FCS) し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 23 時間インキ ュベートした. - 127 - 7-3. 2 成分系複合体 (α-CDE/pSilencer) ; 細胞を 10% FCS を含む培地で 24 時間前培養した. 培地を取り除き, α-CDE/pSilencer からなる 2 成分系複合体 溶液 200 μL を添加し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 1 時間イ ンキュベートした. その後, さらに FCS 22.2 μL を添加 (最終濃度 10% FCS) し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 23 時間インキュベートした. 7-4. α-CDE/siRNA 複合体のポストトランスフェクション: 細胞を 10% FCS を含む培地で 24 時間前培養した. 培地を取り除き, α-CDE/pGL3 複合体溶液 (α-CDE 189 μg, pDNA 2 μg 含有) 200 μL を添加し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 1 時間インキュベートした. さらに, 非血清培地で 2 回 洗浄後, siRNA (20 μM) 1.5 μL, α-CDE (1 mg/mL) 7.85 μL からなる 2 成分系複 合体溶液 270 μL を添加し, その 1 時間後に FCS 30 μL を添加 (最終濃度 10% FCS) し, CO2 インキュベーター中, 37˚C, 5% CO2 下で 22 時間インキュ ベートした. 7-5. 細胞抽出液の調製: トランスフェクション後の各種細胞を Ca2+, Mg2+ 不 含等張リン酸緩衝液 (PBS (-)) 300 μL で 2 回洗浄後, PBS (-) で 5 倍希釈した 細胞溶解剤 200 μL を添加し, 15 分間室温でインキュベートして細胞を溶解し, さらに凍結 (-80˚C) および融解 (37˚C) を 3 回繰り返した. 得られた細胞溶 解液を 10,000 rpm で 5 分間遠心分離し, 得られた上清を細胞抽出液とした. 7-6. 細胞抽出液中のタンパク質の定量: BCA Protein Assay Kit を用いてタン パク質の定量を行った. 細胞抽出液 20 μL に BCA Protein Assay Kit 溶液を 200 μL 添加し, 30 秒間攪拌後, 37˚C, 30 分間インキュベートした. その後, マ イクロプレートリーダーにて 570 nm における吸光度を測定した. なお, 検 量線は細胞溶解剤で BSA (2 mg/mL) を希釈したものを標準液として調製した. 7-7. ルシフェラーゼ活性の測定: 細胞抽出液 20 μL をルミノメーター用試験 管に採取し, これに Luciferase Assay Substrate 100 μL を添加し, 30 秒後にルミ - 128 - ノメーター (Lumat:LB 9506) で 10 秒間の発光量を測定した. ここで得られ た値と, タンパク質濃度を BCA® Protein Assay Kit により測定した値から, 単 位タンパク質量あたりの Relative Light Unit (RLU) を算出した. 本論文で使用した siRNA の配列 siGL2 sense: antisense: 5’- CGUACGCGGAAUACUUCGA dTdT dTdT GCAUGCGCCUUAUGAAGCU siGL3 sense: antisense: 5’- CUUACGCUGAGUACUUCGA dTdT dTdT GAAUGCGACUCAUGAAGCU siLamin sense: antisense: 5’-UCGGGUCUAGCAGUGGUGG dTdT dTdT AGCCCAGAUCGUCACCACC siFas sense: 5’- GUGCAAGUGCAAACCAGAC dTdT antisense: dTdT CACGUUCACGUUUGGUCU G -5’ siFas scramble sense: antisense: 5’- UGC AGA CGG ACA CGA CAA U dTdT dTdT ACG UCU GCC UGU GCU GUU A -5’ - 129 - 8. キャリア/核酸複合体の細胞内取り込み 8-1. 3 成分系複合体; トランスフェクションを行う前日に NIH3T3 細胞を 5 x 104 cells/well になるように播種し, 10% FCS 含有培地で 24 時間培養した. pDNA (1 μg/μL) 2 μL, FITC-siRNA (20 μM) 2.63 μL およびチャージ比 (α-CDE/pDNA) 100/1 になるように α-CDE 溶液 (100 mg/mL) 1.89 μL を添加 し, 混和後, 室温で 15 分間インキュベートした. その後, 3 成分系複合体溶 液を細胞に添加し, 37˚C で 1 時間インキュベートした. 上清を取り除き, PBS (pH 7.4) で 2 回洗浄後, 1 mL の PBS で細胞を懸濁し, FACSCalibur™ に より蛍光を測定し, Cell Quest™ により解析した. なお, pDNA 2 μg に対して L2, TF および LF をそれぞれ 2 μL, 6 μL および 5 μL 添加した. 8-2. 2 成分系複合体; トランスフェクションする前日に NIH3T3-luc 細胞を 5 x 104 cells/well になるように播種し, 10% FCS 含有培地で 24 時間培養した. 1.5 μL の siRNA 溶液 (20 μM, 最終濃度 100 nM) に対して種々のチャージ比 あるいは容量/質量比になるように各種キャリアを添加し, 室温で 15 分間イ ンキュベートした. その後, 2 成分系複合体溶液を細胞に添加し, 37˚C で 1 時間インキュベートした. 上清を取り除き, PBS (pH 7.4) で 2 回洗浄後, 1 mL の PBS で細胞を懸濁し, FACSCalibur™ により FITC-siRNA の蛍光を測定し た. なお, 1.5 μL の siRNA (20 μM) に対して, PEI (1 mg/mL), L2 および RF をそれぞれ 0.275 μL, 2 μL および 2.4 μL 添加した. 9. キャリア/核酸複合体の細胞内挙動 (共焦点レーザー顕微鏡) 細胞を 2 x 105 cells/35 mm glass bottom dish になるように播種し, 10% FCS 含有 培地で 24 時間培養した. 上清を除去後, 上述した 3 成分系複合体溶液 (pDNA/FITC-siRNA/TRITC-α-CDE, L2, TF, LF) あるいは 2 成分系複合体溶液 (FITC-siRNA/α-CDE, L2, RF) を細胞へ添加後, 37˚C で 1 時間インキュベートし た. PBS (pH 7.4) で 2 回洗浄後, メタノールを添加し, 4˚C で 5 分間固定化処 理を行った. PBS で 2 回洗浄し, 退色防止剤 (5.9% w/v DABCO 封入 PVA 溶 液) を添加後, 共焦点レーザー顕微鏡 (LSM410, アルゴンイオンレーザー) によ り FITC-siRNA および TRITC-α-CDE の蛍光を観察した. - 130 - 10. SDS-PAGE および Western blot 10-1. SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 (SDS-PAGE): サンプルに 4 x sample buffer (8% SDS, 40% グリセロール, 24% β-メルカプトエタノールおよ び適量のブロモフェノールブルーを含む 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 6.8)) を 1/4 量加え, 100˚C, 5 分間加熱し, 還元状態の泳動用試料を調製した. 1 レーン あたり 20 μL の試料をゲルにアプライし, 電気泳動 (10 mA で約 45 分後, 20 mA で約 90 分間) を行った. なお, running gel および stacking gel 中の アクリルアミド濃度はそれぞれ, 10% および 4.75% に調製した. 泳動用緩 衝液として 0.192 M glycin, 0.1% SDS, 0.025 M Tris の組成のものを用いた. 10-2. Western blot 分析 ① 試料の調製: Colon26-luc 細胞 (5 x 104 cells/well) を 24 well plate に播種後, 種々の濃度の 2 成分系複合体をトランスフェクションし, 24 時間インキ ュベートした. 細胞を全て回収し, PBS および washing buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 5 mM EDTA, 140 mM NaCl , 25 mM β-メルカプトエタノー ル) で洗浄後, lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 5 mM EDTA, 140 mM NaCl, 25 mM β-メルカプトエタノール, 1% Triton X-100, protease inhibitors) を 50 μL 添加し, 5 分間室温でインキュベートした. 遠心分離 (16,000 rpm, 10 分間) 後, 上清を分取し, lysate を得た. ② lamin A/C および actin の検出: SDS-PAGE 後, PVDF 膜に転写 (100V, 3 時間) した. 転写した PVDF 膜に, ブロッキングバッファー (5% スキム ミルク, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) を用いて, 室 温で 1 時間ブロッキングし, lamin A/C および actin を検出するためにそ れぞれの一次抗体 (mouse anti-lamin A/C antibody (1:200), rabbit anti-actin antibody (1:200)) を 4˚C で一晩作用させた. 0.1% PBS-Tween20 溶液で洗 浄 後 , PBS-Tween20 (0.1%) 溶 液 で 希 釈 し た 二 次 抗 体 (lamin A/C ; peroxidase-conjugated sheep anti-mouse IgG antibody (1:5000), actin ; peroxidase-conjugate donkey anti-rabbit IgG antibody (1:5000)) 溶液を 25˚C で 1 時間作用させた. 0.1% PBS-Tween20 溶液で洗浄後, ECL Western blotting - 131 - analysis system を用いて約 1 分間反応させた. 目的タンパク質のバンド は LAS-3000 mini により検出し, Image Reader LAS-3000™ および Image Gauge™ Ver.4 にて解析した. 11. 細胞表面上の Fas の測定 2 x 104 cells/well の NIH3T3-luc 細胞に, 2 成分系複合体をトランスフェクショ ン (siFas の最終濃度 100 nM) し, 37˚C で 24 時間インキュベートした. トリ プシン溶液 200 μL を添加して細胞を剥離した後, 3,000 rpm で 3 分間遠心分離 し, 細胞を回収した. PBS で 2 回洗浄後, 0.09% NaN3 含有培地 0.5 mL に懸濁 し, 2 μg/mL FITC anti-Fas mAb 溶液を添加後, 4˚C で 30 分間処理した. 遠心分 離 (3,000 rpm, 3 分間) により上清を除去し, PBS で 2 回洗浄後, 0.5 mL の PBS に再懸濁し, FACSCalibur™ にて細胞の蛍光強度を測定し, Cell Quest™ により解析 した. 12. In vivo 実験 12-1. 担癌マウスの作成: BALB/c 雄性マウスの足裏に Colon26-luc 細胞懸濁 液 (5 x 105 cells/100 μL) を接種した. 約 2 週間後, 腫瘍の直径が 10 mm に 到達したマウスを in vivo 実験に用いた. 12-2. トランスフェクション: 2 成分系複合体 (α-CDE/siRNA)溶液 (siRNA ; 10 μg, チャージ比 20/1) 100 μL をマウスの足裏の腫瘍に直接投与し, 24 時間 インキュベートした. 腫瘍を回収後, 5 倍希釈した lysis buffer (Complete proteinase inhibitor cocktail tablet (1 tablet/50 mL) を含む) 1 mL に溶解させ, 24,000 rpm (ULTRA-TURRAX® T-25) でホモジナイズした. その後, 凍結 (-80˚C) および融解 (37˚C) を 3 回繰り返し, 遠心分離 (10,000 rpm, 4˚C, 5 分 間) 後, 上清を細胞抽出液とし, 上記の条件でルシフェラーゼ活性およびタン パク質濃度を求め, RLU を算出した. - 132 - 13. 細胞傷害性 13-1. WST-1 法: 10% (v/v) FCS を含む培地で 24 時間培養した細胞に, 上記 3 成分系複合体溶液 (pDNA/siRNA/キャリア) あるいは 2 成分系複合体溶液 (キャリア/siRNA) 300 μL 添加し, 37˚C, 5% CO2 下で 24 時間インキュベート した. その後, HBSS 300 μL で 3 回洗浄し, HBSS 270 μL および WST-1 30 μL を添加した後, よく混和し, 37˚C, 5% CO2 下で 30 分間インキュベーショ ン後の, 吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した. (測定波長; 405 nm, 参照波長; 630 nm). なお, 細胞生存率は siRNA 非添加時の吸光度の生 存率を 100% として算出した. 13-2. ウサギ赤血球に対する 2 成分系複合体の溶血活性 ① 5% 赤血球懸濁液の調製; PBS (pH 7.4) 5 mL, 赤血球保存液 0.35 mL に日本 白色ウサギ耳介静脈血 1 mL を加え, 緩やかに混和した. 1,000 g で 5 分 間遠心分離して上清を除去後, PBS (pH 7.4) 5 mL を加え, 緩やかに混和した. 1,000 g で 5 分間遠心分離して上清を除去し, 洗浄後, この操作を 2 回繰 り返した. その後, 濃縮赤血球 0.5 mL を 10 mL のメスフラスコに取り, PBS (pH 7.4) で 10 mL にメスアップしたものを赤血球懸濁液とした. ② 溶血実験; 種々濃度の 2 成分系複合体含有 PBS を 250 μL 調製した. その溶液に 13-2-① で調製した 5% 赤血球懸濁液 50 μL を添加し, 37˚C, 30 分間インキュベートした. 1,000 g で 5 分間遠心分離後, 上清約 200 μL を分取し, 540 nm における吸光度を PBS を対照に測定した. なお, PBS の代わりにミリ Q 水で赤血球を処理したときの溶血活性を 100% と して, 各種複合体における溶血活性を算出した. 13-3. フローサイトメトリーによる DNA 含量の測定: 細胞 (4 x 105 cells/well) を 24 well plate に播種した後, 種々のキャリアからなる 2 成分系 複合体を細胞にトランスフェクションし, 24 時間インキュベートした. PBS で洗浄後, 100 μL の冷 70% エタノール中に懸濁させ, 4˚C で 3 時間透過処理 を行った. 遠心操作 (4˚C, 2,000 rpm, 5 分間) により上清を除去後, 1 mL の - 133 - PBS に懸濁させ室温で 30 分間インキュベートし, アポトーシス過程で生じ た DNA 断片を漏出させた. 4˚C, 2,000 rpm, で 5 分間遠心分離後, 500 μL の RNaseA 溶液 (100 μg/mL) を加え, 37˚C, 30 分間インキュベートし RNA を分 解除去した. 遠心操作 (4˚C, 2,000 rpm, 5 分間) により上清を除去後, 100 μL の PI 溶液 (20 μg/mL) に懸濁させ, 氷上で 20 分間染色した. その後, 0.1% BSA 溶液 1 mL を添加し, FACSCalibur™ により細胞の蛍光強度を測定した. 13-4. アガロースゲル電気泳動による DNA ladder の検出: 細胞 (1 x 106 cells) を 35 mm tissue culture dish に播種した後, 種々のキャリアからなる 2 成分系複合体を細胞にトランスフェクションし, 24 時間インキュベートした. PBS で洗浄後, 20 μL の lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA・4Na, 0.5% Triton X-100) 中に懸濁し, 細胞を溶解させた. 1 μL の RNase A 溶液 (10 μg/μL) を加え, 37˚C で 30 分間インキュベートした後, さらに 1 μL の proteinase K (10 μg/μL) を加え, 50˚C で 1 時間インキュベートした. 得られ た細胞溶解液を EtBr (0.5 μg/mL) 含有 2% アガロースゲルを用いて電気泳動 した. DNA のバンドは, トランスイルミネーターにより検出した. 13-5. 細胞内 mRNA の検出 ① Total RNA の抽出: 3 成分系複合体および 2 成分系複合体をトランスフ ェクションし, 24 時間後の細胞 (それぞれ NIH3T3 および NIH3T3-luc 細 胞) を PBS で 2 回洗浄後, RNeasy Mini Kit にて total RNA を抽出し, 分 光光度計 (Nanodrop N-1000) にて 260 nm の吸光度を測定し total RNA 量 を求めた. なお, 調製した RNA は OD260/280 1.8 以上のものを用いた. ② Reverse transcription (RT) 反応: total RNA (1 μg) に対して, 下記に示す それぞれの reverse プライマー (1 μM) 5 μL, 5 x buffer 4 μL, 10 mM dNTPs 2 μL および逆転写酵素 (ReverTra Ace) 1 μL を加え, PCR Thermal Cycler を用 いて, 30˚C, 10 分間インキュベートし, 続いて 42˚C, 60 分間 RT 反応を行 い, それぞれの cDNA を得た. - 134 - ③ Polymerase chain reaction (PCR) 反応: Diethylpyrocarbonate (DEPC) 処理 水 78.5 μL, 10 x PCR buffer 10 μL, 25 mM MgCl2 6 μL, 10 mM dNTPs 2 μL お よび下記に示すそれぞれの forward プライマーと reverse プライマーを 0.5 μL ずつ加え, さらに RT 反応で得られたそれぞれの反応物含有溶液 2 μL および耐熱性ポリメラーゼ (Taq DNA polymerase, 5 U/μL) 溶液 0.5 μL を混 合し, PCR Thermal Cycler を用い, 95˚C, 11 分間プレインキュベーションし, ポリメラーゼを活性化後, 94˚C で 1 分間の変性, 55˚C で 1 分間のアニー リング, 72˚C で 2 分間の DNA 伸長反応を 25 サイクル行い, cDNA を増 幅した. ④ アガロースゲル電気泳動: PCR により増幅された DNA 10 mL に 6 x loading buffer 2 mL を加え, 全量を 0.5 x TBE (Tris-borate EDTA ; 45 mM Tris, 45 mM ホウ酸, 1 mM EDTA) で調製した EtBr (0.01 μg/mL) 含有 2% アガ ロースゲルを用いて電気泳動した. DNA のバンドは, トランスイルミネー ターにより検出した. 各遺伝子に対するプライマー Murine β-actin Forward primer: 5’-TTGGCATAGAGGTCTTTACGGA-3’ Reverse primer: 5’-GCACCACACCTTCTACAATGAG-3’ Murine TNF-α Forward primer: 5’-CAAAGGGATGAGAAGTTCCCAA-3’ Reverse primer: 5’-CTCCTGGTATGAGATAGCAAA-3’ Murine IFN-β Forward primer: 5’-AAACAATTTCTCCAGCACTG -3’ Reverse primer: 5’- ATTCTGAGGCATCAACTGAC-3’ - 135 - 参 考 文 献 1) Scherer L. J. and Rossi J. J., Approaches for the sequence-specific knockdown of 2) mRNA, Nat. Biotechnol., 21, 1457-1465 (2003). Schubert S. and Kurreck J., Ribozyme- and deoxyribozyme-strategies for medical 3) applications, Curr. Drug Targets, 5, 667-681 (2004). Cairns M. J., Saravolac E. G. and Sun L. Q., Catalytic DNA: a novel tool for gene 4) suppression, Curr. Drug Targets, 3, 269-279 (2002). Bagheri S. and Kashani-Sabet M., Ribozymes in the age of molecular therapeutics, 5) Curr. Mol. Med., 4, 489-506 (2004). Khachigian L. M., DNAzymes: cutting a path to a new class of therapeutics, Curr. 6) Opin. Mol. 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